DE69738452T2

DE69738452T2 - Fusionspolypeptide die eine ige-bindungsdomäne und eine hsa-komponente enthalten und deren diagnostische und therapeutische verwendung

Info

Publication number: DE69738452T2
Application number: DE69738452T
Authority: DE
Inventors: Mary Ellen Morristown DIGAN; Philip Morris Plains LAKE; Hermann Gram
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2017-07-26
Also published as: DE69738452D1; TR199900155T2; PL331356A1; PL189415B1; ID19420A; IL128094A; WO1998004718A1; KR100502879B1; PE99498A1; NO323611B1; JP2000516089A; AR008077A1; SK7799A3; PT917581E; NZ333908A; MY120425A; KR20000029563A; BR9710605A; NO990328L; RU2209211C2

Description

Gebiet
Die Erfindung betrifft Fusionspolypeptide. Sie betrifft Fusionspolypeptide, die eine IgE Bindedomäne und eine humane Serumalbuminkomponente (HSA) umfassen und Salze hiervon. Sie betrifft auch Polynukleotide, die Zwischenprodukte bei der Herstellung solcher Fusionspolypeptide sind, geeignete rekombinante Expressionsvektoren hierfür, entsprechende prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme und Verfahren zur Synthese der Fusionspolypeptide.
Hintergrund
Die Wechselwirkung zwischen Immunglobulin E (IgE) und dessen Rezeptoren hat eine etablierte Rolle bei der Abwehr gegen parasitäre Infektionen beim Menschen (M. Capron und A. Capron, Science 264 [1994] 1876–1877). In industrialisierten Ländern ist das Zusammentreffen mit Parasiten durch die verbesserten Hygienebedingungen weniger häufig als die Störung des IgE Netzwerks durch die Überproduktion von IgE in Reaktion auf Umweltallergene, was zu Allergien und anderen IgE- oder IgE-Rezeptor vermittelten Krankheitszuständen führt.
IgE ist der primäre Antikörper, der bei der Initiierung einer unmittelbaren allergischen Reaktion beteiligt ist und ist ein Hauptbeteiligter bei der Aufrechterhalten der Reaktion der späten Phase. IgE wird in B-Lymphozyten gebildet und übt seine Wirkung nach der Bindung an den Hochaffinitätsrezeptor für IgE aus, das heißt FcεRI, der auf der Oberfläche von Allergieeffektorzellen gefunden wird, wie Mastzellen, Basophilen und Eosinophilen. IgE ruft auch Induktionsfunktionen durch die Bindung an dessen Rezeptor auf Antigen-präsentierenden Zellen, wie Langerhanszellen, B-Zellen und Monozyten hervor (G.C. Mudde et al., Allergy 50 [1995] 193–199).
Eine allergische Reaktion oder ein Zustand manifestiert sich, wenn IgE Moleküle an die Oberfläche von Allergieeffektorzellen über den IgE Rezeptor FcεRI binden und durch Allergen quervernetzt werden, wobei sie ein Signal auslösen, um die Degranulation von cytoplasmatischen Granula in den Zellen zu initiieren, wobei gleichzeitig eine Freisetzung von Allergiemediatoren erfolgt, wie Histamin, Serotonin, Prostaglandinen und Cytokinen und anschließend lokalen Gewebeödemen und ein Einstrom an Entzündungszellen resultiert. Ein alternatives Mittel zur Stimulierung der Allergie und assoziierter Zustände ist die Wechselwirkung des IgE Rezeptors FcεRI mit zirkulierenden Autoantikörpern gegen FcεRI.
FcRI existiert typischerweise als Tetramer, das eine α, αβ und zwei γ Ketten (das heißt "Untereinheiten") umfasst, obwohl auf Monozyten und Langerhanszellen die β-Untereinheit fehlt.
Von der IgE Bindungsstelle von FcεRI wurde gezeigt, dass sie vollständig in der α-Untereinheit (bezeichnet als FcεRIα) enthalten ist (J. Hakimi et al., J. Biol. Chem. 265 [1990] 22079–22081, U. Blank et al., J. Biol. Chem. 266 [1991] 2639–2646). Rekombinante "Knockout" Mäuse, die genetisch bezüglich der gesamten α-Untereinheit deletiert wurden, sind unfähig, eine allergische Reaktion gegenüber einer Allergenprovokation zu erzeugen (D. Dombrowicz et al., Cell 75 [1993] 969–976).
FcεRIα ist ein stark glykosyliertes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 60 kDa, das eine hydrophobe Transmembrandomäne wie auch hydrophile, extrazelluläre ("ekto") und cytoplasmatische Domänen aufweist, die auf der äußeren Oberfläche der Zelle exponiert sind. Die IgE Bindungskapazität von FcεRIα wurde ferner auf dessen extrazelulärem Teil lokalisiert. (J. Hakimi et al. [1990], siehe obige Literaturstelle, Leder et al., USP 4 962 035 A ). Es ist möglich, ein lösliches, sekretierbares Molekül durch Abschneiden des Transmembranteils von den Sequenzen stromabwärts hiervon herzustellen (C. Ra et al., Int. Immunol. 5 [1993] 47–54) und die entstehende Verkürzung, die im wesentlichen aus der humanen, extrazellulären FcεRIa Domäne besteht, weist in vitro und in vivo eine IgE-bindende Aktivität auf (M. Haak-Frendscho et al., Immunol. 151 [1993] 351–358, Aminosäurereste 1-204 of FcεRIα fusioniert an eine verkürzte IgG1 H Ketten C Region, C. Ra et al [1993] siehe obige Literaturstelle: die Reste 1–172 des FcεRIα hierin entsprechen der Reste 26–197 der SEQ ID Nr. 1 hiervon). Die Strukturmerkmale dieses Fragments umfassen zwei potentielle Disulfidbrücken und sieben potentielle Glycosylierungsstellen (M. Haak-Frendscho et al. [1993], siehe obige Literaturstelle).
Daher können Verkürzungen von FcεRIα, die im wesentlichen aus der extrazellulären Domäne bestehen, potentiell therapeutisch an einen Säuger zur Bindung von Serum IgE verabreicht werden, um dessen Bindung an den Hochaffinitätsrezeptor auf Allergieeffektorzellen zu vermeiden und auch zur Unterdrückung der de novo IgE Biosynthese in humanen Lymphozyten (Y. Yanagihara et al., J. Clin. Invest. 94 [1994] 2162–2165).
Jedoch wird die wirksame Verwendung eines IgE-bindenden Polypeptids, wie der extrazellulären Domäne von FcεRIα zur systemischen Behandlung von IgE- oder IgE Rezeptor-vermittelten allergischen Störungen bei Säugern durch die extreme Transienz in vivo aufgrund der schnellen Clearance aus dem zirkulierenden Plasma gehindert. Wenn man in Betracht zieht, dass IgE- oder IgE Rezeptor-vermittelte Erkrankungen 10–20% der Arzt-Patientenkontakte ausmachen, würde eine wirksame Behandlung für Patienten einen signifikanten Nutzen darstellen, die an solchen Zuständen leiden und wäre ein wichtiger Fortschritt bei der klinischen Behandlung von IgE- und IgE Rezeptor-vermittelten Störungen, wie Allergie und Allergie-verwandten Zuständen.
Es wäre daher nützlich, ein IgE-bindendes Polypeptid zu erhalten, das eine verlängerte wirksame Serumhalbwertszeit und so eine verbesserte klinische Brauchbarkeit bei der Behandlung von Allergie und insbesondere der systemischen Behandlung der atopen Dermatitis, des atopen Asthmas und der chronischen Urticaria, wie auch eine verbesserte Aktivität in einer effizienten, kostengünstigen Weise aufweist.
Zusammenfassung
Es wurde nun festgestellt, dass durch die Fusion einer IgE Bindungsdomäne an eine humane Serumalbuminkomponente (HSA), die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, das entstehende Fusionspolypeptid eine verlängerte Serumhalbwertszeit relativ zur IgE Bindungsdomäne alleine ohne Verlust der IgE Bindungsaktivität aufweist, was zu IgE Bindungspolypeptiden führt, die zur Verwendung bei der systemischen Behandlung von Allergie und anderen durch IgE vermittelten Störungen indiziert sind. Systemisch verabreichtes IgE Bindepolypeptid bindet an Serum IgE wie auch an zirkulierende Autoantikörper gegen den IgE Rezeptor FcεRIα, was die Bindung an zellgebundenes FcRIot verhindert und daher eine allergische Reaktion und deren assoziierte Manifestierungen verhindert und/oder hemmt.
Es wurde ferner festgestellt, dass signifikante Verbesserungen der IgE Bindungsaktivität durch die Verwendung eines Fusionspolypeptids der Erfindung, das in den Ansprüchen definiert ist und mehr als eine IgE Bindedomäne pro Molekül umfasst, erhalten werden kann. Beispielsweise wurde von einem "Dimermolekül" der Erfindung festgestellt, dass es eine signifikant erhöhte IgE Bindeaktivität relativ zu einem "Monomer" der Erfindung aufweist.
Der Ausdruck "Dimer" bezieht sich hierin auf ein Fusionspolypeptid der Erfindung, das zwei IgE Bindedomänen besitzt.
Es wurde ferner festgestellt, dass ein Dimermolekül der Erfindung eine unerwartet bevorzugte Aktivität aufweist.
Die Erfindung richtet sich daher auf Fusionspolypeptide und Salze hiervon der SEQ ID Nr. 3 oder der Reste Val₂₆-Leu₉₇₈ der SEQ ID Nr. 3.
Die Erfindung richtet sich ferner auf Polynukleotidzwischenprodukte hierfür.
Die Erfindung richtet sich ferner auf ein Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von IgE- oder IgE Rezeptor vermittelten Störungen und insbesondere allergischen Reaktionen, wie atoper Dermatitis, atopem Asthma und chronischer Urticaria, das die Verabreichung der erfindungsgemäßen Fuisonpolypeptide oder pharmazeutisch annehmbaren Salze hiervon an ein Individuum, das einer solchen Behandlung bedarf und auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Fusionspolypeptide oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon, zusammen mit zumindest einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfassen.
Die Erfindung richtet sich ferner auf Polynukleotide, die Zwischenprodukte bei der Herstellung von Fusionspolypeptiden sind, auf Oligonukleotidzwischenprodukte, die zu deren Konstruktion verwendet werden, auf die durch solche Oligonukleotide kodierten Peptide, auf rekombinante Vektoren zur Expression der Fusionsmoleküle, auf prokaryontische oder eukaryontische (speziell Säuger) Expressionssysteme und auf Verfahren zur Herstellung der Fusionspolypeptide oder physiologisch funktionellen Äquivalente hiervon unter Verwendung solcher Expressionssysteme.
Beschreibung der SEQ ID Nr. und verwandte Definitionen

SEQ ID Nr. 1: Aminosäuresequenz der dominanten Form des nativen, humanen Volllängen FcεRIα einschließlich der Signalsequenz.

Der Ausdruck "prä-IgE" bezieht sich auf die Reste Met₁-Leu₂₀₄ der SEQ ID Nr. 1. Der Ausdruck "IgE^R" bezieht sich auf die reife Form von prä-IgE^R und besteht aus den Resten Val₂₆-Leu₂₀₄ der SEQ ID Nr. 1 (das heißt der extrazellulären Domäne von FcεRIα).

SEQ ID Nr. 2: Aminosäuresequenz der dominanten Form von nativem präpro-HSA (hierin als "präpro HSA I" bezeichnet), die die Reste Met₁-Leu₆₀₉ umfasst.

Die dominante Form des reifen nativen Proteins (hierin als "HSA I" bezeichnet) wird durch die Reste Asp₂₅-Leu₆₀₉ der SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
Der Ausdruck "präpro HSA II" bezieht sich auf eine Verkürzung der nativen Sequenz um eine Aminosäure (Leu₆₀₉) am Carboxyterminus und bezieht sich daher auf die Reste Met₁-Gly₆₀₈ der SEQ ID Nr. 2.
Die reife Form von prapro HSA II, die hierin als "HSA II" bezeichnet ist, wird durch die Reste Asp₂₅-Gly₆₀₈ der SEQ ID Nr. 2 dargestellt.

SEQ ID Nr. 3: Aminosäuresequenz, die durch das EcoRI Fragment von Plasmid R-H-R/SK Nr. 50 dargestellt wird, das in Beispiel 5 hergestellt wird und umfasst: "prä-IgE^R" Sequenz von den Resten 1–204, Linker AlaSer(Gly₄)Ser (hierin später als "11" bezeichnet) an den Resten 205–211, HSA II Sequenz an den Resten 212–795, Linker (Gly)₃Ser (hierin später als "L₂" bezeichnet) an den Resten 796–799 und die "IgE^R" Sequenz an den Resten 800–978.

Ein reifes, dimeres Fusionspolypeptid der Erfindung, das hierin als "IgE^R-L-HSA II-L₂-IgER" oder alternativ als "IgE^R-HSA-IgE^R Dimer" bezeichnet wird und von CHO Zellen auf eine in Beispiel 7 beschriebene Weise exprimiert wird, hat die Aminosäuresequenz Val₂₅-Leu₉₇₈ der SEQ ID Nr. 3.

SEQ ID Nr. 4: Nukleotidsequenz des EcoRI Fragments von Plasmid R-H-R/SK Nr. 50 von Beispiel 5, die umfasst: Eine Polynukleotidsequenz, die "prä IgE^R" an den Positionen 10–621 kodiert, ein Oligonukleotid, das für L an den Positionen 622–642 kodiert, ein Polynukleotid, das für HSA II an den Positionen 643–2394 kodiert, ein Oligonukleotid, das für L₂ an den Positionen 2395–2406 kodiert und ein Polynukleotid, das für "IgE^R" an den Positionen 2407–2943 mit 2 Stopcodons an den Positionen 2944–2949 kodiert.

Die Restriktionsstellen an den Enden der kodierenden Fragmente und in den Linkerregionen befinden sich an den Positionen 1–6, 622–627, 637–642, 2387–2393, 2401–2406 und 2950–2955. Eine Kozaksequenz befindet sic an den Nukleotidpositionen 7–9.
Punktmutationen, die sich von der Konsensus HSA Nukleotidsequenz unterscheiden, befinden sich an den Positionen 804, 1239, 1290, 1446, 1815, 2064 und 2079. Da die Punktmutationen in der Wobble Position liegen, beeinflussen sie die Aminosäuresequenz nicht.

SEQ ID Nr. 5: Nukleotidsequenz der dominanten Form des nativen präpro-HSA Entspricht der 12 und der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2.
SEQ ID Nr. 6: Nukleotidsequenz der dominanten Form des nativen, humanen Volllängen FcεRIα einschließlich der Signalsequenz, die der 13 und der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 entspricht.

Beschreibung der Figuren
In den folgenden Figuren werden die angegebenen Moleküle direktional gelesen, das heißt die linke Seite entspricht dem Amino (oder 5') Terminus und die rechte Seite entspricht dem Carboxy (oder 3') Terminus.
1A–1C: Serumhalbwertszeit in Mäusen: Die Proteinkonzentration in vivo (in Picomol an Protein pro ml Serum) über die Zeit (10–800 Minuten nach der Injektion) von

(A) Freiem HSA I Protein und
(B) IgE^R Protein (bezeichnet als "freie alpha Kette") und dimeres IgE^R-L₁-HSA II-L₂-IgE^R Fusionspolypeptid (bezeichnet als "IgE^R-HSA-IgE^R" Dimer), das aus CHO Zellen hergestellt wird, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist.
(C) Serumhalbwertszeit des freien HSA I von (A) im Vergleich mit dem dimeren Fusionspolypeptid ("IgE^R- HSA-IgE^R") von (B) durch Normalisierung auf 1 in Bezug auf Serumkonzentrationen 10 Minuten nach der Injektion.

2: Extravasation, die aus passiver, kutaner Anaphylaxiereaktion bei Mäusen resultiert, denen intravenös serielle Verdünnungen (10 μg/kg, 50 μg/kg oder 500 μg/kg) an IgE^R-L₁-HSA II-L₂- IgE^R Polypeptid ("IgE^R-HSA-IgE^R Dimer") verabreicht werden, das wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt wurde (wobei die Kontrollgruppe 0 μg/kg erhält) und die Fläche in mm² angegeben ist, in Intervallen von 5, 15 oder 30 Minuten vor der Sensibilisierung durch eine intradermale Injektion von monoklonalem Maus IgE anti-Dinitrophenyl (DNP) Antikörper und anschließende Provokation mit DNP-Rinderserumalbuminlösung, die 1% Evans Blau enthält.
3: Schematische Darstellung von 3 Fusionspolypeptiden der Erfindung (zwei Monomere und ein Dimer), wobei die Polypeptidlinker ebenfalls gezeigt sind:

I. Monomere: (1.) HSA-Signalsequenz Monomer, das HSA II (in der Figur als "HSA" bezeichnet) über L ₂("GGGS") fusioniert an IgE^R umfasst. Die für die Positionen Leu₆₀₇Gly₆₀₈ kodierenden Nukleotide von HSA II enthalten eine MstII Einzelschnittstelle, wie dies angegeben ist, und die für GlySer von L₂ kodierenden Nukleotide, die für eine BamHI Schnittstelle kodieren (kodierende Aminosäuren sind unterstrichen). (2.) IgE Bindedomäne-Signalsequenz Monomer, das IgE^R fusioniert an dessen Carboxyterminus über L₁ (das heißt "ASGGGGS") an HSA II (in der Figur als "HSA" bezeichnet) umfasst. Das für L₁ kodierende Oligonukleotid enthält jeweils eine NheI Schnittstelle und eine BamHI Schnittstelle (die kodierten Aminosäuren AlaSer und GlySer von L₁ sind unterstrichen).
II. Dimer: IgE Bindedomäne-Signalsequenz Dimer, das ein erstes IgE^R fusioniert an dessen Carboxyterminus über L₁ an den Aminoterminus von HSA II (in der Figur als "HSA" bezeichnet) umfasst, wobei der Carboxyterminus hiervon an ein zweites IgE^R über L₂ mit Restriktionsschnittstellen in dem kodierenden Polynukleotid fusioniert ist, wie dies oben für das Monomer beschrieben ist.

4: PCR Primer, um die humane Volllängen FcεRIα cDNA (bezeichnet als "IgE Rezeptor cDNA") unter Bildung von DNA zu verkürzen, die kodiert für:

(i) IgE^R [BamHI Schnittstelle an das 5' Ende des für FcεRIα kodierenden Strangs durch Oligonukleotid Nr. 18 angefügt und Stopcodon und EcoRI und SalI Schnittstellen an das 3' Ende des nicht-kodierenden Strangs durch Oligonukleotid Nr. 19 angefügt]
(ii) prä-IgE^R [Oligonukleotid Nr. 20, das SstI, EcoRI und Kozak Steilen an das 5' Ende des für FcεRIα kodierenden Strangs anfügt, Oligonukleotid Nr. 31, das NotI und NheI (und Deletion einer zweiten NheI Schnittstelle) im nicht-kodierenden Strang für FcεRIα anfügt]
(iii) prä-IgE^R [Oligonukleotide Nr. 20 und Nr. 19 werden wie oben beschrieben verwendet]:
(A.) "HSA-Signalsequenz": Subklonierung von (i) oben in den SK Vektor unter Bildung eines Klonierungsvektor TA Klons pEK1, der zur Konstruktion von HSA II-Signalsequenz Monomer verwendet wird,
(B.) "IgER-Signalsequenz": Subklonieurng von (ii) in den SK Vektor unter Bildung des Konstrukts IgER/TANr. 1, das zur Herstellung des IgE^R-Signalsequenz Monomers verwendet wird,
(C.) "IgER alleine": Subklonierung von (iii) in den SK Vektor unter Bildung von Konstrukt IgER FL/TA Nr. 34, das zur Expression von reifem IgE^R zur Verwendung als Standard verwendet wird. Zwei Sterne stehen für zwei Stopcodons.

5: PCR Primerpaare zur Verkürzung der humanen Volllängen präpro-HSA I cDNA unter Bildung von cDNA, die für folgendes kodiert:

(i) präpro-HSA II fusioniert am Carboxyterminus mit L₂ [Oligonukleotid Nr. 24, das Spel, EcoRI und Kozak Sequenz an das 5' Ende des kodierenden Strangs anfügt, Oligonukleotide Nr. 28 und Nr. 29, die einen Linker, der für MstII und HindIII Stellen kodiert, am 3' Terminus von HSA II anfügen]
(ii) L₁ fusioniert an den 5' Terminus von HSA II [Oligonukleotid Nr. 26, das NotI, NheI, Linker und BamHI Schnittstellen an den kodierenden Strang anfügt, Oligonukleotid Nr. 27, das eine NcoI Schnittstelle im nicht-kodierenden Strang enthält],
(iii) präpro-HSA I [wie oben verwendetes Oligonukleotid Nr. 24 und Oligonukleotid Nr. 25, das Stop, EcoRI und HindIII Stellen an das 3' Ende des nicht-kodierenden Strangs anfügt],
(A.) "HSA-Signalsequenz": Subklonierung von (i) in den SK Vektor unter Bildung von pEK7, das zur Konstruktion des HSA II – Signalsequenz Monomers verwendet wird,
(B.) "IgER Signalsequenz": Subklonierung von (ii) in den SK Vektor unter Bildung von HSA/SK Nr. 5, das zur Konstruktion des IgE^R-Signalsequenz Monomers verwendet wird,
(C.) "HSA alleine": Subklonierung von (iii) in den SK Vektor unter Bildung von HSA/SK Nr. 17, der reifes, natives, humanes Serumalbuminprotein (das heißt HSA I) zur Verwendung als Standard kodiert.

6: Humanes Serumalbumin (HSA) sequenzierende Oligonukleotide Nr. 1–10, 12, 16, 17, 22 und 30, die zur Sequenzierung von Materialien, die in TA kloniert werden und nach der Bindung an IgE-bindende Fragmente verwendet werden.
7: IgE Rezeptor sequenzierende Oligonukleotide Nr. 11, 13 und 23, die zur Sequenzierung von Fragmenten, die in TA kloniert wurden und nach der Bindung an die HSA Komponente verwendet werden.
8:

(A) Mutagene Oligonukleotide Nr. 14 und Nr. 15 für humanes Serumalbumin
(B) PCR und Linkeroligonukleotide Nr. 18–20, 24–29 und 31 zur Konstruktion von Fusionspolypeptiden.

9: Konstruktion von Vektor HSA-IgER/SK Nr. 49, der ein Polynukleotid umfasst, das für Präpro-HSA II (in der Figur als "HSA" bezeichnet) kodiert, das am 3' Terminus über einen Oligionukleotid kodierenden Linker L₂ (dargestellt in 9 durch "GGG") an den 5' Terminus des für IgE^R kodierenden Polynukleotids (in der Figur als "IgER" bezeichnet) durch Ligation des BamHI-SalI Fragments von pEK1 in das mit Bam-HI-SalI geschnittene pEK7 fusioniert ist.
10: Konstruktion von Vektor IgER-HSA/SK Nr. 1, der ein Polynukleotid umfasst, das für prä-IgE^R kodiert (in der Figur als "IgER" bezeichnet), das am 3' Terminus über ein Oligonukleotid für den Linker L₁ (repräsentiert durch "GGG") an den 5' Terminus des für HSA II ("HSA") kodierenden Polynukleotids durch die Ligation des SstI-NheI Fragments von IgER/TA Nr. 1 in das SstI-NheI-geschnittene HSA/SK Nr. 5 fusioniert ist.
11: Konstruktion des Vektors HSA-IgER Pstl Sal/SK Nr. 37, der ein Polynukleotid umfasst, das für HSA II kodiert (als "HSA3" angegeben), welches an den 3' Terminus über ein Oligonukleotid für L₂ (nicht gezeigt) an den 5' Terminus des für IgE^R kodierenden Polynukleotids (angegeben als "IgER") durch die Ligation des PstI-SalI Fragments von HSA-IgER/SK Nr. 49 in den SK Vektor fusioniert ist. Ebenfalls gezeigt wird die Konstruktion eines Vektors R-H-R/SK Nr. 50, der ein Polynukleotid umfasst, das für prä-IgE^R kodiert (als "IgER" bezeichnet) und am 3' Terminus über ein Oligo für L₁ (nicht gezeigt) an den 5' Terminus des für HSA II ("HSA") kodierenden Polynukleotids fusioniert ist, das wiederum über das Oligonukleotid für L₂ (nicht gezeigt) an das für IgE^R ("IgER") kodierende Polynukleotid fusioniert ist. Der Vektor wird durch die Ligation des PstI-KpnI Fragments von HSA-IgER Pst-Sal/SK Nr. 37 in das mit PstI-KpnI geschnittene IgER-HSA/SK Nr. 1 hergestellt.
12: Nukleotidsequenz von humanem Serumalbumin und Aminosäuresequenz, die der SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 5 entsprechen.
13: Nukleotidsequenz von IgE^R und Aminosäuresequenz, die der SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 6 entsprechen.
14: Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des EcoRI Fragments von R-H-R/SK Nr. 50, die den SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 entsprechen, welche das dimere R1-HSA-R1 Fusionsprotein kodieren. Die HSA Sequenz wird kursiv dargestellt. Die Linkersequenzen sind im unteren Kasten dargestellt. Punktmu tationen, die sich von der HSA Konsensusnukleinsäuresequenz unterschieden, sind in fett im unteren Kasten gezeigt. Da die Punktmutationen in der Wobble-Position sind, beeinflussen sie nicht die Aminosäuresequenz. Restriktionsstellen an den Enden der Fragmente und der Linkerregion sind unterstrichen.
15: SDS-PAGE von gereinigtem, reifem Fusionspolypeptid von Beispiel 7:
Auf das Gel aufgetragene Gesamtmengen: 8 μg (Spur 1), 6 μg (Spur 2), 4 μg (Spur 3) und 2 μg (Spur 4), Molekulargewichtstandards: 97,4, 66,2, 45, 31, 21,5 und 14,4 kDa (Spur 5).
Detaillierte Beschreibung
Die Erfindung betrifft Fusionspolypeptide und Salze hiervon der SEQ ID Nr. 3 oder der Reste Val₂₆-Leu₉₇₈ der SEQ ID Nr. 3.
Die cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz von humanem FcεRRIα sind bekannt (J. Kochen et al., Nucleic Acids Research 16 [1988], 3584 und Leder et al., US 4 962 035 A ). Humaner FcεRRIα kodiert für ein NH₂-terminales Signaipeptid [Aminosäurereste (einschließlich des ersten Met) Met₁-Ala₂₅], zwei Immunglobulin-ähnliche extrazelluläre Domänen (Reste Val₂₆-Leu₂₀₄), eine hydrophobe Transmembranregion (Gln₂₀₅-Ile₂₂₄) und einen hydrophilen, cytoplasmatischen Schwanz (Reste Ser₂₂₅-Asn₂₅₇) (in Bezug auf die SEQ ID Nr. 1). Das Signalpeptid wird während der intrazellulären Prozessierung abgespalten. Die Volllängenaminosäuresequenz der dominanten Form des nativen humanen FcεRRIα ist hierin als SEQ ID Nr. 1 enthalten.
"IgE^R" bezieht sich hierin auf die Aminosäuresequenz Val₂₆-Leu204 der SEQ ID Nr. 1 (kodiert für die extrazelluläre Domäne), und der Ausdruck "prä-IgE^R" bezieht sich auf die Reste Met₁-Leu₂₀₄ der SEQ ID Nr. 1 (kodiert für die Signalsequenz stromaufwärts der extrazellulären Domäne).
Der andere Hauptbestandteil der rekombinanten Fusionen der Erfindung, das humane Serumalbumin (HSA), stellt das häufigste Plasmaprotein dar, was auf Gewichtsbasis 60% des Gesamtproteingehalts des Plasmas beiträgt. Ein Molekül des humanen Serumalbumins besteht aus einer einzelnen, nicht-gglykosylierten Polypeptidkette mit 585 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 66,5 kDa. Ein Merkmal, das für Albumin spezifisch ist, ist das komplexe Disulfidbindungsmuster (F.F. Clerc et al., J. Chromatogr. 662 [1994] 245–259). Humanes Serumalbumin ist im Körper weit verbreitet, insbesondere im Darm und den Blutgefäßen, wo es vor allem als häufigstes Protein des Serums bei der Aufrechterhaltung der Osmolarität und des Plasmavolumens beteiligt ist. Ferner wird es langsam durch die Leber entfernt und zeigt eine in vivo Halbwertszeit von 14–20 Tagen beim Menschen (T.A. Waldman, "Albumin Structure, Function and Uses", Pergamon Press [1977], 255–275). Humanem Serumalbumin fehlt die enzymatische oder immunologische Funktion. Es ist ein natürlicher Träger, der beim endogenen Transport und der Abgabe von verschiedenen natürlichen wie auch therapeutischen Molekülen beteiligt ist (H. Lu et al., FERS Lett. 356 [1994] 56–59, WO 93 15 199 A , EP 0 648 499 A , P. Yeh et al., PNAS USA, 89 [1992] 1904-1908 , EP 0 413 622 A ).
Humane Zellen synthetisieren Serumalbumin anfänglich in Form eines Präpropolypeptids. Eine Signalsequenz aus 18 Aminosäuren (einschließlich des ersten Met) wird entfernt, wenn das Protein durch das Lumen des endoplasmatischen Reticulums passiert, was immer noch 6 Aminosäuren am N-Terminus lässt (in der vorwiegenden Form: Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg), die dann während oder unmittelbar nach dem Transport durch den Sekretionsapparat einer proteolytischen Abspaltung unterzogen werden.
Von humanem Serumalbumin ist gut bekannt, dass es polymorph ist (D.C. Carter und J.X. Ho, Adv. Prot. Chem. 45 [1994] 153–203). Beispielsweise weist Albumin Naskapi ein Lys₃₇₂ anstelle eines Glu372 auf und Proalbumin Christchurch weist eine veränderte Prosequenz auf, das heißt Glu₂₄ anstelle von Arg₂₄ (Latta et al. US 5 100 784 A ).
Die vollständige Aminosäuresequenz der dominanten Form des natürlich vorkommenden Proteins, das hierin als "präpro-HSA 1" bezeichnet wird, ist bekannt (A. Dugaiczyk et al., PNAS USA 79 [1982] 71–75) (SEQ ID Nr. 2). Die dominante Form des reifen Proteins ("HSA I") wird durch Asp₂₅-Leu₆₀₉ der SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
Speziell bevorzugt ist das Fusionspolypeptid von Beispiel 7, speziell ohne Signalsequenz, das heißt das Polypeptid Val₂₆-Leu₉₇₈ der SEQ ID Nr. 3.
Jeder Peptidlinker (dargestellt als "L" in den Formeln I–V hierin) erlaubt vorzugsweise eine unabhängige Faltung und Aktivität der IgE Bindungsdomäne, ist frei von einer Neigung zur Entwicklung einer geordneten Sekundarstruktur, die mit der IgE Bindedomäne Wechselwirken kann oder eine immunologische Reaktion beim Patienten verursacht und minimale hydrophobe oder Ladungscharakteristiken aufweist, die mit der IgE Bindedomäne Wechselwirken könnten.
Die Linker der vorliegenden Erfindung umfassen: GlyGlyGlySer ("L₁" hierin) und AlaSerGlyGlyGlyGlySer ("L₂" hierin).
Die Erfindung umfasst auch Polynukleotide, die Zwischenprodukte bei der Herstellung der rekominanten Fusionspolypeptide der Erfindung sind.
Als weiterer Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung eines wie oben definierten rekombinanten Fusionspolypeptids oder eines Salzes hiervon bereitgestellt, das umfasst:

(a) Transformation einer Wirtszelle mit einem Vektor, der DNA umfasst, welche für ein wie oben definiertes Polypeptid kodiert,
(b) Expression des Fusionspolypeptids in der Zelle unter Bildung eines Fusionspolypeptids, wie dies oben definiert ist, und
(c) Gewinnung des entstehenden Polypeptids aus der Wirtszelle, vorzugsweise als sekretiertes Produkt, optional in Form eines Salzes hiervon.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert Vektoren, vorzugsweise Plasmide zur Verwendung bei der Expression der Fusionspolypeptide. Diese Vektoren umfassen DNA, die für die oben definierten Polynukleotide kodiert. Im allgemeinen sind geeignete Vektoren, die Mikroorganismen transformieren können, zur Expression der Fusionspolypeptide geeignet, einschließlich Expressionsvektoren, die Nukleotidsequenzen umfassen, die für die Fusionspolypeptide kodieren, die mit Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen verbunden sind, wie Promotoren, welche zusammen eine Expressionskassette darstellen. Die Promotoren können von Genen des bestimmten verwendeten Wirts abstammen oder es können solche Kontrollregionen modifiziert werden, beispielsweise durch ortsspezifische in vitro Mutagenese, durch Einführung zusätzlicher Kontrollelemente oder synthetischer Sequenzen. Die spezifisch in der vorliegenden Erfindung verwendete Expressionskassette umfasst so auch eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion, die im beabsichtigten Wirt funktionsfähig ist und die am 3' Ende der Sequenz positioniert ist, welche für das Hybridmakromolekül kodiert. Zusätzlich zur Expressionskassette umfasst der Vektor einen oder mehrere Marker, die die Selektion der transformierten Wirtszelle ermöglichen. Solche Marker umfassen Marker, die eine Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen, wie G418. Die Resistenzgene werden unter die Kontrolle der geeigneten Transkriptions- und Translationssignale gestellt, die die Expression in einem gegebenen Wirt erlauben.
Genauer gesagt kann die Herstellung der rekombinanten Fusionspolypeptide der Erfindung beispielsweise folgendermaßen bewirkt werden:
A. Konstruktion von Fusionsproteinexpressionsvektoren
Der erste Schritt bei der Konstruktion von rekombinanten Fusionspolypeptiden ist, die Teile der Fusionspolypeptide in Klonierungsvektoren zu subklonieren. In diesem Zusammenhang ist ein "Klonierungsvektor" ein DNA Molekül, wie ein Plasmid, Cosmid oder Bakteriophage, das autonom in einer prokaryontischen Wirtszelle replizieren kann. Klonierungsvektoren enthalten typischerweise eine oder eine kleine Anzahl an Restriktionsendonukleaseerkennungsstellen, an denen fremde DNA Sequenzen in einer vorbestimmten Weise ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vektors eingebaut werden können, wie auch ein Markergen, das zur Verwendung bei der Identifizierung und Selektion von Zellen geeignet ist, die mit dem Klonierungsvektor transformiert sind. Markergene umfassen typischerweise Gene, die eine Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz bereitstellen. Geeignete Klonierungsvektoren sind in J. Sambrook et al. (Herausgeber) Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laborstory Press [1989]) beschrieben und können beispielsweise aus verschiedenen Quellen erhalten werden.
Der FcεRRIα cDNA Klon pGEM-3-110B-1 ist in A. Shimizu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 [1988] 1907–1911 beschrieben und kann von der American Type Culture Collection erhalten werden (ATCC Hinterlegungsnummer 67566). Einzelsträngige humane Leber cDNA kann von Clontech (PCR-ready Quick Clone cDNA, Katalognummer D Nr. 7113-1) erhalten werden. Die Sequenz von HSA ist von GenBank unter den folgenden Hinterlegungsnummern erhältlich: VOO495, JOOO78, LOO132, LOO133. Die HSA cDNA kann durch PCR Amplifikation mittels der Oligonukleotide Nr. 24 und 25 erhalten werden, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist.
Ein Polynukleotid, das für eine geeignete IgE Bindungsdomäne oder HSA Komponenten DNA kodiert, kann unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt werden. Die PCR verwendet eine einzelsträngige cDNA Matrize und ein Gemisch der Oligonukleotidprimer. Das PCR Verfahren wird über eine gut bekannte Methodik ausgeführt (siehe beispielsweise C.R.M. Bangham, "The Polymerase Chain Reaction: Getting Started" in Protocols in Human Molecular Genetics, Human Press [1991], Ch.I. Seite 1–8). Die PCR Kits und das Material zur Verwendung in den Kits sind auch im Handel aus verschiedenen Quellen erhältlich. Kits und Verfahren zu deren Verwendung sind ferner in USP 5 487 993 A beschrieben).
DNA Sequenzen, die für Signalpeptide kodieren, können durch PCR angefügt werden oder erforderlichenfalls mittels synthetischer Oligonukleotide, die für bekannte Signalpeptidsequenzen kodieren. DNA Sequenzen, die für ein heterologes Signalpeptid kodieren, werden im Leserahmen mit DNA Sequenzen subkloniert, die für den N-Terminus des Fusionspolypeptids kodieren.
Die Fusion der Polynukleotide können durch die Subklonierung in Zwischenvektoren erreicht werden. Alternativ dazu kann ein Gen direkt in einen Vektor kloniert werden, der das andere Gen enthält. Linker und Adaptoren können zur Verbindung der DNA Sequenzen verwendet werden.
Die Subklonierung kann gemäß herkömmlicher Techniken ausgeführt werden, wie durch die Verwendung eines Restriktionsenzymverdaus unter Bildung geeigneter Enden, der Verwendung von alkalischer Phosphatasebehandlung zur Vermeidung der unerwünschten Verbindung von DNA Molekülen und der Ligation mit geeigneten Ligasen. Techniken für eine solche Manipulation werden in der Literatur beschrieben und sind in der Technik bekannt.
B. Expressionsklonierung von Fusionspoiypeptiden
Das klonierte Fusionsprotein wird dann aus dem Klonierungsvektor herausgeschnitten und in einen Expressionsvektor eingebaut. Geeignete Expressionsvektoren enthalten typischerweise

(1) Prokaryontische DNA Elemente, die für einen bakteriellen Replikationsursprung und einen Antibiotikumresistenzmarker kodieren, um für das Wachstum und die Selektion des Expressionsvektors in einem bakteriellen Wirt zu sorgen,
(2) Eukaryontische DNA Elemente, die die Initiation der Transkription kontrollieren, wie ein Promotor, und
(3) DNA Elemente, die die Prozessierung von Transkripten kontrollieren, wie eine Transkriptionsterminations-/Polyadenylierungssequenz.

Daher betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung Vektoren, vorzugsweise Plasmidvektoren, zur Verwendung bei der Expression der Fusionspolypeptide der Erfindung, die die hierin beschriebenen Polynukleotidsequenzen enthalten, welche für die erfindungsgemäßen Fusionspolypeptide kodieren. Geeignete Expressionsvektoren, die prokaryontische oder eukaryontische Zellen transformieren können, umfassen Expressionsvektoren, die Nukleotidsequenzen umfassen, welche für die Fusionsmoleküle kodieren, die an transkriptionelle und translationale Regulationssequenzen gebunden sind, die gemäß den verwendeten Wirtszellen selektiert werden. Zur Expression in E. coli können Vektoren, die von M.W. Robertson, J. Biol. Chem. 268 [1993] 12736–12743 beschrieben sind, verwendet werden. Das Produkt dürfte Disulfid-gebunden, aber nicht glykosyliert sein. Zur Expression in Hefen kann ein Expressionsvektor, wie PHIL-D2 mit dem Pichia pastoris Expressionskit (Katalognummer K1710-01) von Invitrogen (San Diego, CA, USA) verwendet werden. Das Produkt dürfte Disulfid-gebunden und glykosyliert sein. Weitere geeignete Hefeexpressionsyssteme umfassen Saccharomyces cerevisiae und Kluveromyces lactis. Zur Expression in Baculovirus sind Vektoren, wie pAC360, pVL1392 und pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) zur Infektion von Insektenzellen brauchbar, die ein glykosyliertes und Disulfidgebundenes Produkt sekretieren dürften.
Das Fusionspolypeptid der Erfindung ist normaleweise ein Glykoprotein, insbesondere wenn es in Säugerzellen exprimiert wird und die Erfindung umfasst Fusionspolypeptide in jedem Glykosylierungs- oder Disulfidbrückenzustand. Insbesondere legt die Mutationsanalyse nahe, dass eine N-gebundene Glykosylierung an der ersten, zweiten und siebten Position der N-gebundenen Glykosylierungsstellen der IgE Rezeptor α Kette (A. Shimizu et al., PNAS USA 85 [1988] 1907–1911, 2) (entspricht den Aminosäureresten 46, 67 und 191 der SEQ ID Nr. 1) die biologische Aktivität des IgE^R Moleküls und von Monomeren und Dimeren fördert, die sie enthalten. Das am meisten bevorzugte Expressionssystem ist ei nes, worin alle angefügten Zucker am ähnlichsten zu denen im nativen Molekül sind, von dem das Polypeptid stammt. Von Hefe- und Insektenzellen ist bekannt, dass sie Glykoproteine unterschiedlich zu Säugerzellen modifizieren, während E. coli keine Zuckermoleküle nach der Sekretion anfügt. Daher ist, während die Expression aus einem dieser Expressionssysteme ein Proteinprodukt ergeben kann, das für diagnostische Anwendungen geeignet ist (beispielsweise die Detektion eines allergischen Zustands) die am meisten bevorzugte Form zur Expression dieses Produkts zur Verwendung als therapeutisches Molekül die Expression in Säugerzellen oder möglicherweise die Expression in die Milch transgener Tiere.
Zur Expression in einem Säugerwirt können die Transkriptions- und Translationsregulationssignale, die in einer Expressionskassette verwendet werden, von viralen Quellen stammen, wie Adenovirus, Rinderpapillomavirus oder Simianvirus, worin die regulatorischen Signale mit einem bestimmten Gen assoziiert sind, das ein hohes Maß an Expression aufweist. Geeignete Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen können auch von Sängergenen erhalten werden, wie Aktin-, Kollagen-, Myosin- und Metallothioningenen. Transkriptionsregulationssequenzen umfassen eine Promotorregion, die ausreicht, um die Initiation von RNA Synthese in einer Sängerzelle zu steuern. Beispiele für typische Säugerzellen sind ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO), SV 40 transformierte Affennierenzellen (COS), HeLa, BHK, NIH Swiss Mausembryozellen, Ratten-, Affen- oder Menschenfibroblasten oder Rattenhepatomzellen.
Zur Expression in Säugerzellen ist das bevorzugte Verfahren die Sekretion aus CHO Zellen. Weder CHO noch humane Zellen fügen die α-1,3-gebundenen Galaktosereste an, die für die Expression in Mauszellen typisch sind, wie C127 und SP2/0 Zellen. Antikörper gegen diese Zuckerbindung kommen im Humanserum vor [C.F. Goochee et al., BioTechnol. 9 [1991] 1347–1355] und können die Halbwertszeit, Zugänglichkeit und Clearance der rekombinanten Produkte beeinflussen, die aus diesen Mauszellen exprimiert werden. CHO, dhfr- Zellen sind bezüglich der Dihydrofolatreduktase (DHFR) mutiert und daher unfähig, Purine, Thymidin und Glycin de novo zu synthetisieren. Die Kopiezahl der chromosomal integrierten Plasmide, die Wildtypkopien des DHFR Gens tragen, können durch Exposition der Zellen, die mit den Plasmiden transformiert sind, gegenüber Methotrexat, einem Folatanalogon, das um die Folatbindung am aktiven Zentrum des Enzyms konkurriert, erhöht oder amplifiziert werden. Ein geeigneter Vektor zur Expression in CHO dhfr- Zellen ist pNT2 (R.J. Kaufman et al., EMBO J. 6 [1987] 187–193)]. Der pMT2 Vektor weist eine Wildtypkopie des DHFR Gens auf, das als einzelne mRNA mit dem Fremdgen transkribiert wird. Daher werden bei der Behandlung der transformierten CHO dhfr- Zellen mit steigenden Konzentrationen an Methotrexat sowohl das Fremdgen als auch das DHFR Gen co-amplifiziert. Das aus diesen Zellen sekretierte Produkt dürfte Disulfid-gebunden und mit einem Säugermuster glykosyliert sein.
Es kann ein Expressionsvektor in Wirtszellen mittels einer Vielzahl an Techniken eingeführt werden, einschließlich Calciumphosphattransfektion, Liposomen-vermittelter Transfektion, Elektroporation und dergleichen. Vorzugsweise werden die transfizierten Zellen, worin der Expressionsvektor stabil im Wirtszellgenom integriert ist, unter Bildung stabiler Transformanden selektiert und vermehrt. Die Zellen können beispielsweise in DMEM Medium kultiviert werden. Das Polypeptid, das in die Medien sekretiert wird, kann durch biochemische Standardansätze nach einer transienten Expression 24 bis 72 Stunden nach der Transfektion der Zellen oder nach Etablierung der stabilen Zelllinien nach einer Selektion durch beispielsweise Antibiotikumresistenz gewonnen werden.
Herkömmliche Verfahren zur Gewinnung eines exprimierten Polypeptids aus einer Kultur umfassen Fraktionierung des Polypeptid-enthaltenden Teils der Kultur unter Verwendung gut bekannter biochemischer Techniken. Beispielsweise können die Verfahren der Gelfiltration, Gelchromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese, Ionenaustausch- oder Affinitätschromatographie, wie sie für Proteinfraktionierungen bekannt sind, zur Isolierung der exprimierten Proteine verwendet werden, die in der Kultur gefunden werden. Zusätzlich können herkömmliche immunchemische Verfahren, wie Immunaffinität oder Immunabsorption ausgeführt werden. Techniken zur Transformation, Kultur, Amplifizierung, Screening und Produktherstellung und -reinigung sind auch gut bekannt (siehe beispielsweise J. Sambrook et al., [1989], siehe obige Literatursstelle, R.J. Kaufman, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, Band 9 [1987] 156–198).
Die Fusionspolypeptide der Erfindung sind zur therapeutischen Verwendung zur Behandlung von Säuger und insbesondere Humanpatienten indiziert, die an Allergien leiden. Die IgE Bindedomäne der Fusionspolypeptide konkurriert mit dem IgE Rezeptor, der natürlicherweise auf Mastzellen, Basophilen und Langerhans Zellen vorkommt um IgE, so dass IgE an das verabreichte Protein gebunden wird und nicht zur Bindung an diese Allergieeffektorzellen zur Vermittlung der allergischen Reaktion fähig sind. Die IgE Bindedomäne konkurriert auch mit dem IgE Rezeptor FcεRI durch die Bindung an Autoantikörper gegen FcεRI.
Daher liefert die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur kompetitiven Bindung von IgE (und/oder Autoantikörpern gegen FcεRI) und/oder Hemmung der Bildung von IgE und so zur suppressiven und/oder präventiven Behandlung von IgE oder IgE Rezeptor vermittelten Störungen und spezifischer Allergie und Zuständen, die mit Allergie assoziiert sind, wie atope Dermatitis, atopes Asthma und chronische Urticaria.
Mit "IgE oder IgE Rezeptor vermittelte Störungen" sind Störungen gemeint, die mit der Bindung des zellgebundenen IgE Rezeptor FcεRI an IgE oder von Autoantikörpern an FcεRI assoziiert sind, beispielsweise allergische Reaktionen ("Hyper-IgE Syndrom"), wie Bronchialasthma, atopes Asthma, Heuschnupfen, Pollenallergie, allergische Rhinitis, atope Dermatitis, Ekzem, Anaphylaxie, wie auch chronische Urticaria und auch nicht allergische Kimura Erkrankung und andere pulmonale, dermatologische oder autoimmune Erkrankungen.
Insbesondere ist atope Dermatitis, eine der dramatischsten Manifestierungen der Atopie, eine chronische Hautentzündungserkrankung, die mit hohen Serum IgE Spiegeln und einer Sensibilisierung gegenüber verschiedenen Umweltallergenen assoziiert ist (M.A. Morren et al., J. Am. Acad. Dermatol. 31 [1994] 467–473). Die derzeitige Behandlung der atopen Dermatitis konzentriert sich auf die Verwendung von Steroid-enthaltenden Cremes und schwere Fälle der atopen Dermatitis wurden erfolgreich mit Cyclosporin A behandelt (H. Granlund et al., Br. J. Dermatol. 132 [1995] 106–112), aber die Nebenwirkungen beschränken diese Therapie auf eine Minderheit der Patienten. Ein Mittel, das die Funktionen von IgE hemmt, wie Mastzelldegranulation und IgE vermittelte Antigenpräsentation durch B Zellen und andere Antigen-präsentierende Zellen wäre jeder derzeit bekannten Behandlung der atopen Dermatitis überlegen und zusätzlich auch für andere mildere Allergieformen brauchbar.
Zusätzlich zu atoper Dermatitis und atopem Asthma können die Polypeptide der Erfindung zur Behandlung oder Prävention chronischer Urticaria (CU) verwendet werden, worin die Mastzelldegranulie rung über die Aktivierung des FcεRIα eine Rolle spielt. Die Fusionspolypeptide der Erfindung können zirkulierende Autoantikörper gegen FcεRIα im Gegensatz zu monoklonalen anti-IgE Antikörpern klären, die alternativ dazu zur Behandlung der Erkrankung vorgeschlagen wurden.
Die Polypeptide können in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, die ein Polypeptid der Erfindung, vorzugsweise ein unmodifiziertes Polypeptid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Der Ausdruck "Salz" bezieht sich insbesondere auf pharmazeutisch annehmbare Salze, die aus pharmazeutisch annehmbaren, nicht toxischen Säuren unter Bildung von Säureadditionssalzen beispielsweise einer Aminogruppe der Polypeptidkette oder aus pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Basen unter Bildung von basischen Salzen beispielsweise einer Carboxylgruppe der Polypeptidkette hergestellt werden. Solche Salze können als innere Salze und/oder als Salze des Amino- oder Carbonsäureterminus des erfindungsgemäßen Polypeptids gebildet werden.
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze sind jene der pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen organischen Säuren, polymeren Säuren oder anorganischen Säuren. Beispiele für geeignete organische Säuren umfassen Essig-, Ascorbin-, Benzoe-, Benzolsulfon-, Citronen-, Ethansulfon-, Fumar-, Glucon-, Glutamin-, Bromwasserstoff-, Chlorwasserstoff-, Isothion-, Milch-, Malein-, Äpfel-, Mandel-, Methansulfon-, Mucin-, Salpeter-, Oxal-, Pamoin-, Pantothen-, Phosphor-, Salicyl-, Bernstein-, Schwefel-, Wein- und p-Toluolsulfonsäure wie auch polymere Säuren, wie Tanninsäure oder Carboxymethylcellulose. Geeignete anorganische Säuren umfassen Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor- und Salpetersäure.
Beispiele für geeignete anorganische Basen zur Bildung von Salzen einer Carboxylgruppe umfassen die Alkalimetallsalze, wie Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze, die Erdalkalimetallsalze, wie Calcium-, Barium- und Magnesiumsalze und Ammonium-, Kupfer-, Eisen-(II)-, Eisen-(III)-, Zink-, Mangan-(II)-, Aluminium- und Mangan-(III)-salze. Bevorzugt sind die Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Kalium- und Natriumsalze. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare organische Basen, die zur Bildung von Salzen einer Carboxylgruppe geeignet sind, umfassen organische Amine, wie Trimethylamin, Triethylamin, Tri(n-propyl)amin, Dicyclohexylamin, β-Dimethylaminoethanol, Trishydroxymethylaminomethan, Triethanolamin, β-Diethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Histidin, N-Ethylpiperidin, Hydrabamin, Cholin, Betain, Ethylendiamin, Glucosamin, Methylglucamin, Theobromin, Purine, Piperazine, Piperidine, Koffein und Procain.
Säureadditionsalze der Polypeptide können auf herkömmliche Weise durch Zusammenbringen des Polypeptids mit einem oder mehreren Äquivalenten der gewünschten anorganischen oder organischen Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, hergestellt werden. Salze der Carboxylgruppen des Peptids können herkömmlich durch Zusammenbringen des Peptids mit einem oder mehreren Äquivalenten einer gewünschten Base, wie einer Metallhydroxidbase hergestellt werden, beispielsweise Natriumhydroxid, einer Metallcarbonat- oder -bicarbonatbase, wie Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat oder einer Aminbase, wie Triethylamin oder Triethanolamin.
Die Erfindung betrifft daher auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein neues wie oben definiertes Fusionspolypeptid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfassen. Der Träger ist vorzugsweise eine sterile, pyrogenfreie, parenteral annehmbare Flüssigkeit. Wasser, physiologische Kochsalzlösung, wässrige Dextrose und Glycole sind bevorzugte flüssige Träger oder Verdünnungsmittel, insbesondere (wenn sie isotonisch sind) für injizierbare Lösungen. Die Zusammensetzungen können ein herkömmlich hergestelltes Lyophilisat sein.
Die Zusammensetzungen können systemisch, das heißt parenteral (beispielsweise intramuskulär, intravenös, subkutan oder intradermal) oder durch intraperitoneale Verabreichung verabreicht werden. Für eine parenterale Verabreichung ist es bevorzugt, dass die Fusionspolypeptide im wesentlichen im Serum oder Plasma des Patienten löslich sind, beispielsweise dass mindestens 1 Milligramm Polypeptid in 1 Milliliter Serum oder Plasma löslich ist.
Die Zusammensetzungen können auch durch bekannte Techniken zur topischen Verabreichung verabreicht werden. Beispiele für geeignete Dosierungsformen umfassen Sprays, ophthalmologische Lösungen, nasale Lösungen und Salben. Beispielsweise kann ein Spray durch Lösen des Peptids in einem geeigneten Lösemittel und dessen Abfüllung in ein Spray als Aerosol für eine allgemein verwendete Inhalationstherapie dienen. Eine ophthalmologische oder nasale Lösung kann durch Lösen des Wirkstoffs in destilliertem Wasser, Zugabe eines erforderlichen Hilfsstoffs, wie Puffer, Isotonizitätsmittel, Verdicker, Konservierungsstoff, Stabilisator, Tensid oder Antiseptikum hergestellt werden, wobei das Gemisch auf pH 4 bis 9 eingestellt wird. Salben können beispielsweise durch die Herstellung einer Zusammensetzung aus einer Polymerlösung, wie wässriges 2% Carboxyvinylpolymer und einer Base, wie 2% Natriumhydroxid, Mischen unter Bildung eines Gels und Mischen einer Menge des gereinigten Fusionspolypeptids mit dem Gel hergestellt werden.
Die Zusammensetzung wird vorzugsweise subkutan oder intravenös verabreicht und am typischsten subkutan.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Behandlung von allergischen Zuständen, die die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Fusionspolypeptids der Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon an einen Patienten umfasst, der einer solchen Behandlung bedarf. Das Behandlungsverfahren wird während des Verlaufs eines allergischen Zustands (das heißt wenn das Nachlassen der Symptome speziell erforderlich ist) oder als kontinuierliche oder prophylaktische Behandlung ausgeführt (das heißt vor dem Einsetzen einer antizipierten durch IgE oder den IgE Rezeptor vermittelten Störung, wie einer allergischen Reaktion).
Die wirksame Dosis hierfür kann über einen großen Bereich variieren, wenn man beispielsweise das Ausmaß oder die Schwere des zu behandelnden Zustands, das Alter, das Geschlecht und den Zustand des Patienten, die Länge der Behandlung und die Stärke des einzelnen Fusionsproteins in Betracht zieht, Faktoren, die durch herkömmliche Verfahren bestimmt werden können.
Da einzelne Individuen breit in ihrem IgE Gehalt variieren (wie auch im Antikörper gegen FcεRT) kann eine therapeutisch wirksame Dosis hierfür am besten zwischen 5 × 10² und 1 × 10⁴ fach der Gesamtmenge an Serum IgE und Antikörper gegen FcεRI auf molekularer Ebene beschrieben werden. Der Patient kann auf einer täglichen Basis in einzelner oder mehrfacher Verabreichung behandelt werden. Die Zusammensetzung kann auch auf einer Monatsbasis (oder in wöchentlichen Intervallen, wie dies geeignet ist) entweder in einzelnen oder mehrfachen Verabreichungen verabreicht werden.
Für ein durchschnittliches Individuum (70 kg) kann eine geeignete monatliche Dosis von einer geringeren Dosis von etwa 0,5 mg pro Monat bis zu einer oberen Dosis von 500 mg pro Monat, vorzugsweise von etwa 1 mg bis etwa 300 mg, bevorzugter von etwa 20 mg bis etwa 250 mg pro Monat des erfindungsgemäßen Fusionsproteins reichen, wie dem Dimer von Beispiel 7, das bequem in verteilten Dosen einmal oder zweimal pro Monat verabreicht wird. Höhere Dosierungen, beispielsweise von 500 mg pro Monat bis 2 g pro Monat, können bei Patienten mit hohem Serum IgE Konzentrationen oder bei frühen Behandlungsphasen indiziert sein.
Die Dosis und die Zeit der Verabreichung können variieren. Anfängliche Verabreichungen der Zusammensetzungen können in höheren Dosierungen innerhalb der obigen Bereiche liegen und häufiger verabreicht werden als spätere Verabreichungen bei der Behandlung der Krankheit. Geeignete Dosierungen können durch Messung des Gehalts an IgE und der Antikörper gegen FcεRI im Serum des Patienten bestimmt werden, wie dies oben angegeben ist. Beispielsweise kann in der frühen Phase der Krankheit das Fusionspolypeptid der Erfindung, wie das Dimer von Beispiel 7, in wöchentlichen Dosen von 200 bis 500 mg des Polypeptids im durchschnittlichen Patienten (70 kg) verabreicht werden. Nach der Clearance von Serum IgE und Antikörper gegen FcεRI kann der Behandlungsplan auf wöchentliche Behandlungen oder Behandlungen jede zweite Woche mit Dosierungen reduziert werden, die von 50 μg bis 100 mg Polypeptid pro Behandlung reichen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können entweder alleine oder in Kombination mit anderen Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder weiterer pharmazeutischer Mittel verabreicht werden, wie Antihistaminika oder Corticosteroiden.
Die Erfindung umfasst die Verwendung der Fusionspolypeptide der Erfindung in einem diagnostischen in vitro Test jedes Standardformats, beispielsweise ELISA, um die Menge an IgE oder Autoantikörpern gegen FcεRI (beispielsweise bei Patienten mit chronischer Urticaria) in einer biologischen Probe zu bestimmen, die von einem Humanpatienten erhalten wurde, beispielsweise Blut oder Gewebeprobe. Die HSA Komponente erleichtert vorteilhafterweise die Bindung und Detektion von IgE oder Autoantikörpern gegen FcεRI in einem Test im ELISA Format. Die Menge an IgE oder Autoantikörper, die in der Probe vorhanden ist, kann als Maß der allergischen Reaktion des Patienten auf eine Substanz dienen, gegenüber der der Patient exponiert wurde. IgE oder Antoantikörper können ebenfalls bestimmt werden, um die Effizienz von Antiallergietherapien zu bestimmen und um einen allergischen Status des Patienten über die Zeit zu verfolgen.
Die Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Ausführung der Gentherapie beim Menschen unter Verwendung eines Polynukleotids, das für ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid kodiert, zur Behandlung von IgE oder IgE Rezeptor vermittelten Störungen. Das Gentherapieverfahren umfasst die Modifikation von Zellen eines Patienten durch die Einführung eines Polynukleotids hierin, das für ein Fusionspolypeptid der Erfindung kodiert, und Expression des Polypeptids durch diese Zellen. Beispielsweise können somatische Zellen zuerst aus einem Patienten entfernt werden, dann genetisch in Kultur durch die Insertion des Polynukleotids modifiziert werden und die entstehenden modifizierten Zellen werden dann wieder in den Patienten eingeführt, wobei ein Polypeptid der Erfindung durch die Zellen des Patienten exprimiert wird.
Alternativ dazu können die Zellen in vivo durch direkte Insertion von Vektor DNA modifiziert werden, die für das Polypeptid kodiert.
Geeignete Zellen zur Modifikation umfassen Endothelzellen oder Leukozyten. Für Gentherapieanwendungen steht das Polynukleotid der Erfindung vorzugsweise unter der Kontrolle eines regulierbaren (beispielsweise induzierbaren) Promotors. Die Expression des Polypeptids kann hierdurch von der Exposition des Patienten gegenüber einem exogenen Faktor mittels bekannter, regulierbarer Promotorsysteme abhängig gemacht werden.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der Verfahren der Gentherapie zur Herstellung von nicht-humanen, somatischen rekombinanten oder nicht-humanen transgenen Tierzellen, die die erfindungsgemäßen Fusionspolypeptide beispielsweise in Milch exprimieren. Solche modifizierten nicht humanen Tiere bilden auch einen Teil der Erfindung. Beispiele für brauchbare nicht-humane Tiere umfassen Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schweine, Schafe, Ziegen und Rinder, die alle mittels Standardtechniken transgen gemacht wurden (beispielsweise D.R. Hurwitz et al., Transgenic Research 3 [1994] 365 bis 375). Die nicht-humanen Tiere können zu Modellierungszwecken oder tatsächlicher Produktion eines Proteins verwendet werden. Insbesondere betrifft die Erfindung eine transgene Maus, Ziege, Kuh oder ein Schwein, die ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid exprimieren. Verfahren zur Herstellung solcher nicht-humaner Tiere sind gut bekannt. Ein Polynukleotid, das für das Fusionsprotein der Erfindung kodiert, kann in die somatischen Zellen der nicht-transgenen Tiere in vitro oder in vivo unter Bildung somatischer, rekombinanter, nicht-humaner Tiere eingeführt werden, die genetisch modifiziert sind, die aber nicht die genetische Modifikation an Nachkommen weitergeben können. Alternativ dazu kann das Polynukleotid in Zellen nicht-humaner Embryos zur Produktion von nicht-humanen transgenen Tieren inseriert werden, die zur Weitergabe der Fähigkeit zur Expression des Protein der Erfindung an die Nachkommen fähig sind.
Die Transfektion von nicht-humanen Zellen zur Gentherapie kann auf herkömmliche Weise erreicht werden, beispielsweise durch Elektroporation, Calciumphosphatfällung, ein auf Lipofectin basierendes Verfahren, intramuskuläre Injektion und Mikroinjektion oder durch die Verwendung eines "Gengewehrs". Plasmidbasierte Vektoren enthalten vorzugsweise einen Marker, wie das Neomycingen, zur Selektion von stabilen Transfektanden mit dem cytotoxischen Aminoglykosid G418 in eukaryontischen Zellen.
Die Infektion wird durch die Einarbeitung der genetischen Sequenz für das Fusionspolypeptid in einen Retrovirusvektor erreicht. Es sind verschiedene Verfahren in der Technik für eine solche Einarbeitung bekannt. Ein solches Verfahren, das vielfach verwendet wird, benutzt einen defekten Mausretrovirus zur Verpackung des Retrovirus und eine amphotrophe Verpackungszelllinie zur Herstellung eines infektiösen, amphotrophen Virus zur Verwendung bei der Infektion der nicht-humanen Zieldonorzellen.
Eine weitere Charakterisierung kann wie folgt erreicht werden:
In vitro Bestimmung der Serumhalbwertszeit
Allgemeines Verfahren:
Weiblichen SKH1/hr/hr Charles River Mäusen, die etwa 25 g wiegen, werden intravenös Testproteine injiziert, die in sterilem, Ca² ⁺, Mg²⁺ freiem PBS verdünnt sind. Die Mäuse werden folgendermaßen in 2 Gruppen eingeteilt:

– Gruppe (i), die 130 μg (1 nmol) an Fusionspolypeptid erhält, beispielsweise das Dimer IgE^R-L₁-HSA II
– L₂-IgE^R, das wie in Beispiel 7 hergestellt wird, oder
– Gruppe (ii), die 60 μg IgE^R (2 nmol) erhält, oder
– Gruppe (iii), die 65 μg HSA I (1 nmol) erhält.

Es werden 100 μl Blut von jeder Maus nach 10 Minuten, 30 Minuten, 3 Stunden, 6 Stunden und 12 Stunden nach der Injektion entnommen. Das Serum wird durch Zentrifugation hergestellt. Die Serumkonzentrationsspiegel der verschiedenen Proteine werden wie folgt bestimmt durch a) IgE Rezeptor ELISA Bindungstest: b) Inhibitions-ELISA oder c) HSA Sandwich ELISA:
a) IgE^R ELISA Bindungstest:
Die IgE Serumkonzentration wird durch die Detektion des IgE bestimmt, das an den folgenden Sandwich ELISA bindet: 200 ng humanes IgE werden in COSTAR Strip Platten mit 8 Vertiefungen (Cambrigde, MA, USA) in 100 μl Beschichtungspuffer in einer feuchten Kammer bei 4°C über Nacht immobilisiert. Jede Vertiefung wird zweimal mit 300 μl Ca² ⁺, Mg²⁺ freiem PBS mit pH 7,2 gewaschen. Die Platten werden für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 200 μl an Ca² ⁺, Mg²⁺ freiem PBS, der 5% BSA (Sigma) enthält, blockiert. Nach dem zweimaligen Waschen mit 300 μl Ca² ⁺, Mg²⁺ freiem PBS, der 0,05% Tween 20 enthält (PEST), werden die Proben, die in 100 μl in 1:10 verdünntem (Ca² ⁺, Mg²⁺ freiem PBS) Mausserum verdünnt sind, zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Vertiefungen werden zweimal mit 300 μl an PBS gewaschen und mit 100 μl (1 ng) eines monoklonalen, anti-human IgE Rezeptorantikörpers, wie 5H5/F8 für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden erneut zweimal mit 300 μl PBST gewaschen und mit 100 μl an Ziege-anti-Maus IgG-HRP (Biorad, 1:2000 verdünnt in Ca² ⁺, Mg²⁺ freiem PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden dreimal mit 300 μl PBST gewaschen und die Meerrettichperoxidasekonjugate (HRP) werden mit 100 μl ABTS Substrat (Biorad) detektiert. Die Reaktion wird nach 5 Minuten mit 100 μl an 3% Oxalsäure gestoppt. Die Farbintensitäten werden mit einem Easy Reader Photometer bei 405 nm gemessen.
b) Inhibitions-ELISA:
100 ng an FcεRlα werden in Nunc Immunplatten mit 96 Vertiefungen (F96 cert. Maxisorb) in 100 μl Beschichtungspuffer (0,1 M NaHCO₃, 0,01% NaN₃ pH 9,6) in einer befeuchteten Kammer bei 4°C über Nacht immobilisiert. Jede Vertiefung wird viermal mit 300 μl PBS, 0,05% Tween 20 (Waschpuffer) gewaschen. Zwei unterschiedliche Sätze an Vertiefungen, entweder eine Negativkontrolle (50 ml Mausserum verdünnt in 1:25 in PBS, 0,05% Twen 20, 2% FCS), eine Verdünnungsreihe des Fusionspolypeptidstandards, beispielsweise IgE^R-L₁-HSA II-L₂-IgE^R Standard (Verdünnungen von 400 ng/ml bis 1,6 ng/ml) oder die Verdünnungsreihe der Proben werden zugegeben. Der Standard und die Proben werden in Mausserum verdünnt, das 1:25 in PBS, 0,05% Tween 20,2% FCS verdünnt wurde. Unmittelbar danach werden 50 μl an 400 ng/μl an humanem IgE-Biotinkonjugat in Verdünnungspuffer zugegeben und gemischt. Die schließliche Mausserumsverdünnung im Inkubationsgemisch beträgt 1:50.
Nach der Inkubation für 2 Stunden bei 37°C werden die Platten viermal mit 300 μl Waschpuffer gewaschen und 50 μl Streptavidin-alkalisches Phosphatasekonjugat (Gibco), das 1:1000 in Verdünnungspuffer verdünnt ist, wird zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten werden viermal mit 300 μl Waschpuffer gewaschen und nach der Zugabe von 100 μl Substrat (1 mg/ml p-Nitrophenyiphosphat in Diethanolaminpuffer, pH 9,8 [BIORAD]) wird die Reaktion nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 37°C mit 50 μl an 2 M NaOH gestoppt. Die optischen Dichten werden mit einem Biomek 1000 Workstation Photometer bei 405 nm gemessen. Die quantitative Evaluierung aus den Standardkurven (logistische Kurvenanpassung mit 4 Parametern) wird mit dem Beckman Immunofit ELISA Evaluierungsprogramm ausgeführt. Berechnung: % Bindung = [OD (Probe oder Standardwert)/OD (Pufferwert)] × 100
c) HSA Sandwich ELISA:
500 ng monoklonaler anti-Maus HSA (HSA-9) werden in Nunc Immunoplatten mit 96 Vertiefungen (F96 cert. Maxisorb) in 100 μl Beschichtungspuffer (0,1 M NaHCO₃, 0,01% NaN₃, pH 9,6) in einer feuchten Kammer über Nacht bei 4°C inkubiert. Jede Vertiefung wird viermal mit 300 μl Waschpuffer (PBS, 0,05% Tween 20) gewaschen. 100 μl an 1:100 verdünntem Mausserum (PBS, 0,05% Tween 20, 2% FCS = Verdünnungspuffer) als Negativkontrolle oder 100 μl Standard (1 μg/ml bis 2 ng/ml humanes Serumalbumin, KABI) oder 100 μl Probe, die in 1:100 verdünntem Mausserum verdünnt ist, werden zugegeben. Nach der Inkubation für 2 Stunden bei 37°C werden die Platten viermal mit 300 μl Waschpuffer gewaschen und 100 μl an 1 ng/μl Kaninchen-anti-HSA Biotinkonjugat, das in Verdünnungspuffer verdünnt ist, werden zugegeben. Das anti-HSA Biotinkonjugat wird durch Immunaffinitätschromatographie mit CH-Seph4B-HSA gereinigt und die Kreuzreaktivitäten mit dem Mausserum werden durch Immunsorbtion mit Mausserumagarose entfernt. Nach der Inkubation für 2 Stunden bei 37°C werden die Platten viermal mit 300 μl Waschpuffer und 50 μl Streptavidin-alkalische Phosphatase Konjugat (Gibco) 1:1000 verdünnt und Verdünnungspuffer wird zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten werden viermal mit 300 μl Waschpuffer gewaschen und nach der Zugabe von 100 μl Substrat (1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in Diethanolaminpuffer, pH 9,8, BIO-RAD) wird die Reaktion nach der Inkubation für 15 Minuten bei 37°C mit 50 μl an 2 M NaOH gestoppt. Die optischen Dichten werden mit einem Biomek 1000 Workstation Photometer bei 405 nm gemessen. Die quantitative Evaluierung aus der Standardkurve (logistische Kurvenanpassung mit 4 Parametern) wird mit dem Beckman Immunofit ELISA Evaluierungsprogramm ausgeführt.
Ergebnisse:
Die Konzentrationen für das dimere Fusionspolypeptid, IgE^R-L₁-HSA II-L₂-IgE^R, das freie IgE^R (bezeichnet als "freie alpha Kette") oder HSA I (bezeichnet als "HSA") werden als Funktion der vergangenen Zeit nach der Injektion in pmol/ml Serum in 1(A) und (B) angegeben.
Die 1(b) zeigt, dass der freie Rezeptor im Mausserum nur für etwa 10 Minuten detektierbar ist, während das dimere Fusionsprotein immer noch 12 Stunden nach der Verabreichung detektierbar ist.
Die 1(C) zeigt die relativen Clearancekinetiken für HSA und das dimere Fusionspolypeptid. Nach der Stabilisierung der Gewebe-Blut-Verteilung in den ersten 10 Minuten zeigen das Dimer und HSA eine fast identische Clearancekurve. Dies bestätigt, dass die Serumhalbwertszeit einer IgE Bindungsdomäne durch die Fusion an HSA wesentlich verlängert werden kann.
Hemmung der passiven, kutanen Anaphylaxie (PCA) bei Mäusen
Allgemeines Verfahren:
(a) Verabreichung des Polypeptids:
Es werden serielle Verdünnungen mit 10, 50 der 500 μg/kg Fusionspolypeptid, beispielsweise IgE^R-L₁-HSA II-L₂-IgE^R, das aus CHO Zellen in Beispiel 7 erhalten wurde, intravenös in weibliche SKH1/hr/hr Charles River Mäuse, die etwa 25 g wiegen, in verschiedenen Intervallen vor der Sensibilisierung injiziert.
Es werden 3 Gruppen an Mäusen in Abhängigkeit der Menge an Polypeptid etabliert, die vor der Sensibilisierung injiziert wird (das heißt 10 μg/kg, 50 μg/kg oder 500 μg/kg). Eine vierte Gruppe an Kontrollmäusen erhält intravenös 200 μg/kg PBS anstelle des Polypeptids. Die 4 Gruppen an Mäusen werden in drei Untergruppen eingeteilt, die sie durch das Intervall zwischen intravenöser Injektion der Verbindung und der intrakutanen Sensibilisierung mit IgE [Schritt (b) unten] unterscheidet. Die getesteten Intervalle sind: 5 Minuten, 15 Minuten und 30 Minuten.
(b) Intrakutane Sensibilisierung:
Die Mäuse werden betäubt und in die Rückenhaut durch 4 intradermale Injektionen mit jeweils 5 ng monoklonalem Maus-anti-Dinitrophenyl (DNP) IgE Antikörper in 10 μl PBS (BioMakor, Rehovot, Israel) sensibilisiert. In der Kontrollgruppe wird Kochsalzlösung intradermal in eine Stelle injiziert.
(c) Allergenprovokation:
90 Minuten nach der Sensibilisierung werden die Mäuse erneut betäubt und mit einer intravenösen Injektion einer Lösung provoziert, die 50 μg an Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin (DNP-BSA) (Calbiochem-Behring, San Diego, USA) enthält, worin 1% Evansblau enthalten ist. Die PCA Reaktion wird durch Messung des Durchmessers der aufgrund der Extravasation gefärbten Teststelle quantifiziert.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in der Säulengraphik in 2 für das reife Fusionspolypeptid von Beispiel 7 gezeigt (Aminosäuren Val₂₆-Leu₉₇₈ der SEQ ID Nr. 3). Bei einer Konzentration von 500 μg/kg blockiert das dimere Fusionspolypeptid vollständig PCA zu allen Zeitpunkten der Anwendung. Bei 50 μg/kg ergibt eine Behandlung 30 Minuten vor der Provokation eine statistisch signifikante Reduktion von 36%. 15 Minuten vor der Provokation wird ein Trend bei der Verabreichung von sowohl 10 als auch 50 μg/kg Dimer beobachtet. Daher ist das dimere Fusionspolypeptid bei der Prävention der PCA wirksam.
Die Verfahren und Techniken zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind in der Technik bekannt. Wenn ihre Herstellung hierin nicht beschrieben ist, sind die verwendeten Verbindungen, Reagenzien, Vektoren, Zelllinien etc. bekannt und leicht erhältlich oder können auf herkömmliche Weise aus bekannten und leicht verfügbaren Materialien erhalten werden oder es können äquivalente Materialien auf herkömmliche Weise aus bekannten und leicht verfügbaren Materialien hergestellt werden.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele erläutern die Erfindung. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
Materialien und Methoden
PCR Amplifizierung:
Die chemische de novo Synthese der Primer der Erfindung kann mittels jedes geeigneten Verfahrens ausgeführt werden, wie beispielsweise des Phosphotriester- oder Phosphodiesterverfahrens.
Verfahren und Systeme zur Amplifizierung einer spezifischen Nukleinsäuresequenz sind in US 4 683 195 A und US 4 683 202 A und in Polymerase Chain Reaction, H.A. Ehrlich et al., Herausgeber, Cold Spring Harbor Laborstory Press [1989] beschrieben.
Nach der PCR werden die DNA Fragmente ausgeschnitten und mittels des QiaEx Protokolls (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA, USA) gereinigt und dann in einen TA Vektor [TA Cloning^® Kit (Invitrogen) (Produktliteratur, Version 2.2)] subkloniert. Die Primer, die bei der Erzeugung der durch PCR amplifizierten Nukleinsäuren verwendet werden, sind in 8 gezeigt. Die DNA wird mittels des Sequenaseverfahrens (USB, Cleveland, OH, USA sequenziert).
Plasmide und Reagenzien:
Der FcεRIα cDNA Klon pGEM-3-110B-1 (A. Shimizu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 [1988] 1907–1911) wird von der American Type Tissue Collection (ATCC Hinterlegungsnummer 67566) erhalten. Einzelsträngige, humane Leber cDNA wird von Clontech (PCR-Ready Quick Clone cDNA, Katalognummer D 7113-1) erhalten. Die Sequenz von HSA ist unter der GenBank Hinterlegungsnummer VOO495, JOOO78, LOO132 und LOO133 erhältlich. Die Restriktionsenzyme werden von Boehringer Mannheim oder Gibco/BRL erhalten. Die Taq DNA Polymerase wird von Perkin Elmer Cetus (PECI) oder von Boehringer Mannheim erhalten. Der SK Vektor wird von Stratagene erhalten.
pHIL-D2 wird von Invitrogen (San Diego, CA, USA, Katalognummer K1710-01 [1994]) erhalten (siehe "Pichia Expression Kit – Protein Expression – A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris – Version 3.0" [Dezember 1994]) (hierin als "Invitrogen Handbuch" beschrieben).
Der pXMT3 Vektor wird von pMT2 (Sambrook et al (Herausgeber) [1989] siehe obige Literaturstelle) durch Klonierung des PstI nach EcoRI Linkers von pUC8 (Pharmacia) in die PstI und EcoRI Schnittstellen von pMT2 (R.J. Kaufman et al [1987] siehe obige Literaturstelle) abgeleitet.
Die Standardtechniken, wie sie unten verwendet werden, sind in Sambrook et al. (Herausgeber) [1989], siehe obige Literaturstelle beschrieben.
Beispiel A: TA Klonierungsvektor
Das Plasmid pCR2 wird getrennt mit jedem der PCR Amplifikationsprodukte ligiert, die in den Beispielen 1 und 2 erhalten werden. Die Ligationsreaktionen werden mittels T4 DNA Ligase im folgenden Reaktionsgemisch ausgeführt:
25 mM Tris-HCl (pH 7,8)
1 mM MgCl₂
1 mM DTT
1 mM ATP
50 ng Vektor DNA
100 bis 200 ng PCR Reaktionsprodukte (ungereinigt)
4 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs)
Jedes Reaktionsgemisch wird bei 15°C für 18 Stunden inkubiert, bevor es in kompetente Zellen transformiert wird.
Beispiel 1: PCR Amplifikation und Klonierung der FcεRIα cDNA
FcεRIα cDNA wird aus pGEM-3-110B-1 mittels des Qiagenverfahrens gereinigt. Anschließend:

(A) Zur Herstellung eines HSA-Signalsequenzkonstrukts wird die PCR Amplifizierung von FcεRIα cDNA mit den Oligonukleotiden Nr. 18 und Nr. 19 (4, 8) mittels des folgenden Reaktionsgemisches ausgeführt: 1 μl (50 ng) der FcεRIα cDNA, 50 pmol jedes der Oligonukleotide Nr. 18 und Nr. 19 5 μl 10fach PCR Puffer (PECI) 0,5 μl an 20 mM dNTP Stammlösung = 200 μM dNTP Endkonzentration 0,5 μl (2,5 E) Taq DNA Polymerase (PECI) Wasser auf 50 μl.

Das Reaktionsgemisch wird mit Mineralöl überschichtet, um eine Verdampfung zu vermeiden und in einem Perkin Elmer Cetus DNA Thermocycler Modell 480 Thermocyclen unterzogen. Die Zyklusbedingungen für diese Reaktion sind: Aufheizen auf 95°C für 5 Minuten, dann 30 Zyklen mit 94°C für 1,5 Minuten, 53°C für 2 Minuten, 72°C für 3 Minuten, gefolgt von einer dreiminütigen Verlängerung bei 72°C und einer über Nacht Inkubation bei 4°C.
Nach der Elektrophorese wird ein amplifiziertes Produkt mit ~550 bp durch Ethidiumbromidfärbung bestätigt. Das Fragment wird in den PCR2 Vektor unter Bildung von pEK1 kloniert, der für IgE^R kodiert (4, 8B).

(B) Zur Herstellung eines IgE-Signalsequenzkonstrukts wird die PCR Amplifizierung der FcεRIα cDNA gemäß dem obigen Verfahren (A) ausgeführt, außer dass die Oligonukleotide Nr. 20 und Nr. 31 (8B) verwendet werden. Nach einer Elektrophorese auf einem 0,7% Agarosegel wird ein amplifiziertes Produkt mit ~600 bp durch Ethidiumbromidfärbung bestätigt. Das Fragment wird in den PCR2 Vektor unter Bildung von IgER/TA Nr. 1 subkloniert, das prä-IgE^R kodiert (4).
(C) Zur Herstellung eines Konstrukts, das für prä-IgE^R kodiert, um das reife, verkürzte Protein zur Verwendung als Kontrolle in Tests zu exprimieren wird eine PCR Amplifizierung der FcεRIα cDNA wie oben in (A) mit den Oligonukleotiden Nr. 20 und Nr. 19 (8B) ausgeführt. Nach der Elektrophorese wird ein amplifiziertes Produkt mit 620 bp durch Ethidiumbromidfärbung bestätigt. Das PCR Fragment wird ausgeschnitten und in den PCR II Vektor unter Bildung von IgERFL/TA Nr. 34 subkloniert, das für prä-IgE^R kodiert, was von einem Stopcodon gefolgt wird.

Beispiel 2: PCR Amplifizierung und Klonierung der humanen Serumalbumin cDNA
Um eine Sequenz zu erhalten, die für präpro-HSA II kodiert, wird eine PCR Amplifizierung einer humane Volllängenserumalbumin cDNA mit den Oligonukleotiden Nr. 24 und Nr. 25 (8B) gemäß dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 1(A) ausgeführt. Der entstehende Klon HSA/TA Nr. 1 hat die Sequenz, die am ähnlichsten zur Sequenz in der Genbank ist. In diesem Klon werden 7 Mutationen in der Wobble Position und eine Mutation detektiert, die zu einer Veränderung von Lysin zu Glutaminsäure an der Base 1333 führt. Die 7 Mutationen in der Wobble Position sind: Base 309: A zu T, Base 744: A zu G, Base 795: G zu A, Base 951: G zu A, Base: 1320: C zu T, Base 1569: A zu C, Base 1584: G zu A (in Bezug auf HSA/TA Nr. 1). Die Lysin zu Glutaminsäure Mutation wird mittels ortsspezifischer Mutagenese zurück zur Sequenz in der Genbank mit den in 8A gezeigten Oligonukleotiden und dem Bio-Rad Mutagene Phagemid in vitro Mutagenesekit (Biorad, Katalog Nr. 170–3581) korrigiert. Dieses Verfahren beruht auf dem Einbau von Uracilresten in den Ausgangsstrang und ihre anschließende Entfernung im mutagenisierten Strang (T.A. Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 [1985] 488–492). Da die Punktmutationen in der Wobble Position die native Aminosäuresequenz des kodierten Proteins nicht ändern, werden die obigen sieben Mutationen nicht korrigiert. Nach der Elektrophorese wird ein amplifiziertes Produkt mit ~1,8 kb durch eine Ethidiumbromidfärbung bestätigt.
Das 1,8 kb Produkt wird in den pCR2 Vektor unter Bildung von HSA/TA Mut Nr. 16 subkloniert, von dem durch DNA Sequenzierung bestätigt wird, das es die vollständige präpro-HSA II Sequenz enthält. HSA/TA mut Nr. 16 wird in Bluescript SK als Spel – HindIII Fragment unter Bildung von HSA/SK Nr. 17 (5) subkloniert.

(A) Zur Herstellung eines HSA-Signalsequenzkonstrukts wird HSA/SK Nr. 17 mit MstII und HindIII zur Entfernung der Nukleotidsequenz verdaut, die die 3'-terminale Aminosäure (Leu₆₀₉) kodiert und ein Oligonukleotid, das für den wie oben definierten Linker L₂ kodiert, wird am 3'-Terminus des linearisierten HSA/SK Nr. 17 durch die Phosphorylierung der Oligonukleotide Nr. 28 und Nr. 29 (8B) und Anelierung und Ligation dieser Fragmente in die MstII/HindIII Stellen des linearisierten HSA/SK Nr. 17 unter Bildung von pEK7 eingeführt, das für präpro-HSA II fusioniert an L₂ kodiert (8B). Eine Minipräparations DNA wird durch BamHI Verdau und Sequenzierung überprüft.
(B) Zur Herstellung eines IgE-Signalsequenzkonstrukts wird HSA/SK Nr. 17, das für präpro-HSA II kodiert, durch PCR mit den Oligonukleotiden Nr. 26 und Nr. 27 (5, 8) amplifiziert. Das Oligonukleotid Nr. 26 entfernt die Präpro Sequenz von HSA und fügt ein Oligonukleotid, das für L kodiert, am 5' Ende von HSA an. Das Oligonukleotid Nr. 27 endet an einer natürlich vorkommenden NcoI Einzelschnittstelle etwa bei der Nukleotidposition 800 der für HSA kodierenden Sequenz. Die PCR Amplifizierung wird gemäß dem Verfahren in Beispiel 1(A) ausgeführt. Ein etwa 800 bp langes Fragment wird durch Gelelektrophorese und Qia isoliert und wird in einen pCR2 Vektor unter Bildung des Klons HSA Nco/TA Nr. 13 subkloniert, dessen Sequenz durch DNA Sequenzierung verifiziert wird. Das NcoI – NotI Fragment aus diesem Klon wird in NcoI und NotI geschnittene HSA/SK Nr. 17 DNA unter Bildung von HSA/ SK Nr. 5 (5) subkloniert, das L₁ gebunden an den 5'-Terminus der für HSA II kodierenden cDNA kodiert.
(C) Zur Expression von HSA alleine wird das oben hergestellte HSA/SK Nr. 17 Konstrukt verwendet.

Beispiel 3: Fusionskonstrukt HSA-IgER/SK Nr. 22, das präpro-HSA + Linker + IgE^R kodiert
pEK7 (enthält präpro HSA II cDNA + Oligonukleotid für L₂) und pEK1 (enthält IgE^R) werden mit BamHI und SalI verdaut. Das erhaltene 1,8 kb Fragment aus pEK7 wird phosphoryliert und dann in das 550 kb Fragment ligiert, das aus pEK1 erhalten wird. Es wird eine positive Minipräparation Nr. 23 präpariert, ist aber mit einem weiteren unbekannten Plasmid kontaminiert, das die Gewinnung der HSA-IgER Bande verhindert. Daher wird das 2,4 kb SpeI-SalI Fragment, das die HSA-IgE^R Fusion und das 2,9 kb Fragment umfasst, das die Vektor DNA enthält, aus der Minipräparation Nr. 23 gereinigt und zusammenligiert, was zu Klon HSA-IgE/SK Nr. 49 (9) führt [Es wird festgestellt, dass Vektorstellen an beiden Enden der subklonierten Region fehlen und daher wird das 2,4 kb SpeI-SalI Fragment aus HSA-IgE/SK Nr. 49 in den mit SpeI und SalI geschnittenen Blueskript SK subkloniert, was zu HSA-IgE/SK Nr. 22 führt (nicht in den Figuren gezeigt)].
Die Sequenzen der Verbindung von HSA und des Linkers mit der IgE Rezeptor DNA und der Sequenz der Enden der Fusion mit der Vektor DNA sind so, wie sie in HSA-IgE/SK Nr. 22 erwartet werden, wie dies durch DNA Sequenzanalyse bestätigt wird.
Beispiel 4: Fusionskonstrukt IgE-HSA/SK Nr. 1, das für IgE^R + präpro-HSA II kodiert
HSA/SK Nr. 5 und IgE^R/TA Nr. 1 werden mit SstI und NheI verdaut. Das 600 bp Fragment aus IgE/TA Nr. 1 wird durch Gelelektrophorese gereinigt und in das geschnittene und mit Phosphatase behandelte HSA/SK Nr. 5 unter Bildung des Klons Ig-HSA/SK Nr. 1 ligiert (10).
Beispiel 5: Fusionskonstrukt R-H-R/SK Nr. 50, das für prä-IgE^R-L₁-HSA II-L₂-IgE^R kodiert
Die PstI Schnittstelle, die für die HSA Region von IgE^R-HSA/SK Nr. 1 und HSA-IgE^R/SK Nr. 49 einzigartig ist, wird zur Verbindung von IgE^R und präpro-HSA II über das Oligonukleotid für L₂ verwendet. HSA/IgE^R/SK Nr. 49 und Bluescript SK werden mit PstI und SalI verdaut. Ein 1,2 kb Fragment, das den 3' Teil von HSA II enthält, der Linker und die IgE^R Sequenz werden in PstI plus SalI geschnittene Bluescript DNA ligiert, was zu HSA-IgE^R Pst Sal/SK Nr. 37 (11) führt, das mit PstI und KpnI geschnitten wird und das 1,2 kb Fragment wird präpariert.
Die IgE^R-HSA/SK Nr. 1 DNA wird mit PstI und KpnI geschnitten und ein 4,8 kb Fragment, das den Vektor, IgE^R, den Linker und die 5' Hälfte von HSA enthält, wird isoliert, mit Phosphatase behandelt und in das 1,2 kb Fragment von HSA-IgE^R Pst Sal/SK Nr. 37 ligiert. Das entstehende dimere Konstrukt R-H-R/SK Nr. 50 wird erhalten (11).
Beispiel 6: HSA II-L₂-IgE^R monomere Fusionspolypeptide durch Transfektion und Kultur von Pichia pastoris
Das Plasmid MB Nr. 2, das für HSA II-L₂-IgE^R kodiert, wird durch Schneiden das Plasmids HSA/SK Nr. 49 mit EcoRI und der Isolierung des 2,4 kb Fragments hergestellt, das für das Fusionsprotein kodiert. Dieses Fragment wird in die EcoRI Schnittstelle des Pichia pastoris Expressionsvektors pHIL-D2 (Invitrogen) nach einem Verdau von Plasmid pHIL-D2 mit EcoRI und alkalischer Phosphatase ligiert. Das entstehende MB Nr. 2 Plasmid wird durch einen Verdau mit NotI linearisiert und in his4 GS115 Zellen transformiert, wie dies im "Invitrogen Handbuch" beschrieben ist. His+ Transformanden werden auf Wachstum auf Methanol gescreent. Stämme, die ein langsames Wachstum auf Methanol zeigen, werden in Glycerinminimalmedium, wie es im "Invitrogen Handbuch" beschrieben ist, bis zur stationären Phase angezogen, durch Zentrifugation in gepuffertes, komplexes Methanolmedium überführt und für 4 Tage angezogen. Der Überstand aus diesen Zellen wird dann durch ELISA auf das Vorkommen von HSA und auf IgE Bindungsfähigkeit getestet. Die IgE Bindungsfähigkeit des erhaltenen Produkts, das aus P. pastoris sekretiert wird, ist auf einer molaren Basis zur HSA Konzentration äquivalent und vollkommen biologisch aktiv.
Beispiel 7: IgE^R-L₁-HSA II-L₂-IgE^R dimeres Fusionspolypeptid durch Transfektion und Kultur der CHO Zellen
Das Plasmid pXMT3-R1α-HSARIα (enthält das Polynukleotid der SEQ ID Nr. 4, welches für pre-IgE^R-L₁-HSA II-L₂-IgE^R kodiert) durch den Verdau von R-H-R/SK Nr. 50 (siehe Beispiel 5) mit EcoRI und der Isolierung des 3 kb EcoRI Fragments hergestellt, das für das dimere Fusionspolypeptid kodiert. Dieses Fragment wird in die EcoRI Einzelschnittstelle von pXMT3 nach dem Verdau von pXMT3 mit EcoRI und einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase ligiert.
Das Plasmid wird in CHO DUKX B11 Zellen transfiziert. Diesen Zellen fehlt ein funktionsfähiges dhfr Gen (Dihydrofolatreduktase), die für die Nukleosidsynthese erforderlich ist. Daher werden die Zellen in alpha+ Medium (MEM apha Medium mit Ribonukleosiden und Desoxyribonukleosiden/Gibco), worin 10% fetales Kälberserum (FCS) enthalten sind, gehalten. Zur Transfektion werden die Zellen zweimal mit Ca²⁺ Mg²⁺ freiem PBS (CMF-PBS) gewaschen und die Zellkonzentration wird in CMF-PBS auf 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt. 0,8 ml der Zellsuspension werden zu 15 μg Plasmid DNA gegeben. Die Transfektion wird durch Elektroporation mittels Bio Rad Gene Pulser (Spannung = 1000 V, Kapazität = 25 μF) ausgeführt. Nach der Transfektion werden die Zellen in 15 ml Alpha+ Medium mit 10% FCS für 3 Tage kultiviert.
Das dhfr-Gen, das auf dem Plasmid pXMT3 liegt, erlaubt die Selektion auf rekombinante Zellen in einem von Nukleosiden befreiten Medium. 3 Tage nach der Transfektion werden die Zellen in Alpha-Medium (MEM Alpha Medium ohne Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside/Gibco) gegeben, worin 10% dialysiertes, fetales Kälberserum (FCSD) enthalten sind. Nach 2 Wochen Kultivierung sind rekombinante Zellkolonien sichtbar. Die Zellen werden in Alpha-Medium, worin 10% FCSD enthalten sind, für 4 weitere Passagen gehalten, bevor die Genamplifizierung gestartet wird.
In Gegenwart von Methotrexat (MTX) werden dhfr und die hiermit verbundenen Gene amplifiziert, was zu einer erhöhten Expression des Transgens führt. Daher erfolgt nach der Selektion auf rekombinan ten Zellen in einem Medium ohne Nukleoside eine Kultivierung in Gegenwart von 20 nM MTX in Alpha-Medium, worin 10% FCSD enthalten sind. Eine weitere Amplifizierung wird durch schrittweise Erhöhungen in Methotrexat bis 100 nM und 500 nM MTX erreicht.
Das Protein wird durch Animpfen des Pools T1/3 – 500 nM in Alpha Medium, worin 10% FCS (GIBCO) enthalten sind, bei einer Dichte von 9 × 10³/cm² in Rollflaschen hergestellt. Der erste Überstand wird 5 Tage nach dem Animpfen gewonnen, wonach auf serumfreies Alpha- gewechselt wird. Die zweite Ernte wird 3 Tage später gemacht, was zu insgesamt 1 Liter Überstand zur Reinigung führt.
Ein zweiter Ansatz wird aus 2 Liter Überstand gereinigt, der von Pool T1/3 – 500 nM stammt, welcher an serumfreie Wachstumsbedingungen angepasst ist. Die Zellen werden mit 5 × 10⁴ Zellen/ml angeimpft und der Überstand wird 6 Tage nach dem Beimpfen gewonnen.
Beispiel 8: Reinigung des Fusionsproteins
Die Kulturüberstände aus Beispiel 7 werden durch Immunaffinitätschromatographie auf immobilisierten, monoklonalen anti-FcεRI Antikörpern gereinigt (beispielsweise 5H5-F8, Maus IgG1), die gemäß Standardtechniken hergestellt und gereinigt werden:
a) Herstellung des Chromatographietragers:
Die monoklonalen Antikörper werden an CnBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit einer Dichte von 10 mg Antikörper/ml Gene gemäß den Anleitungen des Herstellers gekuppelt. Überschüssige reaktive Gruppen werden anschließend mit Ethanolamin blockiert und das Harz wird in PBS bis zur Verwendung gelagert, die mit 0,02% NaN₃ versetzt ist.
b) Affinitätschromatographie
Ein klarer Kulturüberstand wird auf eine 5 ml Antikörpersäule, die in PBS äquilibriert ist, mit einer Flussrate von 0,5 ml/min aufgetragen. Das absorbierte Material wird in 50 mM Citronensäure und 140 mM NaCl, pH 2,70 eluiert. Die Protein-enthaltenden Fraktionen werden sofort auf pH 7,0 (NaOH) eingestellt, wonach eine Sterilfiltration erfolgt.
c) Quantifizierung/Charakterisierung:
Die Konzentration des dimeren Fusionspolypeptids wird durch Absorption bei 280 nm in die native Konformation in 30 mM (3-[N-Morpholino]propan)sulfonsäure (MOPS), pH 7,0 und in die denaturierte Form (6 M Guanidin-HCl) denaturiert. Der entsprechende molare Absorptionskoeffizient wird aus der Anzahl an Tryptophan, Tyrosin und Cysteinresten mittels der tabellierten Absorptionskoeffizienten dieser Aminosäuren in Modellverbindungen berechnet und um die Differenz in der optischen Dichte zwischen gefaltetem und ungefaltetem Protein korrigiert. Das Fusionsprotein enthält 17 Tryptophane, 40 Tyrosine und 21 Cysteine, was zu einem theoretischen Extinktionskoeffizienten von 150840 M^–1cm^–1 führt. Die Qualität des gereinigten Materials wird durch Standard SDS-PAGE und durch N-terminale, automatisierte, Gasphasen-Edman Abbausequenzierung und Massenspektrometrie ermittelt. Nach der SDS-PAGE (15) wandert das Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 140 kDa, was etwa 28% Glykosylierung widerspiegelt (theoretisches MG ohne Glykosylierung: 108863,61 Da). Sequenzlisten

(

Claims

Fusionspolypeptid oder ein Salz hiervon der SEQ.ID.NO.3 oder der Reste Val₂₆-Leu₉₇₈ der SEQ.ID.NO.3.
Isoliertes Polynucleotid, das ein Zwischenprodukt bei der Herstellung eines Polypeptids oder eines Salzes hiervon nach Anspruch 1 ist, das die Reste Val₂₆-Leu₉₇₈ der SEQ.ID.NO.3 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Salzes hiervon nach Anspruch 1, durch (a) Transformation einer Wirtszelle mit einem Vektor, der DNA umfasst, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert, (b) Expression des Polypeptids in dieser Zelle unter Erhalt eines Fusionspolypeptids gemäß der Definition in Anspruch 1, und (c) Gewinnung des erhaltenen Polypeptids aus der Wirtszelle, optional in der Form eines Salzes ^ hiervon.
Vektor, der DNA umfasst, die für ein Polypeptid oder ein Salz hiervon nach Anspruch 1 kodiert.
Transgenes nicht humanes Tier, das ein Polypeptid oder ein Salz hiervon nach Anspruch 1 exprimiert.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz hiervon, für die Verwendung als ein Arzneimittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz hiervon, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
Verwendung eines Fusionspolypeptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Störungen, die durch IgE oder den IgE-Rezeptor mediiert werden.