DE69819349T2

DE69819349T2 - 1-amino-7-isochinolin-derivate als serin protease inhibitoren

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Publication number: DE69819349T2
Application number: DE69819349T
Authority: DE
Inventors: John Walter Macclesfield LIEBESCHUETZ; William Alexander Macclesfield WYLIE; Bohdan Macclesfield WASZKOWYCZ; Christopher William Macclesfield MURRAY; Andrew David Macclesfield RIMMER; Pauline Mary Macclesfield WELSH; Stuart Donald Macclesfield JONES; Jonathan Michael Ernest Macclesfield ROSCOE; Stephen Clinton Macclesfield YOUNG; Phillip John Macclesfield MORGAN; Nicholas Paul Macclesfield CAMP; Andrew Philip Austin Macclesfield CREW
Original assignee: Tularik Ltd
Current assignee: Tularik Ltd
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2018-08-29
Also published as: WO1999011657A1; EP1009758A1; US6262069B1; EP1012166B1; AU8875398A; AU8875798A; US20020040144A1; WO1999011658A1; DE69830410D1; EP1012166A1; DE69830410T2; DE69819349D1; US6420438B1; EP1009758B1

Description

Die Erfindung betrifft Verbindungen, die Inhibitoren von Serinproteasen sind und pharmazeutische Zusammensetzungen hiervon und ihre Verwendung bei der Behandlung des humanen oder tierischen Körpers.
Die Serinproteasen sind eine Gruppe aus proteolytischen Enzymen, die einen gemeinsamen katalytischen Mechanismus aufweisen, der durch einen besonders reaktiven Ser Rest gekennzeichnet ist. Beispiele für Serinproteasen umfassen Trypsin, Tryptase, Chymotrypsin, Elastase, Thrombin, Plasmin, Kallikrein, Komplement C1, acrosomale Protease, lysosomale Protease, Cocoonase, α-lytische Protease, Protease A, Protease B, Serincarboxypeptidase II, Subtilisin, Urokinase, Faktor VIIa, Faktor IXa und Faktor Xa. Die Serinproteasen wurden ausgiebig über einen Zeitraum von mehreren Jahrzehnten untersucht und der therapeutische Wert von Inhibitoren der Serinproteasen ist gut verstanden.
Serinproteasen spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation einer großen Vielzahl an physiologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Fibrinolyse, Fortpflanzung, Entwicklung, Malignität, neuromuskulärem Muster und Entzündung. Es ist gut bekannt, dass diese Verbindungen eine Vielzahl an zirkulierenden Proteasen wie auch Proteasen hemmen, die in Gewebe aktiviert oder freigesetzt werden. Es wird auch klar, dass die Serinproteaseinhibitoren kritische zelluläre Prozesse hemmen, wie Adhäsion, Migration, freie Radikalbildung und Apoptose. Zusätzlich deuten Tierexperimente darauf hin, dass intravenös verabreichte Serinproteaseinhibitoren, Varianten oder Zellen, die Serinproteaseinhibitoren exprimieren, einen Schutzeffekt gegen Gewebeschädigung bereitstellen.
Serinproteaseinhibitoren dürften auch potentiell nützliche Verwendungen bei der Behandlung von Erkrankungen bei einer großen Vielzahl an klinischen Bereichen haben, wie Onkologie, Neurologie, Hämatologie, pulmonale Medizin, Immunologie, Entzündung und Infektionskrankheiten.
Insbesondere können Serinproteaseinhibitoren bei der Behandlung von thrombotischen Erkrankungen, Asthma, Emphysem, Zirrhose, Arthritis, Carzinom, Melanom, Restenose, Atheromen, Trauma, Schock und Reperfusionsverletzung brauchbar sein.
Daher hat beispielsweise ein Inhibitor des Faktors Xa einen Wert als therapeutisches Mittel als Antikoagulans, beispielsweise bei der Behandlung und Prävention von thrombotischen Störungen.
Die Verwendung eines Faktor Xa Inhibitors als Antikoagulans ist in Anbetracht der Selektivität der Wirkung bevorzugt. Viele klinisch zugelassene Antikoagulationsmittel sind mit schädlichen Wirkungen aufgrund der unspezifischen Art ihrer Wirkungen in der Koagulationskaskade assoziiert.
Ebenfalls existieren gut bekannte Beziehungen einer α1 Proteaseinhibitordefizienz mit Emphysem und Zirrhose und eine C1 Esteraseinhibitordefizienz mit Agioödemen.
Ferroni et al., Farmaco, Ed. Sci., 1985, 40(10), 712–729 beschreiben die Ergebnisse der Untersuchung der antiproteolytischen Aktivität der N-(3- und (4-Amidinobenzoyl)-L-aminosäuren gegenüber Rindertrypsin und Schweinepankreaskallikrein.
Die WO 95/13274 A und die EP 0 672 658 A beschreiben bestimmte Benzamidinderivate und andere Derivate als Thrombininhibitoren.
Es wurde festgestellt, dass bestimmte neue aminosubsituierte fusionierte bicyclische Verbindungen als Inhibitoren von Serinproteasen, speziell Proteasen mit negativ geladenen P1 Spezifitätstaschen und vor allem die Serinproteasen Thrombin, Trypsin, Urokinase und der Faktor Xa besonders wirksam sind. Es ist ersichtlich, dass Verbindungen dieses im folgenden beschriebenen Typs leicht bioverfügbar sind, insbesondere leicht oral bioverfügbar.
Daher liefert die Erfindung von einem Aspekt aus betrachtet eine Serinproteaseinhibitorverbindung der Formel I
worin R₁ steht für Wasserstoff Halogen, Cyano, Nitro oder Hydroxyl, Amino, Alkoxy, Alkyl, Aminoalkyl, Hydroxyalkyl, Thiol, Alkylthio, Aminosulfonyl, Alkoxyalkyl, Alkoaycarbonyl, Acylolymethoaycarbonyl oder Alkylamino, wahlweise substituiert durch Hydroxy, Alkylamino, Alkoxy, Oxo, Aryl, Cycloalkyl, Amino, Halogen, Cyano, Nitro, Thiol, Alkylthio, Alkylsulfonyl, Alkylsulfenyl, Alkylsulfonamido, Alkylaminosulfonyl, Halogenalkoxy und Halogenalkyl,
R₂ für Wasserstoff, Halogen, Methyl, Amino, Hydroxy oder Oxo steht, und
R für X-X-Y(R₇)-L-L_p(D)_n steht,
worin jedes X unabhängig für ein C, N, O oder S Atom oder eine CO, CR₁, C(R₁)₂ oder NR₁ Gruppe steht, wobei zumindest ein X für C CO, CR₁ oder eine C(R₁)₂ Gruppe steht,
Y (das α-Atom) für ein Stickstoffatom oder eine CR₁ Gruppe steht oder Y und L zusammengenommen eine cyclische Gruppe bilden,
R₇ für Alkyl, Alkenyl, Mono- oder Bicycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Mono- oder Bicycloalkylalkyl, Mono- oder Bicycloalkylalkenyl, Aralkyl, Heteroarylalkyl, Arylalkenyl oder Heteroarylalkenyl steht, die alle wahlweise durch eine Gruppe R₁ substituiert sind,
L für eine organische Gruppe mit 1 bis 5 Grundgerüstatomen, ausgewählt aus C, N, O und S oder eine verzweigte Alkylgruppe oder cyclische Gruppe steht, und
L_p(D)_n für eine Alkyl-, Heterocyclyl-, Alkenyl-, Alkaryl-, Cycloalkyl-, Polycycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Halogenalkylgruppe oder eine Kombination aus zwei oder mehreren solchen Gruppen steht, wahlweise substituiert durch eine oder mehrere Oxa-, Thia-, Aza- oder R₁ Gruppen, vorzugsweise für eine Gruppe, die bis zu 25 Kohlenstoffatome enthält,
oder ein physiologisch annehmbares Salz hiervon, beispielsweise ein Halogenid-, Phosphat- oder Sulfatsalz oder ein Salz mit Ammonium oder einem organischen Amin, wie Ethylamin oder Meglumin.
In den erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten Arylgruppen, falls nichts anderes angegeben ist, 5 bis 10 Ringatome, die wahlweise 1, 2 oder 3 Heteroatome umfassen, die ausgewählt sind aus O, N und S, Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppen oder Alkylenreste enthalten vorzugsweise bis zu 6 Kohlenstoffe, cyclische Gruppen haben vorzugsweise Ringgrößen von 3 bis 8 Atomen und fusionierte, multicyclische Gruppen enthalten vorzugsweise 8 bis 16 Ringatome.
In den erfindungsgemäßen Verbindungen ist das fusionierte Ringsystem vorzugsweise ein 1-Aminoisochinolinsystem.
Besonders als Substituent am Isochinolinring steht R₁ vorzugsweise für Wasserstoff Hydroxy, Amino oder Alkyl. R₂ steht vorzugsweise für Wasserstoff. Zwei oder mehr Nicht-Wasserstoff R₁ (oder R₂) Gruppen können an den carbocyclischen (oder heterocyclischen) Ringen vorhanden sein, wobei jedoch eine einzelne Nicht-Wasserstoff R₁ (oder R₂) Gruppe bevorzugt ist. R₁ befindet sich vorzugsweise an der Position 6 des fusionierten Ringsystems.
In den erfindungsgemäßen Verbindungen, worin das α-Atom (Y) für Kohlenstoff steht, hat es vorzugsweise die Konfiguration, die aus der Konstruktion aus einer D-α-Aminosäure NH₂-CR₁(R₇)-COOH resultieren würde. Ähnlich ist der vierte Substituent R₁ an einem alpha-Kohlenstoffatom vorzugsweise eine Methyl- oder Hydroxymethylgruppe oder am bevorzugtesten Wasserstoff.
Die Linkergruppe X-X von der fusionierten bicyclischen Gruppe zum α-Atom ist vorzugsweise ausgewählt aus -CH=CH-, -CONH-, -CONR₁-, -NH-CO-, -NH₂-CH₂-, -CH₂-NH-, -CH₂O-, -OCH₂-, -COO-, -OC=O- und -CH₂CHR₁-(beispielsweise-CH₂CH₂-). Vorzugsweise ist der am nächsten zum α-Atom befindliche X Rest ein NH oder O Atom, vorzugsweise eine NH-Gruppe. Der X Rest in α zum fusionierten Ringsystem ist vorzugsweise eine auf Kolhlenstoff basierende Gruppe, wie CH₂ oder CO, vorzugsweise CO.
R₇ steht vorzugsweise für eine unsubstituierte oder mit R₁ substituierte Aryl- oder Cyclohexylgruppe, vorzugsweise Phenyl oder Naphthyl.
Die Linkergruppe L des α-Atoms zur Lp(D)_n Gruppe ist vorzugsweise CO, CH₂NH₂, CONR₁(CH₂)_m, (CH₂)_mN(R₁)CO(CH₂)_m, (CH₂)_m+2, (CH₂)_mCO(CH₂)_m, (CH₂)_mOC=O, (CH₂)_mO oder CH=CH(CH₂)_m (worin jedes m unabhängig für 0 oder 1 steht). Der Linker kann wallweise verzweigt sein, beispielsweise um eine polare Funktionalität aufzunehmen. In einer Ausführungsform werden Y und L unter Bildung einer cyclischen Gruppe zusammengenommen und das α-Atom ist daher ein Kohlenstoffatom. Die cyclische Gruppe kann unsubstituiert oder substituiert sein und kann eine Ringgröße von 3 bis 8 Atomen aufweisen. Vorzugsweise ist die cyclische Gruppe ein cyclisches Amid, am bevorzugtesten eines, worin der Amidstickstoff der cyclischen Amidgruppe an die Lp(D)_n Gruppe gebunden ist.
Lp(D)_n umfasst vorzugsweise eine Gruppe wie Cycloalkyl, Azacycloalkyl, Diazacycloalkyl, Phenyl, Naphthyl, Adamantyl, Decalinyl, Tetrahydrodecalinyl, Bicycloalkyl, Mono- oder Diazabicycloalkyl, heteroaromatisches Mono- oder Bicycloalkyl oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl, Alkylen, Alkenyl oder Alkenylen, die alle wahlweise substituiert sind durch eine Oxa-, Aza-, Thia- oder eine oder mehrere Gruppen R₁ oder eine Kombination aus zumindest zwei solcher Gruppen, die an eine Spirobindung oder eine Einfach- oder Doppelbindung oder durch C=O, O, S, SO, SO₂, CONR₁, NR₁-CO-, NR₁ Bindung gebunden sind. Beispielsweise umfassen repräsentative Lp(D)_n Gruppen Methylcyclohexyl, Methylcyclohexylmethyl, Methylphenylmethyl, Phenylethyl, Benzylpiperidinyl, Benzoylpiperidinyl, Bispiperidinyl oder Phenylpiperazinyl.
Am bevorzugtesten ist Lp(D)_n ausgewährt aus
worin R₃ für R₁, Aryl oder Cycloalkyl steht,
m für 0 oder 1 steht,
R₄ für Wasserstoff (CH₂)_wCOOH, (CH₂)_wCON(R₁)₂, (CH₂)_wCONα-Aminosäure steht,
w für eine ganze Zahl von 0 bis 4 steht, und
X für CH oder N steht.
Beispielsweise umfassen spezifische Lp(D)_n Gruppen
speziell wenn R₈ für H, OMe, F, NO₂, OH oder Cl steht.
Demnach haben bevorzugte Verbindungen der Erfindung die folgende Formel
(worin R₁ wie vorher definiert ist, wobei R₁ vorzugsweise für Wasserstoff, Hydroxy oder Amino steht),
R₅ und R₆ für Wasserstoff stehen oder zusammengenommen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, für eine Carbonylgruppe stehen,
Ar für ein unsubstituiertes oder ein mit R₁ substituiertes Aryl oder für eine Cyclohexylgruppe, vorzugsweise für Phenyl oder Naphthyl steht,
X-X für -CONH-, -CH₂CH₂-, CH₂O-, -COO-, -CH₂NH-, -OCH₂- oder -NHCH₂- steht,
L₁ für eine Valenzbindung oder eine organische Gruppe steht, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, ausgewählt aus C, N und O, und
L_P(D)_n für eine Cycloalkyl-, Azacycloalkyl-, Diazacycloalkyl-, Phenyl-, Naphthyl-, Adamantyl- Decalinyl-, Tetrahydrodecalinyl-, Bicycloalkyl-, Mono- oder Diazabicycloalkyl-, Mono- oder Bicycloheteroaromaten- oder eine lineare oder verzweigte Alkyl-, Alkylen-, Alkenyl- oder Alkenylengruppe steht, die alle wahlweise substituiert sind durch Oxa-, Aza-, Thia- oder eine R₁ Gruppe oder eine Kombination aus zumindest zwei Gruppen, die durch eine Spirobindung oder eine Einfach- oder Doppelbindung oder durch eine C=O, O, S, SO, SO₂, CONR₁, NR₁-CO- oder NR₁ Bindung verbunden sind. Beispielsweise umfassen repräsentative Lp₁(D)_n Gruppen ein Methylcyclohexyl, Methylcyclohexylmethyl, Methylphenylmethyl, Phenylethyl, Benzylpiperidiny, Benzoylpiperidinyl, Bispiperidinyl oder Phenylpiperazinyl und die vorher beschriebenen.
In einer Ausführungsform umfasst L₁ das Rückgrad einer α-Aminosäure, wobei die Lp(D)_n Gruppe die Seitenkette der Aminosäure ist. Der Carbolylteil der α-Aminosäure kann wahlweise über eine Amidbindung an eine Aminosäure oder an ein primäres oder sekundäres, cyclisches oder acyclisches Alkylamin oder -diamin oder über einen Ester an primäre oder sekundäre Alkohole gebunden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform steht L₁ für eine Valenzbindung und die Lp(D)_n Gruppe ist direkt an das Carbonyl-α-atom über ein Stickstoffatom gebunden, das einen Teil der Lp(D)_n Gruppe bildet. Geeignete Lp(D)_n Gruppen umfassen in diesem Fall daher Piperidinyl, Pyrrolidinyl und Piperazinyl. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Piperidin- oder Piperazinylgruppe weiter substituiert durch eine Phenyl-, Benzyl-, Benzoyl-, Pyridyl-, Pyridyloxy-, Piperidinyl- oder Phenoxygruppe, die wahlweise durch eine oder mehrere R₁ Gruppen substituiert ist. Wenn die Lp(D)_n Gruppe für Pyridyl steht, kann man voraussehen, dass N-Oxidpyridylverbindungen auch wirksam sein werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist an die Lp(D)_n Gruppe eine Gruppe der Formel -COOR₁, CON(R₁)₂ oder -CONα-Aminosäure oder ein Esterderivat hiervon gebunden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die das α-Kohlenstoffatom an die Lp(D)_n Gruppe bindende Gruppe eine heterocyclische Gruppe. Demnach umfassen bevorzugte Verbindungen der Erfindung auch
(worin R₁ wie vorher definiert ist, wobei R₁ vorzugsweise für Wasserstoff, Hydroxy oder Amino steht),
Ar für ein unsubstituiertes oder ein mit R₁ substituiertes Aryl oder für eine Cyclohexylgruppe, vorzugsweise für Phenyl oder Naphthyl steht,
X-X für -CONH-, -CH₂CH₂-, CH₂O-, -COO-, -CH₂NH-, -OCH₂- oder -NHCH₂- steht,
m für 0, 1 oder 2 steht,
Het für eine fünf- oder sechsgliedrige heterocyclische Gruppe steht, die durch 1, 2 oder 3 Heteroatome unterbrochen ist, die ausgewählt sind aus O, N und S, die wahlweise durch eine Gruppe R₁ substituiert sind, und
L_p1(D)_n für eine Cycloalkyl-, Azacycloalkyl-, Diazacycloalkyl-, Phenyl-, Naphthyl-, Adamantyl- Decalinyl-, Tetrahydrodecalinyl-, Bicycloalkyl-, Mono- oder Diazabicycloalkyl-, Mono- oder Bicycloheteroaromaten- oder eine lineare oder verzweigte Alkyl-, Alkylen-, Alkenyl- oder Alkenylengruppe steht, die alle wahlweise substituiert sind durch eine R₁ Gruppe oder eine Kombination aus zumindest zwei Gruppen, die durch eine Spirobindung oder eine Einfach- oder Doppelbindung oder durch eine C=O, O, S, SO, SO₂, CONR₁, NR₁-CO- oder NR₁ Bindung verbunden sind, wobei beispielsweise repräsentative Lp₁(D)_n Gruppen Cyclohexyl, Phenyl, Benzyl, Benzyloxy oder Benzoyl umfassen.
Wenn Het für einen fünfgliedrigen Ring steht, sind die zwei Ringatome, an denen es verbunden ist, vorzugsweise durch ein Ringatom getrennt. Wenn Het für einen sechsgliedrigen Ring steht, sind die zwei Ringatome, an denen es verbunden ist, vorzugsweise durch ein oder zwei Ringatome getrennt. Repräsentative heterocyclische Gruppen umfassen Thiazol, Oxazol, Oxadiazol, Triazol, Thiadiazol oder Imidazol. Wenn die heterocyclische Gruppe durch R₁ substituiert ist, ist dies vorzugsweise COOH, CON(R₁)₂ oder COOR₁, das an den Heterocyclus über eine Valenzbindung oder eine Alkylenkette verbunden ist.
In einer weiteren Ausführungsform hat die Lp(D)_n Gruppe eine daran gebundene Gruppe der Formel -COOR₁ oder eine -CONα-Aminosäure oder ein Esterderivat hiervon.
Speziell bevorzugte Verbindungen gemäß der Erfindung umfassen 1-Aminoisochinolin-7-oyl-Dphenylglycinyl-D-2-naphthylalaninylprolin, 1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(4'-pyridyl)piperidinamid, 1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-methoxybenzylamid, 1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(4'hydroxyphenyl)piperazinamid, 1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(2,4-difluorphenyl)piperazinamid, 1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-cyclohexylglycin-4-(4'-pyridyl)piperazinamid, 1-Aminoisochinolin-7-oyl-D,L-1-naphthylglycin-4,4-bipiperidinamid, 2(R)-[[N-(1-Aminoisochinolin)-7-oyl)amino}-2-phenylethyl-4-methylbenzamid und 1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4,4'-(1'-methyl)bipiperidinamid.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch herkömmliche chemische Syntheserouten hergestellt werden, beispielsweise durch Amidbindungsbildung, um die fusionierte bicyclische Gruppe an die lipophile Gruppe zu binden. Eine bevorzugte fusionierte bicyclische Gruppe zur Kupplung an die Lp(D)_n Gruppe ist 1-Amino-7-carboxyisochinolin, das aus dem leicht erhältlichen Ausgangsmaterial 7-Carboxyisochinolin hergestellt werden kann (F. T. Tyson, JACS, 1939, 61, 183). Die Aminierung des 7-Carboxyisochinolins kann leicht mittels Ammoniak bewirkt werden, wie dies später in den Beispielen beschrieben ist.
Die Herstellung der Lp(D)_n Gruppe wird bequemerweise beispielsweise ausgelend von Lp(D)_nNH₂ erreicht (worin Lp(D)_n wie vorher beschrieben definiert ist). Lp(D)_nNH₂ kann an ein Harz gebunden werden, um die Routinefestphasenpeptidsynthese ausführen zu können. Der an das Harz gebundene Lp(D)_nNH₂ Rest kann dann durch herkömmliche Techniken an eine geeignet geschützte Aminosäure gekuppelt werden, deren Seitenkette die R₇ Gruppe bildet, beispielsweise über eine freie Aminogruppe in der Lp(D)_n Gruppe. Die Schutzgruppenabspaltung kann dann vor der Kupplung an 1-Amino-7-carboxyisochinolin und der Isolierung vom Harz ausgeführt werden. Dieses Verfahren ist im späteren Schema 1 erläutert.
Alternativ dazu kann die Synthese ausgehend von einem Lp(D)_nCOOH Derivat initiiert werden und die Carboxylfunktionalität kann an das Harz gekuppelt werden. Dann kann eine herkömmliche Peptidsynthese ausgeführt werden, wie sie in Schema 2 erläutert ist.
Weitere Peptid basierte Synthesen sind in den Schemata 3 bis 5 erläutert.
In allen in den Schemata 1 bis 5 erläuterten Synthesen können die Kupplungsreaktionen natürlich mittels einer aktivierten Form der Carbonylverbindung bewirkt werden, beispielsweise einem Säurechlorid oder aktiven Ester.
Wenn Y und L zusammengenommen eine cyclische Amidgruppe bilden, kann diese bequem durch die Umsetzung einer Lp(D)_n Gruppe, die ein sekundäres Amin mit einer aktiven Seitenkette trägt, mit einer geeigneten Aminosäure eingeführt werden. Die Cyclisierung kann durch Base über einen nukleophilen Angriff des α-Atoms auf die Abgangsgruppe auf der aktiven Seitenkette induziert werden.
Erforderlichenfalls kann die Amidbindung vom Isochinolin zum α-Atom mittels eines geeigneten Reduktionsmittels unter Verwendung der erforderlichen Schätzung reduziert werden.
Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen Verbindungen, worin X-X für C-N oder C-O steht, jeweils aus Verbindungen der Formel H₂NCH(R₇)R'' oder HOCH(R₇)R'' durch Kondensation mit einem geeignet substituierten Isochinolin, beispielsweise 1-Amino-7-brommethylisochinolin, in Gegenwart einer Base hergestellt werden, worin R'' für L-LP(D)_n oder eine Funktionalität steht, die durch hierin beschriebene Verfahren hierzu umgewandelt werden kann.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, worin X-X für C-N steht, können auch aus Verbindungen der Formel H₂NCH(R₇)R'' durch die Kondensation mit einem geeignet substituierten Isochinolinaldehyd oder -keton, beispielsweise 1-Aminoisochinolin-7-carboxaldehyd in Gegenwart eines Reduktionsmittels hergestellt werden, wie Natriumborhydrid oder Natriumtriacetoxyborhydrid.
Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen Verbindungen aus Verbindungen der Formel NH₂CH(R₇)COOH hergestellt werden, die durch die Umsetzung mit Isobutylchlorformiat und die Reduktion mit Natriumborhydrid, erforderlichenfalls mittels einer geeigneten Schätzung, bequem zu einem Alkohol reduziert werden können.
Ein solcher Alkohol kann mittels einer geeigneten Schützung zur Einführung der Lp(D)_n Gruppe durch Reaktionen umgesetzt werden, wie:
Alkylierung mit einem Alkylhalogenid in Gegenwart einer Base,
Umsetzung mit Diethylazodicarboxylat/Triphenylphosphin und einer hydroxylierten Arylverbindung,
Umsetzung mit einer aktivierten Carbonsäure (beispielsweise einem Säurechlorid) oder mit einer Carbonsäure und Diethylazodicarboxylat/Triphenylphosphin,
Umsetzung mit einem Isocyanat, und
Behandlung mit Methansulfonylchlorid oder Trifluormethansulfonsäureanhydrid und Umsetzung mit einem Amin oder mit einem Thiol, wahlweise gefolgt von einer Oxidation, beispielsweise mit Kaliummetaperiodat oder Wasserstoffperoxid.
Auf diese Weise können Verbindungen mit Bindungen wie -CH₂-O-, -CH₂-O-CO-, -CH₂-O-CO-NR₁-, -CH₂-NR₁-, -CH₂-S-, -CH₂-SO- und -CH₂-SO₂-zwischen dein α-Kohlenstoff und der Lp(D)_n Gruppe hergestellt werden. Diese Verbindungen können dann mit 1-Amino-7-isochinolincarbonsäure-TFA-salz gekuppelt werden.
Alternativ dazu kann der Alkohol unter Bildung eines entsprechenden Aldehyds (beispielsweise durch Oxidation mit Mangandioxid oder DMSO/Oxalylchlorid oder DMSO/SO₃ oder Dess-Martin Reagenz) oxidiert werden, das dann zur Einführung der Lp Gruppe durch Reaktionen umgesetzt werden kann, wie:
Umsetzung mit Wittig Reagenzien oder Horner-Emmons Reagenzien, wahlweise gefolgt von der Reduktion der entstehenden Kohlenstoff : Kohlenstoff Doppelbindung mittels H₂/Pd-Kohle,
Umsetzung mit einem organometallischen Reagenz, beispielsweise einem Grignardreagenz, wahlweise gefolgt durch die Umsetzung der entstehenden Hydroxylgruppe, wie Oxidation (beispielsweise mit MnO₂, DMSO/ Oxalylchlorid oder Dess-Martin Reagenz), Alkylierung (beispielsweise mit einem Alkylhalogenid in Gegenwart einer Base in einem Lösemittel, wie DMF), Arylierung (beispielsweise mit Diethylazodicarbolylat/Triphenylphosphin und einer Hydroxyarylverbindung), Esterbildung (beispielsweise mit einer Säurechlorid oder mit einer Carbonsäure und Diethylazidodicarboxylat/Triphenylphosphin) oder Carbamatbildung (beispielsweise mit einem Isocyanat),
Umsetzung mit einem Amin, gefolgt von einer Reduktion, beispielsweise mit Natriumcyanoborhydrid,
Umsetzung mit einem Hydrazin, oder
Umsetzung mit einem Carbazid.
Auf diese Weise können Verbindungen mit Bindungen, wie -CH=CR₁-, -CH₂-CHR₁-, -CHOH-, -CHR₁-O-, -CHR₁-O-CO-, -CHR₁-O-CO-NR₁-, -CO-, -CH₂-NR₁-, -CH=N-NR₁- und -CH=N-NR₁ -CO-NR₁-, zwischen dein α-Kohlenstoff und der Lp(D)_n Gruppe hergestellt werden. Die entstehenden Verbindungen könnten dann erneut an das Isochinolinderivat gekuppelt werden.
Die Umwandlung des Alkohols zum oben angegebenen Amin kann zur Herstellung eines Aminreagenzes für die Einführung der Lp(D)_n Gruppe verwendet werden, beispielsweise einer Verbindung NH₂-CH(R₇)-CH₂-NR₁H.
Ein solches Aminreagenz kann zur Einführung der Lp(D)_n Gruppe umgesetzt werden, beispielsweise durch Acylierung mit einem Säurehalogenid oder einem aktivierten Ester, durch Umsetzung mit Isocyanat, durch Umsetzung mit einem Isothiocyanat oder durch Umsetzung mit einem Sulfonylchlorid. Auf diese Weise können Verbindungen mit Bindungen, wie -CH₂NR₁-CO-, -CH₂-NR₁-CO-NR₁-, -CH₂NR₁-CS-NR₁- und -CH₂NR₁-SO₂- zwischen dem α-Kohlenstoffatom und den Lp(D)_n Gruppen hergestellt werden.
Die Umwandlung der Säure zum oben angegebenen Amid kann zur Herstellung eines Amidreagenzes zur Einführung der Lp(D)_n Gruppe verwendet werden, beispielsweise einer Verbindung NH₂-CH(R_i)-CONH₂.
Solche Amide können zur Einführung der Lp(D)_n Gruppen umgesetzt werden, beispielsweise duch Umsetzung mit einem Halogenketon (beispielsweise Phenacylbromid). Dies liefert eine Bindung
vom α-Kohlenstoff zu den Lp(D)_n Gruppen.
Analog dazu kann das Amid in ein Thioamid durch die Umsetzung mit einem Lawessons Reagenz hergestellt werden und dann mit einem Halogenketon unter Bildung der folgenden Bindung umgesetzt werden
Das Amidreagenz kann ähnlich in ein Nitrilreagenz durch Dehydrierung umgewandelt werden, beispielsweise mit Trifluoressigsäureanhydrid. Das Nitrilreagenz kann mit Hydrazin und dann mit Acylhalogenid umgesetzt werden und dann unter Bildung der folgenden Bindung
cyclisiert werden (beispielsweise mit Trifluoressigsäureanhydrid).
Alternativ dazu kann es mit Hydroxylamin behandelt werden und dann mit Acylhalogenid umgesetzt werden und unter Bildung der folgenden Bindung
cyclisiert werden (beispielsweise mit Trifluoressigsäureanhydrid).
Das oben diskutierte durch die Umsetzung eines Carbonsäurereagenzes mit Hydrazin hergestellte Hydrazid kann ähnlich auch als Reagenz für die Einführung der Lp(D)_n Gruppeneinführung verwendet werden, wie beispielsweise eine Verbindung der Formel NH₂-CH(R₁)-CO-NR₁-N(R₁)₂.
Das Hydrazidreagenz kann mit einem Acylhalogenid umgesetzt und cyclisiert werden, beispielsweise mit Trifluoressigsäureanhydrid, um die folgende Bindung
zu erhalten oder mit einem Acylhalogenid oder einem Isocyanat unter Bildung von Bindungen umgesetzt werden, wie jeweils -CO-NR₁-NR₁-CO- und -CO-NR₁-NR₁-CO-NR₁-.
Alternativ dazu kann das Hydrazid durch die Umsetzung mit einem Lawessons Reagenz umgewandelt und dann mit einem Acylhalogenid umgesetzt und cyclisiert werden (beispielsweise mit Trifluoressigsäureanhydrid), um die folgende Bindung zu bilden
Eine alternative Route zu diesen Verbindungen ist es, jede der obigen chemischen Reaktionen auszuführen, um die Lp(D)_n Gruppe in ein geschütztes Zwischenprodukt einzubauen, wie einer Verbindung der Formel (IV)
Die Schutzgruppe kann dann vor der Kupplung des 1-Amino-7-carboxyisochinolins (wahlweise geschützt) entfernt werden.
Ein Ausgangsreagenz für die Lp(D)_n Gruppeneinführung, worin das α-Atom für Stickstoff steht, kann beispielsweise hergestellt werden durch die Umsetzung eines geschützten β-Hydrazins (ein solcher Schutz muss so ausgewählt werden, dass er mit den anschließend verwendeten Reaktionen kompatibel ist) mit Phosgen, Diphosgen, Triphosgen oder N,N'-Carbonyldiimidazol unter Bildung einer reaktiven Verbindung des Typs
Dieses Zwischenprodukt kann, wie dies oben beschrieben wurde, für die Carbonsäureausgangsmaterialien verwendet werden, worin das α-Atom Kohlenstoff ist.
Die Entfernung der Schutzgruppe durch Standardverfahren und die Kupplung mit einem aktivierten 1-Amino-7-carboxyisochnolin ergibt Verbindungen des Typs IQ-CONH-N(R₇)-L-Lp(D)_n (worin R₇, L und Lp(D)_n wie oben definiert sind und IQ für ein 1-Aminoisochinolin steht, das an die Position 7 gebunden ist).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch jeden bequemen Weg verabreicht werden, beispielsweise in den Gastrointestinaltrakt (beispielsweise rektal oder oral), in die Nase, die Lungen, die Muskulatur oder die Gefäße oder transdermal. Die Verbindungen können in jeder bequemen Verabreichungsform verabreicht werden, beispielsweise Tabletten, Pulver, Kapseln, Lösungen, Dispersionen, Suspensionen, Sirupen, Sprays, Zäpfchen, Gele, Emulsionen, Pflaster usw. Solche Zusammensetzungen können Komponenten enthalten, die in pharmazeutischen Präparationen herkömmlich sind, beispielsweise Verdünnungsmittel, Träger, pH Modifikationsmittel, Süßstoffe, Füllstoffe und weitere Wirkstoffe. Vorzugsweise sind die Zusammensetzungen steril, wenn sie in einer Lösungs- oder Suspensionsform vorliegen, die zur Injektion oder Infusion geeignet ist. Solche Zusammensetzungen bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Von diesem Aspekt aus betrachtet liefert die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen beispielsgemäßen Serinproteaseinhibitor zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff enthält.
Von einem weiteren Aspekt aus betrachtet liefert die Erfindung die Verwendung eines Serinproteaseinhibitors gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers (beispielsweise eines Säuger-, Vogel- oder Replikörpers), um einen Zustand zu bekämpfen, der auf einen Serinproteaseinhibitor anspricht (beispielsweise einen Zustand, wie eine thrombotische Störung, die auf einen Faktor Xa Inhibitor anspricht), wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Serinproteaseinhibitors gemäß der Erfindung an diesen Körper umfasst.
Die Dosis der Inhibitorverbindung der Erfindung hängt von der Art und Schwere des zu behandelnden Zustands, dem Verabreichungsweg und der Größe und Spezies des Patienten ab. Jedoch werden im allgemeinen 0,01 bis 100 μmol/kg Körpergewicht verabreicht.
Alle hierin angegebenen Veröffentlichungen sind hiermit eingeführt.
Die Erfindung wird nun weiter mit Bezugnahme auf die folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben.
Experimentalteil
Die verwendeten Abkürzungen folgen der IUPAC-IUB Nomenklatur. Zusätzliche Abkürzungen sind HPLC für Hochleistungsflüssigchromatographie, DMF für Dimethylformamid, DCM für Dichlormethan, HAOt für 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol, HATU für [O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat], Fmoc für 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, HOBt für 1-Hydroaybenzotriazol, TBTU für 2-(1H-(Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat, DIPEA für Diisopropylethylamin, Boc für tertiäres Butyloxycarbonyl, DIPCI für Diisopropylcarbodiimid, DBU für 1,8-Diazobicyclo[5.4.0]undec-7-en, TEA für Triethylamin, EDC für 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid, Rink-Linker für p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamid]-2,4-dimethoxybenzyl]phenylessigsäure, TFA für Trifluoressigsäure, MALDI-TOF für Matrixunterstützte Laserdesorptionsionisationsflugzeitmassenspektrometrie und Rt für Retentionszeit. Falls nichts anderes angegeben ist, werden die Aminosäurederivate, Harze und Kupplungsreagenzien von Novabiochem (Nottingham, UK) erhalten und andere Lösemittel und Reagenzien von Rathburn (Walkerburn, UK) oder Aldrich (Gillingham, UK) und werden ohne weitere Reinigung verwendet. Alle Lösungskonzentrationen werden als Volumenprozent/Volumenprozent ausgedrückt, falls nichts anderes angegeben ist.
Reinigung: Die Reinigung erfolgt durch Gradientenumkehrphasen-HPLC auf einer Waters Deltaprep 4000 bei einer Flussrate von 50 ml/min mittels einer Deltapak C18 Radialdrucksäule (40 mm × 210 mm, 10–15 μm Partikelgröße). Der Eluent A besteht aus wässriger TFA (0,1%) und der Eluent B aus 90% MeCN in wässriger TFA (0,1%) in einer Gradientenelution (Gradient 1, 0 Minuten 20% B, dann 20% bis 100% für 36 Minuten, Gradient 2, 0 Minuten 5% B für 1 Minute, dann 5% B bis 20% B für 4 Minuten, dann 20% bis 60% für 32 Minuten oder Gradient 3, 0 Minuten 20% B, dann 20% bis 100% für 15 Minuten). Die Faktionen werden durch analytische HPLC und MALDI-TOF oder Elektrospray-LCMS analysiert, bevor die mit > 95% Reinheit zur Lyophilisierung vereingt werden.
Analyse: Die analytische HPLC wird auf einem Shimadzu LC6 Gradientensystem bei Flussraten von 0,4 ml/min ausgeführt, das mit einem automatischen Probengeber, einem Detektor mit variabler Wellenlänge ausgestattet ist. Die Eluenten A und B sind dieselben wie bei der präparativen HPLC. Die verwendeten Säulen sind Techogell5 C18 (2 × 150 mm) (HPLC Technology), Magellan C8 Säule (2,1 × 150 mm, 5 mm Partikelgröße) (Phenomenex). Gereinigte Produkte werden ferner durch MALDI-TOF und NMR analysiert.
Synthese der Inhibitoren
Verfahren 1: Erfolgt unter Verwendung einer Festphasenstrategie auf einem Symphony Multiple Peptide Synthesiser von Protein Technologien, durch die Anbindung von Bisaminosäuren an Peg-2-chlortritylchloridharz: Das 2-Chlortritylchloridharz wird typischerweise mit mehr als einem zweifachen Überschuss des Diamins in trockenem DCM behandelt. Das Harz wird weiter durch die Anbindung der Säuren modifiziert. Die Aktivierung der Fmoc geschützten Aminosäure (2–5 Äquivalente) erfolgt durch TBTU/DIPEA, wobei alle Kupplungen (Minimum 120 Minuten) in DMF ausgeführt werden. Die Schutzgruppenabspaltung der Fmoc Gruppe wird mit 20% Piperidin in DMF erreicht. Andere Säuresubstituenten werden als HOBt oder HOAt Ester entweder durch Aktivierung mit HBTU/HATU oder DIPCI mit oder oder Boc Schutz der Aminogruppen angefügt. Die Abspaltung der Produkte vom Harz erfolgt durch die Behandlung (30 Minuten, Umgebungstemperatur) mit 10% Triethylsilan in TFA, Filtration, Eindamfung und Behandlung mit Diethylether.
Synthese mittels des Symphony Multiple Peptide Synthesisers
Der Symphony Multiple Peptide Synthesiser wird mit DMF, DCM, TBTU in DMF (450 mM), DIPEA in DMF (900 mM und 20% Piperidin in DMF befällt. Die Harze werden in Kunststoffreaktionsgefäßen gehalten, die die Einbringung der Reagenzien und Lösemittel und Stickstoff zum Umwälzen oder zur Lufttrocknung erlauben.
Ein typischer Synthesecyclus am Symphony ist folgender:
Das Reaktionsgefäß, das das Harz (0,1 mmol) enthält, wird mit der Fmoc geschützten Aminosäure (0,5 mmol) behandelt und dann wird diese in DMF (2,5 ml) gelöst, mit TBTU (0,56 mmol, 1,25 ml) und DIPEA (1,1 mmol, 1,25 ml) behandelt und mit Stickstoff für 2 Stunden umgewälzt (Umwälzungszeiten können variieren). Nach dem Kuppeln wird das Harz mit DMF (6 × 5 ml) gewaschen und dann mit 20% Piperidin in DMF (2 × 5 ml für jeweils 1 Minute, dann 1 × 5 ml für 8 Minuten) einer Schutzgruppenabspaltung unterzogen. Das Harz wird dann mit DMF (6 × 5 ml) gewaschen.
Beispiel 1
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-4-aminomethylcyclohexylmethylamid
Bis-1,4-aminomethylcyclohexan (2 ml) wird zu 2-Chlortritylchloridharz (1,2 mmol/g, 0,73 g) gegeben, das in DCM (4 ml) vorgequollen wurde. Nach 2 Stunden wird das Harz mit DCM (6 × 5 ml), DMF (6 × 5 ml) und DCM (6 × 5 ml) gewaschen. Das Harz wird dann luftgetrocknet, um Aliquots entnehmen zu können.
Das Bis-1,4-aminomethylcyclohexan-2-chlortritylharz (0,1 mmol) wird mit Fmoc-D-Phenylglycin (0,5 mmol, 187 mg), DMF (2,5 ml), TBTU in DMF (1,25 ml einer 450 mM Lösung) und DIPEA in DMF (1,25 ml einer 900 mM Lösung) behandelt. Das Gemisch wird mit Stickstoff für 2 Stunden gerührt. Die Schutzgruppenabspaltung und das Waschen erfolgen wie oben beschrieben.
Eine Lösung aus 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäuretrifluoressigsäuresalz (150 mg, 0,5 mmol) (Beispiel 88) in trockenem Dimethylformamid (DMF) wird nacheinander mit HOAt (102 mg, 0,75 mmol) und EDC (115 mg, 0,6 mmol) behandelt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird in den Reaktionskessel im Symphonygerät gegeben und 10 Stunden mit Stickstoff umgewälzt. Das Harz wird mit DMF (6 × 5 ml) und DCM (6 × 5 ml) gewaschen und luftgetrocknet. Das Produkt wird vom Harz mit 10% Triethylsilan in TFA (10 ml) für 30 Minuten abgespalten, dann wird das Harz abfiltriert und die TFA Lösung wird zur Trockne eingedampft und mit Diethylether unter Bildung des Rohprodukts behandelt. Das Rohprodukt wird in Wasser (10 ml) gelöst, filtriert und durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
¹H NMR (CD₃CN) Gemisch aus Cyclohexyl-cis- und -trans-Isomeren. 8,65 (1H, s), 8,10 (1H, d), 7,75 (1H, d), 7,35 (1H, d), 7,30 (2H, m), 7,15 (3H, m), 7,00 (1H, d), 5,40 (1H, s), 3,25–2,55 (4H, m), 1,7–0,9 (7H, m), 0,7–0,5 (3H, m).
MS TOF 446 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA), Rt 8,23 Minuten.
Verfahren 2: Erfolgt durch Festphasenstrategie auf einem Symphony Multiple Peptide Synthesesiser von Protein Techologies unter Verwendung von Fmoc Aminosäureu, die an Peg-2-Chlormetylchloridharz gekuppelt sind: Typischerweise wird das 2-Chlortritylchloridharz mit einem zweifachen Überschuss der Fmoc Aminosäure in einem 1 : 1 Gemisch aus DMF und trockenem DCM und DIPEA (2 Äquivalente) behandelt. Das Harz wird mit DMF/DCM gewaschen und mit 20% Piperidin in DMF einer Schutzgruppenabspaltung unterzogen, bevor es weiter modifiziert wird. Das Harz wird weiter durch die Anbringung von Aminosäure modifiziert. Die Aktivierung der Fmoc geschützten Aminosäuren (2 bis 5 Äqu.) erfolgt durch Aktivierung mit TBTU/DIPEA, wobei alle Kupplungen (Minimum 120 Minuten) in DMF ausgeführt werden. Eine Schutzgruppenabspaltung der Fmoc Gruppe wird mit 20% Piperidin in DMF erreicht. Andere Substituenten werden als HOBt oder HOAt Ester entweder durch Aktivierung mit HBTU/ HATU oder DIPCI mit oder ohne Boc-Schutz der Aminogruppen zugegeben. Die Abspaltung der Produkte vom Harz erfolgt durch eine Behandlung (30 Minuten, Umgebungstemperatur) mit 10% Triethylsilan in TFA, einer Filtration, Eindampfung und Behandlung mit Ether.
Beispiel 2
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycinyl-D-2-naphthylalanyglycin
Fmoc Glycin (0,2 mmol, 59 mg) in DMF (2 ml) wird zu 2-Chlortritylchloridharz (1,0 mmol/g, 0,1 g) gegeben, das in trockenem DCM (2 ml) vorgequollen ist, und dann zu DIPEA (0,2 mmol) gegeben. Nach 2 Stunden wird das Harz mit DCM (6 × 5 ml), DMF (6 × 5 ml) und DCM (6 × 5 ml) gewaschen. Das Harz wird dann luftgetrocknet, um Aliquots für eine weitere Modifikation entnehmen zu können. Auf dein Symphony-gerät wird das Fmoc-Glycyl-2-chlortritylharz (0,1 mmol) mit 20% Piperidin in DMF von den Schutzgruppen befreit und mit DMF (6 × 5 ml) gewaschen und dann mit Fmoc-D-2-Naphthylalanin (0,5 mmol, 220 mg), DMF (2,5 ml), TBTU in DMF (1,25 ml einer 450 mM Lösung) und DIPEA in DMF (1,25 ml einer 900 mM Lösung) behandelt. Das Gemisch wird für 2 Stunden mit Stickstoff umgewälzt. Die Schutzgruppenabspaltung und das Waschen erfolgen wie oben. Das Harz wird dann mit Fmoc-D-Phenylglycin (0,5 mmol, 187 mg), DMF (2,5 ml), TBTU in DMF (1,25 ml einer 450 mM Lösung) und DIPEA in DMF (1,25 ml einer 900 mM Lösung) behandelt. Das Gemisch wird für 2 Stunden mit Stickstoff umgewälzt. Die Schutzgruppenabspaltung und das Waschen erfolgen wie oben.
Eine Lösung aus einem 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäuretrifluoressigsäuresalz (150 mg, 0,5 mmnol) (Beispiel 88) in trockenem Dimnethylformamid (DMF) wird nacheinander mit HOAt (102 mg, 0,75 mmol) und EDC (115 mg, 0,6 mmol) behandelt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird dann in das Reaktionsgefäß auf dem Symphony-gerät gegeben und für 10 Stunden mit Stickstoff umgewälzt. Das Harz wird dann mit DMF (6 × 5 ml) und DCM (6 × 5 ml) gewaschen und luftgetrocknet. Das Produkt wird mit 10% Triethylsilan in TFA (10 ml) für 30 Minuten vom Harz abgespalten, das Harz wird abfiltriert, die TFA Lösung wird zur Trockne eingedampft und mit Diethylether unter Bildung des Rohprodukts behandelt. Das Rohprodukt wird dann in Wasser (10 ml) gelöst, filtriert und durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
¹H NMR (DMSO) 8,80 (1H, s), 8,20 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,55 (6H, m), 7,35 (1H, d), 7,20 (7H, m), 5,80 (1H, s), 4,70 (1H, m), 3,85 (2H, m, verdeckt durch Lösemittel), 3,15 (2H, m). MS TOF 576 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,98 Minuten.
Es können andere Verbindungen durch das obige Verfahren hergestellt werden:
Beispiel 3
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylycinyl-D-2-naphthylalanyl-D-prolin
¹H NMR (DMSO) 8,35 (1H, s), 7,90 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,45 (5H, m), 7,35 (1H, d), 7,20 (1H, d), 7,05 (7H, m), 5,45 (1H, s), 4,75 (1H, m), 4,10 (1H, m), 3,45 (2H, m, verdeckt. durch Lösemittel), 3,00 (2H, m), 2,00 (1H, m), 1,70 (2H, m), 1,45 (1H, m). MS TOF 576 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/ Acetonitril/TFA) Rt 11,19 Minuten.
Verfahren 3: Erfolgt durch Festphasenstrategie auf einem Symphony Multiple Peptide Synthesiser von Protein Technologies mittels Fmoc Aminosäuren, die über den Rink-Amidlinker an TentaGel S-Harz (Rapp Polymere) gebunden sind: Typischerweise wird das TentaGel-Harz mit einem fünffachen Überschuss des Rink-Linkers, TBTU (1 Äqu.), DIPEA (2 Äqu.) in DMF für mindestens 120 Minuten behandelt. Das Harz wird mit DMF gewaschen und mit 20% Piperidin in DMF vor der weiteren Modifikation von den Schutzgruppen befreit. Das Harz wird weiter durch die Anbindung von Säuren modifiziert. Die Aktivierung der Fmoc-geschützten Aminosäure (2 bis 5 Äqu.) erfolgt durch TBTU/DIPEA, wobei alle Kupplungen (Minimum 120 Minuten) in DMF ausgeführt werden. Eine Abspaltung der Fmoc Gruppe wird mit 20% Piperidin in DMF erreicht. Andere Säuresubstituenten werden als HOBt oder HOAt Ester entweder durch Aktivierung mit HBTU/HATU oder DIPCI mit oder ohne einer Boc Schützung der Aminogruppen zugegeben. Die Abspaltung der Produkte vom Harz erfolgt durch Behandlung (30 Minuten, Umgebungstemperatur) mit 10% Triethylsilan in TFA, Filtration, Eindampfung und Behandlung mit Ether.
Beispiel 4
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycinyl-D-2-naphthylalaninamid
Das Symphony TentaGel S-NH₂ Harz (0,1 mmol, 400 mg, 0,24 mmol/g) wird mit Rink-Linker (0,5 mmol, 270 mg), DMF (2,5 ml), TBTU in DMF (1,25 ml einer 450 mM Lösung) und DIPEA in DMF (1,25 ml einer 900 mM Lösung) behandelt. Das Gemisch wird dann für 2 Stunden mit Stickstoff umgewälzt. Die Schutzgruppenabspaltung und das Waschen erfolgen wie oben.
Das Symphony Rink-TentaGel-Harz (0,1 mmol) wird dann mit Fmoc-D-Naphtylalanin (0,5 mmol, 194 mg), DMF (2,5 ml), TBTU in DMF (1,25 ml einer 450 mM Lösung) und DIPEA in DMF (1,25 ml einer 900 mM Lösung) behandelt. Das Gemisch wird dann für 2 Stunden mit Stickstoff umgewälzt. Die Schutzgruppenabspaltung und das Waschen erfolgen wie oben.
Das Harz (0,1 mmol) wird dann mit Fmoc-D-Phenylglycin (0,5 mmol, 187 mg), DMF (2,5 ml), TBTU in DMF (1,25 ml einer 450 mM Lösung) und DIPEA in DMF (1,25 ml einer 900 mM Lösung) behandelt. Das Gemisch wird dann für 2 Stunden mit Stickstoff umgewälzt. Die Schutzgruppenabspaltung und das waschen erfolgt wie oben.
Eine Probe aus 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäuretrifluoressigsäuresalz (150 mg, 0,5 mol) (Beispiel 88) in trockenem Dimethylformamid (DMF) wird nacheinander mit HOAt (102 mg, 0,75 mmol) und EDC (115 mg, 0,6 mmol) behandelt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird dann in das Reaktionsgefäß auf dem Symphony-Gerät gegeben und für 10 Stunden mit Stickstoff umgewälzt. Das Harz wird dann mit DMF (6 × 5 ml) und DCM (6 × 5 ml) gewaschen und luftgetrocknet. Das Produkt wird mit 10% Triethylsilan in TFA (10 ml) für 30 Minuten abgespalten, das Harz wird abfiltriert, die TFA Lösung wird zur Trockne eingedampft und mit Diethylether unter Bildung des Rohprodukts behandelt. Das Rohprodukt wird dann in Wasser (10 ml) gelöst, filtriert und durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
¹H NMR (CD₃CN) 8,45 (1H, s), 8,05 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,55 (5H, m), 7,45 (1H, d), 7,25 (1H, d), 7,10 (7H, breites m), 5,45 (1H, s), 4,65 (1H, m), 3,15 (2H, m). MS TOF 518 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/ Acetonitril/TFA) Rt 10,67 Minuten.
Verfahren 4: Erfolgt durch Strategie in der löslichen Phase: Typischerweise wird eine aktivierte Boc-Aminosäure mit einem Amin (primär oder sekundär) oder einem Alkohol (1 Äqu.) behandelt. Eine Aktivierung der Boc geschützten Aminosäure erfolgt durch HATU oder TBTU/DIPEA (1 : 2), wobei alle Kupplungen (minimal 120 Minuten) in DMF ausgeführt werden. Nach einer wässrigen Aufarbeitung wird die Abspaltung der Boc-Gruppe mit TFA erreicht. Andere Säuresubstituenten werden entweder als HOBt oder HOAt Ester durch Aktivierung mit HBTU /HATU, EDC oder DIPCI mit oder ohne Boc Schutz von Aminogruppen angefügt. Die Endprodukte werden durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
Beispiel 5
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-methylbenzylamid
Boc-D-Phenylglycin (251 mg, 1 mmol) wird in DMF (3 ml) mit HATU (380 mg, 1 mmol) und DIPEA (350 μl, 2 mmol) gelöst. Zu diesem Gemisch wird 4-Methylbenzylamin (121 mg, 1 mmol) und DIPEA (170 μl, 1 mmol) gegeben. Das Gemisch wird über Nacht gerührt. Das Gemisch wird dann in Ethylacetat aufgenommen und mit Wasser, Natriumcarbonatlösung, Wasser, 10% Chlorwasserstoffsäurelösung und Wasser gewaschen. Das Ethylacetat wird ohne Trocknen verdampft und es erfolgt unmittelbar eine Behandlung mit TFA. Dann wird das TFA bis zur Trockne eingedampft und das Produkt wird mit Diethylether behandelt. TEA (1 ml) wird zugegeben und bis zur Trockne eingedampft. Eine Lösung aus 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäuretrifluoressigsäuresalz (300 mg, 1 mmol) (Beispiel 88) wird in trockenem Dimethylformamid (DMF) nacheinander mit HOAt (204 mg, 1,5 mmol) und EDC (230 mg, 1,2 mmol) behandelt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. Das Gemisch wird dann zu dein D-Phenylglycin-4-methylbenzylamid gegeben und über Nacht gerührt. Das Rohprodukt wird in Wasser/Acetonitril (20 ml) gelöst, filtriert und durch präparative HPLC unter Bildung des reinen Produkts gereinigt.
¹H NMR (CD₃CN) 8,86 (1H, s), 8,32 (1H, d), 7,96 (1H, d), 7,60 (1H, d), 7,46 (5H, m), 7,24 (1H, d), 7,06 (4H, m), 5,64 (1H, s), 4,31 (2H, m), 2,29 (3H, m), MS TOF 426 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,00 Minuten.
Es können andere Verbindungen durch das obige Verfahren hergestellt werden
Beispiel 6
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylalanin-4-methylbenzylamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,65 (1H, s), 8,05 (1H, d), 7,80 (1H, d), 7,45 (1H, d), 7,10 (6H, m), 6,95 (4H, m), 4,70 (1H, m), 4,15 (2H, m), 2,95 (2H, m), 2,20 (3H, m), MS TOF 440 (M + 1)⁺ HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,40 Minuten.
Beispiel 7
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-benzoylpiperidinamid
¹H NMR (CD₃CN) Rotamerengemisch 8,85 (1H, d), 8,25 (1H, m), 8,00 (1H, s), 7,85 (2H, m), 7,58 (2H, m), 7,40 (7H, m), 7,20 (1H, d), 6,03 (1H, s), 4,50 (1H, m), 3,15 (1H, m), 2,80 (3H, m), 1,60 (2H, m), 1,42 (1H, m), 0,45 (1H, m), MS TOF 493 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,48 Minuten.
Beispiel 8
1-Aminoisochinolin-7-phephenglycin-4-(4'-pyridyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,70 (1H, s), 8,15 (1H, d), 7,90 (2H, d) 7,85 (1H, d), 7,45 (1H, d), 7,35 (5H, m), 7,10 (1H, d), 6,80 (2H, d), 6,00 (1H, s), 3,70–3,10 (breites 8H, m), MS TOF 467 (M + 1)⁺ HPLC (Magellan C8, Gradient 1, Wasser /Acetonitril/TFA) Rt 9,00 Minuten.
Beispiel 9
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-4-(4'-aminophenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,80 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,55 (1H, d), 7,35 (5H, m), 7,20 (3H, d), 7,00 (2H, d), 6,10 (1H, s), 3,70–2,60 (mehrere breite 8H, m), MS TOF 481 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/ Acetonitril/TFA) Rt 9,91 Minuten.
Beispiel 10
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-phenpiperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,70 (1H, d), 8,25 (1H, d), 7,90 (1H, d), 7,60 (3H, d), 7,40 (3H, m), 7, 25 (2H, m), 7,15 (1H, d), 6,90 (3H, m), 6,15 (1H, s), 3,85 (1H, m), 3,70 (2H, m), 3,55 (1H, m), 3,15 (3H, m), 2,65 (1H, m), MS TOF 466 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,65 Minuten.
Beispiel 11
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(3-pyridyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,75 (1H, s), 8,15 (2H, m), 7,90 (1H, d), 7,80 (2H, m), 7,65 (1H, m), 7,40 (3H, m), 7,25 (3H, m), 7,10 (1H, d), 6,05 (1H, s), 3,70 (3H, m), 3,30 (4H, m), 2,80 (1H, m), MS TOF 467 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 8,30 Minuten.
Beispiel 12
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(2-pyridyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,75 (1H, s), 8,30 (1H, d), 8,20 (1H, d), 8,10 (1H, d), 7,90 (2H, m), 7,60 (3H, m), 7,45 (3H, m), 7,20 (1H, d), 7,10 (1H, d), 6,90 (1H, m), 6,20 (1H, s), 3,80 (3H, m), 3,55 (4H, m), 3,25 (1H, m), MS TOF 467, (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 8,68 Minuten.
Beispiel 13
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(3-trifluorphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃OD) 8,85 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,90 (1H, d), 7,45 (3H, m), 7,30 (4H, m), 7,15 (1H, d), 7,00 (3H, m), 6,15 (1H, s), 3,80 (1H, m), 3,65 (2H, m), 3,50 (1H, m), 3,15 (2H, m), 3,05 (1H, m), 2,65 (1H, m), MS TOF 534, (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 12,72 Minuten.
Beispiel 14
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylycin-4-(2-methoxyphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,85 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,50 (1H, d), 7,45 (2H, m), 7,30 (3H, m), 7,15 (1H, d), 6,95 (1H, m), 6,85 (1H, d), 6,80 (2H, m), 6,10 (1H, s), 3,70 (3H, m), 3,50 (1H, m), 3,00 (3H, m), 2,45 (1H, m), MS TOF 496 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 9,55 Minuten.
Beispiel 15
1-Aminoisochinolin-7-oyl-phenylglycin-4-(2-methylphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,85 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,55 (1H, d), 7,45 (2H, m), 7,35 (3H, m), 7,15 (1H, d), 6,95 (2H, m), 6,80 (2H, m) 6,10 (1H, s), 3,80 (1H, m), 3,60 (2H, m), 3,45 (1H, m), 2,75 (3H, m), 2,30 (1H, m), MS TOF 480 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 9,75 Minuten.
Beispiel 16
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-4-(3,4-methylendioxybenzyl)-piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN), 8,55 (1H, s), 8,15 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,40 (1H, d), 7,30 (5H, m), 7,00 (1H, d), 6,75 (1H, s), 6,70 (2H, s), 5,85 (1H, s), 3,90 (2H, s), 3,60 (2H, m), 3,00–2,00 (breite Signale 8H), MS TOF 524 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 9,25 Minuten.
Beispiel 17
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(4'-fluorphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,75 (1H, s), 8,20 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,55 (1H, d), 7,40 (5H, m), 7,15 (1H, d), 7,05 (4H, m), 6,05 (1H, s), 3,80 (3H, m, verdeckt durch Lösemittel), 3,55 (1H, m), 3,25 (2H, m), 3,10 (1H, m), 2,60 (1H, m), MS TOF 484 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,31 Minuten.
Beispiel 18
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(2-chlorphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,85 (1H, s), 8,45 (1H, d), 8,10 (1H, d) 7,75 (1H, d), 7,50 (6H, m),7,40 (2H, m), 7,20 (2H, m), 6,30 (1H, s), 4,00 (1H, m), 3,85 (2H, m), 3,70 (1H, m), 3,25 (1H, m), 3,10 (2H, m), 2,60 (1H, m), MS TOF 501 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 12,66 Minuten.
Beispiel 19
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(2-pyrimidyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,85 (1H, s), 8,35 (2H, d), 8,25 (1H, d), 7,90 (1H, d), 7,60 (1H, d), 7,45 (5H, m), 7,20 (1H, d), 6,65 (1H, t), 6,10 (1H, s), 3,90–3,50 (breite Signale 6H), 3,50 (1H, m), 3,20 (1H, m), MS TOF 468 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 9,22 Minuten.
Beispiel 20
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycinpiperidinamid
¹H NMR (CD₃CN) 9,10 (1H, s), 8,80 (1H, d), 8,35 (1H, d), 8,00 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,50 (2H, d), 7,40 (5H, m), 7,25 (1H, d), 6,15 (1H, s), 3,70–3,30 (breites 4H, m), 1,60–1,00 (breites 6H, m), MS TOF 389 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,47 Minuten.
Beispiel 21
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(4'-pyridpiperidinamid
¹H NMR (CDCl₃) 9,05 (1H, s), 8,80 (1H, d), 8,60 (2H, m) 8,35 (1H, d), 8,00 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,55 (3H, m), 7,40 (5H, m), 7,25 (1H, d), 6,20 (1H, s), 4,70 (1H, m), 4,30–1,50 (breites 9H, m) MS TOF 466 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 9,58 Minuten.
Beispiel 22
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-phenoxypiperidinamid
¹H NMR (DMSO) 9,05 (1H, s), 8,40 (1H, d), 8,05 (2H, m), 7,65 (1H, d), 7,55 (2H, m), 7,40 (3H, m), 7,25 (3H, m), 6,90 (3H, m), 6,10 (1H, s), 4,55 (1H, m), 3,85 (2H, m), 3,35 (2H, m), 1,90 (1H, m), 1,60 (1H, m), 1,30 (1H, m), 0,90 (1H, m), MS TOF 481 (M + 1)⁺ HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,95 Minuten.
Beispiel 23
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-2-(RS)-methylcyclohexamid
¹H NMR (DMSO) Diastereomerengemisch (Hauptpeaks angegeben) 9,00 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,60 (1H, d), 7,45 (2H, m), 7,25 (4H, m), 5,60 (1H, s), 3,10 (1H, m), 1,80–0,80 (breites m, 9H), 0,40 (3H, m) MS TOF 417 (M + 1)⁺.
HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,23 Minuten.
Beispiel 24
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-1-S-cyclohexylethylamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,80 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,90 (1H, d), 7,50 (1H, d), 7,45 (2H, m), 7,30 (4H, m), 7,15 (1H, d), 5,35 (1H, s), 3,60 (1H, m), 1,70–0,50 (breites m, 11H) 1,00 (3H, d) MS TOF 431 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,09 Minuten.
Beispiel 25
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-methoxybenzylamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,60 (1H, s), 8,05 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,35 (1H, d), 7,30 (2H, m), 7,15 (3H, m), 7,00 (1H, d), 6,85 (2H, d), 6,60 (2H, d), 5,45 (1H, s), 4,10 (2H, m), MS TOF 441 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,91 Minuten.
Beispiel 26
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-3,4-methylendioxybenzylamido
¹H NMR (CD₃CN) 8,65 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,45 (3H, m), 7,30 (3H, m), 7,15 (1H, d), 6,65 (3H, m), 5,55 (1H, s), 4,20 (2H, m), MS TOF 455 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient. 3, Wasser /Acetonitril/TFA) Rt 11,02 Minuten.
Beispiel 27
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-1-naphthylamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,45 (1H, s), 8,20 (1H, d), 7,80 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,60 (2H, m), 7,50 (1H, m), 7,4–7,0 (9H, m), 6,80 (1H, d), 5,80 (1H, s), 4,60 (2H, m), MS TOF 461 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,61 Minuten.
Beispiel 28
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-1,2,3,4-tetrahydro-1-naphthylamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,75 (1H, s), 8,30 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,65 (2H, d), 7,40 (3H, m), 7,30 (1H, d), 7,10 (5H, m), 5,65 (1H, s), 5,10 (1H, m), 2,75 (2H, m) 2,4–1,5 (4H, breites m), MS TOF 451 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,60 Minuten.
Beispiel 29
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-1-indanamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,75 (1H, s), 8,30 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,55 (3H, m), 7,40 (3H, m), 7,30 (1H, d), 7,20 (4H, m), 5,65 (1H, s), 5,40 (1H, m), 2,90 (2H, m) 2,50 (1H, m), 1,80 (1H, m), MS TOF 437 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser Acetonitril/TFA) Rt 11,26 Minuten.
Beispiel 30
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-1,2,3,4-tetrahydroisochinolinamid
¹H NMR (DMSO) 9,20 (1H, s), 8,55 (1H, d), 8,20 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,70 (2H, m), 7,55 (3H, m), 7,40 (1H, d), 7,25 (4H, m), 6,40 (1H, s), 4,80 (2H, m), 3,90 (2H, m) 3,90 (2H, m), MS TOF 437 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,34 Minuten.
Beispiel 31
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-{3-(3-aminophenyl)methyl}anilid
¹H NMR (DMSO) 9,00 (1H, s), 8,30 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,50 (2H, m), 7,30 (4H, m), 7,15 (4H, m), 6,75 (4H, m), 5,75 (1H, s), 3,80 (2H, s), MS TOF 502 (M + 1)⁺ HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 9,48 Minuten.
Beispiel 32
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-3-acetylphenylanilid
¹H NMR(DMSO) 8,85 (1H, s), 8,25 (1H, s), 8,10 (1H, d) 7,85 (2H, m), 7,75 (1H, d), 7,65 (3H, m), 7,40 (3H, m), 6,95 (2H, m), 5,95 (1H, s), 2,50 (3H, s), MS TOF 439 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril /TFA) Rt 10,55 Minuten.
Beispiel 33
1-Aminoisochinolin-7-oyl-phenylglycin-3-(1-hydroxyethyl)phenylanilid
¹H NMR (DMSO) 8,95 (1H, s), 8,15 (1H, s), 7,95 (1H, d), 7,80 (1H, d), 7,65 (2H, m), 7,55 (1H, d), 7,45 (3H, m), 7,30 (1H, d), 7,05 (3H, m), 5,95 (1H, s), 4,75 (1H, m), 1,40 (3H, d), MS TOF 441 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,03 Minuten.
Beispiel 34
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(4'-chlorphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,85 (1H, s), 8,30 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,65 (2H, d), 7,50 (3H, m), 7,30 (3H, m), 7,00 (2H, d), 6,15 (1H, s), 3,95 (1H, m), 3,70 (3H, m), 3,25 (2H, m), 3,05 (1H, m), 2,55 (1H, m), MS TOF 501, (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,95 Minuten.
Beispiel 35
1-Aminoisochinolin-7-oyl-phenglycin-4-(4'-hydroxyphenylperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,85 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,55 (3H, m), 7,45 (3H, m), 7,25 (3H, m), 6,90 (2H, d), 6,15 (1H, s), 3,95 (3H, m), 3,65 (1H, m, verdeckt durch Lösemittel), 3,40 (3H, m), 2,90 (1H, m), MS TOF 481 (M + 1)⁺ HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 7,84 Minuten.
Beispiel 36
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(4'-nitrophenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,70 (1H, s), 8,15 (1H, d), 7,95 (2H, d), 8,80 (1H, d), 7,50 (3H, m), 7,30 (3H, m), 7,05 (1H, d), 6,70 (2H, d), 6,00 (1H, s), 3,60 (3H, m), 3,30 (4H, m), 2,80 (1H, m), MS TOF 511 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,81 Minuten.
Beispiel 37
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(4'-methylphepiperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,85 (1H, s), 8,45 (1H, d), 8,05 (1H, d), 7,70 (3H, m), 7,55 (3H, m), 7,35 (1H, d), 7,25 (2H, d), 7,00 (2H, d), 6,30 (1H, s), 3,95 (3H, m), 3,70 (1H, m), 3,25 (3H, m), 2,60 (1H, m), 2,40 (3H, s), MS TOF 480, (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitryl/TFA) Rt 10,27 Minuten.
Beispiel 38
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(4'-methoxyphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,85 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,55 (3H, m), 7,40 (3H, m), 7,20, (1H, d), 7,15 (2H, d), 6,95 (2H, d), 6,20 (1H, s), 3,85 (3H, m), 3,75 (3H, s), 3,60 (1H, m), 3,30 (2H, m), 3,15 (1H, m), 2,75 (1H, m), MS TOF 496 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 8,86 Minuten.
Beispiel 39
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D,L-4-fluorphenylglycin-4-(4'-fluorphenyl)piperazinamid
¹H NMR (DMSO) 9,05 (1H, s), 8,35 (1H, d), 8,05 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,55 (2H, m), 7,25 (3H, m), 7,05 (2H, m), 6,90 (2H, m), 6,15 (1H, s), 3,60 (3H, m), 3,05 (3H, m), 2,90 (1H, m), 2,60 (1H, m), MS TOF 502 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,13 Minuten.
Beispiel 40
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-cyclohexylglycin-4-(4'-fluorphenyl)piperazinamid
¹H NMR (DMSO) 9,05 (1H, s), 8,70 (1H, d), 8,05 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,30 (1H, d), 7,00 (4H, m), 4,90 (1H, m), 3,85 (2H, m), 3,70 (2H, m), 3,05 (4H, m), 1,90 (1H, m), 1,70 (4H, m), 1,15 (6H, m), MS TOF 490 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,19 Minuten.
Beispiel 41
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-4-(3-chlorphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,80 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,90 (1H, d), 7,50 (3H, m), 7,40 (3H, m), 7,20 (2H, m), 6,85 (3H, m), 6,15 (1H, s), 3,80 (1H, m), 3,65 (2H, m), 3,55 (1H, m), 3,20 (2H, m), 3,05,(1H, m), 2,55 (1H, m), MS TOF 501, (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,47 Minuten.
Beispiel 42
1-Aminoisocinolin-7-oyl-phenylglycin-4-(3-methylphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,80 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,55 (3H, m), 7,45 (3H, m) 7,25 (2H, m) 6,95 (3H, m), 6,15 (1H, s), 3,95 (1H, m), 3,75 (2H, m), 3,65 (1H, m), 3,30 (2H, m), 3,15 (1H, m), 2,60 (1H, m), 2,30 (3H, s), MS TOF 480 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,20 Minuten.
Beispiel 43
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglicin-4-(3-methoxyphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,80 (1H, s), 8,20 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,45 (1H, d), 7,40 (2H, m), 7,25 (3H, m), 7,05 (1H, d), 6,95 (1H, m), 6,35 (1H, d), 6,30 (2H, m), 6,10 (1H, s), 3,80 (1H, m), 3,60 (2H, m), 3,55 (3H, s), 3,45 (1H, m), 3,05 (2H, m), 2,85 (1H, m), 2,45 (1H, m), MS TOF 496, (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/ TFA) Rt 10,85 Minuten.
Beispiel 44
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(2-fluorphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,80 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,50 (6H, m), 7,20 (2H, d), 7,00 (4H, m), 6,15 (1H, s), 3,05 (6H, m), 2,45 (1H, m), 2,15 (1H, m), MS TOF 484 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,06 Minuten.
Beispiel 45
1-Aminoisochnolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(2-hydroxyphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,85 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,50 (6H, m), 7,25 (3H, m), 7,00 (2H, m), 6,15 (1H, s), 4,00 (1H, m), 3,80 (2H, m), 3,70 (1H, m), 3,35 (3H, m), 2,80 (1H, m) MS TOF 482 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 8,44 Minuten.
Beispiel 46
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-4-(2,4-difluorphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃ON) 8,85 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,50 (6H, m), 7,25 (1H, d), 6,95 (3H, m), 6,15 (1H, s), 3,85 (1H, m), 3,65 (2H, m), 3,50 (1H, m), 2,95 (3H, m), 2,40 (1H, m), MS TOF 502 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,27 Minuten.
Beispiel 47
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(2,3-dimethylphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃OH) 8,60 (1H, s), 8,05 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,20 (6H, m), 6,95 (1H, d), 6,65 (1H, m), 6,55 (1H, d), 6,45 (1H, d), 5,95 (1H, s), 3,60 (1H, m), 3,50 (2H, m), 3,30 (1H, m), 2,55 (3H, m), 2,10 (1H, m) 1,90 (6H, d), MS TOF 494 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,98 Minuten.
Beispiel 48
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(2,4-dimethylphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃OH) 8,65 (1H, s), 8,05 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,35 (1H, d), 7,20 (5H, m), 6,95 (1H, d), 6,65 (1H, s), 6,60 (1H, d), 6,50 (1H, d), 5,95 (1H, s), 3,60 (1H, m), 3,50 (2H, m), 3,30 (1H, m), 2,55 (3H, m), 2,10 (1H, m) 1,90 (6H, d), MS TOF 494 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 12,00 Minuten.
Beispiel 49
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(2,6-dimethylphenyl)piperazinamid
¹H NMR (CD₃OH) 8,70 (1H, s), 8,10 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,30 (3H, m), 7,20 (3H, m), 7,00 (1H, d), 6,65 (3H, m), 5,95 (1H, s), 3,85 (1H, m), 3,40 (3H, m), 2,80 (2H, m), 2,65 (1H, m), 2,30 (1H, m) 2,10 (3H, s), 1,90 (3H, s). MS TOF 494 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetontril/TFA) Rt 12,04 Minuten.
Beispiel 50
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-4-(2,5-dimethylphenyl)perazinamid
¹H NMR (CD₃OH) 8,65 (1H, s), 8,05 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,35 (1H, d), 7,25 (2H, m), 7,15 (3H, m), 6,95 (1H, d), 6,70 (1H, d), 6,50 (1H, d), 6,45 (1H, s), 5,95 (1H, s), 3,50 (1H, m), 3,50 (2H, m), 3,30 (1H, m), 2,55 (3H, m), 2,10 (1H, m), 1,95 (6H, d), MS TOF 494 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/ Acetonitril/TFA) Rt 12,09 Minuten.
Beispiel 51
1-Aminoisochinolin-7-yl-cyclohexylglycin-4-(4'-pyridyl)piperazinamid
¹H NMR (DMSO) 9,05 (1H, s), 8,35 (1H, d), 8,25 (2H, d), 8,05 (1H, d), 7,75 (1H, d), 7,25 (1H, d), 7,15 (2H, d), 4,80 (1H, m) 4,10–3,50 (breites 8H, verdeckt durch Lösemittel), 1,95 (2H, m), 1,70 (4H, m), 1,20 (5H, m). MS TOF 473 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 8,00 Minuten.
Beispiel 52
1-Aminoisochinolin-7-oyl-1-D-phenylglycin-4-phenylpiperidinamid
¹H NMR (CD₃CN) 8,90 (1H, s), 8,35 (1H, d), 8,05 (1H, d) 7,70–7,20 (11H, m), 7,10 (1H, d), 6,20 (1H, s), 4,70 (1H, m), 3,30 (1H, m), 2,80 (2H, m), 1,80 (2H, m), 1,50 (2H, m), 0,50 (1H, m), MS TOF 465 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,77 Minuten.
Beispiel 53
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-4-benzpiperidinamid
¹H NMR (CD₃CN) Rotamerengemisch, 8,65 (1H, d), 8,25 (1H, m), 7,80 (1H, m), 7,55–7,00 (12H, m), 6,10 (1H, m), 4,50 (1H, m), 3,90 (1H, m), 2,80 (4H, m), 1,60 (2H, m), 1,25 (2H, m), 1,00 (1H, m), 0,25 (1H, m), MS TOF 479 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 12,66 Minuten.
Beispiel 54
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-piperidinopiperidinamid
¹H NMR (CD₃CN) Conformerengemisch 8,70 (1H, d), 8,25 (1H, m), 8,10 (1H, m), 7,75 (1H, m), 7,45 (5H, m), 7,05 (1H, d), 6,10 (1H, m), 4,70 (1H, m), 4,10 (1H, m), 3,50–3,00 (breites 3H, m), 3,00–2,30 (breites 7H, m), 2,10 (1H, m), 1,80 (5H, m), 1,40 (1H, m), MS TOF 472 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 2, Wasser /Acetonitril/TFA) Rt 12,09 Minuten.
Beispiel 55
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-cyclohexylglycin-1-S-cyclohexylethylamid
¹H NMR (DMSO) 9,05 (1H, s), 8,35 (1H, d), 8,05 (1H, d), 7,75 (1H, d), 7,25 (1H, d), 4,40 (1H, m), 3,65 (1H, m), 1,85–1,50 (breites 11H, m), 1,35–0,80 (breites 11H, m), 1,05 (3H, d), MS TOF 423 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,68 Minuten.
Verfahren 5
Durch Festphase: Typischerweise wird ein Wang-Harz, das mit 4-Nitrophenylcarbonat modifiziert ist (siehe S. W. Kim et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 8 (1988) 735–738) mit 4,4-Bipiperidin umgesetzt. Das Harz wird weiter durch die Anbindung von Säuren modifiziert. Die Aktivierung der Fmoc geschützten Aminosäure (2 bis 5 Äquivalente) erfolgt durch TBTU/DIPEA, wobei alle Kupplungen (Minimum 120 Minuten) in DMF ausgeführt werden. Die Abspaltung der Fmoc Gruppe wird mit 20% Piperidin in DMF erreicht. Andere Säuresubstituenten werden als HOBt oder HOAt Ester entweder durch eine Aktivierung mit HBTU/HATU oder DIPCI mit oder ohne Boc Schutz der Aminogruppen angefügt. Die Abspaltung der Produkte vom Harz erfolgt durch Behandlung (30 Minuten, Umgebungstemperatur) mit 10% Triethylsilan in TFA, einer Filtration, Eindampfung und Behandlung mit Diethylether.
Beispiel 56
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4,4-bipiperidinamid
Wang-Harz (1 g, l mmol/g) lässt man in trockenem DCM (25 ml) quellen, wobei hierzu NMM (0,6 ml, 5,6 mmol) und 4-Nitrophenylchlorformiat (400 mg, 2 mmol) gegeben werden. Das Harz wird über Nacht gerührt und dann mit DCM (25 ml, sechsmal) und DMF (25 ml, sechmal) gewaschen. Dann wird 4,4'-Bipiperidin (332 mg, 2 mmol) in DMF (20 ml) zugegeben und das Harz wird über Nacht gerührt. Das Harz wird dann mit DMF (25 ml, sechsmal), DCM (25 ml, sechsmal) und Diethylether (25 ml, dreimal) gewaschen und darin luftgetrocknet.
Das oben modifizierte Harz (100 mg, 0,1 mmol) wird mit Fmoc-D-Phenylglycin (0,5 mmol, 187 mg), DMF (2,5 ml), TBTU in DMF (1,25 ml einer 450 mM Lösung) und DIPEA in DMF (1,25 ml einer 900 mM Lösung) behandelt. Das Gemisch wird für 2 Stunden mit Stickstoff umgewälzt. Die Schutzgruppenabspaltung und das Waschen erfolgen wie in Verfahren 1.
Eine Lösung aus 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäuretrifluoressigsäuresalz (150 mg, 0,5 mmol) (Beispiel 88) in trockenem Dimethylformamid (DMF) wird nacheinander mit HOAt (102 mg, 0,75 mmol) und EDC (115 mg, 0,6 mmol) behandelt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird in den Reaktionskessel im Symphonygerät gegeben und 10 Stunden mit Stickstoff umgewälzt. Das Harz wird mit DMF (6 × 5 ml) und DCM (6 × 5 ml) gewaschen und luftgetrocknet. Das Produkt wird vom Harz mit 10% Triethylsilan in TFA (10 ml) für 30 Minuten abgespalten, dann wird das Harz abfiltriert und die TFA Lösung wird zur Trockne eingedampft und mit Diethylether unter Bildung des Rohprodukts behandelt. Das Rohprodukt wird in Wasser (10 ml) gelöst, filtriert und durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
¹H NMR (DMSO) 8,80 (1H, s), 8,15 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,50 (1H, d), 7,25 (2H, m), 7,10 (3H, m), 7,00 (1H, d), 5,90 (1H, s), 4,30 (1H, m), 3,80 (1H, m), 3,3–2,3 (8H, verschiedene m, verdeckt durch Lösemittel), 1,80–0,50 (8H, verschiedene m). MS TOF 472 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 1, Wasser/Acetonitril (TFA), Rt 7,32 Minuten.
Andere Verbindungen können durch das obige Verfahren hergestellt werden:
Beispiel 57
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D,L-2-thienylglycin-4,4-bipiperidinamid
MS TOF 478 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,43 Minuten.
Beispiel 58
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D,L-1-naphthylglycin-4,4-bipiperidinamid
MS TOF 522 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 12,99 Minuten.
Beispiel 59
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-cyclohexylglycin-4,4-bipiperidinamid
MS TOF 478 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 12,65 Minuten.
Beispiel 60
1-Aminoisochinolin-7-oyl-L-phenylglycin-4,4-bipiperidinamid
MS TOF 472 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,89 Minuten.
Beispiel 61
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D,L-3-chlorphenylglycin-4,4-bipiperidinamid
MS TOF 507 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 12,54 Minuten.
Beispiel 62
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-isoleucin-4,4-bipiperidinamid
MS TOF 452 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,04 Minuten.
Verfahren 6
Typischerweise wird Boc-(R)-1,2-Diamino-1-phenylethan durch das Verfahren von P. O'Brien et al. J. Med. Chem. 37 (1994) 12, 1810–1822 hergestellt. Die freie Aminogruppe wird mit einem Säurechlorid oder einer aktivierten Säure umgesetzt, wobei alle Kupplungen (Minimum 120 Minuten) in DMF ausgeführt werden. Nach einer wässrigen Aufarbeitung wird die Abspaltung der Boc Gruppe mit TFA erreicht. Andere Säuresubstituenten werden als HOBt oder HOAt Ester entweder durch Aktivierung mit HBTU/HATU, EDC oder DIPCI mit oder ohne Boc Schutz der Aminogruppen angefügt. Die Endprodukte werden durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
Beispiel 63
2(R)-{[N-(1-Aminoisochinolin)-7-oyl]amino}-2-phenyl-4-methylbenzamid
Boc-(R)-1,2-Diamino-1-phenylethan (2 g) wird in DCM (80 ml) gelöst und Toluoylchlorid (1,2 ml) und TEA 1,1 ml) werden zugegeben. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Das Gemisch wird dann mit 2 M Natriumhydroxidlösung, Wasser, 5% Chlorwasserstoffsäure und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das Produkt wird dann aus Hexan umkristallisiert, in DCM (50 ml) gelöst und für 2 Stunden mit TFA behandelt. Das Lösemittel wird eingedampft und der Feststoff wird mit Diethylether behandelt.
Eine Lösung aus 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäuretrifluoressigsäuresalz (300 mg, 1 mmol) in trockenem DMF (10 ml) wird nacheinander mit HOAt (204 mg, 1,5 mmol) und EDC (230 mg, 1,2 mmol) behandelt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. Das Gemisch wird zum R-Amino-2-phenylethyl-4-methylbenzamid-TFA salz (0,38 g, 1,03 mmol) mit DIPEA (129 mg, 1 mmol) gegeben und über Nacht gerührt. Nach der wässrigen Aufarbeitung werden die Endprodukte durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
¹H NMR (DMSO) 8,90 (1H, s), 8,35 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,60 (2H, d), 7,55 (1H, d), 7,25 (6H, m), 5,35 (1H, m), 3,65 (2H, m), 2,25 (3H, s). MS TOF 425 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA), Rt 10,88 Minuten.
Andere Verbindungen können durch das obige Verfahren hergestellt werden:
Beispiel 64
2(R)-{(N-(1-Aminoisochinolin)-7-oyl]amino}-2-phenylethyl-4-methoxybenzamid
¹H NMR (DMSO), 9,00 (1H, s), 8,50 (1H, d), 8,20 (1H, d), 7,85 (3H, m), 7,60 (1H, d), 7,45 (5H, m), 7,15 (2H, d), 5,55 (1H, m), 3,95 (3H, s), 3,85 (2H, m), MS TOF 441 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,90 Minuten
Beispiel 65
2(R)-{(N-(1-Aminoisochinolin)-7-oyl]amino}-2-phenylethylbenzamid
¹H NMR (CD₃CD) 8,75 (1H, s), 8,25 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,60 (2H, d), 7,55 (1H, d), 7,30 (9H, m), 5,35 (1H, m), 3,85 (2H, m), MS TOF 410 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/ TFA) Rt 10,26 Minuten.
Beispiel 66
2(R)-{(N-(1-Aminoisochinolin)-7-oyl]-amino}-2-phenylethylbenzylamid
¹H NMR (CD₃CD) 8,65 (1H, s), 8,10 (1H, d), 7,80 (1H, d), 7,55 (1H, d), 7,55 (1H, d), 7,25 (7H, m), 7,05 (1H, d), 6,95 (3H, m), 5,25 (1H, m), 4,15 (1H, d), 3,75 (2H, m), MS TOF 424 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 10,13 Minuten.
Beispiel 67
2(R-{(N-(1-Aminoisochinolin)-7-oyl]-amino}-2-phenylethylbenzosulfonamid
¹H NMR (CD₃OD) 8,55 (1H, s), 7,95 (1H, d), 7,70 (4H, m), 7,45 (3H, m), 7,20 (5H, m), 6,90 (1H, d) 5,10 (1H, m), 3,30 (2H, m), MS TOF 447 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,22 Minuten.
Beispiel 68
2(R)-{(N-(1-Aminoisochinolin)-7-oyl]-amino}-2-phenylethylcyclohexancarboxamid
¹H NMR(CD₃OD) 8,55 (1H, s), 7,95 (1H, d), 7,70 (2H, m), 7,25 (5H, m), 6,95 (1H, d), 5,20 (1H, m), 3,50 (2H, m), 2,05 (1H, m), 1,6–1,0 (10H, breites m), MS TOF 417 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril /TFA) Rt 11,29 Minuten.
Beispiel 69
2(R)-{(N-(1-Aminoisochinolin)-7-oyl]amino}-2-phenylethylcyclohexylacetamid
¹H NMR (CD₃OD) 8,55 (1H, s), 7,95 (1H, d), 7,70 (2H, m), 7,25 (5H, m), 6,95 (1H, d), 5,20 (1H, m), 3,55 (2H, m) 2,00 (2H, m), 1,7–0,6 (11H, breites m), MS TOF 431 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 11,49 Minuten.
Verfahren 7
Typischerweise wird 4,4'-Bipiperidin mit der tert-Butyloxycarbonylgruppe (Boc) monogeschützt. Die freie Aminogruppe wird mit einem Alkylierungsmittel umgesetzt. Nach einer wässrigen Aufarbeitung wird die Abspaltung der Boc Gruppe mit TFA erreicht. Andere Säuresubstituenten werden als HOBt oder HOAt Ester entweder durch Aktivierung mit HBTU/HATU, EDC oder DIPCI mit oder ohne Boc-Schutz der Aminogruppen angefügt. Die Endprodukte werden durch präparative Umkehrphasen HPLC gereinigt.
t-Butyl-4-(piperidin-4-yl)piperidin-1-carboaylat-4,4'-bipiperidindihydrochlorid (5 g, 20,7 mmol) wird in NaOH (30 ml, 2 N) und Ethanol (50 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wird Di-tert-Butyldicarbonat (4,52 g, 20,7 mmol) gegeben und das Reaktionsgemisch wird über Nacht unter Rühren stehengelassen. Das Ethanol wird unter Vakuum entfernt und die basische Phase wird mit Ethylacetat (100 ml) extraliert, um das DiBoc Material zu entfernen. Das gewünschte Produkt wird dann in wässrige 5% HCl extrahiert und der pH wird auf 11 eingestellt. Die Extraktion mit Ethylacetat (100 ml), ein Waschen mit Kochsalzlösung und eine Trocknung ergeben die Titelverbindung als weißen Feststoff.
Beispiel 70
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D phenylglycin-4,4'-(1'-ethoxycarbonyl)bipiperidinamid
Zu einer Suspension aus t-Butyl-4-(piperidin-4-yl)piperidin-1-carboxylat (536 mg, 2 mmol) und Kaliumcarbonat (580 mg, 4,2 mmol) in Aceton (25 ml) wird Ethylbromacetat (248 μl, 2,2 mmol) gegeben und das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren stehengelassen. Das Aceton wird entfernt und der Rückstand wird mit Ethylacetat behandelt, mit Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das Produkt wird nach der Entfernung der Boc Schutzgruppe weiter wie in Verfahren 4 behandelt.
¹H NMR (CD₃CN) 8,55 (1H, s), 8,15 (1H, d), 8,05 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,35 (2H, m), 7,20 (3H, m), 7,00 (1H, d), 5,90 (1H, s), 4,45 (1H, m), 4,10 (2H, m), 3,80 (1H, m), 3,70 (2H, m), 3,3–2,3 (8H, verschedene m, durch Lösemittel verdeckt), 1,70–0,70 (8H, verschiedene m), 1,10 (3H, t). MS TOF 558 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA), Rt 8,49 Minuten.
Es können andere Verbindungen durch das obige Verfahren hergestellt werden:
Beispiel 71
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4,4'-(1'-ethyl)bipiperidinamid
¹H NMR (CD₃OH) 8,75 (1H, s), 8,15 (1H, d), 7,75 (1H, d), 7,45 (1H, d), 7,25 (5H, m), 7,05 (1H, d), 5,95 (1H, s), 4,45 (1H, m), 3,80 (1H, m), 3,70 (2H, m), 3,35 (2H, m), 2,90 (2H, m), 2,60 (4H, m), 1,85 (1H, m), 1,65 (2H, m), 1,40–0,70 (7H, verschiedene m), 1,10 (3H, t). MS TOF 500 (M + 1)⁺, HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/ Acetonitril/TFA) Rt 7,93 min.
Beispiel 72
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4,4'-(1'-propyl)bipiperidinamid
¹H NMR (CD₃OH) 8,60 (1H, s), 8,05 (1H, d), 7,80 (1H, d), 7,45 (1H, d), 7,35 (5H, m), 7,10 (1H, d), 5,95 (1H, s), 4,35 (1H, m), 3,85 (1H, m), 3,40 (3H, m), 3,05–2,55 (breites 6H, m), 1,90 (1H, m), 1,60 (5H, m), 1,25 (4H, m), 0,80 (4H, m). MS TOF 514 (M + 1)⁺.
HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 8,20 min.
Beispiel 73
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenglycin-4,4'-(1'-carboxymethyl)bipiperidinamid
1-Aminoisochin-7-oyl-D-phenylglycin-4-4'-(1'-ethoxycarbonylmethyl)bipiperidinamid (40 mg, 0,05 mmol) wird mit 2 N Natriumhydroxid (100 μl, 4 Äquivalente) in Ethanol (5 ml) über Nach behandelt. Eine Reinigung durch präparative HPLC ergibt die Titelverbindung als weißen Feststoff.
¹H NMR (CD₃CN) 8,80 (1H, s), 8,35 (1H, d), 8,15 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,35 (2H, m), 7,20 (3H, m), 6,95 (1H, d), 5,90 (1H, s), 4,45 (1H, m), 3,80 (1H, m), 3,65 (2H, m), 3,40 (2H, m), 3,00–2,30 (5H, verschiedene m), 1,70–0,70 (9H, verschiedene m).
MS TOF 530 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA) Rt 7,88 min.
Beispiel 74
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4,4'-(1'-amidomethyl)bipiperidinamid
1-Aminoisochin-7-oyl-D-phenylglycin-4,4'-(1'-ethoxymethyl)bipiperidinamid (40 mg, 0,05 mmol) wird mit überschüssigem Ammoniakgas in wasserfreiem Ethanol (5 ml) für 5 Tage behandelt. Eine Reinigung durch präparative HPLC ergibt die Titelverbindung als weißen Feststoff.
¹H NMR (CD₃CN) 8,65 (1H, s), 8,15 (1H, d), 7,75 (1H, d), 7,40 (3H, m), 7,25 (3H, m), 7,05 (1H, d), 5,95 (1H, s), 4,45 (1H, m), 3,90 (1H, m), 3,65 (2H, m), 3,35 (2H, m), 3,00–0,80 (14H, verschiedene m, verdeckt durch das Lösemittel).
MS TOF 529 (M + 1)⁺: HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitil/TFA). Rt 7,73 min.
Beispiel 75
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4,4'-(1'-methyl)bi)piperidinamid
CBz-D-Phenglycin-4-yl-(boc)piperidin-4-piperidinamid
Zu einer Lösung aus CBz-D-Phenylglycin (877 mg, 3,1 mmol) in wasserfreiem THF (40 ml) werden bei – 25°C n-Methylmorpholin (336 μl, 3,1 mmol) und Isobutylchlorformiat (419 μl, 3,1 mmol) gegeben Die entstehende Suspension kann bei dieser Temperatur für 5 min rühren und dann wird t-Butyl-4-(piperidin-4-yl)piperidin-1carboxylat (825 mg, 3,1 mmol) in wasserfreiem THF (5 ml) in einer Portion bei –25°C zugegeben und das Reaktionsgemisch kann sich über 1 Stunde auf Raumtemperatur erwärmen. Das N-Methylmorpholinhydrochlorid wird abfiltriert und das THF wird unter Vakuum entfernt. Der entstehende Feststoff wird mit TFA/DCM (20 ml, 1 : 1) behandelt und das Reaktionsgemisch lässt man für 2 Stunden rühren. Die organischen Bestandteile werden unter Vakuum entfernt, der Rückstand wird in Ethylacetat (100 ml) gelöst, mit wässriger Natriumbicarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und unter Bildung der Titelverbindung als klares Öl (1,12 g, 84% über zwei Schritte) konzentriert.
CBz-D-Phenylgycin-4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperidinamid
Zu einer Lösung aus CBz-D-Phenylglycin-4-[1-boc-piperidin-4-yl]piperidinamid (1,1 g, 2,5 mmol) in Acetonitril (40 ml) und wässrigem Formaldehyd (10 ml) wird Natriumcyanoborhydrid (315 mg, 5 mmol) portionsweise über 10 nun gegeben Das Rektionsgemisch kann für 3 Stunden rühren und wird dann in Wasser (50 ml) gegossen, das konzentrierte Ammoniakklösung (5 ml) enthält und kann für 15 min rühren. Eine Extraktion mit Ethylacetat (100 ml), Waschen mit Kochsalzlösung und Trocknen ergibt die Titelverbindung als farbloses Öl (1,1 g, 97%).
D-Phenylglycin-4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperidinamid
Eine kräftig gerührte Lösung aus CBz-D-Phenylglycin-4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperidinainid (1,1 g, 2,45 mmol) in Methanol (120 ml), die Palladium auf Kohle (200 mg) enthält wird mit Wasserstoffgas (Ballon) bei atmosphärischem Druck über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird durch Celite filtriert und unter Bildung der Titelverbindung als farbloses Öl (585 mg, 76%) konzentriert.
Das entstehende Produkt wird unter Verwendung des Verfahrens 4 an die 1-Amino-isochinolincarbonsäure (TFA Salz) gekuppelt.
¹H NMR (CD₃CN) 8,60 (1H, s), 8,10 (1H, d), 7,75 (1H, d), 7,45 (3H, m), 7,25 (3H, m), 7,00 (1H, d), 5,90 (1H, s), 4,30 (1H, m), 3,80 (1H, m), 3,3–2,3 (8H, verschedene m, verdeckt durch das Lösemittel, 2,50 (3H, s), 1,80–0,50 (8H, verschiedene m).
MS TOF 486 (M + 1)⁺.
HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 9,11 min.
Beispiel 76
2(R)-{1N-(1-Aminoisochinolin)-7-oyl]amino}-2-phenyl-4-methylphenylcarbonat
Zu einer Lösung aus Boc-(R)-Phenylglycinol (500 mg, 3,65 mmol) in DMF (20 ml) wird 4-Methylphenylisocyanat (0,5 ml, 4,0 mmol) gegeben und das Gemisch wird vor dem Stehen bei Raumtemperatur über Nacht auf 50°C erwärmt. Eine Verdünnung mit Ethylacetat und Waschen mit gesättigtem Natriumbicarbonat ergibt nach dem Trocknen (Magnesiumsulfat) und Verdampfen des Lösemittels das rohe Zwischenprodukt, das durch Blitzchromatographie (Silicagel, EtOAC 0–20% in DCM) gereinigt wird.
Eine Schutzgruppenabspaltung des Amins wird unter Verwendung von 50% TFA in DCM (30 min), Verdampfen des Lösemittels unter verringertem Druck, Lösen in DCM, Waschen mit gesättigtem Natriumbicarbonat, Trocknen (Magnesiumsulfat) und Eindampfen ausgeführt.
Eine Kupplung des Zwischenprodukts an 1-Amino-isochinolincarbonsäure (TFA Salz) wird unter Verwendung des Standardverfahrens 4, ausgeführt.
¹H NMR (DMSO) 9,05 (1H, s), 8,40 (1H, d), 8,05 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,55–7,20 (7H, m), 7,05 (3H, m), 5,55 (1H, m), 4,35 (2H, d), 2,25 (3H, s).
MS TOF 441 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 11,60 min.
Beispiel 77
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-2-(4-aminophenoxy)cyclopentylamid
Cyclopentanoxid (5 g) wird in Ethanol (100 ml) und Wasser (25 ml) gelöst und mit Natriumazid (3,9 g) und Ammoniumchlorid (3,2 g) am Rückfluss für 8 Stunden behandelt. Das Gemisch wird gekühlt, das überschüssige Lösemittel wird bei verringertem Druck verdampft und mit Ether extrahiert. Die organische Lösung wird mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wird in Hexan aufgenommen, mit Wasser unter Entfernung des verbleibenden Ethanols gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter Bildung von Trans-1-Azidocyclopentan-2-ol, 3,6 g eingedampft.
Trans-1-azidocyclopentan-2-ol, 1,27 g, wird in DMF gelöst und mit Natriumhydrid (400 mg, 60%) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. 4-Fluornitrobenzol (1,41 g) wird zugegeben und das Gemisch wird bei 50°C für 4 Stunden gerührt und dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wird mit Wasser gestoppt und mit Ether extrahiert. Die organische Lösung wird mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Eine Reinigung durch Blitzchromatographie (SiO₂–20% DCM/Hexan) ergibt trans-2-(4-Nitrophenoxy)cyclopentylazid.
¹H NMR (CDCl₃) 8,22 (2H, d), 6,98 (2H, d), 5,63 (1H, m), 4,07 (1H, m), 2,20 (2H, m), 1,87 (4H, m).
Eine Hydrierung in Ethanol (30 ml) unter Verwendung von 5% Pd auf C (100 mg) ergibt cis-2-(4-Aminophenoxy)cyclopentylamin.
Trans-2-(4-aminophenoxy)cyclopentylamin wird unter Verwendung von TBTU/DIPEA/DMF wie in Verfahren 4 an Boc-D-phenylglycin gekuppelt und, vom entstehenden Produkt (TFA/DCM) werden die Schutzgruppen abgespalten und an 1-Amino-isochinolincarbonsäure (TFA Salz) unter Verwendung des Verfahrens 4 gekuppelt.
¹H NMR (CD₃CN) 8,55 (1H, s), 8,10 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,35 (1H, d), 7,25 (5H, m), 7,00 (1H, d), 6,55 (4H, s), 5,40 (1H, s), 4,30 (1H, m), 4,00 (1H, m), 2,00–1,00 (breites 6H, m).
MS TOF 496 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 9,26 min.
Beispiel 78
1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-phenylglycinyl-cis-4-phenoxyprolin
t-Butyldicarbonat (1,1 g) und dann gesättigtes Natriumbicarbonat (20 ml) werden zu einer Suspension aus trans-Hyp-OBn (1,1 g) in THF (25 ml) gegeben und das Gemisch wird für 30 min gerührt. Das Gemisch wird mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Eine Blitzchromatographie (SiO₂ DCM dann Ether) ergibt Boc-Hyp-OBn, 1,18 g.
DEAD (Diethylazadicarboxylat ) (0,59 ml) wird zu einem Gemisch aus Boc-Hyp-OBn (1,1 g), Triphenylphosphin (0,9 g) und Phenol (0,32 g) in 10 ml THF über 30 min gegeben. Das Gemisch wird über Nacht gerührt und Triphenylphosphin (0,45 g), Phenol (0,16 g) und DEAD (0,3 ml) werden zugegeben und das Gemisch wird vor der Konzentration über Nacht gerührt. Der Rückstand wird in Ethylacetat aufgenommen und mit 2 M Natriumhydroxid und gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Eine Blitzchromatographie (SiO₂-Hexan dann 20% Ethylacetat in Hexan) ergibt Boc-cis-4-phenoxyprolinbenzylester, 496 mg.
Von Boc-cis-4-phenoxyprolinbenrylester werden die Schutzgruppen abgespalten (TFA/DCM) und es wird an Boc-D-phenylglycin gekuppelt, von dem die Sclutzgruppen entfernt werden (TFA/DCM) und es wird an 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäure (TFA Salz) wie in Verfahren 4, gekuppelt. Das Produkt wird in Ethanol (5% Pd auf C, atmosphärischer Druck) für 4 Stunden unter Bildung der Titelverbindung hydriert.
¹H NMR (CD₃CN) 9,05 (1H, s), 8,35 (1H, d), 8,00 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,55 (1H, d), 7,35 (7H, m), 7,00 (1H, m), 6,85 (2H, d), 6,00 (1H, s), 5,05 (1H, m), 4,60 (1H, d), 3,80 (1H, m), 3,60 (1H, m), 2,50 (1H, m), 2,25 (1H, m).
MS TOF 511 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 10,36 min.
Beispiel 79
1-Amino-isochinolin-7-oyl-D-phenylglycin-4-(4'-pyrimidyl)piperazinamid
Ein Gemisch aus Boc-piperazin (2 g), Natriumbicarbonat (2 g) und 2,4-Dichlorpyrimidin (1,5 g) in Ethanol (40 ml)/Wasser (20 ml) wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Ethylacetat (200 ml) wird zugegeben und das Gemisch wird zweimal mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Das Produkt wird auf DCM/Ether, 2,52 g, kristallisiert.
Das obige Produkt (1 g) wird in Ethanol (30 ml) gelöst und für 4 Stunden unter Bildung von Boc-4-(4'pyrimidyl)piperazin hydriert (5% Pd auf C, 50 psi).
¹H NMR (CDCl₃) 8,53 (1H, s), 8,41 (1H, d), 6,42 (1H, d), 3,45 (8H, m), 1,35 (9H, s).
Von Boc-4-(4'-pyrimidyl)piperazin werden die Schutzgruppen abgespalten (TFA/DCM) und es wird unter Verwendung des Verfahrens 4 unter Bildung von Boc-D-phenylglycin-4-(4'-pyrimidyl)-piperazinmid an Boc-Dphenylglycin gekuppelt, das von den Schutzgruppen befreit wird (TFA/DCM) und es wird an 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäure (TFA Salz) unter Verwendung des Verfahrens 4 gekuppelt.
¹H NMR (CD₃CN) 9,00 (1H, s), 8,75 (1H, s), 8,30 (1H, d), 8,20 (1H, d), 7,95 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,50 (2H, m), 7,35 (3H, m), 7,25 (1H, d), 7,10 (1H, d), 6,15 (1H, s), 3,70–3,30 (breites 8H, m).
MS TOF 468 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 1, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 9,09 min.
Beispiel 80
(R)-1-(2-{1-Aminoisochinolin-7-oyl}amino-2-phenyl)piperidin-2-on
(R)-1-(2-Butoxycarbonylamino-2-phenylethyl)piperidin-2-on
Boc-(R)-1,2-diamino-1-phenylethan (hergestellt durch das Verfahren von O'Brien, P. et al. J. Med. Chem. 37 (1949) 12, 1810–1822) (0,3 g, 1,27 mmol), Methyl-5-bromvalerat (0,18 ml, 1,27 mmol) und DBU (0,19 ml) werden in absolutem Ethanol (10 ml) gelöst und am Rückfluss für 3 Tage gerührt. Das Ethanol wird durch Verdampfen entfernt und der Rückstand wird in Ethylacetat aufgenommen, mit 10% Chlorwasserstoffsäure und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Bildung des Produkts eingedampft. Das obige Produkt wird weiter durch das Verfahren 4 zur Titelverbindung verarbeitet.
¹H NMR (CD₃OD) 8,80 (1H, s), 8,20 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,55 (1H, d), 7,25 (6H, m), 5,45 (1H, m), 4,10 (2H, m), 3,40 (2H, m), 2,70 (4H, m), 2,25 (2H, m).
MS TOF 389 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 9,58 min.
Beispiel 81
(R)-1-(2-{1-Aminoisochinolin-7-oyl}amino-2-phenylethyl)-1,2-dihydro-1-oxoisochinolin
(R)-1-(2-Butoxycarbonylamino-2-phenylethyl)-1,2-dihydro-1-oxoisochinolin
Es wird Boc(R)-1,2-diamino-1-phenylethan (hergestellt durch das Verfahren von O'Brien, P. et al. 7. Med. Chem. 37 (1949) 12, 1810–1822) (0,82 g) in Toluol (50 ml) gelöst. Homophthalsäureanhydrid (2,2 g) wird zugegeben gefolgt von TEA (1,8 ml). Das Gemisch wird unter Stickstoff über Nacht auf 120°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch kann sich abkühlen und wird mit 2 M Natriumhydroxidlösung, 10% Chlorwasserstoffsäure und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird in Methanol (17,5 ml) gelöst und DCM (35 ml) und Natriumborhydrid (70 mg) wird in einer Portion zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird unter Argon für 6 Tage gerührt. Es werden dann 50% Chlorwasserstoffsäure zugegeben und die Reaktion wird für 1 Stunde gerührt. Die Lösemittel werden dann unter Vakuum entfernt und der Rückstand wird in Ethylacetat (50 ml) aufgenommen, mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Bildung des Produkts eingedampft.
Das obige Produkt wird weiter durch das Verfahren 4 zur Titelverbindung verarbeitet.
¹H NMR (CDCl₃) 8,95 (1H, s), 8,40 (1H, d), 8,25 (2H, d), 7,75 (1H, d), 7,60 (1H, m), 7,50 (3H, m), 7,35 (1H, d), 7,20 (5H, m), 6,90 (1H, d), 6,50 (1H, d), 5,45 (1H, m), 4,75 (1H, m), 4,10 (1H, m).
MS TOF 435 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 10,10 min.
Beispiel 82
N-{1(R)-Phenyl-2-(N-phthalimido)ethyl}-1-aminoisochinolin-7-carboxamid (R)-N-(2-Butoxycarbonylamino-2-phenylethyl)phthalimid
Es wird Boc-(R)-1,2-Diamino-1-phenylethan (hergestellt durch das Verfahren von O'Brien, P. et al. J. Med. Chem. 37 (1949) 12, 1810–1822) (0,3 g, 1,27 mmol), Phthalsäureanhydrid (0,2 g, 1,4 mmol) und TEA (0,1 ml) in Chloroform (20 ml) gerlöst und unter Rückfluss für 2 Tage gerührt. Das Rektionsgemisch wird dann mit 10% Chlorwasserstoffsäure, 2 M Natriumhydroxidlösung und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Bildung des Produkts eingedampft. Das obige Produkt wird weiter durch das Verfahren 4 zur Titelverbindung verarbeitet.
¹H NMR (CD₃OD) 9,00 (1H, s), 8,40 (1H, d), 8,10 (1H, d), 7,90 (4H, m), 7,80 (1H, d), 7,55 (2H, d), 7,35 (4H, m), 5,65 (1H, m), 4,15 (2H, d).
MS TOF 437 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 11,19 min.
Beispiel 83
2(R)-{N-(1-Aminoisochinolin-7-oyl)amino}-2-phenylethyl-4-methylbenzoat
Es wird Boc-(R)-Phenylglycinol (2 g, 8,4 mmol) in DCM (50 ml) gelöst und Toluoylchlorid (1,11 ml) und TEA (1,1 ml) werden zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur unter Argon über Nacht gerührt. Das Gemisch wird dann mit 2 M Natriumhydroxidlösung, Wasser, 5% Chlorwasserstoffsäure und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das Produkt wird aus Hexan, das in DCM (50 ml) gelöst ist, umkristallisiert und mit TFA für 2 Stunden behandelt. Das Lösemittel wird verdampft und der Fest stoff wird mit Diethylether behandelt. Eine Lösung aus 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäuretrifluoressigsäuresalz (200 mg, 0,66 mol) in trockenem DMF (5 ml) wird nacheinander mit HOAt (140 mg, 1 mmol) und EDC (147 mg, 0,8 mmol) behadelt und bei Raumtemperatur für 10 min gerührt. Das Gemisch wird zu R-Amino-2-phenylethyl-4-methylbenzoat gegeben. TFA Salz (0,23 g, 1,03 mmol) mit DBU (0,2 ml) wird zugegeben und über Nacht gerührt. Nach der wässrigen Aufarbeitung werden die Endprodukte durch präparative Umkehrphasen HPLC gereinigt.
¹H NMR (DMSO) 8,90 (1H, s), 8,20 (1H, d), 7,90 (1H, d), 7,65 (2H, d), 7,60 (1H, d), 7,45 (2H, d), 7,20 (6H, m), 5,45 (1H, m), 4,45 (2H, d), 2,25 (3H, s).
MS TOF 416 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 11,82 min.
Beispiel 84
O-(1-Aminoisochinolin-7-oyl)-R-mandelyl-4-methylbenzylamid
R-Mandelsäure (152 mg, 1 mmol) wird in DMF (3 ml) mit HATU (380 mg, 1 mmol) und DIPEA (350 μl); 2 mmol, gelöst. Zu diesem Gemisch wird 4-Methylbenzylamin (121 mg, 1 mmol) gegeben. Das Gemisch wird über Nacht gerührt. Das Gemisch wird dann in Ethylacetat aufgenommen und mit Wasser, Natriumcarbonatlösung, Wasser, 10% Chlorwasserstoffsäurelösung und Wasser gewaschen. Das Ethylacetat wird verdampft. 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäure (180 mg), HATU (380 mg, 1 mmol) und DIPEA (350 μl, 2 mmol) gelöst in DMF (5 ml) werden zugegeben und für 10 min gerührt. Dieses Gemisch wird dann zu dein obigen Produkt zusammen mit DBU (100 μl) gegeben. Das Gemisch wird dann über Nacht gerührt. Das Gemisch wird dann in Ethylacetat (50 ml) aufgenommen und mit Wasser, Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen. Das Ethylacetat wird dann verdampft und das rohe Produkt wird durch präparative HPLC gereinigt.
¹H NMR (CD₃CN) 9,10 (1H, s), 8,42 (1H, d), 7,93 (1H, d), 7,65 (2H, d), 7,35 (1H, d), 7,30 (2H, m), 7,20 (1H, d), 7,00 (4H, m), 6,25 (1H, s), 4,25 (2H, m), 2,20 (3H, m).
MS TOF 427 (M + 1)⁺. HPLC (Jupiter 5 C18, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 11,48 min.
Beispiel 85
1-Amino-3,4-dihydroisochinolin-7-oyl-D-cyclohexylglycin-1-S-cyclohexylethylamid
Eine kräftig gerührte Lösung aus 1-Aminoisochinolin-7-oyl-D-cyclohexylglycin-1-S-cyclohexylethylamid TFA Salz (100 mg, 0,40 mmol) (siehe Beispiele für Verfahren 4) in 50%/50% HCl/ Ethanol (10 ml), die Platinoxid (20 mg) enthält, wird mit Wasserstoffgas bei atmosphärischem Druck über Nacht behandelt. Das Reaktionsgemisch wird durch Celite filtriert, konzentriert und durch präparative HPLC unter Bildung der Titelverbindung als weißer Feststoff gereinigt.
¹H NMR (DMSO) 8,40 (1H, s), 8,10 (1H, d), 7,55 (1H, d), 4,35 (1H, d), 3,70 (1H, m), 3,60 (2H, m), 3,10 (2H, m), 1,95–1,60 (breites 11H, m), 1,35–0,90 (breites 11H, m), 1,05 (3H, d).
MS TOF 425 (M + 1)⁺. HPLC (Magellan C8, Gradient 3, Wasser/Acetonitril/TFA). Rt 11,42 min.
Beispiel 86
3-([R]-1-Phenyl-1-aminomethyl)-5-benzyl-2H-1,2,4-triazol
Es wird EDC (1,6 g) in DMF (20 ml) gelöst und mit HOAt (1,16 g) in DMF (10 ml) behadelt und für 10 min gerührt. DIPEA (1,46 ml) wird dann zugegeben und das Rühren wird für weitere 15 min fortgesetzt. Boc-Dphenylglycin (2 g) in DMF (10 ml) wird dann tropfenweise zugegeben und das Rühren wird für weitere 25 nun fortgesetzt. Dann wird 1 M Hydrazin in THF (84 ml) zugegeben und das Gemisch wird über Nach gerührt. Die Lösemittel werden dann verdampft und der Rückstand wird mit Wasser (100 ml) behandelt, mit 2 M Natriumhydroxidlösung basisch gemacht und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert. und unter Bildung eines gelben Feststoffs (1,38 g) eingedampft.
¹H NMR (CDCl₃) 7,20 (5H, s), 5,55 (1H, s), 1,25 (9H, s).
Das obige Produkt (0,3 g, 1,13 mmol) wird in Ethanol (6 ml) gelöst und tropfenweise zu einer Lösung aus Benzylethylimidathydrochlorid in Ethanol (3 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Das Gemisch wird für 30 min gerührt. Das Lösemittel wird dann verdampft und der Rückstand wird mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung behandelt und mit. Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Bildung eines gelbes Kautschbuks eingedampft (0,43 g).
¹H NMR (CDCl₃) 7,30 (10H, m), 5,80 (1H, s), 3,50 (2H, m), 1,45 (9H, s).
Das obige rohe Produkt (0,43 g, 1,12 mmol) wird in Xylol (60 ml) mit para-Toluolsulfonsäure (katalytisch) gelöst und für 1 Tag auf 160°C erhitzt. Das Xylol wird unter Vakuum entfernt und das Triazol (0,35 g) wird ohne weitere Reinigung verwendet.
¹H NMR (CDCl₃) 7,20 (10H, m), 5,70 (1H, s), 4,00 (2H, m), 1,30 (9H, s).
Eine Kupplung dieses Triazolzwischenprodukts an 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäure kann unter Verwendung des Standardverfahrens 4 ausgeführt werden.
Beispiel 87
2-(1-Phenyl-1-aminomethyl)-4-phenylthiazol
Zu einer Lösung aus Boc-D-phenylglycin (875 μg, 3,5 mmol) in einem 1 : 1 Gemisch aus DMF und DCM (40 ml) werden 1-Hydroxybenzotriazol (520 mg, 1 l Äquivalente) und DIPCI (602 μl, 1,1 Äguivalente) gegeben und das Gemisch wird für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Ammoniakgas wird hineingeblasen und das Gemisch wird vor dem Verdünnen mit Ethylacetat und dem Waschen mit 10% Chlorwasserstoffsäure und gesättigtem Natriumbicarbonat über Nacht. stehen gelassen. Die organische Lösung wird Letrocknet (Magnesiumsulfat) und verdampft. Eine Blitzchromatographie (Silicagel DCM/Ethylacetat, 0–5%) ergibt das Amid (770 mg, 86%). Zu einer Lösung aus Boc-D-phenylglycinamid (740 mg, 2,96 mmol) in 25 ml THT wird Lawesson's Reagenz (1,2 g) gegeben und das Gemisch wird über Nacht gerührt. Das Lösemittel wird unter verringertem Druck vedampft und der Rückstand wird durch Blitzchromatographie (Silicagel Hexan/Ethylacetat 10 bis 30%) unter Bildung des Thioamids, 671 mg, gereinigt.
Das Thioamid (650 mg) wird in Aceton (20 ml) und Phenacylbromid (486 mg, 1 Äguivalent gelöst, für 30 min gerührt und mit Chloroform/wässriges Natriumbicarbonat (20 ml jeweils) verdünnt, getrennt, getrocknet (Magnesiumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird in DCM (20 ml) gelöst und mit Pyridin (350 μl) und Trifluoressigsäureanhydrid (360 μl) behandelt. Nach 150 min wird das Lüsemittel unterverringertem Druck entfernt und die Rückstände werden in DCM rückgelöst und mit gesättigtem Natrumbicarbonat gewaschen Eine Reinigung durch Blitzchromatographie (Silicagel Hexan/Ethysetat 10 bis 30%) ergibt das Thiazolzwischenprodukt, 687 mg.
Eine Schutzgruppenabspaltung am Amin wird unter Verwendung von 50% TFA in DCM (30 min), Verdampfung des Lösemittels unter verringertem Druck, Lösen in DCM, Waschen mit gesättigtem Natriumbicarbonat, Trocknen (Magnesiumsulfat) und Eindampfen unter Bildung des Produkts ausgeführt.
¹H NMR (CDCl₃) 7,80 (1H, d), 7,25 (10H, m), 5,95 (1H, s).
Eine Kupplung dieses Thiazolzwischenprodukts an 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäure kann durch das Standardverfahren des Verfahrens 4 ausgeführ werden.
Beispiel 88
1-Aminoisochinolin-7-carbonsäure
Ein 1 Liter fassender Kolben wird mit einem magnetischem Rührstab, einem Kühlbad (flüssiger Stickstoff), einem Absperrhahn, der mit einem Ammoniakzylinder verbunden ist und einem Vakuumsystem ausgestattet. Der Kolben wird mit FeCl₃ (0,2 g) befällt und evakuiert. Ammoniakgas wird unter Bildung von flüssigem Ammnonium (600 ml) kondensiert. Kalium (19,50 g, 0,50 mol) wird in kleinen Stücken (jeweils etwa 0,5 g) unter einer Argonatmosphäre zugegeben. Die Lösung wird anfänglich blau, aber wird nach dein Erhitzen am Rückfluss für 30 min eine graue Suspension. In die Kaliumamid/flüssige Ammoniaksuspension wird in kleinen Mengen Isochinolin-7-carbonsäure {Literaturstelle F. T. Tyson, JACS, 1939, 61, 183} (17,0 g, 0,10 mol) gegeben. Die freie Säure ist anfänglich gelöst, aber das gebildete Kaliumsalz fällt bald als feine Teilchen unter Bildung einer Suspension aus, die für 6 Stunden am Rückfluss erhitzt wird. Nach vorsichtiger Zugabe von Tetraethylethylendiamin (TEEDA) (86 g, 0,50 mol), Toluol (170 ml) und 18-Kronen 6 (1 g) kann der Ammoniak langsam über 40 Stunden unter Bildung einer neuen Suspension des Isochinolin-7-carbonsäurekaliumsalzes verdampfen. Das Reaktionsgemisch wird für 48 Stunden auf 87°C erhitzt. Eine Probe wird entnommen und durch NMR analysiert, was zeigt, dass noch einiges nicht reagierte Ausgangsmaterial vorliegt. Ammoniak wird durch das Reaktionsgemisch für 2 Stunden geblasen und die NMR Analyse zeigt dann, dass kein weiteres Ausgangsmaterial vorhanden ist. Die Reaktion wird dann auf – 16°C gekühlt, Eis (200 g) wird zur Zerstörung des überschüssigen Kaliumamids zugegeben und alle Lösemittel werden bei 76°C und 7 mm Hg und dann bei 65°C und 0,7 mm Hg unter Bildung eines Pulvers verdampft, das in Wasser (1,2 l) gelöst wird und durch Celite unter Bildung einer klaren Lösung filtriert wird. Dies wird durch die Zugabe von Essigsäure (34 g) auf pH 7 angesäuert und kann über Nacht stehen. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, mit Wasser (50 ml × 2) gewaschen und durch azeotrope Destillation mit Ethanol (50 ml × 2) bei 50°C und 7 mm Hg dann bei 50°C und 0,7 min Hg unter Bildung des rohen Produkts (17,6 g, 94%) als nicht ganz weißes Pulver getrocknet. Das rohe Produkt (17,6 g) wird in Wasser (4 l) gelöst und konzentrierte HCl wird unter Bildung eines pH von 1,30 zugegeben. Die Lösung wird für 1 Stunde gerührt und durch Celite unter Bildung einer klaren Lösung filtriert, zu der eine konzentrierte Ammoniaklösung unter Bildung eines pH von 5,07 gegeben wird. Nach dem Rühren für 2 Stunden und dein Stehen über Nacht wird der Niederschlag filtriert, mit Wasser (50 ml × 2) gewaschen und durch azeotrope Destillation mit Ethanol (50 ml × 2) bei 50°C und 7 mm Hg, und dann bei 50°C und 0,7 min Hg unter Bildung der Titelverbindung (15,5 g, 88%) als blassbrauner Feststoff getrocknet.
¹H NMR (DMSO) 9,20 (1H, s), 8,40 (1H, d), 8,10 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,30 (1H, d).
Beispiel 89
Ethyl-1-aminoisochinolin-7-carboxylathydrochlorid
Zu einer Suspension aus 1-Aminoisochinolin-7-carbonsäure TFA Salz (6 g, 20 mmol) in wasserfreiem Ethanol (150 ml) wird Thionylchlorid (7,7 ml, 10 Äquivalente) langsam bei 0°C gegeben und das Rektionsgemisch wird dann am Rückfluss für 5 Stunden erhitzt. Die flüchtigen Bestandteile werden unter Vakuum entfernt und der entstehende Feststoff wird mit Diethylether behandelt und unter Bildung der Titelverbindung als brauner Feststoff filtriert.
¹H NMR (D₂O) 8,40 (1H, s), 8,05 (1H, d), 7,60 (1H, d), 7,40 (1H, d), 6,95 (1H, d), 4,30 (2H, q), 1,35 (3H, t).
Beispiel 90
Ethyl-1-benzylaminoisochinolin-7-carbonoxylattrifluoracetat
Zu einer Suspension aus Ethyl-1-aminoisochinolincarboaxylat HCl Salz (126 mg, 0,5 mmol) und Kaliumcarbonat (152 mg, 1,1 mmol) in wasserfreiem DMF wird Benzylbromid (65 μl, 0,55 mmol) gegeben und das Reaktionsgemisch kann bei Raumtemperatur über Nacht rühren. Eine Reinigung durch präparative HPLC ergibt die Titelverbindung als weißen Feststoff.
¹H NMR (CD₃OH) 9,05 (1H, s), 8,30 (1H, d), 7,85 (1H, d), 7,55 (1H, d), 7,20 (5H, m), 7,05 (1H, d), 5,35 (2H, s), 4,30 (2H, q), 1,25 (3H, t).
Beispiel 91
Ethyl-1-amino-3,4-dihydroisochinolin-7-carboxylattrifluoracetat
Eine kräftig gerührte Lösung aus Ethyl-1-aminoisochinolin-7-carboxylat (100 mg, 0,40 mmol) in 50% Chlorwasserstoffsäurelösung (10 ml), die Platinoxid (20 mg) enthält, wird mit Wasserstoffgas bei atmosphärischem Druck über Nach behandelt. Das Reaktionsgemisch wird durch Celite filtriert, konzentriert und durch präparative HPLC unter Bildung der Titelverbindung als weißer Feststoff gereinigt.
¹H NMR (CD₃CN) 8,40 (1H, s), 8,15 (1H, d), 7,45 (1H, d), 4,30 (2H, q), 3,45 (2H, m), 3,05 (2H, m), 1,35 (3H, t).
Beispiel 92
1-Amino-7-hydroxymethylisochinolin
Es wird Ethyl-1-aminoisochinolincarboxylathydrochlorid (1 g) zwischen Ethylacetat und 2 M Natriumhydroxidlösung aufgeteilt. Die Ethylacetatphase wird mit Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in trockenem THF (10 ml) gelöst, auf –5°C gekühlt und eine 1 M Lösung an Diisobutylaluminiumhydrid (12 ml) wird tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wird bei 0°C für 2 Stunden und dann bei Raumtemperatur für weitere 2 Stunden gerührt. Ethylacetat (50 ml) und 2 M Natriumhydroxidlösung (5 ml) werden dann zugegeben. Die Ethylacetatlösung wird dann abgetrennt, mit Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Bildung des Produkts als brauner Feststoff eingedampft.
¹H NMR (CD₃CN) 7,80 (1H, d), 7,70 (1H, s), 7,60 (1H, d), 7,50 (1H, d), 6,90 (1H, d).
Beispiel 93
1-Amino-7-brommethylisochinolin
1-Amino-7-hydroxymethylisochinolin (0,2 g) wird in trockenem THF (10 ml) gelöst und Phosphortribromid (0,03 ml) wird in einer Portion zugegeben. Man kann beobachten, wie sich ein weißer Niederschlag bildet und die Suspension wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird zur Trockne eingedampft und mit Diethylether unter Bildung des Produkts behandelt.
¹H NMR (CD₃CN) 8,20 (1H, s), 7,80 (1H, d), 7,60 (1H, d), 7,35 (1H, d), 7,00 (1H, d).
Testprotokolle
Enzymhemmtests:
Die Enzymtests werden bei Raumtemperatur in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 gemäß dein Verfahren von Tapparelli et al (7. Biol. Chem. 1993, 268, 4734–4741) hergestellt. Gereinigter Humanfaktor Xa, Trypsin, Thrombin und Plasmin werden von Alexis Corporation, Nottingham, UK bezogen. Urokinase wird von Calbiochem, Nottingham, UK bezogen. Chromogene Substrate für diese Enzyme, nämlich Pefachrome-FXA, Pefachrome-TRY, Pefachrome-TH, Pefachrome-PL und Pefachrome-UK werden von Pentapharm AG, Basel, Schweiz bezogen. Das Produkt (p-Nitroanilin) wird durch eine Absorption bei 405 nm in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mittels eines Dynatech MR5000 Lesegeräts quantifiziert (Dynex Ltd., Billingshurst, UK). Km und Ki werden mittels SAS PROC NLIN (ASA Institute, Cary, NC, USA, Version 6.11) berechnet, die K_m Werte werden mit 100,9 μM für Faktor Xa/ Pefachrome-FXA und 81,6 μM für Trypsin/Pefachrome-TRY bestimmt. Die Inhibitorstammlösungen werden mit 40 mM in Me₂SO hergestellt und bei 500 μM, 50 μM und 5 μM getestet. Die Genauigkeit der Ki Messungen wird durch den Vergleich mit Ki Werten von bekannten Inhibitoren von Faktor Xa und Trypsin bestätigt.
In Übereinstimmung mit veröffentlichten Daten, hemmt Benzamidin den Faktor Xa, Trypsin, Thrombin, Plasmin und Urokinase mit Ki Werten von jeweils 155 μM, 21 μM, 330 nM, 200 nM und 100 nM. NAPAP hemmt Thrombin mit einem Ki Wert von 3 mM. Die Verbindungen der Erfindung haben eine Aktivität in diesen Tests. Beispielsweise zeigen die in Beispiel 75 beschriebenen Inhibitoren einen Ki von 8 nM und die von Beispiel 8 zeigen einen Ki von 70 nM, wenn sie gegen den Faktor Xa getestet werden.
Antithrombotische Aktivität
Das Testmaterial (Faktor Xa Inhibitor) wird entweder intravenös, intraperitoneal oder oral an eine Gruppe von Ratten für das Experiment verabreicht. Eine zweite Gruppe erhält den Träger (Kochsalzlösung) nur als Kontrolle und eine dritte Gruppe von Tieren erhält ein Standardantithrombotikum (subkutanes niedermolekulares Heparin) als Positivkontrolle.
Um das Experiment auszuführen werden männliche Sprague-Dawley Ratten (Gewicht von 250–400 g) durch Inhalation von Isofluran mit der Zugabe von Sauerstoff und Stickstoffmonooxid (nitrous) betäubt. Die linke oder rechte Femoralvene wird sorgfältig freigelegt und von der Femoralarterie und dein Nervus saphenus isoliert. Nach der Entfernung von Bindegewebe wird eine Kanüle, die physiologische Kochsalzlösung enthält, in die Femoralvene eingeführt.
Ein Segment jeweils der linken und rechten Jugularvene wird freigelegt und vom umgebenden Bindegewebe befreit. Jedes Segment besteht aus dem Abschnitt der Vene zwischen der Austrittsstelle aus dem Thorax bis zur ersten Hauptverzweigung des Gefäßes.
Zum gewünschten Zeitpunkt nach der Verabreichung des Testmaterials oder Trägers wird eine Bolusinjektion des "deaktivierten" Humanserums (1,32 ml/kg) über weniger als 30 Sekunden durch die Kanüle in der Femoralvene verabreicht. Zwei Minuten nach der Thombusprovokation werden beide Jugularvenensegmente an beiden Enden ligiert und in situ belassen, damit situ die Thromben bilden können.
Nach 10 Minuten werden beide Jugularsegmente sorgfältig herausgeschnitten und in eine Petrischale gegeben, die 0,9% Kochsalzlösung enthält. Eine Blutprobe (1,8 ml Blut + 0,2 ml 3,8% Natriumcitrat) wird durch eine kardiale Punktion erhalten und das Tier wird durch eine Überdosis Expiral (Natriumpentobarbiton) getötet, das intravenös über die Kanüle in der Femoralvene oder durch kardiale Punktion verabreicht wird. Die 2 Segmente der Jugularvene werden sorgfältig der Länge nach aufgeschnitten, um das Lumen freizulegen und den Gefäßinhalt in die Kochsalzlösung zu entleeren. Die Gewebe werden auf das Vorkommen von Thromben untersucht, die sich entwikkelt haben, und demnach bewertet.
Thrombusbewertung:

0 = kein Thrombus
1 = Einer oder mehrere kleine Thromben
2 = Mehrere große Thromben
3 = Großer Thrombus, der das Gefäß verschließt

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben in diesen Tests eine signifikante antithrombotische Aktivität.
Protokoll für den partiellen Thromboplastinzeittest
Venöses Blut wird in 3,2% (0,109 mol) Trinatriumcitratvakutainerröhrchen mit 1 Volumen Antikoagulans und 9 Teilen Blut gesammelt.
Die Blutzellen werden durch Zentrifugation bei 700 × g für 10 Minuten unter Bildung des Plasmas abgetrennt, das bei –70°C eingefroren wird, bis es benötigt wird.
Um den Test auszuführen werden 100 μl Plasma in ein Glasröhrchen pipettiert, 1 ml Testverbindung in DMSO wird zugegeben und kann sich über 2 Minuten auf 37°C erwärmen.
100 μl warmes (37°C) Manchesterreagenz (Gewebethromboplastin) (Helena Biosciences, UK) wird zugegeben und kann sich für 60 Sekunden äquilibrieren.
100 μl warme (37°C) 25 mM Calciumchloridlösung wird zugegeben, um die Gerinnung zu initiieren.
Das Teströhrchen wird dreimal alle 5 Sekunden um einen Winkel von 90° gekippt, um die Reagenzien zu mischen und die Zeit bis zur Gerinnselbildung wird gemessen.
Die Daten aus einer Reihe an Beobachtungen und Testverbindungskonzentrationen werden durch ein statistisches SAS Analyseprogramm analysiert und es wird eine CT2 (Konzentration, die zur Verdopplung der Gerinnungszeit erforderlich ist) für jede Verbindung berechnet.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen verlängern signifikant die partielle Thromboplastinzeit.

Claims

Serinproteaseinhibitorverbindung der Formel I
worin R₁ steht für Wasserstoff Halogen, Cyano, Nitro oder Hydroxyl, Amino, Alkoxy, Alkyl, Aminoalkyl, Hydroxyalkyl, Thiol, Alkylthio, Aminosulfonyl, Alkoxyalkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxymethoxycarbonyl oder Alkyl-amino, wahlweise substituiert durch Hydroxy, Alkylamino, Aloxy, Oxo, Aryl, Cycloalkyl, Amino, Halogen, Cyano, Nitro, Thiol, Alkylthio, Alkylsulfonyl, Alkylsulfenyl, Alkylsulfonamido, Alkylaminosulfonyl, Halogenalkoxy und Halogenalkyl, R₂ für Wasserstoff Halogen, Methyl, Amino, Hydroxy oder Oxo steht, und R für X-X-Y(R₇)-L-L_p(D)_n steht, worin jedes X unabhängig für ein C, N, O oder S Atom oder eine CO, CR₁, C(R₁)₂ oder NR₁ Gruppe steht, wobei zumindest ein X für C, CO, CR₁ oder eine C(R₁)₂ Gruppe steht, Y (das α-Atom) für ein Stickstoffatom oder eine CR₁ Gruppe steht oder Y und L zusammengenommen eine cyclische Gruppe bilden, R₇ für Alkyl, Alkenyl, Mono- oder Bicycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Mono- oder Bicycloalkylalkyl, Mono- oder Bicycloalkylalkenyl, Aralkyl, Heteroarylalkyl, Arylalkenyl oder Heteroarylalkenyl steht, die alle wahlweise durch eine Gruppe R₁ substituiert sind, L für eine organische Gruppe mit 1 bis 5 Grundgerüstatomen, ausgewählt aus C, N, O und S oder eine verzweigte Alkylgruppe oder cyclische Gruppe steht, und L_p(D)_n für eine Alkyl-, Heterocyclyl-, Alkenyl-, Alkaryl-, Cycloalkyl-, Polycycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Halogenalkylgruppe oder eine Kombination aus zwei oder mehreren solchen Gruppen steht, wahlweise substituiert durch eine oder mehrere Oxa-, Thia-, Aza- oder R₁ Gruppen, oder ein physiologisch annehmbares Salz hiervon.
Verbindung nach Anspruch 1, worin die Doppelbindung zwischen den Positionen 3 und 4 des fusionierten Rings vorkommt.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin R₁ für Wasserstoff Hydroxy, Amino oder Alkyl steht und R₂ für Wasserstoff steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin X-X für -CH=CH-, -CONH-, -CONR₁-, -NH-CO-, -NH-CH₂-, -CH₂-NH-, -CH₂O-, -OCH₂-, -COO-, -OC=O- oder -CH₂CH₂- steht.
Verbindung nach Anspruch 4, worin X-X für -CONH- steht.
Verbindung nach einem der Anspruche 1 bis 5, worin Y für CH steht und R₁ für eine unsubstituierte oder mit R₁ substituierte Aryl, Heteroaryl- oder Cyclohexylgruppe steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin L für CO, CH₂NH, CONR₁(CH₂)_m, (CH₂)_mN(R₁)CO(CH₂)_m, (CH₂)_m ₊₂, (CH₂)_mCO(CH₂)_m, (CH₂)_mOC=O, (CH₂)_mO oder CH=CH(CH₂)_m steht (worin in unabhängig für 0 oder 1 steht).
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin L_p(D)_n eine Cycloalkyl-, Azacycloalkyl- Diazacycloalkyl-, Phenyl-, Naphthyl-, Adamantyl- Decalinyl-, Tetrahydrodecalinyl-, Bicycloalkyl-, Mono- oder Diazabicycloalkyl-, Mono- oder Bicycloheteroaromaten- oder eine lineare oder verzweigte Alkyl-, Alkylen-, Alkenyl- oder Alkenylengruppe steht, die alle wahlweise substituiert sind durch Oxa-, Aza-, Thia- oder eine oder mehrere R₁ Gruppen oder eine Kombination aus zumindest zwei Gruppen, die durch eine Spirobindung oder eine Einfach- oder Doppelbindung oder durch eine C=O, O, S, SO, SO₂, CONR₁, NR₁-CO- oder NR₁ Bindung verbunden sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Serinproteaseinhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zusammen mit zumindest einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff enthält.
Verwendung eines Serinproteaseinhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers zur Bekämpfung eines Zustands, der auf diesen Inhibitor anspricht.
1-Aminoisochinolin-7-carbonsäure oder ein Salz hiervon.