DE69735974T2

DE69735974T2 - Verwendung von strukturierten Tiefenfiltern zur Entfernung von Viren

Info

Publication number: DE69735974T2
Application number: DE69735974T
Authority: DE
Inventors: Magaret Clayton Savage; Werner Dr. Hinsken
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1997-03-10
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2017-03-11
Also published as: ATE327774T1; CA2200148A1; ES2267115T3; EP0798003B1; CA2200148C; JPH1028581A; DE69735974D1; EP0798003A3; AU731658B2; EP0798003A2; AU1636097A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet:
Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein die Entfernung von Viren aus Lösungen, und insbesondere befasst sich die Erfindung mit der Verwendung strukturierter Tiefenfilter zur Herabsetzung des Virus-Titers von Lösungen, die biologisch aktive Proteine enthalten.
Hintergrund:
Verschiedene poröse Filtermedien werden zur Filtration von Feinpartikel-Kontaminanzien aus Flüssigkeiten verwendet. Um als Filter zu fungieren, müssen die Medien das Fluid, gewöhnlich Wasser, durchlassen, während sie den teilchenförmigen Begleitstoff zurückhalten. Dieses Zurückhalten der teilchenförmigen Kontaminanzien bzw. Begleitstoffe wird mittels der Anwendung bzw. Durchführung, innerhalb der porösen Medien, von einem oder beiden zweier ganz unterschiedlicher Filtrationsmechanismen, nämlich (1) einer mechanischen Spannungsbelastung und (2) eines elektrokinetischen Partikeleinfangs, bewerkstelligt. Bei der mechanischen Spannungsbelastung wird der Partikel aus dem Fluidstrom durch physikalisches/körperliches Zurückhalten bei dessen Versuch, durch eine kleinere Pore als seiner selbst hindurchzugehen, beseitigt. Im Fall des elektrokinetischen Einfangmechanismus kollidieren der Partikel bzw. das Teilchen mit einer Oberfläche innerhalb des porösen Materials und wird auf der Oberfläche durch im Kurzbereich wirkende van der Waal's Anziehungskräfte zurückgehalten.
Filtermedien werden oft gemäß ihrer körperlichen Form beschrieben. Einige Filtermedien sind im Wesentlichen diskrete Membranen, die durch Zurückhalten der Kontaminanzien bzw. Begleitstoffe auf der Membranoberfläche funktionieren (Oberflächenfilter). Somit wirken und funktionieren diese Filtermedien über eine mechanische Belastungsspannung, und es ist dabei notwendig, dass die Porengröße des Filtermediums kleiner als die Partikelgröße der Begleitstoffe ist, die aus dem Fluid entfernt werden sollen. Ein derartiges Filtermedium zeigt und ergibt im Normalfall niedrige Fließgeschwindigkeiten und eine Tendenz zu rascher Verstopfung.
Weitere Filtermedien weisen die Form eines porösen Kuchens oder eines Betts aus einem feinen faserartigen oder teilchenförmigen Material auf, das auf einem porösen Träger oder Substrat abgeschieden ist. Die Lösung, die filtriert wird, muss dann ihren Weg durch eine mühsame Strecke von Poren, die durch die Zwischenräume in den Filtermaterialien ausgebildet sind, winden und finden, um kolloidale Kontaminanzien bzw. Begleitstoffe zurückzulassen, die vom Filtermaterial zurückgehalten werden. Wegen der Tiefe des Filtermaterials werden die Filter als Tiefenfilter bezeichnet (im Gegensatz zu den Oberflächenfiltern). Tiefenfilter halten in typischer Weise die Kontaminanzien und Begleitstoffe sowohl durch einen Siebmechanismus als auch durch den elektrokinetischen Partikeleinfangmechanismus zurück. Im elektrokinetischen Partikeleinfangmodus ist es unnötig, dass das Filtermedium eine entsprechend kleine Porengröße aufweist. Das Vermögen zur Bewerkstelligung der angestrebten Beseitigung suspendierter teilchenförmiger Kontaminanzien mit einem Filtermedium signifikant größerer Porengröße ist insofern attraktiv, als dadurch höhere Fließgeschwindigkeiten ermöglicht werden. Ferner weisen die Filter eine höhere Rückhaltekapazität für die Teilchen auf, weshalb sie auch eine nur geringe Tendenz zu Verstopfungen ergeben, siehe Curling (1980) und Meltzer (1987) bezüglich einer allgemeinen Diskussion der Filtration, insbesondere zur Anwendung in der pharmazeutischen Industrie.
Verfahren der Virus-Inaktivierung:
Viele biologisch aktive Proteine werden verwendet, um Krankheitszustände beim Menschen zu behandeln. Allerdings besteht dabei wegen der Protein-Quellen (z.B. aus menschlichen Plasma- oder Zell-Exprimiersystemen) die Möglichkeit zu einer viralen Kontamination in den Produkten. Es ist daher zur Herstellung von Protein enthaltenden Produkten typisch, Stufen zur viralen Herabsetzung oder Inaktivierung einzubauen, um sicherere Produkte zu ergeben, bei denen die Gefahr einer viralen Infektion abgesenkt ist. Die Verringerung von Virus-Titern lässt sich entweder durch Inaktivierung oder durch Beseitigung des Virus bewerkstelligen.
Verfahren zur Inaktivierung von Viren durch Behandeln mit Chemikalien und/oder durch Hitze sind im Stand der Technik üblich. US 4,540,573 von Neurath et al. beschreibt z.B. die Behandlung Protein-haltiger Zusammensetzungen mit Trialkylphosphat und mit einem Detergens zur Inaktivierung der Viren. In US 5,151,499 von Kameyama et al. wird eine trockene Hitze-Stufe dem Trialkylphosphat/Detergens-Verfahren zugefügt, um eine größere Herabsetzung des Virus-Titers zu ergeben. Die Virus-Titer können auch mit Verfahren zur Reinigung von Proteinen herabgesetzt werden. Beim Cohn-Oncley-Verfahren zur Reinigung von IgG-Fraktionen aus Blutplasma hat es sich erwiesen, dass Proteine mit verringerten viralen Titern gewonnen werden, siehe z.B. US 4,762,714 von Mitra et al., siehe auch Friedman et al. (1995) bezüglich einer kurzen allgemeinen Diskussion zur Herabsetzung des Infektionsvermögens von Blutkomponenten.
Mehrere Hersteller haben Produkte entwickelt, aus denen das Virus aus der Lösung über die Siebwirkung beim Durchlaufen der Lösung durch Membranfilter mit kleineren Porengrößen als die der Virus-Partikel entfernt wird. Diese Verfahren sind bei Yuasa et al. (1991), Nader (1994) und DiLeo et al. (1992) beschrieben. Die Viren (und deren Durchschnittsdurchmesser), über die in diesen Literaturstellen berichtet wurde, waren: Hepatitis C-Virus (30 bis 38 nm), Bakteriophage fr (ca. 23 nm), ϕX174 (ca. 28 nm) und ϕ6-Bakteriophage (ca. 78 nm).
Tiefenfilter werden in typischer Weise als Vorfilter verwendet, um die Gebrauchsdauer der endgültigen Filter, in typischer Weise von Oberflächen-(oder Membran)filtern, zu verlängern. Allerdings sind Tiefenfilter auch dafür bekannt, dass sie sich zum Zurückhalten von Viren eignen, sogar wenn die nominale Porengröße größer als der Durchschnittsdurchmesser des Virus ist. McConnell et al. (1984) geben eine virale Klärung von 4log₁₀-Einheiten aus Wasser mittels langsamer Sandfiltration, eines Verfahrens unter Anwendung eines "nicht-strukturierten" Tiefenfilters, siehe Meltzer (1987), S. 8, an.
Über eine derartig hohe Virus-Klärung ist mit "strukturierten" Tiefenfiltern nicht berichtet worden. Strukturierte Tiefenfilter, die zu definierten Größen und Formen vorgeformt erhältlich sind, werden durch eine Vielfalt von Technologien hergestellt und zubereitet. Deren Herstellung umfasst die fixierte Anordnung individueller Fasern oder Bits und Stückchen aus Keramik, Metall oder Polymeren zu einer Formgestalt. Dies kann durch Mattieren, Filzen, Weben, Kleben, Hitze- oder Lösungssintern usw. erfolgen. Der entstehende organische Verbund aus Fasern oder Partikeln stellt das Filterelement dar. Die Zwischenräume unter den verbundenen Komponentenpartikeln umfassen die Filterporen. Die sich durch diese Poren ergebende Filtrierwirkung beinhaltet eine Siebung sowie eine Retention durch Adsorption.
Ein Beispiel eines strukturierten mittleren Tiefenfilters ist in US 4,859,340 von Hou et al. angegeben, worin eine Filtermedienplatte aus Feinteilchen und einer selbst-bindenden Matrix aus Cellulosefaser beschrieben ist, von denen das eine oder beide mit einem kationischen Harz überzogen sind. Entsprechende Patente sind US 4,007,113 und 4,007,114 .
Jones et al. (1978) beschreiben die Verwendung positiv geladener Tiefenfilter, um Poliovirus aus Wasser zurückzuhalten und aufzukonzentrieren. Payment et al. (1988) beschreiben die Verwendung von Faserglas-Tiefenfiltern zur Rückgewinnung von Viren aus Wasser. Sowohl Jones et al. als auch Payment et al. geben eine Adsorption von mehr als 99% des Virus an den Filter an.
Bezüglich der Oberflächenladung von Tiefenfiltermedien ist gezeigt worden, dass sie eine Rolle bei der Adsorption und Elution von Viren spielt, siehe Borrego et al. (1991), Sobsey et al. (1984), Jones et al. (1978). Bezüglich einer allgemeinen Diskussion Ladungs-modifizierter Tiefenfilter, siehe Mandaro (in Meltzer, 1987, Kapitel 5). Der Zweck dieser Virus-Rückgewinnungsassays war es ganz allgemein, das Virus aus großen Lösungsvolumina zurückgewinnen und aufzukonzentrieren, um die Empfindlichkeit des Virus-Nachweis in späteren Assayverfahren zu verbessern. Diese Verfahren wurden somit ganz allgemein zur Analyse des Vorliegens oder der Menge viraler Kontamination in der Wasserbehandlung angewandt. Goyal et al. (1980) haben dieses Verfahren zur Rückgewinnung von Virus aus allantoiden Flüssigkeiten angewandt.
Breitenbach et al. (1995) beschreiben ein neues Filtermaterial, das Viren inaktiviert, und sie berichten über virale Inaktivierungsraten, die 5log₁₀-Einheiten übersteigen. Diese neuen Filter umfassen zwei unterschiedliche Filtermaterial-Schichten. In der einen Schicht wird eine virizide Chemikalie, im gegebenen Fall Jodid, freigesetzt, und in der anderen Schicht wird das Virizid beim Durchgang der Lösung durch diese zweite Filterschicht wieder beseitigt. Obwohl die virale Inaktivierung wesentlich ist, kann der oxidative Charakter des Virizids die biologische Aktivität des durch diesen Filter hindurchgehenden Materials nachteilig beeinflussen.
GB-A-2 045 828 betrifft eine Filtermedienplatte aus Feinpartikeln und einer selbst-bindenden Matrix aus Cellulosefaser, deren mindestens eine Oberfläche mit kationischer kolloidaler Kieselsäure modifiziert ist.
Der Einfang von Latex-Perlen, Bakterien, Endotoxin und von Viren durch Ladungs-modifizierte Filter ist bei Hou K. et al. beschrieben, Applied and Environmental Microbiology, Band 40, Nr. 5, 11/1980, S. 892–896.
Beide Zitate schweigen sich bezüglich des vorliegenden Verfahrens zur Herabsetzung des viralen Titers aus.
Wie oben angemerkt, werden Tiefenfilter derzeit in der pharmazeutischen Industrie als Vorfilter eingesetzt. In weiteren Anwendungen werden sie in typischer Weise entweder als Vor- oder als Endfilter herangezogen, um teilchenförmiges Material aus Lösungen in einem als Klärung bezeichneten Verfahren zu entfernen. Eine gewisse Entfernung von Virus ist inhärent in Ausfällungsstufen im Protein-Reinigungsverfahren; die Lösungen können dann von restlichem Niederschlag über die Anwendung von Tiefenfiltern befreit und geklärt werden. Allerdings ist, gemäß derzeit bestehender Kenntnis, über die Anwendung positiv geladener, strukturierter Tiefenfilter mit größeren Porengrößen als den Virusgrößen zur Bewerkstelligung wesentlicher Verringerungsraten im Virus-Titer von Lösungen, neben einer Fällungsstufe, nicht berichtet worden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es sind nun Bedingungen herausgefunden und entwickelt worden, unter denen die Anwendung eines strukturierten Tiefenfilters zur Filtration einer Lösung biologisch aktiver Proteine zu einer überraschend hohen Absenkung beim Virus-Titer führt. Die zu filtrierende Lösung sollte einen pH-Wert von ca. 5,0 bis ca. 7,0 aufweisen und die Filtration sollte mit einem kationisch geladenen Tiefenfilter durchgeführt werden, der einen Durchschnittsporendurchmesser aufweist, der größer als der Durchschnittsdurchmesser der zu entfernenden Viren ist. Der Virus-Titer im Filtrat wird mindestens um 3 und bevorzugter mindestens um ca. 4log₁₀-Einheiten herabgesetzt. Die biologische Aktivität des Proteins bleibt im Wesentlichen bestehen: die Filtration führt zu einer Retention von mindestens ca. 80% und bevorzugter von mindestens ca. 90% der ursprünglichen (Vor-Filtrations)-Aktivität. Der bevorzugte Durchschnittsporendurchmesser des Filters kann im Bereich von ca. 0,1 bis ca. 5 μm liegen, wobei ein bevorzugterer Bereich bei ca. 0,25 bis ca. 2 μm liegt. Ein bevorzugter Filter wird aus einer Filterhilfe wie Diatomit und einer selbst-bindenden Matrix aus Cellulosefaser hergestellt, von denen der eine Bestandteil oder beide mit einem kationischen Harz überzogen sind; ein bevorzugterer Filter ist ein ZETA PLUS-Markenfilter, in den Handel gebracht von Cuno (Meriden, CT).
Spezifische Ausgestaltungen
Der vorliegende Bericht präsentiert Daten, die die Entfernung verschiedener Modell-Viren unter Einschluss von viralem Rinder-Diarrhövirus (Bovine viral diarrhea virus = BVDV), gewählt als Modell für Hepatitis C-Virus, von Pseudorabies-Virus (PRV), gewählt als Modell für den Hepatitis B- und die Herpes-Viren, sowie von Reo-Virus-Typ 3 (Reo), gewählt als Modell für nicht-umhüllte Viren, und deren Resistenz gegen physikalische und chemische Inaktivierungsverfahren evaluieren.
Die gelieferten Daten zeigen, dass die Tiefenfilter der Beispiele befähigt waren, Virus-Titer von sowohl umhüllten als auch nicht-umhüllten Viren herabzusetzen. Somit liefert diese Studie eine zusätzliche Sicherheit, dass die behandelten Lösungen einen hohen Sicherheitsgrad vor dem Risiko viraler Übertragungen ergeben und aufweisen.
Wie hierin verwendet, bedeutet Durchschnittsporendurchmesser die Porengröße, die einer Zurückweisungsrate durch Siebwirkung von mindestens ca. 90% der Partikel bei der gegebenen Größe durch den Filter entspricht.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Durchschnittsdurchmesser des Virus den für den Durchmesser des Virus allgemein akzeptierten Wert, wie er in der relevanten wissenschaftlichen Literatur angegeben ist.
Wie hierin verwendet, bedeutet die wesentliche Herabsetzung des Virus-Titers eine Herabsetzung um mindestens ca. 3log₁₀-Einheiten beim Virus-Titer.
Wie hierin verwendet, bedeutet biologisch aktives Protein ein Protein, das eine messbare Funktion oder Aktivität zeigt und aufweist oder sich für ein angestrebtes Ergebnis eignet (insbesondere im Gegensatz zum selben Protein in einem denaturierten oder nutzlosen Zustand). Die Funktion, Aktivität oder das angestrebte Ergebnis könnten z.B. eine enzymatische Aktivität oder eine Bindungsaffinität sein.
Wie hierin verwendet, bedeutet die Beibehaltung der biologischen Aktivität eine Beibehaltungsrate von mindestens ca. 80% oder bevorzugter von mindestens ca. 90% der biologischen Aktivität.
Materialien und Verfahren
Effluens III wurde aus Vorräten von menschlichem Plasma, fraktioniert mit dem kalten Cohn-Oncley-Ethanol-Verfahren mit Modifikation gemäß US 4,396,608 von Tenold, erhalten. Das Cohn-Fraktionierungsverfahren ist ganz allgemein so angesehen worden, dass damit sichere Immunoglobulin-Produkte bezüglich potentieller Virus-Übertragungen erhalten werden. Jede eingesetzte individuelle Plasma-Einheit wurde getestet und als nicht-reaktiv für das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) und als negativ für Antikörper gegen Human-Immunodefizienz-Virus-Typen 1 und 2 (HIV-1, HIV-2) und gegen Hepatitis C-Virus (HCV) ermittelt. Alanin-Transaminase (ALT), ein Marker für die Leber-Funktion und durch Interferenz für eine durch die Hepatitis-Viren verursachte Schädigung, überstieg den Normalbereich nicht um das Zweifache. Auf diese Weise wurde das Quellenmaterial, d.h. das Plasma, ausgewählt und getestet, um die Abwesenheit klinisch signifikanter Viren im Effluens III zu bestätigen.
Diese Studie der gewählten Viren und deren Merkmalsattribute sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Bovines virales Diarrhövirus (BVDV), ein umhülltes RNA-Virus, wurde als relevantes Modell für das Hepatitis C-Virus ausgewählt. Pseudorabies-Virus (PRV), ein umhülltes DNA-Virus, wurde als das Modell gewählt für die klinisch relevanten Herpes-Viren: CMV, Epstein-Barr-Virus und Herpes simplex Typen 1, 2, 6 und 7. Außerdem wurde das nicht-umhüllte RNA-Virus, der Reovirus-Typ 3 (Reo), als Modell-Virus mit Resistenz gegen physiko-chemische Mittel gewählt.
Tabelle 1: Verwendete Modell-Viren
Mindestens 2 unabhängige Durchgänge wurden für jedes Virus durchgeführt. Die Titer der Viren wurden in jeder Probe zum Zeitpunkt 0 bestimmt, um die Virus-Beaufschlagung zu bestimmen. Eine Lösung von 150 mL- und 500 mL-Effluens III, gespickt mit Modell-Virus, wurde durch einen ZETA PLUS ZP04701-50CP-Tiefenfilter (Cuno, Inc., Meriden, CT) geleitet. 1 zusätzliche Filtration wurde unter Spicken mit Reo durchgeführt, wobei 650 mL eingesetzt wurden, um das Verhältnis von Volumen zu Oberflächenfläche für die Filtration zu maximieren. Das Effluens III wurde mit 1 Teil Virus plus 19 Teilen des Ausgangsmaterials für die Versuche mit 150 mL sowie mit 650 mL für den zusätzlich durchgeführten Reo-Versuch (zur Erhöhung der Reo-Virus-Last und somit zur Durchführung eines Tests der Robustheit der Filtration) und mit 1 Teil Virus plus 99 Teilen Ausgangsmaterial für die mit 500 mL durchgeführten Versuche gespickt, um Virus zu konservieren.
Virus-Quantifizierungsassays:
Standard-Zellkulturbedingungen wurden für Virus-Infizierbarkeitsassays mit RPMI 1640 oder mit Eagle-Minimal-Essentialmedium (MEM), ergänzt mit nicht-essentiellen Aminosäuren, HEPES-Puffer (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'[2-ethansulfonsäure]), fötalem Rinderserum und mit Antibiotika, angewandt. Das RPMI 1640-Medium wurde für die MT-4-Zellen allein angewandt. Die Virus-Titer wurden mit Gewebekultur-Assayverfahren mit infektiöser Dosis bei 50%igem Infektionsvermögen (TCID₅₀) quantitativ bestimmt. Die TCID₅₀-Titer wurden mit dem Verfahren von Spearman-Karber berechnet, siehe Cavalli-Sforza (1974), S. 171–173.
Mikrotiterplatten mit 96-Lochvertiefungen wurden mit den jeweiligen konfluenten Zellen (BVDV in Bovinem Turbinat(BT)-Zellen, PRV in Rab-9-Zellen, Reo in BSC-1- oder Vero-Zellen) angewandt. Der Becker-Stamm von PRV wurde für Studien herangezogen, bei denen ein höherer Titer benötigt wurde. Das Virus-gespickte Verfahrensinoculum betrug 0,1 mL pro Vertiefung. Log₁₀- oder Halb-log₁₀-Verdünnungen wurden in HBSS von 10^–0,5 oder 10^–1 bis 10^–6, 4 Replikat-Lochvertiefungen pro Verdünnung für einen der Fraktionierungsdurchgänge, hergestellt. Für den zweiten Durchgang wurden zusätzliche 8 Replikat-Lochvertiefungen pro Verdünnung für insgesamt 12 Lochvertiefungen angewandt. Dies erfolgte, um die Empfindlichkeit der Assayverfahren mit 4 Replikat-Lochvertiefungen pro Verdünnung zu bestätigen. 3 Versuche wurden für die Filtrationen mit BVDV und PRV durchgeführt. 4 Versuche wurden beim Spicken mit Reo durchgeführt. Halb-log-Verdünnungen wurden in HBSS von 10^–0,5 bis 10^–7,5 mit 12 Replikat-Lochvertiefungen pro Verdünnung hergestellt.
Das Testmaterial wurde in Kontakt mit Zellen 1 h lang bei 37°C gebracht, um die Virus-Adsorption zu ermöglichen. Das Material wurde entnommen, und frisches MEM wurde in die Lochvertiefungen gegeben. MEM wurde für PRV und Reo verwendet. Für BVDV wurde das MEM mit Pferdeserum anstatt mit dem fötalen Rinderserum ergänzt. Die Platten wurden 5 bis 7 Tage lang bei 36 ± 2°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden Zell-Monoschichten mikroskopisch bezüglich des Auftretens einer viralen Infektion gemäß Anzeige durch den zytopathischen Effekt (CPE) beobachtet. Nach 5 bis 7 Tagen konnte ein durch BVDV und PRV induzierter CPE ganz leicht durch mikroskopische Untersuchung unterschieden werden. War allerdings die CPE-Bestimmung wegen eines Überwachstums der Zellen erschwert, wurden die Reo-infizierten Zellen zur Steigerung der Sichtbarmachung des CPE angefärbt. Die Zellen wurden 10 min lang mit kaltem 95%igen Ethanol (EtOH) fixiert, worauf das EtOH entfernt und die Zellen mit May-Grünwald-Giemsa- oder mit Kristall-Violett-Färbung gefärbt wurden. Nach Färbung und Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Zellen mikroskopisch untersucht. Uninfizierte Zellen erschienen als dunkelblaue Monoschichten, während Herde von mit Virus infizierten Zellen als nur sehr leicht gefärbte Flächen sichtbar wurden.
Tests für Zytotoxizität und virale Interferenz
Für jene Fraktionierungsproduktproben, von denen erwartet wurde, dass sie nur niedrige Virus-Spiegel enthalten, wurden unverdünnte Proben ohne Virus auf jede der Indikator-Zelllinien aufgebracht, um den Matrix-Effekt (Ethanol, Verfahrenspuffer und Proteine usw.) auf den Zellen zu bewerten.
Effluens III wurde auf unverdünnte und mit 1:10 in HBSS verdünnte BT- und Vero-Zellen inoculiert. Filtrat III wurde auf unverdünnte und mit 1:3,2 in HBSS verdünnte Rab 9- und BSC-1-Zellen inoculiert. HBSS wurde als Vergleich herangezogen. Ein zusätzlicher Vergleich schloss 17% Ethanol enthaltendes HBSS ein, um die Auswirkungen der Ethanol-Konzentration auf die Zellen zu bewerten. Nach 1 h Einwirkung auf das Material wurde das Effluens entnommen, und die Zellen wurden mit frischem MEM gespeist. Die Zellen wurden nach 7 Tagen bezüglich der Zytotoxizität untersucht.
Virale Interferenzassayverfahren wurden durch Verdünnen von Virus-Vorräten in HBSS als Vergleich und in mit 1:10 in HBSS verdünntem Effluens III durchgeführt. Die 2 für diese Versuche eingesetzten Viren waren BVDV und Reo. Log₁₀-Verdünnungen wurden hergestellt und die Zellen mit 0,1 mL für eine 1-stündige Adsorptionszeit inoculiert. Das Material wurde entnommen, und Medien wurden zugegeben. 7 Tage nach Infektion wurden die Zellen mikroskopisch bezüglich des viralen CPE untersucht.
Virale Interferenzassayverfahren für Filtrat III wurden durch Verdünnen von Virus-Vorräten in HBSS als Vergleich und in mit 1:3,2 in HBSS verdünntem Filtrat III durchgeführt. Halb-log₁₀-Verdünnungen wurden hergestellt, und die Zellen wurden inoculiert und wie oben beschrieben inkubiert. Die eingesetzten Viren waren PVR und Reo.
Das Wirkvermögen der Verfahrensstufen zur Klärung der relevanten Modell-Viren wurde durch Vergleich der Virus-Last in der Eingabe mit derjenigen der Ausgabe zur Berechnung des Verringerungsfaktors ermittelt. Die Mehrzahl der 95%-Vertrauensintervalle für die Virus-Titerbestimmungen mit log₁₀-Verdünnungen betrug ca. 1log₁₀. Bei Anwendung von Halb-log₁₀-Verdünnungen betrugen die 95%-Vertrauensintervalle für die Virus-Titerbestimmungen ca. 0,3 bis 0,4log₁₀.
Die Erfindung wird nun noch weiter durch die folgenden erläuternden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Filtration von Effluens III zu Filtrat III
Die Ergebnisse der Virus-Klärungsversuche mit den 3 Modell-Viren sind in Tabelle 2 angegeben. Für einen gegebenen Versuch wurde das Virus in Minimalessentialmedium (MEM) zum gegebenen Volumen des Effluens III gegeben (wie oben beschrieben). Beispielsweise wurden zu 504 mL Effluens III 5 g Reovirus in MEM gegeben. Der pH-Wert des Protein enthaltenden Effluens III plus Virus wurde auf 5,4 eingestellt und bei –5°C gekühlt. Filterhilfe wurde auf eine Endkonzentration von 0,6% zugegeben. Eine 10 mL-Probe wurde zur anfänglichen Virus-Titerbestimmung gezogen. Die zurückbleibende Lösung wurde durch einen CUNO ZETA PLUS^® ZP04701-50 CP-Filter bei einem Druck von 10 psi filtriert. Das entstandene Filtrat wurde gesammelt, worauf eine Titerbestimmung der Proben zum Nachweis von Virus durchgeführt wurde. Nach Beendigung der Filtration wurde der Filter entnommen und in 50 mL ausgeglichene Salz-Lösung gegeben und 15 min lang geschüttelt (Filter aus Versuchen mit kleineren Volumina wurden in entsprechend kleineren Volumina ausgeglichener Salz-Lösung geschüttelt). Es wurde auch eine Titerbestimmung dieser Probe zum Nachweis von im Filter zurückgehaltenem Virus durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 als log₁₀-TCID₅₀/mL in jeder Probe ausgedrückt. Der Durchschnitts-log₁₀-Verringerungsfaktor wurde durch Multiplizieren des log₁₀-TCID₅₀/mL mit dem Volumen des Effluens III zur Bestimmung der Gesamtvirus-Einspeisbeladung für jedes der Viren [(Vol)(log₁₀-TCID₅₀/mL)] und dann durch Dividieren mit dem im Filtrat III zurückgebliebenen Gesamt-Virus [(Vol)(log₁₀-TCID₅₀/mL)] berechnet. Der Durchschnitts-log₁₀-Verringerungsfaktor betrug ≤ 1 für BVDV, ≥ 3,8 für PRV und ≥ 4,5 für Reo. Ergebnisse, die mit > angegeben sind, zeigen an, dass eine vollständige Klärung der Virus-Einspeisbeladung bewerkstelligt wurde. Höhere Klärung oder Inaktivierungsfaktoren könnten erzielt werden, falls es ermöglicht würde, höhere Virus-Titer für die Eingabe-Spickungen zu erhalten. Tabelle 2: Tiefenfiltration von Effluens III- zu Filtrat III-Virus in Fraktionierungsproben (Log₁₀-TCID₅₀/mL)

^a A und B = 2 Replikat-Versuche – 150 mL-Filtrationsvolumen
^b C = 500 mL-Filtrationsvolumen
^c D = Für Reo 650 mL-Filtrationsvolumen
^d Gesamt-Virus (Gesamt-log₁₀-TCID₅₀), angewandt für BVDV, weil Virus in allen Proben des Filtrats III gefunden wurde
^e Die Filterunterlagen wurden in 12 bis 18 mL HBSS suspendiert, worauf eine Probe zur Filtration entnommen wurde

Es wird davon ausgegangen, dass das BVDV vom Tiefenfilter deshalb nicht zurückgehalten wurde, weil dieses Virus ein viel höheres Ladungsdichteverhältnis als die eingesetzten weiteren Viren aufweisen mag. Auch die Anwesenheit von anderen Proteinen als IgG, welche aus dem Effluens III mit dem Tiefenfilter entfernt wurden, mag mit diesem Virus so konkurriert haben, dass das Virus nicht zurückgehalten werden konnte. In weiteren Versuchen, in denen die kontaminierenden Proteine nicht und nur IgG in der Protein-Lösung vorhanden waren, wurde das BVDV vom Tiefenfilter zurückgehalten.
Beispiel 2
Virus-Klärungsversuche wurden wie in Beispiel 1 an 3 weiteren Viren durchgeführt: Hepatitis A-Virus, Rinder-Parvovirus und Schweine-Parvovirus. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Die Klärungsraten betrugen ≥ 4,0log₁₀-Einheiten für das Hepatitis A-Virus, ≥ 2,7log₁₀-Einheiten für das Rinder-Parvovirus und ≥ 4,7log₁₀-Einheiten für das Schweine-Parvovirus. Bei weiterer Verfeinerung der Bedingungen wird davon ausgegangen, dass die Virus-Klärung für das Rinder-Parvovirus desgleichen ≥ 3,0log₁₀-Einheiten ergeben würde. Tabelle 3: Tiefenfiltration von Effluens III- zu Filtrat III-Virus in Fraktionierungsproben (Log₁₀-TCID₅₀/mL)

^a 150 mL-Filtrationsvolumen
^b 500 mL-Filtrationsvolumen
^c 600 mL-Filtrationsvolumen

Auf der Grundlage der vorliegend geltend gemachten Erfahrungen und Ergebnisse zur Verfolgung und Aufzeichnung der Aktivität handelsüblich produzierter Immunglobuline wäre von den oben beschriebenen Bedingungen nicht zu erwarten, dass sie die biologische Aktivität der Proteine nachteilig beeinflussen, wobei es eine wesentliche Retention der ursprünglichen biologischen Aktivität des Proteins gäbe.
Die obigen Beispiele sollen die Erfindung lediglich erläutern, wobei sich für den Fachmann Variationen unmittelbar und ohne Weiteres erschließen sollten. Demzufolge soll der Umfang der Erfindung nur durch die unten angegebenen Ansprüche eingeschränkt sein.
Literaturverzeichnis

US 4,007,113 von Ostreicher E. A. vom 8. Februar 1977
US 4,007,114 von Ostreicher E. A. vom 8. Februar 1977
US 4,396,608 von Tenold R. A. vom 2. August 1983
US 4,540,573 von Neurath A. R. et al. vom 10. September 1985
US 4,762,714 von Mitra G. et al. vom 9. August 1988,
US 4,859,340 von Hou K. C. et al. vom 22. August 1989
US 5,151,499 von Kameyama S. et al. vom 29. September 1992
Borrego J. J. et al., "Development and Application of new Positively Charged Filters for the Recovery of Bacteriophages from Water", Appl. Environ. Microbiol. 57: 1218–22 (1991)
Breitenbach J. et al., DE 43 43 226 A1 , veröffentlicht am 22. Juni 1995
Cavalli-Sforza L., Biometrie Grundzüge Biologisch-medizinischer Statistik [Biometry, the Basics of Biological and Medical Statistics], Gustav Fischer Verlag (Stuttgart, 1974)
Curling J. M., Herausgeber, Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press (London, 1980)
DiLeo A. J. et al., "High Resolution Removal of Virus from Protein Solutions Using a Membrane of Unique Structure", Bio/Technol., 10: 182–188 (1992)
Friedman L. J. et al., "Reducing the Infectivity of Blood Components – What We Have Learned", Immunolog. Invest. 29: 49–71 (1995)
Goyal S. M. et al., "Simple Method for the Concentration of Influenza from Allantoic Fluid on Microporous Filters", Appl. Environ. Microbiol. 39: 500–504 (1980)
Jones B. L. et al., "Concentration of Poliovirus from Tap Water Using Positively Charged Microporous Filters", Presented at Ann. Conf. Amer. Water Works Ass'n, Atlantic City, NJ, 26. bis 30. Juni 1978
McConnell L. K. et al., "Reovirus Removal and Inactivation by Slow Rate Sand Filtration", Appl. Environ. Microbiol., 48: 818–825 (1984)
Meltzer T. H., Filtration in the Pharmaceutical Industry, Marcel Dekker (New York, 1987)
Nader W., "Validation of a UF System for the Removal of Viruses and Scrapie Agent", Genet. Engin. News, 1. November 1994, S. 16
Payment P. et al., "Wound Fiberglass Depth Filters as a Less Expensive Approach for the Concentration of Viruses from Water", Can. J. Microbiol., 34: 271–272 (1988)
Sobsey M. D. et al., "Influence of Water Quality on Enteric Virus Concentration by Microporous Filter Methods", Appl. Environ. Microbiol., 47: 956–960 (1984)
Yuasa T. et al., "The Particle Size of Hepatitis C Virus Estimated by Filtration Through Microporous Regenerated Cellulose Fiber", J. Gen. Virol. 72: 2021–2024 (1991)

Claims

Verfahren zur Herabsetzung des Titers von Viren in einer wässrigen Lösung biologisch aktiver Plasmaproteine, ohne die Wirksamkeit des Proteins nachteilig zu beeinflussen, wobei das Verfahren die Stufe umfasst, in der man die Lösung bei einem pH-Wert von ca. 5,0 bis ca. 7,0 durch ein strukturiertes Tiefenfilter aus einem positiv geladenen porösen Filterelement, dessen Durchschnittsporendurchmesser größer als der Durchschnittsdurchmesser der Viren ist, laufen lässt und die Filtration unter Bedingungen durchführt, um eine Herabsetzung des Virus-Titer um mindestens ca. 3log₁₀-Einheiten in der filtrierten Lösung unter Beibehaltung von mindestens ca. 80% der biologischen Aktivität der Proteine zu ergeben, wobei die Viren aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Hepatitis A-Virus, Pseudorabies-Virus, Herpes simplex-Virus-Typ 1, Herpes simplex-Virus-Typ 2, Herpes simplex-Virus-Typ 6, Herpes simplex-Virus-Typ 7, Zytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus, Reovirus und aus Schweine-Parvovirus.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Durchschnittsporendurchmesser des Filterelements im Bereich von ca. 0,25 bis ca. 2 μm liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Filterelement eine Filterhilfe und eine selbst-bindende Matrix aus Cellulosefaser umfasst, von denen mindestens ein Bestandteil mit einem kationischen Harz überzogen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die Filterhilfe Diatomit ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die Proteine IgG sind.