DE69715011T2

DE69715011T2 - Verfahren zur verbesserung der leistung von einem immunoreagenz in einem immunoassay

Info

Publication number: DE69715011T2
Application number: DE69715011T
Authority: DE
Inventors: K. Joseph; R. Mees; R. Pope; A. Pry; Brent Putman; T. Subotich; J. Tarcha
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1996-06-07
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2003-04-30
Anticipated expiration: 2017-06-04
Also published as: JP2000512750A; ATE223053T1; DE69715011D1; ES2185024T3; EP0923735A1; US5681754A; CA2255909A1; WO1997046881A1; EP0923735B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Leistung eines immobilisierten spezifischen Bindungsgliedes in einem Immunoassay, insbesondere in einem Immunoassay, welcher ein spezifisches Bindungsglied verwendet, welches auf einen Festphasenmaterial immobilisiert ist.

2. Beschreibung des Fachgebiets

Zahlreiche analytische Verfahren können bei diagnostischen Assays verwendet werden, um das Vorhandensein und/oder die Menge von Substanzen, die von Interesse oder von klinischer Bedeutung sind, in Testproben, wie zum Beispiel Körperflüssigkeiten, zu bestimmen. Diese interessanten oder klinisch wichtigen Substanzen werden typischerweise als Analyte bezeichnet. Diagnostische Assays sind ein unverzichtbares Mittel zum Nachweis von Analyten in Testproben geworden, indem die Reaktion zwischen einem Analyten und einem spezifischen Bindungsglied verwendet wird, wie verdeutlicht durch die Immunoreaktion zwischen einem Antigen und dem Antikörper gegen dieses Antigen.
Beim Nachweis von Immunoreaktionen wurden Labels oder Marker verwendet, die aus einer nachweisbaren Substanz bestehen, welche an ein spezifisches Bindungsglied, wie zum Beispiel ein Antikörper, angeheftet ist, welcher seinerseits an den Analyten bindet, um einen Antikörper/Analytenkomplex zu bilden. Der Nachweis des markierten Antikörper/Analytenkomplexes, oder des markierten Antikörper, welcher ungebunden bleibt, zeigt das Vorhandensein oder die Menge des Analyten in der Testprobe an.
Assay-Techniken, welche metallische Solpartikel als Marker verwenden wurden entwickelt. Bei diesen Techniken wird ein Metall (z. B. Gold, Silber, Platin), eine Metallverbindung oder eine nicht metallische Substanz, wie z. B. Selen, verwendet, um eine wässerige Dispersion von Partikeln zu bilden. Das zu markierende spezifische Bindungsglied wird auf die Solpartikel mit Adsorption aufgebracht. Die Solpartikel können ein Signal erzeugen, das sowohl visuell nachweisbar als auch durch ein Instrument messbar ist; jedoch, trotz ihrer Nützlichkeit, gestatten die Oberflächen dieser Solpartikel, wie z. B. Gold oder Selen, nicht ohne weiteres die kovalente Anheftung von spezifischen Bindungsgliedern. Somit muss Rücksicht genommen werden, damit die adsorbierten spezifischen Bindungsgliedern nicht von den Solpartikeln durch die Kombination von Verdrängung durch andere Proteine oder Tenside und die Scherkräfte, welche beim Waschen auftreten, entfernt werden.
Partikeförmige Marker bei Immunoassayreagenzien wurden ebenfalls aus polymerisierten Farbstoffen gebildet. Farbstoffmoleküle, z. B. chromogene Monomere, werden polymerisiert, um ein gefärbtes Polymerpartikel zu bilden. Die Farbstoffpartikel können dann an spezifische Bindungsglieder zur Anwendung in einem Assay gebunden werden. Beispiele für solche Farbstoffe umfassen Kongo rot, Trypan blau und Lissamin blau.
Polypyrrolpartikel, oft als Polypyrrollatex bezeichnet, wurden als ein gefärbter Indikator für Immunoassay verwendet. Polyrrollatex bietet verschiedene Vorteile für die Bildung von Immunoreagenzien. Das Latex ist intrinsisch schwarz, und besitzt eine starke Absorption von Licht über das gesamte sichtbare Spektrum. Diese Eigenschaft macht die Partikel nützlich für Nachweisreagenzien, entweder für den visuellen oder Vorrichtungbasierenden Nachweis. Das U.S. Patent Nr. 5,252,459 beschreibt die Verwendung von Polypyrrollatex bei diagnostischen Anwendungen.
Die Verwendung von Polypyrrol in der Form von kolloidalen Partikeln als ein immundiagnostisches Reagenz war beschränkt durch die niedrige ersichtliche Aktivität in verschiedenen Assaysformaten, und durch eine Tendenz zur Veränderung der Assayleistung im Verlauf der Zeit. Die niedrige Aktivität ist die Folge einer Interferenz spezifischer Bindungsglieder durch sterische Stabilisatoren, welche während der Bildung des Polypyrrollatex verwendet wurden. Der Grund der Veränderung der Assayleistung ist eine Folge der Veränderung der sterischen Stabilisatoren im Verlauf der Zeit. Die sterischen Stabilisatoren können nicht leicht aus dem Basislatex während der Reinigung entfernt werden und sind somit auf der Oberfläche des Partikels in dem endgültigen Immunoreagenz vorhanden.
Immunodiagnostische Reagenzien werden durch die Adsorption eines spezifischen Bindungsgliedes hergestellt, wie zum Beispiel ein Antikörper an ein kolloidales Partikel in einem Verfahren, welches "Beschichten" des Partikels bezeichnet wird. Es gab zwei Hauptnachteile für die Anwendung von kolloidalen Partikel von Polypyrrol als eine Verbindung eines immunodiagnostischen Reagenz. Kolloidale Partikel, welche beschichtet werden sofort nach ihrer Synthetisierung und Reinigung zeigten bei Untersuchungen eine eingeschränkte spezifische Bindungsaktivität bei Immunoassays, welche von Agglutination oder von Festphasenfang der kolloidalen Partikel abhängig sind. Bei verlängerter Lagerung der unbeschichteten kolloidalen Partikel zeigten frisch hergestellte Immunoreagenzien eine verbesserte Leistung. Jene Zeit, welche benötigt wird, um die Partikel in einen geeigneten Zustand für die Anwendung in einen Immunoassay zu bringen, ist oft lang (z. B. Wochen oder Monate) und schwankt zwischen verschiedenen Zubereitungen der Partikel. Es wurde beobachtet, dass dieses "Altern" bei erhöhten Temperaturen beschleunigt worden ist. Beispielsweise wiesen Konjugate, welche Antikörper umfassten, welche auf kolloidale Patikel aus Polypyrrol beschichtet waren, welche bei 37ºC für 72 Stunden gemischt wurden, nachweislich eine signifikant erhöhte spezifische Bindungsaktivität auf. Verlängerte Zeiträume der thermischen Behandlung sowohl des beschichteten und unbeschichteten Latex wurden verwendet, um die Leistung von Assays zu verbessern, jedoch tritt das Altern erneut nach der thermischen Behandlung auf.
Obwohl das thermische Altern die spezifische Bindungsaktivität von spezifischen Bindungsgliedern verbesserte, welche auf kolloidalen Partikeln von Polypyrrol immobilisiert waren, führte das thermische "Altern" von kolloidalen Partikeln von Polypyrrol eine zusätzliche Einschränkung ein. Die Immunoreagenzien, welche aus unterschiedlichen Chargen von "gealtertem" Polypyrrol hergestellt waren, zeigten unterschiedliche Niveaus spezifischer Bindungsaktivität. Darüber hinaus fuhren Herstellungen von unbeschichteten, gealterten Polypyrrol damit fort, sich zu verändern, wenn die Lagerungsdauer stieg. In einigen Fällen führte die verlängerte Alterung, entweder durch verlängerte thermische Behandlung oder durch verlängerte thermische Lagerung zur Aggregation der kolloidalen Partikeln, was diese nutzlos werden ließ. Die Variationen der spezifischen Bindungsaktivität, die aus der Lagerung und der Unterschiedlichkeit von Charge zu Charge entstanden, machte es schwierig, reproduzierbare Reagenzien bereitzustellen, die aus Polypyrrolpartikeln hergestellt waren. Wie zuvor gesagt, ist der Zeitraum, welcher benötigt wird, um kolloidale Partikel von Polypyrrol in einem geeigneten Zustand zur Verwendung in einem Immunoassay zu bringen, oft lang, und lag im Bereich von Wochen bis Monaten, und die Partikel variierten von Charge zu Charge.
Es wäre wünschenswert ein Verfahren zur Steuerung der Herstellung von kolloidalen Immunoreagenzien zu entwickeln, welche kolloidale Partikel umfassen, um reproduzierbare Ergebnisse zu sichern. Es wäre wünschenswert die "Alterung" nach Synthese zu reduzieren. Selbst mit beschleunigter Alterung durch thermische Behandlung verändern sich kolloidalen Partikel im Laufe der Zeit, und der Beschichtungsvorgang führt oft zu der Aggregation der kolloidalen Partikel.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Erhöhung der Bindungsaktivität von spezifischen Bindungsgliedern, welche an ein Festphasenmaterial gebunden sind, z. B. Partikel, welche sterisch stabilisiert wurde. Diese Erhöhung der Bindungsaktivität wird durch den Abbau eines sterischen Stabilisators auf der Oberfläche des Festphasenmaterials erzeugt. Im allgemeinen umfasst das Verfahren sowohl das immobilisieren eines spezifischen Bindungsgliedes auf der Oberfläche eines Festphasenmaterials, welches einen sterischen Stabilisator darauf besitzt, und dem Abbau des sterischen Stabilisators. In der bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Immobilisierung eines spezifischen Bindungsglied auf der Oberfläche des sterisch stabilisierten Festphasenmaterials, mit folgendem Abbau des sterischen Stabilisators. Alternativ dazu, aber weniger bevorzugt, kann der sterische Stabilisator vor der Immobilisierung des spezifischen Bindungsgliedes auf der Oberfläche des Festphasenmaterials abgebaut werden. In dem letzteren Fall, müssen Vorsichtsmaßnahme getroffen werden, um die kolloidale Stabilität des Festphasenmaterials vor der Immobilisierung zu sichern. Solche Vorsichtsmaßnahmen umfassen das Erhalten einer niedrigen ionischen Stärke, die Steuerung des pH-Werts und die Verwendung von Tensiden. Das Verfahren der bevorzugten Ausführungsform stellt kolloidale Stabilität während des Immobilisierung-Schrittes zur Verfügung, da spezifische Bindungsglieder, wie zum Beispiel Proteine, als wirksame Stabilisatoren von Kolloiden bekannt sind. Beide Ausführungsformen stellen eine verbesserte Bindungsaktivität des Immunreagenz beim Abschluss des Verfahrens zur Verfügung. Die spezifische Aktivität des Immunreagenz kann durch Steuerung der Bedingungen des Abbaus und der Konzentrationen von Festphasenmaterialien und der verwendeten spezifischen Bindungsglieder verbessert werden.
Bei der vorliegenden Erfindung wird der sterische Stabilisator, welcher verwendet wird, um das Festphasenmaterial zu bilden, während des Verfahrens der Herstellung eines Immunoreagenz, welches ein spezifisches Bindungsglied umfasst, abgebaut. Der Abbau des sterischen Stabilisators führt zur Verbesserung der Erreichbarkeit des gebundenen spezifischen Bindungsglied zum komplementären Glied seines spezifischen Bindungspaares. Diese Veränderung der Erreichbarkeit wird in einer messbaren Verbesserung der spezifischen Aktivität des Immunreagenz wiedergespiegelt.
In dem spezifischen Fall von Polypyrrol umfasst das Verfahren vorzugsweise die Lagerung von ursprünglich vorbereiteten kolloidalen Partikeln, typischerweise bei reduzierter Temperatur, vorzugsweise unter Stickstoff, und den folgenden Abbau des sterischen Stabilisators durch Oxidationsmittel, vorzugsweise durch Periodat-Oxidationsmittel. In dem spezifischen Fall von Polypyrrol, beendet das Verfahren der vorliegenden Erfindung tatsächlich die Alterung der kolloidalen Partikel und oxidiert selektiv den sterischen Stabilisator, vorzugsweise Poly(Vinylalkohol), welcher bei der Herstellung der kolloidalen Partikel verwendet wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Graph, welcher das Verhältnis von Atomprozent-Sauerstoff zu Stickstoff auf der Oberfläche von kolloidalen Partikeln als eine Funktion des berechneten Prozentsatzes von Massenverlust, welcher durch seine Reaktion mit Periodat entsteht, darstellt. Die Atomprozente wurden durch röntgenstrahlangeregte Photoelektronenspektroskopie (XPS) erhalten.
Fig. 2 ist ein Graph, der die Wirkung von Periodat- Sauerstoff auf die spezifische Aktivität von Polypyrrol-Immunoreagenzien bei einem Estradion-1-glucuronid (E1G) Immunoassay zeigt.
Fig. 3 ist ein Graph, der die Wirkung einer gesteuerten Sauerstoffeinwirkung auf die spezifische Aktivität von Polypyrrol-Immunoreagenzien in einem E1G Immunoassay zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Die folgenden Ausdrücke und Bezeichnungen können beim Verständnis der vorliegenden Erfindung nützlich sein.
"Spezifisches Bindungsglied", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Glied eines spezifischen Bindungspaares; d. h. zwei unterschiedliche Moleküle, worin eines der Moleküle durch chemische oder durch physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Zusätzlich zu Antigen und Antikörperspezifischen Bindungspaaren umfassen weitere spezifische Bindungspaare Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lezithine, komplementären Nukleotidsequenzen (einschließlich von Sonden- und Fangnukleinsäuresequenzen, welche in DNA Hybridisationsassays verwendet werden, um eine Ziel-Nukleinsäuresequenz nachzuweisen) komplementäre Peptidsequenzen, Effektor- und Rezeptormoleküle, Enzymcofaktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme und dergleichen. Weiterhin können spezifische Bindungspaare Glieder enthalten, welche Analoga des ursprünglichen spezifischen Bindungspartners sind. Beispielsweise kann ein Derivat oder ein Fragment des Analyten (d. h. ein Analytenanalogon) verwendet werden, solang es mindestens einen Epitop mit dem Analyten gemeinsam hat. Immunoreaktive spezifische Bindungsglieder umfassen Antigene, Hapten, Antikörper und Komplexe davon, einschließlich jener, die durch rekombinante DNA Verfahren oder Peptidsynthese gebildet werden.
"Analyt", wie hierin verwendet, bezeichnet die in einer Testprobe nachzuweisende Substanz. Ein Analyt kann jegliche Substanz sein, für die ein natürlich auftretendes spezifisches Bindungsglied (z. B. ein Antikörper) existiert, oder für welche ein spezifisches Bindungsglied hergestellt werden kann, und der Analyt bindet an ein oder mehrere spezifische Bindungsglieder in einem Assay. "Analyt" schließt ebenfalls jegliche antigene Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen davon ein. Der Analyt kann ein Protein, ein Peptid, eine Aminosäure, ein Hormon, ein Steroid, ein Vitamin, ein Arzneistoff, einschließlich jener, welche zu therapeutischen Zwecken verabreicht werden, wie auch jene welche zu illegalen Zwecken verabreicht werden, ein Bakterium, ein Virus und Metaboliten davon oder Antikörper gegen jegliche der obigen Substanzen einschließen.
"Indikatorreagenz", wie hierin verwendet, bezeichnet einen nachweisbaren Marker, welcher direkt oder indirekt an ein spezifisches Bindungsglied angeheftet ist.
"Fangreagenz", wie hierin verwendet, bezeichnet ein spezifisches Bindungsglied, welches in der Lage ist, den Analyten oder das Indikatorreagenz zu binden, und welches direkt oder indirekt an ein im wesentlichen festes Material gebunden werden kann, um ein Festphasenemfangreagenzkomplex zu bilden. Der Festphasenemfangreagenzkomplex kann verwendet werden um die gebundenen und ungebundenen Verbindungen des Assays zu trennen.
"Zusätzliches spezifisches Bindungsglied", wie hierin verwendet, bezeichnet ein spezifisches Bindungsglied, welches zusätzlich zu den spezifischen Bindungsgliedern des Fangreagenz und des Indikatorreagenz verwendet wird, welches ein Bestandteil des endgültigen Bindungskomplexes werden wird. Eines oder mehrere zusätzliche spezifische Bindungsglieder können in einem Assay verwendet werden. Beispielsweise kann ein zusätzliches spezifisches Bindungsglied in einem Assay verwendet werden, wenn das Indikatorreagenz in der Lage ist, das zusätzliche spezifische Bindungsglied zu binden, welches seinerseits in der Lage ist, den Analyten zu binden.
"Latex", wie hierin verwendet, bezeichnet eine kolloidale Dispersion von Polymerpartikeln, worin Wasser überlicherweise die kontinuierliche Phase oder Medium ist. Die Partikel haben typischerweise eine Größe in dem Bereich von etwa 20 bis etwa 1000 nm.
"Kolloid", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Dispersion von Partikeln wobei diese Partikel typischerweise eine Größe in dem Bereich von etwa 10 bis etwa 1000 nm aufweisen. Kolloidales Material kann organisch oder anorganisch sein, und die kontinuierliche Phase, kann wässerig, organisch oder gasförmig sein.
"Partikel", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Kolloid oder ein Latex.
"Sterischer Stabilisator", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Polymermaterial, welches an der Oberfläche eines kolloidalen Partikels angeheftet ist und welches dazu dient, die kolloidalen Partikel an der Agglomeration zu hindern. Der sterische Stabilisator ist stets durch die kontinuierliche Phase gelöst, in der eine Oberfläche eingetaucht ist, oder in der eine kolloidale Dispersion dispergiert ist.
In einem Aspekt liefert diese Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Bindungsaktivität eines spezifischen Bindungsgliedes, welches an ein Festphasenmaterial gebunden ist, z. B. ein Partikel, welches sterisch stabilisiert wurde. Diese Erhöhung der Bindungsaktivität wird durch den Abbau eines sterischen Stabilisators an der Oberfläche des Festphasenmaterials bewirkt.
Im allgemeinen umfasst das Verfahren sowohl die Immobilisierung eines spezifischen Bindungsgliedes an der Oberfläche des Testphasenmaterials und den Abbau eines sterischen Stabilisators an der Oberfläche dieses Festphasenmaterials. In der bevorzugten Ausführungsform weist das Verfahren die Immobilisierung eines spezifischen Binungsglieds an der Oberfläche des sterisch stabilisierten Festphasenmaterials auf, mit dem folgenden Abbau des sterischen Stabilisators. Alternativ dazu, jedoch weniger bevorzugt kann der sterische Stabilisator vor der Immobilisierung des spezifischen Bindungsgliedes auf der Oberfläche des Festphasenmaterials abgebaut werden.
Die Polymerisierung von Polypyrrollatex bringt typischerweise die Verwendung eines wasserlöslichen sterischen Stabilisators mit sich. Der bevorzugte sterische Stabilisators ist Poly (Vinylalkohol). Der sterische Stabilisator erhält die kolloidale Stabilität des Polypyrrollatex während und nach der Synthese. Die Synthese von kolloidalen Partikel ist im U.S. Patent Nr. 5,252,459 beschrieben. Die kolloidale Stabilität besagt, dass die Partikel aus Polypyrrol einer Aggregation wiederstehen. Es wurde befunden, dass der sterische Stabilisator mit der Fähigkeit eines spezifischen Bindungsgliedes interferiert, welches an der Oberfläche eines kolloidalen Partikels immobilisiert ist, an komplementäre spezifische Bindungsglieder zu binden, welche an der Oberfläche einer zweiten festen Phase immobilisiert sind. Diese Erfindung stellt die gesteuerte Entfernung eines Anteils eines sterischen Stabilisators zur Verfügung, was zu einer wesentlichen Verbesserung der spezifischen Bindungsfähigkeit des spezifischen Bindungsgliedes führt, welches an der Oberfläche des kolloidalen Partikels von Polypyrrol immobilisiert ist.
Die gesteuerte Entfernung, des Anteils des sterischen Stabilisators kann mittels eines chemischen Wirkstoffs durchgeführt werden, bevorzugt eines oxidierenden Wirkstoffes oder eines biologischen Wirkstoffs vorzugsweise ein Enzym. Oxidierende Wirkstoffe, welche für die Entfernung des geeigneten Anteils des sterischen Stabilisators geeignet sind, spalten bevorzugt an einer geeigneten Abspaltstelle ab.
Abbaubare Arten von sterischen Stabilisatoren umfassen Objekte, welche Esterbindungen, Amidbindungen, Vicinaldiolbindungen, Disulfidbindungen und Kohlenhydratbindungen einschließen. Bei den bevorzugten Verfahren der Erfindung werden kolloidale Partikel von Polypyrrol, die mit Antikörper beschichtet und durch Poly(Vinylalkohol) stabilisiert sind, mit Peridsäure oder mit Bleitetraacetat behandelt. Die intressierenden funktionellen Stellen des Poly(Vinylalkohols) sind die vicinalen Diolstellen. Diese Stellen entstehen aus dem relativ seltenen Kopf-zu-Kopf-Zusatzes während der Polymerisierung des Vorläufermonomers, Vinylacetat. Die Acetatgruppen werden anschließend hydrolisiert um den Poly(Vinylalkohol) herzustellen.
Alternativ dazu können andere oxidierende Wirkstoffe verwendet werden, einschließlich aktiviertem Mangandioxid, Thallium III Salzen, Permanganat, und Dichromat. Das Bleitetraacetat wurde einen organischen Hilfslösungsstoff mit dem wässerigen Lösungsstoff erfordern. Permanganat und Dichromat können zu harsch für die Anwendung in Verbindung mit Antikörpern sein. Molekularer Sauerstoff kann einen Abbau von Polyvinylalkohol im Vorhandensein von Polypyrrollatex bewirken, und zwar offensichtlich infolge einer katalytischen Wirkung der Polypyrrol-Oberfläche. Die Erzeugung von Poly(Vinylalkohol) mit niedrigem Molekulargewicht in dieser Situation kann durch Ausschlusschromatographie bestätigt werden. Im Gegensatz dazu bewirkte eine Rücklauferhitzung einer wässerigen Lösung von Poly(Vinylalkohol) bei fehlen von Polypyrrol unter Verwendung eines Kolbens, welcher mit einer Sauerstoff-Ebulliator-Röhre ausgestattet war, keinen sichtlichen Abbau.
Die Abspaltung an den Vicinaldiolstellen führt zu einer Verminderung des Molekulargewichtes des Polyvinylalkohols und zur folgenden Freisetzung eines Anteils des Stabilisators, mit einer folgenden Erhöhung der Fähigkeit zur spezifischen Bindung. Das Ausmaß von Stabilisatorabspaltung wird durch die Bedingungen der Konzentration des Oxidierungsmittels, der Temperatur, der Zeit und des pH-Werts gesteuert. In der Ausführungsform, worin Polypyrrol, welches durch Poly(Vinylalkohol) stabilisiert ist, die feste Phase ist, wird es bevorzugt, dass die Konzentration von Oxidierungsmittel, d. h. Periodat, von etwa 5 mM bis etwa 100 mM reicht. Es wird bevorzugt, dass die Temperatur in dem Bereich von etwa 4ºC bis etwa 37ºC liegt. Es ist bevorzugt, dass die Dauer der Oxidation von etwa 15 Minuten bis etwa 24 Stunden reicht. Es wird bevorzugt, dass die Oxidation unter saurer Bedingungen stattfindet, stärker bevorzugt bei einem pH in dem Bereich von 5 bis etwa 7. Die oxidative Behandlung des Latex kann durchgeführt werden entweder vor oder nach der Beschichtung mit dem spezifischen Bindungsglied. Das spezifische Bindungsglied kann auf die kolloidalen Partikel adsorbiert werden oder kovalent an sie gebunden sein.
Das Molekulargewicht des sterischen Stabilisators ist für die Erfindung nicht wesentlich. Selbstverständlich muss der sterische Stabilisator mindestens eine Abspaltstelle enthalten. Andere Stabilisatoren, welche fähig sind, abgebaut zu werden, können verwendet werden. Ein Beispiel für einen alternativen Stabilisator sind Kohlenhydratpolymere, welche mit geeigneten glycohydrolytischen Enzymen abgebaut werden können. Das Verfahren dieser Erfindung kann auf alle Kolloide, welche eine verknüpfte Polymerschicht besitzen, mit geeigneten Modifikationen des Verfahrens angewendet werden. Solche Kolloide umfassen Metallsole, kolloidale Metalloxide, Keramik, nicht metallische Sole, z. B. Selen, Schwefel, Kohlenstoff, Silikon. Zusammengesetzte Kolloide können ebenfalls verwendet werden. Beispiele von zusammengesetzten Kolloiden sind Partikel, welche sowohl Polypyrrol und Selen in einer einzigen Gesamtheit umfassen, und ein Kolloid, welches sowohl Polypyrrol und Kieselgur in einer einzigen Einheit umfasst.
Kolloide, welche in der Anwendung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können durch die Polymerisierung eines nicht chromophorischen Monomers hergestellt werden; nicht chromophorisches Monomer, wie hierin verwendet, bezeichnet ein organisches Monomer, welches weder ein Pigment nach ein Farbstoff ist, und welches eine Farbe oder Absorptionscharakteristika besitzt, welche die unpolymerisierte Substanz zur Verwendung als einen nachweisbaren Marker ungeeignet machen. Ein Verfahren zu Herstellung dieser Kolloide ist im U.S. Patent Nr. 5,252,459 beschrieben. Andere Polymer-Latexpartikel, die geeignet sind für die Anwendung in dieser Erfindung, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die Partikel, jene, die in den Klassen im U.S. Patent Nr. 5,252,459, in Spalte 10, Zeile 24 bis Spalte 11 Zeile 25 beschrieben werden.
Die vorliegende Erfindung liefert ein steuerbares Verfahren zur Herstellung von Immunoreagenzien, welche kolloidale Partikel umfassen, welche eine minimale Variation von Charge zu Charge zeigen. Die Lagerung von nicht beschichteten kolloidalen Partikeln bei einer niederen Temperatur (z. B. 4 bis 8ºC) unter einer inerten Atmosphäre (z. B. Stickstoff), von Licht geschützt, behält die Eigenschaften der Oberfläche der kolloidalen Partikel in einer solchen Art und Weise, dass diese vergleichbar mit kürzlich synthetisierten, "nicht gealterten" kolloidalen Partikeln sind. Kolloidale Partikel, welche unter diesen Bedingungen gelagert sind, und welche anschließend durch den hierin beschriebenen Abbauschritt behandelt werden, liefern nun Reagenzien, welche geringe Abweichungen von Charge zu Charge zeigen. Die Leistung ist unabhängig von der spezifischen Charge von kolloidalen Partikeln oder der Lagerungsdauer vor der Beschichtung des spezifischen Bindungsgliedes. Ältere Verfahren zur Herstellung von kolloidalen Partikeln aus Polypyrrol, welche mit spezifischen Bindungsgliedern beschichtet sind, haben oft zu aggregierten Zubereitungen geführt, welche eine Ultrasonikation oder andere mechanische Mittel der Dispersion erfordern. Immunoreagenzien, welche gemäß dem Verfahren dieser Erfindung hergestellt werden können, behalten ihre kolloidale Stabilität und erfordern wenig oder keine Redispersion.
Die folgenden Beispiele sind veranschaulichend für die Erfindung und sollen nicht als einschränkend für den Schutzumfang der Erfindung verstanden werden, der in den Ansprüchen definiert.

Beispiel 1

Behandlung von Poly(Vinylalkohol) Lösungen mit Periodat und folgende Analyse des Molekulargewichtes durch Hochleistungs- Ausschlusschromatographie (HPSEC)

Dieses Beispiel zeigt den Abbau von Poly(Vinylalkohol) in Lösung durch Periodatoxidation.
Die Analyse der Molekulargewichtsdurchschnitte (Gewichtsdurchschnitt, MW; und Zahlendurchschnitt, MN) wurde durchgeführt wie beschrieben in W. W. Yau, J. J. Kirkland, und D. D. Bly, Modern Size-Exclusion Liquid Chromatographie, John Wiley & Sons (1979). Die Molekulargewichtsanalyse des nicht abgedorten Poly(Vinylalkohol) mit hohem Molekulargewicht erforderte eine etwas andere experimentelle Anordnung als die Analyse der Fragmente.

Analyse von nicht abgebauten Poly(Vinylalkohol)

Der Poly(Vinylalkohol), der als sterischer Stabilisator bei der Herstellung von kolloidalen Polypyrrolpartikeln verwendet wurde, wurde unter der. Handelsbezeichnung "ELVANOL HV" (E. I. Du Pont de Nemours). verkauft. Die Händlerbezeichnung für dieses Polymer zeigte eine 99,0 bis 99,8%ige Hydrolyse (Molarprozenthydrolyse der Acetatgruppen) an. Der Poly(Vinylalkohol) wurde hinsichtlich der Molekulargewichtsverteilung mittels HPSEC untersucht. Drei HPSEC Säulen wurden hintereinander verwendet: GMPW (Tosohaas), G3000PW (Tosohaas), und SEC-52000 (Phenomenes). Wasser wurde als mobile Phase bei einer Flußrate von 1,0 ml/Min verwendet und die Detektion wurde durchgeführt durch verdampfende Lichtbrechung (ELSD MKIII, Alltech Associates). Eine Molekulargewichtskalibrierungskurve wurde erstellt unter Verwendung von Poly(Ethylenoxid) Standards (Phenomenex) bei Konzentrationen von 0,05 und 0,5% (w/v = Gewicht pro Volumen) in einem Bereich von 10.000 bis 1.390.000 g/Mol. Die Probe Poly(Vinylalkohol) wurden in Wasser mit einer Konzentration von 0,08% (w/v) aufgelöst und 0,1 ml wurden zur Analyse eingeleitet. Die berechneten Durchschnittswerte für "ELVANOL HV" waren MW = 135.600 g/Mol und MN = 71.4000 g/Mol. MW bezeichnet Gewichtsdurchschnitt-Molekulargewicht. MN bezeichnet gezieltes durchschnittliches Molekulargewicht (number average molecular weight).

Analyse der Abbruchfragmente

Für die Periodatbehandlung von Poly(Vinylalkohol) wurden wässerige Lösungen mit Konzentrationen im Bereich von 0,035 bis 1,0% vorbereitet (w/vl). Periodatsäure (0,5 M) wurde in Wasser vorbereitet und der pH-Wert wurde auf 6,5 mit Triethanolamin eingestellt. Ein Aliquot der Periodatlösung (1,1 ml) wurde zu Poly(Vinylalkohol) (10 ml) zugesetzt, was eine endgültige Konzentration von 50 mM Periodat ergab, und der Reaktion wurde gestattet 15 Stunden lang bei einer Temperatur von 8ºC, vor Licht geschützt, fortzuschreiten. Die Reaktionsprodukte wurden durch HPSEC analysiert. Drei SEC-52000 Säulen (Phenomenex) wurden hintereinander verwendet, mit einer mobilen Phase von 0,1 M Natriumnitrat bei einer Flußgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min, und die Detektion wurde durch differentiellen refraktiven Index durchgeführt. Eine Kalibierungskurve wurde unter Verwendung von Poly(Vinylalkohol), Dextranen und kleinen Kohlenhydraten für einen molekularen Gewichtsbereich von 200 bis 10.500 g/Mol erstellt. Probeninjektionen von je 0,05 ml wurden für die Analyse erstellt. Unter diesen Bedingungen wurden Moleküle, deren Molekulargewicht 26.000 g/Mol überschritt, ausgeschlossen. Die berechneten Mittelwerte für das oxidierte Produkt waren MW = 5.800 g/Mol und MN = 5.100 g/Mol. Unter diesen Bedingungen gab es keinen Hinweis auf Polymer mit MW größer 12.000 g/Mol.

Beispiel 2

Behandlung von Polyvinyl Alkohol-stabilisierten Latex mit Periodat und folgende Analyse der Latexoberfläche durch röntgenstrahlangeregte Photoelektronenspektroskopie (XPS) und Lösungsfragmente durch HPSEC

Dieses Beispiel zeigt den Abbau des sterischen Stabilisators Poly(Vinylalkohol) an Polypyrrollatex durch die Periodatoxidation.
Suspensionen von Polypyrrol (1% w/v) wurden mit der Periodattriethanolaminlösung behandelt, wie in Beispiel 1 beschrieben (Analyse von Abbaufragmenten). Die endgültige Konzentration des Periodats wurde variiert zwischen 0 mM bis 50 mM, um seine Wirkung auf das freigesetzte Material festzustellen. Nach der 15 stündigen Oxidationszeit wurde die Suspension bei 40.000 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und weitere 2 Stunden bei 40.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der endgültige Überstand wurde durch eine Zelluloseacetatmembran (0,2 mm Porengröße) gefiltert und durch HPSEC wie zuvor beschrieben analysiert. Die Schätzung der Fragmentmasse wurde erstellt durch Vergleich der Spitzenintensitäten mit einer Standardkurve, die aus einer Verdünnungsreihe für Periodat-behandeltes Poly(Vinylalkohol) hergestellt wurde. Die entstehende Massenschätzung wurde beurteilt als Massenanteil, basierend auf der ursprünglichen Masse von Polypyrrollatex. Es gab keinen Hinweis in irgendeinen der Proben für Fragmente mit einem MW das 12.000 g/Mol überschitt. HPSEC Analyse für lösliches Polymer aus Periodat-behandelten Polypyrrol
Das Latex das aus jeder der obigen Herstellungen gesammelt wurden, wurde weiter gereinigt durch drei wiederholte Zyklen von Resuspension in deionisiertem Wasser, gefolgt durch Zentrifugation und einer endgültigen Resuspension in 10 ml deionisiertem Wasser. Die Latexzubereitungen wurden analysiert hinsichtlich der elementaren Zusammensetzung der Oberfläche durch röntgenstrahlangeregte Photoelektronenspektroskopie (XPS) hinsichtlich von Sauerstoff (O), Stickstoff (N), und Kohlenstoff (C). Die elementare Zusammensetzung und das Atomprozentverhältnis von Sauerstoff zu Stickstoff (O/N) wurde verwendet, um den Verlust an sterischen Stabilisator zu überwachen. XPS Oberflächen-elementare Analyse von Periodat-behandeltem Polylpyrrol
Die HPSEC und XPS Analysen sind komplementär. Die Analysen liefern quantitative Daten für die löslichen bzw. unslöslichen Reaktionsprodukte. Ein Vergleich des Verhältnisses von O/N (XPS) an der Oberfläche der kolloidalen Partikel als eine Funktion der berechneten Prozente der Verlustmasse (HPSEC) ist in der Fig. 1 gezeigt. Der prozentuale Massenverlust ist gleich dem Massenanteil mal 100%. Der lineare Regressionskorrelationskoeffizient für den Vergleich (R²) ist 0,997.

Beispiel 3

Periodatoxidation von Poly(Vinylalkohol)-stabilisiertem Polypyrrollatex beschichtet mit Anit-Estradion-1-glucuronid (E1G) Antikörper

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines kolloidalen Konjugats, welches Polypyrrol und anti-E1G Antikörper umfasst, und den folgenden Abbau des Poly(Vinylalkohol) sterischen Stabilisator durch Periodatoxidation.
Sämtliche Reagenzien die in der Herstellung verwendet werden, werden zu einer Temperatur von 45ºC in einem zirkulierenden Wasserbad vor dem Beschichtungsprozess gebracht. Boratpuffer (0,25 ml, 100 mM Natriumborat, pH-Wert 10) wurde in eine Phiole eingebracht, gefolgt durch den Zusatz von 1,0% (w/v) "BRIJ 35" Polyoxyethylenether (0,50 ml in deionisiertem Wasser), deionisiertes Wasser (1,51 ml) und Polypyrrol (2,50 ml) 2,0% Feststoffe in delonisiertem Wasser). Monoklonaler Mausantikörper (etwa 0,25 ml, 11,4 mg/ml), der Estradion-1-glucuronid (E1G) spezifisch war, wurde zu der Polypyrrollatexsuspension unter Rühren zugesetzt. Die Mischung wurde bei einer Temperatur von 45ºC für 2 Stunden inkubiert. Dann wurde eine Überzugslösung zugesetzt (1,70 ml, 0,25 M BIS-TRIS, 4,0% (w/v) Rinderserumalbumin, 0,1% (w/v) "BRIJ 35" Polyoxyethylenether, pH-Wert 7,0). Die Mischung wurde unter Rühren bei einer Temperatur von 45ºC für weitere 10 Minuten inkubiert. Die beschichtete Latexsuspension wurde dann bei einer Temperatur von 4-8ºC für eine Stunde gehalten. Während die Suspension kontinuierlich gerührt wurde, wurde die Periodatlösung (0,75 ml, 0,3 M Periodsäure, die auf einen pH-Wert von 6-7 mit Triethanolamin neutralisiert wurde) zu der Suspension zugesetzt. Die Suspension wurde, geschützt von Umgebungslicht für 15-18 Stunden bei einer Temperatur von 4 bis 8ºC gemischt. Nach der Oxidation wurde das beschichtete Latex durch tangentielle Filtration mit Hohlfiber gereinigt unter Verwendung eines geeigneten Austauschpuffers (25 mM MOPS, 0,5% Rinderserumalbumin, 0,1% "BRIJ 35" Polyoxyethylenether, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,2 mit Ethanolamin). Die Lösung wurde bei einer Temperatur von 4 bis 8ºC gelagert, bis zu ihrer Verwendung.

Beispiel 4

Qantitative Immunoassaystandardkurve für E1G zum Vergleich unbehandelter und Periodat-behandelter Immunoreagenzien

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung eines Polypyrrolkolloidalkonjugates bei einem Immunoassay.
Ein kompetitives Assayformat wurde verwendet, um einen Immunoassay zum Nachweis des Vorhandenseins und der Menge von E1G zu entwickeln.
Der chromatographische Streifen, der in dem Assay verwendet wurde, war im wesentlichen gleich zu jenem chromatographischem Streifen, der in dem U.S. Patent Nr. 5,252,459 in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist. An einem Ende eines chromatographischen Streifens wurden 0,01% Latex (w/v) (0,025 ml) die wie in Beispiel 3 beschrieben behandelt wurden, abgelegt.
In der Mitte entlang des Streifens wurde eine Fangzone untergebracht, welche aus einem Konjugat aus Rinder IgG und E1G bestand. Die Fangzone wurde als ein horizontaler Balken abgelegt, welche die Ausmaße 0,5 mm mal 4,0 mm aufwies. Das Latex, das an dem Ende des Streifens abgelegt war, wurde vermischt mit einer flüssigen, zu testenden Probe, und die entstehende Mischung wurde durch Absorption und Kapillarwirkung den Streifen entlang gezogen. Bei diesem Assayformat bindet, falls E1G in der Probe vorhanden ist, dieses an den Antikörper auf dem Polypyrrollatex und vermindert die Menge von Latex, welche an das Konjugat bindet, das in der Fangzone immobilisiert ist. Dies führt zu einer leicht gefärbten Fangregion. Die Konzentration von E1G in der Probe ist invers proportional zu der Menge von Latex, die an das Konjugat gebunden ist, das in der Fangzone immobilisiert ist. Eine instrumentelle Vorrichtung, welche die Menge von gebundenen Latex quantifiziert, wie zum Beispiel ein DC-Scanner, kann verwendet werden, um die Konzentration von E1G in der Probe festzustellen. Fig. 2 zeigt die Daten aus zwei Standardkurven; die unter Verwendung einer Verdünnungsserie von E1G erzeugt wurden. Eine Kurve, Kurve A wurde erzeugt unter Verwendung von nicht oxidierten Polypyrrollateximmunoreagenz, und die andere Kurve, Kurve B wurde unter Verwendung von Polypyrrollatex erzeugt, das durch das Verfahren dieser Erfindung behandelt wurde. Das Signal in diesem Beispiel wurde erzeugt durch eine DC-Scanner-Messung und wird dargestellt als die Nettodifferenz des gemessenen Hintergrund-Reflexionsgrads und des Fangzonen-Reflexionsgrads (Rnet). Je größer der Wert von Rnet, desto größer ist die Menge von eingefangenem Latex. Die Daten für den Vergleich sind ebenfalls in der Tabelle unterhalb dargestellt. Wirkung von Periodatoxidation von spezifischer Aktivität von Polypyrrolimmunoreagenzien gegen E1G
Die Daten zeigen die Verstärkung der Assayergebnisse durch die Periodatoxidation des sterischen Stabilisators.

Beispiel 5

Dieses Beispiel ist ein vorhersagendes Beispiel, das die Verwendung eines sterischen Stabilisators darstellt, der nicht Poly(Vinylalkohol) ist.
Ein Protein (2,0 g, "SUPRO-TEIN V" (ein Kalium/Triethanolaminsalz von Kollagenprotein kondensiert mit Kokosnussfettsäure und teilweise komplexiert mit Sorbitol) wird zu destilliertem Wasser (100 ml) hinzugesetzt. Dann wird Eisenchloridhexahydrat (18,6 g) in destilliertem Wasser (100 ml) aufgelöst, gefiltert und mit der Lösung kombiniert, die "SUPRO-TEIN V" Protein enthält. Unter Rühren wird destilliertes Pyrrol (2,0 ml) im Ganzen zugesetzt und es bildet sich Partikel von Polyprrol. Der Reaktion wird für weitere Stunden gestattet fortzulaufen. Die Polypyrrollösung wird durch Kreuzflußfiltration gereinigt (manchmal als eine Diafiltration bezeichnet) bis die Leitfähigkeit des Abstoms geringer ist als 500 mal von destilliertem Wasser. Die Suspension wird dann ausgetauscht in 0,01 M CaCl&sub2; (0,05 M MOPS Puffer, pH-Wert 7, 8). Die CaCl&sub2; Lösung kann 1% Brij 35, ein Nieder-molekulares Tensid, enthalten, um die kolloidale Stabilität zu unterstützen. Dann wird Pronase (200-100 Mikrogramm) in CaCl&sub2; Lösung (5 ml) aufgelöst, und die entstehende Lösung wird zu der Polypyrrolsuspension zugesetzt, um das Protein zu verdauen.
Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 37ºC für 120 Stunden durchgeführt. Dann wird die Reaktion erneut durch Kreuzflußfiltration gereinigt. Die Suspension kann in Formulierung von Immunoreagenzien durch Beschichten der Partikel mit Antikörpern oder anderen spezifischen Bindungsgliedern verwendet werden.

Beispiel 6

Dieses Beispiel ist ein vorhersagendes Beispiel, welches die Verwendung eines sterischen Stabilisators, der nicht Poly (Vinylalkohol) ist, verdeutlicht.
Dextran 75 (2,0 g, durchschnittliches Molekulargewicht: 75.000) wird destilliertem Wasser (100 ml) zugesetzt. Dann wird Eisenchloridhexanhydrat (17,6 g) in destilliertem Wasser (100 ml) aufgelöst, gefiltert und mit der Dextranlösung kombiniert. Unter Rühren wird destilliertes Pyrrol (2,0 ml) im Ganzen zugesetzt und Polypyrrolpartikel bilden sich. Die Reaktion wird vier Stunden lang fortgesetzt. Die Polypyrrolsuspension wird durch Diafiltration gereinigt, bis die Leitfähigkeit des Abstroms geringer ist als 500 von jenen destilliertes Wasser. Die Suspension wird ausgetauscht in 0,1 M Kaliumphosphat (pH-Wert 6,0) und mit dem gewählten Antikörper beschichtet zur Herstellung des Immunoreagenz. Dann wird Dextranase (500 Mikrogramm) mit einer Aktivität von 200 Units, worin eine Unit definiert ist als 1,0 Mikromol von Isomaltose pro Minute produzierend, in Phosphatpuffer (5 ml, pH-Wert 6,0) aufgelöst. Die Dextranaselösung wird zu der Suspension zugesetzt. Die Suspension wird bei einer Temperatur von 37ºC für 30 Minuten erhalten wonach das Dextran abgebaut wird. Die Immunoreagenzsuspension kann weiter durch Zentrifugation und Waschen mit Phosphatpuffer gereinigt werden.

Beispiel 7

Dieses Beispiel vergleicht quantitative Immunoassaystandardkurven für E1G für Polypyrrol, das mit und ohne vorhandenen Sauerstoff gealtert wurde.
Polypyrrol wurde synthetisiert und die Reaktionsnebenprodukte wurden durch Diafiltration hintereinander entfernt. Das frisch vorbereitete Polypyrrol, welches in destilliertem Wasser suspendiert war (< 300 umho Leitfähigkeit) wurden in glasdichten Glasflaschen gelagert, welche "crimp-top"-Gummi "septa"-Siegel hatten. Stickstoff wurde durch das Polypyrrol hindurchgeleitet unter Verwendung von hypothermischen Einleitungs- und Ausleitungsnadeln, um den aufgelösten und atmosphärischen Sauerstoff, der vorhanden war, zu entfernen. Drei gasdichte Flaschen, die mit Polypyrrol gefüllt waren, wurden mittels ähnlichen Verfahren mit reinem Sauerstoff geflutet, so das die überständigen Sauerstoffmoleküle, welche in den Falschen blieben, sich auf insgesamt 1,5 Äquvalente im Bezug auf die vorhandenen Pyrrolwiederholungseinheiten addierten. Die endgültigen Konzentrationen waren wie folgt: 10,5 ml von 2,0% (w/v) Polypyrrol und 118 ml Sauerstoffüberschuss bei 1 Atmosphäre Druck. Das Polypyrrol unter Stickstoff wurde bei einer Temperatur von 37ºC für 25 Tagen ohne Mischen erhalten. Das Polypyrrol unter Sauerstoff wurde bei einer Temperatur von 37ºC für 7 Tage unter den folgenden Bedingungen erhalten: kein Mischen, Rühren durch Rotationstisch, und Mischung mit magnetischem Rühranker. Die Mischung bewirkte eine erhöhte Aussetzung gegenüber dem überständigem Sauerstoff während der thermischen Behandlung. Sämtliches Polypyrrolherstellungen wurden sofort nach der Behandlung beurteilt. Die Polypyrrolsuspensionen wurden beschichtet mit anti-E1G Antikörpern wie in Beispiel 3 beschrieben; die beschichteten Suspensionen wurden jedoch nicht mit, dem Periodat behandelt. Die Immunoassaykurven für die Polypyrrolreagenzien wurden erzielt wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Immunoassaystandardkurven sind in der Fig. 3 gezeigt. Die größere Netto-Reflexion (Rnet), die mit Sauerstoffalterung erzielt wurden, zeigt an, dass mehr Latex eingefangen war. Die Daten für diesen Vergleich sind ebenfalls in der Tabelle unterhalb gezeigt. Wirkung von Sauerstoffbehandlung auf die spezifische Aktivität von Polypyrrolimmunoreagenzien für E1G
In der Fig. 3 stellt Kurve A die Durchläufe dar, in denen Polypyrrol unter Stickstoff ohne Rühren war; Kurve B stellt jene Durchläufe dar, worin Polypyrrol unter Sauerstoff ohne Rühren war; Kurve C stellt die Durchläufe dar, worin Polypyrrol unter Sauerstoff und Bewegung durch einen Rotationstisch war; Kurve D stellt jene Durchläufe dar, worin Polypyrrol unter Sauerstoff war und das Mischen durchgeführt wurde durch das Mittel des Rührankers.

Beispiel 8

Reaktion von Poly(Vinylalkohol) Lösung mit Sauerstoff im Vorhandensein von und bei Fehlen von Polypyrrollatex und folgende Analyse durch HPSEC

Dieses Beispiel zeigt den Abbau von Poly(Vinylalkohol) durch Sauerstoff im Vorhandensein von Polypyrrollatex.
Gereinigtes Polypyrrollatex (25 ml, 2% Feststoffe) wurde in einem rundbödigen Kolben eingesetzt. Dann wurde Poly(Vinylalkohol) ("ELVANOL HV", 25 ml, 2% Feststoffe) in destilliertem Wasser zu dem Kolben zugesetzt. Der Kolben, welcher mit einem Kaltwasserkondensator ausgestattet war, wurde auf 70ºC in einem Glycerolbad erhitzt. Reiner Sauerstoff wurde durch die Lösung hindurchgeleitet durch das Mittel eines Sparging-Stone. Proben (1 ml) wurden bei Intervallen entfernt und verdünnt mit destilliertem Wasser (4 ml) und bei 10.000 Umdrehungen für 1 Stunde mit einem "SS-34 SORVAL" Rotor (E. T. Du Pont de Nemours) zentrifugiert, um das Latex zu entfernen. Der reine Überstand wurde für die Analyse des HPSEC entfernt.
Die Kontollreaktionen wurden durchgeführt bei fehlendem Polypyrrol. Poly(Vinylalkohol) ("ELVANOL HV", 1 g) wurde in destilliertem Wasser (100 ml) aufgelöst, unter Erhitzung in einem rundbödigem Kolben. Der Kolben, welcher mit einem Kaltwasserkondensator ausgestattet war, wurde auf 70ºC in einem Glycerolbad erhitzt. Reiner Sauerstoff wurde durch diese Suspension geleitet durch das Filtern eines Sparging-Stone. Proben (2 ml) wurden an Intervallen für die Analyse durch HPSEC entfernt. Der pH-Wert der Reaktionslösung war 5,8.
Die Kontrollreaktion die zuvor beschrieben ist, wurde wiederholt mit dem Zusatz von 0,5 ml Phosphorsäure. Der pH-Wert dieser Reaktionsmischung war 1,6, was vergleichbar zum pH-Wert der gereinigten, ungepufferten Polypyrrollatexsuspension vergleichbar ist.

Analyse der Poly(Vinylalkohol) Produkte

Die Poly(Vinylalkohol) Produkte wurden analysiert durch HPSEC in der Art und Weise, die in Beispiel 1 beschrieben ist. Die HPSEC Bedingungen wurden so entworfen, um Veränderungen des Molekulargewichts unterhalb 12.000 g/Mol nachzuweisen. Proben aus den Kontrollreaktionen bei pH-Werten von 5,8 und 1,6 wurden in Intervallen über acht Stunden der Sauerstoffdurchleitung bei 70ºC erzielt. Keine der Kontrollproben zeigt die Hinweise auf Fragmentierung innerhalb des Bereiches der HPSEC. Die Überstände der Polypyrrolreaktionssuspension, die Poly(Vinylalkohol) enthielt, wurde durch HPSEC analysiert, um mittlere Molekulargewichte zu berechnen. HPSEC Analyse von löslichen Polymeren aus Polypyrrol behandelt mit Sauerstoffgas
Bei sämtlichen Kontrollreaktionen war sowohl MW und MN größer als 12.000 g/Mol, unabhängig von der Behandlungszeit.
Diese Erfindung kann verwendet werden, um die Bindungsaktivität von Festphasenimmunoreagenzien zu verbessern, welche adsorbierte oder kovalent gebundene Schichten von löslichen Polymer enthalten. Das Polymer muss funktionelle Gruppen haben, welche den Abbau des Polymer-Rückgrates gestatten. Die Behandlung der Oberflächen in der hierin beschriebenen Art und Weise kann eine reduzierte sterische Interferenz des immobilisierten spezifischen Bindungsgliedes gestatten, insbesondere wenn es erforderlich ist, dass das immobilisierte spezifische Bindungsglied mit einem zweiten immobilisierten Bindungsglied zusammenwirkt. Ein weiterer Vorteil, der durch diese Erfindung bereitgestellt wird, ist die Verminderung der Assoziation des spezifischen Bindungsgliedes mit einer gelösten Polymerschicht, welche Bereiche enthalten kann, welche eine geringe Affinität für das spezifische Bindungsglied zeigen. Spezifische Bindungsglieder, welche mit der Polymerschicht in dieser Art und Weise assoziiert sind, sind möglicherweise empfindlich gegenüber einer Ablösung von der festen Phase, wenn Möglichkeiten für stärkere Zusammenwirkungen bereitgestellt werden, wie zum Beispiel eine Bindung an einen immobilisierten Liganden, für welchen das spezifische Bindungsglied eine Spezifität aufweist.

Claims

1. Ein Verfahren zum Erhöhen der Bindungsaktivität eines spezifischen Bindeglieds, welches auf der Oberfläche eines sterisch stabilisierten Festphasenmaterials immobilisiert ist, das folgende Schritte umfaßt:

(a) lmnmobilisieren eines spezifischen Bindeglieds auf der Oberfläche des Festphasenmaterials, und

(b) Degradieren des sterischen Stabilisators.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Schritt Immobilisieren des spezifischen Bindeglieds auf der Oberfläche des Festphasenmaterials vor dem Schritt Degradieren des sterischen Stabilisators erfolgt.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Schritt Immobilisieren des spezifischen Bindeglieds auf der Oberfläche des Festphasenmaterials nach dem Schritt Degradieren des sterischen Stabilisators erfolgt.

4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der sterische Stabilisator durch ein chemisches Mittel degradiert wird.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, worin das chemische Mittel ein Oxidationsmittel ist.

6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der sterische Stabilisator ein Gebilde ist, das eine hydrolysierbare Bindung enthält.

7. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der sterische Stabilisator ein Gebilde ist, das eine Bindung enthält, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Esterbindungen, Amidbindungen, vicinalen Diolbindungen, Disulfidbindungen und Kohlenhydratbindungen.

8. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der sterische Stabilisator durch ein biologisches Mittel degradiert wird.

9. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Festphasenmaterial ein Partikel ist.

10. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Festphasenmaterial ein Polymer ist.

11. Das Verfahren gemäß Anspruch 10, worin das Polymer Polypyrrol ist.