DE69829466T2

DE69829466T2 - Biomolekularer prozessor

Info

Publication number: DE69829466T2
Application number: DE69829466T
Authority: DE
Inventors: Robert E. Fields
Original assignee: Fields Robert E Menlo Park
Current assignee: Fields Robert E Menlo Park
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1998-03-23
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2018-03-24
Also published as: ATE291637T1; EP0972080A2; AU6779098A; DE69829466D1; WO1998042874A2; WO1998042874A3; EP0972080B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Labor- und Klinikgeräte, Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Zielmolekülen aus biologischen Fluiden sowie Geräte zum Kombinieren von Zielmolekülen mit anderen Komponenten einer Prüfmischung.
Hintergrund der Erfindung
In den Vereinigten Staaten sterben mehr als 500 000 Menschen pro Jahr an Sepsis, einer oft verhängnisvollen Komplikation nach operativen Eingriffen, weshalb die Identifizierung eines Bakterienstamms erforderlich ist, bevor eine wirksame Behandlung erfolgen kann. Die Identifizierung durch Zellkultur kann bis zu zwei Wochen dauern. Falls verfügbar, könnte eine Reihe von schnellen Diagnosetests auf der Basis von Nukleinsäuren eingesetzt werden, um zuerst die Familie, dann den Stamm eines Krankheitserregers zu bestimmen. Solche Tests sind allerdings nicht im Routineeinsatz, da der notwendige Arbeitsaufwand für die Isolierung von Nukleinsäuren hoch ist und sehr schnelle Nukleinsäure-Tests fehlen.
Das Auftauchen arzneimittelresistenter Stämme von Viren und Bakterien macht es notwendig, dass die Stämme identifiziert werden, bevor eine wirksame Medikation verordnet werden kann. Die Kultur und die Identifizierung von Mycobacteria-Stämmen ist beispielsweise oft schwierig und langwierig und ein nicht behandelter Patient kann während dieser Zeit andere anstecken. Ein Schnelltest auf Nukleinsäurebasis bezüglich M. tuberculosis mit Differenzierung des Stamms könnte einen entscheidenden Beitrag zur weltweiten Bekämpfung der Tuberkulose leisten.
Latent krebsartige Gewebe können aufgrund von anomalen zellulären Gensequenzen entdeckt werden und auf der Basis der Kenntnis solcher Sequenzen kann eine wirksame Behandlung erfolgen.
Nukleinsäure-Tests, die rasche Information über virale Genotypen in Patientenblut liefern, würden das wirksame Management der HIV-Infektion dadurch unterstützen, dass antivirale Medikamenten-Kombinationen je nach dem Erscheinen mutanter Genotypen des HIV geändert werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung bereit, die die Automatisierung der Reinigung von Nukleinsäuren aus Blut oder Plasma ermöglicht und für ein schnelles Kombinieren von gereinigter Nukleinsäure mit anderen Komponenten von Prüfmischungen sorgt, um spezielle Nukleinsäure-Sequenzen zu detektieren oder quantitativ zu bestimmen, indem sie Techniken wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR) einsetzt oder die Genchip-Technik benutzt. Andere Zielmoleküle als Nukleinsäuren können gereinigt und identifiziert werden durch ein Verfahren, das die erfindungsgemäße Vorrichtung einsetzt.
Alle Reinigungs- und Detektionsverfahren finden in abgeschlossenen Bereichen statt, die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen sind. Dieses Merkmal macht die Erfindung besonders geeignet für den Einsatz als klinisches Diagnoseinstrument, um schnelle Patienteninformation mit einem minimalen Kontaminierungsrisiko für das Klinikpersonal und mit minimalem Risiko einer Testkontaminierung durch „Überbleibsel"-DNA zu erhalten.
Aktuelle Reinigungsverfahren für Nukleinsäuren
Nukleinsäuren sind durch den Einsatz eines breiten Spektrums von Reagentien und Verfahren isoliert und gereinigt worden, je nach der Quelle der Nukleinsäure und dem vorgesehenen Einsatz der gereinigten Nukleinsäure. Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäure aus biologischen Proben umfassen 1) Zell-Lyse durch Einsatz einer Kombination von mechanischem Aufbrechen, Detergentien, proteolytischen Enzymen, chaotropischen Reagentien oder anderen Chemikalien, entweder gefolgt von 2) Extraktion des Lysats mittels Phenol oder eines anderen organischen Lösungsmittels, oder 3) Zentrifugieren zur Klärung des Lysats, gefolgt von 4) Ausfällen der Nukleinsäure oder 5) Adsorption der Nukleinsäure auf Festphasenmaterialien, gefolgt von 6) Waschen der Festphasenmaterialien und 7) Eluieren der gebundenen Nukleinsäure von der Festphase, oder 8) Zentrifugieren der ausgefällten Nukleinsäure und 9) Wiederauf schlämmen des Pellets, oder 10) Reinigung der Nukleinsäure durch Gel-Elektrophorese, 11) Ausschneiden des Nukleinsäurenstreifens aus dem Gel oder 13) Herstellen gereinigter Nukleinsäure mittels zweier oder mehrerer Schritte von Zäsiumchlorid-Dichtegradient-Zentrifugieren mit 14) Wiedergewinnen der Nukleinsäure, und 15) Entfernen der Salze oder Änderung des Nukleinsäurepuffers mittels Dialyse, Gel-Chromatographie oder Spin-Säulen.
Diese Verfahren werden von geschultem Personal von Hand durchgeführt, wobei Verwirbelungsgefäße, handbetätigte Pipettoren, Zentrifugen, Gel-Elektrophorese-Geräte, heiße Wasserbäder, Vakuumabsaugung für die Entfernung von Überständen nach der Zentrifugierung usw. verwendet werden. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse eines Labors hängt oft von der Erfahrung eines einzelnen Technikers im Umgang mit Flüssigkeiten ab sowie von den unterschiedlichen Verzögerungen, die zwischen zahlreichen Schritten liegen können, wenn ein Techniker mehrere Verfahren gleichzeitig im Labor durchführt.
Um den enzymatischen Abbau der Nukleinsäuremoleküle während der Reinigung zu vermeiden, sind Enzym-Inhibitoren verwendet worden, um das Aufschließen von RNAse und DNAse in den Lysaten abzublocken. Cox (in Cox, R.A. (1968) „The use of guanidinium chloride in the isolation of nucleic acids" Methods Enzymol. 12B: 120.) zeigte, dass eine hohe molare Konzentration von Guanidin-Salz nicht nur sekundäre Zellstrukturen aufbricht, wodurch die Freisetzung der Nukleinsäuren erleichtert wird, sondern dass es aufgrund seiner Wirkung als kraftvolles Chaotrop auch die Wirkung der RNAse hemmt. Infolgedessen haben Guanidin-Salze, insbesondere Guanidin-Thiocyanat, weitverbreitete Verwendung bei den Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren gefunden.
Boom (in Boom, R., Sol, C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L., Wertheim-van Dillen, P.M.E. und van der Noordaa,; J. (1990) „Rapid and simple method for purification of nucleic acids" J. Clin. Microbiol. 28 (3), 495.) untersuchte die Möglichkeit, eine Ausgangsprobe mit einer Suspension von Kieselerde-Partikeln oder Diatomeen in Guanidin-Thiocyanat (GuSCN) zu kombinieren. Die Wiedergewinnung von Nukleinsäuren aus Ausgangsmaterialien mit Hilfe dieses Verfahrens erwies sich als problematisch. Booms U.S. Patent Nr. 5,234,809, erteilt an Akzo, N.V., beschreibt das Mi schen einer Nukleinsäure-haltigen Probe mit einer chaotropischen Substanz und einer Nukleinsäure-bindenden Festphase, das Abtrennen der Festphase und das Waschen der Festphase. Das von Boom beschriebene Reinigungsverfahren für Nukleinsäuren wird mit Hilfe von manuellen Verfahren durchgeführt, wie etwa dem Aufwirbeln einer Suspension von Kieselerde-Partikeln, bevor von Hand Ausgangsmaterial zugegeben wird, Zentrifugieren, Entfernen von Überständen durch Vakuumabsaugung, Pipettieren von Waschlösungen, Aufwirbeln von Pellets, um sie vor dem weiteren Zentrifugieren wieder in Waschlösung zu suspendieren, Inkubieren eines Probenrohrs in einem Wasserbad oder Heizblock, usw.
Auf Zentrifugieren beruhende Verfahren können durch den Einsatz von Spin-Rohren oder Spin-Säulen vereinfacht werden, in denen Zielmoleküle nach ihrer Freisetzung mittels Detergentien, Enzymen oder Chaotropen an ein Festphasenmaterial auf dem Boden eines Rohres gebunden werden, das in ein zweites Zentrifugenrohr gesetzt wird. Die Festphase wird gewaschen durch Auftragen einer Waschlösung auf ihre Oberseite und durch Zentrifugieren des verbundenen Rohrpaares, was bewirkt, dass die Waschlösung durch die Festphase hindurchgeht und im zweiten Zentrifugenrohr aufgefangen wird. Die Zielmoleküle werden in einem Zentrifugenrohr aufgefangen, indem eine Eluier-Lösung auf die Oberseite der Festphase gegeben und das Rohrpaar zentrifugiert wird, um das Eluat aufzufangen.
Obwohl der Absaug-Schritt durch den Einsatz von Spin-Rohr-Techniken ausgeschaltet wird, ist die Spin-Rohr-Methode immer noch arbeitsaufwendig und für die Automatisierung ungeeignet. Infolge der relativ langen Zeit, die für die Durchführung dieser und anderer herkömmlicher Standardverfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren erforderlich ist und infolge der arbeitsintensiven Art der Verfahren erhöhen diese Verfahren die Gesamtkosten der Durchführung von Nukleinsäure-Diagnosetests.
Es sind Versuche gemacht worden, Teile der Techniken zur Reinigung der Nukleinsäuren zu automatisieren, wie etwa das Zugeben von Reagentien, das Verdünnen, Absaugen und Mischen von Flüssigkeiten mittels digitaler Spritzenpumpen, Pipettoren und Robotik. Die U.S. Patente Nr. 4, 488,241 und 4, 510,684, erteilt an die Zymark Corp. Und das U.S. Patent Nr. 5,104,621 erteilt an Beckman Instruments, Inc., beschreiben automatisierte Systeme, die auswechselbare Werkzeuge und Greifarme ha ben, um kooperierende Anlagenteile von Laboreinrichtungen zu bedienen, was es ermöglicht, sonst manuelle Verfahren durch das Robotik-Gerät nach einem vom Benutzer eingegebenen Computerprogramm ausführen zu lassen. Diese Patente zeigen den Einsatz von automatisierten Allzweck-Robotik-Systemen, die für den Einsatz bei einem breiten Spektrum von chemischen und Labor-Verfahren bestimmt sind. Diese Erfindungen sind so konzipiert worden, dass sie möglichst flexibel sind und sind nicht speziell für die schnelle Isolierung von Nukleinsäuren oder anderen Zielmolekülen oder das Kombinieren von gereinigter Nukleinäsure mit anderen Komponenten einer Prüfmischung gemacht.
Die Isolierung von Nukleinsäuren aus Flüssigkeiten, die Infektionserreger wie Bakterien und Viren enthalten, verlangt strenge Bearbeitungsmethoden, um Kontaminierung und Infektion von Klinikpersonal zu vermeiden. Um solche Risiken zu minimieren, ist für Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren, die offenes Pipettieren und Zentrifugieren einschließen, vorgeschrieben, dass solche Verfahren unter einem Schutzgehäuse durchgeführt werden.
Die Bedingung, dass solche speziellen Schutzeinrichtungen und andere Instrumente vorhanden sein müssen, die für die Reinigung von Nukleinsäuren notwendig sind, beschränkt diese Verfahren gegenwärtig auf Laboratorien und Kliniken. Beispielsweise muss Blut, dass in entfernten Gebieten der Welt gesammelt wurde, zur Reinigung der Nukleinsäuren und zur Untersuchung rasch in die urbanen Gebiete transportiert werden, da das Blut Enzyme enthält, die die zu isolierenden Nukleinsäuren abbauen. Wenn Nukleinsäuren an Ort und Stelle aus Blut isoliert werden könnten, wären die so erhaltenen gereinigten Nukleinsäuren chemisch stabil und könnten mit vermindertem Abbau-Risiko zurückgebracht werden.
Deshalb wäre es wünschenswert, einen biomolekularen Prozessor bereitzustellen, der nicht den Einsatz manuellen Pipettierens und Zentrifugierens erforderte und weniger arbeitsaufwendig wäre als aktuelle Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren.
Es wäre auch wünschenswert, einen biomolekularen Prozessor bereitzustellen, der während des Reinigungsprozesses die Nukleinsäure-haltige Probe von der Umgebung abschließt, um so das Risiko einer Infektion des Personals und einer Kontaminierung der Umgebung zu reduzieren.
Es wäre auch wünschenswert, einen biomolekularen Prozessor bereitzustellen, der Nukleinsäuren oder andere Zielmoleküle aus frischem vollständigen Blut, Plasma, Sputum, Urin, Samen, Gewebeproben, Kot, Bakterien- oder Zellkulturen isolieren kann.
Es wäre auch wünschenswert, einen biomolekularen Prozessor bereitzustellen, der gereinigte Nukleinsäuren oder andere Zielmoleküle mit Komponenten eines Test kombinieren kann, um solche Zielmoleküle zu detektieren oder zu quantifizieren.
Es wäre auch wünschenswert, einen biomolekularen Prozessor bereitzustellen, der einzelne Proben oder eine Vielzahl von Proben bearbeiten kann und der bei seinem Betrieb vollständig automatisch arbeitet.
Aufgaben der Erfindung
Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Beschränkungen der früheren Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren zu überwinden, indem eine Nukleinsäure enthaltende Probe mit einem Lyse-Reagens kombiniert wird in einem Inkubationsgefäß, aus dem alle Nukleinsäure bindenden Substanzen ausgeschlossen sind, damit die Nukleinsäuren vollständig in die Lysat-Lösung freigesetzt werden können, bevor die Nukleinsäure wiedergewonnen wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, den notwendigen Einsatz von manuellen oder Fachwissen erfordernden Techniken auszuschalten, wie etwa Verwirbeln, Pipettieren, Absaugen, Zentrifugieren, Einsatz von Spin-Säulen, Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, Supension von Pellets oder Einsatz von Vakuum-Vielfachsystemen für die Reinigung der Nukleinsäure.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln, um eine Probe automatisch in die erfindungsgemäße Vorrichtung durch eine Öffnung zu ziehen, die sofort anschließend geschlossen werden kann, um die Kontaminierung der Umgebung durch die Probe zu verhindern.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln, um die Probe in der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem Lyse-Reagens gründlich zu mischen; von Mitteln zur Erwärmung und zur Regelung der Temperatur dieses Lysat-Gemischs; von Mitteln zur Entfernung dieses Lysats aus der Inkubationskammer; von Mitteln, die bewirken, dass dieses Lysat durch eine Festphasenmatrix läuft, auf deren Oberfläche Zielmoleküle gebunden werden können und dadurch aus diesem Lysat entfernt werden; von Mitteln zum Waschen dieser Festphasenmatrix mittels geeigneter Waschflüssigkeiten; von Mitteln zur Erwärmung und zur Regelung der Temperatur dieser Waschlösungen; und schließlich von Mitteln, um diese Festphasenmatrix abzustreifen und die Zielmoleküle mittels einer geeigneten Eluier-Flüssigkeit zu eluieren, sowie von Mitteln zur Erwärmung und zur Regelung der Temperatur dieser Eluier-Flüssigkeit.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, die Isolierung und Reinigung von Nukleinsäure und anderen Zielmolekülen direkt aus Blut, Plasma, Sputum, Urin, Samen, Gewebeproben, Kot, Bakterien- oder Zellkulturen durch voll automatisierte Vorrichtungen zu erreichen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung bereitzustellen für das schnelle Kombinieren einer gereinigten Nukleinsäure oder anderer Zielmoleküle mit anderen Komponenten einer Nukleinsäure oder einer anderen Prüfsubstanz für die Detektierung oder Quantifizierung dieser Zielmoleküle.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung bereitzustellen für die Isolierung, Reinigung und Detektion von Nukleinsäuren oder anderen Zielmolekülen, die schnell ist und außer der erfindungsgemäßen Vorrichtung selbst keinen Einsatz von Laborgeräten erfordert.
Zusammenfassung der Erfindung
Zum einen liefert die Erfindung nach den Ansprüchen 1 und 10 eine Vorrichtung und ein automatisiertes Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren oder anderen Zielmolekülen aus unbearbeiteten Ausgangsmaterialien. Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel für die Isolierung und Reinigung von vollständiger Nukleinsäure liefert eine Vorrichtung, in die Ausgangsmaterial, wie etwa vollständiges Blut, Plasma oder eine Zellsuspension gezogen wird und aus der gereinigte Nukleinsäure automatisch abgegeben wird, ohne dass Pipettieren, Zentrifugieren oder Handarbeit notwendig sind.
Die errfindungsgemäße Vorrichtung kann eine einzelne Probe oder gleichzeitig eine Vielzahl von Proben bearbeiten, wobei ein Spendegerät eingesetzt wird, das mit einer Anordnung von Röhren oder Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte zusammenarbeitet, die Mittel zum Erwärmen und zum Mischen der Inhalte dieser Röhren oder Vertiefungen umfasst, in denen Proben, die Nukleinsäuren oder andere Zielmoleküle enthalten, mit Lyse-Reagentien kombiniert werden, und aus denen gereinigte Zielmoleküle entnommen werden können, ohne dass manuelles Pipettieren, Zentrifugieren, Absaugen oder Handarbeit erforderlich sind.
Die für die Isolierung und Reinigung vorgesehenen Zielmoleküle können zu einer einzigen Art gehören oder eine Kombination von RNS, DNS, Proteinen oder anderen Molekülen sein.
Zum anderen liefert die erfindungsgemäße Vorrichtung Testbausätze, die aus Vorrichtungen mit Einweg-Komponenten und Reagentien nach Anspruch 21 bestehen. Diese ermöglichen die Reinigung, Detektierung oder Quantifizierung von Zielmolekülen, und zwar entweder mit einer einzelnen Testprobe oder mit einer Vielzahl von Testproben in der Weise, dass das Risiko von Kontaminierung der Umgebung oder des mechanischen Teils der erfindungsgemäßen Vorrichtung möglichst gering gehalten wird. Bevorzugte Ausführungsbeispiele sind in den anhängenden Ansprüchen 2 bis 9 und 11 bis 20 beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorstehenden und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich. In der Beschreibung wird auf bevorzugte Ausführungsbeipiele der Erfindung Bezug genommen. Diese Ausführungsbeispiele stellen nicht notwendigerweise den vollen Umfang der Erfindung dar.
1 ist eine Perspektivansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
2 ist ein schematische Ansicht einer Einweg-Extraktionsvorrichtung entsprechend der Erfindung, besonders geeignet für die Verwendung bei der Bearbeitung von Einzelproben von Zielmolekülen.
3 ist eine schematische Ansicht der Ventil-Komponenten für die erfindungsgemäße Vorrichtung.
4 ist eine schematische Ansicht einer Einweg-Extraktionsvorrichtung, besonders geeignet für die Verwendung bei der Bearbeitung von Einzelproben von Zielmolekülen, wobei die Probe automatisch aus einer Kapillarröhre gezogen wird.
5 ist ein schematisches Diagramm der Betriebs-Hardware eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung.
6 ist eine schematische Ansicht eines Einweg-Bestandteils der erfindungsgemäßen Vorrichtung, besonders geeignet für die Verwendung für die Bearbeitung von Einzelproben von Zielmolekülen, wobei die gereinigten Nukleinsäuren automatisch mit Bestandteilen einer Nukleinsäuren-Prüfmischung kombiniert werden, bevor sie in einen PCR-Thermocycler oder eine andere Prüfvorrichtung für Nukleinsäuren eingeleitet werden.
7 ist eine Perspektivansicht des mechanischen Hardware-Bestandteils eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung, das für die Bearbeitung einer Vielzahl von Proben verwendet wird.
8A ist eine Schnittansicht einer Pipettorenspitze zum Extrahieren eines Zielmoleküls, besonders geeignet für die Verwendung bei einer Vielzahl von Proben.
8B ist eine Schnittansicht einer Pipettorenspitze zum Extrahieren eines Zielmoleküls.
Die 9A, B und C zeigen eine Extraktions-Pipettorenspitze beim Extraktions-, Wasch- und Eluierungs-Schritt.
10A ist eine Perspektivansicht einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, die aus einem Kunststoffmaterial gebildet ist.
10B ist eine schematische Ansicht der Anordnung der Vertiefungen der 10A.
10C ist ein Schnittansicht entlang der Linie 2-2' der 10B.
Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen
Mit Bezug auf die 1 umfasst ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung einen mechanischen Aktuator 101, in den eine Einweg-Vorrichtung 105 zum einmaligen Gebrauch eingerastet werden kann, und zwar mittels Verbindungsstücken 70, 71, die in entsprechende Verbindungsstücke 70', 71' in der Vorrichtung 105 eingreifen. Über Röhren 114 können Reagentien 111, 112, 113 in den Aktuator 101 gezogen werden. Die Vorrichtung 105 ist mit einer Öffnung A versehen, die für die Aufnahme einer Probe für eine Analyse geöffnet werden kann, mit einer Öffnung B, die mit einer Inkubationskammer, einem Thermocycler oder einem anderen Bearbeitungsgefäß verbunden werden kann, mit einer Öffnung C, aus der gereinigte Zielmoleküle zum Auffangen oder zur weiteren Analyse ausgegeben werden können, und mit einer Öffnung D, durch die Reagentien aus dem Aktuator 101 zur Reinigung und Identifizierung von Zielmolekülen eintreten können. Die in einer Probe enthaltenen Moleküle sind innerhalb der Vorrichtung 105 vollständig abgeschlossen und können nicht auf die Oberflächen des Aktuators 101 austreten oder damit in Berührung kommen.
2 zeigt bevorzugte Ausführungsbeispiele einer Extraktionsvorrichtung 106 und 107, deren Komponenten der Absperrhahn 108 und das T-Verbindungsstück 109 sind.
Die 3E – 3J zeigen Querschnitte von verschiedenen Ventiltypen. Der Ventilkörper 206 hat Öffnungen bei A, B, C und D, die wahlweise abgeschlossen oder verbunden werden können mittels des beweglichen Teils 207, das einen oder mehrere innere Durchgänge 218 hat, die im Innern dieses Teils gebildet sind.
3E zeigt das Teil 207 in einer solchen Stellung, dass eine interne Verbindung zwischen allen Öffnungen A, B, C, D verhindert wird. 3F zeigt diejenige Stellung des Teils 207, die eine Verbindung zwischen den Öffnungen B und D erlaubt; dementsprechend zeigt 3G die Position des Teils 207, die eine Verbindung der Öffnungen A und C erlaubt; zahlreiche Mittel sind bekannt, um Paarungen oder Kombinationen von Öffnungen mittels eines beweglichen Teils 207 auszuwählen.
3H zeigt ein drehbares Teil 208, das einen Handgriff 213 hat und einen Durchgang 209, der durch das Teil 208 hindurchgebohrt ist. Die Öffnungen A und C können intern durch Drehen des Teils 208 verbunden werden, um den Durchgang 209 mit diesen Öffnungen in Linie zu bringen. Alternativ kann das bewegliche Teil 210 gebohrte Durchgänge 211 und 212 haben, die Öffnungen innerhalb des Körpers 206 miteinander verbinden, indem die Ausrichtung in Linie durch eine geradlinige Bewegung des Teils 210 anstelle einer Drehbewegung erfolgt, wie in 3J gezeigt ist. Die Einweg-Vorrichtung 105 der vorliegenden Erfindung kann einen beliebigen Ventiltyp umfassen und diese Ventile können eine beliebige Anzahl von wählbaren Öffnungen haben.
Die in 2 gezeigte Vorrichtung 106 besteht aus zwei Absperrhähnen 108, die mit zwei T-Verbindungen 109 abdichtend zusammengefügt sind und die Vorrichtung 106 mit vier Öffnungen A, B, C, D bilden. Zahlreiche Wege zur Verbindung der Öffnungen können durch Drehen des beweglichen Absperrhahn-Teils 126 gewählt werden, um interne Durchgänge in der Vorrichtung miteinander in Verbindung zu bringen oder abzublocken. Die bevorzugten T-Verbindungen 109 sind mit engen internen Durchgangsbohrungen 121 versehen sowie mit männlichen Luer-Anschlussstücken, die Ringe 120 haben, und weiblichen Luer-Anschlussstücken, die interne Öffnungen 122 ha ben, die die Tiefe regulieren, in die ein passendes Luer-Stück eindringen kann, wie bei 123 und 124 gezeigt ist, wodurch das interne Volumen der zusammengebauten Vorrichtung 106 reguliert wird.
Die Vorrichtung 107 kann aus drei Bestandteilen gebildet werden, nämlich dem Körper 110 und den beweglichen Teilen 116 und 115, die so bewegt werden können, dass die Öffnungen A, B, C und D verbunden oder getrennt werden können, je nach der Stellung dieser beweglichen Teile, wie in den 3I und 3J gezeigt ist.
4 zeigt ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Einweg-Vorrichtung 301, mit der Nukleinsäure aus einer Probe extrahiert und gereinigt werden kann, die mittels einer Kapillanöhre 2 in die erfindungsgemäße Vorrichtung eingeführt wird. Die Probe kommt nur mit der Einweg-Vorrichtung 301 in Kontakt, die an den mechanischen Aktuator 101 (1) gekoppelt ist. Der mechanische Aktuator 101 hat keinen Kontakt mit einer Probe oder mit Molekülen, die aus einer Probe abgezogen werden. Die Kapillanöhre 2, die eine Probe mit Zielmolekülen enthält, wird in die Öffnung 5 eingeführt, bis die Außenränder des Röhrenendes hineingedrückt sind und an der inneren trichterförmigen Wand der Öffnung bei 18 verschlossen werden. Die Wandfläche besteht vorzugsweise aus einem Elastomermaterial. Das Ventil 10 wird so gedreht, dass die Probe aus der Kapillanöhre in die Vorrichtung 301 abgezogen werden kann. Nach Einführen der Probe in die Vorrichtung wird diese Probe durch Schließen des Ventils 10 von der Umgebung isoliert. Ein Kontakt der Probe mit Reagentien in dem mechanischen Aktuator 101 wird verhindert durch eine Barriere aus alternierenden Volumina von Flüssigkeit 21 und Luft, das heißt, einer segmentierten Flüssigkeitsbarriere, wie bei 20 gezeigt.
Für das Extrahieren von Nukleinsäuren oder anderen Zielmolekülen wird die Vorrichtung 301 mittels einer Verbindung zwischen den Anschlussstücken 4 und 51 (5) am Aktuator 101 befestigt. Der Mikroprozessor 55 veranlaßt, dass das Antriebselement 52 mit dualem Motor des Absperrhahns das Ventil 9 (4) in eine Stellung bringt, in der alle Öffnungen blockiert sind, und das Ventil 10 in eine Stellung bringt, in der die Öffnungen B und C verbunden sind, wie in 4 gezeigt ist. Dann veranlasst der Mikroprozessor 55, dass das Ventil 57 für die Auswahl des Reagens das Lyse-Reagens R1 58 selektiert, und dass die digitale Pumpe 59 anfängt, das Reagens 58 in Rohr 6 der Einweg-Vorrichtung 301 abzugeben. Wird das Reagens 58 weiterhin gepumpt, tritt es in das Rohr 8 und in die Inkubationskammer 15 ein.
Die Kapillarröhre 2, die die Probe zum Extrahieren von Nukleinsäure oder anderer Zielmoleküle enthält, wird in die Gummidichtung 18 eingeführt. Der Mikroprozessor 55 veranlasst das Antriebselement 52 mit dualem Motor des Absperrhahns, den Absperrhahn 10 in eine Stellung zu bringen, in der die Öffnungen A und C verbunden sind und die Öffnung B verschlossen ist. Dann setzt der Mikroprozessor 55 die Pumpe 59 in Gang, um das erforderliche Probenvolumen abzuziehen, was dazu führt, dass der Inhalt der Kapillarröhre 2 in das Ventil 10 und in den Durchgang 14 gezogen wird. Dann bewirkt der Mikroprozessor, dass das Ventil 10 in die Position zurückkehrt, in der B und C verbunden sind, und veranlasst, dass der Inhalt der Kapillarröhre 2 durch die internen Durchgänge der Vorrichtung in die Inkubationskammer 15 hineingepumpt wird. Die digitale Spritzenpumpe 59 kann dann den Inhalt von 15 durch rasches Abziehen und Zugeben einer geeigneten Menge der Mischung in einer Hin- und Herbewegung mischen, wodurch das Lyse-Reagens und die Probenlösung in 15 durch Umrühren gemischt werden. Die Inkubationsphiole sitzt in einer erwärmten Vertiefung des thermostatisch gesteuerten Heizblocks 19, der die Lyse-Mischung erwärmt, um die Freisetzung der Nukleinsäuren zu unterstützen.
Es wird sich als vorteilhaft erweisen, dass eine beliebige Menge Lyse-Reagens aufgegeben werden kann, gefolgt von Stickstoffgas oder Luft, die in die Spritzenpumpe 59 von 60 aus aufgenommen werden. Ein solches Gas kann verwendet werden, um Reagentien und Proben durch die Vorrichtung 301 hindurch zu bewegen, und bestimmte Mengen eines solchen Gases können zwischen verschiedene Reagentien injiziert werden, um die Reagentien zu trennen und zu verhindern, dass die Reagentien eine gemeinsame flüssige Schnittstelle haben und sich dadurch vermischen. In der folgenden Zusammenfassung wird Gas in dieser Weise verwendet, um die verschiedenen Reagentien zu trennen; allerdings werden, um es kurz zu fassen, die Details der Ventil- und Spritzenbewegungen, die für den Einsatz dieses Gases notwendig sind, nicht dargestellt. Es ist klar, dass zahlreiche Kombinationen verschiedener Reagentien und Gase und der Einsätze von Ventilen und Spritzenpumpen alle im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen.
Wenn Nukleinsäuren oder andere Zielmoleküle in der Inkubationskammer 15 freigesetzt worden sind, zieht die Pumpe 59 die Lyse-Mischung aus 15 in das Rohr 6. Das Innenvolumen von 6 ist so gewählt, dass es einen Schutzraum bei 20 gibt, der mit einer segmentierten Flüssigkeitsbarriere gefüllt ist, um die Teile der Vorrichtung, die nicht Einwegteile sind, von Kontakt mit Molekülen im Probenlysat abzuschotten, das in das Rohr 6 gezogen wurde.
Nun wird der Absperrhahn 10 geschlossen und der Absperrhahn 9 wird so gedreht, dass die Öffnungen E und D verbunden sind. Die Pumpe 59 drückt das Lysat durch das Filterelement 21 zur Adsorption des Zielmoleküls, durch den Absperrhahn 9 in den Durchgang 11 und in die Kammer 15. Der Mikroprozessor 55 veranlasst das Reagenswahl-Ventil 57, ein Waschreagens, R3 62, zu selektieren, und bewirkt, dass die digitale Pumpe 59 beginnt, das Reagens 62 in die Vorrichtung 301 zu geben, und zwar durch den Filter 221, wodurch dieser Filter und die gebundenen Zielmoleküle gewaschen werden. Falls erforderlich, kann das Waschreagens R3 im Kolben 415 aufgefangen und durch die Heizvorrichtung 419 erwärmt werden. Tatsächlich kann das Erwärmen des Waschreagens durchgeführt werden, bevor das Lysat durch den Filter 221 hindurchgeht. In jedem Fall kann der Filter abgewaschen werden durch eine Hin- und Herbewegung der Pumpe 59 und die Waschflüssigkeit wird im Kolben 15 aufgefangen. Nun veranlasst der Mikroprozessor 55 das Reagensauswahl-Ventil 57 ein Eluierreagens, R4 64, zu selektieren und R4 in die Vorrichtung 301 zu geben. Wenn das Eluierreagens in das Filterelement 221 eingedrungen ist, erleichtert die Pumpe 59 das Freisetzen von Nukleinsäuren oder anderer Zielmoleküle durch abwechselndes Zugeben und Abziehen eines kleinen Volumens, wodurch Flüssigkeitswirbel innerhalb des Filterelements 221 entstehen, bevor der Absperrhahn 9 in die Stellung gedreht wird, in der die Öffnung E mit der Öffnung F verbunden ist und die Zielmoleküle in dem geringen Volumen der Phiole 415 aufgefangen werden. Das Eluierreagens R4 kann im Kolben 415 aufgefangen und durch die Heizvorrichtung 419 erwärmt werden, bevor das Lysat durch den Filter 221 hindurchgeht. In diesem Fall können Zielmoleküle vom Filter eluiert werden, indem ein erwärmtes Eluierreagens verwendet wird. Andere Reagentien R5, R6 sind jeweils bei 68, 67 vorgesehen.
Es wird sich als vorteilhaft erweisen, dass eine Probe in die Vorrichtung 301 mittels einer Pipettenspitze anstelle einer Kapillarröhre 2 eingeführt werden kann, und dass ein Schlauch am Verbindungsstück 5 vorgesehen werden kann, so dass eine in einer Röhre enthaltene Probe in die Vorrichtung hinein gehebert werden kann. Zusätzlich könnte eine geschützte Nadelvorrichtung vorgesehen werden, um den Gummistopfen einer Probenröhre zu durchstechen, um eine Probe aus einer solchen verschlossenen Röhre zu ziehen. Derartige Variationen liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Darüber hinaus könnten Reagentien enthaltende Einweg-Spritzen anstelle der oben beschriebenen digitalen Spritzen und Auswahl-Ventile vorgesehen werden. Jede Konfiguration einer Einweg-Vorrichtung, einschließlich Einweg-Spritzen, Absperrhähne, Anschlussstücke und Rohre, die während der Reinigung der Zielmoleküle durch das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren mit Molekülen in Berührung kommen, fällt in den Rahmen der Erfindung.
6 ist eine schematische Darstellung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels einer Einweg-Vorrichtung 302, die zur Bestimmung spezifischer Nukleotid-Sequenzen in einer Probe oder zur Bestimmung der Menge der Zielmoleküle eingesetzt wird. Gereinigte Nukleinsäuren oder andere Zielmoleküle werden durch das Rohr 421 aus der Phiole 420 aufgenommen und mit anderen Komponenten einer Prüfsubstanz in Phiole 15 kombiniert. Das entnommene Volumen der Zielmoleküle kann mit Hilfe der digitalen Pumpe 59 in Kombination mit dem Ventil 10 genau bestimmt werden. Für PCR-Untersuchungen erhalten die Ziel-Nukleinsäuren eine Anfangserwärmung durch Vorheizen der Master-mix-Lösung in der Heizvorrichtung 19. Nach gründlichem Mischen wird das Prüfgemisch in die Vorrichtung 430 geleitet, die im Fall der PCR eine Thermocycling-Einheit für die Amplifikation der Zielsequenzen ist. Aber auch andere Vorrichtungen zur Probenbehandlung können eingesetzt werden. Im Falle der PCR werden anschließend an den Amplifikationsschritt die amplifizierten Produkte in die Vorrichtung 425 geleitet, um die amplifizierten Produkte zu detektieren. Die Vorrichtung 425 kann ein Hybridisierrohr oder ein DNS-Chip sein. Waschreagentien und Detektionsreagentien können je nach Bedarf ausgegeben werden für die Auslösung von Fluoreszenz- oder Chemielumineszenz-Reaktionen in der Vorrichtung 425. Nach Beendigung der Messungen wird die Einweg-Vorrichtung 302 sicher entsorgt, ohne die Umgebung kontaminiert zu haben.
Das eben beschriebene Ausführungsbeispiel für die Durchführung der Prüfung und Detektion gemäß der Erfindung kann mit dem vorher beschriebenen Ausführungsbei spiel für die Durchführung der Reinigung gemäß der Erfindung gekoppelt werden, um spezifische Nukleinsäure-Sequenzen automatisch aus einer Ausgangsprobe detektieren und quantitativ bestimmen zu können. Der gekoppelte Einsatz der zwei Ausführungsbeispiele der Erfindung liegt im Rahmen der Erfindung.
7 zeigt ein Ausführungsbeispiel 501 der erfindungsgemäßen Vorrichtung, das vorteilhaft ist, wenn zahlreiche Proben eines Materials, das Blut, Plasma oder eine andere Nukleinsäure, oder ein anderes Zielmolekül enthält, bearbeitet werden sollen. Die Proben werden zur Bearbeitung in Röhren-Gestellen oder Reihenaufstellungen 41 oder in den Vertiefungen einer Mikroplatte angeordnet. Der Robotik-Arm 40 verteilt das Lyse-Reagens R1 26 mittels einer Ventil- und Spritzenpumpe, die hinter 39 angeordnet ist, und zwar durch das Rohr 38 und in jede Inkubationsvertiefung in der Mikroplatte 22 hinein, die in einem erwärmten Block 43 sitzt. Der Robotik-Arm 40 nimmt bei 42 eine reine Pipettorenspitze 24 aus einem Vorratsgestell für Spitzen auf und bringt einen Teil einer ersten Probe in 41 zu einer Inkubationsvertiefung in 22. Das Mikroprozessor-Steuergerät der Vorrichtung mischt die Probe gründlich mit dem Lyse-Reagens durch verwirbelndes Ansaugen der Mischung, wie vorher beschrieben. Die Pipettorspitze wird abgeworfen und eine frische Spitze wird aufgenommen, um die nächste Probe mit Lyse-Reagens zu versetzen. Nachdem alle Proben mit Reagens versetzt und gemischt und die Lysate erhitzt worden sind, um Nukleinsäure oder andere Zielmoleküle freizusetzen, nimmt der Robotik-Arm 40 eine reine Extraktions-Pipettorspitze 70 auf, 8A oder 8B, die in Gestell 44, 7, bereitsteht.
Die Extraktorspitze
Das Gehäuse der Extraktorspitze 70 (8) besteht vorzugsweise aus inertem Kunststoff und hat eine Eingangsöffnung 71 mit geringem Innenvolumen und mit einem Innendurchmesser von üblicherweise zwischen 0,3 mm und 0,8 mm, einen Sammelhohlraum 72 mit geringem Totvolumen, ein poröses Festphasenmaterial 73, das Nukleinsäuren oder andere Zielmoleküle binden kann und diese Moleküle aus Lösung entfernen kann, wenn eine Lysat-Lösung durch das poröse Material 73 hindurchgeht. Die Mittel zum Binden von Zielmolekülen können hydrophob, ionisch oder mit irgendeiner anderen Wechselwirkung sein. Vorzugsweise sind die Extraktorspitzen 70 auch mit einem porösen hydrophoben oder Spüllösung enthaltenden Element 74 ver sehen, durch das Luft hindurchgehen kann, das aber keine Nukleinsäuren oder andere Zielmoleküle passieren lässt, wodurch die Kontaminierung des Pipettier-Instruments verhindert wird. Die Spitze 70 des Extraktionspipettors hat ein trichterförmiges Anschlussstück 75, damit sie dichtschließend in einen Pipettor eingreifen kann. 8B zeigt ein anderes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Festphasen-Bindematerial 76, das die Form von Partikeln haben kann und das zwischen inerten porösen Lagen 77 und 78 gehalten wird. Oberhalb der porösen Lage 78 ist das Reagens 79 in fester Form gezeigt, das mit einem Lysat oder einer anderen Flüssigkeit in Kontakt kommen kann, nachdem diese durch das Bindematerial gegangen ist. Das Reagens 79 kann bei Kontakt mit einer Flüssigkeit wechselwirken, wobei es aktive Agentien wie Pufferverbindungen oder Enzyme oder Prüfkomponenten auflöst oder freisetzt, oder es kann unlösliche Elemente wie Kieselerde oder Latexderivat-Partikel in die Flüssigkeit abgeben. Jede Art oder Kombination von Filterung oder selektivem Bindeelement und jede Art von selbständigem Reagens oder Partikeln, die an der obengenannten Stelle, wie gezeigt, gehalten wird, fällt in den Rahmen dieser Erfindung.
Der Robotik-Arm 40 der erfindungsgemäßen Vorrichtung nimmt eine reine Extraktions-Pipettoren-Spitze 70 auf, die in Gestell 44 liegen, 7, und zieht Lysat (80, 9A) aus einer Inkubationsvertiefung in 43. Das Lysat kann mehrere Male zugegeben und aufgenommen werden (wie bei 81, 9B gezeigt), um die vollständige Adsorption der Zielmoleküle an das Element 73 zu gewährleisten, 9. Anschließend wird die Lysat-Lösung in die Vertiefung 22 zurückgeleitet und der Robotik-Arm 40 wäscht das Filterelement 73, wobei Waschlösung R2 27 verwendet wird, die vorher in die Vertiefungen bei 23 gegeben wurde. Das Filterelement 73 kann mehrfach gewaschen werden, bei 82 (9B), wobei Reagentien verwendet werden, die in zahlreichen Vertiefungen bei 23 bereitgehalten werden. Schließlich wird eine geringe Menge Eluier-Reagens R3 28, üblicherweise 20 bis 100 Mikroliter, in einem Quadranten einer Platte bei 23 verwendet, um den Filter 73 hin- und her abzustreifen, um Zielmoleküle zu entfernen, bevor die Zielmoleküle 84 bei 46 in Reagenzgläser oder Prüfgemische abgegeben werden, je nach dem gerade durchgeführten Verfahren.
Automatisierte Bearbeitung und Lagerung von Prüflösungen
Spezialrohre, Reihen von Rohren oder Vertiefungen in Mikroplatten können derartig geformt werden, dass die Lagerung von gefrorenen Lösungen erleichtert wird. Das Mischen solcher Lösungen nach dem Auftauen und das verwirbelnde Mischen der Flüssigkeitskombinationen in solchen Rohren ermöglicht Kombinationen für Prüfungen. Die 10A und 10B zeigen eine Mikroplatte 90. 10 C zeigt ein Detail eines Querschnitts durch zwei in der Platte 90 gebildete Vertiefungen. Es ist klar, dass dieser gleiche Querschnitt in einer Röhre oder Flasche geformt sein kann oder in einer Reihe von verbundenen Röhren, und dass die Ausführungsbeispiele in den Rahmen dieser Erfindung fallen.
Asymmetrische Vorsprünge 91 können an den Innenfläche der Rohre oder Vertiefungen ausgebildet sein, die eine erste Fläche 92 haben, die in einem relativ steilen Winkel vorspringt, und eine zweite Fläche 93, die mit einem weniger steilen Winkel geformt ist. Diese Vorsprünge können an der Innenfläche einer Röhre in einer Folge angeordnet sein, wobei die scharfen Kanten so ausgerichtet sind, dass die Vorsprünge homolog aufeinander folgen, und eine Reihe von Vorsprüngen kann vom oberen Ende, dem breiteren Ende eines im allgemeinen kegelförmigen Rohres oder einer Vertiefung, nach unten zum Boden hin spiralförmig entlang der Bahn 94 verlaufen und zum oberen Ende hin entlang der Bahn 95 zurücklaufen, wie gezeigt. Wenn ein Rohr mit derartigen Vorsprüngen in vibrierende Bewegung versetzt wird, ist es klar, dass eine Flüssigkeit im Rohr entlang der Bahn 94 hinuntergedrückt und entlang der Bahn 95 hochgedrückt wird. Durch diese Anordnung verursacht eine einfache geradlinige Bewegung die Wirbelbewegung einer Flüssigkeit in einem Rohr. Es ist auch klar, dass eine Lösung, die in einem Rohr mit solchen Vorsprüngen eingefroren ist, in dem Rohr an ihrem Platz festgehalten wird und nicht ausfallen kann, da die Vorsprünge innerhalb der gefrorenen Substanz liegen. Eine bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendete Mikroplatte hat vorzugsweise Kerben 96, die zwischen den Plattenreihen gebildet sind, um das Abbrechen von Reihen für ihre gesonderte Verwendung zu erleichtern, wenn nicht alle Vertiefungen in der Platte verwendet werden sollen.
Der Robotik-Arm 40 verwendet Spitzen 24, um Reagentien 29, 30, 31, 32 für eine Prüfung in die Vertiefungen einer Vorratsmikroplatte 90 an Stelle 46 hineinzugeben und zu kombinieren, die auf einem Temperatur-geregelten Mikroplatten-Block 45 liegt, wobei die Temperatur eines derartigen Blocks, der vorzugsweise durch Widerstandsheizung erwärmt und durch thermoelektrische Kühlung gekühlt wird, durch den Mikroprozessor des Geräts reguliert wird. Nach der Behandlung der Prüflösungen können die einzelnen Lösungen in den Vertiefungen der Platte in situ eingefroren werden, indem die Blocktemperatur unter den Gefrierpunkt der Mischung heruntergefahren wird. Diese Möglichkeit ist vorteilhaft und nützlich für das Präparieren, Einfrieren und Lagern von mehreren Platten mit „Master-mix" Prüflösung, bevor Zielmoleküle extrahiert werden sollen, oder für das Einfrieren und Lagern von Mikroplatten, die gereinigte Nukleinsäuren oder andere Zielmoleküle nach der Reinigung enthalten, oder für das Einfrieren und Lagern von Mikroplatten, die vollständige „Master-mix"- Prüfgemische und gereinigte Nukleinsäuren oder andere Zielmoleküle enthalten. Solche gefrorenen Platten können anschließend leicht und sicher zu einem anderen Ort gebracht werden, beispielsweise zum PCR-Thermocyclieren, ohne dass man befürchten muss, dass geringe Flüssigkeitsmengen unterwegs durch Spritzer verlorengehen.

Claims

Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens zur Isolation und Reinigung eines Zielmoleküls aus einem Ausgangsmaterial wie Blut, Plasma, Urin, Samen oder Zellsuspension, das eine Zelle aufweist, die das Zielmolekül enthält, wobei die Vorrichtung umfasst: a) einen ersten Teil, der nicht mit dem Ausgangsmaterial oder Molekülen, die von dem Ausgangsmaterial abstammen, in physischen Kontakt gelangt, wobei der erste Teil die Bewegung von Fluiden innerhalb innerer Fluidwege eines zweiten, wegwerfbaren Teils steuert, wobei der erste Teil Folgendes umfasst: eine digitale Pumpe (59), ein Mehrwegventil (57) und eine Vielzahl von Reagens-Behältern (59-60, 62, 64, 67, 68), so dass der Betrieb der Pumpe in Verbindung mit dem Öffnen einer ausgewählten Öffnung in dem Mehrwegventil bewirkt, dass ein ausgewähltes Reagens innerhalb eines inneren Fluidwegs des zweiten Teils strömt und mit dem Ausgangsmaterial in Kontakt gelangt, und wobei ein rasches Hin- und Herpumpen eines Fluids in einem inneren Fluidweg ein Mischen und Umrühren von Mischungen von Reagenzien und Proben bewirkt; Mittel zum Erhitzen und Steuern der Temperatur von Reagenzien, die dem zweiten Teil zugeführt werden; und wenigstens eine duale Ventilbetätigungseinrichtung (52), die duale Schrittmotoren umfasst, wobei jeder Motor eine Bewegung eines drehenden Absperrhahngriffs oder eines linear bewegbaren Ventilglieds eines entsprechenden Ventils (9, 10) bewirkt, das in dem zweiten Teil vorhanden ist; und b) den zweiten, wegwerfbaren Teil, der leicht an dem ersten Teil befestigt oder von diesem gelöst werden kann und der eine Inkubationskammer (15) umfasst, in die das Ausgangsmaterial gezogen wird und in der das Ausgangsmaterial durch Kontakt mit einem Lysereagens lysiert wird und aus der isoliertes und gereinigtes Zielmolekül durch ein Festphasen-Filtermittel abgeführt wird, wobei der zweite Teil außerdem innere Flu idwege für eine Bewegung von Probe und Reagenzien sowie bewegliche Ventilglieder von zwei Ventilen (9, 10), die in den Fluidwegen angeordnet sind, umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der zweite Teil einen Abschnitt umfasst, der zur Bildung einer Abdichtung mit dem Ende eines Kapillanohrs oder eines anderen kleinen Rohrs zusammenwirkt, in dem das Ausgangsmaterial gehalten wird, wobei der zweite Teil ein Fluid-Anschlussstück umfasst, das abdichtend mit dem ersten Teil der Vorrichtung verbunden werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der Ausgangsmaterial in den wegwerfbaren zweiten Teil durch eine Röhrenleitung gezogen wird, deren Ende in einer Flüssigkeitsprobe platziert wird, die in einer Probenröhre oder einer Mikrotitrierplatte gehalten wird.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der das Ausgangsmaterial in den wegwerfbaren zweiten Teil durch eine Nadel gezogen wird, die einen Elastomerstopfen einer Probenröhre durchsticht.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der der wegwerfbare zweite Teil zwei 4-Wege-Absperrhähne und zwei untere Totvolumen-T-Verbindungen zusammen mit daran befestigten Röhren, Filtern und Glasfläschchen umfasst, wobei die T-Verbindungen mit Stempeln an männlichen Luer-Anschlussstücken und entsprechenden Sockeln in weiblichen Luer-Anschlussstücken ausgebildet sind, um die Reproduzierbarkeit des Innenvolumens der Verbindungseinrichtungen beim Zusammenbau zu vergrößern.
Vorrichtung nach Anspruch 5, bei der die Absperrhahngriffe des wegwerfbaren zweiten Teils von zwei Motoren gedreht werden, die zusammen an einer einzelnen Platte befestigt sind, wobei der Abstand zwischen den Achsen der beiden Motoren gleich dem Abstand zwischen den Achsen der beiden Absperrhahngriffe ist; wobei die Vorrichtung weiterhin mit Antriebsadaptern versehen ist, die es ermöglichen, dass jeder Absperrhahngriff in dem Adapter einrastet und dadurch durch den entsprechenden Motor gesteuert werden kann, wobei es möglich ist, dass jeder Absperrhahn unabhängig von dem anderen betrieben wird und jede beliebige Kombination von Absperrhahnöffnungen blockiert oder miteinander verbunden wird.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der der wegwerfbare zweite Teil Ventile umfasst, die linear betatätigt werden und durch innere Kanäle verbunden sind, die in einem einzelnen Einrichtungsgehäuse ausgebildet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, mit der ein Test an einem gereinigten Zielmolekül durchgeführt werden kann, wobei die Vorrichtung umfasst: einen wegwerfbaren Abschnitt, in den gereinigte Zielmoleküle gezogen und mit Testreagenzien kombiniert werden; und eine Testkomponente wie einen Thermocycler, Fluoreszenzdetektor oder Genchip, deren Betrieb von dem ersten Teil (a) der Vorrichtung gesteuert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 8, bei der der wegwerfbare Abschnitt mit dem wegwerfbaren Teil (b) verbunden ist, wodurch es ermöglicht wird, die Zielmoleküle zu reinigen und nachfolgend von der Vorrichtung gesteuert vollständig zu untersuchen.
Verfahren zur Isolation und Reinigung eines Nukleinsäure-Zielmoleküls, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, ein Ausgangsmaterial, das das Zielmolekül umfasst, in eine Vorrichtung gemäß einem der vorigen Ansprüche einzuführen und die Vorrichtung zu verwenden, um das Zielmolekül zu isolieren und zu reinigen.
Verfahren nach Anspruch 10, das die Verwendung eines Lysereagens umfasst, das eine Konzentration eines chaotropen Reagens, die größer ist als 5 mol, sowie eine Konzentration von 0,1%-5% eines nichtionischen Detergens enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das chaotropische Reagens aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Urea, Guanidin-Isothiocyanat oder Kaliumiodid besteht.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem das nichtionische Detergens Octylphenoxypolyethoxyethanol ist.
Verfahren nach Anspruch 10, das die Verwendung eines Nukleinsäure-Bindefilters umfasst, der Fasern oder Partikel von Polystyrol, Nitrocellulose, Glas oder Quarz enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem Zielmoleküle unter Verwendung von Lysereagenzien eingefangen werden, die Sonden enthalten, die an die Zielmoleküle gebunden werden können.
Verfahren nach Anspruch 15, das nach dem Umrühren und Erhitzen der Lysemischung die Hinzufügung eines weiteren Reagens umfasst, um die Lysemischung rasch abzukühlen und ihre Lösungsmittelumgebung zu ändern, um die Bindung der Sonden an die Zielmoleküle zu fördern und zu bewirken, dass die Lysemischung durch einen porösen Festphasenfilter hindurchgeht, der die Sonden und die Zielmoleküle, die von den Sonden eingefangen wurden, binden kann.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Sonden RNS, DNS, PNS oder andere Moleküle sind, die selektiv an die Zielnukleinsäuresequenzen gebunden werden können, wobei die Sonden einen zweiten Funktionsabschnitt aufweisen, der nicht selektiv an die Zielmoleküle gebunden wird, und wobei der Filter ein entsprechendes Molekül aufweist, das an den zweiten Funktionsabschnitt gebunden werden kann.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der zweite Funktionsabschnitt Biotin oder einen polyA-Schwanz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, bei dem der Filter Avidin oder polyT-Nukleotide aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, bei dem die Zielmoleküle Nukleinsäuresequenzen sind, die Sonden 5'-biotinylisierte Oligonukleotide mit ei ner Länge zwischen 20 und 40 Nukleotiden sind, die zu der Ziel-Nukleinsäuresequenz komplementär sind, das weitere Lysereagens wenigstens 0,7-molaren Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 aufweist, und der Filter zum Binden der Sonden modifizierte Avidinrückstände enthält, die gebundenes Biotin unter leicht sauren Bedingungen freisetzen können.
Satz zum Durchführen des Verfahrens nach Anspruch 10, wobei der Satz einen wegwerfbaren Teil (b) der Vorrichtung gemäß Anspruch 1 sowie solche Lyse-, Wasch- und Eluierungsreagenzien umfasst, die erforderlich sein können, um das Nukleinsäurereinigungsverfahren durchzuführen.