Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft wasserlösliche Prodrugs, bei denen die
löslichmachenden Gruppen nichttoxische Säuren sind, die in der C2'- und
gegebenenfalls der C7-Hydroxylposition als Ester-Funktionalität an
Paclitaxel gebunden sind. Diese Prodrugs sind in einer wäßrigen Lösung
stabil, werden jedoch unter physiologischen Bedingungen leicht zum
Stammwirkstoff hydrolysiert.
Allgemeiner Stand der Technik
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Paclitaxel (1) ist ein natürliches Diterpenoid, das aus der Pazifischen
Eibe (Taxus brevifolia) abgetrennt worden ist. Paclitaxel hat sich bei
der Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenem Eierstockskrebs
oder Brustkrebs bewährt.
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Obwohl sich Paclitaxel als einzigartiges Antitumormittel erwiesen hat,
hat es einige Nachteile. Eines der wichtigsten Probleme ist die geringe
Wasserlöslichkeit, wodurch die Formulierung im Zusammenhang mit
einer intravenösen Verabreichung problematisch wird. Aufgrund dieser
geringen Löslichkeit wird Paclitaxel unter Verwendung eines
Gemischs von Cremophor EL (ein polyethoxyliertes Rizinusöl) und
Ethanol
mit 1 : 1 formuliert (Rowinsky, E. K. et al. J. Natl. Cancer Inst.
1990, 82, 1247). Dieses Gemisch wird vor einer sehr langen Infusion
mit 5% Dextrose in Wasser oder Kochsalzlösung verdünnt. Leider
wurde bei Patienten, die mit Paclitaxel behandelt worden waren, von
verschiedenen hypotonischen Reaktionen berichtet, die teilweise auf
dem Cremophor EL beruhen, das für die Freisetzung von Histamin
verantwortlich ist, wodurch diese Effekte hervorgerufen werden
(Rowinsky, E. K. et al. ebenda). Eine Vorbehandlung mit Antihistamin-
Arzneimitteln kann diese Nebenwirkungen verringern, führt jedoch zu
einer zusätzlichen Medikation, zusätzlichen Kosten und einer weiteren
Unbequemlichkeit für den Patienten.
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Die Löslichkeitsprobleme bei Paclitaxel können durch die Entwicklung
von besser wasserlöslichen, chemisch stabilen und folglich leichter zu
formulierenden analogen Verbindungen/Prodrugs von Paclitaxel gelöst
werden. Die Prodrug-Strategien bestehen aus einer zeitweiligen
Modifizierung der physiochemischen Eigenschaften einer Verbindung
durch eine chemische Derivatbildung. Diese zeitweilige chemische
Modifikation ist gewöhnlich so gestaltet, daß die Wasserlöslichkeit
und die biologische Verteilung geändert werden, wohingegen die
pharmakologischen Eigenschaften des Stammwirkstoffs intakt bleiben.
Prodrugs lassen sich so gestalten, daß sie in vivo auf vorhersehbare
Weise entweder durch einen enzymatischen Mechanismus oder durch
Hydrolyse, die unter physiologischen pH-Bedingungen eingeleitet
wird, in den aktiven Wirkstoff überführt werden.
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SAR-Untersuchungen haben gezeigt, daß einige Modifikationen in der
C7-Position von Paclitaxel zulässig sind ((a) Mellado, W. et al.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 1984, 124, 329-336. (b) Kingston, D. G. I
et al. New Trends in Nat. Prod. Chem. 1986, 26, 219-235. (c) Horwitz,
S. B. et al. Ann. New York Acad. Sci. 1986, 466, 733-740. (d)
Kingston, D. G. I. et al. J. Nat. Prod. 1990, 53, 1-12. (e) Ringel, I. et al. J.
Pharmacol. Exp. Ther. 1987, 242, 692-698. (f) Chaudhary, A. G. et al.
J. Org. Chem. 1993, 58, 3798-3799. (g) Chen, S. et al. J. Org. Chem.
1993, 58, 5028-5029).
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7-Acetylpaclitaxel hat sich z. B. bei Assays mit Mikrokanalgruppen als
genauso aktiv wie Paclitaxel gezeigt. SAR-Untersuchungen haben auch
gezeigt, daß das Einführen einer Acetylgruppe in der C2'-Position
dazu führte, daß die Fähigkeit, eine Mikrokanalgruppe zu fördern,
verlorenging. Die cytotoxische Aktivität des 2'-Acetylpaclitaxels ist
jedoch fast die gleiche wie bei Paclitaxel, was möglicherweise auf der
Tatsache beruht, daß die C2'-Acetylgruppe entweder unter den
Bedingungen des Bioassays hydrolysiert worden ist oder intrazellulär
in Paclitaxel oder einen aktiven Metaboliten von Paclitaxel überführt
worden ist. Diese Beobachtungen legen nahe, daß die C2'- und C7-
Positionen von Paclitaxel für (zeitweilige) Strukturmodifikationen
geeignet sind. C2'-Position scheint für eine reversible Derivatbildung
besser geeignet.
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Verschiedene Forschergruppen haben von Synthesen und biologischen
Auswertungen von wasserlöslichen Prodrugs von Paclitaxel berichtet.
Diese analogen Verbindungen haben entweder an der C2'- oder
C7-Hydroxylgruppe polare Substituenten. In den meisten Fällen sind diese
polaren Substituenten durch eine Ester-, Carbonat- und Carbamat-
Funktionalität an diese Hydroxylgruppen gekoppelt. Deutsch et al.
(Deutsch, H. M. et al. J. Med. Chem. 1989, 32, 788-792) haben
berichtet, daß einige Salze von 2'-Succinylpaclitaxel und
2'-Glutarylpaclitaxel im Vergleich mit den entsprechenden freien Säuren bessere
Antitumorwirkungen zeigen. Die Triethanolamin- und
N-Methylglucaminsalze zeigten eine bessere Wasserlöslichkeit und waren aktiver als die
Natriumsalze. Zhao et al. (Zhao, Z. et al. J. Nat. Prod. 1991, 54, 1607-
1611) führten Sulfonatgruppen ein, um die Wasserlöslichkeit von
Paclitaxel zu verbessern. Diese analogen Sulfonatpaclitaxel-Verbindungen
zeigten eine bessere Wasserlöslichkeit und hatten im Vergleich mit
Paclitaxel (in vivo) etwa die gleiche Aktivität. Mathew et al. (Mathew,
A. E.
et al. J. Med. Chem. 1992, 35, 145-151) berichteten von der
Synthese und der Auswertung einiger analoger 2'- und 7-Aminosäure-
Verbindungen von Paclitaxel. Die Methansulfonsäuresalze von 2'- als
auch 7-Aminosäureestern von Paclitaxel zeigten eine bessere
Wasserlöslichkeit. Die analogen 2'-Verbindungen zeigten eine Aktivität,
deren Ausmaß ähnlich dem von Paclitaxel war, wohingegen andere eine
geringere Aktivität zeigten. Vyas et al. (Vyas, D. M. et al. Bioorg.
Med. Chem. Lett. 1993, 3, 1357-1360) haben analoge 2'- und 7-
Phosphatpaclitaxel-Verbindungen synthetisiert und ausgewertet. Diese
analogen Verbindungen zeigten eine bessere Wasserlöslichkeit. Diese
Derivate waren jedoch in vitro und auch in vivo im Vergleich mit
Paclitaxel nicht toxisch. Ueda et al. (Ueda, Y. et al. Bioorg. Med.
Chem. Lett. 1993, 3, 1761-1766) haben 2'- und
7'-Phosphonoxyphenylpropionatpaclitaxel synthetisiert, die beide eine bessere
Wasserlöslichkeit zeigten. Die analoge 2'-Verbindung war inaktiv, wohingegen
die analoge 7-Verbindung in vivo die gleiche Aktivität wie Paclitaxel
hatte. Greenwald et al. ((a) Greenwald, R. B. et al. J. Org. Chem. 1995,
60, 331-336. (b) Greenwald, R. B. et al. J. Med. Chem. 1996, 39, 424-
431) haben einige 2'- und 7-Polyethylenglycolester von Paclitaxel
hergestellt. Diese analogen Verbindungen waren sehr stark wasserlöslich.
Die analogen 2'-Verbindungen hatten in vitro und in vivo die gleichen
Aktivitäten wie Paclitaxel, wohingegen die analogen 7-Verbindungen
eine geringere Aktivität zeigten. Greenwald et al. haben beansprucht,
daß durch die Auswahl des geeigneten Gewichtes der 2'-PEG-Einheit
ein Prodrug erzeugt wurde, das in einem in vivo Modell genauso
wirksam wie Paclitaxel/Cremophor EL/Ethanol ist. Nicolaou et al.
(Nicolaou, K. C. et al. Nature 1993, 364, 464-466) haben einige analoge 2'-
(2-Thioaryl)ethylcarbonat-Verbindungen von Paclitaxel sowie auch
einige analoge 2'- und 2',7-(Bis)-C(O)CH&sub2;XCH&sub2;COOH-Verbindungen
(wobei X = O, S oder SO&sub2; ist) von Paclitaxel synthetisiert, die im
Vergleich mit Paclitaxel alle besser wasserlöslich waren und in vitro
höhere cytotoxische Aktivitäten zeigten. Nicolaou et al. ((a) Nicolaou,
K. C. et al. Angew. Chemie 1994, 106, 1672-1675. (b) Paloma, L. G. et
al. Chem. Biol. 1994, 1, 107-112) haben auch analoge 2'- und
7-Methylpyridiniumacetat-Verbindungen von Paclitaxel synthetisiert. Beide
Verbindungen zeigten eine bessere Wasserlöslichkeit. Die analoge 2'-
Verbindung war bei in vivo Modellen so aktiv wie Paclitaxel,
wohingegen die analoge 7-Verbindung weit weniger cytotoxisch war.
Kingston et al. (Kingston et al. US-Patent 1995, US 5411984A) haben
einige analoge 2'- und 2',7-Bis-O-aroyl-Verbindungen hergestellt. Diese
analogen Verbindungen zeigten eine bessere Wasserlöslichkeit. Die
analogen 2'-Verbindungen zeigten in vivo die gleichen Aktivitäten wie
Paclitaxel und einige waren sogar besser.
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Die chemische Stabilität ist bei der Formulierung und der
Aufbewahrung von irgendwelchen wasserlöslichen analogen
Verbindungen/Prodrugs von Paclitaxel kritisch, da ein teilweiser Abbau des
schwer wasserlöslichen Stammwirkstoffs wahrscheinlich zur Fällung
von Paclitaxel führt. Die enzymatische Stabilität (in Ratten, Human-
Plasma oder in vivo) ist im Zusammenhang mit dem Abbau der
Prodrugs zu Paclitaxel oder einem aktiven Metaboliten von Paclitaxel von
Bedeutung.
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Bei den bisher beschriebenen wasserlöslichen Prodrugs von Paclitaxel
wurden die pharmakologischen Eigenschaften der verwendeten
löslichmachenden Funktionalitäten, die abgetrennt werden, wenn
Paclitaxel einmal freigesetzt worden ist, noch nicht untersucht. Es kann
möglich sein, daß diese löslichmachenden Einheiten oder deren
Metabolite einige unerwünschte und/oder unbekannte Nebenwirkungen
haben. Die in diesem Patent beschriebenen Prodrugs setzen nach der
Hydrolyse eine nichttoxische Säure frei.
Aufgabe der Erfindung
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Es ist folglich eine Aufgabe dieser Erfindung, wasserlösliche analoge
Verbindungen/Prodrugs von Paclitaxel für die Behandlung von Krebs
bereitzustellen, wobei eine für den Körper unschädliche,
löslichmachende Einheit verwendet wird.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Erzeugung von
wasserlöslichen analogen Verbindungen von Paclitaxel, die (in vitro
oder in vivo) die gleiche Antitumorwirkung wie Paclitaxel besitzen.
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Weiterhin ist es Aufgabe dieser Erfindung, Prodrugs von Paclitaxel
herzustellen, die in wäßrigen Lösungen stabil sind, die jedoch bei der
Hydrolyse unter physiologischen Bedingungen (in vitro und/oder in
vivo) den gleichen oder einen ähnlichen Wert der Antitumorwirkung
wie Paclitaxel zeigen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die vorstehenden und verschiedene weitere Aufgaben der Erfindung
werden durch wasserlösliche analoge Verbindungen/Prodrugs gelöst,
die die nachstehende allgemeine Formel haben:
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worin:
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R&sub1; = C(O)CH&sub2;CH(OH)COOX
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R&sub2; = H, C(O)CH&sub2;CH(OH)COOX,
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X = H, Li, Na oder irgendein anderes pharmazeutisch verträgliches
Gegeninn.
Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt den Schutz einer der Carbonsäuren zusammen mit der
α-Hydroxylgruppe von Äpfelsäure (2) als Isopropyliden-
Funktionalität, der zur Verbindung 3 führt. In dieser Figur ist
auch die Synthese von 2'-Malylpaclitaxel (5) durch Kopplung
von 3 an die C2'-Hydroxylgruppe von Paclitaxel, die zu 4
führt, und das Entfernen der schützenden Isopropylidin-
Funktionalität gezeigt. Schließlich enthält sie auch die
Umwandlung von 5 in das entsprechende Natriumsalz 6.
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Fig. 2 zeigt die Synthese von 2',7-Bis(malyl)paclitaxel (8), die
ähnlich der Synthese 5 durchgeführt wird. Die
Kopplungsreaktion von 3 mit Paclitaxel, die zu 7 führt, erfolgte bei 40ºC.
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Fig. 3 zeigt die Synthese von 7-Malylpaclitaxel (11) über 2'-
Trocpaclitaxel (9), das mit 3 gekoppelt wurde, was zu 10
führte, danach folgte das Entfernen der Schutzgruppen. Die
Verbindung (11) ist zu Vergleichszwecken aufgeführt.
Definitionen
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Wenn es nicht anhand des Zusammenhangs deutlich wird oder
gegenteilig festgehalten ist, haben die hier benutzten Begriffe die
Bedeutungen, die auf dem Fachgebiet der Chemie herkömmlich sind
und die Definitionen enthalten die in Standardtexten verwendeten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Paclitaxel wurde von Pharmachemie BV Haarlem erhalten. Die
Protonenmagnetresonanzspektren wurden mit einem Spektrometer Bruker
AC-100 oder Bruker AM-400 gemessen. Die Werte der chemischen
Verschiebung sind als δ-Werte im Verhältnis zu Tetramethylsilan als
internem Standard aufgeführt; Deuterochloroform wurde als
Lösungsmittel verwendet. Die Massespektren wurden mit einem doppelt
fokusierenden Spektrometer VG 7070E erhalten. Die Elementaranalysen
erfolgten mit einem Elementaranalysegerät Carlo Erba Instruments
CHNSO EA 1108. Die Schmelzpunkte wurden mit einem Mikroskop
Reichert Thermopan bestimmt und sind nicht korrigiert. Die
Dünnschichtchromatographie erfolgte mit vorher mit Kieselgel
beschichteten Platten 60 F-254 von Merck (Dicke 0,25 mm). Die Punkte wurden
mit UV oder einer 6,2%igen wäßrigen H&sub2;SO&sub4;-Lösung (1 l), die
Ammoniummolybdat (42 g) und Cerammoniumsulfat (3,6 g) enthielt,
gefolgt vom Carbonisieren, sichtbar gemacht. Die
Säulenchromatographie erfolgte mit Silicamaterial 60 oder Silicamaterial 60H
(Merck). Wenn nicht anders angegeben, wurden die Materialien aus
kommerziellen Quellen erhalten und ohne weitere Reinigung
verwendet. Wenn es erforderlich war, wurden die Lösungsmittel nach
Standardverfahren destilliert und getrocknet. Falls erforderlich erfolgten
alle Reaktionen unter einer Argonatmosphäre.
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Diese Synthese der Prodrugs von Paclitaxel, bei denen die 2'-OH- oder
7-OH-Gruppe mit einer Dicarbonsäure verestert ist, erfordert eine
Schutzstrategie für eine der Carbonsäuregruppen.
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Siehe Fig. 1; 1,2-O-(Propan-2,2-diyl)-äpfelsäure (3) wurde nach der
Behandlung mit Äpfelsäure (2) mit Aceton in Gegenwart von
p-Toluolsulfonsäure erhalten. Danach wurde 2'-Malylpaclitaxel (5) bei 0ºC
durch die Reaktion von Paclitaxel (1) mit 1,1 Äquivalent von 3 in
Gegenwart von Diisopropylcarbodiimid (DIPC) und
4-Dimethylaminopyridin (DMAP) synthetisiert, wodurch
2'-(1,2-O-(Propan-2,2-diyl)-malyl)-paclitaxel (4) erhalten wurde, das dann bei 45ºC mit einem
Gemisch von HOAc/THF/H&sub2;O mit 4/1/2 umgesetzt wurde, wodurch 2'-
Malylpaclitaxel (5) erhalten wurde. Diese Verbindung 5 wurde
anschließend mit einem Gemisch von H&sub2;O/Aceton mit 4/1 (V./V.) von
DOWEX 50Wx2 eluiert, das mit 1 n NaOH vorbehandelt worden war,
wodurch das Natriumsalz 6 erhalten wurde.
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Siehe Fig. 2; 1,2-O-(Propan-2,2-diyl)-äpfelsäure (3) wurde bei 40ºC in
Gegenwart von DIPC und DMAP mit Paclitaxel (1) gekoppelt,
wodurch 2',7-Bis(1,2-O-(propan-2,2-diyl)-malyl)paclitaxel (7) erhalten
wurde. Diese Verbindung 7 wurde durch die Behandlung mit einem
Gemisch aus HOAc/THF/H&sub2;O mit 4/1/2 in 2',7-Bis(malyl)paclitaxel
(8) überführt. Die Verbindung 8 kann außerdem analog dem für die
Verbindung 6 beschriebenen Verfahren in z. B. Natriumsalze überführt
werden.
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Siehe Fig. 3; die C2'-Hydroxylgruppe von Paclitaxel (1) wurde mit
2,2,2-Trichlorethylchloroformiat (Troc-C1) in Pyridin geschützt, was
zu 2'-Trocpaclitaxel (9) führte (Magri, N. F. et al. J. Org. Chem. 1986,
51, 797-802). Die Verbindung 9 wurde in Gegenwart von DIPC und
DMAP mit 1,2-O-(Propan-2,2-diyl)-äpfelsäure (3) gekoppelt, wodurch
2'-Troc-7-(1,2-O-(propan-2,2-diyl)-malyl)paclitaxel (10) erhalten
wurde. Diese Verbindung 10 wurde durch Behandlung mit einem
Gemisch aus HOAc/THF/H&sub2;O mit 4/1/2 in Gegenwart von Zinkpulver
(Zn) in 7-Malylpaclitaxel (11) überführt.
Beispiele
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Die folgenden nichtbegrenzenden Beispiele bieten spezifische Syntheseverfahren
zur Herstellung von erfindungsgemäßen Prodrugs/analogen
Verbindungen von Paclitaxel. Alle hier benutzten technischen und
wissenschaftlichen Bezeichnungen haben die gleiche Bedeutung, wie
sie für den Fachmann üblich ist. Andere Verfahren und Materialien,
die den hier beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, können bei
der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung
benutzt werden.
2'-Malylpaclitaxel (5')
a. 1,2-O-(Propan-2,2-diyl)-äpfelsäure (3')
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Zu einer Lösung von Äpfelsäure (2) (5,0 g, 37 mmol) und Aceton (22
g, 0,37 mol) in Pentan (300 ml) wurden PTS (1,0 g, 5,8 mmol) und
H&sub2;SO&sub4; (10 Tropfen) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur
Rückflußtemperatur erhitzt und dann 18 Stunden gerührt. Das
gebildete Wasser wurde azeotrop entfernt und mit Molekularsieben (4 Å)
aufgefangen, wobei ein Dean-Stark-Apparat verwendet wurde. Nach 18
Stunden wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum konzentriert. Der
Rückstand wurde durch Chromatographie (CHCl&sub3;/CH&sub3;CN = 1/1)
gereinigt, wodurch 3 erhalten wurde (3,78 g, 21,7 mmol, 59%).
Schmelzpunkt 113ºC; ¹H-NMR (100 MHz, CDCl&sub3;): δ 4,51 (1H, m,
CH-malyl), 2,68 (2H, m, CH&sub2;-malyl), 1,43 (3H, s, Acetonid), 1,38
(3H, s, Acetonid).
b. 2'-(1,2-O-(Propan-2,2-diyl)-malyl)-paclitaxel (4)
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Eine Lösung von Paclitaxel (1) (100 mg, 0,117 mmol) und
1,2-O-(Propan-2,2-diyl)-äpfelsäure (3) (22 mg, 0,13 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml)
wurde bei 0ºC gerührt. Danach wurden DIPC (36 ul, 0,24 mmol) und
DMAP (15 mg, 0,12 mmol) zugesetzt. Nachdem bei 0ºC 3 Stunden
gerührt worden war, wurde das Gemisch mit EtOAc (25 ml) verdünnt und
mit einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen. Die organische
Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im
Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
(EtOAc/Hexan = 1/1) gereinigt, wodurch 4 erhalten wurde (103 mg,
0,102 mmol, 87%).
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Schmelzpunkt 138ºC; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ 8,15 (2H, d, J =
7,2 Hz, H-Ph), 7,80 (2H, d, J = 7,4 Hz, H-Ph), 7,61 (1H, t, J = 7,2 Hz,
H-Ph), 7,45 (10H, m, H-Ph), 7,01 (1H, d, JNH-3' = 9,2 Hz, NH), 6,29
(1H, s, H10), 6,26 (1H, m, H13), 6,00 (1H, dd, J3'-NH = 9,2 Hz, J3'-2'
= 3,0 Hz, H3'), 5,69 (1H, d, J&sub2;&submin;&sub3; = 7,1 Hz, Hz), 5,52 (1H, d, J2'-3' =
3,0 Hz, Hz'), 4,97 (1H, d, J&sub5;&submin;&sub6; = 8,0, H5), 4,44 (1H, m, H7), 4,32
(1H, d, J20a-20b = 8,4 Hz, H20a), 4,21 (1H, d, J20b-20a = 8,4 Hz,
H20b), 4,12 (1H, m, CH-malyl), 3,82 (1H, d, J&sub3;&submin;&sub2; = 7,1 Hz, H3), 2,96
(2H, m, CH&sub2;-malyl), 2,51 (1H, m, H6), 2,46 (3H, s, OCOCH&sub3;), 2,36
(1H, m, H14a), 2,23 (3H, s, OCOCH&sub3;), 2,19 (1H, m, H14b), 2,03 (1H,
m, H6), 1,93 (1H, s, H18), 1,69 (3H, s, H16), 1,57 (3H, s, Acetonid),
1,51 (3H, s, Acetonid), 1,25 (3H, s, H17), 1,13 (3H, s, H19); FAB-
MS, 1010 [M + H]&spplus;, 1032 [M + Na]&spplus;.
c. 2'-Malylpaclitaxel (5)
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Die Verbindung 4 (100 mg, 0,099 mmol) wurde in einem Gemisch von
HOAc/THF/H&sub2;O (8/2/4 ml) gelöst. Das Gemisch wurde 6 Stunden bei
45ºC gerührt. Danach wurden die organischen Lösungsmittel durch
Verdampfen im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Wasser
(100 ml) verdünnt und gefriergetrocknet, wodurch 5 erhalten wurde
(91 mg, 0,093 mmol, 94%).
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Schmelzpunkt 148 bis 151ºC; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ 8,16
(2H, d, J = 7,6 Hz, H-Ph), 7,93 (2H, d, J = 7,6 Hz, H-Ph), 7,61 (1H, t,
J = 7,3 Hz, H-Ph), 7,36 (11H, m, H-Ph und NH), 6,30 (1H, s, H10),
6,28 (1H, m, H13), 6,08 (1H, dd, J3'-NH = 9,2 Hz, J3'-2' = 2,8 Hz,
H3'), 5,68 (1H, d, J&sub2;&submin;&sub3; = 7,3 Hz, Hz), 5,51 (1H, d, J2'-3' = 2,8 Hz,
H2'), 4,99 (1H, d, J&sub5;&submin;&sub6; = 8,0, H5), 4,46 (1H, m, H7), 4,33 (1H, d,
J20a-20b = 8,4 Hz, H20a), 4,27 (1H, m, CH-malyl), 4,22 (1H, d,
J20b-20a = 8,4 Hz, H20b), 3,82 (1H, d, J&sub3;&submin;&sub2; = 7,3 Hz, H3), 3,03 (2H,
m, CH&sub2;-malyl), 2,55 (1H, m, H6), 2,53 (3H,
s, OCOCH&sub3;), 2,40 (1H,
m, H14a), 2,23 (3H, s, OCOCH&sub3;), 2,13 (1H, m, H14b), 1,93 (1H, s,
H18), 1,88 (1H, m, H6), 1,69 (3H, s, H16), 1,21 (3H, s, H17), 1,14
(3H, s, H19); FAB-MS, 992 [M + Na]&spplus;.
Natriumsalz von 2'-Malylpaclitaxel (6)
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2'-Malylpaclitaxel (5) (30 mg, 0,031 mmol) wurde auf DOWEX 50Wx2
aufgebracht, das mit 1 n NaOH (wäßrig) vorbehandelt worden war. Mit
einem Gemisch aus H&sub2;O und Aceton (4/1, V./V.) als Elutionsmittel
wurde das Natriumsalz 6 (30 mg, 0,030 mmol, 98%) abgetrennt,
nachdem das Aceton im Vakuum entfernt und das Produkt
gefriergetrocknet worden war.
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Schmelzpunkt 195ºC; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): entspricht der
Struktur der Verbindung 5; FAB-MS, 992 [M + H]&spplus;, 1014 [M + Na]&spplus;.
2',7-Bis(malyl)paclitaxel (8)
a. 2',7-Bis(1,2-O-(propan-2,2-diyl)-malyl)-paclitaxel (7)
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Eine Lösung von Paclitaxel (1) (50 mg, 0,0586 mmol) und
1,2-O-(Propan-2,2-diyl)-äpfelsäure (3) (51 mg, 0,29 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml)
wurde bei 0ºC gerührt. Danach wurden DIPC (100 ul, 0,064 mmol)
und DMAP (7,5 mg, 0,061 mmol) zugesetzt. Nach 1 Stunde wurde das
Gemisch bis zur Rückflußtemperatur erhitzt und 3 Tage gerührt. Das
Gemisch wurde über Hyflo filtriert. Das Filtrat wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (30
ml) verdünnt und mit einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen.
Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4;
getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch
Chromatographie (EtOAc/Hexan = 1/1) gereinigt, wodurch 7 erhalten
wurde (49 mg, 0,0421 mmol, 72%).
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Schmelzpunkt 139ºC; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ 8,14 (2H, d, J =
7,6 Hz, H-Ph), 7,80 (2H, d, J = 7,6 Hz, H-Ph), 7,61 (1H, t, J = 7,4 Hz,
H-Ph), 7,39 (10H, m, H-Ph), 7,02 (1H, d, JNH-3' = 9,2 Hz, NH), 6,24
(1H, s, H10), 6,23 (1H, m, H13), 5,99 (1H, dd, J3'-NH = 9,2 Hz, J3'-2'
= 3,0 Hz, H3'), 5,69 (1H, d, J&sub2;&submin;&sub3; = 6,9 Hz, Hz), 5,66 (1H, m, H7),
5,55 (1H, d, J2'-3' = 3,0 Hz, H2'), 4,97 (1H, d, J&sub5;&submin;&sub6; = 9,4, H5), 4,84
(1H, m, CH-malyl), 4,64 (1H, m, CH-malyl), 4,33 (1H, d, J20a-20b =
8,4 Hz, H20a), 4,19 (1H, d, J20b-20a = 8,4 Hz, H20b), 3,94 (1H, d,
J&sub3;&submin;&sub2; = 6,9 Hz, H3), 3,10 (2H, n, CH&sub2;-malyl), 2,97 (2H, m, CH&sub2;-
malyl), 2,60 (1H, m, H6), 2,45 (3H, s, OCOCH&sub3;), 2,35 (1H, m, H14a),
2,25 (1H, m, H14b), 2,21 (3H, s, OCOCH&sub3;), 1,97 (1H, s, H18), 1,85
(1H, m, H6), 1,81 (3H, s, H16), 1,58 (6H, s, Acetonid), 1,56 (6H, s,
Acetonid), 1,21 (3H, s, H17), 11,6 (3H, s, H19); FAB-MS, 1166
[M + H]&spplus;.
b. 2',7-Bis(malyl)paclitaxel (8)
-
Die Verbindung 7 (40 mg, 0,0343 mmol) wurde in einem Gemisch von
HOAc/THF/H&sub2;O (4/1/2 ml) gelöst. Das Gemisch wurde 6 Stunden bei
45ºC gerührt. Danach wurden die organischen Lösungsmittel durch
Verdampfen im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Wasser
(50 ml) verdünnt und gefriergetrocknet, wodurch 8 erhalten wurde (33
mg, 0,0304 mmol, 89%).
-
Schmelzpunkt 166 bis 168ºC; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ 8,11
(2H, d, J = 7,6 Hz, H-Ph), 7,84 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-Ph), 7,63 (1H, t,
J = 7,5 Hz, H-Ph), 7,37 (11H, m, H-Ph und NH), 6,25 (1H, s, H10),
6,16 (1H, m, H13), 5,99 (1H, dd, J3'-NH = 8,8 Hz, J3'-2' = 2,9 Hz,
H3'), 5,67 (1H, d, J&sub2;&submin;&sub3; = 6,4 Hz, Hz), 5,66 (1H, m, H7), 5,63 (1H, d,
J2'-3' = 2,8 Hz, H2'), 4,94 (1H, d, J&sub5;&submin;&sub6; = 7,6, H5), 4,48 (2H, m,
CHmalyl), 4,32 (1H, d, J20a-20b = 7,9 Hz, H20a), 4,17 (1H, d, J20b-20a
= 7,9 Hz, H20b), 3,88 (1H, d, J&sub3;&submin;&sub2; = 6,4 Hz, H3), 2,97 (4H, m, CH&sub2;-
malyl), 2,51 (1H, m, H6), 2,44 (3H, s, OCOCH&sub3;), 2,36 (2H, m, H14),
2,07 (3H, s, OCOCH&sub3;), 1,93 (1H, s, H18), 1,86 (1H, m, H6), 1,79
(3H, s, H16), 1,20 (3H, s, H17): 1,18 (3H, s, H19); FAB-MS, 1108
[M + Na]&spplus;.
7-Malylyaclitaxel (11)
a. 2'-Trocpaclitaxel (9)
-
Eine Lösung von Paclitaxel (1) (80 mg, 0,0938 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (2
ml) und Pyridin (0,2 ml) wurde bei -23ºC gerührt. Danach wurde
2,2,2-Trichlorethylchloroformiat (13 ul, 0,095 mmol) zugesetzt.
Nachdem 1 Stunde bei -23ºC gerührt worden war, wurde das Gemisch mit
CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) verdünnt und mit 1 n HCl (wäßrig) gewaschen. Die
organische Schicht wurde mit einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung und
mit Wasser gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum
konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie (EtOAc/Hexan
= 1/1) gereinigt, wodurch 9 erhalten wurde (63 mg, 0,0612, 65%).
Schmelzpunkt 171ºC (Zersetzung); ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ
8,15 (2H, d, J = 7,4 Hz, H-Ph), 7,75 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-Ph), 7,61
(1H, t, J = 7,4 Hz, H-Ph), 7,44 (10 H, m, H-Ph), 6,93 (1H, d, JNH-3' =
9,4 Hz, NH), 6,29 (1H, s, H10), 6,25 (1H, t, J&sub1;&sub3;&submin;&sub1;&sub4; = 8,8 Hz, H13),
6,05 (1H, dd, J3'-NH = 9,3 Hz, J3'-2' = 2,8 Hz, H3'), 5,69 (1H, d, J&sub2;&submin;&sub3;
= 7,3 Hz, Hz), 5,54 (1H, d, J2'-3' = 2,7 Hz, H2'), 4,97 (1H, dd, J = 9,4
Hz, J = 1,6 Hz, H5), 4,78 (2H, d, J = 8,0 Hz, CH&sub2; (Troc)), 4,43 (1H,
m, H7), 4,32 (1H, d, J20a-20b = 8,4 Hz, H20a), 4,21 (1H, d, J20b-20a
= 8,4 Hz, H20b), 3,82 (1H, d, J&sub3;&submin;&sub2; = 7,2 Hz, H3), 2,55 (1H, m, H6),
2,48 (3H, s, OCOCH&sub3;), 2,40 (1H, m, H14a), 2,23 (3H, s, OCOCH&sub3;),
2,20 (1H, m, H14b), 1,91 (3H, s, H18), 1,88 (1H, m, H6), 1,69 (3H, s,
H16), 1,24 (3H, s, H17), 1,14 (3H, s, H19); FAB-MS, 1030 [M + H]&spplus;,
1052 [M + Na]&spplus;.
b. 2'-Troc-7-(1,2-O-(propan-2,2-diyl)-malyl)paclitaxel (10)
-
Eine Lösung von 9 (63 mg, 0,0612 mmol) und 3 (21 mg, 0,12 mmol) in
CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) wurde bei 0ºC gerührt. Danach wurden DIPC (125 ul,
0,80 mmol) und DMAP (20 mg, 0,16 mmol) zugesetzt. Nach 1 Stunde
wurde das Gemisch auf Rückflußtemperatur erhitzt und dann 3 Tage
gerührt. Das Gemisch wurde über Hyflo filtriert. Das Filtrat wurde mit
CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml) verdünnt und mit einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung
gewaschen. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über
Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand
wurde durch Chromatographie gereinigt (EtOAc/Hexan = 2/5),
wodurch 10 erhalten wurde (38 mg, 0,0320, 52%).
-
Schmelzpunkt 140 bis 145ºC; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ 8,14
(2H, d, J = 7,3 Hz, H-Ph), 7,76 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-Ph), 7,61 (1H, t,
J = 7,5 Hz, H-Ph), 7,45 (10H, m, H-Ph), 6,92 (1H, d, JNH=3' = 9,5
Hz, NH), 6,26 (1H, s, H10), 6,25 (1H, m, H13), 6,04 (1H, dd, J3'-NH
= 9,6 Hz, J3'-2' = 2,8 Hz, H3'), 5,69 (1H, d, J&sub2;&submin;&sub3; = 6,8 Hz, Hz), 5,65
(1H, m, H7), 5,54 (1H, d, J2'-3' = 2,8 Hz, H2'), 4,99 (1H, d, J&sub5;&submin;&sub6; =
8,4, H5), 4,84 (1H, m, CH-malyl), 4,78 (2H, d, J = 9,4 Hz, CH&sub2;
(Troc)), 4,33 (1H, d, J20a-20b = 8,4 Hz, H20a), 4,20 (1H, d, J20b-20a
= 8,4 Hz, H20b), 3,95 (1H, d, J&sub3;&submin;&sub2; = 6,8 Hz, H3), 3,07 (2H, m, CH&sub2;-
malyl), 2,63 (1H, m, H6), 2,47 (3H, s, OCOCH&sub3;), 2,40 (1H, m, H14a),
2,25 (1H, m, H14b), 2,16 (3H, s, OCOCH&sub3;), 1,97 (1H, s, H18), 1,87
(1H, m, H6), 1,81 (3H, s, H16), 1,60 (3H, s, Acetonid), 1,57 (3H, s,
Acetonid), 1,24 (3H, s, H17), 1,14 (3H, s, H19); FAB-MS, 1187
[M + Na]&spplus;, 1209 [M + Na]&spplus;.
c. 7-Malylpaclitaxel (11)
-
Die Verbindung 10 (28 mg, 0,0236 mmol) wurde in einem Gemisch
von HOAc/THF/H&sub2;O (4/1/2 ml) gelöst. Es wurde Zinkpulver (20 mg)
zugesetzt. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 45ºC gerührt. Danach
wurden die organischen Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Der
Rückstand wurde mit Wasser (50 ml) verdünnt und gefriergetrocknet,
wodurch 11 erhalten wurde (23 mg, 0,0237 mmol, 100%).
-
Schmelzpunkt 237 bis 240ºC; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ 8,13
(2H, d, J = 7,3 Hz, H-Ph), 7,76 (2H, d, J = 7,3 Hz, H-Ph), 7,61 (1H, t,
J = 7,4 Hz, H-Ph), 7,38 (10H, m, H-Ph), 6,93 (1H, d, JNH=3' = 9,2
Hz, NH), 6,25 (2H, m, H10 und H13), 5,75 (1H, dd, J3'-NH = 9,2 Hz,
J3'-2' = 2,8 Hz, H3'), 5,69 (1H, d, J&sub2;&submin;&sub3; = 7,1 Hz, H2), 5,66 (1H, m,
H7), 4,96 (1H, d, J&sub5;&submin;&sub6; = 8,4, H5), 4,83 (1H, d, J2'-3' = 2,8 Hz, H2'),
4,74 (1H, m, CH-malyl), 4,28 (1H, d, J20a-20b = 8,0 Hz, H20a), 4,14
(1H, d, J20b-20a = 8,0 Hz, H20b), 3,95 (1H, d, J&sub3;&submin;&sub2; = 7,1 Hz, H3),
3,06 (2H, m, CH&sub2;-malyl), 2,60 (1H, m, H6), 2,47 (3H, s, OCOCH&sub3;),
2,38 (1H, m, H14a), 2,25 (1H, m, H14b), 2,16 (3H, s, OCOCH&sub3;), 1,97
(1H, s, H18), 1,81 (3H, s, H16), 1,25 (3H, s, H17), 1,14 (3H, s, H19);
FAB-MS, 970 [M + H]&spplus;, 992 [M + Na]&spplus;.
Löslichkeit und Stabilität
Verfahren:
-
Wasserlöslichkeit: Paclitaxel oder Paclitaxel-Prodrugs (5, 6, 8, 11)
wurden in Wasser oder einem PBS-Puffer (pH = 7,4) suspendiert, bis
die Konzentration 2 mg/ml erreichte. Die Suspensionen wurden 15
Minuten beschallt und 10 Minuten zentrifugiert (13000 G) (Nicolaou,
K. C. et al. Nature 1993, 364, 464-466). Das oben genannte Fluid
wurde durch HPLC analysiert. Die Konzentration von Paclitaxel
(Prodrug) wurde mit Paclitaxel-Standards in Methanol bestimmt.
-
HPLC: Rheodyne-Einspritzventil (20 ul Ringleitung); Säule
Lichrospher 5RP 18 ((200 · 3 mm, Chrompack); UV-Detektor (Modell
759A, Applied Biosystems); Elutionsmittel: CH&sub3;CN/MeOH/H&sub2;O =
5/1/4 in 10 mM NH&sub4;OAc (pH = 5,0) (Willey, T. A. J. Chromatography
1993, 621, 231-238). Der Nachweis der Wirkstoffe (Prodrugs) erfolgte
bei 226 nm wo angenommen wird, daß die Extinktionskoeffizienten
von Paclitaxel und Paclitaxel-Prodrugs gleich sind. Die
Konzentrationen wurden bestimmt, indem die relative Fläche von Paclitaxel oder
den Paclitaxel-Prodrugs gemessen wurde.
Stabilität in Human-Plasma und PBS-Puffer
-
Die Paclitaxel-Prodrugs (5, 6, 8, 11) wurden in Wasser gelöst,
beschallt und zentrifugiert. 100 ul des oben genannten Fluids wurden so
mit 400 ul Plasma (Heparin) beziehungsweise PBS-Puffer (pH = 7,4)
gemischt, daß die Konzentration des Prodrugs etwa 0,5 ug/ml betrug.
Das Plasma bzw. der PBS-Puffer wurden bei 37ºC inkubiert und zu
unterschiedlichen Zeitpunkten (T = 0, 0,5, 1, 4, 20, 48 Stunden)
wurden 50 ul mit 150 ul EtOAc extrahiert. Nachdem 2 Minuten
gemischt worden war (mit einem Wirbel), wurde das Gemisch
zentrifugiert (2 Minuten, 13000 G), und 100 ul EtOAc wurden
verdampft (30 Minuten, im Vakuum). Die Wirkstoffe (Prodrugs) wurden
in 50 ul Elutionsmittel gelöst und durch HPLC analysiert (Longnecker,
S. M. Cancer Treat Rep. 1987, 71, 53-59). Der Wirkungsgrad bei der
Extraktion von Paclitaxel betrug etwa 80%.
-
Die Werte für die Löslichkeit und Stabilität der erfindungsgemäßen
Verbindungen sind in Tabelle I gezeigt.
Tabelle I
-
a Die Stabilität der analogen Verbindungen ist als Halbwertszeiten (T1/2)
angegeben, in der 50% der analogen Verbindung zu Paclitaxel abgebaut sind.
-
b Es wurde kein freigesetztes Paclitaxel nachgewiesen.
-
Außer bei 11 zeigten alle Prodrugs im Vergleich mit Paclitaxel eine
bessere Wasserlöslichkeit. Die beste Wasserlöslichkeit wurde beim 2'-
Malyl-Prodrug 6 festgestellt. Alle Malyl-Prodrugs 5, 6, 8 und 11
zeigten eine ausreichende Stabilität in einem PBS-Puffer für Anwendungen
als Prodrug. Das Prodrug 6 zeigte auch eine hohe Hydrolyserate in
Human-Plasma. Diese Ergebnisse zeigen, daß für die weitere
Auswertung das vielversprechendste Arzneimittel der in Tabelle I
gezeigten Arzneimittel das Malyl-Prodrug 6 ist.
Biologische Auswertung
Material und Verfahren:
-
Die Bestimmung der IC&sub5;&sub0;-Werte für die neuen synthetisierten
Prodrugs erfolgte bei einer Vielzahl von Zellinien und wurde mit dem
IC&sub5;&sub0;-Wert von Paclitaxel 1 verglichen (siehe Tabelle II).
Verbindungen 1, 5, 8, 11:
-
Es wurden folgende Human-Tumorzellinien verwendet:
-
- MCF7-Brustkrebs
-
- EVSA-T-Brustkrebs
-
- WIDR-Kolonkrebs
-
- IGROV-Eierstockskrebs
-
- M19 MEL-Melanom
-
- A498-Nierenkrebs
-
- HA266-Lungenkrebs, keine kleinen Zellen
-
MCF7 ist der Östrogen-Rezeptor ER+/Progesteron-Rezeptor PgR+ und
EVSA-T ist ER-/PgR-.
-
Die Zellinien WIDR, M19 MEL, A498 und IGROV gehören zur
gegenwärtig benutzten Antikrebs-Prüfliste des National Cancer Institute,
USA (Skeham et al., J. Nat. Cancer Inst. 85: 1107-1112, 1990).
-
Vor den Versuchen wurde bei allen Zellinien ein Myocoplasmatest
durchgeführt und mit negativ festgestellt. Alle Zellinien, außer ETSA-
T, blieben in einer kontinuierlichen logarithmischen Kultur im
Medium RPMI mit Hepes und Phenolrot, das mit 10% Rinderserum vom
Kalb (BCS), 111 IE/ml Penicillin, 111 ug/ml Streptomycin, 46 ug/ml
Gentamycin und 10,6 ug/ml Insulin ergänzt war. EVSA-T blieb wie
beschrieben in DMEM mit 5% BCS und Antibiotika erhalten. Die
Zellen wurden für den Durchlauf und für die Verwendung in den
Versuchen einer leichten Trypsinbehandlung unterzogen.
Versuch:
-
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden wie folgt in einer
Konzentration von 177147 ng/ml gelöst:
-
Paclitaxel 5% DMSO in vollständigem RPMI-Züchtungsmedium
-
5 5% DMSO in vollständigem RPMI-Züchtungsmedium
-
8 5% DMSO in vollständigem RPMI-Züchtungsmedium
-
11 5% DMSO in vollständigem RPMI-Züchtungsmedium
-
Am Tag 0 wurden 200 ul von mit Trypsin behandelten Tumorzellen (2
· 10³ Zellen/Vertiefung) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit
ebenem Boden (Costar, Nr. 3799, Badhoevedorp, Niederlande)
aufgebracht. Die Platten waren vorher 24 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;
inkubiert worden, damit die Zellen haften konnten.
-
Am Tag 2 wurden 100 ul der höchsten Wirkstoffkonzentration in die
Vertiefungen der Säule 12 gegeben und von dort durch
aufeinanderfolgende Übertragung der 100 ul dreifach für die Säule 3
verdünnt, wobei eine Mikropipette mit 8 Kanälen verwendet wurde.
Das abschließende Volumen der Säule 3 wurde mit PBS auf 200 ul
eingestellt. Die Säule 2 diente als Blindwert. Der Säule 1 wurde PBS
zugesetzt, um das störende Verdampfen zu minimieren.
-
Am Tag 7 wurde die Inkubation beendet, indem die Platten zweimal
mit PBS gewaschen wurden. Anschließend wurden die Zellen mit 10
%iger Trichloressigsäure in Wasser Milli Q (Millipore, Etten Leur,
Niederlande) fixiert und 1 Stunde bei 4ºC gehalten.
-
Nach 5 Waschvorgängen mit Leitungswasser wurden die Zellen
mindestens 15 Minuten mit 0,4% SRB gefärbt, in 1%iger Essigsäure
gelöst und anschließend mit 1%iger Essigsäure gewaschen, um die
ungebundene Farbe zu entfernen. Die Platten wurden luftgetrocknet,
und das gebundene Protein wurde mit 150 ul Tris-Base mit 10 mmol/l
gelöst. Die Absorption wurde bei 540 nm abgelesen, wobei ein
automatisches Mikroplatten-Lesegerät verwendet wurde (Titertec, Flow
Laboratories Ltd., Irvine, Schottland). Die Daten dienten der
Erstellung von Konzentrations/Reaktions-Kurven und der Bestimmung des
IC&sub5;&sub0;-Wertes.
Verbindungen 1 und 6:
-
Es wurde die Human-Tumorzellinie OVCAR-3 verwendet. OVCAR ist
ein Eierstockskarzinom.
-
Proliferationshemmende Wirkungen in vitro: Paclitaxel oder
Paclitaxel-Prodrugs wurden in DMSO gelöst, wodurch eine Konzentration
von 5 mM erhalten wurde. Die Konzentrationen wurden durch Messen
der optischen Dichte bei 226 nm bestätigt. Die
proliferationshemmenden Wirkungen der Wirkstoffe und Prodrugs wurde unter Verwendung
von OVCAR-3-Zellen bestimmt. Zellen in einem ergänzten
Gewebekulturmedium (DMEM, 10% fötales Kälberserum mit 50 IE/ml Penicillin
und 50 ug/ml Streptomycin) wurden dreifach in Kulturplatten
mit 96 Vertiefungen gepflanzt (5000/Vertiefung, 100 ul). Nach 24
Stunden wurden 100 ul Kulturmedium zugesetzt, das den Wirkstoff
oder das Prodrug enthielt, wodurch abschließende Konzentrationen im
Bereich von 1 umol bis 10 umol erhalten wurden.
-
Die Zellen wurden weitere 72 Stunden inkubiert, mit 10%iger
Trichloressigsäure fixiert und mit Sulforhodamin B gefärbt. Es wurde
die Absorption bei 540 nm abgelesen, und die
proliferationshemmenden Wirkungen wurden als IC&sub5;&sub0;-Werte angegeben, die die
Konzentrationen des Wirkstoffs (Prodrugs) darstellen, die im Vergleich mit dem
Zellwachstum der Kontrolle eine Hemmung des Wachstums von 50%
ergeben (Houba et al. Bioconj. Chem. 1996, 7, 606-611).
-
Die IC&sub5;&sub0;-Werte der erfindungsgemäßen Verbindungen sind in Tabelle
II aufgeführt.
Tabelle II
-
a IC&sub5;&sub0;: Erforderliche Wirkstoffkonzentration, um die Zellproliferation im
Verhältnis zu unbehandelten Zellen auf 50% zu unterdrücken (37ºC, 72 h).
Auswertung und Schlußfolgerungen
-
Mit Ausnahme der Verbindung 11 zeigten alle analogen Verbindungen
von Paclitaxel im Verhältnis zum Paclitaxel eine bessere
Wasserlöslichkeit.
-
Die Verbindungen 8 und 11 zeigten eine geringere cytotoxische
Aktivität im Vergleich mit Paclitaxel, was möglicherweise auf der
funktionellen Gruppe in der C7-OH-Position beruht. Die analoge Verbindung
in der 7-Position (11) und die analoge Verbindung in der 2',7-Position
(8) sind sehr stabil: im PBS-Puffer (pH = 7,4) sowie auch im Human-
Plasma wurde kein Abbau zum Stammwirkstoff beobachtet, da kein
freigesetztes Paclitaxel nachgewiesen wurde.
-
Die Verbindung 5 zeigte eine ähnliche cytotoxische Wirkung wie
Paclitaxel, die möglicherweise durch den Abbau dieser Verbindungen
unter den für die Bestimmung der Aktivität angewendeten Bedingungen
in den Stammwirkstoff erklärt werden kann. Die analoge Verbindung
in der 2'-Position 5 ist im PBS-Puffer (pH = 7,4) stabil. Nach 24
Stunden wurden nur Spuren von Paclitaxel nachgewiesen. Wohingegen im
Human-Plasma nach nur 20 Stunden 50% der analogen Verbindung zu
Paclitaxel abgebaut wurden.
-
Die Verbindung 6 zeigte gegenüber Paclitaxel eine vergleichbare
Wirkung gegen OVCAR-3-Zellen. Bei der Verbindung 6 waren
innerhalb von 4 Stunden etwa 50% zu Paclitaxel abgebaut worden.
Außerdem ist die Verbindung 6 sechzigmal besser wasserlöslich als
Paclitaxel.