DE69827837T2

DE69827837T2 - Antigenvektoren bestehend aus multilamellarförmigen bläschen

Info

Publication number: DE69827837T2
Application number: DE69827837T
Authority: DE
Inventors: Patrick Mahy; Brigitte Delord; Joelle Amedee; Olivier Freund; Didier Roux; Rene Laversanne; Sophie Gaubert; Dominique Kaiserlian
Original assignee: Capsulis SA
Current assignee: Capsulis SA
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-17
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-09-18
Also published as: EP1024830A1; ES2234152T3; CA2304824A1; AU744308B2; FR2769022B1; EP1024830B1; DE69827837D1; AU9169798A; FR2769022A1; JP2001518452A; WO1999016468A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Antigenvektoren in Form multilamellarer Bläschen und Zusammensetzungen, welche Antigene einschließen, die in den Bläschen eingekapselt sind.
Mehr als 100 Jahre nach der Entdeckung der Infektionserreger durch Louis Pasteur ist nachstehende Frage noch immer aktuell: Wie kann das Immunsystem dazu gebracht werden, dauerhaft gegen eine Infektion unter vollständig sicheren Bedingungen wirksam zu sein? Bei den Forschungsarbeiten geht es nicht nur um die Entwicklung neuer Impfstoffe, sondern auch um eine Verbesserung von bereits bestehenden, wobei die Anzahl von Injektionen verringert werden soll.
Heutzutage sind Virusimpfstoffe abgeschwächte lebende Viren. Diese Strategie hat sich gegen Bakterien als weniger erfolgreich erwiesen, weil bis dato ein einziger abgeschwächter Bakterienimpfstoff verwendet wird: BCG. Dank der molekularbiologischen Techniken, welche es ermöglichen, die Virulenzfunktion der Krankheitserreger zu modifizieren, hat der Ansatz der Abschwächung der Mikroorganismen enorme Fortschritte gemacht. Dennoch ist es schwierig, die Abschwächung der Virulenz und eine wirksame Stimulierung der Immunabwehr miteinander zu vereinbaren. Die so genannten molekularen Impfstoffe auf der Grundlage von gereinigten Antigenen erfordern die Mitwirkung von Adjuvansen, wobei in Bezug auf diese Adjuvanse noch viele Forschungsarbeiten durchzuführen sind. Zum Beispiel wurde der erste Impfstoff dieser Art gegen Hepatitis B im Jahre 1987 ausgehend von einem Virus-Hüllprotein (Antigen HBs) entwickelt, das durch Tierzellen erzeugt wird. Diese molekularen Impfstoffe sind noch nicht sehr zahlreich, da gereinigte Antigene schnell durch den Organismus eliminiert werden. Zudem sind gereinigte Antigene, die alleine injiziert werden, nicht sehr effizient und erfordern die Verwendung von Substanzen, welche ihre Erkennung durch das Immunsystem fördern und ihren Abbau verlangsamen: die Adjuvanse. Zurzeit ist Aluminiumhydroxyd Al(OH)₃, das 1926 entdeckt wurde, ein beim Menschen zugelassenes Adjuvans. Neue Substanzen wurden im Laufe der vergangenen Jahre entdeckt: synthetische Derivate der Wand der Mycobakterien (Muramyldipeptid und dessen Derivate).
Dennoch erfordert der Nachweis der Unschädlichkeit dieser neuen Wirkstoffe eine Vielzahl von Tests, bevor sie bei Impfstoffen verwendet werden können, die für den Menschen vorgesehen sind. Schließlich stellt sich das Problem der Anzahl der Injektionen, da ohne Auffrischungsimpfungen das Immungedächtnis unzureichend wird.
Die moderne Impfung, insbesondere jene, welche rekombinierende Proteine verwendet, beruht auf der Immunreaktion, die mit der Verabreichung eines Antigens auf unterschiedlichen Wegen (intramuskulär, durch die Mundöffnung) in Zusammenhang steht. Dennoch kann diese Reaktion schlecht stimuliert sein, entweder aufgrund einer unzureichenden Bioverfügbarkeit des Antigens (zu kurze Lebensdauer, Proteolyse und Verdünnung in biologischen Flüssigkeiten) oder aufgrund des Fehlens eines wirksamen Einfangens und einer wirksamen Präsentation von Antigenen durch die antigen-präsentierenden Zellen (Zugänglichkeit der denditritischen Zellen zur Immunisierungsstelle, Aufbau des Antigens, der nicht zugleich die Assoziation mit Molekülen der Klasse I und der Klasse II des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes erlaubt), oder aufgrund einer unvollkommenen Erkennung der Antigendeterminanten durch die Immunzellen, selbst wenn die Proteinsequenz in optimaler Weise gestaltet ist (Beispiel: Glycoproteine, die mit dem HIV-Virus assoziiert sind oder Tumormarker).
Somit besteht ein sehr großes Interesse an dem Vektorisieren dieser Moleküle, um zu versuchen, die oben beschriebenen Einschränkungen abzuschwächen.
Klassischerweise zielt das Impfen auf eine humorale Immunreaktion ab. Dieses System schützt das geimpfte Individuum vor einem eventuellen Ausgesetztsein gegenüber einem Krankheitserreger, wobei auf diese Weise die Verbreitung einer extrazellulären Infektion verhindert wird. Dennoch ist es gegenüber einer intrazellulären Infektion machtlos. Die zelluläre Immunreaktion ist somit die unerlässliche Ergänzung zur Eliminierung der infizierten Zelle. Infolgedessen müsste eine ideale Impfung die zwei Arten von Immunität, nämlich die zelluläre und die humorale, begünstigen. Die zelluläre Immunreaktion ermöglicht die Beseitigung von intrazellulären Krankheitserregern, wie zum Beispiel Viren, oder die Zerstörung von Krebszellen. Zurzeit stößt das Erhalten einer adäquaten Immunreaktion durch Verabreichung eines Antigens noch auf zahlreiche Schwierigkeiten. Daher ist es noch nicht möglich, eine Impfung gegen spezifische Tumorantigene (zum Beispiel Brustkrebs) oder gegen schwach immunogene Antigene (zum Beispiel mit HIV assoziierte Glycoproteine) zu erhalten.
Somit besteht ein offensichtlicher Bedarf an einem Verfahren, welches es ermöglicht, Antigene zu vektorisieren, um eine Zellreaktion unter Ausschluss eventueller anaphylaktischer Schocks oder einer Proteolyse im Serum herbeizuführen.
Eine große Anzahl von Krankheiten könnte von der Verabreichung von Antigenproteinen oder Antigenpeptiden profitieren, die therapeutisch vektorisiert wurden. Dies würde es ermöglichen, die unerwünschten Nebenwirkungen, die auf die zu hohe Menge an Antigenen zurückzuführen sind, die verabreicht werden müssen, um die Immunreaktion „auszulösen" (zum Beispiel Krebsschutzimpfung), zu reduzieren.
Es wurde in der Fachliteratur vorgeschlagen, Liposome zugleich als Antigenvektor und als Immunoadjuvans für das Erhalten von Impfstoffen zu verwenden. Die internationale Anmeldung WO 95/22961 lehrt eine besondere Auswahl von Phospholipiden, welche in die Zusammensetzung solcher Liposome eintreten, wobei diese Auswahl dazu bestimmt ist, die Immunreaktion zu verbessern und dies ungeachtet dessen, ob die Antigene einfach in Gegenwart der Liposome verwendet werden oder ob sie in den Liposomen eingekapselt sind.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben für verschiedene Anwendungen auf Gebieten, die sich von jenen der vorliegenden Erfindung völlig unterscheiden, multilamellare Bläschen entwickelt, welche eine so genannte „Zwiebelstruktur" aufweisen und von ihrer Mitte aus bis zu ihrem Umfang aus einer Folge von lamellaren Schichten bestehen, die durch ein flüssiges Medium getrennt sind. Diese Bläschen können durch ein Verfahren erhalten werden, welches die Herstellung einer lamellaren kristallflüssigen Phase und deren Umwandlung durch Anwendung von Aufschneiden umfasst. Ein solches Verfahren wird insbesondere in der Patentschrift WO 93/19735, die aus der französischen Patentschrift FR-2 689 418 hervorgeht, oder in WO 95/18601 beschrieben, die alle hiermit zur Bezugnahme aufgenommen werden.
Gemäß der Patentschrift FR-2 689 418 kann diese Umwandlung während eines Schritts zum homogenen Aufschneiden der kristallflüssigen Phase erfolgen, wobei dies zu Bläschen führt, die auch als Mikrokapseln mit kontrollierter Größe bezeichnet werden. Dennoch kann, wenn mit der Formulierung der lamellaren kristallflüssigen Phase, insbesondere mit der Natur der Tenside, die in die Zusammensetzung aufgenommen werden, gespielt wird, die Umwandlung dieser kristallflüssigen Phase aus Bläschen durch einfache mechanische Beanspruchung, insbesondere zum Zeitpunkt des Mischens der Bestandteile, erhalten werden.
Die von den Erfindern durchgeführten Forschungsarbeiten haben dazu geführt, dass die Erfinder entdeckt haben, dass die Verwendung der oben beschriebenen Techniken die Entwicklung von neuen multilamellaren Vektoren geringer Größe erlaubt, welche eine große Einkapselungswirksamkeit aufweisen und leicht herzustellen sind und welche für das Vektorisieren von Antigenen verwendet werden können, mit dem Ergebnis, dass die Immunreaktion des Organismus gegen das eingekapselte Antigen erhöht wird.
Ein solcher Vektor weist in vielerlei Hinsicht die gesuchten Vorteile für ein Impfadjuvans auf.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass alle Moleküle, die in die Zubereitung der Zusammensetzungen der Erfindung aufgenommen werden, im Handel erhältlich sind.
Andere Vorteile stehen mit dem besonders einfachen Herstellungsverfahren der nützlichen multilamellaren Bläschen gemäß der Erfindung in Zusammenhang, welches die Verwendung einer großen Bandbreite an Tensiden ermöglicht.
Ein weiterer, ebenfalls mit dem Herstellungsverfahren der nützlichen multilamellaren Bläschen der Erfindung in Zusammenhang stehender Vorteil besteht darin, dass es – wie aus folgender Beschreibung hervorgehen wird – erlaubt, mehrerer Antigene im selben Bläschen gemeinsam einzukapseln, wodurch ein eventueller Zugang zu mehrwertigen Impfstoffen oder das gemeinsame Einkapseln mit einem Antigen oder mehreren Antigenen der Zusatzstoffe ermöglicht wird, wodurch es möglich wird, die Bläschen zu funktionalisieren, was zum Beispiel ermöglicht, das Targeting der Zusammensetzung zu verbessern oder die Ausrichtung (humoral oder zellulär) der Immunreaktion zu beeinflussen.
Ein weiterer Vorteil, der ebenfalls im Wesentlichen mit dem verwendeten Verfahren zur Herstellung der verwendeten Bläschen mit Zwiebelstruktur gemäß der Erfindung in Zusammenhang steht, liegt darin begründet, dass die Wirkstoffe und die Zusatzstoffe vor der Ausbildung der Bläschen aufgenommen werden, wodurch ein hervorragender Einkapselungsertrag möglich wird, aus dem sich eine bessere Wirksamkeit und eine deutliche Wirtschaftlichkeit bei extrem teuren Molekülen ergibt.
Ferner besteht ein weiterer, ebenfalls mit dem verwendeten Verfahren zur Herstellung der verwendeten Bläschen gemäß der Erfindung in Zusammenhang stehender Vorteil darin, dass ohne Unterschied sowohl wasserlösliche als auch fettlösliche Wirkstoffe oder Zusatzstoffe aufgenommen werden können.
Genauer gesagt schlägt die vorliegende Erfindung ein neues Mittel zum Vektorisieren von Antigenen vor, mit der Absicht, die Immunreaktion des Organismus gegen diese Antigen oder diese Antigene zu erhöhen. Die vorliegende Erfindung zielt insbesondere auf ein Verfahren zum Verabreichen eines Antigens ab, welches erlaubt, die zelluläre wie auch die humorale Immunreaktion deutlich zu verbessern.
Somit betrifft gemäß einer ihrer wesentlichen Eigenschaften die Erfindung einen neuen Antigenvektor, der aus einer Dispersion aus multilamellaren Bläschen besteht, innerhalb derer das Antigen wenigstens teilweise eingekapselt ist, wobei die Bläschen aus einer zweischichtigen Zusammensetzung bestehen, welche wenigstens ein Tensid umfasst, wobei die zweischichtigen Zusammensetzungen konzentrisch sind und den Bläschen eine Zwiebelstruktur verleihen.
Unter Antigen wird jegliche Substanz verstanden, die eine Reaktion des Immunsystems und/oder die Produktion von Antikörpern herbeiführt. Eine Antigensubstanz umfasst wenigstens einen Antigendeterminanten oder ein Epitop, der/das aus molekularen Motiven besteht, die von den spezifischen Antikörpern und/oder den Zellen des Immunsystems erkannt werden.
Die gemäß der Erfindung verwendeten Antigen sind vorteilhafterweise Proteinantigene. Es kann sich dabei insbesondere um Antigene handeln, die aus natürlichen oder rekombinierenden Proteinen oder Peptiden bestehen.
Es können auch Bläschen der Erfindung als Antigenvektoren vom Typ Glycoproteine oder Polysaccharide verwendet werden.
Die Bläschen der Erfindung können ein Antigen oder ein Antigengemisch enthalten. Als Beispiel für ein Antigengemisch werden insbesondere Gemische angeführt, welche entweder durch Synthese oder Biotechnologie oder durch Extraktion ausgehend von den betroffenen Mikroorganismen erhalten werden.
Unter „Zwiebelstruktur" ist – wie zuvor ausgeführt – eine multilamellare Struktur zu verstehen, in der die Bläschen von im Wesentlichen kugeliger Form aus einer Folge zweischichtiger konzentrischer Zusammensetzungen bestehen und dies von der Mitte bis zum Umfang der Bläschen, daher der Name Zwiebelstruktur, der daher dazu verwendet wird, um solche Strukturen zu bezeichnen.
Solche Strukturen werden vorteilhafterweise durch Aufnahme von wenigstens einem Antigen in eine lamellare kristallflüssige Phase erhalten, welche wenigstens ein Tensid umfasst, wobei danach die lamellare kristallflüssige Phase in eine dichte Phase von multilamellaren Bläschen geringer Größe umgewandelt wird.
Somit betrifft die Erfindung gemäß einer ihrer wesentlichen Eigenschaften ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, welche wenigstens ein Antigen enthält, gemäß dessen eine lamellare kristallflüssige Phase hergestellt wird, welche das Antigen enthält, und wobei die Neuanordnung der kristallflüssigen Phase in multilamellare Bläschen durch Anwenden eines Aufschneidvorgangs herbeigeführt wird.
Dieses Aufschneiden kann ein homogenes Aufschneiden sein, was den Vorteil hat, dass Bläschen mit vollkommen homogener Größe erhalten werden. Dennoch kann sich ein einfaches mechanisches Rühren als ausreichend erweisen, um die Bildung der multilamellaren Bläschen der vorliegenden Erfindung herbeizuführen
Gemäß einer weiteren Eigenschaft der Erfindung betrifft diese Produkte, die durch das Verfahren erhalten werden können.
Gemäß der französischen Patentschrift FR-2 689 418 kann diese Umwandlung während eines Schritts des homogenen Aufschneidens der kristallflüssigen Phase erfolgen, was zu Bläschen oder Mikrokapseln mit kontrollierter Größe führt. Dennoch kann durch Spielen mit der Formulierung der lamellaren kristallflüssigen Phase, insbesondere der Natur der Tenside, die in diese Zusammensetzung aufgenommen werden, die Umwandlung der kristallflüssigen Phase aus Bläschen durch einfache mechanische Beanspruchung, insbesondere zum Zeitpunkt des Mischens der Bestandteile, erhalten werden.
Die Formulierung führt vorteilhafterweise zur Beteiligung eines Gemisches von oberflächenaktiven Molekülen. Es werden im Allgemeinen wenigstens zwei unterschiedliche Tenside verwendet, welche unterschiedliche hydrophil lipophile Balancen aufweisen, wodurch es möglich wird, fortlaufend die Eigenschaften der zweischichtigen Zusammensetzungen zu regeln und somit das Auftreten von Instabilität zu steuern, welche die Ausbildung der multilamellaren Bläschen regelt.
Es scheint, dass diese Struktur für die besonders vorteilhaften Ergebnisse verantwortlich ist, die erhalten werden, und dass die multilamellaren Bläschen der Erfindung dem Antigen ermöglichen, intakt bis zu den antigen-präsentierenden Zellen (CPA) vorzudringen und sein Einfangen durch diese Zellen zu begünstigen. Es erscheint somit, dass die Funktion der Bläschen der Erfindung darin besteht, das Einfangen des Antigens durch das Immunsystem zu vektorisieren, zu schützen und zu verbessern.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform besitzen die Bläschen, die die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bilden, Durchmeser kleiner als 20 μm, vorzugsweise kleiner als 10 μm, noch mehr bevorzugt kleiner als 1 μm und noch weiter bevorzugt zwischen 0,1 und 1 μm.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform enthalten die Membrane der in den Zusammensetzungen der Erfindung enthaltenen Bläschen wenigstens ein Tensid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht:

– hydrogenierten oder nicht hydrogenierten Phospholipiden,
– gesättigten oder einfach oder mehrfach ungesättigten, linearen oder verzweigten Fettsäuren in C₆ bis C₁₈ in Form von Säure oder Salz eines Alkali- oder Erdalkalimetalls oder eines Amins,
– ethoxylierten Estern dieser Fettsäuren und
– Saccharose,
– Sorbitan,
– Mannitol,
– Glycerol oder Polyglycerol,
– Glycol,
– Mono-, Di- oder Triglyceriden oder Gemischen aus Glyceriden dieser Fettsäuren,
– gesättigten oder einfach oder mehrfach ungesättigten, linearen oder verzweigten, ethoxylierten oder nicht ethoxylierten Fettalkoholen in C₆ bis C₁₈,
– ethoxylierten oder nicht ethoxylierten Ethern dieser Fettalkohole und
– Saccharose,
– Sorbitan,
– Mannitol,
– Glycerol oder Polyglycerol,
– Glycol,
– polyethoxylierten, hydrogenierten oder nicht hydrogenierten Pflanzenölen,
– sequenzierten Polymeren von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Poloxamere),
– Polyethylenglycol-Hydroxystearat,
– Alkoholen mit Sterolskelett, wie z. B. Cholesterin, Sitosterol.

Die ausgewählten Tenside, insbesondere die oben erwähnten Tenside, werden vorteilhafterweise aus der Kategorie von Tensiden ausgewählt, die durch die Gesetzgebung für die pharmazeutische Verwendung in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg gestattet sind.
Es werden aus den oben erwähnten Tensiden vorteilhafterweise zwei Tenside ausgewählt, welche relativ unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, insbesondere eine unterschiedliche hydrophil lipophile Balance (HLB). Das erste Tensid wird vorteilhafterweise eine hydrophil lipophile Balance zwischen 1 und 6, vorzugsweise zwischen 1 und 4 aufweisen, während das zweite Tensid eine hydrophil lipophile Balance zwischen 3 und 15, vorzugsweise zwischen 5 und 15 aufweisen wird.
Wie zuvor gesehen, kann durch das Verfahren gemäß der Patentschrift FR 2 689 418 eine bessere Kontrolle der Größe der mehrschichtigen Bläschen erzielt werden.
Die nach der Umwandlung der kristallflüssigen lamellaren Phase in multilamellare Bläschen erhaltene Zubereitung kann im Anschluss verdünnt werden, insbesondere mit einem wässerigen Lösemittel, wie beispielsweise einer Pufferlösung, einer Salzlösung oder einer physiologischen Lösung, um so eine wässerige Bläschensuspension zu erhalten.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Einkapselungstechnik ermöglicht es, einfach sehr hohe Einkapselungserträge, in der Nähe von 100%, zu erreichen. Dennoch sind solche Erträge in Abhängigkeit von den ins Auge gefassten Anwendungen nicht immer unerlässlich.
Somit liegt der Einkapselungsertrag des (oder der) Antigens (Antigene) in den Zusammensetzungen der Erfindung vorteilhafterweise über 50%, vorzugsweise über 80%.
Ein weiterer Vorteil in Zusammenhang mit der Einkapselungstechnik der Erfindung besteht darin, dass sie es ermöglicht, mehrere Antigene innerhalb derselben Bläschen gemeinsam einzukapseln, aber auch ein Antigen oder mehrere Antigene mit Zusatzstoffen, welche es ermöglichen, die Bläschen zu funktionalisieren; dadurch wird es insbesondere möglich, das Targeting zu verbessern. Es können beispielsweise Cytokine gemeinsam eingekapselt werden, welche es ermöglichen, die (humorale oder zelluläre) Ausrichtung der Immunreaktion zu beeinflussen.
Die Erfindung stellt ein Mittel zum Vektorisieren von Antigenen bereit, insbesondere von Proteinantigenen, wobei die Vektorisierung in vivo nach der intravenösen oder intraperitonealen Injektion erfolgen kann.
Gemäß einer weiteren wesentlichen Eigenschaft der Erfindung betrifft diese eine Zusammensetzung, welche wenigstens ein Antigen enthält, gegen das spezifische Antikörper oder eine spezifische Zellreaktion erzeugt werden soll, wobei das Antigen/die Antigene wenigstens teilweise in den multilamellaren Bläschen eines Vektors, wie er zuvor definiert wurde, eingekapselt ist/sind.
Die Zusammensetzungen, welche wenigstens ein Antigen enthalten, das in den zuvor beschriebenen multilamellaren Bläschen eingekapselt ist, können auch pharmazeutische Zusammensetzungen sind, die zur Verwendung als Impfstoffe bestimmt sind, aber auch Zusammensetzungen, die zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern bestimmt sind.
Schließlich betrifft die Erfindung gemäß einer anderen ihrer wesentlichen Eigenschaften ein Verfahren zur Herstellung der zuvor beschriebenen Zusammensetzungen.
Dieses Verfahren umfasst folgende Schritte:

– Herstellung einer kristallflüssigen lamellaren Phase, welche wenigstens ein Tensid umfasst und das Antigen/die Antigene enthält,
– Umwandlung der kristallflüssigen Phase in multilamellare Bläschen mit Zwiebelstruktur durch Aufschneiden,
– Dispersion in einer wässerigen Lösung, um die gewünschte Antigenkonzentration zu erhalten.

Genauer gesagt wird gemäß des Verfahrens in einem ersten Schritt eine kristallflüssige Phase hergestellt, die aus einem Gemisch von amphiphilen Molekülen und einer wässerigen Lösung besteht, welches das/die Antigen/Antigene enthält. Die wässerige Phase kann insbesondere einen PBS-Puffer oder jede andere physiologische Lösung enthalten. Natürlich wird der Arbeitsmodus angepasst, um den eventuellen Mangel an Löslichkeit von bestimmten Antigenen zu berücksichtigen. Somit werden vorteilhafterweise in die wässerige Phase unterschiedliche Zusatzstoffe oder Co-Lösemittel aufgenommen, die dazu neigen, die Lösung des Antigens, beispielsweise Glycerol, Polyethylenglycol, Propylenglycol oder Harnstoff, zu begünstigen. Der Fachmann wird die Natur der Tenside und ihre Anteile so wählen, dass eine weitere einfache Umwandlung der kristallflüssigen Phase in multilamellare Bläschen mit Zwiebelstruktur erzielt wird. Der Fachmann kann – ohne dazu verpflicht zu sein – für die Tenside wenigstens ein eher hydrophobes amphiphiles Molekül auswählen, welches vorzugsweise eine HLB von weniger als 4 aufweist, und ein anderes, eher hydrophiles amphiphiles Molekül, welches eine HLB von vorzugsweise über 5 aufweist. Eine solche Auswahl ermöglicht eine einfache Umwandlung der kristallflüssigen Phase.
In einem zweiten Schritt wird das homogene Gemisch, das aus der gebildeten kristallflüssigen Phase besteht, gemäß einem der zuvor beschriebenen Verfahren aufgeschnitten. Vorteilhafterweise kommt ein homogenes Aufschneiden zur Anwendung, um eine regelmäßige Größe der Bläschen zu erzielen. Dennoch erweist sich das Anwenden eines solchen homogenen Aufschneidens nicht immer als erforderlich, und – vorausgesetzt, dass mit der Formulierung der kristallflüssigen Phase gespielt wird – kann ein einfaches Gemisch in einem industriellen Mischer ermöglichen, die kristallflüssige lamellare Phase in multilamellare Bläschen gemäß der Erfindung umzuwandeln.
In einem dritten Schritt wird das Gemisch, das aus den multilamellaren Bläschen gemäß der Erfindung besteht, in einem Überschuss von wässeriger Lösung, zum Beispiel einem physiologischen Serum, dispergiert, um das Gemisch auf die gewünschte Antigenkonzentration zu bringen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele dargestellt, welche zeigen, dass es möglich ist, die Verwendung von multilamellaren Tensid-Mikrobläschen für die Impfung von Menschen und Tieren in Betracht zu ziehen, wobei folgende Vorteile erzielt werden:

1) Es ist möglich, ein Antigen oder mehrere Antigene getrennt oder gemeinsam in multilamellaren Bläschen geringer Größe zu vektorisieren.
2) Man kann unter Berücksichtigung der Erhöhung der Immunreaktion die Verwendung einer geringeren Menge Antigen ins Auge fassen. Das kann von Bedeutung sein, wenn man beabsichtigt, auf rekombinierende und/oder teure Antigene zurückzugreifen.
3) Die Verstärkung der Immunreaktion durch Mikroeinkapselung ermöglicht es, die Verwendung von schwach immunogenen Molekülen ins Auge zu fassen, die alleine nicht zu einer ausreichenden Immunreaktion führen.
4) Die Geschwindigkeit der Entwicklung der Immunreaktion ermöglicht es, eine Verringerung des Abstands zwischen der Durchführung von aufeinanderfolgenden Auffrischungsimpfungen ins Auge zu fassen. In der Tat tauchen bei der letzten Auffrischungsimpfung nur 30% der behandelten Personen auf, so dass 70% der Personen, obwohl sie eine erste Injektion erhalten haben, nicht wirksam immunisiert sind. Ein kürzerer Zeitabstand zwischen den Auffrischungsimpfungen müsste eine bessere Durchimpfung der Bevölkerung gewährleisten.
5) Die Erhöhung der zellulären Immunreaktion ist die Garantie für ein besseres Impfen.
6) Der Umstand, dass die Wirkung der Verstärkung der Immunreaktion eines eingekapselten Antigens durch die Gegenwart eines Adjuvans, beispielsweise QS21, noch stärker ist, erlaubt es (ohne Verpflichtung), technologische Koppelungen ins Auge zu fassen.

Somit ist abschließend zu sagen, dass die Ergebnisse einen Verstärkungseffekt der Immunreaktion zeigen, der sehr allgemein ist und potentiell bei zahlreichen Impfstoffen für Menschen und Tiere oder für die Herstellung von antigenhaltigen Zusammensetzungen angewendet werden kann.
Die folgenden Beispiele haben lediglich darstellenden Charakter und sind keinesfalls als Einschränkung der Erfindung auszulegen.
Beispiel 3 wird durch 1 bis 4 dargestellt, welche zeigen:
1 die Ergebnisse bezüglich der Herstellung von Anti-HSA Serum-IgG nach Immunisierung gemäß des Protokolls IP/OV, das in Beispiel 3 definiert ist, mit T = 19, T = 35 und T = 050 für vier Behandlungstypen, die mit eingekapseltem HSA (1), freiem HSA in PBS (2), freiem HSA in einem Gemisch mit leeren Bläschen (3) und freien Bläschen (4) erfolgen;
2 die isotypische Anti-HSA-Reaktion nach der Immunisierung gemäß des Protokolls IP/IV, das in Beispiel 3 definiert ist, ausgedrückt durch die mittleren Titer an IgG-Isotypen nach den vier oben definierten Behandlungstypen (1, 2, 3 und 4),
3 die Ergebnisse betreffend die Produktion von Anti-HSA Serum-IgG nach der Immunisierung gemäß des SC-Protokolls, das in Beispiel 3 definiert ist, mit T = 19, T = 35, T = 50 für drei Behandlungstypen, die jeweils als 1 (mit eingekapseltem HSA), 2 (mit freiem HSA in PBS) und 3 (mit freien Bläschen) bezeichnet sind,
4 die isotypische Anti-HSA-Reaktion nach drei Immunisierungen gemäß des Protokolls SC, das in Beispiel 3 definiert wird, im Fall von drei Behandlungen, die als 1, 2 und 3 bezeichnet sind, mit eingekapseltem HSA (1), freiem HSA in PBS (2), leeren Bläschen (3).
5 und 6 werden unter Bezugnahme auf Beispiel 4 angeführt und zeigen jeweils die Dosierungsergebnisse der B-Lymphozytenzellen, welche Anti-NP-Antikörper von IgG-Isotypen erzeugen, in Bezug auf die Gesamtmilzzellen nach der Anwendung der zwei Immunisierungsprotokolle, die im Beispiel 4 definiert sind, umfassend jeweils eine IP-Immunisierung (5) und drei IP-Immunisierungen (6).
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung und Charakterisierung einer Zusammensetzung, welche eingekapselte Antigene enthält
Es wird eine Zusammenstellung hergestellt, die multilamellare Bläschen enthält und folgende Zusammensetzung aufweist, in welcher die Anteile in Gewichtsprozent angeführt werden:
wobei wie folgt vorgegangen wird.
Das Kaliumoleat, das Cholesterin, das Cholesterinsulfat und Laureth 4 werden im Voraus unter magnetischem Rühren eine Stunde lang bei 55°C gemischt. Der erhaltenen Paste, die auf Umgebungstemperatur abgekühlt wird, werden langsam unter leichtem Rühren die wässerige HSA-Lösung (oder reines Wasser für die leeren Mikrobläschen) und danach Phosphatidylcholin beigemengt. Das Gemisch wird im Anschluss in eine Aufschneidzelle eingeführt, die aus zwei koaxialen Zylindern besteht, von denen einer fixiert und der andere in Rotation ist. Diese Art von Vorrichtung wird in der Patentschrift WO 93/19735 beschrieben. Das Aufschneiden von ungefähr 10 s^–1 wird eine Stunde lang aufrechterhalten. Die Probe wird im Anschluss in sterilem Wasser mit 250 mg Paste pro 1 ml Wasser dispergiert.
Ein zweiter Verdünnungsvorgang wird vor der Injektion mit 0,5 ml der vorhergehenden Lösung in 2 ml sterilem Wasser durchgeführt. Bei Proben, die ein Adjuvans enthalten, wird dieses zuvor in das Dispersionswasser mit 5 μl wässeriger Adjuvanslösung (bei 20 μg/μl) in 1,995 ml Wasser aufgenommen. Dadurch wird in der injizierten Lösung eine Antigenkonzentration von 20 μg für 100 μl injizierbares Volumen erhalten und für den Fall, dass das Adjuvans verwendet wird, liegt seine Endkonzentration bei 4 μg für 100 μl.
Der Einkapselungsgrad wird durch Dosierung nach Trennung der Bläschen von dem Überstand und anschließender Befreiung des Antigens geschätzt. Die Dispersion der Bläschen wird ultrazentrifugiert (40 000 Umdrehungen/Minute, 1 h lang). Das Bläschenmaterial wird 10-fach durch eine 10%-ige Deoxycholatnatriumsalzlösung verdünnt. Die Suspension von durch das Deoxycholatsalz zerstörten Bläschen wird einem intensiven Wirbeleffekt ausgesetzt und danach ultrazentrifugiert (50.000 Umdrehungen/Minute, 60 Minuten lang). Die Dosierung des Antigens erfolgt durch Spektrophotometrie des Bläschenmaterials mit Hilfe der Bradford-Technik (Analytical Biochemistry, 1976, 72, S. 248) unter Verwendung der Dosierung „Bio-Rad protein assay" gemäß dem bereitgestellten Protokoll (Bio-Rad Laboratories, USA).
Die mit dem Bläschenmaterial assoziierten Werte, die der Menge an eingekapseltem Antigen (HSA) entsprechen, liegen bei 80% ± 5%.
Die Durchschnittsgröße der multilamellaren Bläschen, welche HSA enthalten, wird durch die Technik der dynamischen Lichtdiffusion gemessen. Man kommt auf eine Größe von 0,218 μm bei einer Polydispersität von 20%, was zeigt, dass in Bezug auf die Größe der Bläschen eine homogene Probe vorliegt.
Beispiel 2
Dosierung der Immunreaktion
a) Impfprotokoll
Es wird die Immunreaktion eines mikroeingekapselten Antigens bestimmt, das in vivo verabreicht wurde, wobei auf ein Mäusemodell zurückgegriffen wird.
Es wurde ein beschleunigtes Impfprotokoll verwendet, um die Kapazität von Vektoren hinsichtlich der schnellen Herbeiführung einer Immunreaktion zu testen. Innerhalb von zwanzig Tagen erfolgten drei Injektionen, danach wurden Dosierungen der Gesamtimmunoglobuline (IgG, IgM) nach zwei und vier Wochen durchgeführt.
Vier unterschiedliche Formulierungen (mit 1 bis 4 bezeichnet), welche dieselben Mengen an Antigen enthielten, sowie zwei Kontrollformulierungen (als 5 und 6 bezeichnet) wurden getestet:

1) Antigen alleine,
2) Antigen in Verbindung mit einem bekannten Adjuvans (QS21 von AQUILA, USA),
3) in multilamellare Mikrobläschen von Tensiden gemäß Beispiel eingekapseltes Antigen,
4) in multilamellare Mikrobläschen von Tensiden gemäß Beispiel 1 eingekapseltes Antigen, in Verbindung mit QS21,
5) multilamellare Mikrobläschen von Tensiden analog zu jenen, die gemäß Beispiel 1 erhalten werden, aber leer,
6) multilamellare Mikrobläschen von Tensiden analog zu jenen, die gemäß Beispiel 1 erhalten werden, aber leer, in Verbindung mit dem Adjuvans QS21.

Alle Formulierungen wurden so hergestellt, dass ein Injektionsvolumen von 100 μl 20 μg Antigen (frei oder eingekapselt) enthält und – sofern vorhanden – 4 μg Adjuvans QS21 (vgl. oben).
Das Mausmodel ist ein Modell von BALB/c weiblichen Mäusen im Alter von 8 Wochen, mit einem Durchschnittsgewicht von 20 g. Zehn Tage verstreichen zwischen der ersten und der zweiten intraperitonealen Injektion. Die dritte und letzte Verabreichung erfolgt intravenös 10 Tage später. Das Protokoll erstreckt sich somit über insgesamt 20 Tage. Dasselbe Protokoll wird für die sechs Formulierungen angewendet, welche den sechs Gruppen der vier Mäuse entsprechen, die mit 1 bis 6 gekennzeichnet sind. Jede Gruppe wurde mit der Formulierung derselben Nummer behandelt.
Die Tiere werden unter „normalen" Bedingungen gehalten, ad libitum ernährt und normal hydriert.
Zwei Blutentnahmen (retroorbitale Entnahme) werden zwei und vier Wochen nach der letzten Injektion durchgeführt, um die Gesamtimmunoglobuline (IgG, IgM) bei dem Serum nach Zentrifugierung des gesamten heparinierten Blutes zu dosieren.
b) Ergebnis: Dosierung der Gesamtantikörperreaktion
Die Dosierung der Gesamtantikörperreaktion erfolgt, indem die Immunoglobuline durch einen ELISA-Test (Saunders G. C. „Immunoassays in the clinical laboratory", Ed. By Nakamura et al. 1979) mit Hilfe von Kaninchen-Immunoglobulinen und Anti-Immunoglobulinen von Mäusen (Institut Pasteur, Paris), die peroxadase-markiert sind, titriert werden. Die fixierten Immunoglobuline werden durch Zugabe des Enzymsubstrats offenbart.
Die in diesem Test durchgeführte Messung ist klassischerweise eine Absorbanzmessung mit 405 nm, wobei das Produkt der enzymatischen Reaktion, das im ELISA-Test gebildet wird, das Licht bei dieser Wellenlänge absorbiert. Das verwendete Analyseverfahren ergibt Ergebnisse, die mit jenen der Absorbanzmessung bei mittlerer Höhe der Sättigung identisch sind, aber mit größerer Genauigkeit bei den schwachen Werten und wobei ein Verfahren angewendet wird, welches es ermöglicht, in einer proportionalen Größe auf die Antigenmenge zuzugreifen, welche im Serum vorhanden ist, durch Parametrierung der Kurven, welche die Absorbanz in Abhängigkeit von der Verdünnung zeigen. In der Tat kann das Verdünnungsgesetz auf folgende Weise modellhaft dargestellt werden:
wobei:
I(D) die bei der Verdünnung D gemessene Absorbanz ist,
I₀ der Grundlärm der Messung ist,
I_S die Messung bei Sättigung (Plateau) ist,
C₀ proportional zur gewünschten Antikörperkonzentration ist (C₀ hat die Größe einer Konzentration).
I₀ wird direkt gemessen. I_S wird ausgehend von einem Experiment erhalten, bei dem die Reaktion ausreichend ist, um die Sättigung zu erzielen. Der erhaltene Wert wird danach in der Parametrierung der anderen Messungen derselben Untersuchungsreihe verwendet, selbst wenn für letztere die Sättigung nie erreicht wird.
Die Parametrierung der Kurven ermöglicht es, für jedes Experiment C₀ abzuleiten, also eine proportionale Anzahl zur Menge der Antikörper, die im untersuchten Serum vorhanden ist.
Dieses Verfahren ist feiner als die einfache Messung der Verdünnung, mit dem Ziel, das Halbplateau zu erhalten, weil es ermöglicht, eine Messung selbst in Abwesenheit von Sättigung zu erreichen. Es ist somit besonders für schwache Reaktionen geeignet.
Die Ergebnisse nach zwei und nach vier Wochen (nach dem Ende des Impfprotokolls) für die Gesamtheit der Zubereitungen werden in folgender Tabelle 1 angeführt.
Die durch dieses Verfahren erhaltenen Werte werden in untenstehender Tabelle 1 angeführt und sind somit proportional zu dem im Blut vorhandenen Immunoglobulinwert.
TABELLE 1
Das Zeichen „-" entspricht einer Reaktion von weniger als 2, was als nicht signifikant beurteilt wird.
Somit sieht man, dass ab zwei Wochen eine signifikante Immunreaktion für die eingekapselten Formulierungen (mit oder ohne Adjuvans) erhalten wird. Am Ende von vier Wochen ergeben die eingekapselten Formulierungen eine sehr bedeutende Reaktion, mehr als 50 Mal höher als die Antigenreaktion in Zusammenhang mit dem Adjuvans und mehr als 100 Mal höher als bei Zugabe des Adjuvans QS21 zum eingekapselten Antigen.
Beispiel 3: Einfluss des Immunisierungsweges
Andere Versuche zur Immunisierung mit HSA bei BALB/c-Mäusen wurden gemäß zweier Immunisierungsprotokolle durchgeführt, die nachstehend als IP/IV und SC bezeichnet sind und folgende Behandlungen umfassen:

– Protokoll IP/IV: 2 intraperitoneale Injektionen (IP), gefolgt von einer intravenösen Injektion (IV),
– Protokoll SC: 3 subkutane Injektionen (SC).

Die Formulierungen der Bläschen sind mit jenen von Beispiel 1 identisch. In allen Fällen lag die HSA-Dosis bei 20 μg pro Injektion von 100 μl. Alle Injektionen erfolgten in einem zeitlichen Abstand von 10 Tagen, das heißt eine Injektion bei T = 0, T = 10 und T = 20. Die (retro-orbitalen) Entnahmen erfolgten bei T = 19, das heißt einen Tag vor der letzten Injektion, und bei T = 35 und T = 50.
Es wurden Gruppen von jeweils 4 Mäusen folgenden Behandlungen unterzogen:
– Für das Protokoll IP/IV:

– nur HSA, aufgelöst im PBS-Puffer (Kontrolle)
– HSA eingekapselt gemäß vorliegender Erfindung, mit 20 μg Protein in 5 mg Bläschen, die im PBS-Puffer bei einem Gesamtvolumen von 100 μl dispergiert sind,
– HSA, aufgelöst im PBS-Puffer, ergänzt um leere Bläschen (20 μg Protein und 5 mg leere Bläschen, dispergiert bei 100 μl im PBS-Puffer),
– leere Bläschen (5 mg Bläschen, dispergiert bei 100 μl im PBS-Puffer).

– Für das Protokoll SC:

– HSA alleine, aufgelöst im PBS-Puffer (Kontrolle),
– HSA eingekapselt in den Bläschen gemäß der Erfindung, mit 20 μg Protein in 5 mg Bläschen, die im PBS-Puffer dispergiert sein, bei einem Gesamtvolumen von 100 μl),
– leere Bläschen (5 mg dispergierte Bläschen bei 100 μl im PBS-Puffer).

Die Dosierungen der Antikörper erfolgten durch ELISA bei Gesamt-Immunoglobulinen (IgGH + L) bei T = 19, T = 35 und T = 050 und bei Isotypen IgG₁, IgG_2a und IgG_2b sowie IgG₃ bei T = 50.
Die Ergebnisse werden in 1 bis 4 angeführt, bei denen die durchschnittlichen Titerwerte erscheinen (Durchschnitt der Dosierungen der einzelnen Seren). Es zeigt sich:

1) eine Null-Antikörperreaktion, wenn freies, nicht eingekapseltes HSA verwendet wird, sowie bei leeren Bläschen;
2) eine bedeutende Erzeugung von Gesamtimmunoglobulinen bei den zwei Verabreichungswegen, wenn HSA eingekapselt ist, mit einem Maximum bei T = 35;
3) eine starke Verstärkung der Reaktion IgG gesamt (H + L) mit eingekapseltem HSA, das auf subkutanem Weg verabreicht wird. Die Ergebnisse werden in nachstehender Tabelle 2 angeführt: TABELLE 2
4) kein Adjuvanseffekt der leeren Bläschen, weil freies HSA in Gegenwart von leeren Bläschen nur eine sehr schwache Reaktion mit sich bringt;
5) eine dominante Produktion von IgG1, die Gegenwart von IgG_2a in den zwei Protokollen mit viel bedeutenderen Titern im Fall von subkutanen Verabreichungen sowie die Gegenwart von IgG_2b. Keine Produktion von IgG₃ konnte festgestellt werden, unabhängig vom Verabreichungsprotokoll.

Dieses vollständige Beispiel vervollständigt die Ergebnisse von Beispiel 2 und zeigt, dass die Einkapselung eines Antigens in multilamellare Bläschen gemäß der Erfindung die Immunreaktion für verschiedene Injektionstypen verstärkt. Zudem wird gezeigt, dass die Wirkung der Bläschen keine Adjuvanswirkung ist, da die Zugabe der leeren Bläschen zum nicht eingekapselten Antigen keinerlei Reaktionsverstärkung mit sich bringt.
Beispiel 4: Tests mit Masern-NP-Protein
Immunisierungstests mit Masern-NP-Protein (internes Protein des Masernvirus) wurden mit zwei Immunisierungsprotokollen mittels intraperitonealer (IP) Injektion durchgeführt:

– eine einzige Injektion (die Ergebnisse sind in 5 dargestellt),
– drei Injektionen mit einem Intervall von 7 Tagen (die Ergebnisse sind in 6 dargestellt), jeweils mit einer NP-Proteindosis von 30 μg bei weiblichen BALB/c-Mäusen.

Die Bläschen wurden gemäß der Formulierung und der Vorgangsweise von Beispiel 1 zubereitet, mit einer Dosis von 30 μg Protein in 75 mg Bläschen, dispergiert im PBS-Puffer (Injektionen von 300 μl, titriert bei 30 μg Protein).
Im Fall von Injektionen, die leere Bläschen enthalten, wurden diese mit 75 mg Bläschen für ein Endvolumen von 300 μl (PBS-Puffer) dosiert.
Für jedes Protokoll und jede Dosis wurden Gruppen zu vier Mäusen wie folgt behandelt:

– NP, aufgelöst in PBS-Puffer (I),
– NP, eingekapselt in den Bläschen gemäß der Erfindung (II),
– NP, aufgelöst im PBS-Puffer, ergänzt durch leere Bläschen (III),
– NP im PBS-Puffer, emulgiert mit vollständigem FREUND-Adjuvans. Das Mischen erfolgt extemporan kurz vor der Injektion, bei 1 Volumen Pufferlösung, welche das Protein enthält, mit 1 Volumen Adjuvans CFA (SIGMA, St. Louis USA) (IV).

Die Dosierungen erfolgten durch ELISPOT bei IgG, 7 Tage nach der letzten Immunisierung. Diese Dosierung besteht darin, die B-Lymphozytenzellen, welche Anti-NP-Antikörper von IgG-Isotypen erzeugen, im Verhältnis zu den Gesamt-Milzzellen zu zählen. Das Ergebnis wird somit als ein Verhältnis r der Anzahl der Zellen, welche spezifische Antikörper erzeugen, zur Gesamtanzahl der beobachten Zellen ausgedrückt.
1) Protokoll 1 Immunisierung

– sehr leichte Verbesserung der Reaktion durch eingekapseltes NP (r = 500 × 10^–7) in Bezug zu NP alleine (r = 400 × 10^–7);
– kein Verstärkungseffekt mit leeren Bläschen, die dem nicht-eingekapseltem NP zugeordnet werden (r = 400 × 10^–7).

2) Protokoll 3 Immunisierungen

– eingekapseltes NP ganz deutlich höher (r = 900 × 10^–7) als NP alleine (r = 250 × 10^–7) und vergleichbar mit NP mit vollständigem FREUND-Adjuvans (r = 900 × 10^–7),
– freies NP, das leeren Bläschen zugeordnet wird, ähnlich wie NP alleine (r = 300 × 10^–7).

Dieses Beispiel bestätigt deutlich – bei einem anderen Modell – die Ergebnisse von Beispiel 3 und zeigt, dass die Werte der Verstärkung der Reaktion, die durch die Einkapselung in den multilamellaren Bläschen gemäß der Erfindung erhalten werden, mit jenen vergleichbar sind, die mit den mächtigsten Adjuvansen erzielt werden (das FREUND-Adjuvans ist besonders wirksam, aber aufgrund seiner Toxizität ist es in den Formulierungen, die zum Impfen oder für therapeutische Zwecke bestimmt sind, nicht erlaubt).

Claims

Antigenvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einer Dispersion multilamellarer Bläschen besteht, innerhalb derer das Antigen wenigstens teilweise eingekapselt ist, wobei die Bläschen von ihrer Mitte bis zu ihrem Umfang aus einer Folge zweischichtiger konzentrischer Zusammensetzungen bestehen, die wenigstens ein Tensid umfassen und durch ein flüssiges Medium getrennt sind.
Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bläschen einen Durchmesser von weniger als 20 μm und von wenigstens 0,1 μm aufweisen.
Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Tenside, aus denen die zweischichtigen Zusammensetzungen bestehen, ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: – hydrogenierten oder nicht hydrogenierten Phospholipiden, – gesättigten oder einfach oder mehrfach ungesättigten, linearen oder verzweigten Fettsäuren in C₆ bis C₁₈ in Form von Säure oder Salz eines Alkali- oder Erdalkalimetalls oder eines Amins, – ethoxylierten Estern dieser Fettsäuren und Saccharose, Sorbitan, Mannitol, Glycerol oder Polyglycerol, Glycol, – Mono-, Di- oder Triglyceriden oder Gemischen aus Glyceriden dieser Fettsäuren – gesättigten oder einfach oder mehrfach ungesättigten, linearen oder verzweigten, ethoxylierten oder nicht ethoxylierten Fettalkoholen in C₆ bis C₁₈, – ethoxylierten oder nicht ethoxylierten Ethern dieser Fettalkohole und Saccharose, Sorbitan, Mannitol, Glycerol oder Polyglycerol, Glycol, – polyethoxylierten, hydrogenierten oder nicht hydrogenierten Pflanzenölen, – sequenzierten Polymeren on Polyoxyethylen und Polyoxypropylen, – Polyethylenglycol-Hydroxystearat, – Alkoholen mit Sterolskelett, wie z. B. Cholesterin, Sitosterol.
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zweischichtigen Zusammensetzungen der Bläschen wenigstens zwei Tenside umfassen, von denen eines eine hydrophil lipophile Balance (HLB) aufweist, die zwischen 1 und 6 liegt, vorzugsweise zwischen 1 und 4, und das andere eine hydrophillipophile Balance (HLB) aufweist, die zwischen 3 und 15 liegt, vorzugsweise zwischen 5 und 15.
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Einkapselungsertrag über 50%, vorzugsweise über 80% beträgt.
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antigen um ein Protein- oder Peptidantigen handelt.
Vektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Proteinantigen aus einem natürlichen oder rekombinierenden Protein besteht.
Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen enthält, gegen das spezifische Antikörper oder eine spezifische Zellreaktion produziert werden sollen, dadurch gekennzeichnet, daß das(die) Antigene wenigstens teilweise in den multilamellaren Bläschen eines Vektors, wie er nach einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert ist, eingekapselt ist(sind).
Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere einen Impfstoff handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Zusammensetzung handelt, die zur Produktion monoklonaler Antikörper bestimmt ist.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Schritte umfaßt: – Herstellung einer kristallflüssigen lamellaren Phase, die wenigstens ein Tensid umfaßt und das(die) Antigene) enthält, – Umwandlung der kristallflüssigen Phase in multilamellare Bläschen mit Zwiebelstruktur durch Aufschneiden, – Dispersion in einer wäßrigen Lösung, um die gewünschte Antigenkonzentration zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Aufschneiden um ein homogenes Aufschneiden handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 Tenside verwendet werden, von denen eines eine HLB zwischen 1 und 6, vorzugsweise zwischen 1 und 4, und das andere eine HLB zwischen 3 und 15, vorzugsweise zwischen 5 und 15, aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antigen um ein Protein- oder Peptidantigen handelt.