DE69133166T2

DE69133166T2 - Inhibitoren von katalytischen antikörpern

Info

Publication number: DE69133166T2
Application number: DE69133166T
Authority: DE
Inventors: J. Massey; Sudhir Paul; J. Powell
Original assignee: IGEN International Inc
Current assignee: IGEN International Inc
Priority date: 1990-02-28
Filing date: 1991-02-26
Publication date: 2003-11-13
Anticipated expiration: 2011-02-27
Also published as: ZA911292B; IL97333A; DE69133166D1; AU657678B2; CA2037199A1; AU7466091A; US5194585A; EP0517817A1; EP0517817A4; IL97333A0; EP0517817B1; ATE228847T1; JPH05506016A; WO1991012812A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft allgemein Substanzen, die katalytische Antikörper inhibieren können, und genauer Substanzen, die natürlich auftretende katalytische Autoantikörper inhibieren können.
Zahlreiche Veröffentlichungen sind in dieser Anmeldung mit Hilfe von arabischen Ziffern in Klammern angesprochen, um den Stand der Technik, auf den sich diese Erfindung bezieht, genauer zu beschreiben. Vollständige Zitate für diese Literaturstellen finden sich am Ende der Beschreibung, unmittelbar vor den Ansprüchen, und die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen werden mittels Bezugnahme ausdrücklich hierin aufgenommen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Natur der Kräfte, die in die Ligandenbindung von Antikörpern und die Bindung von Substrat von Enzymen involviert sind, ist vergleichbar, insbesondere Wasserstoffbrückenbindungen, elektrostatische Wechselwirkungen und hydrophobe Effekte. Die aus der Enzym/Substrat-Bindung erhaltene Energie kann so visualisiert werden, dass sie eine elektronische Belastung auf das Substrat ausübt und die Bildung eines Ubergangszustandes erleichtert. Es gibt starke Belege für die Theorie, dass Enzyme den Übergangszustand der Reaktion, die sie katalysieren, besser als den Grundzustand binden, was zu einer verringerten freien Energie der Aktivierung für die Reaktion führt (1). Dies kennt man als die "Übergangszustandstheorie" der enzymatischen Katalyse. Andere Faktoren, die die enzymatische Katalyse erleichtern können, sind die Nähe und Orientierungseffekte - das einander Gegenüberstellen richtig orientierter Reaktanten in der aktiven Stelle des Enzyms würde das Erfordernis einer großen Anzahl Zufallskollisionen vor einer produktiven Reaktantenmteraktion verringern. Prinzipiell könnten Antikörper chemische Reaktionen über vergleichbare Mittel katalysieren.
Der erste Bericht über die chemische Umwandlung eines Liganden durch einen Antikörper erschien 1980 (2), die in diesem Bericht beschriebene Steroidesterhydrolyse von einem polyclonalen Antiserum aus Kaninchen war jedoch eher stöchiometrisch als katalytisch. Im Folgenden wurde von Antikörpern gezeigt, dass sie chemische Reaktionen katalysieren oder erleichtern, eingeschlossen den Acyltransfer (3), pericyclische Reaktionen (4) und Redoxreaktionen (5). Es wird allgemein angenommen, dass diese Antikörper ähnliche wie Enzyme ihre katalytischen Eigenschaften aus ihrer Fähigkeit erhalten, den Übergangszustand des Liganden besser als seinen Grundzustand zu binden.
Die bekannten katalytischen Antikörper schließen diejenigen ein, die durch Immunisierung mit ausgewählten Epitopen, wie oben beschrieben, erzeugt werden, und diejenigen, von denen gezeigt werden konnte, dass sie natürlich auftreten (6). Diese natürlich auftretenden Antikörper werden von dem Immunsystem eines Tieres gegen eigene zelluläre Komponenten des Tieres (Selbst-Antigen) erzeugt und sind somit "Autoantikörper" im Gegensatz zu Antikörpern, die mit einem Antigen erzeugt werden, das mittels spezifischer Immunisierung gegen ein Ziel-Antigen eingeführt wird, und von ihnen ist bekannt, dass sie die Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion, beispielsweise die Spaltung einer Peptidbindung, fördern oder erhöhen.
Antikörper mit enzymatischer Aktivität bieten die Möglichkeit der spezifischen, hocheffizienten katalytischen chemischen Umwandlung von Liganden. Viele biologische Mediatoren sind Peptide oder Proteine, eingeschlossen die Antigene pathogener Organismen, Hormone, Neurotransmitter und tumor-spezifische Antigene. Es sollte möglich sein, das breite Repertoire an Spezifizitäten, das das Immunsystem umfasst, zu nutzen, um chemische Reaktion zu katalysieren, die sich nicht im Bereich der natürlich auftretenden Enzyme befinden. Die Kombination von Antikörperspezifizität mit der katalytischen Stärke von Enzymen hat das Potenzial der Erzeugung potenter therapeutischer Mittel, beispielsweise von katalytischen Antikörpern, die spezifisch Schlüsselproteine der Virushülle, tumor-spezifische Proteine oder in Erkrankungen involvierte endogene Proteine hydrolisieren können. Die Anwendung dieser katalytischen Antikörper in der Medizin und der Industrie ließe sich stark fördern, wenn ein spezifisches und selektives Verfahren zum Inhibieren der Aktivität dieser Antikörper ebenfalls verfügbar wäre.
Beispielsweise könnte eine solche Inhibition bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen nützlich sein. Es ist wohl bekannt, dass bestimmte Autoimmunerkrankungen mit Autoantikörpern assoziiert sind, die gegen Hormone und Zelloberflächenantigene gerichtet sind. Beispiele dieser Erkrankungen und der damit verknüpften Autoantikörper sind:
Erkrankung / Autoantikörper gegen
Diabetes Insulin, Insulin-Rezeptor
Mysthenia gravis Acetylcholin-Rezeptor
Graves-Erkrankung Rezeptor des Thyroid-stimulierenden Hormons
Systemischer Lupus Erythematodes snRNS, DNS, Histone
perniziöse Anämie intrinsischer Faktor von Castle, Antikörper der gastrischen parietalen Zellen
Es ist bekannt, Autoimmunerkrankungen allgemein mit Hilfe unspezifischer Antümmunbehandlungen zu behandeln. Diese bekannten Behandlungen schließen Steroide, alkylierende Mittel, Bestrahlung, Plasmaphoresen und chirurgische Entfernung der Milz ein. Jede dieser Behandlungen leidet an vielen Nachteilen, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, wie die Schädigung des Immunsystems des Patienten. Da katalytische Autoantikörper wahrscheinlich mehr Schäden anrichten als nicht katalytische Antikörper, wird nun angenommen, dass Autoimmunerkrankungen von katalytischen Autoantikörpern verursacht werden, die gegen Nucleinsäuren, regulatorische Schlüsselpeptide und Proteine (beispielsweise Insulin, Glucagon, Prolactin, VIP, die Substanz P, Faktoren der Blutgerinnung) und die Zelloberflächenrezeptoren für diese Mittel gerichtet sind.
Beispielsweise nimmt man an, dass Asthma von einem Mangel an vaso-aktivem intestinalem Peptid (VIP) verursacht wird. Bei VIP handelt es sich um ein Peptid mit 28 Aminosäuren, das ursprünglich aus dem Dünndarm isoliert wurde, von dem man jedoch nun erkannt hat, dass es sich um ein in dem zentralen und peripheren Nervensystem weit verbreitetes Neuropeptid handelt. Es gibt Hinweise darauf, dass es sich bei VIP um einen Neurotransmitter sui generis handelt. Zusätzlich kann VIP die Neurotransmission über klassische Transmitter modulieren und ist in die Regulation des Blutdrucks, des Bronchialtonus, der neuroendokrinen Aktivität und der exokrinen Sekretion involviert. VIP scheint beim Menschen der hauptsächliche Neurobronchiodilator zu sein und ein verringerter Einfluss von VIP auf die Atemwege kann ein Überwiegen der konstriktorischen Einflüsse gestatten und kann der Überaktivität der Atemwege beim Asthma zu Grunde liegen.
Das VIP gehört zu einer Familie strukturverwandter Peptide, wobei andere prominente Mitglieder derselben das Peptid Histidin Isoleucin (PHI), der Wachstumshormon freisetzende Faktor (GRF = Growth Hormone Releasing Factor) und das Sekretin sind. Wie die Peptide selbst, gibt es Belege dafür, dass die Rezeptoren von VIP, GRF, PHI und Sekretin miteinander verwandt sind. Die Rezeptoren für VIP finden sich in der Lunge, im glatten Gefäßmuskel, im Hirn, im Pankreas, in der Haut, im Dünndarm und anderen Geweben. Die Aminosäuresequenz des VIP ist wie folgt:
H S D A V F T D N Y T R L R K Q M A V K Y L N S Z L N- NH&sub2;.
Es ist entdeckt worden, dass VIP-bindende Antikörper im menschlichen Blutkreislauf vorliegen (7-9). Die Immunpräzipitation mit Anti-Human-IgG wie auch die Chromatographie auf DEAE-Zellulose, Gelfiltrationssäulen und immobilisiertem Protein-G zeigt an, dass die VIP- bindende Aktivität des Plasmas hauptsächlich auf IgG-Antikörpern beruht. Die Antikörper gegen VIP sind im Blut von 18% der Asthmapatienten und 30% gesunder Individuen vorhanden, die eine Vorgeschichte der gewohnheitsmäßigen Muskelübung aufweisen, im Vergleich zu nur 2% gesunder Individuen ohne eine solche Vorgeschichte. Die Antikörper sind hochspezifisch für VIP, beurteilt auf Grund ihrer schlechten Reaktion mit VIP verwandten Peptiden (das heißt GRF, PHI und Sekretin). Ein deutlicher Unterschied hinsichtlich der VIP-Bindungsaffinität der Antikörper aus Asthmapatienten (mittlere Kbind = 0,13 Nm&supmin;¹) und gesundem Individuum (mittlere Kbind = 7,7 Nm&supmin;¹) wurde beobachtet, wobei die Antikörper aus den Asthmatikern eine 60-fach höhere Bindungsaffinität aufwiesen. Das Immun-IgG aus Asthmapatienten verringert die Bindung von VIP durch Lungenrezeptoren wie auch die auf VIP ansprechende Synthese von cyclischem AMP in Lungenmembranen. Somit können die Antikörper gegen ein Epitop oder Epitope gerichtet sein, die den Rezeptor binden oder das Rezeptor bindende Epitop in einer aktiven Konformation halten.
Diese Antikörper werden durch das Messen ihrer Bindung an ¹²&sup5;I-VIP aus Schweinen detektiert. Das VIP aus Mensch und Schwein ist strukturell identisch (10). Somit stellen die VIP- reaktiven Antikörper aus Schwein, die sich in Asthmapatienten finden, Autoantikörper dar. Es ist beobachtet worden, dass Diabetiker, die auf Plasma-VIP-Antikörper positiv sind, mit Insulin behandelt wurden, das mit VIP kontaminiert war, was nahe legt, dass die Bildung von Antikörpern mit dem kontaminierenden VIP in Beziehung stand (11).
Der antigene Stimulus, der zur Bildung dieser Autoantikörper führt, kann nicht mit Sicherheit identifiziert werden. Mögliche Stimuli schließen die Exposition an virale Determinanten ein, die hinsichtlich der Sequenz dem VIP ähnlich sind [beispielsweise das Peptid-T, ein Epitop, das sich auf dem humanen Immunschwächevirus findet (12)], wie auch die Aufnahme von VIP aus Vogel, Fisch und Schildkröte mit der Nahrung, von denen bekannt ist, dass sie sich von menschlichem VIP strukturell unterscheiden (13, 14). Muskelübungen, die zu einer erhöhten Plasma-VIP-Immunreaktivität führen (15, 16), könnte ebenfalls ein möglicher Stimulus für die Bildung von VIP-Autoantikörpern sein. Tatsächlich scheinen Asthma und Muskelübungen bzw. Sport mit einer gesteigerten Häufigkeit an gegen VIP gerichteten Autoantikörpern assoziiert zu sein.
Unabhängig von der Art der antigenen Stimulation, die zur Bildung von VIP-Autoantikörpern führt, können diese Antikörper wesentliche biologische Veränderungen erzeugen. Der Bereich der für die Autoantikörper aus Asthmapatienten beobachteten Ka-Werte ist demjenigen vergleichbar, der für in der Lunge und anderen Geweben vorhandenen VIP-Rezeptoren berichtet wurde (17, 18), und diese Antikörper neutralisieren die VIP-Rezeptorbindung. Es ist möglich, dass die in Asthmatikern gefundenen VIP-Autoantikörper die Wirkung von VIP in den Atemwegen neutralisieren.
Es wurde entdeckt, dass diese VIP-Autoantikörper die Hydrolyse von VIP zwischen den Aminosäureresten 16 und 17, das heißt zwischen Glutamin (Gln¹&sup6;) und Methionin (Met¹&sup7;) katalysieren. Dieses ist in der US-Anmeldung Serien-Nr. 343,081, eingereicht am 25. April 1989, dem Prioritätsdokument der WO-A-90/13661, offenbart, bei der es sich um eine unter Art. 54(3) EPÜ gegen die vorliegende Anmeldung zitierte Druckschrift handelt.
Somit würden spezifische Inhibitoren für katalytische Autoantikörper, beispielsweise ein Inhibitor des Autoantikörpers, der die Spaltung von VIP katalysiert, einen wesentlichen therapeutischen Fortschritt für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen durch katalytische Autoantikörper, insbesondere Asthma und vergleichbare respiratorische Erkrankungen bereitstellen. Allgemeiner würden Inhibitoren katalytischer Antikörper den Stand der Technik mit den Mitteln zum Maßschneidern und Steuern der katalytischen Aktivität solcher Antikörper versorgen, unabhängig davon, wie sie angewandt werden.

Aufgaben der Erfindung

Es ist eine allgemeine Aufgabe der Erfindung, pharmazeutische Zubereitungen, welche einen Inhibitor eines katalytischen Antikörpers enthalten, Verfahren zur Herstellung der Zubereitungen und die Verwendung der katalytischen Antikörper für therapeutische Zwecke bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der Erfindung wird bereitgestellt eine pharmazeutische Zubereitung, umfassend: einen Inhibitor, der (i) einen katalytischen Autoantikörper inhibiert, der die Spaltung des VIP katalysiert, und (ii) ausgewählt ist unter (a) einem Fragment eines Substrats für den katalytischen Antikörper, (b) einem Analogon von (a) und (c) einem Analogon eines Substrats für den katalytischen Antikörper; und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
In einer Ausführungsform der Erfindung inhibiert der Inhibitor einen katalytischen Antikörper, der die Bildung oder Spaltung einer Peptidbindung katalysiert. Die Peptidbindung kann in einem Peptid, einem Protein, einem Hormon, einem Neurotransmitter oder einem neurohumoralen Faktor vorhanden sein.
Die Erfindung stellt außerdem bereit ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, die einen Inhibitor umfasst, der einen katalytischen Antikörper daran hindert, eine chemische Reaktion eines Substrats zu katalysieren, welcher Inhibitor jedoch nicht selbst benutzt worden ist, um den katalytischen Antikörper hervorzurufen, worin der Inhibitor ausgewählt ist unter (a) einem Fragment eines Substrats für den katalytischen Antikörper, (b) einem Analogon von (a) und (c) einem Analogon eines Substrats für den katalytischen Antikörper, das Verfahren umfassend die Schritte:
(a) Synthetisieren eines oder mehrerer Fragmente des Substrats; oder
(b) Synthetisieren eines oder mehrerer Analoga von einem oder mehreren Fragmenten des Substrats; oder
(c) Synthetisieren von einem oder mehreren Analoga des Substrats;
(d) Serientesten bzw. Screenen des einen oder der mehreren Fragmente oder Analoga, synthetisiert in den Schritten (a)-(c), zum Identifizieren eines Fragments oder Analogons, das den katalytischen Antikörper inhibiert; und
(e) Kombinieren des Fragments oder Analogons mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die Erfindung stellt weiterhin bereit die Verwendung eines Inhibitors eines katalytischen Anti-VIP-Antikörpers bei der Herstellung eines Medikaments für Asthma.
Die Erfindung stellt außerdem bereit die Verwendung eines Inhibitors eines katalytischen Autoantikörpers bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung, wobei der Inhibitor (a) ein Fragment eines Substrats für den katalytischen Autoantikörper, (b) ein Analogon von (a) oder (c) ein Analogon eines Substrats für den katalytischen Autoantikörper darstellt.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung richtet sich auf eine pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung von Asthma, die VIP[22-28] und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger hierfür umfasst.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung wird aus der folgenden genauen Beschreibung klarer und vollständiger zu verstehen sein, wenn diese unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen gelesen wird, in denen:
Fig. 1 die Trennung von Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP und Di(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;, Tyr²²)-VIP mittels Umkehrphasen-HPLC zeigt;
Fig. 2 die verringerte Präzipitation von Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP zeigt, das mit 42,5 ug der Anti- VIP-Antikörperfraktion (Δ) behandelt wurde, verglichen mit einer äquivalenten Konzentration einer nicht immunen Antikörperfraktion (·);
Fig. 3 die Hydrolyse von Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP durch IgG zeigt: Sättigung durch steigende Konzentration an VIP;
Fig. 4 einen Scatchard-Plot (A) und einen Hill-Plot (B) der VIP-Bindung durch das IgG zeigt;
Fig. 5 die Umkehrphasen-HPLC von Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP zeigt, behandelt mit intaktem IgG oder für 10 Minuten gekochtem IgG;
Fig. 6, 7 und 8 die Umkehrphasen-HPLC-Reinigung von VIP-Fragmenten zeigen, die durch Behandlung mit der Anti-VIP-Antikörperfraktion erzeugt wurden;
Fig. 7 und 8 die Aminosäuresequenzen der VIP-Fragmente zeigen, ermittelt über das Verfahren des Edman-Abbaus;
Fig. 9 ein Massespektrum der Bombardierung mit partiell positiven Ionen/schnellen Atomen (m/z 1200-1500) des in Fig. 8 gereinigten VIP-Fragments (2) zeigt;
Fig. 10 eine Auftragung der abgedauten Prozente an VIP über die Konzentration an IgG zeigt, welches (i) keine Ultrafiltration erhielt (·) und (ii) Ultrafiltration erhielt ();
Fig. 11 zehn synthetische VIP-Homologe (Fragmente) zeigt, worin (---) die vom katalytischen Anti-VIP-Autoantikörper gespaltene Bindung (spaltbare Bindung) zeigt;
Fig. 12 die sättigbare (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP-Bindung durch die Autoantikörperfraktion (100 ug gereinigtes IgG) zeigt: kompetitive Inhibition durch VIP(o), VIP[15-28] ( ), VIP[22-28] (·) und VIP[18-24] (Δ);
Fig. 13 die katalytische Hydrolyse von VIP[1-28] durch den Autoantikörper (50 kg IgG) zeigt: Inhibition durch 100 uM VIP[22-28], (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP (32 pM) gemischt mit steigenden VIP-Konzentrationen, wurde mit dem IgG in Abwesenheit (·) und Anwesenheit (Δ) von VIP[22-28] behandelt;
Fig. 14 ein Scatchard-Plot der VIP-Bindung durch das IgG ist;
Fig. 15 eine Affinitätschromatographie von menschlichem IgG auf einer VIP-Sepharosesäule zeigt, wobei der Pfeil die Verschiebung hin zu einem Puffer niedrigen pH-Werts und das Nebenbild die Hydrolyse von (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I) VIP als Funktion der Konzentration der mit Säure eluierten Antikörperkonzentration zeigt;
Fig. 16 die Elektrophorese auf reduzierendem SDS-Polyacrylamidgel von affinitäts-fraktionierten VIP-Autoantikörpern zeigt, gefärbt mit einem gegen die L-Kette gerichteten Antikörper (Spur 1), einem gegen die H-Kette gerichteten Antikörper (Spur 2) und Silber (Spur 3);
Fig. 17 die Umkehrphasen-HPLC von (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP zeigt, behandelt mit nicht fraktioniertem IgG (obere Tafel), mit affinitäts-fraktionierten VIP-Antikörpern (mittlere Tafel) und Testverdünner (untere Tafel), wobei die Pfeile die Retentionszeit von synthetischem (¹²&sup5;I)(VIP[1-16]) und nicht hydrolysiertem (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP zeigen; und
Fig. 18 Lineweaver-Burke-Plots der VIP-Hydrolyse durch affinitäts-fraktionierte VIP-Antikörper (obere Tafel) und nicht fraktioniertes IgG (untere Tafel) zeigt.

GENAUE BERSCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung richtet sich im breitesten Sinne auf Inhibitoren, welche katalytische Antikörper am Katalysieren einer chemischen Reaktion hindern können. Ein "katalytischer Antikörper", wie er hierin verwendet wird, ist eine Substanz, die die Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion ändern kann, wobei alle anderen Bedingungen (beispielsweise Temperatur, Reaktanten/Substrat-Konzentration usw.) gleich bleiben, und die nicht in die chemische Reaktion eintritt und daher nicht in der Reaktion verbraucht wird. Es handelt sich außerdem um eine Substanz, welche die Fähigkeit des Umwandelns vieler Mole an Reaktant/Substrat pro Mol des katalytischen Antikörpers aufweist, und die aus mechanischer Sicht den Reaktanten/das Substrat bindet, die beschleunigte Umwandlung des Reaktanten/Substrats zum Produkt bewirkt und anschließend das Produkt freisetzt; und die die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion ohne Verschiebung der Lage des Gleichgewichts ändert. Während die oben genannten Definitionen die Eigenschaften eines idealen Katalysators darstellen, werden in Praxis sogar die besten Katalysatoren vergiftet oder werden durch Kontamination im Reaktionssystem oder als Folge der chemischen oder physikalischen Zerstörung während des Reaktionsprozesses desaktiviert. Aus im Stand der Technik wohl bekannten Gründen kann der tatsächliche Betrieb eines Katalysators durch Komponenten des Reaktionssystems oder durch die Bedingung der Reaktionsumgebung verschleiert werden.
Der Stand der Technik hat bestimmte Arbeitsdefinitionen angenommen, um die katalytische Aktivität auszudrücken. Diese Ausdrücke sind [1] kcat oder "Wechselzahl" und [2] kcat/kuncat der "Beschleunigungsfaktor". Die Wechselzahl zeigt die Anzahl von Molekülen an Reaktant/Substrat an, die pro Mol an katalytischem Antikörper pro Zeiteinheit in Produkt umgewandelt werden können. Beispielsweise würde dann, wenn ein Molekül eine Wechselzahl von 103 an Substrat pro Minute aufweist und das Molekül die katalytische Aktivität für 24 Stunden bei Raumtemperatur und seinem optimalen pH-Wert aufrecht erhält, jedes Molekül an Katalysator eine Gesamtzahl von 1,4 · 10&sup6; Umwandlungen durchführen, was sein katalytisches Verhalten anzeigt. Diese gesamte Umwandlung ist von der gesamten Umwandlung in einer stöchiometrischen Reaktion zu unterscheiden, die niemals 1,0 übersteigen wird, unabhängig davon, wie lang die Reaktion durchgeführt wird. Der Beschleunigungsfaktor ist eine dimensionslose Zahl, welche die Reaktionsgeschwindigkeit in Anwesenheit von Katalysator im Verhältnis zur Reaktionsgeschwindigkeit in Abwesenheit von Katalysator ausdrückt, wobei alle anderen Reaktionsbedingungen gleich sind.
Gemäß der Erfindung kann ein Antikörper gereinigte Immunglobuline (IgG, IgM, IgA, IgD oder IgE) oder Antikörperfragmente wie beispielsweise Fab, F(ab')&sub2;, Fv usw. von Immunglobulinen umfassen. Katalytische Antikörper schließen zwei Hauptkategorien ein. Die erste Kategorie umfasst katalytische Antikörper, die rational designed worden sind, das heißt Antikörper, die gegen ein Antigen gezogen sind, welches über spezifische Immunisierung gegen ein Ziel-Antigen oder Substrat eingeführt wurde. Solche katalytischen Antikörper, Verfahren für deren Herstellung und deren Anwendung sind beschrieben in US-Patent 4,888,281, erteilt am 19. Dezember 1989, US- Patent 4,792,446, erteilt am 20. Dezember 1988, und US-Anmeldung Serien-Nr. 064,239, eingereicht am 19. Juni 1987, deren gesamte Offenbarungen durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind. Die andere Kategorie an katalytischen Antikörpern umfasst natürlich auftretende Antikörper, die von dem Immunsystem eines Tieres gegen eigene zelluläre Komponenten des Tieres (Selbst-Antigen) im Gegensatz zur ersten Kategorie der zuvor beschriebenen katalytischen Antikörper erzeugt werden. Diese "Autoantikörper" sind in der US- Anmeldung Serien-Nr. 343,081, eingereicht am 25. April 1989, beschrieben, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist.
Ein Inhibitor gemäß der Erfindung hindert einen katalytischen Antikörper am Katalysieren einer chemischen Reaktion eines Substrats. Der Inhibitor bindet an den katalytischen Antikörper, wodurch der katalytische Antikörper an der Substratbindung und am Katalysieren der Reaktion des Substrats gehindert wird.
Der Ausdruck "chemische Reaktion" bezieht sich auf eine Reaktion, in der mindestens ein Reaktant in mindestens ein Produkt umgesetzt wird. Solche chemischen Reaktionen schließen chemische Reaktionen ein, die von Enzymen, wie beispielsweise Oxoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen katalysiert werden können, wie auch chemische Reaktionen, für die keine katalytischen Enzyme bekannt sind, wie beispielsweise Oxidationen, Reduktionen, Additionen, Kondensationen, Eliminationen, Substitutionen, Spaltungen und Umlagerungen. In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der chemischen Reaktion um die Spaltung einer Peptidbindung. Eine Peptidbindung, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Amidbindung, verknüpfend zwei benachbarte Aminosäurereste, und wird generisch durch die folgende Formel dargestellt, worin die Peptidbindung in dem Kästchen gezeigt ist:
Eine Aminosäure besteht aus einem Kohlenstoffatom, an das eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, ein Wasserstoffatom und eine unterscheidungskräftige Gruppe gebunden sind, die als eine "Seitenkette" bezeichnet wird (R&sub1; und R&sub2; in der obigen Formel). "Aminosäure", wie hierin verwendet, schließt die 20 natürlich auftretenden Aminosäuren ein, die die Bausteine der Proteine darstellen. Vom Fachmann ist zu verstehen, dass dann, wenn es sich bei einer der benachbarten Aminosäuren um Prolin handelt, die jeweiligen Seitenketten R&sub1; oder R&sub2; an das benachbarte Stickstoffatom gebunden sind, um den charakteristischen, fünfgliedrigen Prolinring zu bilden.
Der Ausdruck "Substrat" ist synonym mit dem Reaktanten in der chemischen Reaktion und kann ein beliebiges einer Anzahl von Molekülen und Biomolekülen darstellen, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf Peptide, Proteine, Phospholipide, Kohlenhydrate (beispielsweise Glycogen, Glukose usw.) wie auch Wirkstoffe bzw. Drogen (eingeschlossen missbrauchte Substanzen und Wirkstoffe aus exogenen Quellen). In einer Ausführungsform enthält das Substrat eine Peptidbindung oder Bindungen, die gespalten werden sollen, und kann ein beliebiges proteinöses Molekül darstellen, wie beispielsweise ein regulatorisches Protein oder ein Strukturprotein, eingeschlossen, jedoch nicht beschränkt auf Peptidho rmone (beispielsweise Insulin, Wachstumshormone, Sekretin usw.), Peptide als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und neurohumorale Faktoren (beispielsweise VIP, Endorphine, Enkephaline, Bradykinine, die Substanz P usw.), Tumorproteine (beispielsweise Onkogenprodukte, carcinoembryonale Antigene usw.), bakterielle Proteine und virale Proteine (beispielsweise das gp 120 des menschlichen Immunschwächevirus (HIV), Influenzaglycoproteine usw.). In einer anderen Ausführungsform kann es sich bei dem Substrat um ein Selbstantigen handeln, das heißl ein beliebiges Antigen, das der Körper unter Anwendung seines eigenen genetischen Kodes herstellt. Somit unterscheiden sich Selbst-Antigene von Fremd-Antigenen (beispielsweise bakteriellen, viralen Antigenen). Der Ausdruck "Tier", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jeden Organismus mit einem Immunsystem und schließt Säuger und Nichtsäuger als Tiere ein.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann ein Inhibitor ein Fragment des Substrats, ein Analogon eines Fragments des Substrats oder ein Analogon des Substrats darstellen, mit der Maßgabe, dass im Falle von katalytischen Antikörpern, die durch spezifische Immunisierung mit einem Antigen erzeugt worden sind, der Inhibitor kein Antigen darstellt, das den katalytischen Antikörper auslösen bzw. erzeugen kann. Der Ausdruck "Fragment des Substrats" bezieht sich auf ein Molekül, das einen Teil des Substrats darstellt. Beispielsweise kann dann, wenn das Substrat ein Peptid ist, der Inhibitor ein Fragment des Peptids sein beispielsweise eines oder mehrere homologe Peptide mit Aminosäureresten, die Aminosäureresten in einem oder mehreren Teilen des Peptidsubstrats identisch sind. Der Ausdruck "Analogon" wird in seinem breitesten Sinne verwandt und schließt Isomere, Homologe oder jegliche Moleküle ein, die dem Substrat hinsichtlich der chemischen Struktur ausreichend ähnlich sind, so dass ein gegen das Analogon gezogener Antikörper in einer immunologischen Reaktion mit dem Substrat partizipieren kann, jedoch nicht notwendigerweise eine Reaktion des Analogons katalysieren wird. Beispielsweise kann es sich bei einem Analogon des Substrats um ein Molekül handeln, das dem Substrat strukturell ähnlich ist, sich jedoch vom Substrat durch eines oder mehrere Elemente derselben Wertigkeit und Gruppe des Periodensystems wie das Element oder die Elemente, die im Substrat ersetzt sind, unterscheidet, beispielsweise ein Analogon des Übergangszustandes der zu katalysierenden Reaktion. Ein Analogon des Substrats gemäß der Erfindung kann auch einen optischen Antipoden des Substrats darstellen. Beispielsweise wäre dann, wenn das Substrat eine D- Aminosäure darstellt, ein Inhibitor gemäß der Erfindung das optische L-Gegenstück. Im Falle eines Autoantikörpers, bei dem das Substrat ein Selbst-Antigen ist, kann es sich bei einem Inhibitor des Autoantikörpers um ein Analogon des Selbst-Antigens, ein kleines Peptid, enthaltend ein Epitop des Selbst-Antigens, an welchem Epitop die chemische Reaktion gegebenenfalls abläuft, ein Analogon eines kleinen Peptids, enthaltend das Epitop, oder ein kleines Peptid, enthaltend ein Analogon des Epitops, handeln. Die oben beschriebenen Inhibitoren können über eine Vielzahl chemischer und immunologischer biosynthetischer Verfahren synthetisiert werden, die im Stand der Technik wohl bekannt sind (19).
Eine andere Ausführungsform der Erfindung richtet sich auf einen Inhibitor, umfassend einen Antikörper, der zu dem zu inhibierenden Antikörper anti-idiotypisch ist. Ein Antikörper, der "anti-idiotypisch" ist, bezieht sich auf einen Antikörper, der einen zweiten Antikörper im variablen Bereich des zweiten Antikörpers bindet. Ein solcher Inhibitor wird durch Erzeugen einer Vielzahl von Antikörpern gegen den katalytischen Antikörper und Sichten bzw. Screenen der Vielzahl zum Identifizieren eines anti-idiotypischen Antikörpers hergestellt, der an den katalytischen Antikörper binden und diesen dadurch inhibieren kann. Verfahren für die Erzeugung der Vielzahl von Antikörpern und Sichtungstests zum Binden und auf Inhibition sind im Stand der Technik wohl bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Tier mit dem katalytischen Antikörper immunisiert, um in dem Tier Antikörper erzeugende Lymphozyten zu erzeugen, die dann aus dem Tier entnommen und mit Myelomzellen zur Erzeugung einer Vielzahl von Hybridomzellen fusioniert werden, die jeweils wiederum monoklonale Antikörper erzeugen. Die monoklonalen Antikörper können dann auf die Bindung an und die Inhibition des katalytischen Antikörpers als Ziel über im Stand der Technik wohl bekannte Verfahren (6) gesichtet werden.
Die hydrolytische Aktivität des katalytischen Anti-VIP-Autoantikörpers ist auf Grund der Anwesenheit eines fest gebundenen Inhibitors relativ geringer Größe latent. Diese Latenz beruht auf der Entdeckung, dass in der IgG-Fraktion von Serum, isoliert aus Individuen mit dem katalytischen Anti-VIP-Autoantikörper dann, wenn das IgG auf hydrolytische Aktivität direkt nach der Reinigung auf immobilisiertem Protein G (6) getestet wurde, nur sehr wenig oder keine VIP- hydrolytische Aktivität vorhanden war. Man beobachtete jedoch eine VIIP-hydrolytische Aktivität dann, wenn das IgG einer der folgenden Behandlungen unterworfen wurde: (a) extensive Dialyse; (b) zwei Ultrafiltrationszyklen; (c) längeres Waschen des IgG bei neutralem pH, wenn dieses auf Protein-G-Sepharose gebunden ist; oder (d) Affinitätschromatographie auf einer VIP- Sepharosesäule.
Die Bindung eines Antigens (oder eines Inhibitors) an einen Antikörper ist eine Gleichgewichtsreaktion wie folgt:
Die Behandlungen (a)-(d) entfernen nicht gebundenen Inhibitor, was das Gleichgewicht auf die linke Seite treibt (klösen) und weitere Entfernung von Inhibitor erleichtert, wodurch ein hydrolytisch aktiver Antikörper zurück bleibt.
Somit richtet sich in noch einer anderen Ausführungsform die Erfindung auf natürlich auftretende Inhibitoren katalytischer Antikörper. Der Inhibitor wird hergestellt durch Sammeln des Serums aus einem Tier mit dem katalytischen Ziel-Autoantikörper, Abtrennen der Gammaglobulinfraktion vom Serum, Abtrennen von Molekülen aus der Gammaglobulinfraktion, die an das Gammaglobulin binden, und Sichten der so abgetrennten Molkeküle zum Identifizieren eines Moleküls, das die katalytische Aktivität eines Ziel-Autoantikörpers inhibieren kann. Diese Moleküle umfassen Metallionen, Antikörper, Antikörperfragmente usw. und stellen typischerweise Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht im Bereich von 1.000 bis 15.000 Dalton dar.
In einer Ausführungsform werden die Moleküle aus der Gammaglobulinfraktion mittels Ultrafiltration oder mittels Dialyse abgetrennt. Der Ausdruck "Ultrafiltration", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Verfahren zum Abtrennen von Proteinen von kleineren Molekülen, indem Druck oder Zentrifugalkräfte verwendet werden, um ein flüssiges Medium und kleine gelöste Moleküle durch eine semi-permeable Membran mit Poren mit einem mittleren Ausschluss-Molekulargewicht im Bereich von 1.000 bis 10.000 Dalton zu filtrieren. Somit wird beispielsweise das Ultrafiltrieren eines Immunglobulins mit einem Molekulargewicht von 150.000 Dalton auf einer Membran mit Poren mit einem mittleren Ausschluss-Molekulargewicht von 10.000 Dalton Moleküle mit Molekulargewichten unterhalb von 10.000 Dalton zum Durchtreten durch die Membran in das Ultrafiltrat veranlassen, wogegen das Immunglobulin auf der Membran verbleibt. Dementsprechend werden sich mögliche Inhibitoren im Ultrafiltrat finden. Das Ultrafiltrat wird anschließend teils gereinigt und Fraktionen desselben auf die Bindung und inhibitorische Aktivität gesichtet. Inhibitorische Aktivität aufweisende Fraktionen werden weiteren Trennverfahren unterworfen, um den reinen Inhibitor zu erhalten. Sobald isoliert, wird der reine Inhibitor der Aminosäureanalyse und dem Peptidsequenzieren und/oder anderen Arten der chemischen Analyse unterworfen, um die chemische Struktur zu identifizieren.
Der Ausdruck "Dialyse", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Verfahren zum Abtrennen globulärer Proteine in Lösung von gelösten Stoffen niedrigen Molekulargewichts, das eine semi-permeable Membran nutzt, um Proteinmoleküle zurückzuhalten und kleinen gelösten Molekülen wie auch Wasser den Durchtritt zu gestatten. Dialysemembranen mit Molekulargewichtsausschlussgrenzen von 12.000-15.000 Dalton werden vorteilhafterweise angewandt. Mögliche Inhibitoren im Dialysat werden anschließend auf inhibitorische Aktivität gesichtet und in analoger Weise zu derjenigen, die oben bezüglich der Ultrafiltration beschrieben wurde, gereinigt.
In einer anderen Ausführungsform werden Moleküle, die an das Gammaglobulin binden, durch Waschen nach Immobilisation auf dem IgG auf einem unspezifischen Protein als Träger oder durch Affinitätschromatographie auf einem proteinösen Träger abgetrennt, der spezifisch für den speziellen Antikörper ist, für den ein Inhibitor gesucht wird. Ein Beispiel eines unspezifischen Proteins als Träger ist Protein-G-Sepharose. Protein-G-Sepharose wird den Fr-Bereich aller Antikörper binden. Somit wird im Falle eines katalytischen Anti-VIP-Autoantikörpers die Protein- G-Sepharose den Fc-Bereich aller Antikörper in der Probe wie auch den Fc-Bereich des katalytischen Anti-VIP-Autoantikörpers binden. Sobald das IgG in der Probe immobilisiert ist, wird dieses mit Puffer gewaschen, um mögliche Inhibitoren zu entfernen. Die möglichen Inhibitoren werden anschließend auf inhibitorische Aktivität gesichtet und auf eine analoge Weise zu der oben beschriebenen gereinigt. Die Säule wird anschließend mit einer sauren Lösung gewaschen, um das freie, aktivierte IgG freizusetzen.
Die Affinitätschromatographie involviert die Verwendung eines Proteinträgers, der nur für den speziellen Antikörper spezifisch ist, für den ein Inhibitor gesucht wird, da sie nur an den variablen Bereich (das heißt den Antigen bindenden Bereich) des Antikörpers binden wird. Die Affinitätschromatographie treibt das Antikörper/Inhibitor-Bindungsgleichgewicht in die Richtung der Dissoziation des Inhibitors, da ein Wettbewerb zwischen dem Inhibitor und dem spezifischen Protein um die Bindungsstelle auf dem Antikörper besteht. Somit sorgt die Affinitätschromatographie für die Isolierung gegen die aktive Stelle gerichteter Inhibitoren und erfordert deshalb weniger Waschen zum Entfernen möglicher Inhibitoren als dies mit den oben beschriebenen unspezifischen Proteinen als Trägern erforderlich ist. Die möglichen Inhibitoren werden anschließend auf Inhibitoraktivität gesichtet und in einer analogen Weise zur oben beschriebenen gereinigt. Die Säule wird anschließend mit einer saurer Lösung gewaschen, um das freie, aktivierte IgG freizusetzen. Im Falle eines katalytischen Anti-VIP-Autoantikörpers wird vorteilhafterweise eine VIP-Sepharosesäule eingesetzt.
Die Inhibitoren der Erfindung können anschließend verwendet werden, um einen katalytischen Antikörper am Katalysieren der Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion eines Substrats zu hindern. Der katalytische Antikörper wird mit einer wirksamen Menge des Inhibitors unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht, damit die Inhibition ablaufen kann. Geeignete Bedingungen zum Inhibieren sind beliebige Bedingungen, welche das Binden des Inhibitorsan den katalytischen Antikörper als Ziel gestatten. Typischerweise sind diese Bedingungen physiologische Bedingungen, das heißt Bedingungen, die sich in vivo finden (beispielsweise im Blut).
Wie oben angemerkt, ist es wohl bekannt, das bestimmte Auteimmunerkrankungen mit Autoantikörpern assoziiert sind, die gegen Hormone und Zelloberflächen-Antigene gerichtet sind. In Autoimmunerkrankungen, bei denen ein Autoantikörper zur Pathophysiologie der Erkrankung beiträgt oder hierfür verantwortlich ist, als Ergebnis der Katalyse einer Reaktion eines Substrats, präsentiert sich ein Verfahren zur Behandlung der Autoimmunerkrankung selbst auf Basis der Verwendung eines Inhibitors gemäß der Erfindung für diesen Autoantikörper. Somit richtet sich eine andere Ausführungsform der Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung von einer Autoimmunerkrankung in einem Tier, worin ein Autoantikörper, der eine chemische Reaktion eines Substrats in dem Tier katalysiert, zur Pathophysiologie dieser Autoimmunerkrankung als Folge der katalysierten Reaktion beiträgt oder hierfür verantwortlich ist. Das Verfahren umfasst die Verabreichung eines Inhibitors gemäß der Erfindung, der den Autoantikörper am Katalysieren der chemischen Reaktion hindert, an das mit der Autoimmunerkrankung betroffene Tier oder an ein Fluid eines solchen Tieres. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Inhibitor direkt an das Tier als pharmazeutische Zubereitung, umfassend den Inhibitor und einen geeigneten pharmazeutischen Träger, entweder oral oder mittels Injektion (I.V. oder I.M.) verabreicht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Inhibitor an das Tier extra-corporal verabreicht, das heißt ein Fluid des Tieres, beispielsweise Blut, wird aus dem Tierkörper durch eine Matrix geführt, die mit dem Inhibitor gemäß der Erfindung imprägniert ist. Der mit der Pathophysiologie der Autoimmunerkrankung assoziierte Autoantikörper wird aus dem Fluid als Ergebnis der Bindung zwischen dem Inhibitor und dem Autoantikörper entfernt und das Fluid wird anschließend in den Körper des Tieres rückgeführt. Autoimmunerkrankungen, die gemäß der Erfindung behandelt werden können, schließen Asthma, Bronchitis, Diabetes und Impotenz ein.

BESCHREIBUNG BESTIMMTER BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung richten sich auf Inhibitoren eines Autoantikörpers ("katalytischer Anti-VIP-Autoantikörper"), der katalytisch die Peptidbindung zwischen Glutamin und Methionin ("Gln¹&sup6;-Met¹&sup7;") im VIP spaltet. In einer Ausführungsform handelt es sich bei den Inhibitoren um eine Familie von Peptidhomologen des VIP, die an den katalytischen Anti-VIP-Autoantikörper bindet, ohne selbst der katalytischen Spaltung zu unterliegen.
Somit wurden zehn synthetische Peptidhomologe (Fragmente des VIP) (Fig. 11), entsprechend linearen Untersequenzen des VIP, auf ihre Reaktivität mit dem (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP- bindenden Autoantikörper gesichtet. IgG, gereinigt aus Plasma eines menschlichen Individuums, war die Quelle des Antikörpers. Die Bindungstests wurden durchgeführt unter Verwendung von: (1) IgG, das nicht dialysiert worden war, um den möglichen Inhibitor der Hydrolyse zu entfernen; (2) eine Temperatur von 4ºC; oder (3) Puffer (7,5 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 0,64% Natriumchlorid, 0,5% Rinderserumalbumin, 25 mM EDTA, 0,005% Bacitracin, 0,005% Protaminsulfat, 0,073% Natriumazid und 0,025% Tween-20), das heißt experimentellen Bedingungen, welche die (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP-Hydrolyse nicht gestatten. Das N-terminale Fragment VIP[1-16] inhibierte bei 500 uM die Bindung von (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP nicht. Das C-terminale Fragment VIP[15-28] inhibierte im Gegensatz dazu die Bindung mit einer Potenz (KI = 1,25 nM) nahe derjenigen des Gesamtpeptids VIP[1-28] (KD = 0,3 nM) (Fig. 12). Von den anfänglich bei einer Konzentration von je 500 uM getesteten sieben kürzeren Peptiden inhibierten nur das VIP[22-28] und VIP[18-24] die (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP-Bindung. Die KI für VIP[22-28] betrug 242 uM. VIP[22-28] zeigte eine etwa 8-fach höhere Potenz als VIP[18-24]. Daher wird angenommen, dass die Reaktivität des letzteren Peptids auf der gemeinsamen Sequenz VIP[22-24] beruht. Die anscheinende Bindungsenergie für die Peptide betrugen in kcal/Mol 12,1 für VIP[1-28]; 11,3 für VIP[15-28] und 4,6 für VIP[22-28]. Die Bindungsenergie der Reste 22-28 ist substanziell, obwohl sie nur 38% derjenigen für das Peptid gesamter Länge ausmacht.
Da das VIP[22-28] im Vergleich zu den anderen Homologen den Autoantikörper am stärksten band, wurde es für die katalytische inhibierende Aktivität duch Messen seiner Wirkung auf die Katalyse durch den Autoantikörper gesichtet. Die Hydrolyse steigender Konzentrationen an VIP in Anwesenheit und Abwesenheit von VIP[22-28] wurde verglichen. Die Auftragung der reziproken Geschwindigkeit der VIP-Hydrolyse über den Umkehrwert der Konzentration an VIP (Fig. 13) war linear, was die Konformität mit der Michaelis-Menten-Kinetik anzeigt. Km und Kcat- Werte für die VIP-Spaltung in Abwesenheit von VIP[22-28] betrugen 115 ± 14 nM und 6,5 ± 0,3 Minute&supmin;¹. In Anwesenheit von 100 uM VIP[22-28] war die anscheinende Km erhöht (159 ± 4 nM) und kcat war unverändert (6,9 ± 0,02 Minute&supmin;¹), was eine kompetitive Inhibition der VIP-Hydrolyse nahe legte. Der KI für VIP[22-28], berechnet aus diesen Daten, betrug 260 uM. Mit dem IgG behandeltes VIP[22-28] wurde selbst nicht gespalten.
Es wurde angenommen, dass die Bindung und Hydrolyse von VIP durch denselben Autoantikörper, der in dem IgG vorhanden ist, vermittelt wird, da: (i) die Scatchard-Analyse der VIP-Bindung nahelegte, dass das IgG eine einzelne Klasse an VIP bindendem Antikörper enthält (6); (ii) ein spezifischer Antikörper, gereinigt aus dem IgG mittels Bindung an VIP, gekuppelt an einen festen Träger, den Ergebnissen zufolge (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP an derselben Peptidbindung (Gln¹&sup6;- Met¹&sup7;) wie das ursprüngliche IgG hydrolysierte; und (iii) die Untersec uenz VIP[22-28] nicht nur die Bindung des VW voller Länge durch den IgG inhibierte, sondern auch dessen Hydrolyse. Die Reaktivität von VIP[22-28] mit dem katalytischen Autoantikörper sclieint sequenz-spezifisch zu sein, da: (i) die Inhibition (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP-Bindung und Hydrolyse durch das VIP[22-28] kompetitiver Natur war; (ii) die Inhibition trotz Anwesenheit eines Überschusses (> 300-fach im Gewicht) eines nicht verwandten Proteins (BSA) beobachtet wurde; und (iii) 400 uM VIP[1-7] ein nicht bindendes Fragment, die VIP-Hydrolyse nicht inhibierte. Diese Annahme wurde durch die Affinitätschromatographie des IgG auf einer VIP-Sepharose bestätigt.
Das VIP[22-28] enthält die spaltbare Peptidbildung (Gln¹&sup6;-Met¹&sup7;) nicht, es bindet jedoch den katalytischen Autoantikörper und inhibiert die antikörper-katalysierte VIP-Hydrolyse. Somit wird angenommen, dass von der Stelle der chemischen Reaktion beabstandete Aminosäurereste für die Substraterkennung und Bindung durch den Antikörper wichtig bzw. von Bedeutung sind. Antikörper bindende Taschen schienen relativ groß zu sein, wobei sie bis zu 16 Aminosäuren an Antigen (20) kontaktieren können. Das VIP[22-28] band den katalytischen Autoantikörper mit signifikanter Energie (4,5 kcal/Mol), diese Energie macht jedoch nur 41% derjenigen des VIP[15- 28] aus. Diese Daten legen nahe, dass es sich bei VIP[15-28] um das von dem katalytischen Antikörper erkannte Epitop handelt und das VIP[22-28] ein "Unter-Epitop" darstellt, das einige, jedoch nicht alle Antikörper bindenden Wechselwirkungen beiträgt. Dieser Schluss ist mit den vorherigen Ergebnissen konsistent, dass kleine Fragmente an Protein als Antigen üblicherweise eine gering affine Bindung an Antikörper zeigen, die gegen die Stammproteine gezogen werden (21). Der genaue Beitrag der Reste 15-21 des VIP zur Bindung an den katalytischen Autoantikörper ist unbestimmt. Lineare VIP-Fragmente, bestehend aus den Resten 15-21, 11-17 und 13-20, zeigten keine signifikante Wechselwirkung mit dem katalytischen Autoantikörer in den Bindungstests, die Reste an der spaltbaren Bindung (Gln¹&sup6;-Met¹&sup7;) müssen die katalytische Gruppe(n) in der aktiven Stelle des Antikörpers jedoch auf irgendeine Weise kontaktieren. Einer oder mehrere der Reste in VIP[15-21] könnten integral in einer Konformationsdeterminante sein, erkannt von dem Autoantikörper. Andererseits könnten diese Reste relativ unspezifisch zur Erhöhung der Bindungsenergie von VIP[22-28] beitragen, da die N-terminale Verlängerung kleiner Peptide mit irrelevanten Aminosäuren oder Octanoylgruppen bekanntermaßen deren Antikörperbindungsaffinität erhöht (22).
Herkömmliche Peptidasen hydrolysieren einen breiten Bereich an Proteinen mit Spezifizitäten, die primär über die Art der Aminosäuren an oder in der unmittelbaren Nähe der spaltbaren Bindung diktiert werden (23). Im Falle relativ spezifischer Peptidasen wie Renin (24) können drei oder vier Aminosäurereste, die an jeder Seite der Spaltstelle angeordnet sind, die Enzymbindung beeinflussen. Sogar in diesen Fällen wird angenommen, dass die Bindung an Substratsequenzen ohne spaltbare Bindung nicht gezeigt worden ist. Im Gegensatz hierzu weist der katalytische Autoantikörper eine signifikante Bindung an die Reste 22-28 des VIP auf, die sich vier Aminosäuren beabstandet von der spaltbaren Bindung befinden. Die Erkennung einer beabstandeten Peptidsequenz kann so interpretiert werden, dass sie eine außerordentliche Substratspezifizität dieses katalytischen Antikörpers reflektiert, im Vergleich zu herkömmlichen Peptidasen. Es gibt Hinweise darauf, dass im Falle von Enzymen die Bindungsenergie aus Wechselwirkungen an anderen Resten als denjenigen an der spaltbaren Bindung verwendet wird, um die katalytische Geschwindigkeit zu erhöhen (25). Es wird angenommen, dass die Bindung an den Resten 22-28 des VIP die Katalyse durch den Antikörper erleichtert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Inhibitor um eine natürlich auftretende Verbindung, die an den katalytischen Anti-VIP- Autoantikörper bindet und dadurch seine katalytische Aktivität inhibiert. Wie zuvor angegeben, ist entdeckt worden, dass in der IgG-Fraktion aus Serum, isoliert aus Individuen mit dem katalytischen Anti-VIP-Autoantikörper, wenn dieses direkt nach der Reinigung auf immobilisiertem Protein G getestet wurde (6), keine oder nur geringe VIP-hydrolytische Aktivität vorhanden war. Nach Unterwerfen des IgG unter die Ultrafiltration wurde jedoch eine VIP-hydrolytische Aktivität beobachtet. Es ist nun entdeckt worden, dass die Entfernung eines fest gebundenen, natürlich auftretenden Inhibitors dem Autoantikörper die VIP-hydrolytische Aktivität verleiht. Somit wird gemäß der Erfindung der natürlich auftretende Inhibitor des katalytischen Anti-VIP- Autoantikörpers durch Sammeln von Serum aus einem Tier mit dem Autoantikörper, Abtrennen der Gammaglobulinfraktion aus dem Serum über im Stand der Technik bekannte Verfahren, Unterwerfen der Gammaglobulinfraktion unter Ultrafiltration, um Moleküle mit niedrigerem Molekulargewicht aus der Gammaglobulinfraktion abzutrennen, und anschließendes Sichten der Moleküle mit niedrigerem Molekulargewicht in dem Ultrafiltrat auf Bindung und inhibitorische Aktivität hergestellt. Fraktionen des Ultrafiltrats, die positiv auf inhibitorische Aktivität getestet werden, werden weiter aufgereinigt und die chemische Struktur des Inhibitors über im Stand der Technik bekannte Verfahren bestimmt.
Es ist beobachtet worden, dass Störungen der Atemwege, insbesondere Asthma und Bronchitis mit VIP-Autoantikörpern assoziiert sind, von denen einige katalytische Aktivität aufweisen (9). Das Erkrankungen verursachende Potenzial von katalytischen Antikörpern, die sich gegen Selbst-Antigene richten wie VIP, ist größer als dasjenige von Antikörpern, die nur an Selbst- Antigene binden. Somit können hoch affine Peptidhomologe und natürlich auftretende Inhibitoren, wie diejenigen, die gerade beschrieben worden sind, zur Behandlung von Erkrankungen der Atemwege, insbesondere von Asthma genutzt werden.
Die Erfindung soll nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die zur Veranschaulichung gegeben werden, vollständiger beschrieben und verstanden werden.

Beispiel 1

Herstellung von Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP

Gereinigtes VIP aus Schwein (Bachem) wurde mit ¹²&sup5;Jod über das Chloramin-T-Verfahren markiert (26). Das resultierende Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP wurde auf einer Seppak-C18-Kartusche gereinigt, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC mit einem Gradienten von Acetonitril in Trifluoressigsäure. Zwei Hauptpeaks an Radioaktivität wurden erhalten (Fig. 1), entsprechend Verbindungen, die mit Anti-VIP-Antiserum aus Kaninchen in einem Radioimmungssay reagierten. Um ausreichend Peptid zum Sequenzieren zu erhalten, wurde das VIP mit ¹²&sup5;I, verdünnt mit ¹²&sup7;I zum Verringern der spezifischen Aktivität, jodiert und die Reinigung wie zuvor durchgeführt. Die Analyse des Peaks mit einer Retentionszeit von 25,3 Minuten auf einem Applied Biosystems Sequenziergerät mit Online-Aminosäuredetektion mittels Phenylthiohydantoin zeigte Radioaktivität hauptsächlich im Zyklus 10, wobei die HPLC-Eigenschaften denjenigen des Monojodtyrosins (bezogen von Calbiochern) vergleichbar waren, was anzeigte, dass es sich bei diesem Material um Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP handelt. Der zweite Peak an Radioaktivität (Retentionszeit 27,8 Minuten) wurde als Di(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;, Tyr²²)-VIP über vergleichbare Methoden bestimmt. Das Di(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;, Tyr²²)-VIP und das Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP verhielten sich in einem Radioimmuntest nahezu äquivalent. Da natives VIP, mit Chloramin-T ohne Na¹²&sup5;I oxidiertes VIP (DT-VIP) und Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP wohl getrennt waren, wurde geschlossen, dass das ¹²&sup5;I-VIP frei von nicht markiertem Peptid war.

Beispiel 2

Demonstration von VIP-Autoantikörpern in menschlichen Individuen

Die Antikörper wurden in Plasmaproben aus Asthmapatienten und gesunden Subjekten gemessen, unterteilt in Untergruppen hoher sportlicher Betätigung (high exercise = Hx) und geringer sportlicher Betätigung (low exercise = Lx) (8). Asthma wurde auf der Basis der Patientengeschichte und typischer klinischer Indikatoren diagnostiziert. Die gesunden Hx- Individuen wiesen eine Geschichte gewohnheitsgemäßer Muskelbetätigung auf und die gesunden Lx-Subjekte taten dies nicht. Menschliche Blutproben wurden in einer Mischung aus Peptidhydrolase-Inhibitoren gesammelt (Aprotinin, Phenylmethylsulfonylfluorid, Pepstatin, Ethylendiamintetraessigsäure) (9). Die Immunglobulin-G-Fraktion (IgG-Fraktion) aus Blut wurde über sequenzielle Chromatographie (7,9) auf DEAE-Zellulose (Whatrnan) und Protein-G- Sepharose (Pharmacia) hergestellt. Das IgG (4 mg/ml) wurde auf einer YN-10-Membran mit einem mittleren Ausschluss-Molekulargewicht von 10.000 Dalton ultrafiltriert, unter Verwendung einer Amicon-Vorrichtung, Modell 8 MC, und zwar auf 27 mg/ml, zurück verdünnt auf 0,8 mg/ml und anschließend einem zweiten Ultrafiltrationszyklus unterworfen. Die Endkonzentration des auf diese Weise hergestellten IgG betrug etwa 20 mg/ml. Die elektrophoretische Analyse und das Färben auf Nitrozelluloseblots mit Anti-Human-IgG, konjugiert an Peroxidase, zeigte keine Anwesenheit von Nicht-Immunglobulin-Material in dieser Präparation. Die Anwesenheit von VIP-Antikörpern wurde durch Messen der sättigbaren Bindung an Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP (die Bindung wurde durch einen Überschuss an unmarkiertem VIP inhibiert) in Plasmaproben oder gereinigtem IgG etabliert. Die mono-jodierte Form des VIP wurde verwendet, da sie mit höherer Watrscheinlichkeit die Wechselwirkungen von nativem VIP mit den Antikörpern reproduzierte. Gebundenes und freies VIP wurden durch Präzipitation mit Polyethylenglykol oder spezifischen Schaf-Antikörpern gegen menschliches IgG getrennt (9). Es wurde beobachtet, dass Plasmaproben aus einigen Asthmapatienten und gesunden Individuen sättigbare ¹²&sup5;I-VIP-Bindungsaktivitäten (bis zu 67,5% des gesamten ¹²&sup5;I-VIP) aufwiesen. Die VIP-Antikörper fanden sich in 18% der Asthmapatienten (N = 74), 30% der gesunden Hx-Individuen (N = 51), 2% der gesunden Lx-Individuen (N = 44). Die mittleren ¹²&sup5;I-VIP-Bindungswerte (%B/T mit Standardabweichung in Klammern) bei den antikörper-positiven Asthmapatienten und Hx-Individuen betrugen 23,4 (5,3) und 20,4 (3,2). Das einzige antikörper-positive Individuum in der Lx-Gruppe zeigte einen prozentualen BIT-Wert von 12,1%.

Beispiel 3

Hydrolyse von VIP durch Anti-VIP-Autoantikörper

Um die antikörper-vermittelte Hydrolyse und die spontane Hydrolyse des Peptids VIP zu vergleichen, wurde Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP mit (i) immunem und (ii) nicht immunem IgG für ansteigende Zeitspannen inkubiert. Das IgG aus einem nicht immunen menschlichen Individuum und einem VIP-Antikörper positiven Individuum wurde mittels Chromatographie auf DEAE- Zellulose, gefolgt von Ultrafiltration, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Das IgG oder das Test-Verdünnungsmittel (Endvolumen von 200 ul in 50 mM Tris-HCl, 100 mM Glycin, 0,025% Tween-20 und 0,1% Rinderserumalbumin, pH 8,0) wurde mit Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP (etwa 30 p) für steigende Dauer bei 38ºC inkubiert. Rinderserumalbumin und Tween-20 wurden in diese Inkubationen eingeschlossen, um adsorptive Verluste des Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP auf Glas- und Plastikoberflächen zu verhindern. Die Ausfällung mit Trichloressigsäure (TCA) (27) wurde als anfängliches Kriterium des Abbaus von Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP angewandt (6). Dementsprechend setzte man 1 ml TCA (Endkonzentration 10% v/v) zu den Reaktionsgemischen zu, die anschließend bei 3000 xg zentrifugiert wurden. Die Überstände wurden abgesaugt und die Radioaktivität in den Niederschlägen gemessen (Spektrometer Beckman Modell 5500). Bei dieser TCA-Konzentration fielen mehr als 90% des intakten Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP aus (das heißt fanden sich in dem TCA-unlöslichen Niederschlag). Werte für die VIP-Hydrolyse wurden aus der Radioaktivität berechnet, beobachtet als Zählrate pro Minute (CPM) in den TCA-fällbaren Fraktionen und zwar wie folgt:
(CPMTestpuffer - CPMAntikörper) · 100/CPMTestpuffer.
Verglichen zu 8% Hydrolyse des Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP, inkubiert mit nicht immunem IgG, wurden 73% des Peptids durch Behandlung mit immunem IgG hydrolysiert.
Die Fähigkeit des IgG, Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP zu hydrolysieren, ging durch Ausfällen mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat oder durch Ultrafiltration auf einer 100-kDa-Membran als Filter nicht verloren. Die Behandlung des IgG mit Anti-Human-IgG aus Kaninchen oder Behandlung bei 100ºC (10 Minuten) vor der Inkubation mit dem Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP zerstörte die hydrolytische Aktivität des IgG, wie über eine Reduktion der Radioaktivitätsmenge im Peak mit einer Retentionszeit von 10 Minuten angezeigt.
Die Behandlung von Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP mit immunem IgG für steigende Zeitspannen verringerte progressiv die Radioaktivitätsmenge, die von 10% TCA ausgefällt wurde (Ausgangs- Radioaktivität in jedem Röhrchen war 15.040 CPM), wie in Fig. 2 gezeigt. Nach Inkubation mit immunem IgG für 6 Stunden wurden 73% des ursprünglichen Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP nicht länger mittels TCA ausgefällt, verglichen mit nur 8% des Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP, das mit nicht immunem IgG inkubiert war. Der Abbau des Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP war pH-abhängig, und zwar mit einem optimalen pH-Wert von 8,0-8,5.
Kinetische Daten wurden durch Inkubieren von IgG mit steigenden Konzentrationen an nicht markiertem VIP, gemischt mit einer fixen Konzentration an Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIp als Tracer, für 2 Stunden bei 38ºC erhalten. Die Hydrolyse war mit steigenden VIP-Konzentrationen sättigbar und eine Auftragung von 1/Geschwindigkeit über 1/Substrat-Konzentration war linear, wie in Fig. 3 gezeigt, was anzeigt, dass die Reaktion der Michaelis-Menten-Kinetik entsprach (Daten angepasst an die Michaelis-Menten-Gleichung unter Anwendung des ENZFITTER (Elsevier)). Ein Km für die Reaktion von 37,9 nM, ermittelt über die Steigung der linearen Auftragung in Fig. 1, zeigte relativ stabile Antikörper-VIP-Bindungen an. Ein Scatchard-Plot der VIP-Bindung durch den Antikörper unter Bedingungen, die nicht zur VIP-Hydrolyse führten, war linear, wie in Fig. 4A gezeigt. Die Steigung für den Hill-Plot, gezeigt in Fig. 4B, war nahezu 1 (1,02). Diese Daten weisen auf eine einzige Antikörperklasse mit einer Kd 0,4 nM und Konzentration von 73,4 fM/mg IgG an (unter Annahme der Bivalenz des Antikörpers). Die kcat- und kcat/KmWerte fit die Hydrolyse, berechnet auf Basis der Hydrolysekinetik und der Antikörper-Konzentrationen, erhalten aus den Bindungsdaten, betrugen 0,26 Sekunde&supmin;¹ und 6,9 · 10&sup6; M&supmin;¹Sekunde&supmin;¹. Diese Werte zeigten an, dass der Anti-VIP katalytisch wirkt, um VIP hydrolysieren. Eine Wechselzahl von 0,26 Sekunde&supmin;¹ (das heißt etwa 16 Moleküle an VIP werden von einem Molekül an Antikörper pro Minute hydrolysiert) wurde berechnet. Diese Berechnung basierte auf der Gesamtzahl an Antikörpern, die an VIP binden konnten. In der Realität sind jedoch nicht alle Antikörper, die an VIP binden können, notwendigerweise zur katalytischen Hydrolyse von VIP befähigt. Daher ist die tatsächliche Wechselzahl wahrscheinlich größer als die berechnete.

Beispiel 4

Identifikation von Peptidfragmenten, resultierend aus der Hydrolyse von VIP, katalysiert von Anti- VIP-Autoantikörpern

Die Umkehrphasen HPLC von Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP, behandelt mit dem immunen IgG, zeigte eine Verringerung der Menge an intaktem Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP (Retentionszeit (RT): 25 Minuten) und das Auftreten eines früh eluierenden Peaks an Radioaktivität (RT: 10,0 Minuten), der von dem intakten Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP und von freiem ¹²&sup5;I (RT: 65-l,0 Minuten) wohl getrennt war (Fig. 5). Die Wärmebehandlung des IgG vor der Inkubation mit Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP führte zu einer Verringerung der Menge an Radioaktivität in dem Peak mit einer Retentionszeit von 10 Minuten. Wenn das Mono-(¹²&sup5;I Tyr¹&sup0;)-VIP in Puffer anstelle des IgG inkubiert war, wurde die Hauptmenge der Radioaktivität in Form von intaktem Peptid rückgewonnen und nur 13,9% in dem Peak mit einer Retentionszeit von 10 Minuten. Um die Fragmente von VIP zu reinigen, wurde nicht markiertes VIP (50 ug) mit 525 ug immunem IgG oder nicht immunen IgG, wie zuvor behandelt, ausgenommen, dass Rinderserumalbumin aus dem Reaktionsgemisch weggelassen wurde. Die Reaktionsmischungen wurden auf Extract Clean C18 Kartuschen (Alltech) extrahiert und anschließend einer Umkehrphasen-HPLC auf einer Novapak-C18-Säue (Waters) unterworfen, eluierend mit einem Gradienten von Acetonitril in Trifluoressigsäure. Die Absorption des Eluats wurde bei 214 nm beobachtet. Zwei A&sub2;&sub1;&sub4; nm absorbierende Peaks (bezeichnet als 1 und 2 in Fig. 6), die nach der Behandlung des VIP mit immunem IgG zu bemerken waren, fehlten in den mit nicht immunem IgG oder Testpuffer behandelten Peptidpräparationen. Diese Peaks wurden über eine zweite Runde der Umkehrphasen-HPLC unter Anwendung flacherer Giradienten für die Elution gereinigt (Fig. 7 und 8). Die Peptidfraktionen, die mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt worden waren, wurden getrocknet und unter Anwendung eines gepulsten Flüssigphasen-Sequenziergeräts von Applied Biosystems (Modell 477A) mit Online-Aminosäuredetektion über Phenylthiohydantoin sequenziert. Dieses Verfahren belegte unwiderleglich, dass die A&sub2;&sub1;&sub4;- absorbierenden Hauptpeaks, identifiziert als 1 bzw. 2 in Fig. 7 bzw. 8, VIP[1-16] und VIP[17-28] darstellten. Eine Massenspektrometrie mit schneller Atombombardienng (f.a.b.-Mess- Spektrometrie = fast atom bombardment mass spectrometry) des Peptids 2 in Fig. 8 und von intaktem VIP[1-28] wurde in dem positiven Jonenmodus auf einem VJ-Analytical-ZAB-2SE- Spektrometer (Beschleunigungspotenzial: 8 kV) (M-Scan) unter Anwendung von in 5% Essigsäure und Thioglycerol/Glycerol- oder m-Nitrobenzylalkohol-Matrizes gelösten Peptiden ausgeführt. Die Massenkalibration erfolgte mit Cäsiumjodid oder Cäsiumjodid/Glycerol. Die f.a.b.- massenspektrometische Analyse (Fig. 9) legte nahe, dass die Molekülmasse des Peptids 2 1393 Dalton betrug, entsprechend dem molekularen Ion von VIP[17-28]. Es wird angenommen, dass der zusätzlich beobachtete Peak mit einer Masse von 1415 Dalton wahrscheinlich das Natriumadukt des VIP[17-28] darstellt. Die Analyse von VIP[1-28] führte zu einem Signal bei 3325 Dalton, welches sehr gut dem molekularen Ion des Peptids entsprach. Das Aminosäuresequenzieren der gereinigten Fragmente, die durch Hydrolyse von VIP mit dem Autoantikörper erzeugt worden waren, zeigte, dass es sich bei der spaltbaren Bindung um Gln¹&sup6;-Met¹&sup7; handelte (6).

Beipiel 5

Induktion der katalytischen Aktivität beim Anti-VIP-Autoantikörper durch Entfernung des Inhibitors

A. Ultrafiltration

IgG wurde Chromatographie auf (i) Protein G, konjugiert an Sepharose, oder (ii) DEAE- Zellulose hergestellt. Das IgG (4 mg/ml) wurde auf einer YM-10-Membran mit einem mittleren Ausschluss-Molekulargewicht von 10.000 Dalton ultrafiltriert, und zwar unter Anwendung einer Amicon-Vorrichtung, Modell 8 MC, auf 27 mg/ml, auf 0,8 mg/ml rückverdünnt, und anschließend einem zweiten Ultrafiltrationszyklus unterworfen. Die Endkonzentration des auf diese Weise hergestellten IgG betrug 20 mg/ml. Das wie oben, jedoch ohne Ultrafiltration gereinigte IgG und wie oben mit Ultrafiltration gereinigte IgG wurden jeweils mit Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP in Radioimmun-Assay-Puffer bei 4ºC für 2 Stunden in Anwesenheit von steigenden, nicht markierten VIP-Konzentrationen inkubiert und die TCA-lösliche Radioaktivität, wie in Beispiel 4 beschrieben, ermittelt.
Fig. 10 zeigt an, dass die Behandlung von Mono-(¹²&sup5;I, Tyr¹&sup0;)-VIP mit IgG, das keiner Ultrafiltration unterworfen worden war, zu einer dosisabhängigen Zersetzung, jedoch bei niedrigem Level, des Peptids führte, beurteilt durch die ansteigende TCA-lösliche Radioaktivität über den Wert, der mit Testpuffer erhalten wurde. Das IgG, das der Ultrafiltration unterworfen worden war, zersetzte VIP besser als das IgG, das nicht ultrafiltriert worden war.

B. Dialyse

IgG (2 mg/ml), hergestellt durch Chromatographie wie in A oFen beschrieben, wurde unter Anwendung einer Dialysemembran mit einer Ausschlussgrenze von 12.000-15.000 Dalton für 4 Tage gegen 1.000 Volumen an Puffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM Glycin, pH 8,0, enthaltend 0,025 % Tween-20) mit täglichem Pufferaustausch (insgesamt drei Austausche) dialysiert. Wie mit der Ultrafiltration zersetzte IgG, das der Dialyse unterworfen worden war, das VIP besser als das IgG, das der Dialyse nicht unterworfen worden war.

C. Waschen nach Immobilisation auf Protein-G

IgG (1 mg in 0,5 ml Puffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM Glycin. pH 8,0, enthaltend 0,25% Tween-20)), hergestellt über Chromatographie wie in A oben beschrieben, wurde auf eine Protein- G-Sepharose-Säule aufgetragen (Absetzvolumen 3,3 ml), um das IgG auf dem Protein G zu immobilisieren. Das immobilisierte IgG wurde anschließend mit 135 ml eines Puffers mit Neutral- pH (50 ml Tris-HCl, pH 7,3) gewaschen, gefolgt von Elution mit einem Niedrig-pH-Puffer (100 mlvi Glycin-HCl, pH 2,7). Das saure Eluat wurde anschließend sofort neutralisiert und das IgG isoliert. Wie mit der Ultrafiltration zersetzte IgG, das den Waschungen mit neutralem Puffer unterworfen worden war, das VIP besser als IgG, das einer solchen Behandlung nicht unterworfen worden war.

D. Affinitätschromatographie auf VIP-Sepharose

IgG-Fraktionen, enthaltend VIP-hydrolytische Autoantikörper, wiesen relativ starke Bindung an VIP auf. Diese Eigenschaft wurde genutzt, um spezifisch katalytische VIP-hydrolytische Autoantikörper auf einer VIP-Sepharosesäule zu reinigen. Das IgG wurde aus dem Plasma eines menschlichen Individuums mittels Ammoniumsulfat-Fällung und DEAE-Zellulose- Chromatographie gereinigt (9). Das IgG war frei von detektierbaren Nicht-Immunglobulin- Materialien (6). Um die Affinitätschromatographiematrix herzustellen, wurde synthetisches VIP[1- 28] (10 mg), gemischt mit etwa 20 pg (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP, kovalent an 5 g CNBr-Sepharose (5 g; Pharmacia) in 0,1 M NaHCO&sub3;, pH 7, in 0,5 M NaCl für 2 Stunden bei 4ºC gekuppelt und nicht umgesetzte Gruppen auf dem Gel wurden mit 0,2 M Glycin in Kupplungspuffer abgestoppt (8). Die Kupplungseffizienz war größer als 90%, basierend auf dem Einbau des (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP. Etwa 90 mg IgG wurden mit 4,5 ml VIP-Sepharosegel bei 4ºC und 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, für 2 Stunden geschüttelt. Die Mischung wurde in eine Säule gegossen, das Gel mit Puffer gewaschen, bis der A&sub2;&sub8;&sub0; des Eluats (Empfindlichkeit 0,05 AUFS) auf die Grundlinie zurückkehrte, und gebundenes IgG mit 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,7, eluiert und sofort mit 1 M Tris-HCl, pH 9,0, neutralisiert. Antikörper-Konzentrationen wurden mittels Scans (A&sub5;&sub6;&sub2;) auf Silber gefärbten, nicht reduzierenden SDS-Gelen abgeschätzt unter Anwendung von authentischem IgG als Standard (Gilford Response II Spektrofotometer). Steigende Konzentrationen an authentischem IgG (2-20 ng pro Spur) zeigten einen linearen Anstieg der A&sub5;&sub6;&sub2;-Werte. Wie mit der Ultrafiltration, zersetzte das IgG, das der Affinitätschromatographie unterworfen worden war, das VIP besser als IgG, das keiner Affinitätschromatographie unterworfen worden war.

Beispiel 6 Herstellung von VIP-Homologen

Synthetische Peptidhomologe von VIP wurden zum Sichten auf inhibitorische Aktivität hergestellt. 10 synthetische Peptide (Fig. 11), entsprechend 7-meren, 16-meren und 14-meren linearen Untersequenzen von VIP wurden über die Festphasensynthese unter Anwendung im Stand der Technik bekannter Verfahren (29) an der Structure Care Facility der University of Florida, Gainsville, hergestellt und deren Identität durch Analyse der Aminosäurezusammensetzung bestätigt. Umkehrphasen-HPLC auf einer C18-Säule zeigte ein einzelnes A&sub2;&sub1;&sub4;-absorbierendes Peptid in jeder der Zubereitungen. Der Peptidgehalt jeder dieser Zubereitungen betrug > 80%. Das VIP[1-28] voller Länge war von Bachem.

Beispiel 7

Sichten der VIP-Homologen auf Inhibition des VIP-katalytischen Autoantikörpers

A. Sichten auf Bindungsaktivität

Die 10 synthetischen Peptide wurden auf die Fähigkeit, an (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP zu binden, gesichtet. Die Peptide wurden mit der Autoantikörper-IgG-Fraktion und (Tyr10-¹²&sup5;I)-VIP in einem Puffer inkubiert, der die VIP-Hydrolyse nicht gestattete, das heißt in 7,5 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 0,64% Natriumchlorid, 0,5% Rinderserumalbumin, 25 mM EDTA, 0,005% Bacitracin, 0,005 % Protaminsulfat, 0,073% Natriumacid und 0,025% Tween-20.
Das aus dem Plasma eines menschlichen Individuums gereinigte IgG war die Quelle des Autoantikörpers. Plasma, hergestellt durch Zentrifugation von Blut, wurde mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgefällt, das Präzipitat in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, rekonstituiert, gegen diesen Puffer dialysiert und das IgG mittels Chromatographie auf DEAE-Zellulose gereinigt (9). Das IgG zeigte eine einzelne Silber gefärbte Proteinbande auf SDS-Polyacrylamidgelen mit einer molekularen Masse von 150 kD, welche mit Peroxidase konjugiertem Anti-Human-IgG in Immunblots reagierte (6).
Die Scatchard-Analyse der IgG-VIP-Bindung legte nahe, dass das IgG einen einzelnen Typus an VIP bindendem Antikörper enthielt (6). Dieser Schluss wurde durch die Beobachtung gestützt, dass ein VIP-spezifischer Antikörper, gereinigt aus dieser IgG-Präparation, zur Hydrolyse des Mono-(Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP befähigt war.
Die Affinitätsreinigung des katalytischen Antikörpers erfolgte durch Chromatographie auf VIP, an CNBr-Sepharose kovalent gekuppelt, wie im Beispiel 5 beschrieben. Die gebundenen Antikörper wurden mit Säure eluiert (pH 2,7) und auf neutralen pH gebracht. Elektrophorese dieses Materials auf reduzierenden SDS-Polyacrylamidgelen zeigte zwei Silber gefärbte Proteinbanden mit Massen von 58 kD und 25 kD, anfärbbar mit Anti-Human-H-Ketten-Antikörpern (IgG) bzw. Anti-Human-L-Ketten-Antikörpern in Immunblots. Ein analytisches isoelektrisches Fokussieren und die Silberfärbung auf Phast-Gelen (pH-Gradient 3 bis 10; Pharmacia) zeigte eine Serie dicht benachbarter Banden mit pI 6,8-8,4, was eine begrenzte Antikörperpopulation anzeigt. Die affinitätsfraktionierten Autoantikörper hydrolysierten das (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I) -VIP (Km: 0,12 uM) an derselben Peptidbindung (Gln¹&sup6;-Met¹&sup7;) wie das ursprüngliche IgG (1), beurteilt durch Co-Elution des Reaktionsproduktes ((Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP[1-16], mit authentischem (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP[1-16] in der Analyse über Umkehrphasen-HPLC.
Bindungstests wurden bei 4ºC für 20 Stunden durchgeführt (6). Die durch 10% Trichloressigsäure nach Inkubation in Puffer und immunem IgG präzipitierte Menge an (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)- VIP war vergleichbar (85,6% bzw. 82,6% der Gesamtmenge an verfügbarer Radioaktivität), was anzeigt, dass das (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP unter diesen Bedingungen nicht von dem IgG gespalten wurde.
Das N-terminale Fragment VIP[1-16] zeigte bei einer Konzentration von mehr als 10&sup7;-fach über derjenigen des (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP keine Verschiebung der Bindung des radioaktiven Liganden durch den Autoantikörper. Im Gegensatz hierzu inhibierte das C-terminale Fragment VIP[15-28] die Bindung mit einer Potenz (KI = 1,25 nM) nahe derjenigen des Peptids voller Länge VIP[1-28] (KD = 0,3 nM) (Fig. 12; Daten, als Mittelwerte von Doppelbestimmungen, berichtigt um unspezifische Bindung, beobachtet in Anwesenheit von 1 uM VIP, wurden aus diesen Experimenten zusammengestellt). Die sättigbare Bindung, die ohne kompetitive Peptide beobachtet wurde, reichte von 4.053 bis 6.012 CPM und die unspezifische Bindung betrug in etwa 600 CPM. Die apparente KD oder KI für VIP, VIP[15-28] und VIP[22-28] wurden unter Anwendung der EBDA- und LIGAND-Programme (Elsevier) erhalten. Es wurde angenommen, dass (i) die Bindungsreaktion ein Gleichgewicht erreicht hatte, und (ii) die KD für I Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP und unmarkiertes VIP gleich waren. Die freie Energie der Bindung, ΔF, wurde berechnet als: ΔF = - RTInKA, worin R die Gaskonstante bei Normaltemperatur und Normaldruck, T die Reaktionstemperatur (277ºK) und KA die apparente Assoziationskonstante (1/KD oder 1/KI) darstellt. KI wurde aus der Gleichung berechnet: Kmapp = Km(1 + [I]/Ki), worin [I] die Inhibitor- Konzentration darstellt.
Von den verbleibenden sieben, ursprünglich bei Konzentrationen von je 500 uM getesteten kürzeren Peptiden inhibierten nur das VIP[22-28] und das VIP[18-24] den Autoantikörper an der Bindung von (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP. Die KI für VIP[22-28] betrug 242,1 uM. VIP[22-28] zeigte eine etwa 8-fach höhere Bindungspotenz als VIP[18-24], was nahe legt, dass die Reaktivität des letzteren Peptids auf der gemeinsamen Sequenz VIP[22-24] beruhen kann. Ungefähre Werte der Bindungsenergie für diese Peptide betrugen in kcal/Mol: VIP[1-28] 12,1; VIP[15-28] 11,3; und VIP[22-28] 4,6. Die Bindungsenergie der Reste 22-28 war substanziell, obwohl sie nur 38% derjenigen für das Gesamtlängenpeptid ausmachte.

B. Sichten auf Inhibition der katalytischen Anti-VIP-Aktivität durch VIP[22-28]

Da VIP[22-28] eine signifikante Bindung an den Autoantikörper zeigte, wurde dessen Fähigkeit, die katalytische Aktivität des Autoantikörpers zu inhibieren, bestimmt. Die Hydrolyse steigender Konzentrationen an VIP in Abwesenheit und Anwesenheit von VIP[22-28] wurde verglichen. (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP, 32 pM, wurden mit steigenden VIP-Konzentrationen gemischt und mit dem Autoantikörper, 50 ug IgG, in Abwesenheit und Anwesenheit von VIP[22-28] (100 uM) für 3 Stunden bei 38ºC behandelt. Die Auftragung des Kehrwerts der Geschwindigkeit der VIP-Hydrolyse über den Kehrwert der VIP-Konzentration war linear, was die Konformität mit der Michaelis-Menten- Kinetik anzeigt (Fig. 13; die Werte waren Mittelwerte von Doppelbestimmungen, angepasst an die Michaelis-Menten-Gleichung mit Hilfe des ENZFITTER-Programms (Elsevier)). Die Km und kcat- Werte für die VIP-Spaltung in Abwesenheit von VIP[22-28] betrugen 115 ± 14 nM bzw. 6,5 ± 0,3 Minute&supmin;¹. In der Anwesenheit von 100 uM VIP[22-28] war die apparente Km erhöht (158,6 ± 4, 4 nM) und war kcat unverändert (6,9 ± 0,2 Minute&supmin;¹), was eine kompetitive Inhibition der VIP-Hydrolyse nahe legt. Die KI für VIP[22-28], berechnet aus der Gleichung Kmapp = Km(1 + [I]/KI), worin [I] die Inhibitor-Konzentration darstellt, betrug 260 uM. Inhibition wurde in Anwesenheit eines Überschusses (> 300-fach in Gewicht) an Rinderserumalbumin beobachtet. Zusätzlich inhibierten 400 uM VIP[1-7], ein nicht bindendes Fragment, die VIP-Hydrolyse nicht.
6 ug VIP[22-28] wurden mit Testverdünner oder IgG unter Anwendung von Inkubationsbedingungen, die denjenigen identisch waren, die zum Hydrolysieren von VIP[1-28] genutzt worden waren, behandelt und das Reaktionsgemisch auf einer C18-Seppak-Kartusche extrahiert und mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert (6), und zwar unter Anwendung eines Gradienten von Acetonitril (8-64% in 45 Minuten) in 0,1% Trifluoressigsäure. Die Mengen an VIP[22-28] (Retentionszeit = 39,1 Minuten), die nach der Inkubation in Verdünner und IgG rückgewonnen wurden, waren nicht signifikant unterschiedlich, beurteilt über die Flächen der A&sub2;&sub1;&sub4;- absorbierenden Peptidpeaks, was anzeigt, dass VIP[22-28] nicht gespalten wurde.
VIP[22-28] enthält die spaltbare Peptidbindung (Gln¹&sup6;-Met¹&sup7;) nicht, es band jedoch, wie durch die obigen Daten gezeigt, den Autoantikörper und inhibierte die autoantikörper-katalysierte VIP-Hydrolyse.

Beispiel 8 Reinigung und Identifizierung natürlich auftretender Inhibitoren von gegen VIP gerichteten katalytischen Antikörpern

Das Ergebnis aus Beispiel 5 löste den Schluss aus, dass jedes der vier Induktionsverfahren, das heißt die Ultrafiltration, Dialyse, Waschen nach Immobilisierung auf Protein G und Affinitätschromatographie auf VIP-Sepharose, einen fest gebundenen Inhibitor entfernte, wodurch dem Autoantikörpefeine VIP-hydrolytische Aktivität verliehen wurde. Um den Inhibitor zu isolieren, zu reinigen und zu identifizieren, wurde das Ultrafiltrat, Dialysat, die Neutralpufferwaschungen aus der Protein-G-Säule oder die Pufferwaschungen aus der Affinitätschromatographie, enthaltend den Inhibitor, auf 3 ml konzentriert und auf einer Seppak-C- 18-Kartusche extrahiert. Das zurückgehaltene Material wird mit Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert, im Vakuum getrocknet und der Umkehrphasen-HPLC auf einer C-8- oder C-18-Säule unterworfen.
Aliquote Anteile der Säulenfraktionen werden auf Bindungsakiivität, wie in Beispiel 7A beschrieben, und auf inhibitorische Aktivität, wie in Beispiel 7B beschrieben, durch Mischen mit (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP und katalytischem IgG, Inkubation für 3 Stunden bei 38ºC und Ausfällen mit 10% Trichloressigsäure gesichtet. In Kontrollröhrchen wird die Hydrolyse des VIP in Testverdünner anstelle der Säulenfraktionen gemessen. Fraktionen, die inhibitorische Aktivität zeigen, werden gepolt und weiteren Trennverfahren unterworfen, um den reinen Inhibitor zu erhalten. Diese Trennverfahren schließen Ionenaustauschchromatographie und Chromatofokussierung (30) ein. Der reine Inhibitor wird der Aminosäureanalyse und der Peptidsequenzierung auf einem Applied Biosystems Sequenziergerät unterworfen. Sobald die Identität des Inhihitors bekannt ist, wird dieser in großer Menge unter Anwendung von Standardverfahren der Festphasenpeptidsynthese synthetisiert (29). Der synthetische Inhibitor wird anschließend zum spezifischen Inhibieren des katalytischen Autoantikörpers verwendet, resultierend in der Linderung der Pathogenese der Autoimmunstörung (Asthma), die durch den katalytischen Autoantikörper (Anti-VIP-Autoantikörper) verursacht wird.

Beispiel 9 Charakterisierung und katalytische Aktivität von IgG gereinigt mittels Affinitätschromatographie (Fraktionierung) auf VIP-Sepharose

A. VIP-Hydrolyse

(Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP (etwa 30 pM), gemischt mit steigenden VIP-Konzentrationen, wurde mit dem IgG oder Antikörpern, gereinigt mittels Affinitätschromatographie an VIP-Sepharose, wie in Beispiel 5D, für 3 Stunden bei 38ºC in 200 ul 0,05 M Tris-HCl, 0,1 M Glycin, pH 8, enthaltend 0,025% Tween-20 und 0,1% BSA, behandelt. Das IgG und die Antikörper, die in Hydrolysetests getestet wurden, wurden zuvor gegen 500 Volumen an Puffer für 4 Tage mit täglichen Pufferaustauschen dialysiert. Die Hydrolyse des VIP wurde über Messung der TCA löslich gemachten Radioaktivität berechnet, berichtigt um die Radioaktivität, beobachtet nach Inkubation in Testverdünner (6). Die Katalyse durch den Antikörper wurde in Abwesenheit und Anwesenheit von VIP[22-28] bestimmt. Die Daten wurden an die Michaelis-Menten-GIcichung mit Hilfe des ENZFITTER-Programms (Elsevier) angepasst. Die Umkehrphasen-HFLC der mit Antikörper behandelten Reaktionsgemische erfolgte auf einer C18-Säule (6).

B. (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP-Bindung

Mittels DEAE-Zellulose-Chromatographie hergestelltes IgG wurde auf die sättigbare (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP-Bindung getestet (9), und zwar in Abwesenheit und Anwesenheit steigender Konzentration an nicht markiertem VIP. Die apparente KD für VIP wurde unter Anwendung der EBDA- und LIGAND-Programme (Elsevier) bestimmt, und zwar unter der Annahme, dass (i) die Bindung ein Gleichgewicht erreicht hatte und (ii) die KD von (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP und unmarkiertem VIP identisch waren.

C. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und isoelektrisches Fokussieren (IEF)

Die Elektrophorese von Antikörper-Zubereitungen, behandelt mit 20 mM 2-Mercaptoethanol und 2,5% SDS (100ºC, 5 Minuten), erfolgte auf Phast-SDS-Gradientengelen (8-25%) (Pharmacia). Das Gel wurde mit Silber gefärbt (31). Für die Immunfärbung wurden die Proteine auf Nitrozellulose (BA85, Schleicher und Schuell) mittels Diffusionsblotting (30 Minuten) transferiert, die Membran mit Blockierungspuffer (0,02 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 3% BSA, 0,05% Tween-20) behandelt, anschließend mit Anti-Human-H-Ketten-Antikörper aus Kaninchen (IgG) (1 : 1.000) oder Anti-Human-L-Ketten-Antikörper (1 : 2.500) (Accurate) für 60 Minuten behandelt, mit Puffer gewaschen, mit Peroxidase konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG aus Ziege (1 : 1.000; Accurate) behandelt, wiederum gewaschen und schließlich mit 0,5 mg p-Aminobenzidin/ml (Sigma) und 0,03% Wasserstoffperoxid für 10-30 Minuten inkubiert. Die isoelektrische Fokussierung erfolgte auf Phast-IEF-Gelen unter Anwendung eines pH-Gradienten von 3-10, konstruiert mit Pharmalyten.

D. Charakterisierung des katalytischen Anti-VIP-Autoantikörpers

(Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP gegen VIP-Bindung wurde unter Anwendung eines IgG gemessen, der keine messbare VIP-hydrolytische Aktivität aufwies (das heißt IgG, der nicht der Ultrafiltration, Dialyse, Protein-G-Chromatographie oder Affinitätschromatographie auf VIP-Sepharose unterworfen worden war), beurteilt über die Menge an Radioaktivität, die in 10% TCA nach Inkubation in Testverdünner oder immunem IgG ausgefällt wurde (87,9% und 91,0%). Ein Scatchard-Plot der VIP-Bindung durch das IgG zeigte eine einzelne bindende Komponente (r = 0,99) mit einer KD = 0,3 nM und einer VIP-Antikörper-Konzentration von 184 fMol/mg IgG (Fig. 14; die in Fig. 14 Werte gezeigten sind Mittelwerte von drei Wiederholungen jeweils). Progressiv ansteigende (Tyt¹&sup0;- ¹²&sup5;I)-VIP-Hydrolyse durch steigende Konzentrationen des affinitäts-gereinigten Antikörpers wurde beobachtet, beurteilt durch die Menge an Radioaktivität, die in TCA löslich gemacht wurde (Fig. 15). Die SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen zeigte an, dass das affinitäts-fraktionierte Material aus 61 kD H-Ketten und 26 kD L-Ketten bestand, beurteilt mittels Silberfärbung und Reaktivität mit Anti-H- und Anti-L-Ketten-Antikörpern in Immunblots(Fig. 16). Das IEF-Profil der affinitäts-fraktionierten Zubereitung (pH-Bereich 3,0-10,5) zeigte einen eingegrenzten Bereich an Antikörperspezies (etwa 12 eng benachbarte Banden, fokussiert bei pH 6,9-8,4), verglichen mit nicht fraktioniertem IgG (unzählige Banden, fokussiert hauptsächlich bei pH 7,1-9,5).

E. Hydrolytische Spezifität und Katalyse durch VIP-Antikörper

Die hier verwendete IgG-Preparation hydrolysierte die Gln¹&sup6;-Met¹&sup7;-Bindung in VIP (32). Somit wird dann, wenn man (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VW als Substrat verwendet, ein radioaktives Fragment erzeugt, nämlich (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP[1-16]. Um deren hydrolytische Spezifizitäten zu vergleichen, wurden 100 ug unfraktioniertes IgG und 0,3 ug des affinitäts-gereinigten Antikörpers mit 210 pg (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP inkubiert und das Reaktionsprodukt mittels Umkehrphasen-HPLC charakterisiert (Fig. 17). Die Behandlung mit beiden Arten der Antikörper-Zubereitungen erzeugte ein einziges radioaktives Peptid mit einer Retentionszeit, die derjenigen von synthetischem ¹²&sup5;I-VIIP[1-16] identisch war (8,2 Minuten). Diese radioaktive Peptid war von nicht hydrolysiertem (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP wohl getrennt (Retentionszeit 21,5 Minuten). Diese Daten legten nahe, dass es sich bei dem von dem affinitäts-fraktionierten Antikörper und IgG erzeugten Peptid um (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP[1-16] handelt, und es wurde daher geschlossen, dass der affinitäts-gereinigte Antikörper wie nicht fraktioniertes IgG die Gln¹&sup6;-Met¹&sup7;-Bindung spaltet. Ein direkter Nachweis, dass der Antikörper katalytisch ist, wurde aus der Sättigungskinetik der VIP-Hydrolyse erhalten. Die affinitäts-fraktionierte Antikörper-Zubereitung wurde mit steigenden VIP-Konzentrationen und einer fixen (Tyr¹&sup0;-¹²&sup5;I)-VIP- Konzentration (30 pM) inkubiert und die in TCA löslich gewordene Radioaktivität gemessen. Auftragungen des Kehrwerts der Geschwindigkeit über den Kehrwert der VIP-Konzentration waren für affinitäts-fraktionierte Autoantikörper (66 ng) und für nicht fraktioniertes IgG (300 ug) im Wesentlichen linear, was Konformität mit der Michaelis-Menten-Kinetik nahe legt (Fig. 18). Der Km Wert für den affinitäts-fraktionierten Antikörper betrug 110 ± 3 nM, verglichen mit 112 ± 6 nM für unfraktioniertes IgG. Die Wechselzahl des Antikörpers (kcat), berechnet auf der Basis der Gesamtmenge an Protein im Test, betrugt 0,11 ± 0,1 Minute&supmin;¹. Ein Vergleich der spezifischen Aktivitäten (Vmax/ng Gesamtprotein) der affinitäts-gereinigten Antikörper-Zubereitung und mit von nicht fraktioniertem IgG zeigte einen 2.076-fachen Reinigungsfaktor.

F. Kinetische Untersuchung

Die Untersuchung der Sättigungskinetiken, die von der affinitäts-gereinigten Zubereitung gezeigt wurden, stellte einen direkten Beweis dafür bereit, dass der VIP-Antikörper ein Katalysator ist. Der Antikörper schien VIP relativ fest zu binden (Km = 110 nM), verglichen mit herkömmlichen Peptidasen (33) und gegen Hapten gerichteten katalytischen Antikörpern, die Km Werte üblicherweise im mikromolaren bis millimolaren Bereich aufweisen (34). Die anscheinend hoch affine Substratsbindungseigenschaft des VIP-Antikörpers ist ein wünschenswertes Merkmal, da sie wahrscheinlich stringente Substratspezifizität verleiht. Vorausgesetzt, dass die Hydrolyse der Peptidbindung eine energetisch anspruchsvolle chemische Reaktion darstellt, sind die berechneten Werte der Wechselzahl (kcat = 0,11 Minute&supmin;¹) und die kinetische Effizienz (kcat/Kin = 1,1 · 10&sup6; M&supmin;¹ Minute&supmin;¹) des VIP-Antikörpers beeindruckend. Obwohl das IEF-Profil der affininiiäts-fraktionierten VIP-Antikörper einen eingeschränkten Bereich an Antikörpern zeigte, bleibt es möglich, dass die Zubereitung nicht homogen ist. Somit stellt die für die affinitäts-fraktionierte Antikörper-Zubereitung gemessene kcat (0,11 Minute&supmin;¹) einen Minimalwert dar. Der theoretische kcat-Wert des VIP-Antikörpers, der in nicht fraktioniertem IgG vorhanden ist (Vmax/Menge an Antikörper, abgeschätzt aus dem x-Achsen-Abschnitt des Scatchard-Plots) betrug 6,5 Minute&supmin;¹. Im Vergleich betrugen die kcat- und kcat/Km Werte, die für einen Amidase-Antikörper berichtet wurden, gezogen gegen ein vermutetes Analogon eines Übergangszustandes, 0,08 Minute&supmin;¹ bzw. 1,4 · 10² M&supmin;¹ Minute&supmin;¹ (35). Ein Antikörper, der die Gly-Phe-Bindung mit Hilfe eines Metalls als Co-Faktor spalten kann, wird als echter Katalysator beschrieben, und zwar mit einer kcat von 0,04 Minute&supmin;¹, seine Sättigungskinetiken sind jedoch nicht beschrieben (36).
Andere Ausführungsformen der Erfindung werden dem Fachmann aus einer Betrachtung dieser Beschreibung oder bei Ausführung der hierin offenbarten Erfindung offensichtlich werden.

Claims

1. Pharmazeutische Zubereitung. umfassend:

- einen Inhibitor, der (i) einen katalytischen Autoantikörper inhibiert, der die Spaltung des vasoaktiven intestnalen Polypeptids (VIP) katalysiert und (ii) ausgewählt ist unter (a) einem Fragment eines Substrats für den katalytischen Antikörper, (b) einem Analogon von (a) und (c) einem Analogon eines Substrats für den katalytischen Antikörper; und

- einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

2. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 1, worin der Inhibitor die Spaltung der Peptidbindung Gln¹&sup6;-Met¹&sup7; im VIP inhibiert.

3. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 2, worin der Inhibitor VIP (22-28) umfasst.

Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, die einen Inhibitor umfasst, der einen katalytischen Antikörper daran hindert, eine chemische Reaktion eines Substrats zu katalysieren, welcher Inhibitor jedoch nicht selbst benutzt worden ist, um den katalytischen Antikörper hervorzurufen, wann der Inhibitor ausgewählt ist unter (a) einem Fragment eines Substrats für den katalytischen Antikörper, (b) einem Analogon von (a) und (c) einem Analogon eines Substrats für den katalytischen Antikörper, das Verfahren umfassend die Schritte:

(a) Synthetisieren eines oder mehrerer Fragmente des Substrats; oder

(b) Synthetisieren eines oder mehrerer Analoga von einem oder mehreren Fragmenten des Substrats; oder

(c) Synthetisieren von einem oder mehreren Analog des Substrats;

(d) Serientesten bzw. Screenen des einen oder der mehreren Fragmente oder Analoga, synthetisiert in den Schritten (a)-(c) zum Identifizieren eines Fragments oder Analogons das den katalytischen Antikörper inhibiert und

(e) Kombinieren des Fragments oder Analogons mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin der katalytische Antikörper die Bildung oder Spaltung einer Peptidbindung katalysiert.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin das Substrat ein Peptid, ein Protein, ein Hormon, ein Neurotransmitter oder ein neurohumoraler Faktor ist.

7. Verwendung eines Inhibitors eines katalytischen Anti-VIP-Antikörpers bei der Herstellung eines Medikaments für Asthma.

8. Verwendung eines Inhibitors eines katalytischen Autoantikörpers bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung, wobei der Inhibitor (a) ein Fragment eines Substrats für den katalytischen Autoantikörper, (b) ein Analogon von (a) oder (c) ein Analogon eines Substrats für den katalytischen Autoantikörper darstellt.