DE69811348T2

DE69811348T2 - Verfahren zur modulierung des wachstums kollateraler arterien und / oder anderer arterien aus bestehenden arteriolen verbindungen

Info

Publication number: DE69811348T2
Application number: DE69811348T
Authority: DE
Inventors: D. Ito; Wolfgang Schaper
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 1997-04-04
Filing date: 1998-04-01
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2018-04-02
Also published as: EP1304123A3; EP0969877A1; CA2284922A1; ATE232399T1; WO1998044953A1; PT969877E; DK0969877T3; DE69811348D1; US20040023881A1; JP2001519795A; EP0969877B1; EP1304123A2; ES2187972T3; US6592862B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Modulierung des Wachstums kollateraler Arterien oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen. Im Besonderen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zur Verstärkung des Wachstums kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen, umfassend das Inkontaktbringen von Gewebe oder Zellen mit einem Monocytenchemotaktischen Protein (MCP) oder einem Nucleinsäuremolekül, welches das MCP codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines MCP oder eines Nucleinsäuremoleküls, welches das MCP codiert, zur Herstellung von Arzneimitteln zur Verstärkung des kollateralen Wachstums kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren, umfassend das Inkontaktbringen von Gewebe oder Zellen mit einem Mittel, welches das Wachstum kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen durch die Anlockung von Monocyten unterdrückt. Die vorliegende Erfindung beinhaltet weiter die Verwendung eines Mittels, welches das Wachstum kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen durch die Anlockung von Monocyten unterdrückt, zur Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung von Tumoren.
Bei der Behandlung von Patienten mit Arterienverschlusskrankheiten zielen die meisten der gegenwärtigen Behandlungsstrategien auf die Verbesserung der Wirkungen. Die einzigen heilenden Ansätze beinhalten eine Angioplastie (Ballondilatation) oder Bypass-Operation. Die erstgenannte geht einher mit einem hohen Restenoserisiko und kann nur bei bestimmten Verschlusskrankheiten, wie ischämischen Herzerkrankungen, durchgeführt werden. Die letztgenannte ist invasiv und ebenfalls auf bestimmte Arten von Arterienverschlusskrankheiten beschränkt. Es gibt keine etablierte Behandlungsmethode zur Verstärkung des kollateralen Wachstums.
Gefäßwachstum in adulten Organismen beginnt über zwei verschiedene Mechanismen, Knospung von Kapillaren (Angiogenese) und in situ Vergrößerung von bestehenden arteriolären Verbindungen in echte kollaterale Arterien¹. Jüngste Untersuchungen haben Mechanismen die zur Angiogenese führen, mit Gefäßendothel-Wachstumsfaktor ("vascular endothelial growth factor", VEGF) als einer Hauptkomponente, offenbart²&supmin;&sup6;. Dieses spezifische Endothel-Mitogen wird durch Hypoxie hochreguliert und kann, wenn es nach Entfernung der femoralen Arterien in die hinteren Gliedmaßen von Kanninchen infundiert wird, Gefäßwachstum auslösen7,8. Diese Untersuchungen haben allerdings nicht zwischen Kapillarknospung, einem Angiogenese genannten Vorgang, und echtem kollateralem Arterienwachstum unterschieden. Während VEGF nur auf Endothelzellen mitogen wirkt, ist für kollaterales Arterienwachstum die Proliferation von Endothelzellen und glatten Muskelzellen erforderlich und es treten ausgeprägte Umgestaltungsprozesse auf1,9-12.
Weiterhin wird in ischämischen Gebieten, zum Beispiel im Schweineherz oder in schnell wachsenden Tumoren, vorwiegend Kapillarknospung beobachtet1,3,13,14. Echtes kollaterales Arterienwachstum jedoch ist in den meisten untersuchten Modellen zeitlich und räumlich von der Ischämie getrennt1,15. Andere oder zusätzliche Mechanismen als die für die Angiogenese in ischämischen Gebieten beschriebenen sind daher nötig, um kollaterales Arterienwachstum zu erklären. Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, dass diese kollateralen Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen wachsen¹.
Während Mittel wie VEGF und andere Wachstumsfaktoren derzeit eingesetzt werden, um die Entwicklung von Angiogenese nach Arterienverschluss zu stimulieren, ist es nicht vorstellbar, dass solche Mittel zur Modulierung des Wachstums bestehender arteriolärer Verbindungen in echte kollaterale Arterien fähig sind.
Somit ist das technische Problem der vorliegenden Erfindung, Arzneimittel und Verfahren zur Modulierung des Wachstums kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen bereitzustellen.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen erreicht.
Entsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung des Wachstums kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen, umfassend das Inkontaktbringen von Gewebe oder Zellen mit einem Monocytenchemotaktischen Protein (MCP) oder einem Nucleinsäuremolekül, welches das MCP codiert.
Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das Wachstum von Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen auch als "Arteriogenese" bezeichnet. Im Besonderen ist "Arteriogenese" das in situ Wachstum von Arterien durch Proliferation von Endothelzellen und glatten Muskelzellen aus bestehenden arteriolären Verbindungen, wodurch Blut für ischämisches Gewebe, Tumoren oder Entzündungsherde bereitgestellt wird. Diese Gefäße wachsen weitgehend außerhalb des betroffenen Gewebes, sind aber sehr viel wichtiger für die Zufuhr von Nährstoffen in das ischämische Gebiet, den Tumor oder den -Entzündungsherd als Kapillaren, welche durch angiogenetische Vorlänge in das krankhafte Gewebe einsprießen.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich die Bezeichnung "Monocytenchemotaktisches Protein" oder "MCP" auf Proteine und Peptide, welche auf Monocyten wirken können und zur Zunahme der Aktivierung, Akkumulation und Mikration von Monocyten führen³&sup5;. Somit kann gemäß der vorliegenden Erfindung jedes MCP oder andere funktionell zu einem MCP äquivalente Substanzen, welche nämlich in der Lage sind Monocyten zu aktivieren und anzulocken, zum Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Wirkung der MCPs, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, soll nicht auf die vorstehend beschriebenen Spezifitäten beschränkt sein, sondern sie können zum Beispiel auch auf Eosinophile, Lymphocytensubpopulationen und/oder Stammzellen wirken.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, dass durch die Anlockung von Monocyten durch das Monocyten-chemotaktische Protein-1 (MCP-1) das Wachstum von kollateralen Arterien und die Arteriogenese in Tieren nach Verschluss der femoralen Arterien signifikant gesteigert werden konnte. Experimente, die im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, verdeutlichen, dass die lokale Infusion von MCP-1 die kollaterale sowie die periphere Leitfähigkeit nach Verschluss der femoralen Arterien erhöht, aufgrund von verstärktem Gefäßwachstum durch Zunahme der Monocytenakkumulation und gleichzeitigen proliferativen Effekten auf Endothelzellen und/oder glatten Muskelzellen. Also können MCPs oder Nucleinsäuremoleküle, welche MCPs codieren, verwendet werden, um Monocyten zu einem bestimmten Gewebe oder einer bestimmten Zelle zu locken, was wiederum zum Wachstum kollateraler Arterien sowie zum Wachstum von Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen führt, was zur Heilung verschiedener Verschlusskrankheiten nötig ist.
MCP-1 ist ein 14-kDa Glycoprotein, das von vielen Zellen, einschließlich vaskulären glatten Muskelzellen und Endothelzellen,²&sup9;&supmin;³² gebildet wird und in subnanomolaren Konzentrationen Monocytenchemotaxis induziert³³. MCP-1 ist ein wirksamer Agonist für die β- Chemokinrezeptoren CCR2 und CCR4, welche beide hauptsächlich von Monocyten exprimiert werden aber auch auf Basophilen, T- und β-Lymphozyten gefunden wurden³&sup4;. Diese G-Protein-gekoppelten Rezeptoren mit sieben transmembranen Domänen führen zur Aktivierung von Monocyten und erhöhter Adhäsivität von Integrinen, ein Prozeß, der schließlich zum Monocytenarrest auf Endothelzellen führt³&sup5;. Das MCP-1 Gen zeigt große Homologien zwischen den Spezies³&sup0; und kann durch verschiedene Cytokine (z. B. Tumornekrosefaktor α) und Immunglobulin G induziert werden³&sup6;. Kürzlich wurde in vitro gezeigt, dass die Genexpression und die Proteinsekretion von MCP-1 auch durch Scherkräfte und zyklische Belastung hochreguliert werden¹&sup6;&supmin;¹&sup8;. Wie kürzlich gezeigt wurde, erhöhen diese mechanischen Kräfte die Sekretion von Monocyten-chemotaktischem Protein-1 (MCP-1) in gezüchteten menschlichen Endothelzellen, was zu erhöhter Monocytenadhäsion führt¹&sup6;&supmin;¹&sup8;. Diese Ergebnisse stützen die Beobachtung, dass Monocyten nach der Induktion einer Koronararterienverengung im Hundeherz zu einem Zeitpunkt an die Gefäßwand anheften und in diese einwandern wenn der Proliferationsindex maximal erhöht ist¹&sup9;. Weiterhin wird Monocytenakkumulation auch im Mikroembolisationsmodell der Angiogenese beim Schwein beobachtet. Darüber hinaus wurden erhöhte Mengen von MCP-1 mRNA in ischämischem Gewebe von mikroembolisiertem Schweinemyokard²¹ sowie in reperfundiertem ischämischem Myokard³&sup7; gefunden. Obwohl es verschiedene veröffentlichte Berichte gibt, die darauf hinweisen, dass Monocyten in die Angiogenese involviert 2224, wurde nicht angenommen, dass Monocyten bei der Entwicklung von kollateralen Arterien und der Arteriogenese²&sup5; eine Rolle spielen.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen einzusetzenden MCPs können aus verschiedenen Quellen beschrieben nach dem Stand der Technik erhalten werden, siehe z. B. Proösl&sup6;&sup9;, Dahinden&sup7;&sup0;, Alam&sup7;¹ und Oppenheim&sup7;². Unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie besteht die Möglichkeit zur Herstellung verschiedener Derivate von MCPs, umfassend einen funktionellen Teil daraus oder Proteine, die wie vorstehend beschrieben funktionell äquivalent zu MCPs sind. In diesem Zusammenhang bedeutet "funktionell äquivalent" oder "funktionaler Teil" eines MCP, wie in dieser Ausführung durchweg gebraucht, ein Protein, welches einen Teil der oder die vollständige Primärstrukturkonformation eines MCP aufweist und zumindest die biologische Fähigkeit zur Anlockung von Monocyten besitzt. Der funktionale Teil des Proteins oder das funktionell äquivalente Protein kann ein Derivat eines MCPs sein, gewonnen durch Aminosäure(n)deletion, -substitution, -insertion, -addition und/oder Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren, zum Beispiel durch gerichtete Mutagenese der entsprechenden DNA. Die rekombinante DNA-Technologie ist dem Fachmann wohlbekannt und zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al. (Molecular cloning; A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour NY (1989)). Zum Beispiel wurde herausgefunden, dass eine Mutation der Aminosäuren Leu25 und Va127 in Tyr eine neue Monocyten-chemoattraktive Aktivität in Interleukin-8 induziert, das normalerweise nicht Monocyten aktiviert&sup6;&sup6;.
MCPs oder funktionale Teile davon oder Proteine, die funktionell äquivalent zu MCPs sind, können durch bekannte herkömmliche chemische Synthesen oder rekombinante Techniken unter Verwendung der Aminosäure- und DNA-Sequenzen nach dem Stand der Technik hergestellt werden&sup6;&sup9;&supmin;&sup7;², zum Beispiel können MCPs durch Züchtung einer geeigneten Zelle oder Zelllinie, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, welche bei Expression unter der Kontrolle regulatorischer Sequenzen ein MCP oder einen funktionalen Teil davon oder ein Protein, das funktionell äquivalent zu einem MCP ist, codiert. Geeignete Techniken zur Herstellung rekombinanter Proteine sind beschrieben z. B. in Sambrook, vorstehend. Chemische Syntheseverfahren zur Konstruktion von MCPs und Proteinen wie vorstehend beschrieben, die in den erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen eingesetzt werden können, sind Fachleuten ebenfalls bekannt.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Monocytenchemotaktischen Proteins (MCP) oder eines Nucleinsäuremoleküls, welches das MCP codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verstärkung des kollateralen Wachstums kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen.
Das Arzneimittel umfasst zumindest ein MCP wie vorstehend definiert und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipient. Beispiele geeigneter pharmazeutischer Träger sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und beinhalten Phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Befeuchtungsmitteln, sterile Lösungen usw. Mittel, die solche Träger umfassen, können durch herkömmliche Verfahren entwickelt werden. Die Arzneimittel können dem Patienten in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Dosierung kann vom behandelnden Arzt unter Berücksichtigung der Kondition des Patienten, der Schwere der Erkrankung und anderer klinischer Faktoren bestimmt werden. Die Verabreichung der geeigneten Mittel kann auf unterschiedlichen Wegen erfolgen, z. B. durch intravenöse, intraperitoneale, subcutane, intramuskuläre, topicale oder intradermale Verabreichung.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das in den erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen verwendete MCP aus der Gruppe bestehend aus MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1α, RANTES, J-309 oder einem anderen CC-Chemokin oder klassischen Chemoattraktoren wie N-Farnesyl-Peptid, C5a, Leukotrien-B4 oder Thrombozytenaktivierender Faktor (PAF)35,48 ausgewählt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dienen die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen zur Behandlung von Patienten, die an Verschlusskrankheiten leiden, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Krankheiten der Koronararterien, cerebralen Verschlusskrankheiten, peripheren Verschlusskrankheiten, visceralen Verschlusskrankheiten, renalen Arterienkrankheiten und. Insuffizienz der Mesenteralarterien.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dienen die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen zur Behandlung von Patienten während oder nachdem diese einem Mittel oder Strahlung oder chirurgischer Behandlung ausgesetzt waren, wodurch Arterien beschädigt oder zerstört wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in den erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen verwendete MCP ein rekombinantes MCP. DNA-Sequenzen, welche MCPs codieren, die in den erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen verwendet werden können, sind nach dem Stand der Technik beschrieben, z. B. Garcia-Zepeda³&sup4;. Darüber hinaus sind DNA- und Aminosäure-Sequenzen von MCPs in der GenBank Datenbank zugänglich. Wie vorstehend beschrieben, sind Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine dem Fachmann wohlbekannt, siehe z. B. Sambrook, vorstehend.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Arzneimittel hergerichtet für die Verabreichung in Verbindung mit Wachstumsfaktoren, vorzugsweise Fibroblasten- Wachstumsfaktor oder vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF). Diese Ausführungsform ist besonders geeignet für die Verstärkung sowohl der Knospung von Kapillaren (Angiogenese) als auch der in situ Vergrößerung bereits vorhandener arteriolärer Verbindungen in echte Kollateralarterien. Arzneimittel umfassend zum Beispiel ein MCP wie MCP-1 und einen Wachstumsfaktor wie VEGF können zur Behandlung peripherer Gefäßkrankheiten oder Krankheiten der Koronararterien verwendet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren
(a) das Erhalten von Zellen eines Patienten;
(b) das Einbringen eines Nucleinsäuremoleküls, welches das MCP codiert, in diese Zellen, wodurch diesen die Expression und Sekretion des MCP in einer für die Anlockung von Monocyten geeigneten Weise möglich wird;
(c) Rückführung der in Schritt (b) erhaltenen Zellen in den Patienten.
Durch die vorliegende Erfindung ist vorgesehen, dass die MCPs und die Nucleinsäuremoleküle, welche die MCPs codieren, entweder allein oder in Verbindung, und gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten, verabreicht werden. Die Nucleinsäuremoleküle können stabil in das Genom der Zelle integriert sein oder in extrachromosomaler Form vorhanden sein. Andererseits können virale Vektoren zur Transfektion bestimmter Zellen oder Gewebe, vorzugsweise Zellen und Gewebe, welche vorhandene arterioläre Verbindungen umgeben, verwendet werden. Elemente, welche in der Lage sind, ein Nucleinsäuremolekül und/oder Protein zu spezifischen Zellen zu steuern, sind nach dem Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel Somia, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92 (1995), 7570-7574. Also ist es möglich die Verfahren und Verwendungen der Erfindung zur somatischen Gentherapie einzusetzen, die auf dem Einbringen funktionaler Gene in Zellen mittels ex vivo oder in vivo Techniken basiert und die eine der wichtigsten Anwendungen von Gentransfer darstellt, siehe z. B. Schaper&sup7;³ und hierin zitierte Literatur.
Also ist in einer bevorzugten Ausführungsform das Nucleinsäuremolekül, das in dem Arzneimittel für die erfindungsgemäße Verwendung enthalten ist, konstruiert für die Expression und Sekretion des MCP durch Zellen in vivo in einer für die Anlockung von Monocyten geeigneten Form, durch zum Beispiel direktes Einbringen des Nucleinsäuremoleküls oder Einbringen eines das Nucleinsäuremolekül enthaltenden Plasmids, eines Plasmids in Liposomen oder eines viralen Vektors (z. B. adenoviral, retroviral).
Wie vorstehend ausgeführt, ist das Arterienwachstum aus bestehenden arteriolären Verbindungen notwendig für die Zufuhr von Nährstoffen zu Tumoren. Also ist eine Unterdrückung und/oder Hemmung des Tumorwachstums zu erwarten, wenn das Wachstum dieser Gefäße zum Tumor unterdrückt wird. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren, umfassend das Inkontaktbringen von Gewebe oder Zellen mit einem Mittel, welches das Wachstum kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen durch die Anlockung von Monocyten unterdrückt. Mittel, welche das Wachstum kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen unterdrücken, können Peptide, Proteine, Nucleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Hormone, Neuraltransmitter, Peptidomimetica oder PNAs sein (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines Mittels, welches das Wachstum kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen durch die Anlockung von Monocyten unterdrückt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform hemmt das in den erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen verwendete Mittel, wie vorstehend beschrieben, die biologische Aktivität eines MCP und/oder hemmt ein durch den Rezeptor für ein MCP im Monocyten ausgelöstes interzelluläres Signal, vorzugsweise blockiert das zuvor erwähnte Mittel die Interaktion von MCP und seinem Rezeptor. Verschiedene Rezeptoren für MCPs sind nach dem Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Charo&sup6;&sup8; und in "Chemokin-Rezeptoren"&sup6;². Weiterhin wurde kürzlich gezeigt, dass die Phosphorylierung des MCP-Rezeptors die Rezeptor- Desensibilisierung und -Internalisierung steuert und dass über Änderung der Phosphorylierungsstellen des Rezeptors die chemotaktische Antwort von Leukocyten auf MCP-1 und verwandte Chemokine moduliert werden kann&sup6;&sup7;.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CCR1, CCR2, CCR4 und CCR5.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel, welches die Interaktion des MCP und seines Rezeptors blockiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
(i) einem anti-MCP Antikörper und einem anti-MCP-Rezeptor Antikörper; und/oder
(ii) einer nicht-stimulatorischen Form eines MCP-Proteins und einer löslichen Form eines MCP-Rezeptors.
Anti-MCP oder anti-MCP-Rezeptor Antikörper können nach bekannten Verfahren unter Verwendung des gereinigten MCP oder dessen Receptors oder Teile davon als Antigen hergestellt werden.
Monoklonale Antikörper können hergestellt werden zum Beispiel durch die Techniken beschrieben in Köhler und Milstein, Nature 256 (175), 495 und Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, welche die Fusion von Maus Myelom-Zellen und Nierenzellen aus immunisierten Säugetieren umfassen. Weiterhin können Antikörper oder Fragmente davon gegen die zuvor erwähnten MCPs oder deren Rezeptoren erhalten werden durch Verwendung von Verfahren, welche z. B. beschrieben sind in Harlow und Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbour, 1988. Diese Antikörper können monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder synthetische Antikörper sein sowie Fragmente von Antikörpern, wie Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente etc.
Nicht-stimulatorische Formen von MCPs und Antagonisten von MCP-Rezeptoren wurden zum Beispiel beschrieben in Gong&sup6;&sup5;.
In einer anderen Ausführungsform ist das Mittel, welches das Wachstum kollateraler Arterien und/oder die Arteriogenese unterdrückt, eine anti-sense RNA des MCP oder dessen Rezeptors. Es kann wünschenswert sein, die Expression des Gens, welches das MCP codiert und/oder des Gens, welches dessen Rezeptor codiert, zu inaktivieren. Dies kann erreicht werden durch Verwendung von zum Beispiel Nucleinsäuremolekülen, welche den komplementären Stang des mRNA-Transkripts oder eines Teils davon, welches das MCP oder dessen Rezeptor codiert, darstellen oder umfassen. Solche Moleküle können entweder DNA oder RNA oder ein Hybrid daraus sein. Weiterhin kann das Nucleinsäuremolekül zum Beispiel Thioester-Bindungen und/oder Nucleotidanaloga, welche herkömmlicherweise in Oligonucleotid-Anwendungen verwendet werden, enthalten. Die Modifikationen können hilfreich sein zur Stabilisierung des Nucleinsäuremoleküls gegenüber Endo- und/oder Exonucleasen in der Zelle. Die Nucleinsäuremoleküle können auch durch einen geeigneten Vektor transkribiert werden, der ein chimäres Gen enthält, welches die Transkription des Nucleinsäuremoleküls in der Zelle ermöglicht. Derartige Nucleinsäuremoleküle können weiter Ribozymsequenzen enthalten, welche spezifisch die mRNA schneiden, die das MCP oder dessen Rezeptor codiert. Weiterhin können Oligonukleotide konstruiert werden, welche komplementär sind zu einer Region des Genes, das für das MCP oder dessen Rezeptor codiert (Tripelhelix; siehe Lee, Nucl. Acids Res. 6 (1979), 3073; Cooney, Science 241 (1988), 456 und Dervan, Science 251 (1991), 1360), wodurch die Transkription und Produktion des MCP oder dessen Rezeptors verhindert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die anti-sense RNA so konstruiert, dass sie in vaskulären Zellen oder Zellen, welche bestehende arterioläre Verbindungen zu einem Tumor umgeben, exprimiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen eingesetzt zur Behandlung eines Tumors, welcher ein vaskulärer Tumor ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kolonkarzinom, Sarkom, Brustkarzinom, Kopf-/Nackenkarzinom, Mesotheliom, Glioblastom, Lymphom und Meningeom.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäß gebrauchte Arzneimittel konstruiert zur Verabreichung durch Katheter auf intraarteriellem, intravenösem, intraperitonealem oder subcutanem Wege. In den Beispielen der vorliegenden Erfindung wurde die menschliche Form des MCP-1 Proteins lokal über eine osmotische Minipumpe verabreicht. Die positive immunhistochemische Färbung auf BrdU, welches in zwei Tiere auf gleichem Wege wie MCP-1 infundiert wurde, veranschaulichte, dass die lokale Zuführung von Substanzen in die kollaterale Zirkulation möglich ist.
Das MCP und dessen codierendes Nukleinsäuremolekül kann in verschiedenen Formen für therapeutische Zwecke verwendet werden. Entweder, wie in den hier beschriebenen Experimenten, lokal über implantierte Pumpen oder als arterielle oder venöse Bolusgaben entweder systemisch oder lokal über speziell konstruierte Katheter oder andere Vorrichtungen. Sie können auch intramuskulär oder in jedes andere Gewebe, in welchem kollaterales Arterienwachstum gefördert werden muss, injiziert werden. Alternativ können sie vor der Injektion an Mikrokapseln oder Mikrosphären gebunden werden.
Ein anderer Ansatz würde sein, eine Gentransfer-Methode zu verwenden, entweder durch Verwendung eines Plasmids oder eines in Liposomen eingebetteten Plasmids oder eines viralen Vektors. Man kann entweder eine in vivo Gentransfer-Methode verwenden, für die vielfältige Vorrichtungen, wie Doppelballon- oder andere Katheter konstruiert wurden, oder direkte Injektion ins Zielgewebe, wie vorstehend beschrieben. Alternativ ist es möglich, eine ex vivo Methode zu verwenden, indem Zellen, welche bekanntermaßen in Geweben eingelagert sind in denen Gefäßwachstum gefördert oder gehemmt werden muss, aus dem Körper isoliert werden und dann unter Verwendung eines der vorstehend genannten Verfahren transfiziert und reinjiziert werden.
Die erfindungsgemäßen Verwendungen und Verfahren können zur Behandlung aller Arten von Erkrankungen verwendet werden, von denen bislang nicht bekannt ist, dass sie in Verbindung stehen mit oder abhängig sind von der Modulation des Wachstum kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen. Die Verfahren und Verwendungen der vorliegenden Erfindung können wünschenswerterweise beim Menschen angewendet werden, obwohl auch die Behandlung von Tieren von den hier beschriebenen Verfahren und Verwendungen eingeschlossen wird.
Die Figuren zeigen
Fig. 1: Monocyten/Macrophagen Akkumulation nach Verschluss der femoralen Arterien im Kaninchen-Hinterbein. A) Ein Monocyt haftet an der Wand einer ausgeschnittenen kollateralen Arterie (Pfeil); zwei andere, grün gefärbte, Makrophagen (hell) sind schon in die Gefäßwand eingewandert. B) Makrophagen sind im unteren Bein auch interstitiell zu finden (Pfeile). C) und D) grün gefärbte Monocyten/Makrophagen (hell) sind sehr viel zahlreicher in MCP-1 behandelten Tieren (Maßstabbalken: 20 mm).
Fig. 2: Post-mortem Angiogramme von Kaninchen-Hinterbeinen nach einwöchigem Verschluss der femoralen Arterien. A) Ohne MCP-1 Behandlung. B) Nach einwöchiger lokaler MCP-1 Infusion. Die Dichte kollateraler Gefäße mit typischer Korkenzieher-Erscheinung ist deutlich erhöht in Hinterbeinen von Tieren, die mit MCP-1 behandelt wurden.
Fig. 3: Färbung von Bromdeoxyuridin (BrdU) (helle Grünfluoreszenz), das als Proliferationsmarker kontinuierlich durch eine Minipumpe infundiert wurde und mit Phalloidin-TRITC als Marker für Actin gegengefärbt wurde: ausgeprägte Aufnahme von BrdU in Endothelzellen und glatte Muskelzellen während der ersten Woche des Verschlusses der femoralen Arterien. B) Spezifische Färbung von Kapillaren mil: einem Antikörper gegen CD31 in einem normalen gastrocnemialen Muskel. C) Derselbe Muskel gefärbt auf CD31 nach einwöchigem Verschluss; die Anzahl der Kapillaren hat sich erhöht. D) Gastrocnemialer Muskel nach einwöchigem Verschluss und MCP-1 Infusion; Kapillaren sind viel zahlreicher nach MCP-1 Behandlung (Maßstabbalken in allen Abbildungen: 20 mm).
Fig. 4: Massenleitfähigkeit von Kaninchen-Hinterbeinen nach einwöchigem Verschluss der femoralen Arterien mit lokaler MCP-1 Infusion im Vergleich zu Kontroll-Hinterbeinen nach akutem, einwöchigem oder dreiwöchigem Verschluss oder ohne Verschluss. Die Massenleitfähigkeit in MCP-1- behandelten Tieren war signifikant höher als in Kontrolltieren nach der gleichen Zeit des Verschlusses der femoralen Arterien und erreichte Werte nicht-verschlossener Beine (*p < 0,05 und **p < 0,01 verglichen mit akutem Verschluss, p < 0,05 verglichen mit einwöchigem Verschluss ohne MCP-1 Behandlung).
Fig. 5: Kollaterale Leitfähigkeit von Kaninchen-Hinterbeinen nach einwöchigem Verschluss der femoralen Arterien mit lokaler MCP-1 Infusion in Vergleich zu Kontroll-Hinterbeinen nach akutem, einwöchigem und dreiwöchigem Verschluss in verschiedenen Regionen. Die kollaterale Leitfähigkeit in MCP-1 behandelten Tieren war in der Quadriceps- und Adductor longus-Muskelregion signifikant höher als in Kontrolltieren nach gleich langem Verschluss der femoralen Arterien. Diese Werte neigten dazu höher zu sein als die, welche in Kontrolltieren nach dreiwöchigem Verschluss der femoralen Arterien beobachtet wurden (*p < 0,05 und **p < 0,01 verglichen mit akutem Verschluss; p < 0,01 verglichen mit einwöchigem Verschluss ohne MCP-1 Behandlung).
Fig. 6: Periphere Leitfähigkeit von Kaninchen-Hinterbeinen nach einwöchigem Verschluss der femoralen Arterien mit lokaler MCP-1 Infusion in Vergleich zu Kontroll-Hinterbeinen nach akutem, einwöchigem oder dreiwöchigem Verschluss. Die periphere Leitfähigkeit in MCP-1 behandelten Tieren war signifikant höher als in Kontrolltieren nach gleich langem Verschluss der femoralen Arterien. Ähnlich wie bei der kollateralen Leitfähigkeit neigten diese Werte dazu, höher zu sein als die, welche in Kontrolltieren nach dreiwöchigem Verschluss der femoralen Arterien beobachtet wurden (*p < 0,05 und **p < 0,01 verglichen mit akutem Verschluss; p < 0,01 verglichen mit einwöchigem Verschluss ohne MCP-1 Behandlung).
Fig. 7: Anzahl kollateraler Arterien, identifiziert durch ihre Stammregionen, Mittelzonenregionen und Wiedereintrittsregionen in stereoscopen, dreidimensionalen Angiogrammen. Die Anzahl kollateraler Arterien nach einwöchigem Verschluss (rechtes Bein) war fast zweimal so hoch in MCP-1 behandelten Tieren verglichen mit Tieren, die nur mit dem Träger behandelt wurden. Im nicht-verschlossenen linken Kontroll-Bein wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden.
Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1: Verschluss der femoralen Arterien bei Tieren und lokale Zufuhr von Mitteln

Die vorliegende Studie wurde durchgeführt mit Zustimmung des Landes Hessen, Regierungspräsidium Darmstadt, gemäß § 8 des deutschen Tierschutzgesetzes. Dieses entspricht dem "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" veröffentlicht von den US National Institutes of Health (NIH Publication No.85-23, überarbeitet 1985). Zwölf Kaninchen wurden einem 7-tägigen bilateralen Verschluss der femoralen Arterien ausgesetzt. Sie wurden zufällig ausgewählt, um entweder Monocytenchemotaktisches Protein-1 (MCP- 1; PeproTech Inc. Rocky Hill, NJ, USA) lokal über osmotische Minipumpen (2ML-2 Alza Corp, USA; 3 mg in 2 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei einer Geschwindigkeit von 10 ml/h), PBS über eine osmotische Minipumpe oder keine Behandlung zu erhalten. Neun zusätzliche Tiere wurden zum Vergleich entweder keinem, einen akuten oder einem 21-tägigen Verschluss der femoralen Arterien ausgesetzt. Zwei Tiere wurden ausgestattet mit einer osmotischen Minipumpe (2ML-2 Alza Corp, USA), die Bromdesoxyuridin (BrdU: Sigma Chemicals, St. Louis) auf gleichem Wege wie MCP-1 zuführte, um die Funktion des lokalen Zufuhrsystems zu verifizieren und die Proliferation kollateraler Arterien und Kapillaren zu untersuchen.
Für die anfängliche Operation wurden die Tiere betäubt mit einer intramuskulären Injektion von Ketaminhydrochlorid (4-8 mg pro Kilogramm Köpergewicht) und Xylazin (8-9 mg pro Kilogramm Körpergewicht). Zusätzliche Dosen des Anesthetikums (10-20% der anfänglichen Dosis) wurden wenn nötig intravenös gegeben. Die Operation wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die femoralen Arterien wurden freigelegt und es wurde ein steriler Polyethylen-Katheter (1 mm i.d., 1,5 mm o.d.) eingeführt, der stromaufwärts zeigte, wobei die Spitze des Katheters distal der Verzweigung der Arteria circumflexa femoris positioniert war. Der Katheter selbst war verbunden mit der osmotischen Minipumpe (2ML-2 Alza Corp, USA), die unter der Haut des unteren Abdomens implantiert war. Die Kaninchen waren bekleidet mit einem speziell angefertigten Anzug, der es ihnen erlaubte sich frei zu bewegen sie aber vor Selbstverstümmelung schützte. Sie wurden zusammen in einem großen Käfig gehalten mit freiem Zugang zu Wasser und Futter, um Mobilität sicherzustellen. Vor der Opferung erhielten die Tiere eine weitere intramuskuläre Injektion von Ketaminhydrochlorid und Xylazin. Die Tiere wurden dann einer Tracheostomie unterzogen und wurden künstlich ventiliert. Die Anästhesie wurde mit Pentobarbital (12 mg/kg Körpergewicht pro Stunde) vertieft. Die Carotis war zur kontinuierlichen Beobachtung des Druckes mit einer Kanüle versehen. Die Arteria saphena magna (vordere Tibialarterie beim Menschen; wichtigste arterielle Versorgung zum unteren Hinterbein und Fuß beim Kaninchen) wurde direkt über der Ferse freigelegt und mit einer Kanüle mit Polyethylen Schläuchen (0,58 mm i.d., 0,96 mm o.d.) versehen. Diese waren zur Messung von peripheren Drucken angeschlossen an einen Statham P23DC Druckwandler (Statham, Spectramed, USA). Nach Heparinisierung mit 5000 Einheiten Heparin wurden beide externen Iliakalarterien freigelegt und mit einer Kanüle mit Metallschläuchen mit 2,0 mm Innendurchmesser versehen. Die abdominale Circumflexarterie und die Arteria spermatica wurden abgebunden und um beide Oberschenkel wurde proximal ein Tourniquet gelegt, wobei die femorale Arterie offen gelassen wurde. Die femorale Vene und die Ischiasvene wurden zur Drainage venösen Blutes eingeschnitten. Die Tiere wurden dann ausgeblutet, die Beine wurden über der Hüfte amputiert und zügig in die Perfusionsapparatur überführt. Während oder nach der primären Operation wurde kein Tier verloren. Auch wurde nach Verschluss der femoralen Arterien keinerlei Infektion oder grobe Funktionsstörung beobachtet. Zwei Tiere mußten von der Studie ausgeschlossen werden wegen Luftembolie. Nach Beendigung des Experimentes wurde die gesamte im Reservoir der Minipumpe verbliebene Flüssigkeit gesammelt und gewogen. In den zwei Kontroll-Tieren, die Bromdesoxyuridin (BrdU) erhielten, wurde eine BrdU-Färbung anhand Standard immunhistochemischer Verfahren, die an anderer Stelle beschrieben sind²&sup6;, durchgeführt. Die Evaluierung der im Reservoir verbliebenen Flüssigkeiten zeigte, dass in allen Experimenten eine Pumprate von 10 ml/h erreicht wurde. Die positive immunhistochemische Färbung auf BrdU zeigte, dass die lokale Infusion in die kollaterale Zirkulation über osmotische Minipumpen möglich war.

Beispiel 2: Ex vivo Druck-Durchfluss-Beziehungen

Die Beine wurden mit autologem, Sauerstoffhaltigem Blut, das auf 37ºC gewärmt war, unter Verwendung einer Stoeckert-Rollerpumpe (Stoeckert GmbH, Deutschland) und eines Jostra M2-Membranxygenators (Jostra GmbH, Deutschland) perfundiert. Der Hämatokrit wurde zwischen 34% und 37% gehalten und die Sauerstoffsättigung bei 99%. Maximale Vasodilatation wurde erreicht durch Zugabe von 25 mg Papaverin (Sigma Chemicals, St. Louis, USA) zum Perfusat (priming Volumen: 60 ml). Die Beine wurden bei drei verschiedenen Druckhöhen (40, 60 und 80 mmHg) perfundiert. Nach der Stabilisation wurden radioaktive Mikrosphären injiziert und es wurde unter Verwendung einer Spritzenpumpe (Braun Melsungen, Deutschland) eine Referenzprobe genommen. Für jede Druckhöhe wurden Mikrosphären, die entweder mit Ruthenium, Cerium, Niobium oder Scandium (Dupond NEN Products, USA) markiert waren, zufällig ausgewählt. Dies erlaubte es, die Gewebeperfusion auf verschiedene Perfusionsdrucke zu beziehen. Der Gesamt-Durchfluss wurde bestimmt unter Verwendung einer Ultraschall-Inlinefluss-Sonde, die mit einer T201 Durchflußmeßvorrichtung (Flowmeter, Transonic Systems Inc., USA) verbunden war. Systemische Drucke und periphere Kapillardrucke wurden mit einem Statham P23DC Druckwandler (Statham, Spectramed, USA) verfolgt. Alle Aufnahmen wurden online auf ein computerisiertes Aufnahmesystem (MacLab, Apple Microsoft, USA) überragen, von welchem sie für weitere Verarbeitung wiedergewonnen wurden. M. quadriceps, M. adductor longus und M. adductor magnus, M. gastrocemius, M. soleus und die peronealen Muskeln wurden aus dem Bein entnommen und jeder Muskel wurde vom proximalen zum distalen Ende in fünf aufeinanderfolgende Proben geteilt. Die Proben wurden gewogen und anschließend zusammen mit den entsprechenden Referenzproben unter Verwendung eines Gedetectors analysiert wie früher beschrieben²&sup7;. Von den insgesamt 27 Hinterbeinen, die perfundiert wurden, wurden vier ausgeschlossen weil die peripheren Drucke nicht erhalten werden konnten und einer wurde von der Bestimmung der kollateralen und kapillaren Leitfähigkeiten wegen Fehlern bei der Probennahme ausgeschlossen. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Leitfähigkeiten zwischen den Tieren, die PBS über eine Minipumpe erhielten und den Tieren, die keine Behandlung erhielten (Massenleitfähigkeit (bulk conductance): 57,2+/-8,60 vs. 69,2+/-10,01; kollaterale Leitfähigkeit: 24,5+/-5,69 vs. 25,3+/-3,29; alle Daten in ml/min/100 mmHg). Daher wurden diese beiden Gruppen in der Endanalyse vereinigt.
Zur Berechnung von Proben-Durchflussraten wurde die mittlere Probenaktivität pro Gramm Muskelgewicht (Am/g) verwendet und bezogen auf den Gesamt-Durchfluss pro Gramm Muskelgewicht (Ft/g), was die Berechnung des Proben-Durchflusses (FS) unter Verwendung der Gleichung Fs = Ft/Am · As erlaubte. Dies stimmte gut überein mit der Berechnung der Proben-Durchflusses (FS) aus Probenaktivität (AS), Referenzprobenaktivität (Ar), Gewicht der Referenzprobe (Wr) und Zeit der Referenzprobenentnahme (t) gemäß der Gleichung Fs = As/Ar · Wr/t.
Im vorliegenden Modell liefern kollaterale Arterien, welche sich nach Verschluss der femoralen Arterien in typischer Korkenzieherformation entwickeln, Blut zur distalen Adduktor-Region und zum unteren Bein. Der systemische Druck (SP) und der periphere Druck in der saphenous Arterie wurde verwendet. Der venöse Druck war gleich dem atmosphärischen Druck (AP, null im vorliegenden Fall). Da arterielle Wiederstände viel niedriger als kollaterale und periphere Wiederstände sind, können sie vernachlässigt werden. SP stellt den Druck in der Stammregion der kollateralen Arterien dar. PP ist der Druck in der Wiedereintrittsregion und ist identisch mit dem höchsten Druck der Zirkulation im unteren Bein, AP ist der Druck am venösen Ende der peripheren Zirkulation. Der kollaterale Durchfluss (Fc) ist gleich der Summe aus Durchfluss zum Gewebe des distalen Adduktors (FdTA) und dem Durchfluss zum Gewebe des unteren Beines (FTII). (Der Durchfluss zum Knochen war sehr klein und die arterielle Hauptversorgung zum Bein war abgebunden. Daher wurden diese Werte in unserer Berechnung vernachlässigt). Der kollaterale Wiederstand (Rc) wurde definiert als Druckdifferenz zwischen Perfusionsdruck (SP) und peripherem Druck (PP) geteilt durch den Durchfluss der zum distalen Adduktor und zum unteren Bein geht. Der periphere Wiederstand (Rp) wurde definiert als peripherer Druck (PP) geteilt durch den Durchfluss zum unteren Bein (FTII) und die Massenleitfähigkeit wurde definiert als der systemische Druck (SP) geteilt durch den Massen-Durchfluss aufgenommen mit der Ultraschall-Durchfluss-Sonde. Die reziproken Werte dieser Wiederstände repräsentieren die kollaterale, periphere und Massenleitfähigkeit (Cc, Cp und Cb). Da ein positives Abhören des Druckes sogar bei maximaler Vasodilatation beobachtet wird, wurden alle Leitfähigkeiten berechnet aus der Neigung der Druck/Durchfluss-Beziehungen.
Nach einwöchigem Verschluss der femoralen Arterien wurde die Massenleitfähigkeit, wie berechnet aus Druck/Durchfluss-Beziehungen, signifikant höher in MCP-1 behandelten Tieren (142,1+/-31,71 ml/min/100 mmHg versus 66,2+/-7,76 ml/min/100 mmHg; p < 0,05)(Fig. 4). Nach siebentägigem Verschluss erreichten die Massenleitfähigkeiten von MCP-1 behandelten Tieren sogar größere Höhen als in unbehandelten Tieren nach dreiwöchigem Verschluss der femoralen Arterien und waren vergleichbar mit Werten in unverschlossenen Hinterbeinen.
Auch die kollaterale Leitfähigkeit war nach einwöchigem Verschluss signifikant höher in MCP-1 behandelten Tieren verglichen mit Tieren ohne dieser Behandlung (70,6+/-19,23 ml/min/100 mmHg versus 25,1+/-2,59 ml/min/100 mmHg; p < 0,01) (Fig. 5). Die kollaterale Leitfähigkeit von Tieren, die MCP-1 für eine Woche erhalten hatten, neigte dazu in allen Gebieten in denen kollaterales Wachstum beobachtet wurde sogar größer zu sein als in unbehandelten Tieren nach dreiwöchigem Verschluss der femoralen Arterien. In der Wade war die Leitfähigkeit nach einwöchigem Verschluss der femoralen Arterien auch signifikant höher in Tieren mit MCP-1 Behandlung verglichen mit Kaninchen, die kein MCP-1 erhalten hatten (119,3+/-22,37 ml/min/100 mmHg versus 45,4+1-6,80 ml/min/100 mmHg; p < 0,01) (Fig. 6). Alle Daten sind im Mittel +/- SEM gezeigt. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden durchgeführt durch ungepaarte Student's t-Tests. Im Falle ungleicher Varianzen wurde der Rangfolgentest nach Mann-Withney verwendet. Zur Annahme statistischer Signifikanz wurden Wahrscheinlichkeitswerte von 0,05 oder weniger benötigt.
Die Behandlung mit MCP-1 erhöhte sowohl die kollaterale als auch die periphere Leitfähigkeit zweifach, wie verglichen mit unbehandelten Tieren nach siebentägigem Verschluss der femoralen Arterien. Also erreichten Tiere, die lokal MCP-1 injiziert erhielten, nach einwöchigem Verschluss der femoralen Arterien normale Leitfähigkeitswerte, während die Leitfähigkeitswerte in unbehandelten Tieren sogar drei Wochen nach Verschluss nicht auf Normalwerte zurückgingen. Wie vorstehend erwähnt, ist MCP-1 hauptsächlich bekannt als Chemoattraktor für Monocyten31,35. Eine mögliche Erklärung würde daher sein, dass MCP-1 seine ausgeprägten Effekte auf die kollaterale und periphere Leitfähigkeit über Anlockung und Aktivierung von Monocyten ausübt, welche daraufhin Wachstumsfaktoren herstellen, was zur Proliferation von Endothelzellen und glatten Muskelzellen führt. Dies setzt voraus, dass Monocyten an die kleinen arteriolären Verbindungen anhaften, welche sehr wahrscheinlich der Ursprung unserer kollateralen Arterien sind35,48,49. Diese bestehenden arteriolären Verbindungen erfahren eine große Zunahme von Scherkräften wenn die Haupt- Arterienversorgung zum unteren Bein verschlossen wird.

Beisipiel 3: Post mortem Angiographie

Nach maximaler Vasodilatation wurden die Beine auf 37ºC gewärmt und mit Krebs- Henseleit-gepufferter Kochsalzlösung für eine Minute perfundiert, gefolgt von der Perfusion mit Kontrastmedium basierend auf Bismut und Gelatine gemäß einer Formel entwickelt von Fulton²&sup8;. Anschließend konnte das Kontrastmedium durch Lagerung des Beines auf zerstoßenem Eis gelieren und aus zwei verschiedenen Winkeln wurden in einer Balteau- Radiographieapparatur (Machlett Laboratories, USA) unter Verwendung eines einzeln umhüllten Structurix D7 DW Films (AGFA, Deutschland) Angiogramme aufgenommen. Die resultierenden stereoskopen Bilder erlaubten die Analyse des kollateralen Wachstums in drei Dimensionen.
Die Post mortem Angiogramme zeigten Korkenzieher-Kollaterale hauptsächlich in den Muskeln adductor longus, adductor magnus und vastus intermedius, die das Perfusionsbett der arteria femoralis profunda mit dem der arteria saphena parva in den Adduktormuskeln und das Perfusionsbett der arteria circumflexa femoris lateralis mit dem der arteriae genuales im Quadricepsmuskel verbinden. Angiogramme, die von Hinterbeinen von Tieren mit MCP-1 Behandlung aufgenommen wurden, zeigten einen bemerkenswerten Anstieg in der Dichte dieser kollateralen Gefäße (Fig. 2A und B). Auf Angiogrammen im unteren Bein von normalen und MCP-1 behandelten Tieren waren keine kollateralen Gefäße sichtbar.

Beispiel 4: Histologische Untersuchungen

Die abdominale Aorta wurde mit einer Metallkanüle mit 2 mm Innendurchmesser versehen, die Brust wurde geöffnet und das Herz wurde freigelegt. Nach Einschnitt des rechten Atriums, um die Dränage von Spüllösung und Fixativ zu ermöglichen, wurde die Perfusion gestartet mit einer Spüllösung, die 0,5 % BSA, 5 mM EDTA, 0,317 mg/ml Adenosin in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) · 1,5 enthielt, für 5 min. gefolgt von der Fixierung mit 4% Formalin in der Spüllösung ohne BSA für 20 min. Anschließend wurde eine post mortem Angiographie, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt. Dies erlaubte die genaue Lokalisation und Entfernung kollateraler Gefäße, deren Stamm- und Wiedereintrittsregionen.
Für Immunhistochemische Analysen wurden die Proben über Nacht in 20% Saccharose gehalten und dann eingefroren und in Stickstoff-gekühltem Methylbutan bei -130ºC auf Kork eingebettet. Sie wurden bei -80ºC bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt. Zur Visualisierung von BrdU wurden 20 mm Gefrierschnitte in einem Leica cm 3000 Kryotom erhalten, auf Silikon-beschichtete Objektträger aufgebracht und für 20 min in 2 mol/l HCl bei 38ºC inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS für jeweils 5 Minuten wurden diese mit dem Primärantikörper gegen BrdU (Clon BU20a, DAKO Corp.) 1 : 20 in PBS bei 4ºC über Nacht inkubiert. Zum Nachweis wurden die Proben für eine Stunde mit einem biotinylierten Esel Anti-Maus Antikörper (DIANOVA Corp.) 1 : 100 in PBS inkubiert, gefolgt von der Inkubation mit Streptavidin-cy2 (Biotrend, Köln, Deutschland) 1 : 100 in PBS für 30 Minuten. Schließlich wurden die Schnitte gegengefärbt, entweder mit 7-Aminoactinomycin D (7-AAD 1 : 50 in PBS, Molecular Probes, Eugene, Oregon USA) als Kernfärbung oder mit Phalloidin- TRTC (1 : 100 in PBS) als Marker für Aktin. Die Objektaräger wurden in Mowiol (Hoechst, Frankfurt/M., Deutschland) eingebettet und in einem Leica Konfokal-Lasermikroskop angeschaut. Benachbarte Schnitte, die bis auf das Weglassen des Primärantikörpers identisch behandelt wurden, dienten als Negativkontrollen. Die immunhistochemische Färbung von kapillaren Endothelzellen würde durchgeführt gemäß dem vorstehend beschriebenen Protokoll aber mit einem Antikörper gegen CD31 (DAKO, Deutschland), einem Endothelspezifischen Antigen, als Primärantikörper. Die Färbung auf Makrophagen wurde durchgeführt unter Verwendung von RAM 11 (DAKO, Deutschland), einem spezifischen Antikörper gegen Kaninchen-Makrophagen, als Primärantikörper. Nach Verschluss der femoralen Arterien fand man, dass Monocyten/Makrophagen in Gefäßwänden entfernter kollateraler Arterien und im unteren Bein interstitiell akkumulieren (Fig. 1A und B). Sie waren zahlreicher in MCP-1 behandelten Tieren (Fig. 1C und D). Weiterhin wurden makroskopisch in allen Tieren, die MCP-1 erhielten, weiße Plaques um den Infusionsort beobachtet. Diese Plaques enthielten große Mengen mononucleärer Zellen, die durch immunhistochemische Färbung mit RAM 11 (DAKO GmbH, Hamburg, Deutschland) vorwiegend als Monocyten/Makrophagen identifiziert wurden.
Durch makroskopische Inspektion der Injektionsorte und histologische Untersuchung von kollateralen Arterien aus dem Oberschenkel und Gewebeschnitten aus Wadenmuskeln wurde offensichtlich, dass die MCP-1 Injektion zu einem Anstieg der Monocytenakkumulation in unserem Experiment geführt hat. Die Positiv-Färbung von entfernten kollateralen Arterien auf BrdU lieferte Hinweise, dass kollaterale Gefäße, die angiographisch im Oberschenkel beobachtet wurden, wirklich proliferierten.
Kollaterale Arterien, die nach siebentägigem Verschluss entfernt wurden, zeigten in der BrdU-Färbung Proliferation von Endothelzellen und glatten Muskelzellen (Fig. 3A). Im unteren Bein wurde Proliferation von kapillaren Endothelzellen gesehen, was zu einem Anstieg der Zahl der Kapillaren sieben Tage nach Verschluss führte (Kontroll-Bein: Fig. 3 B, Bein nach siebentägigem Verschluss: Fig. 3C). MCP-1 behandelte Tiere zeigten nach einwöchigem Verschluss mehr Kapillaren im unteren Bein als unbehandelte Tiere, was auf eine Verstärkung der Kapillarknospung durch MCP-1 hindeutet (Fig. 3D).
Die immunhistochemischen Untersuchungen nach kontinuierlicher BrdU-Infusion zeigten deutlich, dass kollaterale Gefäßbildung im Oberschenkel die Proliferation von Endothelzellen und glatten Muskelzellen beinhaltete, in Anbetracht der Tatsache, dass die normale Generationszeit für Endothelzellen und ähnlich für glatte Muskelzellen mindestens sechs Monate beträgt und dass in normalen Arterien für gewöhnlich keine Proliferation gesehen wird³&sup9;. Das Maß an Proliferation ist ähnlich dem kollateraler Arterien im Hundeherz nach Setzen eines ameroid Construktors und erreicht das von Tumoren&sup4;&sup0;. Obwohl dies nicht die Möglichkeit ausschließt, dass MCF-1 kollaterale Arterienproliferation hypothetisch über unbemerkte chronisch vasodilatatorische Effekte verstärkt, sind die Schnelligkeit und das Ausmaß des Anstiegs kollateraler Leitfähigkeit viel höher als mit jedem anderen bekannten Vasodilatator&sup4;¹&supmin;&sup4;&sup4;. Weiterhin wurde gezeigt, dass Monocyten Stickoxid-Synthase, einen sehr starken Vasodilatator, in kultivierten Aortenendothelzellen herunterregulieren, was vermuten läßt, dass MCP-1 Vasodilatation eher hemmen als verstärken würde&sup4;&sup5;. Daher ist Vasodilatation eine sehr unwahrscheinliche Erklärung für die vorstehenden Befunde. Die höhere Dichte kollateraler Arterien in den Angiogrammen unterstützt weiter die Vorstellung, dass kollaterales Arterienwachstum für den Anstieg der kollateralen Leitfähigkeit verantwortlich ist.
Im Gegensatz zum Oberschenkel, wo die Dichte kollateraler Arterien zunahm, wurden verglichen mit Kontrolltieren nach siebentägigem Verschluss mehr Kapillaren in histologischen Schnitten von Wadenmuskeln von MCP-1 behandelten Tieren gefunden. Ein Antikörper gegen CD31 (PECAM) wurde als Marker für Endothelzellen gewählt, weil dieses Zelladhäsiosmolekül konstitutiv auf allen endothelialen Zellen exprimiert wird und nicht abhängig von ihrem Phänotyp oder ihrer Aktivierung46,47. Unter Verwendung von BrdU als Proliferationsmarker, wurden im Wadenmuskel nur proliferierende Kapillaren nachgewiesen. In diesem Bereich wurde kein Wachstum eines anderen Gefäßtyps gefunden. Was die kollaterale Leitfähigkeit angeht, kann passive Gefäßvergrößerung aufgrund von Vasodilatation ausgeschlossen werden, da sich eine Ursache für die periphere Leitfähigkeit durch die Durchführung der Messungen bei maximaler Vasodilatation verändert. Also sind Veränderungen der peripheren Leitfähigkeit am wahrscheinlichsten der Kapillarknospung zuzuschreiben.
Die histologischen Daten lassen darauf schließen, dass in MCP-1 behandelten Tieren mehr Monocyten akkumulieren. Da Monocyten potentiell in der Lage sind, große Mengen an Wachstumsfaktoren herzustellen, unterstützt dies weiter die Hypothese, dass Monocyten der Mediator für die Veränderungen, die mit MCP-1 Behandlung gesehen wurden, sind.
Zusammenfassend haben unsere Ergebnisse gezeigt, dass die lokale Infusion von MCP-1, einem wirksamen und spezifischen Chemoattraktor für Monocyten, in der Lage ist, sowohl die kollaterale als auch die periphere Leitfähigkeit merklich zu erhöhen. Angiographische und histologische Befunde deuten darauf hin, dass dieser Effekt aufgrund von verstärkter kollateraler Arterien- und Kapillarenproliferation zustande kommt und lassen darauf schließen, dass Adhäsion, Aktivierung und Migration von Monocyten eine wichtige Rolle spielen bei beiden Arten von Gefäßwachstum.

Beispiel 5: Anzahl kollateraler Arterien

Post mortem Angiographien wurden erhalten wie in Beispiel 3 beschrieben. Zur Quantifizierung wurde der Knochen extrahiert und die Wadenmuskeln wurden entfaltet bevor das Gewebe in die Balteau-Radiograpie-Apparatur eingesetzt wurde. Dies erlaubte die Identifizierung und die Zählung individueller kollateraler Arterien aufgrund ihrer Stammregionen, Mittelzonenregionen und Wiedereintrittsregionen in stereoskopen Angiogrammen. Die Anzahl so gezählter kollateraler Arterien differierte in individuellen Tieren nicht, wenn sie unabhängig durch vier verschiedene Beobachter erhalten wurde. Die Angiogramme wurden erhalten von sechs Tieren, die MCP-1 lokal über osmotische Minipumpen nach unilateralem Verschluss der femoralen Arterien erhielten und wurden verglichen mit Angiogrammen von sechs Tieren, die den Träger PBS nach Verschluss der femoralen Arterien auf gleichem Wege erhielten. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt. Nach siebentägigem Verschluss war die Anzahl kollateraler Arterien fast zweimal so hoch in Tieren, die MCP-1 erhielten verglichen mit Tieren, die PBS allein erhielten (30,17+/-1,96 vs 16,17+/-1,4; P < 0,001); siehe Tabelle 1.

Tabelle 1

PBS l. 500 ± 0.45
MCP-1 l 6.67 ± 1.17
PBS r. 16.17 ± 1.40
MCP-1 r. 30.17 ± 1.96
PBS r. vs. MCP-1 r. P = 0.0002
Tabelle 1: Anzahl kollateraler Arterien identifiziert anhand ihrer Stammregionen, Mittelzonenregionen und Wiedereintrittsregionen in stereoskopen, dreidimensionalen Angiogrammen. Die Anzahl kollateraler Arterien nach einwöchigem Verschluss (rechtes Bein) war fast zweimal höher in MCP-1 behandelten Tieren verglichen mit Tieren, die nur mit dem Träger behandelt wurden. In den nicht-verschlossenen linken Kontrollbeinen wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden. In den nicht-verschlossenen Kontrollbeinen gab es keinen Unterschied in der Anzahl kollateraler Arterien zwischen mit MCP-1 und mit Träger behandelten Tieren, was darauf schließen läßt, dass zusätzliche Mechanismen, welche durch Verschlüsse hervorgerufen werden, nötig sind, um kollaterales Wachstum zu fördern. MCP-1 wird daher kollaterales Wachstum oder das Wachstum anderer Gefäße in Gebieten ohne Gefäßverschlüsse nicht erhöhen.

Beispiel 6: Langzeit-Effekte der MCP-1-Behandlung nachgewiesen durch MRI-Scan

Sechs Tiere, die mit MCP-1 behandelt wurden, und sechs Kontrolltiere wurden mittels MRI- Scan nach 7 Tagen, 2 Wochen, 1, 2 und 3 Monaten nach unilateralem Verschluss der femoralen Arterien untersucht. Die anatomische Struktur wurde mit hochauflösenden T1-SE Bildern analysiert. Die MR-Angiographie wurde durchgeführt mit einer 3-D FISP-Sequenz. Die Perfusion wurde nach intravenöser Bolusgabe von GD-DTPA mit einer TFL-SR-Sequenz gemessen. Die Analyse wurde durchgeführt entsprechend den verschiedenen Muskelgruppen. Die Anzahl kollateraler Arterien in MCP-1 behandelten Tieren war höher im ganzen untersuchten Zeitrahmen. Im Gegensatz zu den Kontrolltieren war die retrograde Füllung der femoralen Arterie in MCP-1 behandelten Tieren nach 2 Wochen Verschluss wieder normalisiert.

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Claims

1. In-vitro-Verfahren zur Verstärkung des Wachstums kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien von bereits vorhandenen arteriolären Verbindungen, umfassend das Inkontaktbringen von Gewebe oder Zellen mit einem Monocyten-chemotaktischen Protein (MCP) oder einem Nucleinsäuremolekül, welches das MCP codiert.

2. In-vitro-Verfahren zur Verstärkung des Wachstums von kollateralen Arterien und/oder anderen Arterien von bereits vorhandenen arteriolären Verbindungen, umfassend das Inkontaktbringen von Gewebe oder Zellen mit MIP-1α, RANTES, J-309 oder einem anderen CC-Chemokin oder klassischen Chemoattraktoren wie N-Farnesyl-Peptide, C5a, Leukotrien-B4 oder thrombocytenaktivierender Faktor (PAF).

3. Verwendung eines Monocyten-chemotaktischen Proteins (MCP) oder eines Nucleinsäuremoleküls, welches das MCP codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Verschlusskrankheiten oder zur Behandlung von Patienten, während oder nachdem sie einem Mittel oder Strahlung oder chirurgischer Behandlung ausgesetzt waren, welche Arterien beschädigen oder zerstören.

4. Verwendung von MIP-1α, RANTES, J-309 oder irgend eines anderen CC-Chemokins oder klassischer Chemoattraktoren wie N-Farnesyl-Peptid, C5a, Leukotrien-B4 oder thrombocytenaktivierender Faktor (PAF) für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Verschlusskrankheiten oder zur Behandlung von Patienten, während oder nachdem sie einem Mittel oder Strahlung oder chirurgischer Behandlung ausgesetzt waren, welche Arterien beschädigen oder zerstören.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 3, wobei das MCP MCP-1, MCP-2, MCP-3 oder MCP-4 ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 5 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Verschlusskrankheit eine Arterienverschlusskrankheit ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Koronararterienkrankheiten, Cerebralverschlusskrankheiten, periphere Verschlusskrankheiten, viszerale Verschlusskrankheiten, renale Arterienkrankheiten und Mesenterialarterien-Insuffizienz.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 5 oder 6 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das MCP ein rekombinantes MCP ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei das Arzneimittel geeignet ist zur Verabreichung in Verbindung mit Wachstumsfaktoren wie Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei das Nucleinsäuremolekül im Arzneimittel zur Expression und Sekretion des MCP durch Zellen in vivo in einer Form geeignet für die Anlockung von Monocyten hergestellt ist.

10. Verwendung eines Mittels, welches die biologische Aktivität eines MCP wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert hemmt, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren.

11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Mittel eine Wechselwirkung des MCP und seines Rezeptors blockiert.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CCR1, CCR2, CCR4 und CCR5.

13. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Mittel, welches die Wechselwirkung des MCP und seines Rezeptors blockiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

(i) einem anti-MCP-Antikörper und einem anti-MCP-Rezeptor- Antikörper; und/oder

(ii) einer nicht stimulierenden Form eines MCP-Proteins und einer löslichen Form eines MCP-Rezeptors.

14. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Mittel eine Antisense-RNA des MCP oder seines Rezeptors ist.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Antisense-RNA hergestellt ist, um in vaskulären Zellen oder Zellen, welche bereits vorhandene arterioläre Verbindungen zu einem. Tumor umgeben, exprimiert zu werden.

16. Verwendung nach einen der Ansprüche 10 bis 15, wobei der Tumor ein vaskulärer Tumor ist.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kolonkarzinom, Sarkoma, Brustkarzinom, Kopf- Nackenkarzinom, Mesotheliom, Glioblastom, Lymphom und Meningeom.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 17, wobei das Arzneimittel zur intraarteriellen, intravenösen, intraperitonealen oder subkutanen Verabreichung mittels Katheter hergestellt ist.