DE69736698T2

DE69736698T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin

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Publication number: DE69736698T2
Application number: DE69736698T
Authority: DE
Inventors: c/o Ajinomoto Co. Masayuki Kawasaki-ku Kawasaki-shi Araki; c/o Ajinomoto Co. Masakazu Kawasaki-ku Kawasaki-shi Sugimoto; c/o Ajinomoto Co. Yasuhiko Kawasaki-ku Kawasaki-shi Yoshihara; c/o Ajinomoto Co. Tsuyoshi Kawasaki-ku Kawasaki-shi Nakamatsu
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1996-12-05
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2017-12-06
Also published as: CN1187540A; BR9706059A; EP0854189A3; HU224492B1; ES2273355T3; DE69736698D1; US6004773A; HUP9702360A3; EP0854189A2; EP0854189B1; BR9706059B1; CN1524956A; PL323546A1; SK285201B6; SK163697A3; DK0854189T3; PL190430B1; CN1273592C; HUP9702360A2; CN1159443C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der erhalten wird durch Modifizieren eines coryneformen Bakteriums, das bei der Gärungsherstellung einer Aminosäure oder dergleichen mittels einer Technik auf Basis der Gentechnik verwendet wird.
L-Lysin, das als Futterzusatzstoff verwendet wird, wird gewöhnlich durch ein Gärungsverfahren hergestellt, bei dem ein L-Lysin herstellender mutanter Stamm, der zu den coryneformen Bakterien gehört, verwendet wird. Verschiedene L-Lysin herstellende Bakterien, die derzeit bekannt sind, sind solche, die durch künstliche Mutation erzeugt werden, wobei mit Wildtypstämmen, die zu den coryneformen Bakterien gehören, begonnen wird.
In Bezug auf die coryneformen Bakterien sind ein Vektorplasmid, das autonom in Bakterienzellen replizierbar ist und ein chemikalienresistentes Markergen aufweist (siehe US-Patent Nr. 4,514,502) und ein Verfahren zum Einführen eines Gens in Bakterienzellen (z.B. japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 2-207791) bekannt. Es ist ebenfalls eine Möglichkeit zum Züchten eines L-Threonin oder L-Isoleucin herstellenden Bakteriums unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken bekannt (siehe US-Patent Nrn. 4,452,890 und 4,442,208). In Bezug auf das Züchten eines L-Lysin herstellenden Stammes ist eine Technik bekannt, bei der ein Gen, das an der L-Lysin-Biosynthese teilnimmt, in ein Vektorplasmid eingeführt wird, damit das Gen in Bakterienzellen amplifiziert wird (z.B. japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 56-160997).
Bekannte Gene der L-Lysin Biosynthese umfassen z.B. ein Dihydrodipicolinatreduktasegen (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 7-75578) und ein Aspartataminotransferasegen (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 6-102028), wobei ein Gen, das an der L-Lysin-Biosynthese teilnimmt, kloniert ist, sowie ein Phosphoenolpyruvatcarboxylasegen (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 60-87788), ein Dihydrodipicolinatsynthasegen (japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-55149) und ein Diaminopimelatdecarboxylasegen (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 60-62994), wobei die Amplifikation eines Gens die L-Lysin Produktivität beeinflusst.
Bezüglich der Enzyme, die an der L-Lysin-Biosynthese teilnehmen, ist ein Fall eines Enzyms bekannt, das bei der Verwendung eines Wildtyps eine Feedbackinhibierung erlebt. In diesem Fall ist die L-Lysin-Produktivität durch Einführen eines Enzymgens mit einer solchen Mutation, so dass die Feedbackinhibierung desensibilisiert ist, verbessert. Solche, die als ein derartiges Gen bekannt sind, umfassen speziell z.B. ein Aspartokinasegen (internationale Veröffentlichung von WO 94/25605).
Wie zuvor beschrieben, wurden bestimmte erfolgreiche Ergebnisse mittels der Amplifikation von Genen des L-Lysin-Biosynthesesystems oder durch Einführen von Mutantengenen erzielt. Zum Beispiel stellt ein coryneformes Bakterium, das ein mutantes Aspartokinasegen mit arrangierter desensibilisierter Inhibierung durch Lysin und Threonin beherbergt, eine beträchtliche L-Lysinmenge (ungefähr 25 g/l) her. Dieses Bakterium leidet jedoch unter der Abnahme der Wachstumsgeschwindigkeit im Vergleich mit einem Bakterium, das kein mutantes Aspartokinasegen beherbergt. Es wurde ebenso berichtet, dass die L-Lysin-Produktivität durch weiteres Einführen eines Dihydrodipicolinatsynthasegens zusätzlich zu einem mutanten Aspartokinasegen verbessert wird (Applied and Environmental Microbiology, 57(6), 1746-1752 (1991)). Ein solches Bakterium leidet jedoch unter einer weiteren Abnahme der Wachstumsgeschwindigkeit.
In Bezug auf das Dihydrodipicolinatreduktasegen wurde gezeigt, dass die Aktivität der Dihydrodipicolinatreduktase in einem coryneformen Bakterium, in den das Gen eingeführt worden ist, verbessert ist, jedoch gibt es keinen Bericht über den Einfluss auf die L-Lysin-Produktivität (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 7-75578).
Unter den vorliegenden Gegebenheiten ist kein Fall von coryneformen Bakterien bekannt, in dem jemand erfolgreich die L-Lysin-Ausbeute durch Kombinieren einer Vielzahl von Genen der L-Lysin-Biosynthese erheblich verbessert hat, ohne das Wachstum zu unterdrücken. Es ist über keinen Fall berichtet worden, bei dem beabsichtigt ist, dass das Wachstum durch gleichzeitiges Erhöhen eines Gens der L-Lysin-Biosynthese verbessert wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist es, die L-Lysin-Produktivität eines coryneformen Bakteriums unter Verwendung genetischen Materials von DNA-Sequenzen, die jeweils Aspartokinase codieren (hiernach als "AK" bezeichnet, vorausgesetzt, dass ein Gen, das ein AK-Protein codiert, hiernach als "lysC", wenn notwendig, bezeichnet wird), Dihydrodipicolinatreduktase (hiernach als "DDPR" bezeichnet, vorausgesetzt, dass ein Gen, das ein DDPR-Protein codiert, hiernach als "dapB", wenn notwendig, bezeichnet wird), Dihydrodipicolinatsynthase (hiernach mit "DDPS" abgekürzt, vorausgesetzt, dass ein Gen, das ein DDPS-Protein codiert, hiernach als "dapA", wenn notwendig, bezeichnet wird), Diaminopimelatdecarboxylase (hiernach als "DDC" bezeichnet, vorausgesetzt, dass ein Gen, das ein DDC-Protein codiert, hiernach als "lysA", wenn notwendig, bezeichnet wird), und Aspartataminotransferase (hiernach als "AAT" bezeichnet, vorausgesetzt, dass ein Gen, das ein AAT-Protein codiert, hiernach als "aspC", wenn notwendig, bezeichnet wird), wobei dies wichtige Enzym der L-Lysin-Biosynthese in Zellen von coryneformen Bakterien sind.
Das erfindungsgemäße Prinzip basiert auf der Tatsache, dass die L-Lysin-Produktivität durch Erhöhen von mutantem lysC (hiernach einfach als "mutantes lysC", wenn notwendig, bezeichnet), das mutantes AK codiert (hiernach einfach als "mutantes AK", wenn notwendig, bezeichnet), wobei die arrangierte Inhibierung durch Lysin und Threonin desensibilisiert ist, und durch dapA, dapB, lysA und aspC in Kombination verbessert werden kann.
Und zwar liefert die vorliegende Erfindung eine rekombinante DNA, die autonom in Zellen von coryneformen Bakterien replizierbar ist, umfassend eine DNA-Sequenz, die eine Aspartokinase codiert, bei der die Feedbackinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin wesentlich desensibilisiert ist, eine DNA-Sequenz, die eine Dihydrodipicolinatreduktase codiert, eine DNA-Sequenz, die Dihydrodipicolinatsynthase codiert, eine DNA-Sequenz, die Diaminopimelatdecarboxylase codiert, und eine DNA-Sequenz, die Aspartataminotransferase codiert.
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein coryneformes Bakterium, das eine Aspartokinase umfasst, bei der die Feedbackinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin wesentlich desensibilisiert ist und das eine verbesserte DNA-Sequenz, die eine Dihydrodipicolinatreduktase codiert, eine verbesserte DNA-Sequenz, die Dihydropicolinatsynthase codiert, eine verbesserte DNA-Sequenz, die Diaminopimelatdecarboxylase codiert und eine verbesserte DNA-Sequenz, die Aspartataminotransferase codiert, umfasst.
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, umfassend die Schritte des Kultivierens eines der oben beschriebenen coryneformen Bakterien in einem geeigneten Medium, um die Herstellung und Anhäufung von L-Lysin in einer Bakterienkultur und das Sammeln von L-Lysin aus der Kultur zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine DNA, die ein Protein, umfassend eine in SEQ ID NO: 31 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, bereit. Ein Beispiel der DNA ist eine DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz der Nukleotidzahlen 879 bis 2174 in der in SEQ ID NO: 30 gezeigten Nukleotidsequenz.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Vektor pVK7 bereit, der in autonomen Zellen von Escherichia coli und Brevibacterium lactofermentum replizierbar ist und eine Mehrfachklonierungsstelle und lacZ' umfasst.
Auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommenen coryneformen Bakterien sind eine Gruppe von Mikroorganismen, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, Seite 599 (1974) beschrieben sind und die aerob, grampositiv, nicht säurefest sind und keine spurenbildende Fähigkeit aufweisen. Die coryneformen Bakterien umfassen Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium gehören, Bakterien, die zur Gattung Brevibacterium, die bislang klassifiziert wurden, in die Gattung Brevibacterium, aber vereinigt wurden als Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium gehören, und Bakterien, die zur Gattung Brevibacterium gehören, die eng mit Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium gehören, verwandt sind.
Erfindungsgemäß kann die L-Lysin-Produktivität von coryneformen Bakterien verbessert werden.
KURZE ERLÄUTERUNG DER ABBILDUNGEN
1 stellt ein Verfahren zur Erzeugung der Plasmide p399AK9B und p399AKYB, umfassend mutantes lysC dar.
2 stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Plasmids pDPRB, umfassend dapB und Brevi.-ori dar.
3 stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Plasmids pDPSB, umfassend dapA und Brevi.-ori dar.
4 stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Plasmids p299LYSA, umfassend lysA dar.
5 stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Plasmids pLYSAB, umfassend lysA und Brevi.-ori dar.
6 stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Plasmids pCRCAB, umfassend lysC, dapB und Brevi.-ori dar.
7 stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Plasmids pCB, umfassend mutantes lysC und dapB dar.
8 stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Plasmids pAB, umfassend dapA, dapB und Brevi.-ori dar.
9 stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Plasmids pCAB, umfassend mutantes lysC, dapA, dapB und Brevi.-ori.
10 stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Plasmids pCABL, umfassend mutantes lysC, dapA, dapB, lysA und Brevi.-ori dar.
11 stellt ein Verfahren zur Erzeugung neuer Klonierungsvektoren für coryneforme Bakterien, pVK6 und pVK7 dar.
12 stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Plasmids pOm, umfassend aspC dar.
13 stellt zwei offene Leserahmen (ORFs) auf einem ATCC 13869 chromosomalen DNA-Fragment dar.
14 stellt ein Verfahren zur Erzeugung von pORF1 dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1. Herstellung von Genen für die L-Lysin-Biosynthese, die erfindungsgemäß verwendet werden
Die erfindungsgemäß verwendeten Gene der L-Lysin-Biosynthese werden jeweils erhalten durch Herstellen chromosomaler DNA aus einem Bakterium als ein DNA-Spender, Herstellen einer chromosomalen DNA-Bibliothek unter Verwendung eines Plasmidvektors oder dergleichen, Auswählen eines Stammes, der das gewünschte Gen beherbergt und Gewinnen der rekombinanten DNA, in die das Gen eingeführt worden ist aus dem ausgewählten Stamm. Der DNA-Spender des erfindungsgemäß verwendeten Gens der L-Lysin-Biosynthese ist nicht speziell eingeschränkt, vorausgesetzt, dass das gewünschte Gen der L-Lysin-Biosynthese ein Enzymprotein exprimiert, das in Zellen von coryneformen Bakterien wirkt. Der DNA-Spender ist jedoch bevorzugt ein coryneformes Bakterium.
Alle Gene lysC, dapA, dapB und lysA, die von coryneformen Bakterien abstammen, haben bekannte Sequenzen. Folglich können sie durch Amplifikation gemäß der Polymerasekettenreaktion erhalten werden (PCR; siehe White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)).
Jedes der erfindungsgemäß verwendeten Gene der L-Lysin-Biosynthese ist gemäß bestimmter Verfahren, die nachstehend beispielhaft aufgeführt werden, erhältlich.
(1) Herstellung von mutantem lysC
Ein DNA-Fragment, enthaltend mutantes lysC kann aus einem mutanten Stamm hergestellt werden, bei dem synergistische Feedbackinhibierung der AK-Aktivität durch L-Lysin und L-Threonin wesentlich desensibilisiert ist (internationale Veröffentlichung WO 94/25605). Ein solcher mutanter Stamm kann z.B. aus einer Gruppe von Zellen erhalten werden, die von einem Wildtypstamm eines coryneformen Bakteriums abstammen, das einer Mutationsbehandlung ausgesetzt wird, indem eine gewöhnliche Mutationsbehandlung z.B. durch ultraviolette Bestrahlung und Behandlung mit einem Mutationsagens, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), angewendet wird. Die AK-Aktivität kann durch ein Verfahren gemessen werden, das von Miyajima, R. et al. in The Journal of Biochemistry (1968), 63(2), 139-148 beschrieben ist. Der am meisten bevorzugte mutante Stamm ist veranschaulicht durch ein L-Lysin herstellendes Bakterium AJ3445 (FERM P-1944), das durch eine Mutationsbehandlung aus einem Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (wobei sein Corynebacterium glutamicum-Name geändert wurde) abstammt.
Alternativ ist mutantes lysC auch erhältlich durch eine in vitro-Mutationsbehandlung von Plasmid-DNA, enthaltend Wildtyp lysC. In einem anderen Aspekt sind Informationen speziell über eine Mutation bekannt, um die synergistische Feedbackinhibierung der AK durch L-Lysin und L-Threonin zu desensibilisieren (internationale Veröffentlichung WO 94/25605). Folglich kann mutantes lysC unter Berücksichtigung von Informationen über z.B. das seitengerichtete Mutageneseverfahren, auch von Wildtyp lysC hergestellt werden.
Ein Fragment, umfassend lysC, kann isoliert werden aus einem coryneformen Bakterium durch Herstellen chromosomaler DNA gemäß z.B. einem Verfahren von Saito und Miura (H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) und Amplifizieren von lysC gemäß dem Polymerasekettenreaktionsverfahren (PCR; siehe White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)).
DNA-Primer sind beispielhaft dargestellt durch einzelsträngige DNA von 23 und 21 Nukleotiden mit Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 1 und 2 der Sequenzliste gezeigt sind, um auf Basis einer Sequenz, die für Corynebacterium glutamicum (siehe Molecular Microbiology (1991), 5(5), 1197-1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324) bekannt ist z.B. einen Bereich von ungefähr 1643 Bp zu amplifizieren, der lysC codiert. DNA kann gemäß einem gewöhnlichen Verfahren unter Verwendung einer DNA-Synthetisiervorrichtung 380B, hergestellt von Applied Biosystems, und unter Verwendung des Phosphoamiditverfahrens (siehe Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859) synthetisiert werden. PCR kann durchgeführt werden unter Verwendung des DNA-thermalen Zyklus, Modell PJ2000, hergestellt von Takara Shuzo, und unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase gemäß einem von dem Anbieter genannten Verfahren.
Es ist bevorzugt, dass lysC, amplifiziert durch PCR, mit Vektor-DNA, die autonom in E. coli- und/oder coryneformen Bakterienzellen replizierbar ist, ligiert wird, um rekombinante DNA herzustellen, und die rekombinante DNA wird zuvor in E. coli-Zellen eingeführt. Durch eine solche Vorkehrung werden die folgenden Vorgänge vereinfacht. Der in E. coli-Zellen autonom replizierbare Vektor ist bevorzugt ein Plasmidvektor, der bevorzugt in den Wirtszellen autonom replizierbar ist, einschließlich z.B. pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 und RSF1010.
Wenn ein DNA-Fragment mit einer Fähigkeit, dass ein Plasmid autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist, in diese Vektoren eingeführt wird, können sie als ein Shuttle-Vektor der autonom sowohl in E. coli als auch in coryneformen Bakterien replizierbar ist, verwendet werden.
Ein solcher Shuttle-Vektor umfasst die folgenden Mikroorganismen, die die Vektoren beherbergen, die Zugangsnummern der internationalen Hinterlegungsbehörden (in Klammern) sind gezeigt.

pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532)
pAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)
pAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)
pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)
pAJ3148: orynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137)
pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140).

Diese Vektoren sind aus den hinterlegten Mikroorganismen wie folgt erhältlich. Zellen, die in einer logarithmischen Wachstumsphase gesammelt wurden, wurden unter Verwendung von Lysozym und SDS lysiert, gefolgt von der Trennung aus dem Lysat durch Zentrifugierung bei 30.000 × g, um einen Überstand zu erhalten. Zu dem Überstand wurde Polyethylenglycol gegeben, gefolgt von der Fraktionierung und Reinigung mit einer Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gleichgewichtsdichte-Gradientenzentrifugierung.
E. coli kann durch Einführen eines Plasmids gemäß z.B. einem Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) oder eines Verfahrens, bei dem Empfängerzellen mit Calciumchlorid behandelt sind, um die Durchlässigkeit der DNA zu erhöhen (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), transformiert werden.
Wildtyp lysC wird erhalten, wenn lysC aus einem AK-Wildtypstamm isoliert wird, während mutantes lysC erhalten wird, wenn lysC aus einem AK-Mutantenstamm gemäß dem oben beschriebenen Verfahren isoliert wird.
Ein Beispiel einer Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments, enthaltend Wildtyp lysC, ist in SEQ ID NO: 3 der Sequenzliste gezeigt. Eine Aminosäuresequenz der α-Untereinheit eines Wildtyp-AK-Proteins wird aus der Nukleotidsequenz abgeleitet und ist in SEQ ID NO: 4 der Sequenzliste zusammen mit der DNA-Sequenz gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt. Eine Aminosäuresequenz der β-Untereinheit des Wildtyp-AK-Proteins wird aus der Nukleotidsequenz der DNA abgeleitet und ist in SEQ ID NO: 6 der Sequenzliste zusammen mit der DNA-Sequenz gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt. Bei jeder Untereinheit wird GTG als Anfangscodon verwendet und eine entsprechende Aminosäure wird durch Methionin dargestellt. Diese Darstellung bezieht sich jedoch auf Methionin, Valin oder Formylmethionin.
Das erfindungsgemäße mutante lysC ist nicht speziell eingeschränkt, vorausgesetzt, dass es AK codiert, wobei die synergistische Feedbackinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin desensibilisiert ist. Das mutante lysC ist jedoch beispielhaft dargestellt durch eine Mutation, bei der der Aminosäurerest entsprechend dem 279ten Alaninrest, wenn vom N-terminalen Ende gezählt wird, in einen Aminosäurerest außer Alanin einer sauren Aminosäure, außer Alanin, in der α-Untereinheit geändert wird und der Aminosäurerest entsprechend dem 30ten Alaninrest vom N-terminalen Ende in eine Aminosäure, einer sauren Aminosäure, außer Alanin, in der β-Untereinheit in der Aminosäuresequenz von Wildtyp AK geändert wird. Die Aminosäuresequenz von Wildtyp AK schließt speziell als α-Untereinheit die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 der Sequenzliste gezeigt ist und als β-Untereinheit die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 7 der Sequenzliste gezeigt ist, ein.
Diejenigen, die als Aminosäurerest außer Alanin und außer einer sauren Aminosäure bevorzugt sind, schließen Threonin-, Arginin-, Cystein-, Phenylalanin-, Prolin-, Serin-, Tyrosin- und Valinreste ein.
Das Codon, das einem zu substituierenden Aminosäurerest entspricht, ist nicht speziell eingeschränkt auf einen Typ, vorausgesetzt, dass es den Aminosäurerest codiert. Es ist zu erwarten, dass die Aminosäuresequenz von Wildtyp AK sich etwas unterscheiden kann in Abhängigkeit der Unterschiede bei den Bakterienarten und Bakterienstämmen. AKs, die eine Mutation auf Basis z.B. einer Substitution, Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder mehreren Positionen, die für die Enzymaktivität irrelevant sind, wie oben beschrieben, können außerdem erfindungsgemäß verwendet werden. Eine DNA, codierend AK mit einer spontanen Mutation, kann erhalten werden durch Isolieren einer DNA, die unter stringenter Bedingung mit z.B. der DNA, die ein Teil der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Nukleotidsequenz aufweist, hybridisierbar ist. Unter "stringenter Bedingung", auf die hier Bezug genommen wird, ist eine Bedingung gemeint, unter der ein spezifisches Hybrid gebildet wird und ein nicht-spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig, die Bedingung mit numerischen Werten eindeutig zu beschreiben. Die Bedingung wird beispielhaft jedoch durch eine Bedingung dargestellt, unter der eine Nukleinsäure mit hoher Homologie, z.B. DNA mit Homologie von nicht weniger als 90 % miteinander hybridisieren und Nukleinsäuren mit Homologie weniger als der obigen nicht miteinander hybridisieren oder eine Bedingung, bei der die Temperatur von dem Schmelztemperaturbereich (Tm) eines vollständig zusammenpassenden Hybrids von (Tm – 30)°C, bevorzugt von Tm bis (Tm – 20)°C und einer Salzkonzentration entsprechend 1 × SSC, bevorzugt 0,1 × SSC.
Andere AKs, die künstliche Mutationen auf Basis z.B. von Substitution, Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäurereste aufweisen, können ebenso verwendet werden, vorausgesetzt, dass kein wesentlicher Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensibilisierung der synergistischen Feedbackinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin ausgelöst wird. Eine DNA, die AK mit der künstlichen Mutation codiert, kann erhalten werden durch Modifizieren der Nukleotidsequenz, z.B. durch Substitution, Deletion oder Insertion einer spezifizierten Stelle durch z.B. ortsspezifische Mutagenese. Außerdem kann lysC mit einer Mutation durch eine bekannte mutagene Behandlung erhalten werden. Die mutagene Behandlung umfasst eine in vitro-Behandlung einer DNA, enthaltend lysC mit Hydroxylamin oder dergleichen und eine Behandlung des Mikroorganismus, der eine DNA, enthaltend lysC beherbergt, mit einem Mutagen, wie durch ultraviolette Bestrahlung oder mit einem Mutagenagens, das gewöhnlich bei der künstlichen Mutagenese verwendet wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder Salpetersäure. Nach der mutagenen Behandlung kann eine Stelle, in der die Mutation eingeführt wird oder in der die Mutation auftritt, durch Auswählen einer DNA oder eines Mikroorganismus bestimmt werden, der AK codiert oder herstellt, der AK-Aktivität aufweist und dessen Aminosäuresequenz von der der Mutagenenbehandlung unterworfenen DNA oder der Mutagenbehandlung unterworfenen Mikroorganismus mutiert ist. Die Stelle der eingeführten Mutation ist nicht speziell eingeschränkt, vorausgesetzt, dass kein wesentlicher Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensibilisierung der Feedbackinhibierung ausgelöst wird. Die Zahl der eingeführten Mutation hängt von der Stelle und der Art der mutierten Aminosäure in der sterischen Struktur des Proteins ab und ist nicht speziell eingeschränkt, vorausgesetzt, dass kein wesentlicher Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensibilisierung der Feedbackinhibierung ausgelöst wird. Die Zahl beträgt gewöhnlich 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 10.
Ein Aminosäurerest, entsprechend dem spezifizierten Alaninrest in der Aminosäuresequenz von AK mit der Mutation, wie zuvor beschrieben, kann leicht durch den Fachmann bestimmt werden.
Ein AJ12691-Stamm, der erhalten wird durch Einführen eines mutanten lysC-Plasmids p399AK9B in einen AJ12036-Stamm (FERM BP-734) als Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum wurde am 10. April 1992 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-12918 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) hinterlegt und auf die internationale Hinterlegung gemäß dem Budapest Vertrag am 10. Februar 1995 übertragen und unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4999 hinterlegt.
(2) Herstellung von dapB
Ein DNA-Fragment, enthaltend dapB, kann hergestellt werden aus einem Chromosom eines coryneformen Bakteriums durch PCR. Der DNA-Spender ist nicht speziell eingeschränkt, jedoch ist er beispielhaft dargestellt durch den Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm.
Eine DDPR codierende DNA-Sequenz von Brevibacterium lactofermentum ist bekannt (Journal of Bacteriology, 175(9), 2743-2749 (1993)) und auf dessen Basis können DNA-Primer durch PCR hergestellt werden. Solche DNA-Primer sind speziell beispielhaft dargestellt durch DNA mit einer Länge von 23 Nukleotiden, wobei sie Nukleotidsequenzen, wie in SEQ ID NO: 8 und 9 der Sequenzliste dargestellt sind, aufweisen. Die DNA-Synthese, PCR und Herstellung eines Plasmids, enthaltend die erhaltene dapB, können auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie zuvor für lysC beschrieben.
Eine Nukleotidsequenz eines DNA-Fragmenten, enthaltend dapB und eine Aminosäuresequenz, abgeleitet von der Nukleotidsequenz, sind in SEQ ID NO: 10 dargestellt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 11 dargestellt. Zusätzlich zu den DNA-Fragmenten, die diese Aminosäuresequenz codieren, können erfindungsgemäß DNA-Fragmente äquivalent verwendet werden, die Aminosäuresequenzen codieren, die im wesentlichen die gleichen sind wie die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 11 gezeigt ist, nämlich Aminosäuresequenzen mit Mutation auf Basis von z.B. Substitution, Deletion oder Insertion ein oder mehrerer Aminosäuren, vorausgesetzt, dass sie keinen wesentlichen Einfluss auf die DDPR-Aktivität aufweisen. Das dapB mit spontaner oder künstlicher Mutation kann auf die gleiche Weise hergestellt werden wie DNA, die AK mit Mutation codiert und die keinen Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensibilisierung der synergistischen Feedbackinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin auslöst.
Ein transformanter Stamm AJ13107, erhalten durch Einführen eines Plasmids pCRDAPB, enthaltend dapB, erhalten in einem später beschriebenen Beispiel, in einen E. coli JM109-Stamm ist international auf Basis des Budapester Vertrages seit dem 26. Mai 1995 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5114 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) hinterlegt.
(3) Herstellung von dapA
Ein DNA-Fragment, enthaltend dapA, kann hergestellt werden aus Chromosomen eines coryneformen Bakteriums durch PCR. Der DNA-Spender ist nicht besonders eingeschränkt, ist aber beispielhaft dargestellt durch den Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm.
Eine DNA-Sequenz, die DDPS codiert, ist für Corynebacterium glutamicum (siehe Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL Hinterlegungsnummer X53993) bekannt, auf dessen Basis DNA-Primer zur PCR hergestellt werden können. Solche DNA-Primer sind speziell beispielhaft dargestellt durch DNA mit einer Länge von 23, insbesondere mit der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 12 und 13 der Sequenzliste dargestellt sind. DNA-Synthese, PCR und die Herstellung eines Plasmids, enthaltend das erhaltene dapA, können auf die gleiche Weise hergestellt werden, wie für lysC oben beschrieben.
Eine Nukleotidsequenz eines DNA-Fragmentes, enthaltend dapA und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind in SEQ ID NO: 14 beispielhaft gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 15 gezeigt. Zusätzlich zu den DNA-Fragmenten, die diese Aminosäuresequenz codieren, können erfindungsgemäß äquivalente DNA-Fragmente verwendet werden, die Aminosäuresequenzen codieren, die im wesentlichen mit der in SEQ ID NO: 15 gezeigten Aminosäuresequenz übereinstimmen, nämlich Aminosäuresequenzen mit Mutation auf Basis von z.B. Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren, vorausgesetzt, dass sie keinen wesentlichen Einfluss auf die DDPS-Aktivität aufweisen. Das dapA mit spontaner oder künstlicher Mutation kann auf die gleiche Weise erhalten wie DNA, die AK mit Mutation codiert, und die keinen Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensibilisierung synergistischer Feedbackinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin aufweist.
Ein transformanter Stamm AJ13106, der durch Einführen eines Plasmids pCRDAPAm enthaltend dapA, in den E. coli JM109-Stamm erhalten wurde und im nachfolgenden Beispiel beschrieben ist, ist international auf Basis des Budapester Vertrages seit 26. Mai 1995 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5113 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) hinterlegt.
(4) Herstellung von lysA
Ein DNA-Fragment, enthaltend lysA, kann aus Chromosomen eines coryneformen Bakteriums durch PCR hergestellt werden. Der DNA-Spender ist nicht besonders eingeschränkt, aber ist beispielhaft durch den Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm gezeigt.
Bei coryneformen Bakterien bildet lysA ein Operon, zusammen mit argS (Arginil-tRNA-Synthasegen) und lysA existiert stromabwärts von argS. Die Expression von lysA ist durch einen Promotor reguliert, der stromaufwärts von argS vorhanden ist (siehe Journal of Bacteriology, Nov., 7356-7362 (1993)). DNA-Sequenzen dieser Gene sind für Corynebacterium glutamicum (siehe Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)) auf deren Basis DNA-Primer zur PCR hergestellt werden können. Solche DNA-Primer sind speziell beispielhaft durch DNA mit einer Länge von 23, die jeweils Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 16 der Sequenzliste (entsprechend den Nukleotidnummern 11 bis 33 in der Nukleotidsequenz, die in Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990)) und SEQ ID NO: 17 (entsprechend den Nukleotidnummern 1370 bis 1392 in der Nukleotidsequenz, die in Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988) beschrieben ist) aufweisen. DNA-Synthese, PCR und Herstellung eines Plasmids, enthaltend erhaltenes lysA, können auf die gleiche Weise wie oben für lysC beschrieben, hergestellt werden.
In einem später beschriebenen Beispiel wurde ein DNA-Fragment, enthaltend einen Promotor, argS und lysA verwendet, um lysA zu verbessern. Erfindungsgemäß ist argS jedoch nicht wesentlich. Es ist erlaubt, ein DNA-Fragment zu verwenden, bei dem lysA genau stromabwärts eines Promotors ligiert ist.
Eine Nukleotidsequenz eines DNA-Fragmentes, enthaltend argS und lysA, und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wird, sind in SEQ ID NO: 18 gezeigt. Ein Beispiel einer Aminosäuresequenz, die durch argS codiert ist, ist in SEQ ID NO: 19 gezeigt und ein Beispiel einer Aminosäuresequenz, die durch lysA codiert ist, ist in SEQ ID NO: 20 gezeigt. Zusätzlich zu den DNA-Fragmenten, die diese Aminosäuresequenzen codieren, können erfindungsgemäß äquivalente DNA-Fragmente verwendet werden, die Aminosäuresequenzen codieren, die im wesentlichen mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 20 gezeigt ist, übereinstimmen, nämlich Aminosäuresequenzen mit Mutation auf Basis von z.B. Substitution, Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren vorausgesetzt, dass sie keinen wesentlichen Einfluss auf die DDC-Aktivität aufweisen. Das lysA mit spontaner oder künstlicher Mutation kann auf die gleiche Weise erhalten werden wie DNA, die AK mit Mutation codieren, und die keinen Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensibilisierung der synergistischen Feedbackinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin aufweisen.
(5) Herstellung von aspC
Ein DNA-Fragment, enthaltend aspC kann aus einer Genbibliothek hergestellt werden, die aus Chromosom eines Mikroorganismus, wie eines coryneformen Bakteriums, und eines Bakteriums, das zur Gattung Escherichia gehört, hergestellt werden und zwar unter Verwendung von Komplementarität einer auxotrophen Eigenschaft eines AAT-mangelhaften Stammes als Indikator. Der DNA-Spender des coryneformen Bakteriums ist nicht besonders eingeschränkt, ist jedoch beispielhaft durch den Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm gezeigt. Der DNA-Spender des Bakteriums, das zur Gattung Escherichia gehört, ist nicht besonders eingeschränkt, ist jedoch beispielhaft durch den E. coli JM109-Stamm gezeigt.
Ein Verfahren zur Herstellung von aspC aus coryneformen Bakterien ist speziell bekannt (japanische Patentveröffentlichungsnummer 6-102028) und aspC kann gemäß diesem Verfahren hergestellt werden.
Eine DNA-Sequenz, die AAT codiert, ist für E. coli (Kuramitsu, S. et al., J. Biochem., 97(4), 1259-1262 (1985)) bekannt und auf dessen Basis können Primer zur PCR hergestellt werden. Solche DNA-Primer sind speziell durch DNA mit einer Länge von 20 gezeigt, jeweils mit Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 21 und 22 der Sequenzliste veranschaulicht sind. Die DNA-Synthese PCR und Herstellung eines Plasmids, enthaltend erhaltenes aspC, können auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie oben für lysC beschrieben.
Eine Nukleotidsequenz eines DNA-Fragmentes, enthaltend aspC und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind in SEQ ID NO: 23 gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 24 gezeigt. Eine andere Nukleotidsequenz eines DNA-Fragmentes, enthaltend aspC, und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind in SEQ ID NO: 30 gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 31 gezeigt. Zusätzlich zu den DNA-Fragmenten, die diese Aminosäuresequenz codieren, können erfindungsgemäß äquivalente DNA-Fragmente verwendet werden, die Aminosäuresequenzen codieren, die im wesentlichen mit der in SEQ ID NO: 24 oder 31 gezeigten Aminosäuresequenz übereinstimmen, nämlich Aminosäuresequenzen mit Mutation auf Basis von z.B. Substitution, Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren, vorausgesetzt, dass sie keinen wesentlichen Einfluss auf die AAT-Aktivität haben. Das aspC mit spontaner oder künstlicher Mutation kann auf die gleiche Weise hergestellt werden wie DNA, die AK mit Mutation codieren, und die keinen Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensibilisierung von synergistischer Feedbackinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin aufweisen.
Das aspC mit der in SEQ ID NO: 30 gezeigten Nukleotidsequenz stammt vom Corynebacterium lactofermentum und wurde erfindungsgemäß erstmals durch das nachfolgend in Beispiel 9 beschriebene Verfahren erhalten. Die Erfindung stellt eine DNA bereit, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 31 gezeigt ist, umfasst. Ein Beispiel der DNA umfasst eine DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz der Nukleotidzahlen 879 bis 2174 der in SEQ ID NO: 30 gezeigten Nukleotidsequenz.
2. Rekombinante DNA und coryneformes Bakterium der Erfindung
Das erfindungsgemäße coryneforme Bakterium beherbergt eine Aspartokinase (mutante AK), bei der die Feedbackinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin wesentlich desensibilisiert ist, wobei die DNA-Sequenz, die ein Dihydrodipicolinatreduktase codiert, die DNA-Sequenz, die eine Dihydrodipicolinatsynthase codiert, die DNA-Sequenz, die eine Diaminopimelatdecarboxylase codiert, und die DNA-Sequenz, die eine Aspartataminotransferase codiert, verbessert sind.
Der Ausdruck "verbessert" betrifft hier die Tatsache, dass die intrazelluläre Aktivität eines Enzyms, das durch die DNA codiert ist, erhöht ist, und zwar durch z.B. Erhöhen der Kopienanzahl eines Gens, unter Verwendung eines starken Promotors, unter Verwendung eines Gens, das ein Enzym mit einer hohen spezifischen Aktivität codiert oder durch Kombinieren dieser Mittel.
Das coryneforme Bakterium, das die Mutante AK beherbergt, kann eines sein, das die Mutante Aspartokinase als Ergebnis einer Mutation herstellt oder eines, das durch Einführen von mutantem lysC transformiert ist.
Beispiele des coryneformen Bakteriums, das zum Einführen der oben beschriebenen DNA verwendet wird, umfasst z.B. die folgenden, Lysin herstellenden Stämme vom Wildtyp:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;
Corynebacterium callunae ATCC 15991;
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;
(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;
(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;
(Corynebacterium lilium) ATCC 15990;
(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
Corynebacterium melassecola ATCC 17965;
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;
Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
Außer den oben beschriebenen Bakterienstämmen umfassen solche, die als Wirt verwendbar sind, z.B. mutante Stämme mit einer L-Lysin herstellenden Fähigkeit, die von den zuvor erwähnten Stämmen abstammt. Solche künstlichen mutanten Stämme umfassen die Folgenden: S-(2-Aminoethyl)cystein (hiernach als "AEC" abgekürzt) resistente mutante Stämme (z.B. Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147), japanische Patentveröffentlichungen Nr. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 und 7-112438); mutante Stämme, die eine Aminosäure, wie L-Homoserin, für deren Wachstum benötigen (japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 48-28078 und 56-6499), mutante Stämme, die Resistenz gegen AEC entfalten und Aminosäuren, wie L-Leucin, L-Homoserin, L-Prolin, L-Serin, L-Arginin, L-Alanin und L-Valin (Vereinigte Staaten Patente Nrn. 3,708,395 und 3,825,472) benötigen, L-Lysin herstellende mutante Stämme, die Resistenz gegen DL-α- amino-ε-caprolactam, α-Aminolauryllactam, Aspartat-analog, Sulfa-Medikament, Chinoid und N-Lauroylleucin entfalten; L-Lysin herstellende mutante Stämme, die Resistenz gegen Inhibitoren von Oxyaloacetatdecarboxylase oder Enzym des Atmungssystems entfalten (japanische offengelegte Patentanmeldung Nrn. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 und 56-39778, und japanische Patentveröffentlichung Nrn. 53-43591 und 53-1833); L-Lysin herstellende mutante Stämme, die Inositol oder Essigsäure benötigen (japanische offengelegte Patentanmeldung Nrn. 55-9784 und 56-8692), L-Lysin herstellende mutante Stämme, die Empfindlichkeit für Fluorbrenztraubensäure oder für eine Temperatur von nicht weniger als 34°C aufweisen (japanische offengelegte Patentanmeldung Nrn. 55-9783 und 53-86090) und herstellende mutante Stämme, die zur Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium gehören, die Resistenz gegen Ethylenglycol entfalten und L-Lysin herstellen (Patent der Vereinigten Staaten Nr. 4,411,997).
In einer spezifizierten Ausführungsform zur Verstärkung der Gene der L-Lysin-Biosynthese in dem Wirt, wie oben beschrieben, werden die Gene in den Wirt unter Verwendung eines Plasmidvektors, Transposons oder Phagenvektors oder dergleichen eingeführt. Nach der Einführung wird in einem gewissen Ausmaß eine Verstärkung erwartet, sogar unter Verwendung eines Vektors vom vervielfältigungsarmen Typ. Es ist jedoch bevorzugt, einen Vektor vom Mehrfachvervielfältigungstyp zu verwenden. Ein solcher Vektor umfasst z.B. die Plasmidvetoren, pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 und pAJ440, die oben beschrieben sind. Außerdem sind Transposone, die von coryneformen Bakterien abstammen, beschrieben in den internationalen Veröffentlichungsschriften WO 02/02627 und WO 93/18151, dem europäischen Patent, Veröffentlichungsnummer 445385, der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 6-46867, Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994), Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994), Vertes, A. A. et al., Mol.
Gen.Genet., 245, 397-405 (1994), Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995), der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 7-107976, der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 7-327680 und dergleichen.
Erfindungsgemäß ist es nicht unabkömmlich, dass das mutante lysC notwendigerweise verstärkt ist. Es ist erlaubt, solche zu verwenden, bei denen die chromosomale DNA von lysC eine Mutation aufweist oder bei denen mutantes lysC in die chromosomale DNA eingeführt ist. Alternativ kann mutantes lysC unter Verwendung eines Plasmidvektors eingeführt werden. Auf der anderen Seite werden dapA, dapB, lysA und aspC bevorzugt verbessert, um effizient L-Lysin herzustellen.
Die lysC-, dapA-, dapB-, lysA- und aspC-Gene können erfolgreich in den Wirt unter Verwendung verschiedener Vektoren jeweils eingeführt werden. Alternativ können zwei, drei, vier oder fünf Arten von Genen zusammen unter Verwendung eines einzelnen Vektors eingeführt werden. Wenn verschiedene Vektoren verwendet werden, können die Gene in jeder Reihenfolge eingeführt werden, es ist jedoch bevorzugt, Vektoren zu verwenden, die einen stabilen Benutzungs- und Beherbergungsmechanismus in dem Wirt aufweisen, und die nebeneinander bestehen können.
Vor allem wird als Vektor zum Einführen von aspC in coryneforme Bakterien, ein Vektor pVK7 bevorzugt verwendet. Der Vektor pVK7 ist ein Klonierungsvektor für coryneforme Bakterien, der erfindungsgemäß bereitgestellt wird und der in Escherichia coli- und Brevibacterium lactofermentum-Zellen autonom replizierbar ist und eine Mehrfachklonierungsstelle und lacZ' umfasst. Der Vektor pVK7 kann gemäß dem nachfolgend in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren erzeugt werden.
Ein coryneformes Bakterium, das mutante AK beherbergt und außerdem verbessertes dapB, dapA, lysA und aspC umfasst, wird z.B. erhalten durch Einführen einer rekombinanten DNA, die mutantes lysC und dapB, dapA, lysA und aspC, autonom in Zellen von coryneformen Bakterien replizierbar, in einen Wirt, ein coryneformes Bakterium, erhalten wird.
Die oben erwähnten rekombinanten DNAs können z.B. erhalten werden durch Einführung jedes der Gene, die an der L-Lysin-Biosynthese teilnimmt, in einen Vektor, wie einen Plasmidvektor, ein Transposon oder einen Phagenvektor, wie oben beschrieben.
In dem Fall, in dem ein Plasmid als Vektor verwendet wird, kann die rekombinante DNA in den Wirt gemäß einem elektrischen Impulsverfahren eingeführt werden (Sugimoto et al., offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2-207791). Die Amplifikation eines Gens unter Verwendung von Transposon kann erreicht werden durch Einführen eines Plasmids, das ein Transposon trägt in die Wirtszelle und Auslösen der Transposition des Transposons.
In den erfindungsgemäß verwendeten coryneformen Bakterien kann ein Gen, das an der L-Lysin-Biosynthese teilnimmt, wie eine DNA, die Phosphoenolpyruvatcarboxylase codiert und ein Gen, das Diaminopimelatdehydrogenase codiert, zusätzlich zu den oben erwähnten Genen verstärkt werden.
3. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
L-Lysin kann effizient hergestellt werden durch Kultivieren des coryneformen Bakteriums, das die verbesserten Gene der L-Lysin-Biosynthese, wie oben beschrieben, umfasst in einem geeigneten Medium, so dass L-Lysin hergestellt und in einer Kultur des Bakteriums angehäuft und L-Lysin aus der Kultur gesammelt werden kann.
Das verwendete Medium wird beispielhaft durch ein gewöhnliches Medium dargestellt, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und wahlweise andere organische Komponenten enthält.
Als Kohlenstoffquelle ist es möglich, Zucker, wie Glucose, Fructose, Sucrose, Melassen und Stärkehydrolysat und organische Säuren, wie Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure (succinic acid, diktiert Succininsäure) zu verwenden.
Als Stickstoffquelle ist es möglich, anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organischen Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolat, Ammoniakgas und wässriges Ammoniak zu verwenden.
Als organische Spurennährstoffquelle ist es wünschenswert, dass erforderliche Substanzen enthalten sind, wie Vitamin B1 und L-Homoserin oder Hefeextrakt oder dergleichen in geeigneten Mengen. Außer den oben beschriebenen werden Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenion, Manganion usw. in kleinen Mengen, wenn notwendig, zugegeben.
Die Kultivierung wird bevorzugt bei aeroben Bedingungen ungefähr 30 bis 90 Stunden durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wird bevorzugt bei 25°C bis 37°C gehalten und der pH wird bevorzugt bei 5 bis 8 während der Kultivierung eingerichtet. Anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen oder Ammoniakgas oder dergleichen können zur pH-Anpassung verwendet werden. L-Lysin kann aus einer Kultur gesammelt werden durch Kombinieren eines gewöhnlichen Ionenaustauscherharzverfahrens, eines Ausfällungsverfahrens und anderer bekannter Verfahren.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird hiernach unter Bezugnahme auf die Beispiele besonders erläutert.
Beispiel 1: Herstellung des lysC-Gens vom Wildtyp und des mutanten lysC-Gens aus Brevibacterium lactofermentum
1. Herstellung von Wildtyp- und mutantem lysC und Herstellung von Plasmiden, die diese enthalten
Ein Brevibacterium lactofermentum-Stamm ATCC 13869 und ein L-Lysin herstellender mutanter Stamm AJ3445 (FERM P-1944), der durch eine Mutationsbehandlung aus dem ATCC 13869-Stamm erhalten wurde, werden als chromosomale DNA-Spender verwendet. Der Stamm AJ3445 ist einer Mutation unterworfen worden, so dass lysC geändert wurde, um eine wesentliche Desensibilisierung mittels konzertierter Inhibition durch Lysin und Threonin zu verursachen (Journal of Biochemistry, 68, 701-710 (1970)).
Ein DNA-Fragment, enthaltend lysC, wurde von der chromosomalen DNA gemäß dem PCR-Verfahren amplifiziert (Polymerasekettenreaktion; siehe White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)). Als zur Amplifikation verwendete DNA-Primer wurden einzelsträngige DNAs mit einer Länge von 23 und 21, die Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigt sind, aufweisen, synthetisiert, um einen Bereich von ungefähr 1.643 Bp zu amplifizieren, der lysC codiert, auf Basis einer Sequenz, die für Corynebacterium glutamicum bekannt ist (siehe Molecular Microbiology (1991), 5(5), 1197-1204; und Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). DNA wurde gemäß einem gewöhnlichen Verfahren unter Verwendung eines DNA-Synthetisiermodells 380B, hergestellt von Applied Biosystems und unter Verwendung des Phosphoamiditverfahrens (siehe Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859) synthetisiert.
Das Gen wurde durch PCR unter Verwendung des DNA-thermalen Cyclers, Modell PJ2000, hergestellt von Takara Shuzo, und unter Verwendung der Taq DNA-Polymerase gemäß einem von dem Anbieter angebetenen Verfahrens amplifiziert. Ein amplifiziertes Genfragment von 1.643 kB wurde durch Agarosegelelektrophorese bestätigt. Danach wurde das aus dem Gel herausgeschnittene Fragment gemäß einem gewöhnlichen Verfahren gereinigt und es wurde mit den Restriktionsenzymen NruI (hergestellt von Takara Shuzo) und EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut.
pHSG399 (siehe Takeshita, S. et al., Gene (1987), 61, 63-74) wurde als Klonierungsvektor für das Genfragment verwendet. pHSG399 wurde mit den Restriktionsenzymen SmaI (hergestellt von Takara Shuzo) und EcoRI verdaut und wurde mit dem amplifizierten lysC-Fragment ligiert. DNA wurde unter Verwendung des DNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß einem vorgesehenen Verfahren ligiert. Folglich wurden Plasmide hergestellt, bei denen die lysC-Fragmente, die von dem Chromosomen von Brevibacterium lactofermentum amplifiziert sind, jeweils mit pHSG399 ligiert wurden. Ein Plasmid, umfassend lysC aus ATCC 13869 (Wildtyp-Stamm) wurde als p399AKY bezeichnet und ein Plasmid, umfassend lysC aus AJ3463 (L-Lysin herstellendes Bakterium) wurde als p399AK9 bezeichnet.
Ein DNA-Fragment (hiernach als "Brevi.-ori" bezeichnet) mit der Fähigkeit, ein Plasmid in Bakterien, die zu der Gattung Corynebacterium gehören, autonom replizierbar zu machen, wurde jeweils in p399AKY und p399AK9 eingeführt, um Plasmide herzustellen, die lysC tragen und in Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium gehören, autonom replizierbar sind. Brevi.-ori wurde hergestellt aus einem Plasmidvektor pHK4, enthaltend Brevi.-ori und der in Zellen von sowohl Escherichia coli als auch in Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium gehören, autonom replizierbar ist. pHK4 wurde hergestellt durch Verdau von pHC4 mit KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) und BamHI, (hergestellt von Takara Shuzo), Extrahieren eines Brevi.-ori-Fragmentes und Ligieren desselben mit pHSG298, das ebenfalls mit KpnI und BamHI verdaut worden war (siehe offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-7491). pHK4 verleiht dem Wirt Kanamycinresistenz. Escherichia coli, das pHK4 beherbergt, wurde als Escherichia coli AJ13136 bezeichnet und am 01. August 1995 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5186 hinterlegt bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan).
pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut und die gespalteten Ränder wurden mit stumpfen Enden versehen. Die Bildung von stumpfen Enden wurde durchgeführt unter Verwendung des DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß einem vorgesehenen Verfahren. Nach der Bildung von stumpfen Enden wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu bewirken, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 durch Verdau mit nur BamHI herausgeschnitten werden könnte. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399AKY ligiert und p399AK9 wurde ebenfalls mit BamHI verdaut, um jeweils Plasmide herzustellen, wobei jedes das lysC-Gen enthält und in Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium gehören, autonom replizierbar sind.
Ein Plasmid, enthaltend das Wildtyp-lysC-Gen, abstammend von p399AKY, wurde als p399AKYB bezeichnet und ein Plasmid, enthaltend das mutante lysC-Gen, abstammend von p399AK9, wurde als p399AK9B bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von p399AK9B und p399AKYB ist in 1 gezeigt. Ein Stamm AJ12691, erhalten durch Einführen des mutanten lysC-Plasmids p399AK9B in einen Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum (AJ12036-Stamm, FERM BP-734) wurde am 10. April 1992 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-12918 hinterlegt bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) und wurde in eine internationale Hinterlegung auf Basis des Budapester Vertrages am 10. Februar 1995 übertragen und unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4999 hinterlegt.
2. Bestimmung der Nukleotidsequenzen von Wildtyp-lysC und mutantem lysC aus Brevibacterium lactofermentum
Das Plasmid p399AKY, enthaltend Wildtyp-lysC, und das Plasmid p399AK9, enthaltend mutantes lysC, wurden aus den jeweiligen Transformanten hergestellt, um die Nukleotidsequenzen von Wildtyp lysC und mutantem lysC zu bestimmen. Die Nukleotidsequenzbestimmung wurde gemäß einem Verfahren von Sanger et al. durchgeführt (z.B. F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)).
Die Nukleotidsequenz von Wildtyp-lysC, die durch p399AKY codiert ist, ist in SEQ ID NO: 3 der Sequenzliste gezeigt. Auf der anderen Seite wies die Nukleotidsequenz von mutantem lysC, das durch p399AK9 codiert ist, nur eine Mutation von einem Nukleotid auf, so dass das 1051ste G in ein A in SEQ ID NO: 3 im Vergleich zum Wildtyp-lysC geändert wurde. Es ist bekannt, dass lysC aus Corynebacterium glutamicum zwei Untereinheiten (α, β) aufweist, die von einem identischen Leserahmen auf einem identischen DNA-Strang codiert sind (siehe Kalinowski, J. et al., Molecular Microbiology (1991) 5(5), 1197-1204). Nach der Homologie zu urteilen wird angenommen, dass das hier sequenzierte Gen auch zwei Untereinheiten (α, β) aufweist, die von einem identischen Leserahmen auf einem identischen DNA-Strang codiert sind.
Eine Aminosäuresequenz der α-Untereinheit des Wildtyp-AK-Proteins, die von der Nukleotidsequenz der DNA abgeleitet ist, ist in SEQ ID NO: 4 zusammen mit der DNA-Sequenz gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt. Eine Aminosäuresequenz der β-Untereinheit des Wildtyp-AK-Proteins, die von der Nukleotidsequenz der DNA abgeleitet ist, ist in SEQ ID NO: 6 zusammen mit der DNA-Sequenz gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt. Bei jeder der Untereinheiten wird GTG als Anfangscodon verwendet und eine entsprechende Aminosäure ist durch Methionin dargestellt. Diese Darstellung bezieht sich jedoch auf Methionin, Valin oder Formylmethionin.
Auf der anderen Seite bedeutet eine Mutation auf der Sequenz von mutantem lysC das Auftreten einer Aminosäurerestsubstitution, wie z.B. das der 279zigste Alaninrest der α-Untereinheit in einen Threoninrest geändert wird und ein 30igste Alaninrest der β-Untereinheit in einen Threoninrest in der Aminosäuresequenz des Wildtyp-AK-Proteins (SEQ ID NO: 5, 7) geändert wird.
Beispiel 2: Herstellung von dapB aus Brevibacterium lactofermentum
1. Herstellung von dapB und Herstellung des Plasmids, enthaltend dapB
Ein Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde als chromosomaler DNA-Spender verwendet. Chromosomale DNA wurde hergestellt aus dem ATCC 13869-Stamm gemäß einem gewöhnlichen Verfahren. Ein DNA-Fragment, enthaltend dapB, wurde aus der chromosomalen DNA gemäß PCR amplifiziert. Als DNA-Primer, die zur Amplifizierung verwendet wurden, wurden jeweils DNA mit einer Länge von 23, die Nukleotidsequenzen, der SEQ ID NO: 8 und 9 der Sequenzliste aufweisen, synthetisiert, um einen Bereich von ungefähr 2,0 kB, der DDPR codiert, zu amplifizieren und zwar auf Basis einer Sequenz, die für Brevibacterium lactofermentum bekannt ist (siehe Journal of Bacteriology, 175(9), 2743-2749 (1993)). Die DNA-Synthesen und PCR wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. pCR-Script (hergestellt von Invitrogen) wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment von 2.001 Bp verwendet und wurde mit dem amplifizierten dapB-Fragment ligiert. Folglich wurde ein Plasmid hergestellt, bei dem das dapB-Fragment von 2.001 Bp, das aus dem Chromosom von Brevibacterium lactofermentum amplifiziert wurde, mit dem pCR-Script ligiert ist. Das wie oben beschrieben erhaltene Plasmid, das dapB, abstammend von ATCC 13869 aufwies, wurde als pCRDAPB bezeichnet. Ein transformanter Stamm AJ13107, der durch Einführen von pCRDAPB in den E. coli-Stamm JM109 erhalten wurde, ist seit dem 26. Mai 1995 international auf Basis des Budapester Vertrages unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5114 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) hinterlegt.
Ein Fragment von 1.101 Bp, enthaltend ein strukturelles DDPR-Gen, wurde durch Verdau von pCRDAPB mit EcoRV und SphI extrahiert. Dieses Fragment wurde mit pHSG399, das mit HincII und SphI verdaut worden war, ligiert, um ein Plasmid herzustellen. Das hergestellte Plasmid wurde als p399DPR bezeichnet.
Brevi.-ori wurde in das hergestellte p399DPR eingeführt, um ein Plasmid zu erzeugen, das dapB trägt und in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. pHK4 wurde mit einem Restriktionsenzym KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und die gespaltenen Ränder wurden mit stumpfen Ende versehen. Die Bildung von stumpfen Ende wurde durchgeführt unter Verwendung des DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß einem vorgesehenen Verfahren. Nach der Bildung von stumpfen Enden wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu bewirken, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 durch Verdau mit nur BamHI ausgeschnitten werden konnte. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399DPR, das ebenfalls mit BamHI verdaut worden war, ligiert, um ein Plasmid herzustellen, das dapB enthält und in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. Das hergestellte Plasmid wurde als pDPRB bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von pDPRB ist in 2 gezeigt.
2. Bestimmung der Nukleotidsequenz von dapB aus Brevibacterium lactofermentum
Plasmid-DNA wurde aus dem AJ13107-Stamm, der p399DPR beherbergt, hergestellt und deren Nukleotidsequenz wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Eine bestimmte Nukleotidsequenz und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind in SEQ ID NO: 10 gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 11 gezeigt.
Beispiel 3: Herstellung von dapA aus Brevibacterium lactofermentum
1. Herstellung von dapA und Herstellung des Plasmids, enthaltend dapA
Ein Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde als chromosomaler DNA-Spender verwendet. Chromosomale DNA wurde hergestellt aus dem ATCC 13869-Stamm gemäß einem gewöhnlichen Verfahren. Ein DNA-Fragment, enthaltend dapA, wurde aus der chromosomalen DNA gemäß PCR amplifiziert. Als DNA-Primer, die für die Amplifizierung verwendet wurden, wurden jeweils DNA mit einer Länge von 23, die Nukleotidsequenzen, die die SEQ ID NO: 12 und 13 der Sequenzliste aufweisen, synthetisiert, um einen Bereich von ungefähr 1,5 kB, der DDPS codiert, zu amplifizieren, und zwar auf Basis einer Sequenz, die für Corynebacterium glutamicum bekannt ist (siehe Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL Zugangsnummer X53993). DNA-Synthese und PCR wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. pCR1000 (hergestellt von Invitrogen, siehe Bio/Technology, 9, 657-663 (1991)) wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment von 1.411 Bp verwendet und wurde mit dem aplifizierten dapA-Fragment ligiert. Die Ligation der DNA wurde unter Verwendung des DNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß einem vorgesehenen Verfahren durchgeführt. Folglich wurde ein Plasmid hergestellt, bei dem das dapA-Fragment von 1.411 Bp., das aus dem Chromosom von Brevibacterium lactofermentum amplifiziert ist, mit pCR1000 ligiert. Das wie oben beschrieben erhaltene Plasmid, das dapA, abstammend von ATCC 13869 aufwies, wurde als pCRDAPA bezeichnet.
Ein transformanter Stamm AJ13106, erhalten durch Einführen von pCRDAPA in den E. coli-Stamm JM109, ist auf Basis des Budapester Vertrages seit dem 26. Mai 1995 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5113 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) hinterlegt.
Brevi.-ori wurde eingeführt in den hergestellten pCRDAPA, um ein Plasmid herzustellen, das dapA trägt und in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und die gespaltenen Ränder wurden mit stumpfen Enden versehen. Die Bildung von stumpfen Enden wurde unter Verwendung des DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß einem vorgesehenen Verfahren durchgeführt. Nach der Bildung von stumpfen Enden wurde ein phosphorylierter SmaI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifikation zu bewirken, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 durch Verdau mit nur SmaI ausgeschnitten werden könnte. Dieses Plasmid wurde mit SmaI verdaut und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit pCRDAPA, das ebenfalls mit SmaI verdaut worden war, ligiert, um ein Plasmid herzustellen, das dapA enthält und autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Dieses Plasmid wurde als pDPSB bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von pDPSB(Km^r) ist in 3 gezeigt.
2. Bestimmung der Nukleotidsequenz von dapA aus Brevibacterium lacofermentum
Die Plasmid-DNA wurde aus dem Stamm AJ13106 hergestellt, der pCRDAPA beherbergt, und deren Nukleotidsequenz wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Eine bestimmte Nukleotidsequenz und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind in SEQ ID NO: 14 gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 15 gezeigt.
Beispiel 4: Herstellung von lysA aus Brevibacterium lactofermentum
1. Herstellung von lysA und Herstellung des Plasmids, enthaltend lysA
Ein Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde als chromosomaler DNA-Spender verwendet. Die chromosomale DNA wurde aus dem Stamm ATCC 13869 gemäß einem gewöhnlichen Verfahren hergestellt. Ein DNA-Fragment, enthaltend argS, lysA und einen Promotor eines Operons, enthaltend denselben, wurden aus der chromosomalen DNA gemäß PCR amplifiziert. Als DNA-Primer, die zur Amplifizierung verwendet wurden, wurden jeweils synthetische DNA mit einer Länge von 23, die Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 16 und 17 der Sequenzliste aufweisen, verwendet, um einen Bereich von ungefähr 3,6 kB, der Arginyl-tRNA-Synthase und DDC codiert, zu amplifizieren, und zwar auf Basis einer Sequenz, die für Corynebacterium glutamicum (siehe Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990); Molecular und General Genetics, 212, 112-119 (1988)) bekannt ist. Die DNA-Synthese und PCR wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. pHSG399 wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment von 3.579 Bp verwendet. pHSG399 wurde mit einem Restriktionsenzym SmaI (hergestellt von Takara Shuzo), das mit dem DNA-Fragment, enthaltend lysA, ligiert war, verdaut. Ein Plasmid, das wie oben beschrieben erhalten wurde, und das lysA, abstammend von ATCC 13869, aufwies, wurde als p399LYSA bezeichnet.
Ein DNA-Fragment, enthaltend lysA, wurde durch Verdau von p399LYSA mit KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) und BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) extrahiert. Dieses DNA-Fragment wurde mit pHSG299, das mit KpnI und BamHI verdaut worden war, ligiert. Ein erhaltenes Plasmid wurde als p299LYSA bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von p299LYSA ist in 4 gezeigt.
Brevi.-ori wurde in das erhaltene p299LYSA eingeführt, um ein Plasmid herzustellen, das lysA trägt und in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut und die gespaltenen Ränder wurden mit stumpfen Enden versehen. Die Bildung von stumpfen Enden wurde unter Verwendung des DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß einem vorgesehenen Verfahren durchgeführt. Nach der Bildung von stumpfen Enden wurde ein phosphorylierter KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu bewirken, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 durch Verdau mit nur KpnI ausgeschnitten werden konnte. Dieses Plasmid wurde mit KpnI verdaut und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p299LYSA, das ebenfalls mit KpnI verdaut worden war, ligiert, um ein Plasmid herzustellen, das lysA enthält und in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. Das hergestellte Plasmid wurde als pLYSAB bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von pLYSAB ist in 5 gezeigt.
2. Bestimmung der Nukleotidsequenz von lysA aus Brevibacterium lactofermentum
Die Plasmid-DNA aus p299LYSA wurde hergestellt und deren Nukleotidsequenz wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Eine bestimmte Nukleotidsequenz und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind in SEQ ID NO: 18 gezeigt. Betreffend die Nukleotidsequenz sind eine Aminosäuresequenz, die durch argS codiert ist und eine Aminosäuresequenz, die durch lysA codiert ist, in SEQ ID NO: 19 und 20 jeweils gezeigt.
Beispiel 5: Herstellung von aspC aus Escherichia coli und Herstellung des Plasmids, enthaltend aspC
Ein Escherichia coli JM109-Stamm wurde als chromosomaler DNA-Spender verwendet. Chromosomale DNA wurde aus dem E. coli JM109-Stamm gemäß einem gewöhnlichen Verfahren hergestellt. Ein DNA-Fragment, enthaltend aspC, wurde aus der chromosomalen DNA gemäß PCR amplifiziert. Als DNA-Primer, die bei der Amplifizierung verwendet werden, wurden synthetische DNAs mit einer Länge von 20, die Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 21 und 22 der Sequenzliste gezeigt sind, jeweils verwendet und zwar auf Basis einer Sequenz, die für E. coli bekannt ist (siehe Kuramitsu, S. et al., J. Biochem., 97(4), 1259-1262 (1985)). Die DNA-Synthese und PCR wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Das amplifizierte Fragment von 1.331 Bp wurde in den TA-Klonierungsvektor pCR1000 kloniert. Das erzeugte Plasmid wurde als pCRASPC bezeichnet.
Eine Nukleotidsequenz der amplifizierten DNA, enthaltend aspC, und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind in SEQ ID NO: 23 gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 24 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 1: Herstellung eines Plasmids, umfassend eine Kombination aus mutantem lysC und dapA
Ein Plasmid, umfassend mutantes lysC, dapA und einen Replikationsursprung von coryneformen Bakterien, wurde hergestellt aus dem Plasmid pCRDAPA, umfassend dapA, und dem Plasmid p399AK9B, umfassend mutantes lysC und Brevi.-ori. p399AK9B wurde vollständig mit SalI verdaut und anschließend mit stumpfen Enden versehen und wurde mit einem EcoRI-Linker ligiert, um ein Plasmid herzustellen, bei dem die SalI-Stelle in eine EcoRI-Stelle modifiziert wurde. Das erhaltene Plasmid wurde als p399AK9BSE bezeichnet. Das mutante lysC und Brevi.-ori wurden aus einem Fragment durch Teilverdau von p399AK9BSE mit EcoRI herausgeschnitten. Dieses Fragment wurde mit pCRDAPA ligiert, das mit EcoRI verdaut worden war. Das erhaltene Plasmid wurde als pCRCAB bezeichnet. Dieses Plasmid ist in E. coli und in coryneformen Bakterien autonom replizierbar und verleiht einem Wirt Kanamycinresistenz, wobei das Plasmid eine Kombination aus mutantem lysC und dapA umfasst. Das Herstellungsverfahren von pCRCAB ist in 6 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 2: Herstellung eines Plasmids, umfassend die Kombination von mutantem lysC und dapB
Ein Plasmid, umfassend mutantes lysC und dapB wurde aus dem Plasmid p399AK9 mit mutantem lysC und dem Plasmid p399DPR mit dapB hergestellt. Ein Fragment von 1.101 Bp, enthaltend ein strukturelles DDPR-Gen, wurde durch Verdau von p399DPR mit EcoRV und SphI extrahiert. Dieses Fragment wurde mit p399AK9, das mit SalI verdaut worden war, ligiert und anschließend mit stumpfen Enden versehen und weiter mit SphI verdaut, um ein Plasmid herzustellen, das eine Kombination aus mutantem lysC und dapB umfasst. Dieses Plasmid wurde als p399AKDDPR bezeichnet.
Anschließend wurde Brevi.-ori in das erhaltene p399AKDDPR eingeführt. Das Plasmid pHK4, enthaltend Brevi.-ori, wurde mit dem Restriktionsenzym KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und die gespaltenen Ränder wurden mit stumpfen Enden versehen. Die Bildung von stumpfen Enden wurde unter Verwendung des DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß einem vorgesehenen Verfahren durchgeführt. Nach der Bildung von stumpfen Enden wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifikation zu bewirken, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 durch Verdau mit nur BamHI herausgeschnitten werden konnte. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399AKDDPR, das auch mit BamHI verdaut worden war, ligiert, um ein Plasmid herzustellen, das mutantes lysC und dapB enthält und in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. Das erzeugte Plasmid wurde als pCB bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von pCB ist in 7 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 3: Herstellung eines Plasmids, das eine Kombination von dapA und dapB umfasst
Das Plasmid pCRDAPA, umfassend dapA, wurde mit KpnI und EcoRI verdaut, um ein DNA-Fragment zu extrahieren, das dapA enthält und wurde mit dem Vektorplasmid pHSG399, der mit KpnI und EcoRI verdauten worden war, ligiert. Ein erhaltenes Plasmid wurde als p399DPS bezeichnet.
Auf der anderen Seite wurde das Plasmid pCRDAPB, umfassend dapB, mit SacII und EcoRI verdaut, um ein DNA-Fragment von 2,0 kB, enthaltend einen Bereich, der DDPR codiert, zu extrahieren und wurde mit p399DPS, das mit SacII und EcoRI verdaut worden war, ligiert, um ein Plasmid zu erzeugen, das eine Kombination aus dapA und dapB umfasst. Das erhaltene Plasmid wurde als p399AB bezeichnet.
Anschließend wurde Brevi.-ori in p399AB eingeführt. pHK4, enthaltend Brevi.-ori, wurde mit einem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und die gespaltenen Ränder wurden mit stumpfen Enden versehen. Die Bildung von stumpfen Enden wurde unter Verwendung des DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß einem vorgesehenen Verfahren durchgeführt. Nach der Bildung von stumpfen Enden wurde ein phosphorylierter KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifikation zu bewirken, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 durch Verdau mit nur KpnI herausgeschnitten werden konnte. Dieses Plasmid wurde mit KpnI verdaut und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399AB, das auch mit KpnI verdaut worden war, ligiert, um ein Plasmid zu erzeugen, das dapA und dapB enthält und autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das hergestellte Plasmid wurde als pAB bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von pAB ist in 8 gezeigt.
Beispiel 6: Herstellung eines Plasmids, das eine Kombination aus mutantem lysC, dapA und dapB umfasst
p399DPS wurde mit EcoRI und SphI verdaut und mit stumpfen Enden versehen, gefolgt von der Extraktion eines dapA-Genfragmentes. Dieses Fragment wurde mit p399AK9, das mit SalI verdaut worden war, ligiert und mit stumpfen Enden versehen, um ein Plasmid p399CA herzustellen, bei dem mutantes lysC und dapA zusammen vorkamen.
Das Plasmid pCRDAPB, umfassend dapB, wurde mit EcoRI verdaut und mit stumpfen Enden versehen, gefolgt von dem Verdau mit SacI, um ein DNA-Fragment von 2,0 kB, umfassend dapB, zu extrahieren. Das Plasmid p399CA, umfassend dapA und mutantes lysC, wurde mit SpeI verdaut und mit stumpfen Enden versehen und wurde danach mit SacI verdaut und mit dem extrahierten dapB-Fragment ligiert, um ein Plasmid zu erhalten, das mutantes lysC, dapA und dapB umfasst. Dieses Plasmid wurde als p399CAB bezeichnet.
Anschließend wurde Brevi.-ori in p399CAB eingeführt. Das Plasmid pHK4, umfassend Brevi.-ori, wurde mit einem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und die gespaltenen Ränder wurden mit stumpfen Enden versehen. Die Bildung von stumpfen Enden wurde unter Verwendung des DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß einem vorgesehenen Verfahren durchgeführt. Nach der Bildung von stumpfen Enden wurde ein phosphorylierter KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifikation zu bewirken, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 durch Verdau mit nur KpnI herausgeschnitten werden konnte. Dieses Plasmid wurde mit KpnI verdaut und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399CAB, das ebenfalls mit KpnI verdaut worden war, ligiert, um ein Plasmid zu erzeugen, das eine Kombination aus mutantem lysC, dapA und dapB umfasst und autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das hergestellte Plasmid wurde als pCAB bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von pCAB ist in 9 gezeigt.
Beispiel 7: Herstellung eines Plasmids, umfassend eine Kombination aus mutantem lysC, dapA, dapB und lysA
Das Plasmid p299LYSA, umfassend lysA, wurde mit KpnI und BamHI verdaut und mit stumpfen Enden versehen und anschließend wurde ein lysA-Genfragment extrahiert. Dieses Fragment wurde mit pCAB, das mit HpaI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und mit stumpfen Enden versehen worden war, ligiert, um ein Plasmid herzustellen, das eine Kombination aus mutantem lysC, dapA, dapB und lysA umfasst und autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das hergestellte Plasmid wurde als pCABL bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von pCABL ist in 10 gezeigt. Es ist zu bemerken, dass das lysA-Genfragment in eine HpaI-Stelle in einem DNA-Fragment, enthaltend das dapB-Gen in pCABL, eingeführt wird, jedoch befindet sich die HpaI-Stelle stromaufwärts eines Promotors des dapB-Gens (Nukleotidzahlen 611 bis 616 in SEQ ID NO: 10) und das dapB-Gen ist nicht entkoppelt.
Beispiel 8: Herstellung eines Plasmids, umfassend aspC
Als Vektor zum Einführen von aspC in coryneforme Bakterien wurde ein Klonierungsvektor für coryneforme Bakterien, pVK7, der neu erzeugt wurde, verwendet. pVK7 wurde, wie nachfolgend beschrieben, hergestellt durch Ligieren von pHSG299, einem E. coli-Vektor (Km^r; Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63-74 (1987)), mit pAM330, einem kryptischen Plasmid für Brevibacterium lactofermentum. pAM330 wurde aus dem Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm hergestellt. pHSG299 wurde mit einem Restriktionsenzym AvaII (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, was zu einer Spaltstelle führt, unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen und mit pAM330, das mit HindIII (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen worden war, ligiert. In Abhängigkeit der Orientierung des eingeführten pAM330 in pHSG299 wurden die zwei erhaltenen Plasmide als pVK6 und pVK7 bezeichnet und pVK7 wurde bei den nachfolgenden Experimenten verwendet. pVK7 ist sowohl in E. coli als auch in Brevibacterium lactofermentum autonom replizierbar und weist eine Mehrfachklonierungsstelle, die von pHSG299 abstammt und lacZ' auf. Das Herstellungsverfahren von pVK6 und pVK7 ist in 11 gezeigt.
Mit dem hergestellten Shuttlevektor pVK7 wurde aspC ligiert. pCRASPC wurde mit einem Restriktionsenzym EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und mit pVK7, das auch mit EcoRI verdaut worden war, ligiert. Die DNA-Ligierung wurde unter Verwendung des DNA-Ligierungskits (hergestellt von Takara Shuzo) durchgeführt. Unter denen, bei denen ein aspC-Fragment in pVK7 ligiert wurde, wurde eines, bei dem das Fragment in der gleichen Orientierung, wie der Transkriptionsorientierung des lac-Promotors, der in pVK7 verfügbar ist, eingeführt wurde, als pOm bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von pOm ist in 12 gezeigt.
Beispiel 9: Herstellung von aspC aus Brevibacterium lactofermentum
1. Herstellung von aspC abstammend von Brevibacterium lactofermentum
Ein Asparaginsäure auxotropher Stamm 102-7, der der Gattung Corynebacterium angehört, und der in aspC-Aktivität (AAT-Aktivität) mangelhaft war, um Asparaginsäure auxotroph zu sein (I. Shiio und K. Ujikawa, J. Biochem., 84, 647 (1978)), wurde transformiert durch Einführen einer Genbibliothek (internationale Veröffentlichung Nr. WO95/23224) hergestellt durch Ligieren verschiedener Fragmente der chromosomalen DNA vom Wildtyp ATCC 13869-Stamm von Brevibacterium lactofermentum mit einem Vektor, der in Zellen von Bakterien, die der Gattung Corynebacterium angehören, wirkt. Die erhaltenen Transformanten wurden gesammelt und mit destilliertem Wasser zweimal gewaschen. 10.000 der Transformanten wurde auf Agarplatten auf einem minimalen Medium, Medium 10, enthaltend keine Stickstoffquelle außer Ammoniak (I. Shiio und K. Ujikawa, J. Biochem., 84, 647 (1978)) aufgetragen, um Transformanten zu erhalten, die die Asparaginsäure-Auxotrophie wiederherstellen und ausgezeichnetes Wachstum auf der Platte zeigten. Plasmid-DNA wurde aus dem erhaltenen Fleck gewonnen, wobei die Asparaginsäure-Auxotrophie wieder hergestellt wurde, und das erhaltene Plasmid wurde als pAC bezeichnet. Beim Transformieren des Wildtyp-ATCC 13869-Stammes von Brevibacterium lactofermentum mit pAC wurde die aspC-Aktivität des Transformanten erhöht (Tabelle 1). Die Aktivitätsbestimmung wurde gemäß einem bekannten Verfahren durchgeführt (siehe Sizer, I.W. und Jenkins, W.T., Meth. Enzymol., Band 5, 677-679 (1962)).
Durch die Ergebnisse wurde bestätigt, dass das Fragment von ungefähr 2,5 kB der chromosomalen DNA des ATCC 13869-Stamms auf der Plasmid-DNA aspC von Brevibacterium lactofermentum enthielt.
Tabelle 1
2. Analyse von aspC, abstammend von Hrevibacterium lactofermentum
Die Nukleotidsequenz des 2,5 kB DNA-Fragmentes wurde gemäß dem Didesoxyverfahren von Sangar et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977) bestimmt. Die bestimmte Nukleotidsequenz wurde in SEQ ID NO: 25 gezeigt. Die Nukleotidsequenz wurde unter Verwendung des GENETYX-MAC, Version 7,3-Programmes (Software Kaihatsu KK) untersucht. Die Suche nach dem ORF (offenen Leserahmen) zeigte zwei ORFs, die in gegenüberliegender Orientierung überlappten, wie in 13 gezeigt. Der ORF von 432 Aminosäuren oder 426 Aminosäuren, der in der normalen Orientierung codiert ist und zwar zwischen dem ATG der Nukleotidzahl 579 bis 881 oder 897 bis 899 als Anfangscodon und dem TAG der Nukleotidzahl 2175 bis 2177 als Endcodon in der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 25 gezeigt ist, wurde als ORF1 bezeichnet. Der ORF von 393 Aminosäuren, der in der Umkehrorientierung codiert ist, und zwar zwischen GTG, komplementär zu CAC der Nukleotidzahl 2163 bis 2165 als Anfangscodon und TGA, komplementär zu TCA der Nukleotidzahl 984 bis 986 als Endcodon, in der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 25 gezeigt ist, wurde als ORF2 bezeichnet.
3. ORF-Bestimmung, die aspC codiert
Ein DNA-Fragment, das nicht den ORF2 in gesamter Länge enthält und den ORF1 in gesamter Länge codiert, wurde durch PCR aus pAC amplifiziert, um zu bestätigen, ob der ORF für das AAT-Protein unter den zwei ORFs codiert. Als DNA-Primer, die zur Amplifizierung verwendet wurden, wurden synthetische DNAs mit einer Länge von 23, die Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 26 und 27 der Sequenzliste aufweisen, jeweils verwendet, und zwar auf Basis der Sequenz, die in SEQ ID NO: 25 gezeigt ist. Die DNA-Synthese und PCR wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Das amplifizierte Fragment von 2.062 Bp der Nukleotidzahl 126 bis 2.187 in der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 25 gezeigt ist, wurde in einen TA-Klonierungsvektor pCR2.1 (hergestellt von Invitrogen) kloniert. Das hergestellte Plasmid wurde als pCRORF1 bezeichnet.
Auf die gleiche Weise wurde ein Genfragment von 1.543 Bp der Nukleotidzahl 975 bis 2.517 in der in SEQ ID NO: 25 gezeigten Nukleotidsequenz, die nur für die gesamte Länge von ORF2 codiert, amplifiziert und kloniert. Das hergestellte Plasmid wurde als pCRORF2 bezeichnet.
Zur Einführung der klonierten DNA-Fragmente in Bakterienzellen, die der Gattung Corynebacterium angehören, wurden die DNA-Fragmente mit dem in Beispiel 8 beschriebenen Shuttlevektor ligiert. pCRORF1 wurde mit einem Restriktionsenzym EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und mit pVK7, das mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut worden war, ligiert. Die Ligation der DNA wurde unter Verwendung des DNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) durchgeführt. Das hergestellte Plasmid wurde als pORF1 bezeichnet. Das Herstellungsverfahren von pORF1 ist in 14 gezeigt.
Auf die gleiche Weise wurde pORF2 aus pCRORF2 und pVK7 hergestellt.
Die hergestellten pORF1 und pORF2 wurden in Zellen des Brevibacterium lactofermentum Wildtyp ATCC 13869-Stammes auf die gleiche Weise wie in Beispiel 9 eingeführt. Die aspC-Aktivitäten von ATCC 13869 und den erhaltenen Plasmideingeführten Stämmen ATCC 13869/pORF1 und ATCC 13869/pORF2 wurden bestimmt. Die Aktivitätsbestimmung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde ein Anstieg der aspC-Aktivität nur bei ATCC 13869/pORF1 beobachtet, was darauf hindeutet, dass aspC durch ORF1 codiert ist.
Die aspC-Nukleotidsequenz von Brevibacterium lactofermentum, die durch die oben beschriebenen Experimente bestimmt wurde und eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind in SEQ ID NO: 30 gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 31 gezeigt. Eine Homologie-Recherche zeigte keine Homologie zu bekannten Aminosäuresequenzen, einschließlich AAT-Proteinen, die von anderen Organismen abstammen.
Tabelle 2
Beispiel 10: Einführung von Plasmiden, umfassend Gene der L-Lysin-Biosynthese in L-Lysin herstellenden Bakterien von Brevibacterium lactofermentum
Das pCABL(Cm^r), hergestellt in Beispiel 7, wurde in ein L-Lysin herstellendes Bakterium AJ11082 (NRRL B-11470) von Brevibacterium lactofermentum eingeführt. Der AJ11082-Stamm weist die Eigenschaft der AEC-Resistenz auf. Das Plasmid wurde gemäß einem elektrischen Impulsverfahren (Sugimoto et al., japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 2-207791) eingeführt. Transformanten wurden ausgewählt auf Basis eines medikamentenresistenten Markers, den das Plasmid aufweist. Transformanten wurden ausgewählt auf einem vollständigen Medium, enthaltend 5 μg/ml Chloramphenicol, wenn ein Plasmid, umfassend ein Chloramphenicol-Resistenz-Gen, eingeführt wurde, oder Transformanten wurden ausgewählt auf einem vollständigen Medium, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin, wenn ein Plasmid, umfassend ein Kanamycin-Resistenzgen eingeführt wurde.
Der wie oben beschrieben erhaltene Transformant AJ11082/pCABL wurde mit dem Plasmid pOm (Km^r) mit aspC von E. coli oder pORF1 (Km^r) mit aspC von Brevibacterium lactofermentum transformiert. Da pCABL als Replikationsursprung pHM1519 in Zellen von Brevibacterium lactofermentum und ein Cm-Resistenzgen als Marker verwendet und pOm als Replikationsursprung pAM330 in Zellen von Brevibacterium lactofermentum und ein Km-Resistenzgen als Marker verwendet, sind beide Plasmide in Brevibacterium lactofermentum stabil. Folglich wurden die Stämme AJ11082/pCABL/pOm und AJ11082/pCABL/pORF1 erhalten, wobei ein Plasmid, enthaltend ein Gen, das an der L-Lysin-Biosynthese und ein Plasmid, das aspC enthält, erhalten wurden.
Auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, wurden p399AK9B(Cm^r), pDPSB(Km^r), pDPRB(Cm^r), pLYSAB(Cm^r), pOm, pCRCAB(Km^r), pAB(Cm^r), pCB(Cm^r) und pCAB(Cm^r) in den AJ11082- Stamm eingeführt, um Transformanten zu erhalten, bei denen mutantes lysC, dapA, dapB, lysA oder aspC einzeln verbessert war oder zwei oder drei dieser Gene in Kombination verbessert waren.
Beispiel 11: Bestimmung der aspC-Aktivität der Transformanten
Die aspC-Aktivitäten der Transformanten AJ11082/pCABL, AJ11082/pCABL/pOm und AJ11082/pCABL/pORF1 wurden bestimmt. Die Aktivitätsbestimmung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 9 unter 3. beschrieben, durchgeführt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurde beobachtet, dass der lac-Promoter auf dem pOm-Vektor ebenfalls in Brevibacterium lactofermentum und die aspC-Aktivität von AJ11082/pCABL/pOm sich ungefähr um das Dreifache erhöhte. Ein weiterer Anstieg der aspC-Aktivität um ungefähr das Neunfache wurde für AJ11082/pCABL/pORF1 beobachtet. Tabelle 3
Beispiel 12: Herstellung von L-Lysin
Jeder der in Beispiel 10 erhaltenen Transformanten wurde in einem L-Lysin herstellenden Medium kultiviert, um die L-Lysin-Produktivität zu beurteilen. Das L-Lysin herstellende Medium hatte die folgende Zusammensetzung.
L-Lysin herstellendes Medium
Die folgenden Komponenten außer Calciumcarbonat (in 1 1) wurden aufgelöst und der pH wurde mit KOH auf 8,0 eingestellt. Das Medium wurde bei 115°C 15 Minuten sterilisiert und Calciumcarbonat (50 g), das getrennt in heißer Luft in einem trockenen Zustand sterilisiert worden war, wurde danach hinzugefügt.
Jeder der verschiedenen Typen der Transformanten und der Elternstamm wurden auf das Medium mit der oben beschriebenen Zusammensetzung geimpft, um die Kultivierung bei 31,5°C mit Schütteln durchzuführen. Die Menge an hergestelltem L-Lysin nach 40 oder 72 Kultivierungsstunden und das Wachstum nach 72 Stunden (OD₅₆₂) sind in Tabelle 4 gezeigt. In der Tabelle stellt lysC* mutantes lysC dar. Das Wachstum wurde quantitativ bestimmt durch Messen der OD bei 562 nm nach 101facher Verdünnung.
Tabelle 4 L-Lysin-Anhäufung nach der Kultivierung für 40 oder 72 Stunden

Bemerkung 1: aspC aus Escherichia coli
Bemerkung 2: aspC aus Brevibacterium lactofermentum

Wie oben gezeigt, war die Menge an hergestelltem L-Lysin größer als oder äquivalent zu der, der durch den Elternstamm nach 72 Stunden der Kultivierung hergestellt wurde, wenn mutantes lysC, dapA, dapB, lysA oder aspC einzeln verbessert wurde, jedoch war die Menge an hergestellten L-Lysin kleiner als die, die durch den Elternstamm nach 40 Kultivierungsstunden hergestellt wurde. Die L-Lysin herstellende Geschwindigkeit war nämlich bei der Kultivierung für eine kurze Zeitdauer verringert. Ähnlich, wenn mutantes lysC und dapA oder dapA und dapB in Kombination verbessert wurden, war die Menge an hergestelltem L-Lysin größer als die, die durch den Elternstamm nach 72 Kultivierungsstunden hergestellt wurde, jedoch war die Menge an hergestelltem L-Lysin kleiner als die, die von dem Elternstamm nach 40 Kultivierungsstunden hergestellt wurde. Folglich war die L-Lysin herstellende Geschwindigkeit verringert.
Bei dem Stamm, bei dem dapB zusammen mit mutantem lysC verbessert wurde, bei dem Stamm, bei dem mutantes lysC, dapA und dapB jeweils verbessert wurden und bei dem Stamm, bei dem mutantes lysC, dapA, dapB und lysA jeweils verbessert wurden, wurde im Gegensatz dazu die akkumulierte L-Lysin-Menge verbessert in sowohl der kurzen als auch der langen Kultivierungsdauer.
Bei dem Stamm, bei dem mutantes lysC, dapA, dapB, lysA und aspC von Escherichia coli jeweils verbessert wurden und bei dem Stamm, bei dem mutantes lysC, dapA, dapB, lysA und aspC von Brevibacterium lactofermentum jeweils verbessert wurden, war die L-Lysin-Produktivität noch mehr in jedem der Kultivierungsdauern verbessert. Das Ausmaß der Verbesserung beim letzteren war größer als das beim ersteren. SEQUENZLISTE

Claims

Rekombinante DNA, die in Zellen coryneformer Bakterien autonom replizierbar ist, umfassend eine DNA-Sequenz, die eine Aspartokinase codiert, worin die Feedbackinhibition durch L-Lysin und L-Threonin im wesentlichen desensibilisiert ist, eine DNA-Sequenz, codierend für eine Dihydrodipicolinatreduktase, eine DNA-Sequenz, codierend für Dihydrodipicolinatsynthase, eine DNA-Sequenz, codierend für Diaminopimelatdecarboxylase, und eine DNA-Sequenz, codierend für Aspartataminotransferase.
Rekombinante DNA gemäss Anspruch 1, wobei die Aspartokinase, bei der die Feedbackinhibition durch L-Lysin und L-Threonin im wesentlichen desensibilisiert ist, eine Aspartokinase ist, die von coryneformen Bakterien abstammt, und wobei die Aspartokinase eine mutierte Aspartokinase ist, worin ein Aminosäurerest, der zu einem 279. Alaninrest, gezählt vom N-Terminus, in der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz in der α-Untereinheit zu einem Aminosäurerest geändert ist, der nicht Alanin und kein saurer Aminosäurerest ist, und ein Aminosäurerest, der zum 30. Alaninrest, gezählt vom N-Terminus in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 7 korrespondiert, in der β-Untereinheit in einen Aminosäurerest geändert ist, der nicht Alanin und kein saurer Aminosäurerest ist.
Rekombinante DNA gemäss Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die die Dihydropicolinatreduktase codiert, für eine Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 11 dargestellt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe ist wie die in SEQ ID NO: 11 dargestellte Aminosäuresequenz.
Rekombinante DNA gemäss Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die die Dihydropicolinatsynthase codiert, die in SEQ ID NO: 15 dargestellte Aminosäuresequenz codiert, oder eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe ist, wie die in SEQ ID NO: 15 dargestellte Aminosäuresequenz.
Rekombinante DNA gemäss Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die die Diaminopimelatdecarboxylase codiert, die in SEQ ID NO: 20 dargestellte Aminosäuresequenz codiert, oder eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe ist, wie die in SEQ ID NO: 20 dargestellte Aminosäuresequenz.
Rekombinante DNA gemäss Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die die Aspartataminotransferase codiert, die in SEQ ID NO: 24 oder 31 dargestellte Aminosäuresequenz codiert, oder eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe ist, wie die in SEQ ID NO: 24 oder 31 dargestellte Aminosäuresequenz.
Coryneformes Bakterium, das eine Aspartokinase beherbergt, worin die Feedbackinhibition durch L-Lysin und L-Threonin im wesentlichen desensibilisiert ist, und umfassend eine verstärkte DNA-Sequenz, die die Dihydrodipicolinatreduktase codiert, eine verstärkte DNA-Sequenz, die die Dihydrodipicolinatsynthase codiert, eine verstärkte DNA-Sequenz, die die Diaminopimelatdecarboxylase codiert, und eine verstärkte DNA-Sequenz, die die Aspartataminotransferase codiert.
Coryneformes Bakterium gemäss Anspruch 7, transformiert durch Einführen der rekombinanten DNA wie in Anspruch 1 definiert.
Verfahren zur Erzeugung von L-Lysin, umfassend die Schritte der Kultivierung des coryneformen Bakteriums, wie in Anspruch 7 oder 8 definiert, in einem geeigneten Medium, um die L-Lysinproduktion und seine Anhäufung in einer Kultur des Bakteriums zu ermöglichen, und Sammeln des L-Lysins aus der Kultur.
DNA, codierend für ein Protein, umfassend die in SEQ ID NO: 31 dargestellte Aminosäuresequenz.
DNA gemäss Anspruch 10, die eine Nukleotidsequenz mit den Nukleotidzahlen 879 bis 2174 der in SEQ ID NO: 30 dargestellten Nukleotidsequenz umfasst.