DE69736226T2

DE69736226T2 - Verfahren zur anregung einer immunantwort durch verabreichung von nutzorganismen, die intimin allein oder als fusionsprotein mit einem oder mehreren anderen antigenen exprimieren

Info

Publication number: DE69736226T2
Application number: DE69736226T
Authority: DE
Inventors: N. Charles Greensboro STEWART; L. Marian Great Falls MCKEE; D. Alison Bethesda O'BRIEN; R. Marian Sonoma WACHTEL
Original assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Current assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Priority date: 1996-04-19
Filing date: 1997-04-18
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2017-04-19
Also published as: EP0895543B1; JP2000510332A; DE69736226D1; CA2252439C; AR006718A1; AU722327B2; WO1997040177A1; CA2252439A1; AU2662197A; ATE331798T1; US6881411B2; US6406885B1; EP0895543A1; JP2008161199A; US6261561B1; US20030147902A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Plasmid zum Manipulieren von Pflanzen, damit diese Intimin exprimieren, allein oder als Fusionsprotein mit einem oder mehreren Antigenen, und auf ein Verfahren zur Förderung einer protektiven Immunantwort durch Verabreichen von Wirtsorganismen, die mit solchen Plasmiden transformiert wurden. Eine solche protektive Immunantwort wird gegen Intimin oder Teile davon und/oder das eine oder die mehreren Antigene gerichtet sein. Die Wirtsorganismen schließen Bakterien, Hefe, Pilze und Pflanzen ein.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine virulente Form der blutigen Diarrhö wird durch enterohämorrhagische E. coli (EHEC) verursacht. Dieses Pathogen ist die häufigste infektiöse Ursache der blutigen Diarrhö (auch hämorrhagische Colitis [HC] genannt) in den Vereinigten Staaten (Centers for Disease Control and Prevention (Kurzfassung). MMWR 43(Nr.RR-5):1-18 (1994); Griffin, P.M. et al. Annals of Internal Med.109:705(1988)). Insbesondere ein Serotyp, 0157:H7, ist der am häufigsten isolierte Serotyp von EHEC in den Vereinigten Staaten und wurde mit einer signifikanten Anzahl von Ausbrüchen von HC, die 1982 begannen, in Verbindung gebracht (Riley, LW. et al. N. Eng. J. Med. 308:681 (1983)).
Der Hauptübertragungsweg von EHEC tritt durch Aufnahme kontaminierter Nahrung, insbesondere nicht durchgebratener Hamburger, auf (Doyle, M.P. und Schoeni, J.L. Appl. Environ. Microbiol. 53:2394 (1987); Samadpour, M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 60:1038 (1994)). Von den mit EHEC infizierten Menschen leiden nicht weniger als 5 % an ernsthaften Komplikationen, die hämolytisches urämisches Syndrom (HUS) genannt werden, ein Zustand, der durch die Wirkung der Shiga-ähnlichen Toxine verursacht wird, die Zellen, welche die Blutgefäße auskleiden (Endothelzellen), wie z. B. solche, die in den Glomeruli der Niere vorhanden sind, gezielt angreifen und zerstören (Johnson, W.M. et al. Lancet. i:76 (1983); O'Brien, A.D. et al. Lancet. i:702 (1983)). HUS kann zu bleibenden Nierenschäden oder sogar vollständigem Nierenversagen führen.
Obwohl EHEC selbst in gesunden Erwachsenen sehr schwere Krankheit verursachen kann, sind insbesondere junge Kinder einem größeren Risiko ausgesetzt, an der Infektion zu sterben oder bleibende Schäden durch sie zu erleiden. Andere Bevölkerungsgruppen, für die die Infektion besonders gefährlich sein kann, schließen ältere Menschen und Menschen mit geschwächtem Immunsystem ein. Aufgrund der Prävalenz von EHEC in Rindern und der subjektiven Eigenschaft, zwischen garen und nicht durchgebratenen Hamburgern zu differenzieren, kann eine angenehme Rast in einem Fastfood-Restaurant oder sogar eine Grillparty in der Familie in einer Familientragödie enden.
Ein Schlüssel zu der tödlichen Eigenschaft von EHEC ist die Fähigkeit des Bakteriums, anheftende/beseitigende (attaching/effacing, A/E) intestinale Läsionen im Darm, wie z. B. die in gnotobiotischen Schweinen gezeigten (Tzipori, S. et al. Infect Immun. 57:1142 (1989)), zu verursachen. Die A/E-Läsionen, die in Schweinen nachgewiesen wurden, sind durch die enge bakterielle Anheftung an die Mukosazellen in der Darmauskleidung und die Auflösung von Mikrovilli gekennzeichnet (McKee, M.L. et al. Infect. Immun. 63:3739 (1995); Tzipori, S. et al. Infect. Immun. 57:1142 (1989)). Ähnliche Läsionen wurden in laryngealen Epithelzellen (HEp-2) (ATCC # CCL23) des Menschen in Gewebekulturen beobachtet (McKee, M.L. et al. Infect. Immun. 63:3739 (1995); Tzipori, S. et al. Infect. Immun. 57:1142 (1989)).
1990 identifizierten Jerse et al. ein chromosomales Gen in einem verwandten, Diarrhö verursachenden E. coli-Stamm, enteropathogene E. coli (EPEC). Von diesem Gen, was eae genannt wurde, wurde festgestellt, dass es für das Bakterium erforderlich ist, um A/E-Läsionen in Gewebekulturen zu erzeugen (Jerse, A.E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:7839 (1990)). Das eae Gen codierte ein Protein von 94 kDa der äußeren Membran, das Eae genannt wurde, und welches das Intimin von EPEC ist.. Ein ähnliches Protein wurde in einem EHEC 0157:H7-Stamm nachgewiesen (Jerse, A.E. and Taper, J.B. Infect. Immun. 59:4302 (1991)).
Kürzlich haben Forscher nachgewiesen, dass Intimin notwendig für die Adhärenz von EHEC an humane Epithelzellen des Larynx (HEp-2) und humane ileozökale Epithelzellen (HCT8), (ATCC # CCL244) (McKee, M.L. et al. Infect. Immun. 63:3739 (1995)) sowie für die Bildung von A/E-Läsionen im Darm von Schweinen ist (Donnenberg, M.S. et al. J. Clin. Invest. 92:1418 (1993); McKee, M.L. et al. Infect. Immun. 63:3739 (1995)). Obwohl Humanstudien mit EHEC noch nicht durchgeführt wurden, ist das Intiminprotein, das in EPEC gefunden wurde, stark mit dem Auftreten von Diarrhö und Fieber in humanen Freiwilligen assoziiert (Donnenberg, M.S. et al. J. Clin. Invest. 92:1412 (1993); Levine, M.M. et al. J. Infect. Dis. 152:550 (1985)).
Humane Freiwillige (10 von 10), die mit dem EPEC-Stamm E2348/69 provoziert wurden, zeigten nach 28 Tagen eine merkliche Immunantwort gegen das 94 kDa Protein (Levine et al. J Infect. Dis. 152:550, 1985)). In dieser Untersuchung mit Menschen war der einzige Freiwillige (1 von 10), der nach der Aufnahme von E2348/69 keine Diarrhö entwickelte, das Individuum in dieser Gruppe, das vor der Provokation nachweisbare Antikörpermengen gegen das 94 kDa Protein aufwies.
Von zwei weiteren Bakterienspezies, die fähig sind, A/E-Läsionen zu induzieren, wurde gezeigt, dass sie den eae Locus enthalten: Hafnia alvei (Albert, M.J. et al. J. Med. Microbiol. 37:310 (1992)) und Cifrobacter freundii Biotyp 4280 (Schauer, D.B. und Falkow, S. Infect. Immun. 61:2486 (1993)). Obwohl diese Bakterien nicht generell mit einer Pathologie im Menschen assoziiert sind, können sie in den Tierspezies, in denen sie normalerweise vorkommen, erhebliche Krankheiten verursachen. Zum Beispiel ist Citrobacter freundii Biotyp 4280 mit gastrointestinalen Erkrankungen in Mäusen vergesellschaftet. Mäuse dienen häufig als Kontroll- und Test-Objekte in Experimenten. Kostspielige und sorgfältig kontrollierte Experimente können durch einen Ausbruch dieser Krankheit in einer Tierversorgungseinrichtung aufs Spiel gesetzt werden. Außerdem können solche Bakterienspezies pathogen für immunkompromittierte Patienten, junge und ältere Menschen werden.
Tiere, wie z. B. Kühe, die mit Bakterienstämmen infiziert sind, die Intimin exprimieren, können selbst krank werden, und zusätzlich als Quelle für Infektionen von anderen dienen. Das Ausradieren oder selbst die Beschränkung dieser tierischen Reservoire an Intimin-exprimierenden Bakterien in Tieren mit Hilfe der Antibiotikatherapie wäre unerschwinglich teuer. Darüber hinaus ist die Behandlung der Infektionen in Menschen und Tieren mit Antibiotika nicht nur kostspielig, sondern die Antibiotika selbst sind mit Nebenwirkungen verbunden, die gefährlich sein können. Wie bei EHEC können diese Nebenwirkungen besonders für junge Kinder und ältere Menschen gefährlich sein.
Folglich existiert der Bedarf an weiteren Mitteln zur Reduzierung der Schwere der Infektionen oder ihre völlige Verhinderung durch Fördern einer protektiven Immunantwort gegen Bakterien, die Intimin exprimieren.
Ein weiterer Bedarf besteht an Arten der Immunisierung, die weniger zeitaufwändig sind, weniger teuer und weniger schmerzhaft als die Immunisierung durch Injektionen von Antigenen. Einen weiteren Bedarf gibt es für die Erzeugung einer protektiven Immunantwort in den spezifischen Geweben, die zum Zeitpunkt der Infektion involviert sind, am häufigsten der gastrointestinalen Mukosa.
Weitere Organismen, die das gastrointestinale Gewebe infizieren, einschließlich Salmonella sp. und Shigella sp. (jedoch nicht auf diese beschränkt), besitzen Antigene, gegen die eine Immunantwort erzeugt weiden könnte. Es gibt jedoch einen Bedarf an einem Mittel zum Targeting dieser Antigene zur gastrointestinalen Mukosa, um eine mukosale Immunantwort zu stimulieren, ebenso wie zur Stimulierung zirkulierender Antikörper.
Schließlich existiert ein Bedarf an alternativen Mitteln zur Lieferung von Wirkstoffen, die eine protektive Immunantwort fördern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort, welches das Transformieren einer Pflanze mit einem Vektor, der für Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon codiert, wobei die Pflanze ein Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon exprimiert, und das Verabreichen der Pflanze oder eines Teiles davon an einen Patienten umfasst. Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort, welches das Transformieren einer Pflanze mit einem Vektor, der Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon codiert, wobei die genannte Pflanze ein Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon exprimiert; die Extraktion des Intimins, eines Teils des Intimins oder eines Intimin-ähnlichen Proteins aus der Pflanze oder eines Teiles davon; die Verabreichung des extrahierten Intimins, des Teils des Intimins oder eines Intimin-ähnlichen Proteins an einen Patienten, umfasst.
Die Erfindung bezieht sich darüber hinaus auf ein DNA-Konstrukt, das für die Expression einer heterologen DNA in einer Pflanze codiert, wobei die heterologe DNA für ein Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon codiert. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Pflanzenzelle, die ein heterologes DNA-Konstrukt enthält, das eine heterologe DNA codiert und exprimiert, wobei die heterologe DNA für ein Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon codiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen, welches das Bereitstellen einer Pflanzenzelle, die fähig zur Regeneration ist und die Transformation der Pflanzenzelle mit einem DNA-Konstrukt, wie oben beschrieben, umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt pEB313 dar, ein Plasmid, das RIHisEae codiert. Das Plasmid codiert ein Intimin mit einem Histidin-Tag, das sich über 900 der 935 vorhergesagten Aminosäuren erstreckt.
2 stellt die vorhergesagte Proteinsequenz des vollständigen EHEC 933 eae Gens dar.
3 stellt die DNA Sequenz des EHEC-Stammes CL8 dar, sequenziert von Beebakhee, G. et al.
4 stellt die DNA Sequenz des EHEC-Stammes 933 dar, sequenziert von Yu und Kaper.
5 stellt das 3144 bp Fragment von eae dar, das durch PCR-Amplifikation hergestellt wurde, in der als eae bezeichneten Region.
6 stellt pEB311 dar, ein Plasmid, das für eae (die vollständige codierende Sequenz) des EHEC-Stammes 86-24 codiert, gesteuert durch den lac-Promotor.
7 stellt pEB310, ein Plasmid, welches das eae (die vollständige codierende Sequenz) des EHEC-Stammes 86-24 codiert, gesteuert durch den PT7-Promotor.
8 stellt mit einem Histidin-Tag versehene Expressionsplasmide dar (Qiagen Inc.).
9 stellt das Repressorplasmid dar (Qiagen Inc.) (Multicopy).
10 stellt pEB312 dar, ein Plasmid, das RVHindHis codiert. Dieses Plasmid codiert ein mit einem Histidin-Tag versehenes Intimin, das sich über 604 der 935 vorhergesagten Aminosäuren erstreckt.
11 stellt die verschiedenen Fragmente von eae dar, die in dem mit einem His-Tag versehenen Vektoren kloniert wurde, sowie die dazugehörigen Namen dieser Plasmide.
12 stellt die verschiedenen C-terminalen Fragmente von eae dar, die in mit einem His-Tag versehene Vektoren kloniert wurden und die dazugehörigen Namen dieser Plasmide.
13 stellt die Konstruktion eines eae-Mutanten, 86-24 eaeΔ10, durch allelen Austausch dar.
14 stellt pEB290 dar, ein Plasmid, welches für die meisten der strukturellen Gene von eae codiert. Die 3' gelegenen 250 Basenpaare von eae werden nicht von pEB290 codiert.
15 stellt pEB300 dar, der verwendet wurde, um den Deletionsmutanten herzustellen; in ihm ist das 1275 bp interne BclI Fragment von eae deletiert.
16 stellt pAM450 dar, einen Suizid-Vektor zur Einführung klonierter Gene in das Bakterienchromosom.
17 stellt pEB305 dar, ein Plasmid, welches das deletierte eae Gen in dem Vektor pAM450 für homologe Rekombination codiert.
18 stellt das Klonierungsschema für die Konstruktion eines Plasmids dar, das N-His-IcsA-Intimin-C exprimiert.
19 stellt das Klonierungsschema für die Konstruktion eines Plasmids dar, das zur Manipulierung von Pflanzen zur Expression von His-Intimin entwickelt wurde. Der Pflanzenexpressionsvektor pKLYX71S² und das Plasmid PINT, welches His-Intimin codiert, sind ebenfalls dargestellt.
20 stellt das Klonierungsschema zur Konstruktion eines Plasmids dar, das zur Manipulierung von bakteriellen Wirten zur Expression von His-Intimin entworfen wurde.
21 stellt pGHNC5 dar, ein Plasmid, das eine Pflanzenexpressionskassette enthält. Die MARs sind nukleäre Scaffold-Attachment-Regionen aus Tabak. Das ClaI-EcoRI Fragment, das 3'-rbcs-eae-His-35S² enthält, wird aus pINT ausgeschnitten und in pGHNC5 ligiert, um pMAREAE zu erzeugen, der in 22 dargestellt ist.
22 stellt das Plasmid pMAREAE dar. Das SacI-KpnI Fragment, das MAR-35S²-His-eae-3'rbcs-MAR enthält, wird aus pMAREAE ausgeschnitten und in pBIN19 ligiert, um pBIN-ME zu erzeugen, der in 23 dargestellt ist. Das Plasmid pBIN19 codiert das NPTII Gen (Nopalinsynthase aus Agrobacterium tumefaciens, die Kanamycinresistenz verleiht). NPTII wird von einem Nopalinsynthase-Promotor (pNOS) ebenso wie von einem Nopalinsynthase-Terminator (3'NOS) flankiert.
23 stellt pBIN-ME dar, ein Plasmid, das MAR-35S²-His-eae-3'rbcs-MAR enthält. Dieses Plasmid weist eine Kanamycinresistenz auf, welche durch die 3'NOS-NPTII-pNOS-Kassette verliehen wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort, welches das Transformieren einer Pflanze mit einem Vektor umfasst, der Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon codiert, wobei die Pflanze ein Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon exprimiert, und die Verabreichung der Pflanze oder eines Teiles davon an einen Patienten. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf solche Methoden, in denen das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon zusätzlich wenigstens ein Antigen umfasst, wenigstens ein Arzneimittel oder eine Kombination davon, das rekombinant an das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder den Teil davon fusioniert ist.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort, welches das Transformieren einer Pflanze mit einem Vektor umfasst, der für Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon codiert, wobei die Pflanze ein Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon codiert, wobei die Pflanze ein Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon exprimiert; das Extrahieren des Intimins, eines Teils des Intimins oder eines Intimin-ähnlichen Proteins aus der Pflanze oder eines Teils davon; und das Verabreichen des extrahierten Intimins, Teils des Intimins oder des Intimin-ähnlichen Proteins an einen Patienten. Diese Erfindung bezieht sich außerdem auf das Verfahren, in dem das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon zusätzlich wenigstens ein Antigen, wenigstens ein Arzneimittel oder eine Kombination davon umfasst, das rekombinant an das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder den Teil davon fusioniert ist.
Die oben beschriebenen Verfahren können weiterhin einen Schritt zur Anreicherung des Intimins, des Teils des Intimins oder des Intimin-ähnlichen Proteins vor der Verabreichung oder einen Schritt zur Reinigung des Intimins, des Teils des Intimins oder des Intimin-ähnlichen Proteins vor der Verabreichung beinhalten. Vorzugsweise ist das Intimin in den oben beschriebenen Verfahren EHEC-Intimin. Es wird außerdem bevorzugt, dass das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon weiterhin wenigstens einen Histidin-Tag umfasst.
In den oben beschriebenen Verfahren kann die Pflanze eine Monokotyledone oder eine Dikotyledone sein. Beispiele für solche Pflanzen werden weiter unten detaillierter beschrieben, schließen jedoch bevorzugterweise Alfalfa-, Karotten-, Kanola-, Tabak-, Bananen- und Kartoffelpflanzen ein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein DNA-Konstrukt, das für die Expression einer heterologen DNA in einer Pflanze codiert, wobei die heterologe DNA für Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder ein Teil davon codiert. Die heterologe DNA kann zusätzlich weiterhin wenigstens ein Antigen codieren, wenigstens ein Arzneimittel oder eine Kombination davon, das rekombinant an das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder den Teil davon fusioniert ist.
Vorzugsweise ist das DNA-Konstrukt ein Pflanzentransformationsvektor. Der Pflanzentransformationsvektor ist vorzugsweise ein Agrobacterium-Vektor. Es wird außerdem bevorzugt, dass die Pflanzentransformation mittels Mikropartikel durchgeführt wird. Es ist außerdem bevorzugt, dass der Pflanzentransformationsvektor ein viraler Vektor ist.
In dem oben beschriebenen DNA-Konstrukt gemäß der Erfindung umfasst das von der genannten DNA codierte Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon weiterhin einen Histidin-Tag. Es wird außerdem bevorzugt, dass die Codons der heterologen DNA durch Codons ersetzt sind, die für die Expression in einer Pflanzenzelle bevorzugt werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Pflanzenzelle, welche ein heterologes DNA-Konstrukt enthält, das eine heterologe DNA codiert und exprimiert, wobei die heterologe DNA ein Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon codiert.
In einer solchen Pflanzenzelle kann die heterologe DNA zusätzlich wenigstens ein Antigen, wenigstens ein Arzneimittel oder eine Kombination davon codieren, das rekombinant an das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder den Teil davon fusioniert ist. Vorzugsweise umfasst in diesen Pflanzenzellen das durch die DNA codierte Intimin, Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon weiterhin einen Histidin-Tag.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich darüber hinaus noch auf ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen, welches das Bereitstellen einer Pflanzenzelle, die fähig zur Regeneration ist, und das Transformieren der Pflanzenzelle mit einem DNA-Konstrukt, wie oben beschrieben, umfasst. Vorzugsweise wird der Transformationsschritt dieses Verfahrens durch Induzieren der Pflanzenzelle mit einem Agrobacterium-Vektor, der das DNA-Konstrukt in die Pflanzenzelle überträgt, ausgeführt. Es wird außerdem bevorzugt, dass der Transformationsschritt durch Beschuss der Pflanzenzelle mit Mikropartikeln, welche das DNA-Konstrukt beinhalten, ausgeführt wird. Zusätzlich wird bevorzugt, dass der Transformationsschritt durch Transformation mit einem viralen Vektor durchgeführt wird.
Für die oben beschriebenen Verfahren wird bevorzugt, dass die Pflanzenzelle sich in einem Pflanzengewebe befindet, das fähig zur Regeneration ist. Das oben beschriebene Verfahren kann außerdem den Schritt der Regeneration von Sprösslingen, Wurzeln oder einer Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen umfassen. In diesem Verfahren ist die Pflanze vorzugsweise eine Monokotyledone oder Dikotyledone. Es wird außerdem bevorzugt, dass in diesem Verfahren das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon, der von der DNA codiert wird, weiterhin einen Histidin-Tag umfasst.
Ein Ziel der Erfindung ist es, Intimin in einem Wirtsorganismus zu exprimieren, wobei der Wirt direkt oder nach dessen Verarbeitung an Tiere oder Menschen verabreicht oder verfüttert wird, um eine Immunantwort gegen Intimin zu stimulieren. Solch eine Immunantwort wird das Tier oder den Menschen gegen Unwohlsein, Krankheit und sich daraus ergebende Folgeschädigungen, die von EHEC und anderen Pathogenen verursacht werden, welche die Fähigkeit aufweisen, über Proteine, die einen gewissen Grad an Homologie mit dem spezifischen von EHEC exprimierten Intimin aufweisen, an Epithelzellen zu binden.
Das Ziel wird durch Stimulieren einer Immunantwort, die gegen Intimin gerichtet ist, erreicht, wodurch die Fähigkeit von EHEC zur Bindung an Epithelzellen blockiert wird. Folglich wird in der Anmeldung der Begriff Immunisierung verwendet. Der Grad des Schutzes wird sich mit dem Grad der Homologie zu Intimin ändern, ebenso mit den einzigartigen Eigenschaften des Patienten, insbesondere, da verschiedene Spezies behandelt werden. Es ist unwichtig, bei der Durchführung der Erfindung den genauen Grad des Schutzes für irgendein bestimmtes Pathogen zu quantifizieren. Außerdem beschreibt die Erfindung die Expression von Intimin in einem Wirtsorganismus als Fusionsprotein mit einem oder mehreren Antigenen und die Verabreichung des Wirtsorganismus, um eine protektive Immunantwort gegen Intimin und das Antigen oder die Antigene zu fördern.
Neben der Stimulierung einer Immunantwort, die es einem Patienten erlaubt, eine Infektion vollständig zu vermeiden, bedeutet Immunisierung, wie hierin verwendet, außerdem die Verminderung der Fähigkeit der Pathogene, den gastrointestinalen Trakt zu kolonisieren und außerdem die Schwere einer Infektion zu mindern, was durch jeden der folgenden Indikatoren gemessen wird: reduziertes Vorkommen von Todesfällen, HUS oder bleibende Nierenschäden; verminderte Mengen an Toxinen; reduzierter Flüssigkeitsver lust; oder weitere Krankheitsindikatoren, die regelmäßig von den durchschnittlichen Fachleuten auf dem relevanten Gebiet verwendet worden. Folglich handelt es sich bei einer immunprotektiven Menge um die Menge, die ausreichend ist, um die Fähigkeit des Pathogens, den gastrointestinalen Trakt kolonisieren, zu vermindern, ebenso wie die Schwere einer Infektion, die durch die oben genannten Indikatoren gemessen wird, zu vermindern.
Ein bevorzugter Wirt der Erfindung ist eine Pflanzenzelle.
Pflanzenzellen wurden erfolgreich manipuliert, um heterologe Gene zu exprimieren, wie z. B. Gene bakteriellen Ursprungs. Kulturpflanzen jeglicher Art wurden mit Genen bakterieller Herkunft manipuliert. Einige Beispiele dafür sind die häufig verwendeten Antibiotika-Resistenzgene, wie z. B. die Markergene für die Neomycinphosphotransferase (NPTII) und Hygromycinphosphotransferase (HPII). Diese Gene wurden aus dem Bakterium E. coli isoliert (Fraley, R.T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983); Vandenberghe et al., Plant Mol. Biol. 5: 299 (1985)). Ein anderes beliebtes Markergen, das routinemäßig in Studien zur Pflanzentransformation verwendet wird, stammt ebenfalls aus E. coli: β-Glucuronidase (GUS) (Jefferson Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405 (1988)). All diese Gene waren nützlich und wurden von transgenen Pflanzen, d. h. solchen, die heterologe DNA enthalten, in ihrer nativen Form stark exprimiert; sie benötigten keine Modifikationen in ihren codierenden Sequenzen.
Weitere Gene aus Bakterien wurden jedoch schwach exprimiert, als sie in Pflanzen eingebracht wurden. Ein Beispiel ist das Quecksilberion-Reduktasegen aus E. coli (Wilde et al., Mecuric ion reduction and resistance in transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a modified bacterial merA gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA im Druck). Es benötigte Modifikationen in seiner codierenden Sequenz, bevor es exprimiert worden konnte. Das vielleicht am besten bekannte Beispiel sind die Insekten-tötenden cry Gene aus Bacillus thuringiesis. Sie alle zeigten eine geringe bis keine Expression, bis sie "umkonstruiert" oder für die Expression in Pflanzen Codon-optimiert wurden (Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324-3328 (1991); Adang et al., Plant Mol. Biol. 21: 1131-1145 (1993)). In diesen Studien rekonstruierten Forscher die Gene, indem sie Oligonukleotide synthetisierten und miteinander verbanden, die bevorzugte Codons für die Pflanzenspezies codierten, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern. Durch Anpassen der Codonverwendung des neuen Gens an von Pflanzen bevorzugte Codons kann das einge führte Gen stark exprimiert werden (z. B. Stewart et al., Insect control and dosage effects in transgenic canola, Brassica napus L. (Brassicaceae), containing a synthetic Bacillus thuringiensis Cryla(c) gene. Plant Physiology, 112:115-120 (1996)). Auf diese Weise konnte die Expression bakterieller Gene durch Pflanzenzellen erreicht werden.
Pflanzen, die durch ein fremdes Gen verändert wurden, waren bereits erfolgreiche Lieferanten für orale Vakzine. Wie kürzlich in einem Review dargelegt (Mason und Arntzen, Tibtech 13: 388392 (1995)), sind solche Verwendungen von manipulierten Pflanzen auf dem Gebiet anerkannt. Das gesammelte Arbeitswissen schließt außerdem den kürzlichen Beweis ein, dass, wenn Gene exprimiert werden, die für Antigene von viralen und bakteriellen Pathogenen in Pflanzen codieren, diese Antigene ihre immunogenen Eigenschaften behalten (Mason und Arntzen, Tibtech 13: 388-392 (1995)). Mason et al. (Mason et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:11745-11749(1992)) haben das Konzept eingeführt, Pflanzen als Vehikel-Liefersysteme für Vakzine zu manipulieren und haben seitdem gezeigt, dass ihr System effektiv für Hepatitis B (Thanavala et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3358-3361 (1995)), Enterotoxin B-Untereinheit aus E. coli und die Choleratoxin-Untereinheit (Haq et al., Science 268: 714-716 (1995)) ist. Eine Basis für die Wirksamkeit dieser Strategie beruht auf der Tatsache, dass die Antigene die mukosale Immunität stimulieren.
Bei der Ausführung dieser Erfindung wird ein Fragment des Intimin-Gens, eae (das z. B. den His-Tag enthalten kann, wie z. B. das XhoI-HindIII Fragment aus pEB313), mit einem Pflanzenpromotor in einen geeigneten Vektor ligiert. Das Einführen dieses Vektors z. B. in Tabakpflanzen durch geeignete Verfahren führt zu der Expression von Intimin, wie z. B. His-Intimin, durch die Tabakpflanzen. Sobald die Tabakpflanzen gewachsen sind, werden sie homogenisiert, um "Tabaksuppe" (Proteinextrakt) herzustellen. Diese Suppe wird anschließend als Adsorptionsmittel für einen ELISA unter Verwendung der Standardmethode verwendet, um das Vorhandensein von Intimin nachzuweisen. Alternativ wird dieser Extrakt auf einem SDS-PAGE-Gel zur Westernblot-Analyse laufen gelassen. Man kann für solche Analysen polyklonale Antiseren verwenden, die gegen das Intimin gerichtet sind oder, um die Anwesenheit eines Histidin-Tags nachzuweisen, Antikörper, die gegen den Histidin-Tag gerichtet sind (erhältlich von QIAGEN). Die Menge an Intimin, die von der Pflanze exprimiert wird, kann unter Verwendung des ELISA oder Westernblots quantifiziert werden.
Unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes kann der Fachmann Intimin oder z. B. Intimin als Fusionsprotein mit einem oder mehreren anderen Antigenen in der Tabakpflanze oder anderen Pflanzen, wie z. B. Karotten, Bananen, Canola oder Alfalfa, exprimieren, obwohl andere Pflanzen ebenfalls von der Erfindung umfasst sind. Wenn solche transformierten Pflanzen an Tiere verfüttert werden, wie z. B. Rinder, exprimieren die transformierten Pflanzen das Intiminprotein oder das Fusionsprotein, wodurch sie die Antigene an die Tiere liefern, um eine Immunantwort zu stimulieren. Solch ein Verfahren ist insofern wünschenswert, als es ein günstiges und effizientes Verfahren zum Schutz der Tiere ist und der Schutz gegen die zukünftige Kolonisierung solcher Tiere durch humane Pathogene, wie z. B. EHEC, darüber hinaus das Risiko von Infektionen für Menschen reduziert.
In einem Transformationsverfahren steht das eae Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Pflanzenpromotors in einem Agrobacterium tumefaciens binären Vektor, und die Pflanzen werden durch Agrobacterium-vermittelte Transformation manipuliert.
Das Intimin, das in dem Wirtsorganismus exprimiert wird, hat eine Größe, die ihre Funktion zur Bindung beibehält und kann Intimin einschließen, welches mit einem Histidin-Tag versehen wurde. Darüber hinaus kann das Intimin in dem Wirt als Fusionsprotein mit einem oder mehreren anderen Antigenen exprimiert werden. Die Verabreichung des Wirtes an Patienten, einschließlich Tieren, stimuliert eine Immunantwort gegen das Intimin und das Antigen oder die Antigene.
Die Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass die Größe des mit einem His-Tag versehenen Intimins, die verwendet werden soll, entsprechend der speziellen Zwecke für die Verabreichung des Intimins verändert werden kann. Zum Beispiel kann, wenn das mit einem His-Tag versehene Intimin mit einem oder mehreren Antigenen konjugiert werden soll, ein kleineres Fragment ausgewählt werden, um die Stabilität des kombinierten Fusionsprodukts zu erhöhen; obwohl die Verwendung eines größeren Fragmentes in keinster Weise ausgeschlossen wird. Die Größe oder Konformation des anderen Antigens und die Lokalisierung seiner maßgeblichen Epitope kann darauf hinweisen, dass eine bestimmte Länge des mit dem His-Tag versehenen Intimins die Epitope in enge Nähe zu der Mukosa bringen wird. Die gewünschte Größe wird außerdem mit dem Nutzen der verfügbaren Restriktionsstellen, angesichts des Materials und der den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren variieren. Folglich bedeuten die Begriffe His- Intimin und mit einem His-Tag versehenes Intimin, wie hierin verwendet, Polypeptide, die wenigstens 900 der 935 vorhergesagten C-terminalen Aminosäuren von Intimin mit einem Histidin-Tag (vollständig langes Intimin) enthalten sowie kleinere Teile des mit dem His-Tag versehenen Proteins, welche die Bindungsfunktion beibehalten.
Das Konjugat kann mit Hilfe der Rekombinationstechnik erzeugt werden, um ein Fusionsprotein zu erzeugen, das einen Teil des Intimins und wenigstens ein zusätzliches Proteinantigen oder Arzneimittel umfasst. Darüber hinaus kann Intimin chemisch oder physikalisch an Arzneimittel, Proteine, Peptide, Kohlenhydrate und andere Antigene mit Hilfe von Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, konjugiert werden. Verfahren zur chemischen Konjugation sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und schließen zum Teil die Kopplung über verfügbare funktionelle Gruppen (wie z. B. Amino-, Carboxyl-, Thio- und Aldehydgruppen) ein. Siehe S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking CRC Press (1991); und Brenkeley et al. Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes, Haptens and Cross-linking Agents, Bioconjugate Chemistry 3 #1 (Jan. 1992).
Die Aufrechterhaltung der Bindungsfunktion bedeutet, dass das Intimin, die Intimin-ähnlichen Proteine und/oder Teile davon die Fähigkeit zur Bindung an Epithelzellen oder Zelllinien, wie z. B. HEp-2 und HCT-8, behalten. Eine solche Bindung kann mit Hilfe des Mikrokolonie-Assays als bakterielle Mikrokoloniebildung (Frankel et al., Infect. Immun. 62(5):1835-1842 (1994)), mit Hilfe von FAS (florescence actin staining, fluoreszente Aktinfärbung) oder beidem (McKee und O'Brien, Infect. Immun. 63(5):2070-2074 (1995) visualisiert werden. Darüber hinaus kann die Bindung durch jedes Standardverfahren auf dem Gebiet, einschließlich der in vivo-Messung als Funktion der bakteriellen Virulanz oder Pathogenizität oder durch post mortale histologische Untersuchung gemessen werden. Beispiele für jedes der oben genannten Verfahren zur Bestimmung der Bindungsfunktion werden in unten stehenden Beispielen genauer beschrieben, einschließlich des Adhärenz-Assays, das in Beispiel IV beschrieben wird.
Soweit nicht anders angegeben, sind die hierin dargelegten Verwendungen und Verfahren im Allgemeinen bei Menschen und Tieren anwendbar. Der Begriff Patient wird hierin in der Bedeutung verwendet, dass er sowohl Menschen als auch Tiere meint, und Tiere sind nicht auf Haustiere beschränkt, sondern können Wildtiere und Labortiere ebenfalls einschließen.
Isolierung und Reinigung des mit einem His-Tag versehenen Intimins
Es wurde gezeigt, dass eine His-Intimin-Fusion, in der das N-terminale Drittel des Moleküls deletiert ist (RVHindHis), fähig war, die Adhärenz eines nicht-adhärenten EHEC eae Mutanten zu komplementieren; d. h., die Bindungsfähigkeit in einem EHEC-Stamm, der seine Bindungsfähigkeit infolge einer genetischen Veränderung, welche Expression von Intimin verhinderte, verloren hatte, wiederherstellte. Das Adhärenzmuster, das sich in der wiederhergestellten Bindung zeigte, war von dem in dem Wildtypstamm 86-24 beobachteten nicht unterscheidbar (McKee, M.L. und O'Brien, A.D. Infect. Immun. Im Druck (1996)). Soweit mit Hilfe des Mikrokolonie-Assays, das oben beschrieben wurde, bestimmt, ist die Wildtypaktivität als unterbrochenes Muster mit lokalisierten Gebieten intensiver Färbung zu erkennen.
Die Reinigung des Intiminproteins jedoch war schwierig, zum Teil deshalb, weil Intimin immer mit der äußeren Membran von EHEC assoziiert ist. Der mehrheitliche Teil des überexprimierten rekombinanten Intimins blieb mit der Bakterienmembranfraktion assoziiert, sogar nach dem Aufschluss des Wirtsbakteriums mit Ultraschall und der Zugabe eines milden Detergens zu dem Extraktionspuffer. Die Unlöslichkeit des Intiminproteins, in Kombination mit Fülle weiterer nativer E. coli-Proteine im Bereich von 97 kDa, erschwerten die Reinigung des nativen Proteins.
Versuche zur Herstellung einer Intimin-Maltosebindeprotein-Fusion (MBP) waren ebenfalls nicht erfolgreich, da das vorhergesagte Proteinprodukt Deletionen und Rearrangements aufwies. Ein Versuch von anderen Forschem zeigte ein Konstrukt einer MBP-Fusion an die C-terminalen 280 Aminosäuren von Intimin, das Fusionsprotein zeigte jedoch keine EHEC-ähnliche Bindungsfunktion. Das diffuse Adhärenzmuster, das von dem MBP-Intiminprotein vermittelt wurde, unterschied sich klar von dem Muster der EHEC-Bindung an HEp-2 Zellen (Frankel, G. et al. Infect. Immun. 62:1835 (1994)).
Eine mögliche Erklärung für die Erfolglosigkeit, ein funktionelles MBP-Intimin-Fusionsprotein mit einer Länge von mehr als 280 Aminosäuren zu erhalten, ist, dass die Überexpression eines Teils von Eae, das größer als die letzten 280 Aminosäuren ist, instabil und folglich anfällig gegenüber Rearrangements ist, d. h. es könnte unmöglich sein, diesen Klon zu isolieren, da seine Expression tödlich oder zerstörerisch für die Zelle ist. Al ternativ könnte die Überexpression eines Teils des MBP-Intimin-Fusionproteins, der größer als 280 Aminosäuren ist, die Bakterienmembran verstopfen, was tödlich für die Zellen wäre.
Nach den erfolglosen Versuchen, Intimin unter Verwendung von MBP zu reinigen, wurde eine Fusion unter Verwendung des QIAexpressionist-Kits von QIAGEN, Inc., erzeugt, die das Anfügen eines Histidin-Tags an das Protein beinhaltet. Der Histidin-Tag bindet fest an eine Nickelaffinitätsmatrix, was die Reinigung großer Mengen an Material für weitere Studien erleichtert. Darüber hinaus erlaubt das Expressionssystem die strenge Kontrolle der Expression des His-Fusionsproteins, um jede mögliche letale Wirkung des rekombinanten Proteins aus den E. coli-Wirtsstamm als Ergebnis der Überexpression des Proteins zu verhindern. Beispiel I beschreibt die Erzeugung eines solchen Fusionsproteins.
BEISPIEL I
A. Konstruktion eines Plasmids, pEB313 (1), welches das mit einem His-Tag versehene Intimin codiert, das 900 von 935 vorhergesagten Aminosäuren enthält (2)
Das eae Gen wird aus dem EHEC-Stamm 86-24 (Serotyp 0157:H7) kloniert, der leicht von Griffin, P.M. et al., Ann. Intern. Med. 109:705-712 (1988) oder Phil Tarr (Children's Hospital and Medical Center, 4800 Sand Point Way NE, Seattle, WA. 98105, 206-526-2521.) erhältlich ist. Die DNA wird gemäß den Standardmethoden zur chromosomalen Präparation (Wilson, K. in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (ed.) vol1:2.4.1 – "Preparation of Genomic DNA from Bacteria") extrahiert.
Das Gen wird unter Verwendung der Polymerasenkettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR), einem Standardverfahren auf dem Gebiet, unter Verwendung von Primern kloniert, die aus einem Gemisch der beiden bekannten EHEC eae Sequenzen konstruiert wurden. Zwei Primer wurden konstruiert: Sn20-CGTTGTTAAGTCAATGGAAAC, ein 5'-Primer, der die Basen 20-41 der Sequenz aus dem Stamm CL8 umfasst, der von Beebakhee, G. et al. FEMS Microbiology. 91:63 (1992) (3) sequenziert wurde; und MM2-TCTAGAGAGAAAACGTGAATGTTGTCTCT, ein 3'-Primer, der die Basen 3061-3082 der Sequenz aus dem Stamm 933 umfasst, der von Yu, J. und Kaper, J.B. Mol. Microbi ol. 6:411 (1992) (4) sequenziert wurde. MM2 wurde weiterhin so konstruiert, dass er eine XbaI-Stelle am 3'-Ende enthält.
Die PCR-Reaktionen werden unter Verwendung des AmpliTaq-Kits gemäß den Instruktionen des Herstellers, Perkin Elmer, durchgeführt. Die PCR-Amplifikation produziert ein 3144 bp Fragment, das den gesamten eae offenen Leseraster (open reading frame, ORF) (5, die Region ist als eae bezeichnet) codiert und schließt 186 bp stromaufwärts ein. Das PCR-Produkt wird prozessiert, um stumpfe Enden herzustellen und in die EcoRV-Stelle des Vektors pBRKS^– (Schmitt et al., J. Bacteriol. 176:368-377 (1994)) ligiert.
Das Gen wird in beiden Richtungen kloniert, um eine Transkription sowohl von P_lac pEB311 (6) und von P_T7 pEB310 (7) unter den geeigneten Bedingungen zu erlauben. Die Plasmide werden in den Wirtsstamm XL1BlueF'Tn5lacI_Q (erhältlich von QIAGEN, Inc., 9600 DeSoto Ave., Chatsworth, CA. 91311, 1-800-362-7737) transformiert. Die Rekombinanten werden unter der konstitutiven Kontrolle des lac Repressors gehalten, da die zuvor erfolglosen Versuche zur Klonierung von eae nahe legten, dass die Überexpression von eae letal für den E. coli Wirtsstamm sein könnte. Die geringere Kopienzahl des pBRKS^–-Vektors, zusammen mit der durch den lac-Repressor verliehenen Kontrolle umgeht diese Probleme.
Ein mit einem His-Tag versehenes Intimin-Plasmid wird durch Verdau von pEB310 mit EcoRI, dem Auffüllen mit Klenow-Fragment, dem Verdau mit HindIII und der Isolierung des resultierenden 2895 bp Fragments konstruiert. Die DNA-Fragmente werden unter Verwendung des Geneclean-Kits, Bio101 (1070 Joshua Way, Vista, CA.92083,1-800-424-61010) isoliert. Das His-Tag-Expressionsplasmid pQE32 (8) (erhältlich von QIAGEN, Inc.) wir mit SmaI und HindIII verdaut. Das 2895 bp Fragment wird anschließend in pQE32 ligiert, wodurch pEB313 erzeugt wurde (1).
Dieses Plasmid, pEB313, codiert ein mit einem His-Tag versehenes Eae Fragment von 101 kDa, RIHisEae genannt, dass 900 von 935 vorhergesagten Aminosäuren codiert. Dieses His-Intimin-Fusionsprotein wird so konstruiert, dass die N-terminalen 35 Aminosäuren deletiert werden, um jede mögliche Signalsequenz zu entfernen. Eine Signalsequenz könnte das Fusionsprotein zur Membran targeten oder zur Abspaltung des His-Tags von dem codierten Intimin führen.
Nachdem das pEB313-Konstrukt hergestellt wurde, wird es in einen Laborstamm von E. coli transformiert, welcher den lac-Repressor (lacI_Q) enthält, wie z. B. M15 pREP4 (der Repressor, der in dem Multicopy-Plasmid pREP4 enthalten ist, das von QIAGEN, Inc. geliefert wird) (9) oder XL1BlueF'Tn5lacI_Q (der Repressor, der auf dem Singlecopy F'-Plasmid enthalten ist, ebenfalls von QIAGEN, Inc. erhältlich). Die transformierten E. coli exprimieren das His-Intimin-Fusionsprotein, das von pEB313 codiert wird. Die Reinigung des Proteins wird wie in Beispiel III dargelegt durchgeführt.
B. Konstruktion eines Plasmids, pHis-Inv1, welches das mit einem His-Tag versehene Invasin von Yersinia pseudotuberculosis codiert, und Konstruktion eines Plasmids, pHis-Inv2, welches das mit einem His-Tag versehene Inversin von Yersinia pseudotuberculosis mit einer Deletion der N-terminalen 40 Aminosäuren codiert.
Das Plasmid pRI203 enthält ein 4,6 kb Fragment der chromosomalen DNA von Yersinia pseudotuberculosis, einschließlich des inv Gens und der umgebenden Nukleotidsequenzen, und ist leicht von Dr. Ralph Isberg (Dept. Of Molecular Biology and Microbiology, Tufts University School of Medicine, Boston, Mass. 02111; ref. R. R. Isberg, D. L. Voorhis, and S. Falkow. Cell. 50:769 (1987)) erhältlich. Die pRI203 DNA wird mit Hilfe eines QIAGEN DNA-Extraktionskits (QIAGEN, Chatsworth, CA.) in Übereinstimmung mit den Instruktionen des Herstellers aus dem zur Verfügung gestellten Bakterienstamm extrahiert.
Um pHis-Inv1 zu konstruieren, werden zwei Primer, Inv1 (= 5' GTACGGATCCATGATGGTTTTCCAGCCAATCAGTGAG 3' und Inv3 (= 5' GTACGGTACCTTATATTGACAGCGCACAGAGCGGG 3') in einer PCR-Reaktion (wie oben in Teil A beschrieben) verwendet, um die gewünschten inv Sequenzen aus pR1203 zu amplifizieren. Das resultierende 2960 bp inv Fragment wird mit BamHI und KpnI verdaut, auf einem Agarosegel laufen gelassen, mit einer Rasierklinge ausgeschnitten und unter Verwendung von GeneClean (Bio101, LaJolla, CA.) gereinigt. Das gereinigte inv Fragment wird in den His-Tag-QIAGEN-Vektor ligiert, der den geeigneten Leseraster enthält, welcher der amplifizierten inv Sequenz entspricht (pQE30, 31 oder 32, QIAGEN, Chatsworth, CA), der mit BamHI und KpnI verdaut wurde. Die ligierten Plasmide werden anschließend in DH5αF'Tn5lacI_Q transformiert, und die Transformanten werden auf das Vorhandensein des Inserts in passender Größe überprüft.
Das Plasmid pHis-Inv2 wird für den Fall konstruiert, dass eine Signalsequenz (und folglich der sich anschließende His-Tag) von dem Protein, das von pHis-Inv1 exprimiert wird, abgespalten wird.
Um pHis-Inv2 zu konstruieren, werden zwei Primer, Inv2 (= 5' GTACGGATCCATATGTGGAATGTTCATGGCTGGGG 3') und Inv3 (= 5' GTACGGTACCTTATATTGACAGCGCACAGAGCGGG 3') in einer PCR-Reaktion (wie in Teil A oben beschrieben) verwendet, um die gewünschten inv Sequenzen von pRI203 zu amplifizieren. Das resultierende 2840 bp inv Fragment wird, wie oben beschrieben, gereinigt und in den His-Tag-QIAGEN-Vektor wie oben ligiert und in einen ähnlichen bakteriellen Wirtsstamm transformiert.
Alternativ werden ähnliche Plasmide durch den Restriktionsenzymverdau von pRI203, gefolgt von einer Ligation in den QIAGEN His-Tag-Vektor (pQE30, 31 oder 32), der den geeigneten Leseraster bezüglich des 5'-Endes des Invasinfragments aufweist, konstruiert. Die vorstehenden Beispiele sind zur Illustration der Konstruktion von Plasmiden gedacht, welche mit Histidin versehenes Invasin aus Yersinia pseudotuberculosis codieren. Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass analoge Konstrukte, die unter Verwendung alternativer Vektoren und/oder weiterer Intimin-ähnlicher Proteine entworfen werden, gemäß den Standardverfahren auf dem Gebiet konstruiert werden können. Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt außerdem, dass die oben genannten, mit einem His-Tag versehenen Invasive und andere mit einem His-Tag versehene Intimin-ähnliche Proteine in den an anderer Stelle hierin offenbarten Verfahren verwendet werden können.
C. Konstruktion eines Plasmids (pEB312) (10), das für ein mit einem His-Tag versehenes Intimin codiert, das 604 von 935 vorhergesagten Aminosäuren umfasst.
Verdau des Plasmids pEB310 (erhalten wie in Teil A beschrieben) mit EcoRV und HindIII, Isolieren des 1971 bp Fragments und Ligieren des Fragments in pQE32, der mit SmaI und HindIII verdaut wurde. Die in den Protokollen verwendeten Restriktionsenzyme, die Ligasen und das Klenow-Fragment stammen von New England BioLabs (32 To zer Rd., Beverly, MA. 01915-55991, 1800-NEB-LABS) oder Gibco BRL (P.O. Box 681 Grand Island, N.Y. 14072-0068, 1-800828-8686). Das resultierende Plasmid wird pEB312 genannt.
Das Plasmid pEB312 codiert ein mit einem His-Tag versehenes Eae Fragment, das RVHindHis genannt wird, das etwa 65 kDa groß ist und für 604 von 935 vorhergesagten Aminosäuren codiert. Dieses Konstrukt enthält die C-terminalen zwei Drittel des Wildtyp Intiminproteins.
Wie bei dem von pEB310 exprimierten Intimin bleiben die Fusionsproteine nach dem Schallausschluss des Wirtes E. coli in erster Linie in dem unlöslichen Pellet. Daher werden Harnstoff und Guanidin-HCl in dem Reinigungsprotokoll eingeschlossen, was eine Extraktion der Fusionsproteine aus dem löslichen Pellet erlaubt.
D. Konstruktion zusätzlicher Plasmide, die verschiedene Fragmente von eae exprimieren.
Jedes dieser Plasmide wird unter Verwendung eines Adhärenz-Assays getestet, um sicherzustellen, dass das Proteinfragment die volle Bindungsfunktion aufweist. (Siehe Beispiel IV unten). Darüber hinaus wird die Wahl der Länge des Intimins entweder davon abhängen, ob das Protein allein exprimiert wird oder ob eine Kreuzimmunität mit einem Intimin-ähnlichen Protein mit bekannter Aminosäuresequenz gewünscht wird. Beispiele für Intimin-ähnliche Proteine schließen zusätzlich zu dem von EHEC und EPEC exprimierten Intimin die Intimin-ähnlichen Proteine von Citrobacter rodentium, Hafnia alveii und die Invasine von Yersinia enterocolitica und Yersinia pseudotuberculosis ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Zum Beispiel wird das größere 900 aa Intimin gewählt, wenn es den verstärkten Wunsch nach einer Kreuzreaktion mit Yersinia pseudotuberculosis gibt, da EHEC-Intimin 31 % identische und 51 % ähnliche Aminosäuren mit dem Protein von Yersinia pseudotuberculosis teilt, das als Invasin bekannt ist (Yu, J. und Kaper, J.B. Mol. Microbiol. 6:411 (1992)). Ein höherer Grad an Homologie existiert innerhalb der aminoterminalen zwei Drittel der jeweiligen Proteine.
Bei Invasin handelt es sich um ein 103 kDa Protein der äußeren Membran, welches die bakterielle Penetration kultivierter Epithelzellen erlaubt (Isberg, R.R. et al. Cell. 60:769 (1987)) und die effiziente Penetration des intestinalen Epithels in vivo (Pepe. J.C. und V.L. Miller. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 90:6473 (1993)). Zelladhäsionsrezeptoren auf dem intestinalen Epithel, die als Integrine identifiziert wurden, binden Invasin vor der bakteriellen Internalisierung (Isberg, R.R. and J.M. Leong. Cell. 50:861 (1990)). Der zentrale Teil des Invasins ist verantwortlich für die Proteinlokalisierung an die äußere Membran, während der C-Terminus notwendig ist für die Rezeptorbindung (Isberg, R.R. Mol. Microbiol. 3:1449 (1989)).
In ähnlicher Weise wird ein größeres 900 aa Intimin ausgewählt, wenn es den verstärkten Wunsch nach Kreuzimmunität mit enteropathogenen Escherichia coli (EPEC), Citrobacter rodentium oder Hafnia alveii gibt. EPEC-Intimin teilt 83 % Identität mit EHEC-Intimin über die gesamte Länge des Proteins; die N-terminalen 75 % der Proteine weisen 94 % Identität auf, während die C-terminalen 25 % der Proteine 49 % Identität teilen (Yu, J. und Taper, J.B. Mol. Microbiol.6:411(1992)). Intimin von Citrobacter freundii teilt 84 % Nukleotididentität mit EHEC eae innerhalb der ersten 2106 bp und 57 % Identität zu den 3' gelegenen 702 bp (Schauer, D.B. und Falkow, S. Infect. Immun. 61:2486 (1993)).
Die Plasmide, die verschiedene Fragmente von eae exprimieren, können unter Verwendung einer der folgenden Methoden konstruiert werden: (1) Verwendung einer geeigneten Restriktionsstelle innerhalb von eae, z. B. pEB313 verdaut mit SalI und HindIII, Isolieren des 1298 bp Fragments und Ligieren in pQE30 (QIAGEN, Inc.), der mit SmaI und HindIII verdaut wurde. Das resultierende Plasmid exprimiert die letzten 432 Aminosäuren an dem C-Terminus von Eae; (2) Deletion von der 5'- oder 3'-Region irgendeines gewünschten Fragmentes unter Verwendung der Nuklease BAL-31, Exonuklease III oder der Nuklease aus der Mungbohne (mung bean) (alle erhältlich von New England BioLabs, 32 Tozer Rd., Beverly, MA 01915); (3) Konstruktion von Plasmiden mit nicht aufeinander folgenden eae Fragmenten, ebenfalls unter Verwendung der oben genannten Methoden; und (4) Konstruktion von Plasmiden, welche die gewünschten spezifischen Sequenzen codieren, mit Hilfe von PCR-Primern, welche die 5'- und 3'-Enden solcher Sequenzen spezifizieren, wie unten detaillierter beschrieben.
Im Hinblick auf die dritte Methode wird ein Plasmid mit einem His-Tag versehener Deletionsmutant des mittleren Drittels von Intimin konstruiert (pMW114). Das Plasmid pMW106 (unten beschrieben) wird in den dam-Stamm DMIF'Tn5lacI_Q transformiert. DNA wird unter Verwendung des QIAGEN-Kits (QIAGEN, Inc.) hergestellt und mit BclI verdaut. Die DNA wird auf einem Agarosegel laufen gelassen. Die 5178 bp Bande wird ausgeschnitten, unter Verwendung von GeneClean (Bio 101) gereinigt, ligiert und anschließend in DH5aF'Tn5lacI_Q (oder einen anderen geeigneten Stamm, wie z. B. XL1 Blue oder M15pREP4) transformiert. Die Transformanten werden mit Hilfe eines Restriktionsverdaus der DNA überprüft. Diese Beschreibung schließt die Konstruktion anderer Plasmide, welche nicht zusammenhängende eae Sequenzen codieren, nicht aus.
Im Hinblick auf die vierte Methode kann eine PCR verwendet werden, um spezifische Fragmente von eae zu amplifizieren; die Fragmente werden mit Hilfe des Restriktionsenzymverdaus und der Agarosegelelektrophorese isoliert und in den geeigneten His-Tag-Expressionsvektor (d. h. pQE30, 31 oder 32; QIAGEN, Inc.) ligiert.
Zum Beispiel werden Klone konstruiert, welche die verschiedenen Regionen von eae codieren (siehe 11 und 12). Die Fähigkeit dieser Klone, eine Adhärenzfunktion beizubehalten, wird entweder mit Hilfe (1) der Transformation in den eae Mutant, gefolgt von Adhärenz-Assays mit HEp-2 Zellen (siehe Bsp. III, Absatz C) oder (2) der Zugabe exogener Proteine zu Bakterien (siehe Bsp. III, Abschnitt D) überprüft. Es ist wichtig, dass das ausgewählte Fragment die Wildtyp-Bindungsaktivität vollständig oder fast vollständig behält.
Es wird die Hypothese aufgestellt, dass Klone, welche die höchste Bindungsaktivität aufweisen, das C-terminale Drittel (dritte Drittel) des Proteins beinhalten, vielleicht so wenig wie 150 C-terminale Aminosäuren. Diese Hypothese wird, z. B., durch die Ergebnisse, die von Frankel et al., Infection & Immunity, 62:1835 (1994), Frankel et al., Infection & Immunity, 63:4323 (1995) und Frankel et al., J. Biol. Chem., 271:20359 (1996), offenbart werden, gestützt. Proteine können nicht als lineare Anordnung von Aminosäuren betrachtet werden; eher existieren sie in einer 3-dimensionalen Struktur. Es ist wichtig, sich in Erinnerung zu rufen, dass der Austausch einer einzigen Aminosäure oder eine Deletion eines Teils des Proteins diese Struktur stören kann. Daher kann für eine vollständige Zellbindungsaktivität die Anwesenheit zusätzlicher, nicht zusammenhängender Sequenzen zusammen mit dem dritten Drittel der mutmaßlichen Bindungsdomäne erforderlich sein.
Es wird weiterhin die Hypothese aufgestellt, dass Klone, welche eine hohe Bindungsaktivität aufweisen, die zwei C-terminalen Cys (codiert an Basenpaar 2780 und Basenpaar 3002, Nummerierungsreferenz: Beebakhee, G., J. DeAzavedo und J. Brunton, FEMS Microbiology Letters 91:63 (1992)) zur angenommenen Disulfid-Brückenbildung und daraus resultierender Schleifenbildung enthalten werden. Darüber hinaus wird die Hypothese aufgestellt, dass Klone, die eine hohe Bindungsaktivität aufweisen, ein oder beide Aspartat(e) (codiert bei bp 2819 und 2828, Nummerierungsreferenz Beebakhee) erfordern. Diese Hypothese wird, z. B. durch Analogie zu Invasin, wie in Leong, J.M., Embo. J. 14:422 (1995) beschrieben, unterstützt.
Sämtliche Klone werden auf ähnliche Weise konstruiert. PCR-Primer werden entworfen, welche die 5'- und 3'-Region des gewünschten eae Fragmentes spezifizieren. Um die Klonierung in pQE31 zu erleichtern, enthält jeder 5'-Primer (MW1, MW3, MW5, MW7, MW8, MW9, MW10) eine 5' BamHI-Stelle und jeder 3'-Primer (MW2, MW4, MW6, MW11, MW12) enthält eine 5' KpnI-Stelle. Jeder PCR-Primer wird so konstruiert, dass das Leseraster der spezifischen eae Sequenz für die Insertion in pQE31 geeignet ist. Die folgenden mit einem His-Tag versehenen Konstrukte werden unter Verwendung der angegebenen PCR-Primer kloniert:

(1) pMW101 – codiert das N-terminale Drittel von Eae; 27 kDa Protein (PCR-Primer: MW1 (5' PCR-Primer) = 5' GTACGGATCCGAATTCATTTGCAAATGGTG 3'; MW2 (3' PCR-Primer) = 5' GTACGGTACCTGATCAATGAAGACGTTATAG 3');
(2) pMW102 – codiert das mittlere Drittel von Eae; 42 kDa Protein (PCR-Primer MW3 (5' PCR-Primer) = 5' GTACGGATCCTGATCAGGATTTTTCTGGTG 3'; MW4 (3' PCR-Primer) = 5' GTACGGTACCTGATCAAAAAATATAACCGC 3');
(3) pMW103 – codiert das C-terminale Drittel (282 Aminosäuren) von Eae; 32 kDa Protein (PCR-Primer: MW5 (5' PCR-Primer) = 5' GTACGGATCCTGATCAAACCAAGGCCAGCATTAC 3'; MW6 (3' PCR-Primer) = 5' GTACGGTACCTTATTCTACACAAACCGCATAG 3');
(4) pMW104 – codiert die N-terminalen zwei Drittel von Eae; 69 kDa Protein (PCR-Primer: MW1 und MW4);
(5) pMW105 – codiert die C-terminalen zwei Drittel von Eae; 73 kDa Protein (PCR-Primer: MW3 und MW6);
(6) pMW106 – codiert Eae mit einer kleinen N-terminalen Deletion von 35 Aminosäuren; 100 kDa Protein (PCR-Primer: MW1 und MW6);
(7) pMW108 – codiert die C-terminalen 150 Aminosäuren von Eae (PCR-Primer: MW7 (5' PCR-Primer) = 5' GTACGGATCCACTGAAAGCAAGCGGTGGTGATg 3'; MW6);
(8) pMW109 – codiert die C-terminalen 140 Aminosäuren von Eae (PCR-Primer: MW8 (5' PCR-Primer) = 5' GTACGGATCCTTCATGGTATTCAGAAAATAC 3'; MW6);
(9) pMW110 – codiert die C-terminalen 130 Aminosäuren von Eae (PCR-Primer: MW9 (5' PCR-Primer) = 5' GTACGGATCCGACTGTCGATGCATCAGGGAAAG 3'; MW6);
(10) pMW111 – codiert die C-terminalen 120 Aminosäuren von Eae (PCR-Primer: MW10 (5' PCR-Primer) = 5' GTACGGATCCGAATGGTAAAGGCAGTGTCG 3'; MW6);
(11) pMW112 – codiert 120 Aminosäuren von Eae mit dem C-Terminus, umfassend bp #2560-2923, (die Nummerierung bezieht sich auf die eae Sequenz des Stammes CL8, Referenz Beebakhee, G., J. DeAzavedo und J. Brunton. FEMS Microbiology Letters 91:63)). (PCR-Primer: MW7; MW11 (3' PCR-Primer) = 5' GTACGGTACCTCCAGAACGCTGCTCACTAG 3');
(12) pMW113 – codiert die C-terminalen 282 Aminosäuren von Eae, Cys bei bp 3002 ersetzt durch Ser mit Hilfe des PCR-Primers MW12 (die Nummerierung bezieht sich auf die eae Sequenz des Stammes CL8, Referenz Beebakhee, G., J. DeAzavedo und J. Brunton. FEMS Microbiology Letters91:63 (1992)) (PCR-Primer: MW5; MW12 (3' PCR-Primer) = 5' GTACGGTACCTTATTCTACAGAAACCGCATAG 3').

Alle Klone werden dadurch konstruiert, dass zunächst lyophilysierte Primer auf 10 μM mit dH₂O verdünnt werden. Template-DNA aus dem Stamm XL1 blue pEB310 (welcher das gesamte eae Gen codiert) wird unter Verwendung von QIAGEN prep (QIAGEN, Inc.) hergestellt, durch Verdau mit einem Restriktionsenzym, das nicht innerhalb oder nahe der codierenden Region schneidet, wie z. B. HindIII, linearisiert und unter Verwendung eines Spektrofotometers quantifiziert. PCR-Reaktionen werden durch Mischen von 10 μl 10 × Taq-Puffer (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, N.J.), 10 μl 2mM dNTP-Mix (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.), 10 μl 10 μM 5' PCR-Primer, 10μl 10 μM 3' PCR-Primer, 6μl 25 mM MgCl₂ (Perkin Elmer/Roche), 52 μl dH₂O und 1 μl (1-10 ng) linearer Template-DNA durchgeführt. Zwei Tropfen Mineralöl werden auf die Mischung gegeben, die 5 Minuten lang auf 100°C erhitzt wird, um das Template zu denaturieren. Ein μl (5U) AmpliTaq-Polymerase (Perkin Elmer/Roche) wird dazu gegeben, und die PCR-Reaktionen werden gestartet: 95°C/1 min, 50°C/1 min, 72°C/3 min für 30 Zyklen, gefolgt von 72°C/10 min und Verbleiben bei 4°C. Nachdem die PCR-Reaktionen abgeschlossen sind, wird die DNA zu einem Wizard PCR Clean-up-Kit (Promega, Madison, Wis.) gegeben, und in 50 μl TE-Puffer resuspendiert. Die mit Hilfe der PCR amplifizierte DNA wird mit BamHI und KpnI verdaut, auf einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen, die Bande von entsprechender Größe ausgeschnitten und mit Hilfe von Gene Clean (Bio101, LaJolla, CA.) gereinigt. Die verdauten PCR-Fragmente werden anschließend in pQE31 ligiert, der mit BamHI und KpnI verdaut wurde, in DH5αF'Tn5lacI_Q (oder einen anderen geeigneten Stamm, wie z. B. M15pREP4 oder XL1Blue) transformiert, und die Transformanten werden auf das Vorhandensein des Inserts mit geeigneter Größe überprüft.
Im Hinblick auf jeden der oben genannten Methoden kann, wenn es später notwendig ist, den Histidin-Tag in dem gereinigten Protein zu entfernen, eine Proteasespaltstelle zwischen die 6 × His Sequenz und den N-Terminus (N-terminaler Tag) oder den C-Terminus (C-terminaler Tag) des Proteins insertiert werden. Zum Beispiel erkennt die Enterokinase die Sequenz "DDDK" (Asp₄-Lys) und schneidet nach dem Lysin. Ein PCR-Primer, der diese Sequenz codiert, wird konstruiert und verwendet, um eine ortsspezifische Mutagenese des gewünschten Genfragmentes durchzuführen. Alternativ kann die Carboxypeptidase A für die Entfernung C-terminaler His-Tags verwendet werden. Dieses Enzym entfernt effizient aromatische C-terminale Reste (Hoculi, E. Chemische Industrie. 12:69 (1989)), bis es auf einen basischen Rest trifft, an welchem Punkt die Entfernung beendet wird. Zusätzlich kann die PCR verwendet werden, um einen Primer zu entwerfen, so dass die Proteasestelle an dem N- oder C-Terminus des codierten Proteins codiert wird; oder die PCR kann verwendet werden, um einen Vektor zu konstruieren, der diese Stellen beinhaltet, und die obigen Methoden können verwendet werden, um in den zuvor genannten Vektor zu klonieren.
Sämtliche Fragmente von Intimin, die von pEB312 oder anderen Konstrukten exprimiert werden, werden für die Reinigung von Intimin in großen Mengen unter Verwendung eines Protokolls, das dem Protokoll, das in Beispiel II beschrieben wird, ähnlich ist, gereinigt. Es ist offensichtlich, dass die Fachleute auf dem Gebiet zusätzliche Restriktionsstellen auswählen können.
BEISPIEL II
Anreicherung von mit Histidin versehenem Intimin in großtechnischem Maßstab
Wachstum von Massen-Expressionskulturen
Animpfen von 20 ml LB (Luria-Bertaini) Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 40 μg/ml Kanamycin, mit einer Öse M15 pREP4 pEB313 (hergestellt wie in Beispiel I oben beschrieben). Wachsenlassen über Nacht (15-18 Stunden) bei 37°C, bei heftigem Schütteln. Animpfen von 1 l LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampillicin und 40 μg/ml Kanamycin mit 20 ml der Übemachtkultur. Wachsenlassen der Kultur bei 37°C unter heftigem Schütteln bis zu einer OD₆₀₀ = 0,7-0,9 (~ 3 Stunden). Zugabe von IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Louis, MO. 63178, 1-800-325-3010) mit einer Endkonzentration von 1 mM (0,476 g) und Fortsetzen des Wachstums der Kultur für weitere 3 Stunden. Verteilen des Überstandes in 500 ml-Flaschen (die zuvor gewogen wurden) und Zentrifugieren bei 4000 × g 10 Minuten lang. Verwerfen des Überstandes, Wiegen des Zellpellets und Lagern bei –70°C oder direkte Weiterverwendung.
Auftauen der Zellen für 15 Minuten, Vortexen und Resuspendieren in Puffer A [6 M GuHCl, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0] mit 5 ml/g Nassgewicht. Rühren der Zellen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren des Lysates bei 10000 × g für 15 Minuten, Sammeln des Überstandes. Zugabe von 5 ml einer 50 % Aufschlämmung Ni-NTA-Harz (Ni-NTA-Slurry von QIAGEN, Inc.), das zuvor mit Puffer A äquilibriert wurde. Rühren bei Raumtemperatur für 45 Minuten, absetzen lassen der Aufschlämmung, Entfernen des Überstandes, Zugabe von 5 ml Puffer A, die Aufschlämmung absetzen lassen, Entfernen des Überstandes, Zugabe von 5 ml Puffer A und Laden des Harzes auf eine Säule. Die Säule wird mit 10 Säulenvolumina Puffer A gewaschen, gefolgt von Waschen mit Puffer B [8 M Harnstoff, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0], bis zu einer OD₂₈₀ ≤ 0,01 (wenigstens 5 Säulenvolumina). Waschen der Säule mit Puffer C [8 M Harnstoff, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris-HCl, pH 6,3] bis zu einer OD₂₈₀ ≤ 0,01. Das Protein wird mit Puffer C plus 0,25 mM Imidazol eluiert, wobei dreißig 1 ml-Fraktionen gesammelt werden.
Notieren der OD₂₈₀ jeder Fraktion. Vereinigen der Aliquots des gereinigten Proteins in Dialyseschläuche (Spectra/Por Cellulose Ester Membrane MW cut oft = 8000; Spectrum Medical Industries, 1100 Rankin Rd. Houston, TX. 77073-4716) und Äquilibrieren in kaltem (4°C) Puffer C. Einstellen der Konzentration der Aliquots auf ≤ 1 mg/ml unter Verwendung eines kommerziellen Standard-Quantifizierungs-Kits (Bio-Rad Microassay, Bio-Rad Labs, 2000 Alfred Noble Dr., Hercules, CA. 94547, 1-800-4810RAD) mit BSA, verdünnt in Puffer C, als Standard. Durchführen einer schrittweisen Dialyse des Proteins in der Kälte (4°C), beginnend mit Puffer C und Reduzieren der Molarität des Harnstoffes durch Steigerungen in ganzen Zahlen. Dialyse für eine Stunde in jeder Lösung, endend in 1 × PBS. Analyse des Proteins mit Hilfe von (10 %) SDS-PAGE, wobei ~ 2 μl Protein pro Tasche laufen gelassen werden, um die Proteingröße und -menge zu bestimmen. Das Molekulargewicht von RIHisEae beträgt 101 kDa.
Alternativ Zugabe des Proteins in den Dialyseschlauch, direktes Dialysieren in 1 × PBS. Quantifizieren des Proteins unter Verwendung eines kommerziellen Standardprotein-Quantifizierungs-Kits (Pierce BCA Protein Assay Kit, Pierce, P.O. Box 117, Rockford, III. 61105), Aliquotieren und Lagern bei –20°C. Wie bei der ersten Alternative Analysieren des Proteins mit Hilfe von 10 % SDS-PAGE, Laufenlassen von ~ 2 μl Protein pro Vertiefung, um die Proteingröße und -menge zu überprüfen.
Nach der Anreicherung des mit einem His-Tag versehenen Intimins wird das gewonnene Material analysiert, um den Reinheitsgrad mit Hilfe von SDS-PAGE zu bestimmen. Ein 10 % SDS-PAGE-Gel wird mit einer 2 μl-Probe des angereicherten mit einem His-Tag versehenen Intimins beladen und bei 200 V eine Stunde lang einer Elektrophorese unterzogen. Molekulargewichtsmarker werden zum Größenvergleich auf dem Gel eingeschlossen. Wird das Gel mit Colloidal Coomasie Färbung (Sigma, St. Louis, MO) gefärbt, erscheint die deutlichste Bande bei ~ 101 kDa. Mehrere weitere weniger deutliche Banden mit hohem Molekulargewicht erscheinen ebenfalls. Wird das Gel mit Silberfärbung (BioRad, Richmond, CA) in Einklang mit den Instruktionen des Herstellers gefärbt, erscheinen sehr dünne Banden mit hohem Molekulargewicht, ebenso wie einige deutliche re Banden mit niedrigen Molekulargewichten, wobei die deutlichste Bande bei etwa 29 kDa erscheint. Das angereicherte Produkt enthält vorzugsweise etwa 70-80 % des vollständig langen (d. h. 900 von 935 vorhergesagten Aminosäuren) Intimins. Vorzugsweise enthält das angereicherte Produkt nicht mehr als 25 % Kontaminanten (d. h. nicht mit Intimin verwandte Moleküle), bevorzugter nicht mehr als 20 % Kontaminanten, am meisten bevorzugt nicht mehr als 10 % Kontaminanten.
BEISPIEL III
Reinigung des angereicherten mit einem Histidin-Tag versehenen Intimins
Eine angereicherte Herstellung des mit dem His-Tag versehenen Intimins, hergestellt wie oben in Beispiel II beschrieben, wird durch Methoden gereinigt, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich der Hochleistungs-Flüssigchromatografie (high performance liquid chromatography, HPLC), Gelsäulenchromatografie und SDS-PAGE, wobei die Methoden jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
Mit Hilfe des SDS-PAGE-Verfahrens wird eine angereicherte Herstellung des mit einem His-Tag versehenen Intimins auf einem 10 % Polyacrylamidgel aufgetrennt und visualisiert, z. B. durch Färbung einer analytischen Spur mit Colloidal Coomasie-Färbung (Sigma, St. Louis, MO). Die Bande des vollständig langen Intimins mit hohem Molekulargewicht kann mit einer Rasierklinge aus dem präparativen Gel ausgeschnitten werden und bei 4°C bis zur Immunisierung gelagert werden. Fragmente von Intimin, die weniger als vollständig lang sind, d. h. Teile von Intimin und/oder Intimin, das mit einem oder mehreren Antigenen konjugiert ist, können auf ähnliche Weise aus dem Gel ausgeschnitten werden.
Unabhängig von dem Verfahren, das für die Reinigung von Intimin oder eines Teils davon verwendet wird, bezeichnet das gereinigte Protein, wie hierin verwendet, eine Population von Polypeptiden, die ausschließlich aus Intimin oder Teilen von Intimin besteht, die optional mit einem Histidin markiert sind. Es ist auf dem Gebiet anerkannt, dass die Population von Polypeptiden, die von einem DNA-Fragment exprimiert werden, das nur einen einzigen offenen Leseraster enthält, der Intimin codiert (und Intimin-ähnliche Proteine), auf einem SDS-PAGE-Gel in mehrere Banden aufgetrennt werden kann. McKee et al., Infection & Immunity, 64(6): 2225-2233 (1996), Jerse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7839-7843 (1990), und Isberg, Cell 50:769-778 (1987). Folglich kann das gereinigte Intimin, ebenso wie Teile des Intimins und Intimin, das mit einem oder mehreren Antigenen konjugiert ist, als mehrere Banden auf einem SDS-PAGE-Gel visualisiert werden.
BEISPIEL IV
A. Adhärenz-Assay
Die Adhärenz von E. coli entweder an HEp-2 oder an HCT-8 Zellen wird durch eine Modifikation des Verfahren nach Carvioto et al. Curr. Microbiol. 3: 95-99 (1979) bestimmt. Genauer gesagt, werden semikonfluente Monolayer von HEp-2 Zellen auf Glasträgern in 24 Well-Gewebskulturplatten oder in 8 Well-Permanox Chamber Slides (Nunc, Naperville, III.) mit Adhärenz-Assaymedium (EMEM oder Eagle's Minimum Essential Medium, angereichert mit 0,4 % Natriumbicarbonat und 1 % Mannose) bedeckt, welches 20 μl/ml (v/v) einer Übernachtkultur der zu testenden Bakterien in LB-Medium enthält.
Jedes Inokulum enthält ≥ 10⁷ Bakterien (unten beschrieben), was in einer ungefähren Multiplizität einer Infektion (multiplicity of infection, MOI) von 100:1 resultiert. Die infizierten Monolayer werden bei 37°C in einer 5 % CO₂-Atmosphäre inkubiert. Nach drei Stunden wird das Medium, welches die nicht adhärenten Bakterien enthält, aspiriert und die Monolayer werden einmal mit steriler 10 mM Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS: Natriumchlorid, Dinatriumphosphatat und Monokaliumphosphatat) gewaschen.
Frisches Adhärenz-Assaymedium wird zu den Zellen mit den adhärenten Bakterien gegeben, und die infizierten Zellen werden anschließend für weitere drei Stunden inkubiert. Die Monolayer werden anschließend sechsmal mit PBS gewaschen, um nicht-adhärente Bakterien zu entfernen. Die Waschlösung wird jeweils vorsichtig durch Aspiration entfernt, um das Stören der Monolayer zu vermeiden. Jedes Assay wird ≥ zweimal durchgeführt, und Duplikate von Trägem werden hergestellt, um sowohl eine Giemsa- als auch eine FITC-Phalloidin (FAS)-Färbung zu ermöglichen, um die Bindung und damit assoziierte Folgen zu visualisieren.
Für die Giemsa-Färbung werden die HEp-2 Zellen und adhärenten Bakterien mit 70 % (v/v) Methanol (Glasdeckgläser) oder in stufenweisen Waschschritten mit Aceton (Kam merobjektträger) fixiert und mit 1:10 Giemsa (Sigma) 20 Minuten lang gefärbt. Um den FAS-Phänotyp zu bestimmen, wird das FITC-Phalloidin (Sigma)-Färbeverfahren von Knutton et al. Infect. Immun. 57: 1290-1298 (1989) verwendet. Phalloidin ist ein Phallotoxin aus dem Pilz, das spezifisch filamentöses, nicht globuläres Aktin bindet. FITC-Phalloidin-gefärbte Präparate werden sowohl mit Hilfe der Phasenkontrast- als auch der Fluoreszenz-Mikroskopie unter Verwendung eines Olympus Modell GHS-Mikroskops mit einem Modell BH2-RFL lichtreflektierenden fluoreszenten Aufsatz (Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, Japan) untersucht.
Adhärenz-Assays mit HCT-8-Zellen werden mit Hilfe des oben für HEp-2 Zellen beschriebenen Verfahrens durchgeführt, jedoch wird den Bakterien erlaubt, 2,5 Stunden lang vor dem ersten Waschen und zusätzliche 2,5 Stunden lang nach dem Ende des Assays mit den HCT-8-Zellen zu interagieren. Sämtliche Assays mit HCT-8-Zellen werden in 8 Well-Permanox Kammerobjektträgern durchgeführt.
B. Konstruktion eines Bakteriums für die Verwendung in dem Assay: ein EHEC eae-Mutant
Um eine In-Frame-Deletion in der chromosomalen Kopie des eae Gens in einem bestimmten Stamm von EHEC, Stamm 86-24, zu erzeugen, wird die Wildtypkopie des Gens mit Hilfe einer doppelten homologen Rekombination durch eine intern-deletierte Kopie von eae ersetzt (13). Plasmid pEB290 (14) beinhaltet den überwiegenden Teil des eae strukturellen Gens und wird aus einem PCR-Produkt, das von dem 86-24-Chromosom mit Primer MM1 (MM1 = ATAACATGAGTACTCATGGTTG; beginnt bei dem zweiten Codon des eae strukturellen Gens und schließt eine ScaI-Restriktionsstelle ein) in Kombination mit dem Primer MM2 (MM2 = TCTAGAGAGAAAACGTGAATGTTGTCTCT) amplifiziert wird, konstruiert. Das resultierende 2953 Basenpaar Fragment, das mit Hilfe der PCR gewonnen wurde, wird mit ScaI und XbaI verdaut und in pBluescript SK⁺ (Stratagene), der mit SmaI und XbaI geschnitten wurde, ligiert. Die DNA Sequenzierung der Enden des pEB 290 Inserts zeigt, dass die 3' gelegenen 250 Basenpaare verloren gegangen sind.
Plasmid pEB290 wird in den E. coli-Stamm GM119 [dam-6, dcm-3, [Arraj, J.A. und Marinus, M.G. J. Bacteriol. 153:562-565 (1983)] transformiert, um nicht-methylierte DNA zu erhalten, die sensitiv gegenüber der Restriktionsendonuklease BclI ist. Plasmid-DNA wird isoliert (Maniatis et al., Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor (1982)) und mit BclI geschnitten, um ein internes 1125 bp Fragment aus dem Gen zu entfernen. Die resultierenden klebrigen Enden werden miteinander ligiert, um pEB300 zu erzeugen (15).
Das deletierte eae Gen wird durch Verdau von pEB300 mit XbaI und HindIII ausgeschnitten, und das Fragment, welches die eae Sequenz enthält, wird in die BamHI Stelle des Suizidvektors pAM450 ligiert (16), um pEB305 zu bilden. Plasmid pAM450 ist ein Derivat von pMAK705 (Hamilton et al., J. Bacteriol., 171:4617-4622 (1989)) mit drei besonderen Merkmalen. Zunächst besitzt es einen Temperatur-sensitiven (ts) Replikationsursprung. Zweitens trägt das Plasmid den sacB/R-Locus von Bacillus subtilis, was den Wirtsstamm sensitiv gegenüber Sucrose macht (Gay et al., J. Bacteriol164:918-921 (1985)); Lepesant et al., Marburg. Mol. Gen. Genet. 118:135-160(1972)). Drittens codiert das Plasmid eine Ampicillin-Resistenz. Diese Merkmale erlauben eine homologe Rekombination und positive Selektion für ein zweites Rekombinationsereignis, was zum Auflösen und Verlust der Vektorsequenzen führt. Die Insertion des deletierten eae Gens (aus pEB300) in den Suizidvektor (pAM450) führt zu einem Plasmid, das pEB305 genannt wird (17).
Das Suizid:eae Konstrukt, pEB305, wird mit Hilfe der Elektroporation (Sizemore et al., Microb. Pathog. 10:493-499 (1991)) in den Wildtyp EHEC-Stamm 86-24 transformiert. Doppelrekombinanten, die von den Vektorsequenzen befreit wurden, werden durch Wachstum auf Medium, das Sucrose enthält, selektiert, und anschließend auf Ampillicin-Sensitivität hin untersucht (Blomfield et al., Mol. Microbiol., 5:1447-1457 (1991)). Transformanten, welche die Suizidvektorsequenzen los geworden sind, sind Sucroseresistent, Ampicillin-sensitiv und fähig, gleich gut bei 30° und 42°C zu wachsen. Die Deletion der chromosomalen eae Sequenzen wird überprüft durch: (i) die reduzierte Größe des eae Fragmentes nach der PCR-Amplifikation mit dem MM1 und MM2; (ii) Southernblot-Analyse der mutierten chromosomalen DNA; (iii) Verlust von Restriktionsstellen innerhalb der deletierten Region des eae Gens; und (iv) die Unfähigkeit einer internen Sonde, das mutierte Chromosom zu erkennen.
Der resultierende In-Frame-Deletionsmutant des EHEC-Stammes 86-24 wird als 86-24-eaeΔ10 bezeichnet. Von der Mutation wird mit Hilfe von in vitro-Transkription und Translationsanalysen des durch die PCR gewonnenen Produktes aus 86-24-eaeΔ10 bestätigt, dass sie im Leserastern (In-Frame) ist. Ein verkürztes Proteinprodukt der vorhergesagten Größe, von etwa 68000 Da, wird durch Markieren des Translationsproduktes mit [³⁵S]-Methionin identifiziert. Der eae Mutantenstamm stimmt mit dem Wildtyp 86-24 in allen Eigenschaften überein, einschließlich: dem Wachstum in LB-Medium, der Agglutination mit 0157 und H7-Antiseren, der Unfähigkeit zur Fermentierung von Sorbitol und dem Wachstum auf MacConkey-Agar bei 37°C.
Die durchschnittlichen Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass weitere Verfahren zur Erzeugung von EHEC-Stämmen, die Mutationen in eae aufweisen und ihre Bindungsfähigkeit nicht beibehalten, möglich sind und diese ersetzen können.
C. Die Rolle von eae in der EHEC-Adhärenz in vitro.
Die isogenen Stämme, 86-24, 86-24eaeΔ10 und 86-24eaeΔ10 mit pEB310, werden auf ihre Adhärenz an HEp-2- und HCT-8-Zellen getestet. Wildtyp 86-24 bildet Mikrokolonien, wenn die Bakterien mit HEp-2- oder HCT-8-Zellen interagieren. M.L. Mckee & A.D. O'Brien, Infection & Immunity 63:2070 (1995). Diese lokalisierte Adhärenz ist FAS (fluorescence actin staining) positiv, was die Polymerisierung von F-Aktin an der Stelle der Bakterienanheftung zeigt (d. h., das erwartete Resultat). Der Mutant 86-24eaeΔ10 ist unfähig, sich an HEp-2 Zellen anzuheften. Wird eae in 86-24eaeΔ10 eingeführt, entweder auf pEB310 oder pEB311, wird der LA/FAS (LA = lokalisierte Adhärenz oder Mikrokoloniebildung)-Phänotyp vollständig wiederhergestellt, eine Beobachtung, die zeigt, dass Intimin allein die eae-Mutation komplementiert. Da beide Klone die eae-Mutation komplementieren, ist der native Promotor für eae in den PCR-amplifizierten Sequenzen vorhanden.
D. Die Wirkung der Zugabe exogener His-Intimin-Fusionsproteine
Das Adhärenz-Assay kann außerdem verwendet werden, um die Wirkung von exogen zugefügten His-Intimin-Fusionproteinen auf die Bindungsfähigkeit von 86-24eaeΔ10 und die Bindungsfähigkeit von Wildtypstamm 86-24 zu bestimmen. In diesem Fall werden gereinigte His-Intimin-Fusionsproteine zu den Monolayern von Epithelzellen vor der Zugabe der Bakterien zugegeben, wie in dem jeweiligen Experiment angegeben.
HEp-2 Zellen werden mit 20 ng–20 μg RIHisEae 30 Minuten lang vor der Zugabe von 86-24 zu dem Monolayer inkubiert. Die infizierten Monolayer werden anschließend intensiv gewaschen, mit FITC-Phalloidin gefärbt und mikroskopisch untersucht. Die Fusionsproteine erhöhen die Bindung des Wildtypstammes 86-24 an HEp-2 Zellen. Die Größe der 86-24-Mikrokolonie, ebenso wie die Gesamtzahl an HEp-2 Zellen mit adhärenten Mikrokolonien nimmt mit zunehmender Konzentration an RIHisEae zu. In hohen Dosen (20 μg) veranlasst das Fusionsprotein die HEp-2 Zellen, anomale Stiele und Fortsätze zu zeigen. Daher sind 1-2 μg die bevorzugteste Dosis für weitere Studien.
Wird es exogen zu HEp-2 Zellen dazugegeben, komplementiert RIHisEae den HEp-2 Zellenbindungsdefekt von 86-24eaeΔ10 (oder stellt die Bindungsfähigkeit wieder her). Das kürzere Fusionsprotein, RVHdHisEae, komplementiert ebenfalls die Adhärenz. Eine ähnliche aminoterminale Fusion von Histidinresten an Dihydrofolatreduktase aus der Maus (His-DHFR) erhöht die Adhärenz von 86-24 nicht. Darüber hinaus sind Plasmide, welche die Intimin-Fusionsproteine codieren, pEB312 und pEB313, fähig, 86-24eaeΔ10 für die Anheftung in vitro zu komplementieren. Folglich zeigen solche Studien, dass die von pEB312 und pEB313 codierten Proteine ausreichen, um Adhärenz zu verleihen.
Wie oben in Beispiel I erwähnt, sind die Fusionsproteine nach dem Aufschluss der Wirtsstämme mit Schallwellen in der unlöslichen Pelletfraktion lokalisiert, was zeigt, dass diese Proteine in der Membran lokalisiert sind. Das Plasmid pQE16, welches die His-DHFR-Fusion codiert, komplementiert 86-24eaeΔ10 nicht (Daten nicht gezeigt). Dass das irrelevante Fusionsprotein mit den Histidinresten dem eae-Mutanten keine HEp-2 Zelladhärenz verleiht, zeigt, dass die Histidinreste, an die Intimin angefügt wurden, nicht für die Aktivität verantwortlich sind, die für die exogen zugegebenen Histidinfusionsproteine beobachtet wurde. Die Verstärkung oder Komplementierung der EHEC-Bindung and HEp-2 Zellen, die mit exogenem RIHisEae und RVHdHisEae zu beobachten ist, zeigt, dass Intimin sowohl mit den Bakterien als auch den Epithelzellen interagiert.
BEISPIEL V
Die Rolle von eae in vivo – Infektionsmodell gnotobiotischer Ferkel
Die Rolle von Intimin bei der intestinalen Kolonisierung, A/E-Läsionsbildung und EHEC-vermittelten Kolitis und Diarrhö in gnotobiotischen Ferkeln wird mit Hilfe des Verfahrens von Francis, et al. (Francis et al., Infect. Immun., 51:953-956 (1986)) bestimmt. Beide Ferkelpaare, die mit dem Wildtyp-Elternstamm 86-24 inokuliert wurden, entwickeln Diarrhö und weisen bei der Nekropsie Ödeme in dem Mesenterium des Spiralkolons auf.
Histologisch betrachtet kolonisiert der Stamm 86-24 primär das Zökum und das Spiralkolon. Histologisch und in Kultur lässt sich kein Anhalt für eine bakterielle Dissemination in die Leber, Niere, Lunge oder ins Hirn finden. Eine enge Bakterienadhärenz und A/E-Läsionen, wie die von Staley (Staley et al., Vet. Pathol. 56:371-392 (1969)) und Moon (Moon et al., Infect. Immun., 41:1340-1351 (1983)) für EPEC beschriebenen, sind sowohl im Lichtmikroskop als auch in der EM-Untersuchung des Zökum und des Darms von mit 86-24 infizierten Ferkeln ersichtlich. A/E-Läsionen schließen die Akkumulation von elektronendichtem Material an der Stelle der Anheftung ein. In einigen Bereichen sind abgeworfene enterozytische Fragmente und Mikrovilli mit angehefteten Bakterien in dem Darmlumen zu beobachten. In histologischen Schnitten des Zökums und des Spiralkolons von mit 86-24 infizierten Ferkeln wird ein inflammatorisches Infiltrat beobachtet. Die Entzündung ist gekennzeichnet durch vereinzelte Neutrophile in der Lamina propria und eine leicht diffuse Akkumulation von seröser Flüssigkeit und perivaskulären Lymphozyten und Makrophagen in der Submukosa.
Beide Ferkel, die mit dem Mutantenstamm 86-24eaeΔ10 inokuliert wurden, haben zum Zeitpunkt der Nekropsie Kot gebildet. Histologisch betrachtet und durch EM-Untersuchung gibt es keinen Anhaltspunkt, dass der Stamm 86-24eaeΔ10 fähig ist, den Darm des Ferkels zu kolonisieren und die A/E-Läsion zu verursachen. Die wenigen Bakterien, die im Lichtmikroskop und bei der EM-Untersuchung beobachtet werden, befinden sich in dem Schleim, der das Mukosaepithel des Zökums und des Spiralkolons bedeckt. Eines der beiden Ferkel, die mit 86-24eaeΔ10 inokuliert wurden, weist leichte Ödeme im Mesokolon auf, jedoch werden in keinem der Ferkel größere oder mikroskopische Läsionen beobachtet.
Mit 86-24eaeΔ10 (pEB310) beimpfte Ferkel zeigen bei der Nekropsie zähflüssigen Kot und Ödeme im Mesokolon. Der Stamm 86-24eaeΔ10 (pEB310) heftet sich eng an die mukosalen Enterozyten an und verursacht A/E-Läsionen in dem Zökum und dem Spiralkolon. Histologisch betrachtet wird außerdem eine perivaskuläre lymphohistiozytäre Typhlocolitis, ähnlich der, die durch den Wildtyp 86-24 verursacht wird, beobachtet.
Ähnliche Experimente werden in einem Modell eines neugeborenen Kalbs, dem das Kolostrum vorenthalten wurde, durchgeführt, und sie zeigen, dass Intimin notwendig ist, um A/E-Läsionen in dem Darm hervorzurufen, ebenso wie eine durch E. coli O157:H7-Stamm 86-24-vermittelte Diarrhö zu verursachen (A.D. O'Brien, M.R. Wachtel, M.L. McKee, H.W. Moon, B.T. Bosworth, C. Neal Stewart, Jr. und E.A. Dean-Nystrom. "Intimin: Candidate for an Escherichia coli O157:N7 Anti-Transmission Vaccine". Abstract of the 32nd Joint Conference on Cholera and Related Diarrhea Diseases, Nagasaki, Japan, Nov 14-16, 1996). Diese Experimente zeigen außerdem, dass nach 2 Tagen nach der Infektion die Anzahl der infizierenden Organismen in dem unterem Darm in den Tieren, denen der eae-Mutant oder ein nicht-pathogener E. coli Stamm verfüttert wurde, signifikant geringer ist als in den Kälbern, die mit dem Wildtyp oder dem eae-Mutanten mit dem komplementierenden Klon gefüttert wurden.
BEISPIEL VI
Erkennen der EHEC-Proteine durch HC-Patientenseren
Getestete konvaleszente Immunseren von Patienten mit hämorrhagischer Kolitis (freundlich zur Verfügung gestellt von T. Barrett vom Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) reagieren mit P_T7-exprimierten Intimin-Herstellungen (d. h. His-Intimin, das von pEB310 und pEB311 exprimiert wird) in einem Western-Immunblot. Um die Reaktivität der Seren von Patienten mit hämorrhagischer Kolitis mit E. coli Proteinen in dem Expressionssystem zu reduzieren, werden die Serenproben mit Gesamtzellextrakten von DH5α, die mit pGP1-2 und pBRKS^– (dem Expressionsvektor) transformiert wurden, adsorbiert. Nach der Adsorption erkennen die normalen Serenkontrollen nur Proteine in der Ammoniumsulfat-konzentrierten Fraktion der Intimin-Herstellungen, reagieren jedoch nicht länger mit Proteinen, die von pEB310 oder der Vektorkontrolle exprimiert werden. Nach der Adsorption erkennen die HC-Patientenseren noch immer sehr viele E. coli-Proteine, die Reaktion mit Intimin bleibt jedoch stark.
BEISPIEL VII
Verabreichung von His-Intimin an Patienten
Das folgende Beispiel stellt die Verabreichung von His-Intimin an Patienten zur Stimulierung einer protektiven Immunantwort bereit. Eine protektive Immunantwort ist eine, welche ausreichend Antikörper hervorruft, um einem Patienten das Verhindern einer Infektion zu ermöglichen, die Bedeutung oder Schwere einer Infektion zu verringern oder die Fähigkeit der Bakterien, den gastrointestinalen Trakt zu kolonisieren, zu reduzieren.
Verfahren zur Verabreichung von His-Intimin schließen die Injektion (einschließlich, jedoch nicht auf diese beschränkt, der intraperitonealen, intravenösen, subkutanen und intramuskulären) des His-Intimins direkt in den Patienten, um eine Immunantwort auszulösen, die Ingestion oder Zwangsernährung des His-Intimins allein oder mit der Nahrung und die intranasale Inokulation mit His-Intimin, was die Bindung des Intimins an Rezeptoren von Epithelzellen in dem Nasopharynx fördert, ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Wird das His-Intimin geschluckt, befindet sich das Protein in einer Gelkapsel, einem Liposom oder ist an eine inerte Substanz angeheftet, um die Passage des Inokulums durch den Magen zu unterstützen. Da das Fusionsprotein säurestabil ist, kann es außerdem allein aufgenommen oder in Nahrungsprodukte gemischt werden. Ein bevorzugtes Verfahren der Verabreichung ist ein Fusionsprotein aus His-Intimin und SLT (Shiga-ähnliches Toxin, Shiga-like toxin). Ein His-Intimin SLT-Fusionsprotein wird über die SLT-Rezeptorinteraktion an SYNSORB (SynSorb Biotech, Inc., 1204 Kensington Rd, N.W., Calgary, Alberta, Kanada, T2N3P5), das einen Rezeptor für SLT aufweist, gebunden. Das SYNSORB-Konstrukt wird mit einem Schokoladenpudding gemischt und an Kinder verfüttert.
Gereinigtes RiHisEae (mit einem His-Tag versehenes Eae, 900/935 Aminosäuren), ebenso wie das dritte Drittel von Intimin (codiert von pMW103) sind nach der Inkubation bei pH 2,0 bei 37°C 24 Stunden lang stabil. Dies zeigt, dass ein His-Eae Fusionsprotein unbeschädigt und unzersetzt den Magen passieren kann. Darüber hinaus wird Eae in der Natur auf der äußeren Membran des Bakteriums exprimiert und fördert die enge Ad härenz nach der Passage durch den Magen noch immer, was dessen Resistenz gegenüber sauren Umgebungen zeigt.
Die Ingestion oder intranasale Inokulation stimuliert die lokale Immunität, was zukünftige Kolonisierung durch EHEC und EPEC verhindert. Eine Kreuzimmunität durch Homologie wird gegen Hafnia alveii und Citrobacter rodentium, Yersinia sp. und anderen Bakterienspezies, die Intimin-ähnliche Proteine aufweisen, stimuliert. Obwohl es nicht notwendig ist, den Grad der Kreuzimmunität, die durch Verabreichung von Intimin verliehen wird, zu quantifizieren, um von einer protektiven Immunantwort gegen Infektionen durch andere Bakterien als EHEC zu profitieren, die Intimin-verwandte Proteine exprimieren, wird ein Assay für einen solchen Schutz in Beispiel IX beschrieben. Das Assay erlaubt die Bestimmung der Effizienz von Intimin-Antikörpern, die Interaktion von Pathogenen, von denen bekannt ist, dass sie Intimin-ähnliche Bindungsproteine aufweisen, mit Epithelzellen zu blockieren.
In einer weiteren Ausführungsform führt die Injektion von His-Intimin in Kuheuter zu einer Immunantwort in der Kuh. Antikörper gegen das Protein sind in der Milch der Kuh vorhanden. Kälber, welche die Milch trinken, werden passiv immunisiert, bis sie durch Verfahren nach Wahl aktiv immunisiert werden können. Alternativ kann His-Intimin an Kühe verfüttert werden oder in das Futter der Kühe eingemischt werden. Das Vorhandensein von His-Intimin, das auf diese Weise eingeführt wird, stimuliert außerdem eine Antikörperantwort in den Kühen, so dass Antikörper produziert werden und in der Kuhmilch auftreten.
Eine weitere Ausführungsform betrifft die Verabreichung von Nukleinsäure-Vakzinen. His-Intimin wird als nackte eae-DNA in einen Patienten injiziert, oder die DNA wird dem Körper über ein Trägersystem, wie z. B. Retroviren, Adenoviren oder andere Träger, die auf dem Gebiet bekannt sind, verabreicht. Im Anschluss an die Verabreichung baut der Patient eine Immunantwort gegen transient exprimierte fremde Antigene auf.
Aktuelle Nukleinsäure-Vakzine nähern sich im Allgemeinen klinischen Versuchen. Dieser Vakzinierungsansatz umfasst das Einbringen der DNA, welche für das gewünschte Antigen codiert, durch Insertieren des Gens in einen nicht-replikativen Plasmidvektor in den Wirt (Marwick, C. JAMA 273:1403 (1995); reviewed in Vogel, F.R. and N. Sarver. Clin. Microbiol. Rev. 8:406 (1995)).
Der erste publizierte Nachweis der protektiven Wirkung eines solchen Vakzins hat gezeigt, dass die intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA, welche für das Nukleoprotein (NP) des Influenza A-Virus (A/PR/8/34) codiert, eine protektive Immunantwort in Balb/c-Mäusen gegen einen heterologen Stamm des Influenza-Virus (A/HK/68) hervorrief (Ulmer, J.B. et al. Science 259:1745 (1993)). Die immunisierten Tiere zeigten reduzierte Virustiter in ihren Lungen, einen geringeren Gewichtsverlust und eine erhöhte Überlebensrate im Vergleich zu provozierten Kontrollmäusen. Sowohl NP-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) und NP-Antikörper wurden erzeugt. Die NP-Antikörper konnten keinen wirksamen Schutz verleihen, jedoch töteten die CTLs virusinfizierte Zellen und Zellen, die mit dem passenden Hauptkompatibilitätskomplex Klasse I-beschränkten Peptidepitop gepulst waren.
Eine andere Studie hat gezeigt, dass die intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA, die für das Hämagglutinin des Influenza-Virus A/PR/8/34 codiert, zu der Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern führt, welche die Mäuse gegen eine Provokation mit einem heterologen letalen Influenza-Virus schützen (Montgomery, D.L. et al. DNA Cell Biol. 12:777 (1993)).
Die Ausführung der Erfindung mit Hilfe dieses Verfahrens kann durch Hinweise auf die zuvor genannten Artikel, insbesondere Montgomery, D.L. et al. DNA Cell Biol. 12:777 (1993) erreicht werden. Der eae Locus ist in 5 beschrieben, entsprechend seiner Restriktionsstellen und entsprechend seiner Sequenz in 3 für Stamm CL8, und dessen Sequenz in Stamm 933 ist in 4 gezeigt.
BEISPIEL VIII
A. Konjugation von Antigenen aus verschiedenen Pathogenen mit His-Intimin, um eine Immunantwort sowohl gegen Eae als auch das konjugierte Antigen hervorzurufen.
Antigene (Ag) und Haptene von verschiedenen Pathogenen werden mit einem mit Histidin versehenen Intiminmolekül konjugiert. Dieses Fusionsprotein wird als Inokulum mit Intimin verwendet, der als Träger zur zielgerichteten Bindung an intestinale Epithelzellen wirkt. Diese Konjugatprotein kann in einer der folgenden Konfigurationen konstruiert werden: N-His-Intimin-Ag-C, N-Ag-Intimin-His-C, N-His-Ag-Intimin-C, N-Intimin-Ag-His-C, N-Intimin-His-Ag-C oder N-Ag-His-Intimin-C.
Die Größe des Intimins ändert sich mit der Größe des zu fusionierenden Antigens und der Anzahl der Antigene, an die das Intimin fusioniert wird, wie von den Fachleuten auf dem Gebiet erkannt werden wird. Die bei dem Entwurf solcher Fusionsproteine zu berücksichtigenden Variablen sind: (1) das fremde Antigen; (2) die Größe des verwendeten Intimins, das jede mögliche Größe haben kann, die die Bindungsfunktion, wie oben beschrieben, behält; (3) die Fusionsreihenfolge N-C; und (4) das Verfahren der Konjugation, wie z. B. genetische Verfahren, wie die Klonierung und Expression eines Fusionsproteins und chemische Verfahren, obwohl zusätzliche Verfahren für die Fachleute auf dem Gebiet leicht offensichtlich sind (D.V. Goeddel, "Systems for Heterologous Gene Expression," Meth. Enzymol., Vol. 185, Academic Press, New York, 1990.; K. Itakura, "Expression in E. coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin," Science,198: 1056-1063 (1977); und D.V. Goeddel et al., "Expression of chemically synthesized genes for human insulin," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 281:544-548 (1979)).
Die Lieferung dieser gekoppelten Antigene geschieht unter Verwendung der gleichen Mechanismen wie denen für Histidin-markiertes Intimin allein, wie oben in Beispiel VII dargelegt.
Haptene und Antigene können von Bakterien, Rickettsien, Pilzen, Viren, Parasiten, Arzneimitteln oder Chemikalien abgeleitet sein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Sie können z. B. kleine Moleküle, wie Peptide, Oligosaccharide und Toxine, enthalten. Bestimmte antimikrobielle Arzneimittel, chemotherapeutische Arzneimittel, welche die Fähigkeit aufweisen, auf der Mukosaoberfläche absorbiert zu werden, können ebenfalls an Intimin gekoppelt werden. Die Antigene und Polysaccharide, die an Intimin gekoppelt werden können und verabreicht werden können, um eine protektive Immunantwort zu stimulieren, können die in Tabelle 1 unten gezeigten enthalten. Tabelle 1 Antigene und/oder Polysaccharide aus:
Die Größen des His-Intimins, welche an die in Tabelle 1 aufgeführten Antigene konjugiert werden können, schließen RIHisEae (900/935 aa, EcoRI-HindIII Fragment von pEB313) und RVHindHis (604/935 aa, EcoRV-HindIII Fragment von pEB313), wie oben in Beispiel I dargelegt, ein. Die Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass zusätzliche Fragmente mit variierenden Längen, welche eine Adhärenzaktivität aufweisen, ausgewählt werden können. Die Effizienz der Fragmente, welche für die Auswahl in Betracht gezogen werden, kann gemäß den in Beispiel IV beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
B. Konstruktion eines Plasmids, das N-His-IcsA-Intimin-C exprimiert.
Shigella flexneri verursacht bazilläre Dysenterie in Menschen durch Invasion der Epithelzellen der Darmmukosa (Labrec et al. J. Becteriol. 88:11503-1518, (1964)). Ein 120 kDa Protein der äußeren Membran, IcsA genannt, ist notwendig für die intra- und interzelluläre Ausbreitung dieses Organismus (Bernardini et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.86:3867-3871, (1989); Lett et al. J. Bacteriol. 171:353-359, (1989)). Ein iscA-Mutant (SC560) wurde einigermaßen gut von oral infizierten Makacken-Affen toleriert und rief einen Schutz gegen homologe Provokation hervor (Sansonetti et al. Vaccine 9:416-422,1991).
Das folgende Protokoll kann verwendet werden (18):
Transformieren von pEB313 in einen dam^–-Wirt, wie z. B. DM1 (Gibco BRL, P.O. Box 68, Grand Island, N.Y. 14072, 1-800-828-6686). Verdau von pEB313/ClaI/HindIII, Isolieren des 1796 bp Fragmentes (dieses Fragment codiert die letzten 547 Aminosäuren von Intimin). Ligieren in BluescriptSK+/ClaI/HindIII (pBluescriptSK+ ist erhältlich von Stratagene, 11011 N. Torrey Pines Rd., La Jolla, CA. 92037, 1-800-424-5444). Das Plasmid wird pEae1 genannt. Verdau von pHS3192 mit AvaI, Auffüllen des Endes mit dem Klenow-Fragment, Verdau mit ClaI, Isolieren des 2490 bp Fragments [dieses Fragment codiert 2923 bp oder 974 aa von Basenpaar #706-3629; der ORF von icsA umfasst bp #574-3880, das sind 3306 bp und codiert 1102 aa's; Referenz für die Sequenz von icsA ist Lett et al., J. Bacteriol. 171:353 (1989)] (pHS3192 ist erhältlich von P. Sansonetti (Referenz Bernardini, M.L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:3876 (1989)). Ligieren des 2490 bp Fragments in pEae1, der mit ClaI und HindIII verdaut wurde, Herstellen eines Plasmides, das pEae2 genannt wird. Unter Verwendung dieser Restriktionsenzyme bleiben die Leseraster von icsA und eae im Raster. Verdau von pEae2 mit XhoI und HindIII, Isolieren des 4286 bp Fragmentes; Ligieren in pQE 32 (QIAGEN), der mit SmaI und HindIII verdaut wurde. Diese Ligation wird den richtigen Leserahmen von beiden Genen mit dem Promotor aufrechterhalten. Das resultierende Plasmid wird plcsA-Eae genannt.
Alternativ könnte man zwei Gene im Leseraster durch Klonieren mit Hilfe von PCR fusionieren, gefolgt von einer Ligation in den geeigneten pQE-Vektor. Diese Methode ist den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt.
C. Herstellen eines Konjugat-Vakzins unter Verwendung von His-Intimin als Proteinträger.
Während jedes Polysaccharid verwendet werden könnte, wird in diesem Vakzin das kapsuläre Vi-Polysaccharid von Salmonella typhi verwendet. Reinigung des His-Intimins wie in Beispiel II; dieses würde mit Vi konjugiert (gereinigt aus S. typhi gemäß den etablierten Verfahren (Szu et al. J. Exp. Med. 166:1510 (1987)). Die Konjugation wird unter Verwendung der Standard-Protein-Polysaccharid-Konjugationstechniken durchgeführt, die den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Konjugationsverfahren sind den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und schließen die Heteroligationsmethoden von Brunswick, M. et al., J. Immunol. 140:3364,1988, ein. Siehe auch Chemistry of Protein conjugates and Crosslinking CRC Press, Boston (1991).
Methoden zur Konjugation von Komponenten an primäre oder sekundäre Träger sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und schließen, zum Teil, die Kopplung über zur Verfügung stehende funktionelle Gruppen ein (wie z. B. Amino-, Carboxyl-, Thio- und Aldehydgruppen). Siehe S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking CRC Press (1991); und Brenkeley et al. Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes, Haptens and Cross-linking Agents, Bioconjugate Chemistry 3 #1 (Jan. 1992).
Ein Vakzin wie das in diesem Beispiel beschriebene würde einen Schutz vor Diarrhö verursachenden Pathogenen zur Verfügung stellen, die sowohl solche Organismen einschließen, die Intimin exprimieren (oder Intimin-ähnliche Proteine), als auch ein Diarrhö verursachendes Pathogen, das Vi exprimiert.
Jegliche Kombination eines Intimins mit einem anderen Antigen von einem anderen Diarrhö-verursachenden Pathogen kann vorgenommen werden. Darüber hinaus wäre das Intimin-Polysaccharid-Vakzin, wenn Polysaccharide aus Organismen verwendet würden, welche andere Krankheiten hervorrufen, wie z. B. Polysaccharide von Pneumokokken, nützlich zum Schutz vor multiplen Krankheiten. Die Verabreichung eines Vakzins gegen respiratorische Pathogene wird bevorzugterweise direkt in den Respirationstrakt erfolgen; mit der Nahrung aufgenommene Pathogene über die Ingestion.
BEISPIEL IX
Erzeugen und Testen von Adhärenz-blockierenden anti-Intimin Antikörpern: polyklonal und monoklonal
Polyklonale anti-Intimin Antiseren mit hohem Titer werden bei intraperitonealer Injektion von RIHisEae in Mäuse, Kaninchen und Ziegen hervorgerufen. Das Überprüfen des Antikörpertiters und ein Antikörper-Effektivitäts-Assay werden gezeigt. Die Erzeugung monoklonaler Antikörper wird ebenfalls beschrieben.
A. Erzeugen polyklonaler Antikörper
Verschiedene Methoden können verwendet werden, um Antikörper gegen vollständig langes Intimin oder verschiedene Teile davon in verschiedenen Tieren herzustellen. Mehrere dieser Methoden werden unten beschrieben. Wie von dem Fachmann auf dem Gebiet erkannt werden würde, können polyklonale Antikörper aus Intimin und Teilen von Intimin erzeugt werden, die nicht mit einem His-Tag versehen sind, sowie von Intimin-ähnlichen Proteinen und Teilen davon.
1. Erzeugen von Maus anti-RIHisEAE polyklonalen Antikörpern
Die Methode von Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988), kann verwendet werden. Das allgemeine Vorgehen wird hierin beschrieben. Entnahme von Vor-Blut jeder zu immunisierenden Maus: Bluten aus der Schwanzvene in ein Eppendorf-Gefäß. Inkubieren bei 37°C für 30 Minuten, sanftes Rühren mit einem sterilen Zahnstocher (um den Pfropfen aufzulösen), über Nacht Lagern bei 4°C. Am Morgen 10 min/10000 rpm in der Mikrofuge zentrifugieren und Sammeln des Serums (d. h. des Überstandes; rote Blutzellen befinden sich im Pellet). Lagern des Serums bei –20°C. Die erhaltenen Seren werden als Negativkontrolle verwendet werden, nachdem die Mäuse immunisiert wurden.
Intraperitoneales Injizieren von 25 μg RIHisEae (unter Verwendung von Titremax-Adjuvans, gemäß den Instruktionen des Herstellers (CytRyx Corp., 154 Technology Pkwy., Norcross, GA. 30092, 800-345-2987) in eine Maus. 2 Wochen abwarten, mit einer identischen Injektion boosten, 7 Tage warten und aus der Schwanzvene in ein Ep pendorf-Gefäß bluten lassen. Inkubieren 30 min bei 37°C, sanftes Rühren mit einem sterilen Zahnstocher (um den Pfropfen zu lösen), über Nacht lagern bei 4°C. Am Morgen in der Mikrofuge 10 min/10000 rpm zentrifugieren und das Serum sammeln. Lagern der Seren bei –20°C.
2. Erzeugen von anti-drittes Drittel von Intimin polyklonalen Seren aus der Maus:
Mäuse werden über die Schwanzvene, wie oben in Beispiel IX, Teil A beschrieben, vorgeblutet. Das dritte Drittel von Intimin wird angereichert und, wie oben in Beispiel III beschrieben, dialysiert. Mäusen wird das dritte Drittel von Intimin, gemischt mit TitreMax-Adjuvans, wie in Beispiel IX, Teil A beschrieben, injiziert. Nach 3 Boosts werden die Mäuse über den Sinus retro orbitalis geblutet, und die Seren werden, wie in Beispiel IX, Teil A beschrieben, hergestellt. Die Seren werden mit Hilfe von Westernblot-Analysen, wie unten in Abschnitt 4 für die polyklonalen Seren aus der Ziege beschrieben, getestet. Die Seren werden auf ihre Fähigkeit, die EHEC-Adhärenz an HEp-2 Zellen zu blockieren, wie oben in Beispiel IX, Teil C beschrieben, überprüft.
3. Erzeugen von polyklonalen anti-Intimin Antikörpern aus Kaninchen
Polyklonale Seren aus Kaninchen werden gegen das (1) erste Drittel, (2) zweite Drittel und (3) dritte Drittel von Intimin erzeugt. Jedes spezifische Serum wird separat in dem HEp-2 Adhärenz-Assay auf seine Kapazität, die Adhärenz von EHEC auf HEp-2 Zellen zu blockieren, getestet.
Herstellung eines ersten Drittelteils von Intimin für die Kaninchenimmunisierung
Klon pMW101 wird in den Stamm DH5αF'lacI^Q transformiert. Die Induktion der Proteinexpression und die Reinigung des mit einem His-Tag versehenen Intiminfragments über die Ni-NTA-Affinitätssäule wird wie in dem Qiagen-Handbuch, das dem QIAexpressionist Ni-NTA resin purification-Kit beiliegt (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) beschrieben, durchgeführt. Die eluierten Fraktionen werden auf ihren Proteingehalt bei A₂₈₀ und mit Hilfe der Bradford-Analyse unter Verwendung eines Färbereagenz von Bio-Rad (Hercules, CA) überprüft. Peak-Fraktionen, die von der Ni-NTA-Säule (mit 250mM Imidazol) eluiert wurden, werden auf 15 % Polyacrylamidgelen mit SDS zur Analyse und Reinigung einer Elektrophorese unterzogen. Um die Proteine auf den Gelen zur Analyse zu visualisieren, werden sowohl Silber- (Bio-Rad) als auch Coomassieblau G-250 (Sigma)-Färbungen verwendet.
Um das Protein zur Immunisierung von Tieren zum Erhalt von Antiseren zu reinigen, werden die Peak-Säulenfraktionen auf präparativen SDS-Polyacrylamidgelen laufen gelassen, und die Proteine werden mit Kupfer-Färbung (Copper stain, Bio-Rad) visualisiert. Die Proteinbande, welche dem Intiminfragment entspricht, wird mit einer sauberen Rasierklinge aus dem Gel ausgeschnitten, und das Gelstück wird gemäß den Instruktionen, die mit dem Kupfer-Färbereagenz bereitgestellt werden, entfärbt. Das Protein wird anschließend unter Verwendung eines Elektroeluters Modell 422 (Bio-Rad) gemäß den Instruktionen des Herstellers aus dem Gelstück eluiert. Das Protein wird danach unter Verwendung eines Centricon10-Konzentrators von Amicon (Beverly, MA) konzentriert. Der überwiegende Teil an SDS in der eluierten Proteinprobe wird durch eines von zwei Verfahren entfernt. Das erste Verfahren beinhaltet die Zugabe von Phosphat-gepufferter Satzlösung (PBS) zu der Proteinprobe, was die Präzipitation von SDS hervorruft. Der überwiegende Teil des Proteins präzipitiert nicht, und das Präzipitat wird nicht analysiert, um zu bestimmen, welche Ionen ebenfalls präzipitiert sein könnten. Das SDS wird durch Zentrifugation pelletiert; und der Überstand, der das meiste Protein und möglicherweise einen Rest SDS enthält, wird entfernt und unter Verwendung eines Centricon-10-Konzentrators von Amicon (Beverly, MA) konzentriert.
Das zweite Verfahren zur Entfernung des SDS beinhaltet die Herstellung einer Säule aus Extracti-Gel^RD Detergent Removing Gel, das von Pierce (Rockford, IL) erworben wird. Das Extracti-Gel^RD Detergent Removing Gel wird gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet. Das gereinigte Protein wird wie oben beschrieben konzentriert. Die Proteinkonzentrationen werden mit Hilfe der Bradford-Analyse unter Verwendung eines Färbereagens, das von Bio-Rad erworben wird, und außerdem durch Laufenlassen verschiedener Volumina an gereinigtem Protein auf einem Gel neben Aliquots mit variierenden Mengen der originalen Säulenfraktionen, um die Proteinmengen visuell zu vergleichen, bestimmt. Fraktionen dieses gereinigten Proteins werden mit Hilfe von SDS-PAGE unter Verwendung von sowohl Silber- als auch Coomassie-Färbung analysiert.
Herstellen eines zweiten Drittelteils von Intimin für die Kaninchenimmunisierung
Die Reinigung des mit einem His-Tag versehenen mittleren Drittelfragments des Intiminproteins, das von dem Klon pMW102 exprimiert wird, wird mit Hilfe derselben Verfahren, die für das N-terminale Drittel verwendet wurden, mit den folgenden Instruktionen durchgeführt. Die SDS-PAGE-Analyse wird unter Verwendung eines 12,5 % Acrylamidgels durchgeführt. Für die Gelreinigung des Proteins und die Elektroelution werden die meisten präparativen Gele mit Kupferfärbung, wie oben beschrieben, gefärbt; und ein Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue, das in Wasser gelöst wurde, wie Harlow E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben, gelöst. Viel von dem SDS in den elektroeluierten Proteinfraktionen wird durch Zugabe von PBS-Puffer präzipitiert. Für die Konzentrierung des Proteins werden Amicon Centricon-30-Konzentratoren verwendet (Amicon).
Herstellung des dritten Drittelteils von Intimin für die Kaninchenimmunisierung
Das dritte Drittel Intiminprotein wird wie oben in Beispiel II beschrieben angereichert und dialysiert. Ein mg Protein wird mit Hilfe von SDS-PAGE auf vier BioRad MiniProtean II-Gelen laufen gelassen. Das Protein wird negativ mit Copper stain (BioRad, cat # 161-0470, Richmond, CA) in Übereinstimmung mit den Instruktionen des Herstellers wie folgt gefärbt: das Gel wird in dH₂O 45 gespült, in 1 × Kupferfärbung 5 Minuten gefärbt und 3 Minuten lang in dH₂O gespült. Das Gel wird gegen einen schwarzen Hintergrund visualisiert, und die ~ 37 kDa Proteinbande wird mit einer Rasierklinge aus dem Gel ausgeschnitten. Gereinigte Gelstücke werden anschließend in Puffer (25 mM Trisbase, 192 mM Glycin, 3 × /10 min) entfärbt, in Plastikfolie eingewickelt und bei –20°C bis zur Immunisierung gelagert.
Immunisierung von Kaninchen

Weiße, weibliche New Zealand-Kaninchen (5 bis 6 Pfund) werden getrennt voneinander mit den wie oben hergestellten Antigenen in Übereinstimmung mit einem Zeitplan, der von dem Fachmann auf dem Gebiet leicht bestimmt werden kann, immunisiert. Ein Beispiel für solch einen Zeitplan ist der Folgende:

TAG	VERFAHREN
0	Vorbluten/initiale Inokulation, 100 μg Ag, gemischt mit vollständigem Freund'schen Adjuvans
14	Boost, 50 μg, gemischt mit unvollständigem Freund'schen Adjuvans
21	Boost, 50 μg, gemischt mit unvollständigem Freund'schen Adjuvans
35	Testblut
45	Boost, 50 μg, gemischt mit unvollständigem Freund'schen Adjuvans
56	Testblut

Der Injektionsweg kann subkutan und/oder intermuskulär an mehreren Stellen sein. Seren, die von Testblut stammen, werden auf die spezifische Erkennung des Antigens mit Hilfe von Westernblot-Analyse getestet, wie für die polyklonalen Seren aus der Ziege in Abschnitt 4 unten beschrieben. Sobald eine Erkennung des Antigens mit hohem Titer erreicht wird, wie von dem Fachmann auf dem Gebiet erkennbar ist, wird das Kaninchen ausgeblutet, um die Antikörper zu gewinnen. Die Blutprobe mit großem Volumen wird mit Hilfe der Westernblot-Analyse auf spezifische Erkennung des Antigens überprüft.
Affinitätsreinigung von anti-Intimin polyklonalen Seren aus Kaninchen mit Hilfe von Westernblot
Anti-Intimin polyklonale Seren aus Kaninchen werden affinitätsgereinigt, um kreuzreagierende Antikörper, die nicht spezifisch für Intimin oder Intimin-ähnliche Proteine sind, aus den Seren zu entfernen (Harlowe, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988), S. 498 oder S.H. Lillie und S.S. Brown. Yeast. 3:63 (1987)). RIHisEae (0,250 mg) wird mit Hilfe von SDS-PAGE einer Elektrophorese unterzogen (Größe: BioRad MiniProtean II minigel, BioRad, Richmond, CA), auf Nitrocellulose übertragen und mit Ponceau S (Sigma, St. Louis, MO.) gefärbt. Ein Streifen der Nitrocellulose, welcher die Bande mit dem vollständig langen His-Intimin enthält (etwa 100 kDa) wird mit einer Rasierklinge ausgeschnitten, und der das Protein enthaltene Nitrocellulosestreifen wird über Nacht bei 4°C in 2 % Milch/TBS-0,2 % Tween inkubiert, wobei er sanft geschüttelt wird. Der Nitrocellulosestreifen wird kurz in TBS-Tween gewaschen und in einem Container auf ein Stück Parafilm (American National Can, Greenwich, Conn.) platziert. Kaninchenserum wird auf den Miniwesternblot pipettiert (soviel Volumen wie passt, etwa 400-500 μl), und feuchte Papiertücher werden über den Con tainer gelegt, ohne dass sie den Nitrocellulosestreifen berühren, gefolgt von Plastikfolie. Der Blot wird 5 Stunden lang vorsichtig geschüttelt, danach werden die Seren (jetzt "depletierte Seren" genannt) entfernt und für die Analyse aufgehoben. Der Streifen wird dreimal in PBS 10 Minuten lang gewaschen, und Glycinpuffer (150 mM NaCl, pH 2,3 mit HCl) wird für 30 Minuten dazugegeben (soviel Volumen, wie auf den Streifen passt). Affinitätsgereinigte Antikörper werden abpipettiert und 1/10 Volumen Tris-HCl, pH 8,0 wird dazugegeben. Die so gewonnenen Antikörper werden anschließend mit 1N NaOH neutralisiert und mit Hilfe der Westernblot-Analyse, wie unten beschrieben, getestet.
Affinitätsreinigung von anti-Intimin polyklonalen Seren aus Kaninchen mit Hilfe einer Antigen-Affinitätssäule
Anti-Intimin polyklonales Serum aus Kaninchen wird affinitätsgereinigt, um kreuzreagierende Antikörper, die nicht spezifische Intimin sind, aus dem Serum zu entfernen. Antiseren, die gegen Intimin oder verschiedene Teile davon gewonnen wurden, werden unter Verwendung einer Antigen-Affinitätssäule unter Verwendung von Methoden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wie z. B. die in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschriebenen, gereinigt.
Die Antigene (Intimin oder Teile von Intimin) werden wie oben in Beispiel II beschrieben angereichert. Antigene können darüber hinaus mit Hilfe der Elektrophorese auf einem Acrylamidgel, gefolgt von einer Elektroelution aus einem Gelstück, welches das Protein enthält, wie unten in Teil 4 beschrieben gereinigt werden. Andere Verfahren können die Gelreinigung und Elektroelution zur weiteren Reinigung des Proteins nach der Elution von der Ni-NTA-Säule ersetzen. Diese Verfahren können die Ionenaustauschsäulenchromatografie und Gelfiltrationschromatografie einschließen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Nach der Reinigung kann es notwendig sein, das Intiminprotein für die Kopplung an aktivierte Beads, um das Affinitätsharz für die Antiserenreinigung zu bilden, in einen geeigneten Puffer zu dialysieren.
Aktivierte Beads, die sind für die Kopplung an das Antigen geeignet sind, werden auf der Grundlage verschiedener Eigenschaften ausgewählt: Kopplungsreagens, Bindungsgruppe oder Matrix, Liganden und Stabilität der endgültigen Matrix (wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) auf geführt). Zum Beispiel wird das gereinigte Intimin-Proteinantigen (oder Teile des Intimin-Proteinantigens) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers (Bio-Rad, Richmond, CA) an Affigel-Beads gekoppelt. Eine Säule aus den aktivierten Beads, die an das Antigen gekoppelt sind, wird hergestellt und in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers der Beads gewaschen. Die Säule wird anschließend gemäß dem in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschriebenen Verfahren gewaschen.
Eine Ammoniumsulfatpräzipitation wird verwendet, um die Seren bei der Herstellung für die Affinitätssäule teilweise zu reinigen. Die Ammoniumsulfatpräzipitation, das Resuspensieren des Proteinpellets in PBS, die Dialyse der Lösung gegen PBS und die Zentrifugation zur Klärung der Lösung werden wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben, durchgeführt.
Antiseren, die teilweise mit Hilfe der Ammoniumsulfatpräzipitation und der Dialyse gegen PBS gereinigt wurden, werden über die Antigen-Affinitätssäule wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben, gegeben. Die Antiseren können mehrere Male über die Säule gegeben werden, da dies zu einer vollständigeren Bindung der Antikörper an die Säule führen kann. Die Säule wird anschließend gewaschen und die affinitätsgereinigten Antikörper werden eluiert und wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben, gegen PBS dialysiert.
Adhärenz-Assay
Affinitätsgereinigtes polyklonales Serum wird in HEp-2 Zelladhärenz-Assays auf die Fähigkeit zur Blockierung der bakteriellen Bindung in HEp-2 Zellen unter Verwendung des unten in Beispiel IX, Teil C beschriebenen Verfahrens überprüft.
4. Erzeugung von anti-RIHIsEae polyklonalen Antikörpern aus der Ziege
Vorblut wird von potenziellen zu immunisierenden Ziegen abgenommen. Das Blut wird von der Vena jugularis unter indirektem Vakuum gewonnen. Die Seren werden wie oben in Beispiel IX, Abschnitt A beschrieben von dem Vollblut getrennt und mit Hilfe eines ELISA unter Verwendung von RIHisEae als Adsorptionsmittel (wie in Beispiel IX, Ab schnitt B unten für den ELISA und Beispiel II oben für die Anreicherung von RIHisEae beschrieben) oder mit Hilfe einer Westernblot-Analyse, wie unten beschrieben, getestet.
Die für die Immunisierung ausgewählte Ziege weist Vorimpfserum mit sowohl (a) der geringsten Erkennung von Intimin in der Westernblot-Analyse und (b) dem geringsten Titer gegen Intimin im ELISA auf und hat nicht die Angewohnheit, aus der Weide auszubrechen.
Westernblot-Analyse von anti-RIHisEae polyklonalem Serum aus der Ziege
a. Erzeugen von Gesamtzell-Lysaten
Die gewünschten Stämme (z. B.: 86-24, 86-24eaeΔ 10, DH5α, M15 pREP4 pEB313) werden über Nacht in LB, enthaltend die geeigneten Antibiotika, bei 37°C unter Schütteln wachsen gelassen. Zellen (4,5 ml) werden in einem Eppendorfgefäß pelletiert und 500 μl Ultraschallpuffer (50 mM Na-Phosphat pH 7,8, 300 mM NaCl) werden dazu gegeben. Die Zellen werden in 15 sekündigen Pulsen auf Eis beschallt, aliquotiert und bei –20°C eingefroren.
b. Westernblot-Analyse
Gesamtzelllysate, die wie oben hergestellt wurden (2-5 μl) oder gereinigtes RIHisEae (2 μl) werden mit Hilfe von SDS-PAGE laufen gelassen, auf Nitrocellulose übertragen und für die Westernblot-Analyse von Ziegenseren verwendet. Die Seren (primäre Antikörper) werden zu diesem Zweck typischerweise 1:500 oder 1:1000 verdünnt. Der sekundäre Antikörper, der verwendet wird, ist ein Schwein-anti-Ziegen-IgG, der mit Meerrettichperoxidase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) konjugiert ist, 1:2000 verdünnt. Vorblut von Ziegenserum enthält gewöhnlich mehrere kreuzreaktive Banden, die später mit Hilfe der Affinitätsreinigung entfernt werden.
Herstellung von gereinigtem RIHisEae (Antigen) zur Immunisierung in Ziegen
Ein mg RIHisEae, das wie in Beispiel II oben beschrieben erzeugt wurde, wird mit Hilfe eines präparativen SDS-PAGE laufen gelassen. Eine dünne analytische Spur wird mit Colloidal Coomasie-Färbung (Sigma, St. Louis, MO) gefärbt und für den Vergleich mit dem Rest auf dem präparativen Gel verwendet. Die Bande von vollständig langem Intimin mit hochmolekularem Gewicht (nicht gefärbt, läuft bei etwa 100 kDa) wird mit einer Rasierklinge aus dem präparativen Gel ausgeschnitten und bei 4°C bis zur Immunisierung gelagert.
Immunisierung der Ziegen mit Antigen
Weibliche Ziegen (etwa eineinhalb Jahre alt, reinrassige Saanan oder Saanan X La-MANCHA) wurden getrennt voneinander mit den wie oben beschrieben hergestellten Antigenen in Übereinstimmung mit einem Zeitplan, der von dem Fachmann auf dem Gebiet leicht bestimmt werden könnte, immunisiert. Zum Beispiel wird der Ziege eine primäre Immunisierung von 500 μg des hergestellten RIHisEae, gemischt mit vollständigem Freund'schen Adjuvans, verabreicht. In Zwei-Wochen-Intervallen wird die Ziege mit 250 μg Ag, gemischt mit unvollständigem Freund'schen Adjuvans, geboostet. Testblutungen werden begonnen, nachdem die Ziege einen Monat lang immunisiert worden ist und fortgesetzt, bis ein hoher anti-Intimin Titer erreicht wird, was durch Westernblot-Analyse bestimmt wird, wie oben beschrieben. Wenn das Serum Intimin mit Hilfe von Westernblot erkennt, werden pro Sitzung große Blutproben entnommen (500 ml, was etwa 250 ml Serum ergibt), mit zweiwöchigen Intervallen zwischen großen Blutungen. Die daraus resultierenden großvolumigen Serumproben werden auf die Erkennung mit Intimin mit Hilfe der Westernblot-Analyse wie oben beschrieben verifiziert.
Affinitätsreinigung von Ziege anti-Intimin polyklonalem Serum mit Hilfe von Westernblot
Ziege anti-Intimin polyklonales Serum wird affinitätsgereinigt, um kreuzreaktive Antikörper aus dem Serum zu entfernen, die nicht spezifisch für Intimin sind. (Harlowe, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988), S. 498 oder S.H. Lillie und S.S. Brown. Yeast. 3:63 (1987)). RIHisEae (0,250 mg) wird mit Hilfe von SDS-PAGE einer Elektrophorese unterzogen (Größe: BioRadMini Protean II minigel, BioRad, Richmond, CA), auf Nitrocelullose übertragen und mit Ponceau S (Sigma, St. Louis, MO.) gefärbt. Ein Streifen Nitrocellulose, der die Bande mit vollständig langem His-Intimin enthält (etwa 100 kDa) wird mit einer Rasierklinge ausgeschnitten, und der Cellulosestreifen, der das Protein enthält, wird über Nacht bei 4°C in 2 % Milch/TBS-0,2 % Tween inkubiert, wobei er sanft geschüttelt wird. Der Nitrocellulosestreifen wird kurz in TBS-Tween gewaschen und in einen Container auf ein Stück Parafilm (Ame rican National Can, Greenwich, Conn.) gelegt. Ziegenserum wird auf den Miniwesternblot (soviel Volumen wie passt, etwa 400-500 μl) pipettiert, und feuchte Papiertücher werden auf den Container platziert, ohne dass sie den Nitrocellulosestreifen berühren, gefolgt von einer Plastikfolie. Der Blot wird 5 Stunden lang sanft geschüttelt, anschließend wird das Serum (jetzt "depletiertes Serum") entfernt und für die Analyse aufbewahrt. Der Streifen wird 3 mal mit PBS 10 Minuten lang gewaschen, und Glycinpuffer (150 mM NaCl, pH 2,3 – mit HCl) wird für 30 Minuten dazugegeben (soviel Volumen wie auf den Streifen passt). Affinitätsgereinigte Antikörper werden abpipettiert und 1/10 Volumen Tris-HCl, pH 8,0 wird dazugegeben. Die Antikörper werden anschließend mit 1N NaOH neutralisiert und mit Hilfe der Westernblot-Analyse, wie oben beschrieben, getestet.
Affinitätsreinigung von anti-Intimin polyklonalem Serum aus Kaninchen Mit Hilfe einer Antigen-Affinitätssäule
Kaninchen anti-Intimin polyklonales Serum wird affinitätsgereinigt, um kreuzreagierende Antikörper aus dem Serum zu entfernen, die nicht spezifisch für Intimin sind. Gegen Intimin oder verschiedene Teile davon erzeugte Antiseren werden unter Verwendung einer Antigenaffinitätssäule unter Verwendung von Methoden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wie z. B. den in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschriebenen, gereinigt.
Die Antigene (Intimin oder Teile von Intimin) werden, wie oben in Beispiel II beschrieben, angereichert. Die Antigene können weiterhin mit Hilfe der Elektrophorese auf einem Acrylamidgel, gefolgt von Elektroelution aus einem Gelstück, das das Protein enthält, wie unten in Teil 4 beschrieben, gereinigt werden. Weitere Verfahren können die Gelreinigung und Elektroelution ersetzen, um das Protein nach der Elution von der Ni-NTA-Säule weiter zu reinigen. Diese Verfahren können Ionenaustauschsäulenchromatografie und Gelfiltrationschromatografie enthalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Nach der Reinigung kann es sein, dass das Intiminprotein zur Kopplung an aktivierte Beads in einen geeigneten Puffer dialysiert werden muss, um das Affinitätsharz für die Antiserumreinigung zu bilden.
Aktivierte Beads, die für die Kopplung an das Antigen geeignet sind, werden auf Grundlage verschiedener Eigenschaften ausgewählt: Kopplungsreagens, Bindungsgruppe oder Matrix, Ligandenanfügung und Stabilität der endgültigen Matrix (wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988)) aufgelistet. Zum Beispiel wird das gereinigte Intimin-Proteinantigen (oder Teile des Intimin-Proteinantigens) an Affigel-Beads (Bio-Rad, Richmond, CA) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers gekoppelt. Eine Säule aus den aktivierten Beads, die an das Antigen gekoppelt sind, wird hergestellt und gemäß den Angaben des Herstellers der Beads gewaschen. Die Säule wird anschließend in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben wird, gewaschen.
Die Ammoniumsulfatpräzipitation wird verwendet, um das Serum bei der Herstellung der Affinitätssäule teilweise zu reinigen. Die Ammoniumsulfatpräzipitation, Resuspension des Proteinpellets in PBS und Dialyse der Lösung gegen PBS und die Zentrifugation zur Klärung der Lösung, wird wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben, durchgeführt.
Das Antiserum, das teilweise mit Hilfe der Ammoniumsulfatpräzipitation und der Dialyse gegen PBS gereinigt wurde, wird über die Antigenaktivitätssäule, wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben, gegeben. Die Antiseren können mehrere Male über die Säule gegeben werden, da dies zu einer vollständigeren Bindung der Antikörper an die Säule führen kann. Die Säule wird anschließend gewaschen und die affinitätsgereinigten Antikörper werden eluiert und gegen PBS dialysiert, wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben.
Adhärenz-Assays
Affinitätsgereinigte polyklonale Seren werden in HEp-2 Zelladhärenz-Assays auf die Kapazität zur Blockierung der bakteriellen Bindung an HEp-2 Zellen unter Verwendung des unten in Beispiel IX Teil C beschriebenen Verfahrens untersucht.
B. ELISA zur Bestimmung des Titers der Antikörper
Der Methode von Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) kann gefolgt werden. Das allgemeine Verfahren wird unten dargelegt:

(1) Binden von RIHisEae an Plastikmikrotiterplatten mit 50 ng/Well in PBS. Inkubieren 2 Std./RT (Raumtemperatur) oder über Nacht bei 4°C.
(2) Waschen der Platte 2 × mit PBS.
(3) Blockieren der Wells mit 100 μl Blocking-Lösung [3 % bovines Serumalbumin (Sigma Chemical, St. Louis, MO.), 0,02 % Natriumazid (Sigma) in PBS – Aufbewahren der Stammlösung bei 4°C] 1-2 Stunden lang bei RT.
(4) Waschen der Platte 2 × mit PBS.
(5) Primärer Antikörper (Ab) = 50 μl Testserum, z. B. verdünnt in Blocking-Lösung, beginnend mit 1: 50 und Ausführen von elf 1:2-Verdünnungen oder beginnend mit 1:50 und elf 1:10-Verdünnungen), Inkubieren 2 Std./RT.
(6) Waschen 4 × mit PBS.
(7) Sekundärer Antikörper (Ab) = Ziege anti-Maus Ig, konjugiert mit Meerrettich, affinitätsgereinigt (Boehringer Mannheim Corp., 9115 Hague Rd., P.O. Box 50414, Indianapolis, IN. 46250, 800-262-1640). Zugabe des sekundären Antikörpers, der 1:500 in Blocking-Lösung ohne Azid verdünnt wurde. Inkubieren 1 Std./RT.
(8) Waschen 4 × mit PBS.
(9) Zugabe von 100 μl TMB-Peroxidasesubstrat zu jeder Vertiefung (hergestellt gemäß den Angaben des Herstellers, BioRad Labs, 3300 Regatta Blvd., Richmond, CA. 94804). Entwickelnlassen der blauen Farbe (nicht länger als 10 min). Stoppen der Reaktion mit 100 μl H₂SO₄. Auswerten der Platte bei 450 nm.

Ein Titer wird definiert als Absorptionswert ≥ 0,2 Einheiten über dem Wert, der für Prä-Immunserum der Maus erhalten wurde.
Anti-Intimin Antikörper können verabreicht werden, um einem Patienten, der dies braucht, passiven Immunschutz zur Verfügung zu stellen. Darüber hinaus können die anti-Intimin Antikörper, die von Tieren erhalten werden, klinisch in Menschen verwendet werden. In solchen Fällen wird bevorzugt, den Antikörper zu humanisieren. Solche Methoden sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohl-bekannt. G. Winter et al., "Man-made antibodies," Nature, 349: 293-299 (1991); P.T. Jones et al., "Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse," Nature, 321: 522-525 (1986); P. Carter et al., "Humanization of an antip185^HER2 antibody for human cancer therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992). Solche Antikörper können den Geschwistern eines infizierten Patienten verabreicht werden, um das Risiko einer Infektion des Geschwisters zu reduzieren.
C. Westernblot-Analyse von anti-RIHisEae polyklonalem Serum
Polyklonales Serum wird mit Hilfe der Westernblot-Analyse untersucht, um das Erkennen von Intimin zu überprüfen.
1. Erzeugung von Gesamtzelllysaten
Die gewünschten Stämme (z. B.: 86-24, 86-24eaeΔ 10, DH5α, M15 pREP4 pEB313) werden über Nacht in LB, enthaltend die geeigneten Antibiotika, bei 37°C unter Schütteln wachsen gelassen. Zellen (4,5 ml) werden in einem Eppendorfgefäß pelletiert und 500 μl Ultraschallpuffer (50 mM Na-Phosphat pH 7,8, 300 mM NaCl) werden dazu gegeben. Die Zellen werden in 15 sekündigen Pulsen auf Eis beschallt, aliquotiert und bei –20°C eingefroren.
2. Westernblot-Analyse
Gesamtzelllysate, die wie oben hergestellt wurden (2-5 μl) oder gereinigtes RIHisEae (2 μl) werden mit Hilfe von SDS-PAGE laufen gelassen, auf Nitrocellulose übertragen und für die Westernblot-Analyse von Serum verwendet. Die Seren (primärer Antikörper) werden zu diesem Zweck typischerweise 1:500 oder 1:1000 verdünnt. Der sekundäre Antikörper ist spezifisch für das Tier, welches Quelle des Primärantikörpers ist und ist mit Meerrettichperoxidase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) konjugiert. Vorblut von Serum kann mehrere kreuzreaktive Banden enthalten, die später mit Hilfe der Affinitätsreinigung entfernt werden.
D. Affinitätsreinigung von anti-Intimin polyklonalem Serum mit Hilfe von Westernblot
Anti-Intimin polyklonales Serum wird affinitätsgereinigt, um kreuzreaktive Antikörper aus dem Serum zu entfernen, die nicht spezifisch für Intimin sind. (Harlowe, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988), S. 498 oder S.H. Lillie und S.S. Brown. Yeast. 3:63 (1987)). RIHisEae (0,250 mg) wird mit Hilfe von SDS-PAGE einer Elektrophorese unterzogen (Größe: BioRadMini Protean II minigel, BioRad, Richmond, CA), auf Nitrocelullose übertragen und mit Ponceau S (Sigma, St. Louis, MO.) gefärbt. Ein Streifen Nitrocellulose, der die Bande mit vollständig langem His-Intimin enthält (etwa 100 kDa) wird mit einer Rasierklinge ausgeschnitten, und der Cellulosestreifen, der das Protein enthält, wird über Nacht bei 4°C in 2 % Milch/-TBS-0,2 % Tween inkubiert, wobei er sanft geschüttelt wird. Der Nitrocellulosestreifen wird kurz in TBS-Tween gewaschen und in einen Container auf ein Stück Parafilm (American National Can, Greenwich, Conn.) gelegt. Serum wird auf den Miniwesternblot (soviel Volumen wie passt, etwa 400-500 μl) pipettiert, und feuchte Papiertücher werden auf den Container platziert, ohne dass sie den Nitrocellulosestreifen berühren, gefolgt von einer Plastikfolie. Der Blot wird 5 Stunden lang sanft geschüttelt, anschließend wird das Serum (jetzt "depletiertes Serum") entfernt und für die Analyse aufbewahrt. Der Streifen wird 3 mal mit PBS 10 Minuten lang gewaschen, und Glycinpuffer (150 mM NaCl, pH 2,3 – mit HCl) wird für 30 Minuten dazugegeben (soviel Volumen wie auf den Streifen passt). Affinitätsgereinigte Antikörper werden abpipettiert und 1/10 Volumen Tris-HCl, pH 8,0 wird dazugegeben. Die Antikörper werden anschließend mit 1N NaOH neutralisiert und mit Hilfe der Westernblot-Analyse wie oben beschrieben getestet.
E. Affinitätsreinigung des anti-Intimin polyklonalen Serums durch eine Antigen-Affinitätssäule
Kaninchen anti-Intimin polyklonales Serum wird affinitätsgereinigt, um kreuzreagierende Antikörper aus dem Serum zu entfernen, die nicht spezifisch für Intimin sind. Gegen in timin oder verschiedene Teile davon erzeugte Antiseren werden unter Verwendung einer Antigenaffinitätssäule unter Verwendung von Methoden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wie z. B. die in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschriebenen, gereinigt.
Die Antigene (Intimin oder Teile von Intimin) werden, wie oben in Beispiel II beschrieben, angereichert. Die Antigene können weiterhin mit Hilfe der Elektrophorese auf einem Acrylamidgel, gefolgt von Elektroelution aus einem Gelstück, das das Protein enthält, wie unten in Teil 4 beschrieben, gereinigt werden. Weitere Verfahren können die Gelreinigung und Elektroelution ersetzen, um das Protein nach der Elution von der Ni-NTA-Säule weiter zu reinigen. Diese Verfahren können Ionenaustauschsäulenchromatografie und Gelfiltrationschromatografie enthalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Nach der Reinigung kann es sein, dass das Intiminprotein zur Kopplung an aktivierte Beads in einen geeigneten Puffer dialysiert werden muss, um das Affinitätsharz für die Antiserumreinigung zu bilden.
Aktivierte Beads, die für die Kopplung an das Antigen geeignet sind, werden auf Grundlage verschiedener Eigenschaften ausgewählt: Kopplungsreagens, Bindungsgruppe oder Matrix, Ligandenanfügung und Stabilität der endgültigen Matrix (wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988)) aufgelistet. Zum Beispiel wird das gereinigte Intimin-Proteinantigen (oder Teile des Intimin-Proteinantigens) an Affigel-Beads (Bio-Rad, Richmond, CA) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers gekoppelt. Eine Säule aus den aktivierten Beads, die an das Antigen gekoppelt sind, wird hergestellt und gemäß den Angaben des Herstellers der Beads gewaschen. Die Säule wird anschließend in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben wird, gewaschen.
Die Ammoniumsulfatpräzipitation wird verwendet, um das Serum bei der Herstellung der Affinitätssäule teilweise zu reinigen. Die Ammoniumsulfatpräzipitation, Resuspension des Proteinpellets in PBS und Dialyse der Lösung gegen PBS und die Zentrifugation zur Klärung der Lösung, wird wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben, durchgeführt.
Das Antiserum, das teilweise mit Hilfe der Ammoniumsulfatpräzipitation und der Dialyse gegen PBS gereinigt wurde, wird über die Antigenaktivitätssäule, wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben, gegeben. Die Antiseren können mehrere Male über die Säule gegeben werden, da dies zu einer vollständigeren Bindung der Antikörper an die Säule führen kann. Die Säule wird anschließend gewaschen und die affinitätsgereinigten Antikörper werden eluiert und gegen PBS dialysiert, wie in Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben.
F. Assay zur Blockierung der bakteriellen Bindung durch Antikörper gegen Intimin
Um die Wirkung von anti-Intimin Antikörpern auf die EHEC-Adhärenz zu überprüfen, werden Maus, Kaninchen oder Ziege anti-Intimin Antiseren (oder normale Seren als Kontrollen) zu EHEC-Bakterien gegeben, die in Adhärenzmedium suspendiert sind, und die Bakterien-Antiseren-Mischungen werden bei 37°C dreißig Minuten lang vor der Infektion von HEp-2 Zellen inkubiert. Die Antiseren werden das ganze Assay über in dem Adhärenzmedium aufbewahrt. Die Adhärenz und die damit in Zusammenhang stehenden Folgeerscheinungen werden unter Verwendung von GIEMSA- und FITC-Phalloidin (FAS)-Färbung wie oben beschrieben mikroskopisch untersucht.
Um die Wirkung der anti-Intimin Antikörper auf die Adhärenz anderer Bakterien, die Intimin-ähnliche Proteine aufweisen, zu überprüfen, werden Maus, Kaninchen oder Ziege anti-Intimin Antiseren (oder normale Seren als Kontrollen) zu EHEC-Bakterien gegeben, die in Adhärenzmedium suspendiert sind, und die Bakterien-Antiseren-Mischungen werden bei 37°C dreißig Minuten lang vor der Infektion mit HEp-2 Zellen inkubiert.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden den Fachleuten auf dem Gebiet nach Betrachten der Beschreibung und der Ausführung der darin offenbarten Erfindung offensichtlich sein.
G. Erzeugung monoklonaler Antikörper, die spezifisch für Intimin sind
Monoklonale Antikörper, die gegen Intimin gerichtet sind, werden verwendet, um einen Patienten passiv gegen die Kolonisierung durch EHEC (oder Bakterien, die Intimin-ähn liche Proteine exprimieren) zu schützen. Monoklonale Antikörper werden von Mauszellen erzeugt, und die Spezifität dieser Antikörper wird für die Verwendung in Menschen verändert. G. Winter et al., "Man-made antibodies, "Nature, 349: 293-299 (1991);P.T. Jones et al., "Replacing the complementarity determining regions in a human antibody with those from a mouse," Nature, 321: 522-525 (1986); P. Carter et al., "Humanization of ananti-p185^HER2 antibody for human cancer therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992). Monoklonale Antikörper stellen einen "reineren" Antikörper für die Verabreichung an einen Patienten dar.
1. Erzeugung monoklonaler anti-Eae Antikörper
Zwei Beispiele für Verfahren zur Erzeugung monoklonaler anti-Intimin Antikörper werden unten beschrieben.
a. Verfahren 1
Erzeugung von anti-Eae mAbs
Dem Verfahren, das in Harlow, E. und D. Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1988) dargestellt wird, wird mit Modifikationen gefolgt. Neun Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Harlan Spraque-Dawley, Indianapolis, IN) werden für die Herstellung monoklonaler Antikörper verwendet. Vor der Immunisierung wird eine Serumprobe von jeder Maus über den Sinus retro orbitalis gewonnen. Das Vollblut wird in ein Mikrofugengefäß gegeben und bei 4°C zwischen 4 und 16 Stunden abgekühlt. Serum wird durch Zentrifugation des Vollblutes bei 1000-1200 × g für 15 Minuten bei 10-15°C hergestellt. Das Serum wird unter Verwendung einer Mikropipette und sterilen Pipettenspitzen in neuen Mikrofugengefäße überführt. Das Serum wird bei –20°C bis zu seiner Verwendung gelagert.
Das Antigen wird von SDS-PAGE-Gelen von RIHisEae erhalten, das wie oben in Beispiel II beschrieben erhalten wurde. Die Intiminbande mit hohem Molekulargewicht wird mit einer Rasierklinge ausgeschnitten, wie oben in Beispiel IX, Abschnitt A, Teil 4 beschrieben. Ein mg RIHisEae wird auf vier MiniProtean II-Gelen (BioRad, Richmond, CA) zu diesem Zwecke laufen gelassen. Von dem aus den Gelen ausgeschnittenen Protein wird unter Verwendung eines Mörsers und Stößels in etwa 8 ml Phosphat-gepufferter Salzlö sung (PBS) ein Brei hergestellt. Am Tag 0 des Experimentes werden 0,8 ml des Breis mit 1,2 ml vollständigen Freund'schen Adjuvans (complete Freund's adjuvant, CFA) gemischt und in 0,2 ml Aliquots subkutan in jede der vier Mäuse injiziert. 0,5 ml des Breis werden mit 0,5 ml RIBI T-700-Adjuvans (RIBI Immunochem, Hamilton, Montana) gemischt und 0,2 ml werden in jede der vier zusätzlichen Mäuse injiziert.
An den Tagen 21 und 42 des Experiments erhalten die Mäuse Booster-Injektionen. Das Antigen wird wie oben beschrieben hergestellt, mit dem Unterschied, dass unvollständiges Freund'sches Adjuvans (incomplete Freund's adjuvant, IFA) anstelle von CFA verwendet wird.
Serumproben werden wie oben an den Tagen 14, 35 und 49 des Experimentes entnommen.
Die Serumproben werden mit Hilfe eines Immun-Assays (wie unten beschrieben) untersucht, um Mäuse zu identifizieren, die Serum mit der stärksten Antwort gegen Eae produzieren, was von den Fachleuten auf dem Gebiet erkannt würde. Die Reaktivität der Serumproben wird mit Hilfe einer Westernblot-Analyse, wie oben in Beispiel IX, Absatz 4, Teil 4 beschrieben, überprüft. Drei Tage vor der Fusion (am Tag 59 des Experiments) wird die für die Fusion ausgewählt Maus mit einer 50 %-Mischung des Überstandes des Intiminbreis in PBS immunisiert. Insgesamt 0,1 ml dieses Breis werden intravenös über die Schwanzvene injiziert.
Milzzellen von der ausgewählten Maus werden mit SP2/0 Myelomzellen (Cat # CRL1581 American Type Culture Collection, Rockville, MD 20850, 301-881-2600) fusioniert. Ein Verhältnis von 10 Milzzellen zu 1 Myelomzelle wird für die Fusion verwendet. Die Fusion wird durch die Verwendung von Polyethylenglycol (Cat # 783 641 Boehringer-Mannheim Corp., 9115 Hague Road, PO Box 50414, Indianapolis, IN 46250, 800-262-1640) erreicht. Fusionierte Zellen werden in 96 Well-Gewebskulturschalen für das Wachstum verteilt. Hybridome werden durch Wachstum der Kulturen für 10 Tage in Medium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält, selektioniert. Hybridome, welche anti-Intimin-spezifische Antikörper sezernieren, werden aus den 96 Well-Gewebskulturschalen mit Hilfe eines Immun-Assays wie unten beschrieben identifiziert. Kulturen, die positiv für Antikörper sind, die mit Eae reagieren, werden durch Transfer in 24 Well-Schalen expandiert, erneut auf Reaktivität mit Eae mit Hilfe eines Immun-Assays getestet und zweimal durch limitierende Verdünnung kloniert.
Immunassay (ELISA) von polyklonalem anti-Initmin-Serum aus der Maus und von Hybridom-Überständen (anti-Intimin monoklonale Antikörper)
Drei ml des Intiminbreies, der für die Immunisierung verwendet wurde, wird bei etwa 1000 × g 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Eine Probe des resultierenden, geklärten Überstandes wird verwendet, um die Immunassay-Platten zu beschichten. Kurz beschrieben, wird der Intimin-enthaltende Überstand 1:300 in PBS verdünnt und als Antigen zum Beschichten verwendet. Nunc Maxisorp Stripwells werden mit 100 μl/Well des verdünnten Überstandes 2-24 Stunden lang bei Raumtemperatur beschichtet.
Nicht gebundenes Material wird mit vier Waschschritten mit PBS, enthaltend 0,5 % Tween-20 (PBS-T), aus den Vertiefungen gewaschen. Für Untersuchungen der Serumproben werden mehrfache Verdünnungen einer jeden Probe in PBS-T hergestellt und zu Replikat-Vertiefungen gegeben. Für Untersuchungen von Kulturüberständen von 96 Well-Kulturschalen wird jeder Überstand 1:2 in PBS-T verdünnt und zu einer einzelnen Vertiefung gegeben. Überstände von 24 Well-Kulturschalen werden ebenfalls 1:2 in PBS-T verdünnt und in Duplikaten getestet. Assays von Serumproben beinhalten eine Pufferkontrolle und eine bekannte polyklonale anti-Intimin-Kontrolle. Assays von Überständen schließen eine Pufferkontrolle, eine Mediumkontrolle und eine bekannte polyklonale anti-Intimin Kontrolle ein.
Serum und Überstände werden in einer zugluftfreien Umgebung bei Raumtemperatur 30- 60 Minuten lang auf den mit Intimin beschichteten Vertiefungen inkubiert, und nicht gebundene Antikörper und Fremdbestandteile (wie z. B. Serumproteine) werden mit vier Waschschritten mit PBS-T aus den Vertiefungen gewaschen. Jeder Well enthält anschließend 100 μl Kaninchen anti-Maus IgG (gamma-spezifisch)-HRP (Zymed, South San Francisco, CA), 1:4000 in PBS-T verdünnt.
Die Platten werden erneut in einer zugluftfreien Umgebung bei Raumtemperatur 30-60 Minuten lang inkubiert. Jede Vertiefung erhält anschließend 100 μl einer Einkomponenten-TMB-Substratlösung (Kirkegaard and Perry Labs, Gaithersburg, MD 20878, 301-948- 7755). Die Reaktion wird 15 Minuten im Dunkeln weiter laufen gelassen und anschließend durch Zugabe von 80 μl/Well TMB-Stoppreagens (Kirkegaard and Perry Labs, Gaithersburg, MD 20878, 301-948-7755) gestoppt.
b. Verfahren 2
Dem in Harlow, E. und D. Lane, Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) dargelegten Verfahren wird gefolgt: fünf 4 bis 5 Wochen alte weibliche BALB/cJ-Mäuse werden vorgeblutet und intraperitoneal mit 25 μg RIHisEae, das in 100 μl TiterMax suspendiert ist, immunisiert. Die Mäuse werden zweimal in Zwei-Wochen-Intervallen intraperitoneal mit 25 μg RIHisEae, das in 100 μl TiterMax suspendiert ist, geboostet. Sieben Tage nach jedem Boost wird Blut (~ 300-500 μl) aus der Schwanzvene entnommen. Die Seren werden auf das Vorhandensein von anti-RIHisEae Antikörper mit Hilfe eines ELISA (wie oben beschrieben) untersucht.
Mäuse, die hohe Titer an anti-RIHisEae Antikörpern produzieren, werden sowohl intravenös als auch intraperitoneal mit 25 μg RIHisEae in 100 μl PBS geboostet, drei Tage später geopfert, und Seren werden gewonnen. Milzzellen werden isoliert und mit Sp2/0-Ag Mausmyelomzellen (ATCC #CRL1581) in einem Verhältnis von 10 Milzzellen zu 1 Myelomzelle fusioniert. Fusionierte Zellen werden in Mikroverdünnungsplatten verteilt, und Kulturüberstände werden mit Hilfe eines ELISA nach 3-4 Wochen der Kultivierung auf RIHisEae Antikörper hin untersucht. Kulturen, die positiv für die Produktion von anti-RIHisEae Antikörper sind, werden expandiert und zweimal mit Hilfe von limitierender Verdünnung kloniert.
2. Bestimmung, ob anti-RIHisEae mAbs Konformationsepitope oder lineare Epitope erkennen
Die Reaktivitäten der mAbs werden verglichen durch: 1) ELISA, in dem natives RIHisEae als Adsorptionsmittel verwendet wird; und 2) Immunblots von RIHisEae, das denaturiert und durch ein SDS-PAGE aufgetrennt wurde. Mehrere Pools von mAbs werden erhalten: 1) solche, die nur Konformationsepitope erkennen und im ELISA, jedoch nicht in der Immunblot-Analyse positiv reagieren; 2) solche, die lineare Epitope erkennen und in beiden Assays reagieren; und 3) solche, die lineare Epitope erkennen und positiv in der Immunblot-Analyse reagieren, nicht jedoch im ELISA. Darüber hinaus werden Kolonie- Immunblots von nicht-lysierten Zellen durchgeführt, um zu bestimmen, ob die mAbs Eae erkennen, das auf der Oberfläche des Wildtypstammes 86-24 exprimiert wird.
3. Testen der Fähigkeit von anti-Eae mAbs zur Blockierung der Adhärenz von Stamm 86-24 an HEp-2 Zellen
Stamm 86-24 wird einem qualitativen Adhärenz-Assay mit HEp-2 Zellen unterzogen und parallel mit Bakterien getestet, die zuvor mit verschiedenen Verdünnungen von anti-RIHisEae mAbs inkubiert wurden.
Ausgewählte, die Adhärenz blockierende mAbs und Konformations-mAbs werden einer Isotypenbestimmung unterzogen (Immunopure mAb Typing Kit, Pierce, Rockford, III.). Einzigartige Antikörper werden anschließend mit Hilfe der Affinitätschromatografie auf einer Protein G Sepharosesäule (Pharmacia, Piscataway, N.J.) gereinigt. Die resultierenden affinitätsgereinigten mAbs werden erneut auf ihre Fähigkeit zur Blockierung der Adhärenz von Stamm 86-24 an HEp-2 Zellen getestet, um sicherzustellen, dass der Antikörper nach der Reinigung noch funktionell ist.
H. Verwendung von polyklonalen und monoklonalen anti-Intimin Antikörpern in diagnostischen Kits
Diagnostische Kits können verwendet werden, um Intimin-exprimierende Bakterien nachzuweisen, insbesondere EHEC. Eine allgemeine Beschreibung der Herstellung und Verwendung solcher Kits wird in der parallel anhängigen US-Anmeldung, Serien-Nr. 08/412,231, eingereicht am 10. März 1995, zur Verfügung gestellt.
Beispiel VIII
Polyklonale anti-Intimin Antiseren mit hohem Titer werden durch intraperitoneale Injektion von 25 μg RIHisEae in Mäuse und Kaninchen unter Verwendung von Titremax Adjuvans (CytRx Corp., 154 Technology Parkway, Technology Park/Atlanta, Norcross, GA. 30092, 800-345-2987) hervorgerufen. Die Überprüfung des Antikörpertiters und ein Antikörper-Wirksamkeits-Assay sind gezeigt. Monoklonale Antikörper werden ebenfalls beschrieben.
A. Herstellen polyklonaler Antikörper
Dem Verfahren von Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) kann gefolgt werden. Das allgemeine Verfahren wird hierin dargelegt. Entnahme von Vorblut jeder zu immunisierenden Maus: Bluten aus der Schwanzvene in ein Eppendorf-Gefäß. Inkubieren bei 37°C für 30 Minuten, sanftes Rühren mit einem sterilen Zahnstocher (um den Pfropfen zu lösen), Lagern über Nacht bei 4°C. Am Morgen 10 min/10000 rpm in der Mikrofuge zentrifugieren und das Serum sammeln (d. h. Überstand; rote Blutzellen sind in dem Pellet). Lagern des Serums bei –20°C. Die erhaltenen Seren werden als negative Kontrolle verwendet, nachdem die Mäuse immunisiert sind.
Injizieren von 25 μg RIHisEae (unter Verwendung von Titremax-Adjuvans, gemäß den Instruktionen des Herstellers (CytRyx Corp., 154 Technology Pkwy., Norcross, GA. 30092, 800-345-2987) intraperitoneal in eine Maus. 2 Wochen abwarten, mit einer identischen Injektion boosten, 7 Tage warten und von der Schwanzvene in ein Eppendorf-Gefäß bluten lassen. Inkubieren 30 min bei 37°C, sanftes Rühren mit einem sterilen Zahnstocher (um den Pfropfen zu lösen), über Nacht lagern bei 4°C. Am Morgen in der Mikrofuge 10 min/10000 rpm zentrifugieren und das Serum sammeln. Lagern der Seren bei –20°C.
B. ELISA zur Bestimmung des Titers der Antikörper (Abs).
Der Methode von Harlow, E. und D. Lane (ed.) Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) kann gefolgt werden. Das allgemeine Verfahren wird unten dargelegt:

(1) Binden von RIHisEae an Plastikmikrotiterplatten mit 50 ng/Well in PBS. Inkubieren 2 Std./RT (Raumtemperatur) oder über Nacht bei 4°C.
(2) Waschen der Platte 2 × mit PBS.
(3) Blockieren der Wells mit 100 μl Blocking-Lösung [3 % bovines Serumalbumin (Sigma Chemical, St. Louis, MO.), 0,02 % Natriumazid (Sigma) in PBS – Aufbewahren der Stammlösung bei 4°C) 1-2 Stunden lang bei RT.
(4) Waschen der Platte 2 × mit PBS.
(5) Primärer Antikörper (Ab) = 50 μl Testserum, z. B. verdünnt in Blocking-Lösung, beginnend mit 1: 50 und Ausführen von elf 1:2-Verdünnungen oder beginnend mit 1:50 und elf 1:10-Verdünnungen), Inkubieren 2 Std./RT.
(6) Waschen 4 × mit PBS.
(7) Sekundärer Antikörper (Ab) = Ziege anti-Maus Ig, konjugiert mit Meerrettich, affinitätsgereinigt (Boehringer Mannheim Corp., 9115 Hague Rd., P.O. Box 50414, Indianapolis, IN. 46250, 800-262-1640). Zugabe des sekundären Antikörpers, der 1:500 in Blocking-Lösung ohne Azid verdünnt wurde. Inkubieren 1 Std./RT.
(8) Waschen 4 × mit PBS.
(9) Zugabe von 100 μl TMB-Peroxidasesubstrat zu jeder Vertiefung (hergestellt gemäß den Angaben des Herstellers, BioRad Labs, 3300 Regatta Blvd., Richmond, CA. 94804). Entwickelnlassen der blauen Farbe (nicht länger als 10 min). Stoppen der Reaktion mit 100 μl H₂SO₄. Auswerten der Platte bei 450 nm.

Ein Titer wird definiert als Absorptionswert ≥ 0,2 Einheiten über dem Wert, der für Prä-Immunserum der Maus erhalten wurde.
Anti-Intimin Abs, die von Tieren erhalten werden, können klinisch verwendet werden, wenn man die Spezifität des Antikörpers zu einer humanen verändert. Solche Methoden sind den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet wohl-bekannt. G. Winter et al., "Man-made antibodies" Nature, 349: 293-299 (1991); P.T. Jones et al., "Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse," Nature, 321: 522-525 (1986); P. Carter et al., "Humanization of ananti-p185^HER2 antibody for human cancer therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992). Solche Antikörper können dem Geschwister eines infizierten Patienten verabreicht werden, um das Risiko der Infektion des Geschwisters zu reduzieren.
C. Assay zur Blockierung der bakteriellen Bindung durch Antikörper gegen Intimin
Um die Wirkung von anti-Intimin Antikörpern auf die EHEC-Adhärenz zu überprüfen, werden Maus- oder Kaninchen anti-Intimin Antiseren (oder normale Seren als Kontrollen) zu EHEC-Bakterien zugegeben, die in Adhärenzmedium suspendiert sind, und die Bakterien-Antiseren-Mischungen werden bei 37°C dreißig Minuten vor der Infektion von HEp-2 Zellen inkubiert. Die Antiseren werden das ganze Assay über in dem Adhärenzmedium aufbewahrt. Die Adhärenz und damit in Zusammenhang stehenden Folgeerscheinungen werden unter Verwendung von GIEMSA- und FITC-Phalloidin (FAS)-Färbung, wie oben beschrieben, mikroskopisch untersucht.
Um die Wirkung der anti-Intimin Antikörper auf die Adhärenz anderer Bakterien, die Intimin-ähnliche Proteine aufweisen, zu überprüfen, werden anti-Intimin Antiseren aus Maus oder Kaninchen (oder normale Seren als Kontrollen) zu EHEC-Bakterien gegeben, die in Adhärenzmedium suspendiert sind, und die Bakterien-Antiseren-Mischungen werden bei 37°C dreißig Minuten lang vor der Infektion mit HEp-2 Zellen inkubiert.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden den Fachleuten auf dem Gebiet nach Betrachten der Beschreibung und der Ausführung der dann offenbarten Erfindung offensichtlich sein. Es ist beabsichtigt, dass die Beschreibung und die Beispiele lediglich als exemplarisch angesehen werden, wobei der wahre Umfang und Geist der Erfindung in den folgenden Ansprüchen dargelegt ist.
D. Erzeugen monoklonaler Antikörper gegen Intimin
Monoklonale Antikörper, die gegen Intimin gerichtet sind, werden verwendet, um einen Patienten passiv gegen die Kolonisierung durch EHEC (oder Bakterien, die Intimin-ähnliche Proteine exprimieren) zu schützen. Monoklonale Antikörper werden von Mauszellen erzeugt, und die Spezifität dieser Antikörper wird für die Verwendung in Menschen verändert. G. Winter et al., "Man-made antibodies" Nature, 349: 293-299 (1991);P.T. Jones et al., "Replacing the complementarity determining regions in a human antibody with those from a mouse," Nature, 321: 522-525 (1986); P. Carter et al., "Humanization of ananti-p185^HER2 antibody for human cancer therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285- 4289 (1992). Monoklonale Antikörper stellen einen "reineren" Antikörper für die Verabreichung an einen Patienten dar.
1. Erzeugung von anti-Eae mAbs:
Dem in Harlow, E. und D. Lane, Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) dargelegten Verfahren wird gefolgt: fünf 4 bis 5 Wochen alte weibliche BALB/cJ-Mäuse werden vorgeblutet und intraperitoneal mit 25 μg RIHisEae, das in 100 μl TiterMax suspendiert ist, immunisiert. Die Mäuse werden zweimal in Zwei-Wochen-Intervallen intraperitoneal mit 25 μg RIHisEae, das in 100 μl TiterMax suspendiert ist, geboostet. Sieben Tage nach jedem Boost wird Blut (~ 300-500 μl) aus der Schwanzvene entnommen. Die Seren werden auf das Vorhandensein von anti-RIHisEae Antikörper mit Hilfe eines ELISA (wie oben beschrieben) untersucht.
Mäuse, die hohe Titer an anti-RIHisEae Antikörpern produzieren, werden sowohl intravenös als auch intraperitoneal mit 25 μg RIHisEae in 100 μl PBS geboostet, drei Tage später geopfert, und Seren werden gewonnen. Milzzellen werden isoliert und mit Sp2/0-Ag Mausmyelomzellen (ATCC #CRL1581) in einem Verhältnis von 10 Milzzellen zu 1 Myelomzelle fusioniert. Fusionierte Zellen werden in Mikroverdünnungsplatten verteilt, und Kulturüberstände werden mit Hilfe eines ELISA nach 3-4 Wochen der Kultivierung auf RIHisEae Antikörper hin untersucht. Kulturen, die positiv für die Produktion von anti-RIHisEae Antikörper sind, werden expandiert und zweimal mit Hilfe von limitierender Verdünnung kloniert.
2. Bestimmen, ob die anti-RIHisEae mAbs Konformationsepitope oder lineare Epitope erkennen:
Die Reaktivitäten der mAbs werden verglichen durch: 1) ELISA, in dem natives RIHisEae als Adsorptionsmittel verwendet wird; und 2) Immunblots von RIHisEae, das denaturiert und durch ein SDS-PAGE aufgetrennt wurde. Mehrere Pools von mAbs werden erhalten: 1) solche, die nur Konformationsepitope erkennen und im ELISA, jedoch nicht in der Immunblot-Analyse positiv reagieren; 2) solche, die lineare Epitope erkennen und in beiden Assays reagieren; und 3) solche, die lineare Epitope erkennen und positiv in der Immunblot-Analyse reagieren, nicht jedoch im ELISA. Darüber hinaus werden Kolonie-Immunblots von nicht-lysierten Zellen durchgeführt, um zu bestimmen, ob die mAbs Eae erkennen, das auf der Oberfläche des Wildtypstammes 86-24 exprimiert wird.
Testen der Fähigkeit von anti-Eae mAbs zur Blockierung der Adhärenz von Stamm 86-24 an HEp-2 Zellen:
Stamm 86-24 wird einem qualitativen Adhärenz-Assay mit HEp-2 Zellen unterzogen und parallel mit Bakterien getestet, die zuvor mit verschiedenen Verdünnungen von anti-RIHisEae mAbs inkubiert wurden.
Ausgewählte, die Adhärenz blockierende mAbs und Konformations-mAbs werden einer Isotypenbestimmung unterzogen (Immunopure mAb Typing Kit, Pierce, Rockford, III.). Einzigartige Antikörper werden anschließend mit Hilfe der Affinitätschromatografie auf einer Protein G Sepharosesäule (Pharmacia, Piscataway, N.J.) gereinigt. Die resultierenden affinitätsgereinigten mAbs werden erneut auf ihre Fähigkeit zur Blockierung der Adhärenz von Stamm 86-24 an HEp-2 Zellen getestet, um sicherzustellen, dass der Antikörper nach der Reinigung noch funktionell ist.
BEISPIEL X
Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation verschiedener Pflanzen zur Expression von Intimin
Pflanzen werden transformiert, um Intimin oder funktionelle Teile von Intimin zu exprimieren und an Patienten zum Verzehr verabreicht. Wie die Fachleute auf dem Gebiet erkennen würden, kann das Intimin, wie in Beispiel I beschrieben, mit einem His-Tag versehen sein oder nicht. Darüber hinaus kann das Intimin ein Fusionsprotein sein, das Intimin sowie ein oder mehrere Antigene umfasst, gegen welche die Erzeugung einer Immunantwort gewünscht ist. (Siehe Beispiel VII.)
Jedes Pflanzengewebe kann mit einem Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert werden. Der Begriff "Organogenese", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Verfahren, durch das Sprösslinge und Wurzeln der Reihe nach aus meristematischen Zentren entwickelt werden; der Begriff "somatische Embryogenese", wie hierin verwendet, bezeichnet einen Prozess, durch den sich Sprösslinge und Wurzeln zusammen, in gemeinsamer Art und Weise (nicht der Reihe nach) entwickeln. Beispielhafte Zielgewebe schließen Blattscheiben, Pollen, Embryos, somatische Embryos, Kotyledone, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierende meristematische Gewebe (z. B. apikale Meristeme, axilläre Knospen und Wurzelmeristeme) sowie induziertes Meristemgewebe (z. B. kotyledones Meristem und hypokotyles Meristem) ein.
A. Konstruktion des Plasmids, welches das eae Gen enthält.
Das vorliegende Beispiel verwendet den Vektor pKYLX 71S² (17). Dieser Vektor wurde von David Hunt, Dept. of Crop Science, University of Kentucky, Lexington, Kentucky erhalten, jedoch werden die Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass andere erhältliche Vektoren verwendet werden können oder konstruiert werden können. Dieser Vektor ist ein Agrobacterium tumefaciens binärer Vektor, der das in vivo selektierbare Kanamycin-Markergen (NPTII) enthält. Ein binäres Vektorsystem enthält zwei Plasmide. Ein Tumor-induzierendes (Ti)-Plasmid enthält DNA (t-DNA), in welche die gewünschte codierende Region in eine multiple Klonierungsstelle insertiert wird. Das andere Plasmid enthält vir Gene, welche Virulenzgene sind, die der t-DNA ermöglichen, in die Pflanzenzellen einzudringen und in das Genom zu integrieren. Der pKYLX71S²-Vektor stellt die gewünschte codierende Sequenz unter die Kontrolle eines doppelt verstärkten Cauliflower-Mosaikvirus 35S (CaMV 35S oder einfach 35S)-Promotor. In diesem Fall handelt es sich bei dem doppelt verstärkten Promotor um zwei ribosomale Promotoren in Tandem-Anordnung.
Agrobacterium-Vektoren sind nützlich, um fremde Gene in eine Vielzahl von Pflanzenspezies einzubringen und insbesondere nützlich zur Transformation von Dikotyledonen. Zahlreiche Agrobacterium-Vektoren sind bekannt. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,536,475 von Anderson, US-Patent Nr. 4,693,977 von Schliperoort et al.; US-Patent Nr. 4,886,937 von Sederoff et al.; T. Hall et al., EPO-Anmeldung 0122791; R. Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4803 (1983); L. Herrera-Estrella et al., EMBO J. 2, 987 (1983); G. Helmer et al., Bio/Technology 2, 5201 (1984); N. Murai et al., Science 222, 476 (1983).
Das His-eae Gen (erhalten wie oben in Beispiel I beschrieben) wird unter Verwendung rekombinanter Verfahren, die den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, in den Vektor pKYLX 71S² ligiert, wodurch der Pflanzentransformationsvektor pINT (17) erzeugt wird.
Das His-eae Gen (erhalten wie oben in Beispiel I beschrieben) wird in den Vektor pKYLX 71S² ligiert, was das DNA-Konstrukt pINT (17) erzeugt. Solche Vektoren, die heterologe DNA enthalten, können unter Verwendung rekombinanter Methoden erzeugt werden, die den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet wohl-bekannt sind. Zum Bei spiel wird DNA aus pEB313 (oben in Beispiel I beschrieben) unter Verwendung eines QIAGEN DNA extraction -Kits (QIAGEN, Chatsworth, CA.) hergestellt. Dieses His-eae Gen wird durch Verdau von pEB313 mit XhoI und NheI isoliert, auf einem Agarosegel aufgetrennt, gefolgt von dem Ausschneiden der 3147 bp Bande, die eae enthält, mit einer Rasierklinge. Die gereinigte DNA wird mit GeneClean (Bio101, LaJolla) aus der Agarose extrahiert und in pKYLX71s² ligiert, der mit XhoI und XbaI verdaut wurde. Ligierte Plasmide werden in DH5αF'Tn5lacI_Q transformiert, und die Transformanten werden mit Hilfe eines Verdaus mit geeigneten Restriktionsenzymen auf das Vorhandensein der insertierten DNA überprüft. Siehe auch Beispiel I. Jeder öffentlich erhältliche Agrobacterium fumefaciens-Stamm kann verwendet werden; die Stämme LBA4404, GV3850 oder EHA105 (erhältlich von Stanley Gelvin, Purdue-University, West Lafayette, Indiana) werden jedoch bevorzugt. Das pINT-Plasmid wird in A. tumefaciens unter Verwendung von Calciumchloridionen, gefolgt von einer Transformation durch Einfrieren und Wiederauftauen, Elektroporation oder anderen den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren, übertragen. Siehe, z. B., Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166:577-80 (1983).
B. Transformation von Tabak
Tabak wird sehr häufig als Modell für die Pflanzentransformation verwendet. Eine allgemeine Annahme, die durch viele empirische Studien bestätigt wurde, ist, dass ein Transgen, wenn es in Tabak exprimiert wird, in anderen dikotylen Pflanzen ebenfalls exprimiert wird. Berücksichtigt man, dass Tabak keine essbare Pflanze ist, so wird ein rekombinantes Intimin, sofern es in Tabak produziert wird, auch in einer essbaren Pflanze wie z. B. Canola exprimierbar sein.
Tabak (Nicotiana tabacum)-Kultur 'Xanthi' wird mit Hilfe von Agrobacterium-vermittelter Transformation unter Verwendung eines effizienten Standard-Infektionsprotokolls (Schardl et al., Gene 61: 1-11 (1987)) transformiert. Kurz beschrieben, werden Tabakblattscheiben mit 0,5 cm Durchmesser verletzt und Agrobacterium tumefaciens, der pINT enthält, ausgesetzt. Pflanzen werden unter Verwendung eines organogenen Verfahrens unter Kanamycin-Selektion (200 mg/l) in Gewebekultur regeneriert.
Zweihundert 0,5 cm Blattscheiben von Tabak werden Agrobacterium tumefaciens, der pINT enthält, ausgesetzt. Die Bedingungen für die Gewebekultur und die Pflanzenregeneration entsprechen Schardl. et al. 1987. Sprösslinge werden direkt aus den verletzten Blattscheiben unter 200 mg/l Kanamycinselektion und 400 mg/l Timentin zur Tötung der Agrobakterien gebildet. Dieses System ist sowohl hocheffizient als auch nicht durchlässig (nicht transgene "Entkommende" sind extrem selten). Dreihundertfünfundsiebzig Sprösslinge gehen aus dem Experiment hervor, und 120 dieser Sprösslinge werden zufällig ausgewählt, um auf hormonfreiem Medium zu wurzeln. Sämtliche Pflanzen sind morphologisch normal und fruchtbar. Diese Ergebnisse entsprechen dem typischerweise erreichten Transformationseffizienzen unter Verwendung dieses Systems. Die hohen Transformationsfrequenzen und die Tatsache, dass die Pflanzen gesund sind, zeigt, dass Intimin nicht toxisch ist und dass es mit der normalen Pflanzenentwicklung und Funktion nicht interferiert.
Um nachzuweisen, dass His-eae stabil in die Pflanze integriert ist, wird Blattgewebe in Übereinstimmung mit wohl-bekannten Verfahren für die Southern (DNA)-Blotanalyse (Stewart et al., Plant Physiol. 112:121-129 (1996); Stewart, C. N., Jr. und Via, L.E., Biotechniques 13:748-751 (1993) et al.), die PCR-Analyse (Stewart et al., Plant Physiol. 112:121-129 (1996) und Western (Protein)-Blotanalyse (Stewart et al., Plant Physiol. 112:121-129 (1996) verarbeitet. Der Southernblot wird durchgeführt, um die Gegenwart des eae Gens in der DNA des Blattgewebes zu bestätigen. Die PCR-Analyse wird ebenfalls durchgeführt, um die Gegenwart des eae Gens zu bestätigen. Die verwendeten Primer können die oben in Beispiel I, Teil D erwähnten einschließen. Zum Beispiel ergibt die PCR-Amplifikation der vermutlich eae enthaltenden Pflanzen-DNA unter Verwendung der Primer MW1 (= 5' GTACGGATCCGAATTCATTTGCAAATGGTG 3') und MW2 (= 5' GTACGGTACCTGATCAATGAAGACGTTATAG 3') eine erwartete 734 bp Bande, wenn sie auf einem Agarosegel aufgetrennt wird. Die Westernblot-Analyse wird durchgeführt, um die Expressionsmenge von His-Intimin in dem Blatt zu bestimmen. Sobald die Expression an His-Intimin 0,1 % von dem gesamten Pflanzenprotein überschreitet, wird das His-Intimin Protein unter Verwendung einer einstufigen Nickelsäulenreinigung isoliert (Stolz et al., Plant Journal 6: 225-233 (1994)). Das Reinigungsverfahren gemäß Beispiel II ist eine Alternative. His-Intimin wird dem in Beispiel III gezeigten Adhärenz-Assay unterzogen, um die funktionelle Bindung zu überprüfen.
Herstellung von Extrakten
Proteinextrakte werden wie folgt aus den vermeintlich transgenen Tabakpflanzen gewonnen: fünfhundert Mikroliter Extraktionspuffer (20 ml 0,5 M Tris HCl pH 8,0, 4 ml 0,5 M EDTA pH 8,0, 36 ml Glycerol, 20 ml β-Mercaptoethanol) oder 500 μl Phosphatpuffer (50 mM Na-Phosphat pH 7,8, 300 mM NaCl) werden zu 0,2 g Blattgewebe gegeben, die Mischung wird auf Eis homogenisiert und anschließend mit Hilfe einer Pulszentrifugation in einer Mikrofuge geklärt. Der Überstand wird gewonnen, in ein frisches Eppendorfgefäß überführt und bei –70°C gelagert. Die Proteinextrakte werden mit Hilfe einer Westernblot-Analyse, wie in Stewart et al., Plant Physiol. 112:121-129 (1996) beschrieben, getestet, wobei irgendeiner der monoklonalen oder polyklonalen anti-Intimin Antikörper, die in Beispiel IX oben beschrieben werden, verwendet wird.
Wird die Expression des His-Intimins durch den hohen Adenin (A)/Thymin (T)-Gehalt von eae erschwert, wird das Gen unter Verwendung von Verfahren, die in Adang et al. (Adang et al., 1993) dargelegt sind, neu konstruiert. Kurz beschrieben, wird im Falle des Segmentes von eae, das in pINT enthalten ist, die Nukleotidsequenz analysiert, um das Codon für jede Aminosäure in dem Intiminfragment zu bestimmen. Indem aus der Redundanz des genetischen Codes Kapital geschlagen wird, werden die Codons neu geschrieben, um A oder T durch C oder G zu ersetzen, ohne die durch das Codon spezifizierte Aminosäure zu verändern; folglich werden die Codons der heterologen DNA, die z. B. bakterieller Herkunft ist, z. B. durch Codons ersetzt, die für die Expression in einer Pflanzenzelle bevorzugt werden. Die bevorzugten Substitutionen werden in Übereinstimmung mit der Codonpräferenz der verwendeten Pflanzenspezies gewählt. Siehe z. B. Murray, E. E., et al., Nucleic Acids Res. 17 (2):477-498 (1989); Dinesh-Kumar, S. P. und Miller, W. A., Plant Cell 5 (6): 679-692 (1993); Kumar, P. A. und Sharma, R. P., J. Plant Chemistry and Plant Biotechnol. 4 (2): 113-115 (1995).
Die synthetische Gensequenz wird in Abschnitte von 200-300 Basenpaaren geteilt, und Oligonukleotide werden für jede Region synthetisiert. Die Oligonukleotide werden von Research Genetics, Huntsville, Alabama, synthetisiert. Der durchschnittliche Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass die Oligonukleotide in vielen anderen kommerziellen Laboratorien synthetisiert werden können. Die Oligonukleotide werden in Übereinstimmung mit dem in Adang et al. Plant Mol. Biol. 21: 1131-1145 (1993) dargelegten Verfahren ligiert, und das rekonstruierte Gen wird in pKYLX 71S² insertiert. Das resultierende Plasmid, pINTrecCA, wird verwendet, um irgendeinen der bevorzugten Agrobacterium tumefaciens-Stämme LBA4404, GV3850 oder EHA105 zu transformieren. Der Tabak wird transformiert und das Expressionsprodukt wird wie oben dargelegt analysiert.
C. Transformation anderer Pflanzen.
Tabak ist nicht essbar, daher muss jedes Intimin, das in der Tabakpflanze exprimiert wird, gereinigt werden, um zur sicheren Verwendung Alkaloide zu entfernen. Pflanzen, die Teil der normalen Ernährung des Patienten sind und die einfach modifiziert werden können, werden bevorzugt. Als Beispiele, die nicht beschränkend gemeint sind, können für Rinder, Schweine und Schafe entweder Canola (Stewart et al., Insect control and dosage effects in transgenic canola, Brassica napus L. (Brassicaceae), containing a synthetic Bacillus thuringiensis Cryla(c) gene (Stewart et al., Plant Physiol.112:115-120 (1996)) oder Alfalfa (Thomas et al., Plant Cell Rep. 14: 3136 (1994)) transformiert werden, um Intimin oder ein Intimin-Fusionsprotein zu exprimieren. Für Menschen können Canola oder Karotten (Droge et al., 1992) transfomiert werden.
Der Patient sollte die Intimin-enthaltende Pflanze oder den Intimin-enthaltenden Teil der Pflanze mit der Nahrung aufnehmen. Der mit der Nahrung aufgenommene Teil kann ein Pflanzenblatt, eine Wurzel, Frucht, Beere, Samen, Knolle, Blütenstand, Stiel usw. oder eine Kombination davon sein. Der mit der Nahrung aufgenommene Teil kann außerdem als Pflanzenderivat, wie z. B. Mehl, Schrot, Brei, Tee/Aufguss, Paste, Saft, Puder, Kuchen oder Pellet aus einer Pflanze extrahiert werden. Der mit der Nahrung aufgenommene Teil kann weiterhin in ein komplexes Futtermittel oder Nahrungsmittel in Übereinstimmung mit Methoden, die allgemein auf dem Gebiet bekannt sind, eingebracht werden.
Haq et al., Science, 268:714-716, 1995 haben transgene Tabak- und Kartoffelpflanzen unter Verwendung der Gene, welche die B-Untereinheit des hitzelabilen Enterotoxins (LT-B) von ETEC codieren oder dieses Gens mit einer mikrosomalen Retention sequence (SEKDEL) hergestellt. Beide Pflanzen exprimierten die Fusionsproteine, welche Oligomere bildeten, die an den natürlichen Liganden gebunden haben. Wenn Mäusen über einen Schlauch ein löslicher Rohextrakt von Tabakpflanzen, die LT-B-SEKDEL exprimieren, gefüttert wurde, erzeugten sie im Serum und in der Darmmukosa anti-LT-B-Immunglobine, welche das Enterotoxin in Zell-Protection-Assays neutralisierten. Mäuse, denen Kartoffelknollen verfüttert wurden, die LT-B-SEKDEL exprimieren, entwickelten ebenfalls eine Serum- und Darmmukosa-Immunität, die spezifisch für LT-B ist.
Pflanzen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ein (sind jedoch nicht auf diese limitiert): Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Sojabohne (Glycine max), Sonnenblume, Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Cassava (Manihot esculenta), Kaffee (Coffea spp.), Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Citrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis), Banane (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya), Cashew (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrübe (Beta vulgaris), Mais (Zea mays), Weizen, Hafer, Roggen, Gerste, Reis, Gemüse, Ziergewächse und Koniferen. Gemüse schließen Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z. B. Lactuea sativa), grüne Bohnen (Phaseolus vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Pisum spp.) und Mitglieder der Gattung Cucumis, wie z. B. Gurke (C. sativus), Cantaloupe (C. cantalupensis) und Moschusmelone (C. melo) ein. Zierpflanzen schließen Azalea (Rhododendron spp.), Hydrangea (Macrophylla hydrangea), Hibiskus (Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa spp.), Narzissen (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), Nelke (Dianthus caryophyllus), Weihnachtsstern (Euphorbia pulcherima) und Chrysanthemen ein. Gymnospermen, welche bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Koniferen ein, einschließlich Pinien, wie Ioblollypine (Pinus taeda), Douglastanne (Pseudotsuga menziesii); Hemlocktanne (Tsuga canadensis); Sitkafichte (Picea glauca) und Rotholz (Sequoia sempervirens).
BEISPIEL XI
Mit einer Genpistole (gene gun) vermittelte Transformation verschiedener Pflanzen, z. B. Monokotyledone wie Mais, Weizen und Reis.
Ein anderes Verfahren zum Transformieren von Pflanzen, damit sie Intimin oder Intimin-Fusionsproteine exprimieren, wird bereitgestellt. Das in Beispiel IX beschriebene Plasmid, pINT, wird auf Mikroprojektile (Mikropartikel) geschichtet. Genauer gesagt wird 1 μg pINT auf 10 mg Goldmikropartikel mit 1 Mikron Durchmesser geschichtet (Biorad Laboratories Wolframpartikel, die von Sylvania erhalten wurden, können ebenfalls verwendet werden). Als nächstes werden 5 μl von 10⁸ Zellen von Agrobacterium tumefaciens auf die mit pINT beschichteten Mikroprojektile überschichtet. Ein mg der doppelt beschichte ten Mikroprojektile wird in Übereinstimmung mit dem Hersteller (Biorad Laboratories) in die PDS 1000-He-Pistole geladen. Ein Gramm Sojabohnenembryos, die aus unreifen Kotyledonen hervorgehen, werden mit doppelt beschichteten Mikroprojektilen mit 1000 psi beschossen. Beschossene Embryonen werden unter Selektion mit Kanamycin (200 mg/l) in Gewebekulturen wachsen gelassen. Sie werden reifen und keimen gelassen und werden an Tiere, wie z. B. Schweine, verfüttert.
Dasselbe Verfahren kann verwendet werden, um Bananen zu transformieren. Das oben genannte Verfahren kann außerdem ohne den Schritt der Zugabe von Agrobacterium tumefaciens durchgeführt werden. Die Rekonstruktion des eae Gens oder der gewünschten Genregion kann wie in Beispiel IX dargelegt erreicht werden.
BEISPIEL XII
Expression von Intimin als chimäres Viruspartikel (CVP)-Fusionsproteine
Ein weiteres Verfahren zum Transformieren von Pflanzen, damit sie Intimin exprimieren, erfolgt über die Verwendung eines rekombinanten Pflanzenvirus. Dieses Verfahren wird für die schnelle Entwicklung und die Verabreichung kostengünstiger oraler Vakzine bevorzugt. Ein Intimin oder Intimin-ähnliches Protein, oder Teil davon oder ein rekombinantes Fusionsprotein davon kann unter Verwendung einer rekombinanten viralen Infektion einer Pflanze und eines Expressionssystems, wie z. B. dem von Dalsgaard und Mitarbeitern beschriebenen (Dalsgaard et al., Nature Biotechnology, 15:248-252 (1997) und wie weiterhin von Arntzen beschrieben (Nature Biotechnology, 15:221-222 (1997) exprimiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird DNA, die das Intimin oder Intimin-ähnliche Protein oder den Teil davon oder das rekombinante Fusionsprotein davon codiert, rekombinant in ein Gen insertiert, das ein Hüllprotein codiert und wird optimalerweise als Fusionsprotein zusammen mit dem Hüllprotein exprimiert. Vorzugsweise ist das Intim oder Intimin-ähnliches Protein oder der Teil davon oder das Fusionsprotein davon antigen. Das resultierende rekombinante virale Genom wird anschließend in einer Pflanze oder einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle oder Pflanzenextrakt propagiert, was zu der Expression von Intimin oder dem Intimin-ähnlichen Protein oder dem Teil davon oder dem rekombinanten Fusionsprotein führt. Das Intimin oder Intimin-ähnliche Protein oder Teil davon oder rekombinante Fusionsprotein, das so durch den viralen Vektor produziert wird, kann mit der Nahrung aufgenommen, extrahiert, angerei chert, gereinigt oder auf andere Weise in den Verfahren, die an anderer Stelle hierin offenbart werden, verwendet werden.
BEISPIEL XIII
Expression von His-Intimin in anderen bakteriellen Spezies, die es normalerweise nicht exprimieren
Das Intimin oder Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon oder ein rekombinantes Intimin-Fusionsprotein kann in einem Wirtsbakterium exprimiert werden, und das Wirtsbakterium kann als Impfstoff verabreicht werden. Zum Beispiel zeigen Su. G-F. et al. Microbial Pathogenesis 13:465 (1992) die B-Untereinheit des Shiga-Toxins, fusioniert an den 23 kDa C-Terminus von Hämolysin A (AlyA) aus E. coli, welches anschließend verwendet wurde, um es aus einem attenuierten Trägerstamm von Salmonella typhimudum aroA (SL3261) zu exportieren. Die Expression dieses Fusionsgens erfolgte unter konstitutiver Kontrolle oder der Kontrolle eines Eisen-regulierten Promotors. Die orale und intraperitoneale Immunisierung von Mäusen mit dem Hybridstamm führte zu einer signifikanten B-Untereinheit-spezifischen mukosalen und Serum-Antikörperantwort. Sowohl die zytoplasmatische Expression als auch der extrazelluläre Export aus dem Antigen-Trägerstamm resultierten nachweislich in Antigen-spezifischen Immunantworten.
Darüber hinaus zeigen Pozzi, G. et al. Infect. Immun. 60:1902 (1992) ein System, in dem ein fremdes Antigen an das C-terminale Anheftungsmotiv des fibrillären M-Proteins aus Streptococcus pyogenes fusioniert ist. Das Fusionsprotein wird auf der Oberfläche von S. gordonii exprimiert, einem kommensalen Organismus in der Mundhöhle. In dieser Studie wurde das E7-Protein des humanen Papillomavirus Typ 16 als das fremde Antigen ausgewählt und mit dem fibrillären M-Protein fusioniert. Mäuse wurden subkutan infiziert. Von dem M-E7-Fusionsprotein, das auf der Oberfläche von S. gordonii exprimiert wurde, wurde gezeigt, dass es für beide Aspekte des Fusionsproteins in Mäusen immunogen ist, wie mit Hilfe einer Westernblot-Analyse unter Verwendung von Seren, die von infizierten Mäusen gepoolt wurden, gezeigt wurde.
Darüber hinaus zeigten Schafer, R. et al. J. Immunol. 149:53 (1992), dass Listeria monocytogenes, die β-Galactosidase (fremdes Antigen) aus E. coli exprimieren, als lebende Vakzinvektoren verwendet wurden. BALB/c-Mäuse wurden oral oder intraperitoneal im munisiert. Milzzellen, die eine Woche nach der oralen Infektion oder fünf Wochen nach der oralen oder peritonealen Infektion (geboostet nach 4 Wochen) gewonnen wurden, zeigten β-Galactosidase-spezifische zytotoxische T-Lymphozytenantworten. Die einzelnen Serumproben von Mäusen, die intraperitoneal oder intravenös immunisiert wurden, wurden auf anti-β-Galactosidase Antikörper getestet; etwa 11 % wiesen positive Titer für diese Antikörper auf. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl orale als auch parenterale Immunisierung mit diesen Spezies in einer zellulären Immunantwort gegen das fremde Protein resultieren.
Ein Beispiel für die Durchführung der vorliegenden Erfindung in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Su et al. wird hierin gezeigt. In diesem Beispiel wird eae (oder His-eae) unter die Kontrolle eines Aerobactin-Promotors gesetzt und mit einem DNA-Fragment fusioniert, welches die 23 C-terminale Signaldomäne von Hämolysin A (HlyA) codiert, die das gewünschte Protein extrazellulär targetet. Der Aerobactin-Promotor wird bei Eisenlimitierung aktiviert, eine Bedingung, die in der intestinalen mukosalen Umgebung auftritt, was die Genexpression in vivo fördert. Das zur Förderung einer solchen Expression verwendete Plasmid ist ein pBR322-basiertes Plasmid mit mittlerer Kopienzahl, welches einen höheren Grad an Immunität verleiht, als ein Plasmid mit hoher Kopienzahl, wie z. B. pUC18. Der Bakterienwirt für die Expression des Fremdproteins ist Salmonella typhimurium aroA-Stamm SL3261 pLG575, ein attenuiertes Derivat eines Darmpathogens (erhältlich von Kenneth Timmis, Dept. of Microbiology, GBF-National Research Centre for Biotechnology, D-3300 Braunschweig, Deutschland, wie in Su et al. beschrieben). Dieser Stamm enthält außerdem das Plasmid pLG575, welches die hlyB- und hlyD Gene codiert, die für den Export des Intimin-HlyA-Proteins erforderlich sind.
Kurz beschrieben (18), wird das BamHI StxB-Fragment aus dem Plasmid pSU204 (erhältlich von Kenneth Timmis, Dept. of Microbiology, GBF-National Research Centre for Biotechnology, D-3300 Braunschweig, Deutschland, wie obige Referenz) herausgeschnitten, um pSU2004 zu erzeugen. Ein BamHI DNA-Fragment, das Intimin oder ein Intimin-Fusionsprotein codiert, wird mit Hilfe der PCR so konstruiert, dass die codierende Region in dem richtigen Leserahmen sowohl mit dem Aerobactin-Promotor, der in pSU2004 enthalten ist, als auch mit der hlyA-codierenden Region ist. Das BamHI eae Fragment wird in pSU2004 ligiert, was zu pAero-Eae führt. Dieses Plasmid wird in den restriktionsnegativen modifikationspositiven S. typhimurium-Stamm SL5283 (erhältlich von Kenneth Timmis) in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Hanahan, D.J., Mol. Biol. 166:577-580 (1983) transformiert. Solch ein Schritt modifiziert die pAero-Eae-DNA durch Methylierung, und aus diesem Stamm gereinigte Plasmid-DNA transformiert den S. typhimurium aroA-Stamm SL3261 pLG575 effizienter. Die methylierte pAero Eae-DNA wird in den S. typhimudum aroA-Stamm SL3261 pLG575 durch das Verfahren nach Hanahan, D.J., Mol. Biol. 166:577-580 (1983) transformiert.
Acht bis zehn Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse werden mit dem immonogenen Bakterienwirt wie folgt gefüttert. Die Bakterien werden über Nacht bei 37°C in LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, wachsen gelassen, in einer Verdünnung von 1:50 in frisches Medium inokuliert und bis zu einer OD₆₀₀ = 0,3 wachsen gelassen. Der Promotor wird anschließend mit 2,2'-Bipyridyl (100 μM Endkonzentration) 3 Stunden lang induziert. Die Kultur wird gewaschen und in PBS für die Verfütterung resuspendiert.
Zwei Bakteriendosen werden im Abstand von 4 Tagen mit 10¹⁰ CFU verfüttert, mit Hilfe eines Fütterungsschlauches. Einundzwanzig Tage nach der ersten Fütterung wird eine Booster-Injektion verabreicht. Die Mäuse werden ein Woche später geopfert und zeigen eine mukosale und humorale Immunantwort.

Claims

Verwendung einer Pflanze oder eines Teiles davon zur Herstellung eines Medikamentes zur Vorbeugung und/oder Behandlung einer Infektion mit Bakterien, die Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Intimin-ähnlichen Proteinen von Citrobacter rodentium, Hafnia alvei und Invasinen von Yersinia enterocolitica und Yersinia pseudotuberculosis oder einen Teil des genannten Intimins oder des Intimin-ähnlichen Proteins exprimieren, wobei das genannte Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil des Intimin oder des Intimin-ähnlichen Proteins fähig ist, an eine aus HEp-2 und HCT-8 ausgewählte Epithelzelllinie zu binden, und wobei die genannte Pflanze oder der Teil davon mit einem Vektor transformiert ist, der das genannte Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder den Teil des Intimins oder des Intimin-ähnlichen Proteins kodiert.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon zusätzlich wenigstens ein Antigen, wenigstens ein Arzneimittel oder eine Kombination davon umfasst, das rekombinant an das genannte Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder den Teil davon fusioniert ist.
Die Verwendung von Intimin, einem Intimin-ähnlichen Protein oder einem Teil davon, wie in Anspruch 1 definiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur Vorbeugung und/oder Behandlung einer Infektion von Bakterien, die Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon exprimieren, wobei das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon in einer Pflanze exprimiert wird und aus dieser Pflanze für die genannte Herstellung extrahiert wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon zusätzlich wenigstens ein Antigen, wenigstens ein Arzneimittel oder eine Kombination davon umfasst, das rekombinant an das genannte Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder den Teil davon fusioniert ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 3 oder 4, die weiterhin das Anreichern des genannten Intimins, des Intimin-ähnlichen Proteins oder des Teils davon vor der genannten Verwendung umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 3 oder 4, die weiterhin die Reinigung des genannten Intimins, des Intimin-ähnlichen Proteins oder des Teils davon vor der genannten Verwendung umfasst.
Die Verwendung gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, wobei die genannte Pflanze EHEC- oder EPEC-Intimin exprimiert.
Die Verwendung gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, wobei das genannte Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon weiterhin einen Histidin-Tag umfasst.
Die Verwendung gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, wobei die Pflanze eine Monokotyledone ist.
Die Verwendung gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, wobei die Pflanze eine Dikotyledone ist.
Die Verwendung gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, wobei die Pflanze Alfalfa ist.
Die Verwendung gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus Karotten, Canola, Tabak, Banane und Kartoffel.
Die Verwendung gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, wobei die Pflanzenzelle ausgewählt ist aus Sojabohne, Sonnenblume, Erdnüssen, Baumwolle, Süßkartoffel, Maniok, Kaffee, Kokosnuss, Ananas, Zitrus, Kakao, Tee, Avocado, Feige, Guave, Mango, Olive, Papaya, Cashew, Macadamia, Mandel, Zuckerrübe, Mais, Weizen, Hafer, Roggen, Gerste, Reis, Tomate, Salat, grüne Bohnen, Limabohne, Erbse, Cucumis, Cantalupensis, Moschus-Melone, Azalee, Hydrangea, Hibiskus, Rosen, Tulpen, Narzissen, Petunien, Nelke, Christstern, Chrysanthemen und Koniferen.
DNA-Konstrukt, das für die Expression einer heterologen DNA in einer Pflanze kodiert, wobei die heterologe DNA Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon, wie in Anspruch 1 definiert, kodiert.
Der DNA-Konstruktvektor gemäß Anspruch 14, wobei die heterologe DNA zusätzlich wenigstens ein Antigen, wenigstens ein Arzneimittel oder eine Kombination davon kodiert, das rekombinant an das genannte Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder den Teil davon fusioniert ist.
Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei das Konstrukt ein Pflanzentransformationsvektor ist:
Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 16, wobei der Pflanzentransformationsvektor ein Agrobacterium-Vektor ist.
Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 16, wobei der Pflanzentransformationsvektor ein Mikropartikel ist.
Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 16, wobei der Pflanzentransformationsvektor ein viraler Vektor ist.
Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 16, wobei das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon, das von der genannten DNA kodiert wird, weiterhin einen Histidin-Tag umfasst.
Das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 16, wobei Kodons der genannten heterologen DNA durch Kodons ersetzt sind, die für die Expression in einer Pflanzenzelle bevorzugt werden.
Pflanzenzelle, die ein heterologes DNA-Konstrukt enthält, das eine heterologe DNA kodiert und exprimiert, wobei die heterologe DNA Intimin, ein Intimin-ähnliches Protein oder einen Teil davon, wie in Anspruch 1 definiert, kodiert.
Die Pflanzenzelle gemäß Anspruch 22, wobei die heterologe DNA zusätzlich wenigstens ein Antigen, wenigstens ein Arzneimittel oder eine Kombination davon kodiert, das rekombinant an das genannte Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder den Teil davon fusioniert ist.
Die Pflanzenzelle gemäß Anspruch 22, wobei das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon, das durch die genannte heterologe DNA kodiert wird, weiterhin einen Histidin-Tag umfasst.
Die Pflanzenzelle gemäß den Ansprüchen 22, 23 oder 24, wobei die Kodons der genannten heterologen DNA durch Kodons ersetzt sind, die für die Expression einer Pflanzenzelle bevorzugt werden.
Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen, welches das Bereitstellen einer Pflanzenzelle, die fähig zur Regeneration ist und die Transformation der genannten Pflanzenzelle mit einem DNA-Konstrukt gemäß dem Anspruch 14 oder 15 umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die genannte Transformation durch Infizieren der genannten Pflanzenzelle mit einem Agrobacterium-Vektor, der das genannte DNA-Konstrukt in die genannte Pflanzenzelle transferiert, durchgeführt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die genannte Transformation durch Beschuss der genannten Pflanzenzelle mit Mikropartikeln, die das genannte DNA-Konstrukt beinhalten, durchgeführt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die genannte Transformation durch Transformieren mit einem viralen Vektor durchgeführt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die genannte Pflanzenzelle sich in einem Pflanzengewebe befindet, das zur Regeneration fähig ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, das weiterhin die Regeneration von Sprösslingen aus den genannten transformierten Pflanzenzellen umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, das weiterhin die Regeneration von Wurzeln aus den genannten transformierten Pflanzenzellen umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, das weiterhin die Regeneration einer Pflanze aus den genannten transformierten Pflanzenzellen umfasst
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die genannte Pflanze eine Monokotyledone ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die genannte Pflanze eine Dikotyledone ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das Intimin, das Intimin-ähnliche Protein oder der Teil davon, das durch die genannte DNA kodiert wird, weiterhin einen Histidin-Tag umfasst.