DE69714269T2

DE69714269T2 - Patrone und system zum speichern und verteilen von reagenzien

Info

Publication number: DE69714269T2
Application number: DE69714269T
Authority: DE
Inventors: Mats Malmqvist
Original assignee: ALPHAHELIX UPPSALA AB
Current assignee: ALPHAHELIX UPPSALA AB
Priority date: 1996-09-16
Filing date: 1997-09-16
Publication date: 2003-03-27
Anticipated expiration: 2017-09-17
Also published as: CA2265770A1; DE69714269D1; DK0925113T3; EP0925113B1; US6432694B1; AU725668B2; CA2265770C; PL332047A1; ES2181028T3; WO1998010866A1; PL185992B1; CN1095693C; JP2001508644A; EP0925113A1; AU4406897A; JP4050794B2; CN1230904A; ATE220951T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Aufbewahren und Verteilen chemischer Reagenzien. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Aufbewahren und Verteilen biochemischer Reagenzien, die in kleinen Volumina verwendet werden und daher empfindlich für Verunreinigung, Oxidation und Reaktionen zwischen den Reagenzien untereinander sind.

Hintergrund der Erfindung

Immunologische Verfahren wie RIA, EIA und ELISA haben während der letzten Jahrzehnte eine weit verbreitete Anwendung in der medizinischen Diagnostik gefunden. (RIA, EIA und ELISA sind Abkürzungen für Radio-Immunoassay, Enzym-Linked-Immunoassay bzw. Enzym-Linked-Immunosorbentassay). Diese Verfahren entwickelten sich schnell zu Standardverfahren. Um die Forderung nach effizienter Handhabung sowohl mit manuellen als auch mit automatisierten Pipetten, wie auch in Nachweisgeräten, zu erfüllen, wurden genormte Reaktionsgefäße entwickelt, mit denen gleichzeitig mehrere Proben gehandhabt werden können. Diese Gefäße werden im Rest dieser Schrift als Multi-Proben-Platten bezeichnet.
Eine Mikrotiterplatte besteht im allgemeinen aus einer rechteckigen Platte, die aus spritzgegossenem Polystyrol-Kunststoff hergestellt ist. Die Platte enthält eine Anzahl von Vertiefungen, die in einem Gitter angeordnet sind. Diese Vertiefungen sind als Mulden bekannt und wirken als Reaktionsgefäße für einzelne chemische Reaktionen. Die drei wichtigsten Normen von Mikrotiterplatten sind ihre äußeren Abmessungen, die es ihnen erlauben, in Standardgeräte zu passen, ihr sogenannter Gitter-Abstand, der der Abstand zwischen der Mitte einer Mulde und der Mitte der benachbarten Mulde in derselben Reihe oder Spalte des Gitters ist, und die Position der Mulden in Beziehung zueinander und zu den äußeren Rändern der Platte. Das am häufigsten verwendete Mikrotiterplatten- Format ist näherungsweise 128 · 85 · 14 Millimeter mit 96 Mulden, die in einem Gitter von acht Reihen und 12 Spalten angeordnet sind. Der Gitter-Abstand zwischen den Mulden beträgt etwa neun Millimeter. Man findet jedoch in dem oben genannten Format mehrere andere Einteilungen. Platten mit 192, 384 oder sogar mehr Mulden sind ebenfalls üblicherweise anzutreffen. Mikrotiterplatten, die die Hälfte des oben angegebenen Formats besitzen, sind ebenfalls in Gebrauch. Die jüngste Hinzufügung zu dieser Vielfalt von Multi-Proben- Platten sind die Multi-Proben-Platten, die in der sogenannten Vielfachanordnungs-Technologie (multiple array technology), bei der extrem kleine Volumina auf eine Oberfläche, zum Beispiel eine absorbierende Oberfläche, aufgespritzt werden, verwendet werden. Beispiele für diese Technologie sind die Multi-Proben-Platten oder -Flachmaterialien, die bei Versuchen und Verfahren, die die Hybridisierung an Hochdichte-Oligonucleotid-Anordnungen benutzen, zum Beispiel beim Nachweis genetischer Mutationen, Genom-Screening oder Sequenzierungsvorgängen, verwendet werden. Multi-Proben-Platten, die bei der Vielfachanordnungs-Technologie verwendet werden, werden auch als Nanotiter-Platten oder Nanomulden-Platten bezeichnet. Auch Silicium-Chips oder -Wafer mit Bereichen zur Aufnahme von Reagenzien und Proben sollten in die Definition "Multi-Proben-Platten" eingeschlossen werden.
Mikrotiterplatten mit Mulden, die in einer Gitterform angeordnet sind, sind die am häufigsten verwendete Form von Multi-Proben-Platten. Man findet jedoch bei Multi-Proben-Platten auch andere Anordnungen von Vertiefungen, wie runde Formen.
Bei der routinemäßigen Arbeit mit Mikrotiterplatten, insbesondere in Bereichen klinischer Anwendung, zielt der Anwender darauf ab, durch Einführung verschiedener Grade automatisierter Systeme für die verschiedenen Schritte die Handhabungsgeschwindigkeit, das heißt die Durchsatzgeschwindigkeit der Proben, zu erhöhen. Ein solcher Schritt ist die Handhabung der Reagenzien.
Die Reagenzien können mit manuell betätigten Pipetten wie jenen, die als Kolbenpipetten bekannt sind, gehandhabt werden. Für die Arbeit mit Mikrotiterplatten wurden Vielkanal-Pipetten entwickelt. Diese erlauben ein manuelles Pipettieren in vollständige Reihen oder Spalten von Mulden bei einer einzigen Handlung. Mit dem Ziel, diese Pipettierungsarbeit weiter zu automatisieren, wurde auch eine Reihe elektronischer Geräte unterschiedlicher Komplexität entwickelt. Beispiele sind Kolbenpipetten mit elektronisch angetriebenen Stufenmotoren und Vielkanal-Pipetten und Verteiler mit verschiedenen Arten von Pumpen.
Ein hoher Automatisierungsgrad kann erreicht werden durch Integrieren von Elementen, die das Reaktionsgefäß bezüglich des Verteilungs-Mündungsstücks positionieren, und von Elementen für die computerisierte Steuerung dieser Positionierung bezüglich des Pipettierungsverfahrens. Ein Gerät mit einem solch hohen Automatisierungsgrad wird üblicherweise als Pipettierungs- Roboter bezeichnet. Mit anderen Worten, ein Pipettierungs-Roboter weist drei Hauptfunktionselemente auf. Erstens, ein Verteiler-Element, das eine oder mehrere einzelne Präzisionspumpen aufweist. Die Funktion dieser Art von Präzisionspumpe ist, zu einer bestimmten Zeit ein bestimmtes Flüssigkeitsvolumen durch das Mündungsstück zu verteilen. Zweitens weist ein Pipettierungs-Roboter ein Positionierungs-Element auf, das die Position des Verteilungs- Mündungsstücks zum genauen Augenblick der Verteilung bezüglich des Reaktionsgefäßes ausrichtet. Drittens, ein elektronisches Steuerelement.
Die Schwierigkeit bei der Konstruktion eines Pipettierungs-Roboters der in dem vorherigen Absatz beschriebenen Art ist, einen ausreichend hohen Präzisionsgrad im Hinblick auf eine Anzahl von Schlüsselfunktionen zu erzielen. Eine Schlüsselfunktion eines Pipettierungs-Roboters ist die Genauigkeit der Durchschnittsmenge an verteilter Flüssigkeit und die Standardabweichung zwischen verschiedenen Pipettierungs-Handlungen. Im allgemeinen ist der Genauigkeitsgrad beim Pipettieren kleiner Volumina geringer als beim Pipettieren großer Volumina. Eine weitere Schlüsselfunktion ist natürlich die Arbeitsgeschwindigkeit, gemessen als die Anzahl vollständig verteilter Proben pro Zeiteinheit. Es hat sich als schwierig erwiesen, Roboter zu konstruieren, die sowohl genau sind, wenn sie kleine Volumina verteilen, als auch ausreichend schnell sind, um beispielsweise die Anforderungen molekularbiologischer Arbeit im Klinikbereich zu erfüllen.
Zusätzlich zu diesen hauptsächlichen Funktionseigenschaften eines Pipettierungs-Roboters gibt es andere Eigenschaften, die auch wichtig sein können. Beispiele für solche Eigenschaften sind der Kaufpreis, Kosten-Rentabilität für kleine Probenreihen, Gerätegröße und das Erfordernis, das Mündungsstück und andere Teile zu reinigen, um eine Verunreinigung durch Fremdmaterial und durch Material von vorangehenden Pipettierungs-Handlungen verhindern zu helfen. Außerdem sollten das Reaktionsgefäß, die Probe und die Chemikalien davor geschützt werden, in Luft enthaltenen Teilchen, die derartiges verunreinigendes Material tragen können, ausgesetzt zu werden.
Heute gibt es Pipettierungs-Roboter, die sich im Hinblick darauf unterscheiden, ob sie getrennte Mündungsstücke zum Ansaugen und Verteilen haben, oder ob dasselbe Mündungsstück für beide Funktionen verwendet wird. Der erste Typ enthält ein oder mehrere Ansaug-Mündungsstücke, die mit einem oder mehreren Flüssigkeits-Vorratsbehältern, das heißt Gefäßen, aus denen die Reagenzien verteilt werden sollen, verbunden sind. Diese Reagenzien gelangen aus diesem Gefäß durch das Ansaug-Mündungsstück und über das Verteilerelement zu einem oder zu mehreren Verteilungs-Mündungsstücken, von wo sie zu dem Reaktionsgefäß überführt werden. Dieser Typ von Pipettierungs-Roboter wird nachfolgend als ein Pumpen-Verteiler bezeichnet.
Der zweite Typ von Pipettierungs-Roboter zeichnet sich durch ein oder mehrere kombinierte Ansaug- und Verteilungs-Mündungsstücke aus. Dieser Typ hat einen separaten Flüssigkeits-Vorratsbehälter. Die chemischen Reagenzien werden aus dem Probengefäß zu dem Mündungsstück aufgezogen und dann mit demselben Mündungsstück in die Reaktionsgefäße verteilt. Dieser Typ von Pipettierungs-Roboter wird nachfolgend als ein Pipetten-Verteiler bezeichnet.
Der Pipettierungs-Roboter vom Pumpen-Verteiler-Typ erfüllt normale Genauigkeitsanforderungen, selbst beim Verteilen kleiner Volumina. Er erfüllt jedoch nicht die Arbeitsgeschwindigkeits-Anforderungen. Der Pipettierungs- Roboter vom Pipetten-Verteiler-Typ erfüllt im Gegensatz dazu normale Arbeitsgeschwindigkeits-Anforderungen. Er erfüllt jedoch normalerweise nicht die Anforderungen nach einem hohen Genauigkeitsgrad, was eine der Hauptvorraussetzungen ist.
Ein weiteres Problem ist, daß keiner der beiden Typen von Pipettierungs-Robotern für kleine Probenreihen, das heißt die Handhabung von etwa 500 Proben oder weniger, kostenrentabel ist. Der Schutz gegen Verunreinigungen in der Luft kann auch ein Problem sein. Außerdem sind Pumpen-Verteiler sehr teuer in der Anschaffung, und es ist oft schwierig, ihre Mündungsstücke zu reinigen.
Die für diese Erfindung relevanten Arbeitsvorgänge, die heute mit konventionellen Techniken, entweder manuell oder automatisch, durchgeführt werden, sind, in chronologischer Reihenfolge: die industrielle Synthese von Reagenzien, ihre Lagerung in großen Packungen, der Transport dieser Packungen zum Anwender, das Abmessen der relevanten Reagenz-Volumina und das Verteilen dieser Volumina auf die passenden Proben-Mulden oder Reagenz-Gefäße, wie beispielsweise die Multi-Proben-Platte. Wenn die tatsächliche Probe aufgebracht und mit den Reagenzien in den Mulden oder mit etwas zur Verwendung in der Multi-Proben-Platte bestimmten Äquivalentem gemischt wurde, ist dieses Gefäß fertiggestellt und wird in ein Gerät oder an einen anderen Ort zum Inkubieren gebracht.
Pipettierungs-Roboter werden in dieser Kette von Ereignissen hauptsächlich für zwei Arbeitsvorgänge verwendet. Sie werden zum Teil in Verbindung mit der industriellen Synthese von Reagenzien und ihrer Lagerung in großen Packungen verwendet. Diese Roboter sind häufig der Pumpen-Verteiler-Typ und sind oft groß, teuer und relativ langsam. Sie sind jedoch sehr genau und sind Teil eines hinsichtlich aller möglichen Verunreinigungsbedrohungen, Verwechslungs-Risiken und ähnlicher Gefahren qualitätsgesicherten Prozesses.
Pipettierungs-Roboter werden auch im Laboratorium des Anwenders eingesetzt, um relevante Reagenz-Volumina abzumessen und diese, beispielsweise, auf eine Multi-Proben-Platte, wo eine bestimmte Analyse durchgeführt werden soll, zu verteilen. Diese Pipettierungs-Roboter können von unterschiedlicher Art sein, aber sie müssen schnell sein und können nicht sperrig oder teuer sein. Aus diesen Gründen sind sie üblicherweise nicht so genau wie der vorher erwähnte Typ. Ein Problem im Laboratorium des Anwenders kann das Risiko von Verunreinigung aufgrund von Teilchen, die normalerweise in der Luft enthalten sind, Aerosolen, Verspritzen oder über das Mündungsstück oder ein anderes Bauteil sein. Das Risiko des Verwechselns von Großpackungen, beispielsweise, ist besonders groß, wenn viele kurze Probenreihen gefahren werden oder viele verschiedene Anwender beteiligt sind. In diesem Zusammenhang bedeutet Probe eine Patienten-Probe, Testmaterial oder einen anderen vom Anwender gewählten Bestandteil, wovon die Probe einen Teil des Reagenz-Gemisches, das herzustellen ist, bildet.
Es wäre äußerst vorteilhaft, wenn man die Vorteile des in industriellem Zusammenhang verwendeten Pipettierungs-Roboters, das heißt Genauigkeit und Sicherheit im Hinblick auf Verunreinigung, Verwechslung und ähnliche Risiken, mit den Vorteilen des im Labor des Anwenders eingesetzten Pipettierungs- Roboters, das heißt Geschwindigkeit, geringer Preis und Kompaktheit, kombinieren könnte.
Dies konnte erreicht werden durch Ersetzen der Aufbewahrung industriell synthetisierter Reagenzien in Großpackungen durch das Aufbewahren der Reagenzien direkt im Endverbraucher-Reaktionsgefäß, das dann mit den fertig gemischten Reagenzien zum Labor des Anwenders transportiert wird. In dem Labor findet dann nur die Einbringung der Probe statt. Dies stellt eine schnelle, genaue und sichere Handhabung in diesem Umfeld sicher. Das Erfordernis eines Pipettierungs-Roboters wird auf diese Weise beseitigt, und so können die Vorteile eines niedrigen Preises und kompakter Größe als erfüllt betrachtet werden.
Diese Lösung ist dennoch mit zwei Nachteilen verbunden. Erstens bevorzugen verschiedene Endverbraucher verschiedene Typen und Hersteller von Reaktionsgefäßen, was eine effiziente industrielle Handhabung schwierig macht. Zweitens kann ein Vormischen der Reagenzien in dem Reaktionsgefäß verschiedene chemische Prozesse starten, was die Empfindlichkeit und Lagerfähigkeit verringert, was wiederum zu falschen Probenergebnissen führen kann.

Stand der Technik

US-A-3 554 705 beschreibt eine chemische Packung oder Rohreagenz-Patrone, die verschiedene Reagenzien in getrennten Aufbewahrungsräumen, die zur Verbindung miteinander geeignet sind, enthält, wobei die Kammern mit Rückhaltemitteln, die die vorzeitige Bewegung der vorgepackten Reagenzien aus jedem der Aufbewahrungsräume verhindern, verschlossen sind. Dieser Aufbau ähnelt dem Blisterverpackungs-System, das für festes und teilchenförmiges Material verwendet wird. Obwohl in der Beschreibung und den Ansprüchen keine Volumina erwähnt sind, macht der Aufbau der Aufbewahrungsräume klar, daß sie dazu gedacht sind, Volumina in der Größenordnung von Millilitern und keinesfalls so kleine Volumina, daß sie der Schwerkraft widerstehen und zum Verlassen der Patrone ein Zentrifugieren erfordern, zu enthalten.
EP 678 745 A1 stellt einen jüngeren Versuch dar, bei dem eine Probe durch Zentrifugieren aus einem zugespitzten Gefäß in ein Reaktionsgefäß überführt wird, wobei das letztere von einer Membran bedeckt ist und das zugespitzte Gefäß die Membran durchdringt. Dieses System betrifft jedoch nicht die Aufbewahrung und das Verteilen von Reagenzien und besitzt nicht die mit der vorliegenden Erfindung verbundenen Vorteile.
WO 95/26798 offenbart die Anordnungen temporärer Flüssigkeits-Aufbewahrungshohlräume in einem Zentrifugenröhrchen. Ein derartiger temporärer Aufbewahrungshohlraum wird gebildet aus einem Flüssigkeit haltenden Hohlraum oder aus Bereichen an der Innenseite des Röhrchens mit flußbeschränkenden, sich nach unten erstreckenden Flüssigkeit-Abflußkanälen. Von dem Anwender wird ein Tropfen eines Reagenz oder einer Probe in einen derartigen Hohlraum pipettiert, aber durch die Ausgestaltung des Hohlraums und der Abflußrinne daran gehindert, zum Boden des Röhrchens zu fließen. Es muß Zentrifugierungskraft angewendet werden, um die Überführung des flüssigen Bestandteils zum Bodenbereich des Zentrifugenröhrchens zu veranlassen. Die Offenbarung der WO 95/26798 umfaßt auch einen reibschlüssig dichtenden Klappdeckel oder einen Schraubkappendeckel, dessen Unterseite zwei oder mehr Flüssigkeit haltende Hohlräume oder Kammern enthält. Bei offenem Deckel wird mindestens ein Tropfen zur temporären Aufbewahrung in mindestens eine Kammer eingebracht. Dann wird der Deckel geschlossen oder wieder an dem Röhrchen befestigt, aber das Fließen von Flüssigkeit aus einer Kammer wird verhindert. Wiederum muß Zentrifugierungskraft angewendet werden, um die Überführung des flüssigen Bestandteils zu dem Bodenbereich des Zentrifugenröhrchens zu veranlassen. Dies ist jedoch keine Lösung für die mit der Aufbewahrung von Reagenzien verbundenen Probleme, noch bietet es die Vorteile des Vorverteilens von Reagenzien in einer auf verschiedene Reaktionen, Reaktionsgefäße und Mikrotiterplatten anwendbaren Form.
DE 44 19 759 A1 offenbart ein Reaktionsgefäß, wie ein konventionelles Mikrozentrifugenröhrchen, wobei in dem Gefäß durch Einschließen eines oder mehrerer Reagenzien, die durch eine Substanz, die beim Erwärmen des Gefäßes mit seinen Inhalten geschmolzen werden kann, wie eine Wachsschicht, getrennt sind, Kammern ausgebildet sind.
Bei Verwendung der extrem kleinen Volumina, die in diesem Zusammenhang typisch sind, das heißt in der Größenordnung weniger ul und weniger, tritt eine Anzahl spezieller Probleme auf. Beispielsweise sind die Volumina so klein, daß eine Kraft erforderlich ist, um sie von den Seiten des Gefäßes oder Behälters, in dem sie aufbewahrt werden, abzulösen. Diese Volumina werden oft durch eine Schicht aus Wachs oder einem viskosen Öl gegen Verdampfung und Oxidation geschützt. In der Praxis ist eine größere Kraft als die Schwerkraft erforderlich, um das Reagenz aus dem Verteilungs-Behälter oder der Verteilungs-Vorrichtung in das Reaktionsgefäß zu überführen.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung bereitzustellen, die mit gängigen Normen und Arbeitsverfahren, insbesondere jenen, die in der biochemischen Analyse angewendet werden, übereinstimmt. Biochemische Analyse bezieht sich auf Verfahren zum Nachweis biochemischer Bestandteile, zum Beispiel von Proteinen, Enzymen und Oligonucleotiden, oder zum Nachweisen der Anwesenheit spezieller Zellen, zum Beispiel krankheitsverursachenden Organismen oder Zellen, die eine pathogene Umwandlung durchgemacht haben, wie Krebszellen. Insbesondere ist es das Ziel der Erfindung, ein System bereitzustellen, das die sichere und verunreinigungsfreie Aufbewahrung von Reagenzien, das genaue Verteilen mit einem hohen Grad von Reproduzierbarkeit und eine einfache Handhabung, die die Anzahl von Arbeitsschritten des Anwenders minimiert, erlaubt. Ein Ziel ist, das Erfordernis des manuellen oder automatisierten Pipettierens durch den Anwender, das heißt das Labor, in dem die Analyse durchgeführt wird, zu beseitigen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Nachteile gängiger, oben beschriebener Techniken, werden durch die vorliegende Erfindung, wie sie in den beigefügten Ansprüchen beschrieben ist, überwunden. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Aufbewahren und Verteilen biochemischer Reagenzien, die in kleinen Volumina verwendet werden und daher empfindlich für Verunreinigung, Oxidation und Reaktionen zwischen den Reagenzien untereinander sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung wird detaillierter beschrieben unter Bezugnahme auf die beigeschlossenen Zeichnungen, in denen
Fig. 1a einen schematischen Schnitt einer Reagenz-Patrone gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt,
Fig. 1b eine perspektivische Ansicht der Patrone in Fig. 1a zeigt,
Fig. 2 schematisch zeigt, wie erfindungsgemäß Reagenz-Patronen mit einer Multi-Proben-Reaktionsplatte kombiniert werden können,
Fig. 3A und 3B zwei Ausführungsformen der Erfindung zeigen,
Fig. 4 einen schematischen Schnitt zeigt, der veranschaulichend ist für eine Ausführungsform, in der eines der Reagenzien in einer offenendigen Kapillare, die in einem der Räume einer erfindungsgemäßen Reagenz-Patrone enthalten ist, eingeschlossen ist,
Fig. 5 eine perspektivische Ausschnitts-Ansicht einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zeigt, bei der die Reaktions-Patronen in denselben Anzahlen und Positionen wie die Reaktionsgefäße in einer als Mikrotiterplatte bekannten Multi-Proben-Platte angeordnet sind.

Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß werden die Reagenzien unter Verwendung einer Vorrichtung, die in der Lage ist, zwei oder mehrere Reagenzien, getrennt voneinander und vor der Atmosphäre geschützt, zu enthalten, aufbewahrt und verteilt. Die Reagenzien werden dann durch Zentrifugieren, gewünschtenfalls nach mechanischem Entfernen oder örtlich Verändern von Mitteln wie Deckeln, Verschlüssen oder Begrenzungen, die die Räume der Vorrichtung abschließen, aus der Vorrichtung entfernt. Die Mittel können Stopfen oder Ventile, Folien, Membranen und auch viskose Flüssigkeiten oder Wachse umfassen.
Die erfindungsgemäßen Reagenz-Räume weisen ein bestimmtes, physisch abgetrenntes Volumen auf, wobei sie im allgemeinen Volumina von weniger als etwa 100 ul enthalten. Bei Wasch-Schritten kann das Volumen dennoch größer sein, zum Beispiel 200 bis 500 ul. Bei speziellen, bevorzugten Ausführungsformen sind die Volumina beträchtlich kleiner, im Intervall von 0,001 bis 0,5 ul.
Fig. 1a zeigt schematisch eine Reagenz-Patrone (1) mit ihren verschiedenen Räumen (2), in denen kleine Mengen von Reagenzien aufbewahrt werden. Diese Reagenzien sind schwarz markiert. Die Reagenzien sind voneinander und von der umgebenden Atmosphäre durch Abdichtungen (3) aus geeignetem Material wie Wachs oder viskosen organischen Verbindungen getrennt. Die Räume (2) selbst können mit anderen Arten von Verschlüssen (4) wie Stopfen oder thermoplastischen Membranen verschlossen sein.
Fig. 1b zeigt die obige Ausführungsform in einer perspektivischen Ansicht, wobei eine räumliche Anordnung der Räume veranschaulicht wird. Offensichtlicherweise kann im Rahmen der Erfindung die Anzahl und Gestaltung der Räume variieren.
Fig. 2 zeigt, wie mehr als eine Reagenz-Patrone (1A und 1B) an dem Halter einer Kassette so angeordnet werden kann, daß die Anzahlen und Positionen der Reagenz-Patronen zu den Anzahlen und Positionen der Reaktionsgefäße in der Multi-Proben-Platte, in die die Reagenzien verteilt werden sollen, passen. 1A und 1B zeigen zwei verschiedene Arbeitsstadien. In der Reagenz-Patrone 1A wurde die Abdichtung des linken Raumes entfernt und das Reagenz in das Gefäß überführt, während die Abdichtung 4 des rechten Raumes noch an Ort und Stelle ist und alle Reagenzien und ihre abschließenden Schichten (3', 3") an Ort und Stelle bleiben. In 1B wurden die Abdichtungen 4 und 3' entfernt, aber die Abdichtung 3" und das letzte Reagenz bleiben.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung können die Reagenz-Räume zusätzlich durch einen ablösbaren oder beweglichen Deckel, Stopfen oder eine brechbare Abdichtung oder Folie verschlossen werden. Die Fig. 3A und 3B zeigen schematisch zwei Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die Abdichtung 4 mechanisch betätigt und geöffnet wird. 3A zeigt eine Ausführungsform, in der sich alle Abdichtungen gleichzeitig öffnen. 3B zeigt eine andere Ausführungsform, die es erlaubt, daß die Abdichtungen unabhängig voneinander geöffnet werden.
Eine das Öffnen der Verschlußmittel betreffende Ausführungsform umfaßt Platten mit einem dreidimensionalen Muster, zum Beispiel Rillen und Rücken, die mit Teilen der Verschlußmittel im Eingriff stehen, mit Verlängerung durch die Reagenz-Patrone hindurch (Fig. 3A und B). Diese Platten werden im folgenden "Druckplatten" genannt. Eine derartige Druckplatte kann in verschiedener Weise ausgestaltet sein, beispielsweise mit Farb-Codes, die verschiedenen Gewichten und/oder Mustern entsprechen, ausgestattet sein. Bevorzugt werden diese Druckplatten während des Zentrifugierens der Anordnung, die aus einer aufnehmenden Multi-Proben-Platte, Reagenz-Patronen und der Druckplatte besteht, betätigt. Gewünschtenfalls kann die Druckplatte manuell mit oder ohne mechanische Hilfsmittel niedergedrückt werden. Der Vorteil der Betätigung durch Zentrifugieren oder unter Verwendung optionaler mechanischer Hilfsmittel ist, daß garantiert ist, daß das Öffnen der Patronen, entsprechend dem Muster der Druckplatte, gleichzeitig erfolgt und alle betroffenen Patronen umfaßt.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform, die schematisch in Fig. 4 gezeigt ist, ist eines oder sind mehrere der Reagenzien in einer offenendigen Kapillare, die in einem der Räume in einer erfindungsgemäßen Reagenz-Patrone enthalten ist, untergebracht. Dies ist speziell bevorzugt, wenn sehr kleine Volumina an Reagenz, zum Beispiel Volumina in dem Intervall von 0,001 bis 0,50 ul, verteilt werden. Diese Anordnung ist auch vorteilhaft, als sie ein kleines Reagenz- Volumen vor Umwelteinflüssen schützt. Volumina in diesem Intervall sind darüber hinaus sehr schwierig exakt abzumessen, da physikalische Wechselwirkungen wie Oberflächenspannung, Adsorption und hydrodynamisches Verhalten einen beträchtlichen Einfluß auf den Tropfen ausüben.
Beim Abmessen, Aufbewahren und Verteilen extrem kleiner Volumina, beispielsweise Volumina von weniger als 50 Nanolitern, trifft man auf spezielle Schwierigkeiten. Wie vorstehend beschrieben, werden derartige Volumina bisher nur von tintenstrahlerähnlichen Vorrichtungen in zufriedenstellender Weise gehandhabt. Von dem Erfinder vorliegender Erfindung wurde gezeigt, daß das Verhalten derart kleiner Volumina von der Beziehung zwischen Volumen und der Fläche der Oberfläche, die mit dem Volumen in Kontakt ist, abhängt. Beim Füllen und Schneiden dünner Kapillaren beispielsweise verursacht das Schneiden selbst ein Zusammendrücken der Kapillare und daher eine Flüssigkeits- Verlagerung. Überraschenderweise wird, wenn die Fläche der Oberfläche, die mit der Flüssigkeit in Kontakt ist, maximiert wird, beispielsweise durch Verwenden einer längeren und dünneren Kapillare anstelle einer kürzeren und dickeren, die Verformung während des Schneidens und daher die Flüssigkeits- Verlagerung verringert. Es ist besonders bevorzugt, einen Kern in die Kapillare einzuführen und auf diese Weise ein Volumen, das von den Außenwandungen des Kerns und den Innenwandungen der Kapillare eingeschlossen wird, zu bilden. Dies trifft unabhängig von der Gestalt der Kapillare zu, jedoch haben runde oder ovale Querschnitte praktische Vorteile. Außerdem hat, wenn man die Länge der mit Flüssigkeit gefüllten Abschnitte ausdehnt, die Wirkung des Schneidens weniger Auswirkung auf die Genauigkeit. Die Technologie des Schneidens von Abschnitten einer vorbestimmten Länge ist auch gut entwickelt, und es wird eine hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit erzielt.
Die Kapillare in Fig. 4 kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch eine Multi-Hohlraum-Kapillare sein, die einen Teil einer Reagenz-Patrone darstellen kann, wie eine in einem Raum einer Patrone enthaltene Kapillare.
Fig. 5 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, das heißt eine Kassette, in der mehrere Reagenz-Patronen so angeordnet sind, daß ihre Anzahlen und Positionen zu den Anzahlen und Positionen oder Bruchteilen der Anzahlen und Positionen der Reaktionsgefäße in einer Multi-Proben-Platte wie einer Mikrotiterplatte passen. Idealerweise sind die Reagenz-Patronen in Reihen von acht und Spalten von zwölf in einer Kassette, die auf oder teilweise in eine Mikrotiterplatte des allgemein verwendeten Formats mit 96 Mulden gebracht werden kann, angeordnet. Es ist jedoch beabsichtigt, daß die Patronen einem Bruchteil dieses oder eines anderen üblicherweise verwendeten Formats entsprechen. Reagenz-Patronen können zu Kassetten, die 3 · 8 Patronen aufweisen, oder zu Streifen von Patronen, Einzelreihen variierender Längen, zusammengesetzt werden.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Reagenz-Patronen können sie, wenn sie mit Reagenzien gefüllt werden, mehrere getrennte Elemente aufweisen, aber zum Kombinieren zu einer Kassette geeignet sein, so daß mehrere zusammen verwendet werden können. Dies erlaubt eine effektive und flexible Herstellung, insbesondere in Fällen, in denen die Patronen mit verschiedenen Reagenzien oder verschiedenen Reagenz-Konzentrationen gefüllt werden. So kann eine große Reihe von Patronen mit identischer oder ähnlicher Zusammensetzung hergestellt werden, um später zu Kassetten, die für spezielle Analysen gedacht sind, kombiniert zu werden. Ein einfaches Beispiel dafür ist die Herstellung einer Kassette zur Verwendung in einer Optimierungsreaktion. Große Serien von Reagenz-Patronen mit verschiedenen Konzentrationen eines Reagenz können hergestellt und dann als Konzentrationsgradienten in den verschiedenen Reihen oder Spalten der Multi-Proben-Platte angeordnet werden.
Die vorstehend angesprochenen Abdichtungen der offenen Räume sind geeignet zum Öffnen durch eines der folgenden Mittel: erhöhte Temperatur, Zentrifugieren der Reagenz-Patrone oder Anwendung einer äußeren Kraft. Ein Erhöhen der Temperatur kann beispielsweise beinhalten, die Temperatur der Reagenz-Patrone von einer Aufbewahrungstemperatur von -18ºC oder darunter auf eine Temperatur von -4ºC, +8ºC oder +20ºC ansteigen zu lassen, oder sie auf eine höhere Temperatur zu erwärmen. Das Zentrifugieren kann bei verschiedenen Geschwindigkeiten durchgeführt werden, so daß die zum Öffnen der Abdichtungen verwendete Kraft kontrolliert werden kann. Anordnungen zum Anwenden einer äußeren Kraft umfassen jede Art von mechanischem Einfluß einschließlich der vorstehend beschriebenen "Druckplatten".
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reagenz-Patrone mindestens eines der folgenden Reagenzien: DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, reverse Transcriptase, Uracil-N-glycolase, DNA-Ligase, katalytische Ribonucleinsäure, Deoxyribonucleotide, Ribonucleotide, Oligonucleotide, fluoreszierende Farbstoffe, Rinderserumalbumin, Formamid, Glycerol, Puffer- Substanzen, Ammoniumsulfat, Dimethylsulfoxid, anionische Detergentien und nicht-ionische Detergentien für eine spezielle Reaktion.
Die Erfindung umfaßt auch ein System zum Aufbewahren und Verteilen chemischer Reagenzien, insbesondere kleiner Volumina biochemischer Reagenzien. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien in bestimmten Räumen in einer Reagenz-Patrone angeordnet und von der umgebenden Atmosphäre isoliert sind, und durch die Anordnung mehrerer ähnlicher Reagenz-Patronen dergestalt, daß ihre Anzahlen und Positionen die Anzahlen und Positionen von in einer Multi-Proben-Platte enthaltenen, als Mulden bekannten, Reaktionsgefäßen widerspiegeln.
Reaktionen, deren Durchführung besonders geeignet ist zur Verwendung dieser Reagenz-Patrone oder des Systems gemäß der beschriebenen Erfindung, sind wie folgt: eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction), eine Ligase-Kettenreaktion (LCR, ligase chain reaction), eine "Lücken-LCR- Reaktion" ("gapped-LCR reaction"), eine Amplifikation auf Nucleinsäuresequenz-Basis (NASBA, nucleic acid sequencebased amplification), eine selbsterhaltende Sequenz-Replikation (3SR, self-sustained sequence replication), eine transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA, transcription mediated amplification), eine Strangversetzungs-Amplifikation (SDA, strand displacement amplification), eine Ziel-Amplifikation, eine Signal-Amplifikation oder eine Kombination irgendwelcher der obigen Reaktionen.
Eine Reagenz-Patrone oder ein System gemäß der vorliegenden Erfindung ist insbesondere anwendbar zum Nachweis einer Nucleotidsequenz oder von Nucleotidsequenzen, die Teil irgendeiner der folgenden Nucleinsäuren ist (sind): ein Virus-Genom, aus Bakterienzellen oder Eukaryontenzellen hervorgehende Nucleinsäuren oder kodierende Bereiche von Zellen von Wirbeltieren, die zur Gewebebestimmung verwendet werden.
Eine Reagenz-Patrone oder ein System gemäß der vorgelegten Erfindung ist insbesondere anwendbar zum Nachweis irgendeines der folgenden Viren: Immunschwächevirus des Menschen (HIV), Papillomavirus des Menschen, Hepatitis-Viren, Cytomegaloviren oder ähnliche.
Eine Reagenz-Patrone oder ein System gemäß der vorgelegten Erfindung ist insbesondere anwendbar zum Nachweisen von Zellen irgendeiner der folgenden Gattungen: Chlamydia, Rickettsia, Mycobakterium, Haemophilus, Neisseria, Streptococcus, Listeria, Cryptococcus, Coccoides, Blastomyces, Histoplasma oder ähnliche.
Eine Reagenz-Patrone oder ein System gemäß der vorgelegten Erfindung ist insbesondere anwendbar zum Nachweis von Krebszellen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem Kits zur Durchführung irgendeiner der oben beschriebenen Reaktionen oder Tests, wobei ein solcher Kit die notwendigen Reagenzien, vorgepackt in Patronen, die optional zu einer oder mehreren Kassetten zusammengesetzt sind, gewünschtenfalls Reaktionsgefäße und Auslösungsmittel, wie Druckplatten, und eine Gebrauchsanleitung enthält.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Kassette, die bei der Durchführung chemischer Reaktionen, insbesondere biochemischer Analysen unter Verwendung von Multi-Proben-Platten, die als Mikrotiterplatten bekannt sind, verwendet wird. Sie ist dadurch gekennzeichnet, daß die Kassette aus einer Anzahl von Reagenz-Patronen besteht, die so angeordnet sind, daß ihre Anzahlen und Positionen zu den Anzahlen und Positionen von als Mulden bekannten Reaktionsgefäßen, die in einer Multi-Proben-Platte wie dem konventionellen 96 Loch-Mikrotiterplatten-Format enthalten sind, passen.
Schließlich umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Verteilen von Reagenzien, hauptsächlich biochemischer Reagenzien, die in kleinen Mengen während Analysen, die Multi-Proben - Platten benutzen, verwendet werden. Dieses Verfahren enthält die folgenden Schritte:
- mindestens zwei Reagenzien werden physisch getrennt voneinander in eine erfindungsgemäße Reagenz-Patrone abgefüllt,
- mehrere Reagenz-Patronen werden in mindestens einer Kassette so angeordnet, daß ihre Anzahlen und Positionen zu den Anzahlen und Positionen oder Bruchteilen der Anzahlen und Positionen von Reaktionsgefäßen in einer Multi-Proben-Platte wie einer Mikrotiterplatte passen,
- die Kassette oder die Kassetten wird/werden mit einer Multi-Proben- Platte kombiniert,
- die Reagenz-Patronen werden ihrer Inhalte entleert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform findet das Entleeren in mehreren Schritten statt, beispielsweise durch die aufeinanderfolgende Ausführung einer oder mehrerer der folgenden Maßnahmen: Temperaturerhöhung, Anwendung einer äußeren Kraft oder einer Kombination davon, gefolgt von Zentrifugieren.

Claims

1. Reagenz-Patrone zum Aufbewahren und Verteilen biochemischer Reagenzien, aufweisend mindestens zwei getrennte und bestimmte Räume (2) für Reagenzien, wobei mindestens ein Reagenz in einem Raum angeordnet ist und jedes Reagenz ein solches Volumen hat, daß Zentrifugieren erforderlich ist, um es von der Patrone abzulösen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Raum eine Abdichtung darin hat, die das Reagenz gegen die umgebende Atmosphäre abschließt, und dadurch, daß die Reagenz-Patrone ein Einzelgegenstand ist, der an oder teilweise in dem Reaktionsgefäß einer Mikrotiterplatte angebracht werden kann, wodurch die Reagenz-Patrone dazu geeignet ist, zu einer Kassetten-Anordnung von mehreren Reagenz-Patronen kombiniert zu werden.

2. Reagenz-Patrone nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Öffnung zu mindestens einem Raum hat, die mit einem Verschluß (4, 4', 4"), der geöffnet werden kann, verschlossen werden kann, wobei der Verschluß geöffnet werden kann, ohne die Umgebung der Öffnung oder möglicherweise andere einzeln verschlossene Räume, die in derselben Vorrichtung angeordnet sind, zu beeinflussen.

3. Reagenz-Patrone nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der verschlossene Verschluß geöffnet wird durch irgendeine der folgenden Maßnahmen: Temperaturanstieg, Zentrifugieren, Anwendung einer äußeren Kraft oder eine Kombination davon.

4. Reagenz-Patrone nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenz-Volumina in dem Intervall von 1 bis 200 ul sind.

5. Reagenz-Patrone nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Patrone mindestens eines der folgenden Reagenzien enthält: DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, reverse Transcriptase, Uracil-N-glycolase, DNA-Ligase, katalytische Ribonucleinsäure, Deoxyribonucleotide, Ribonucleotide, Oligonucleotide, fluoreszierende Farbstoffe, Rinderserumalbumin, Formamid, Glycerol, Puffer-Substanzen, Ammoniumsulfid, Dimethylsulfoxid, anionische Detergentien, nicht-ionische Detergentien für eine spezielle Reaktion.

6. Reagenz-Patrone nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einem der Räume (2) eine getrennte, Reagenz enthaltende Kapillare enthalten ist.

7. Reagenz-Patrone nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die getrennte Kapillare eine Multi-Hohlraum-Kapillare ist.

8. Reagenz-Patrone nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die getrennte Kapillare eine Außenwand und einen Kern aufweist, die den Kapillarraum zwischen der Wand und dem Kern definieren.

9. System zum Aufbewahren und Verteilen biochemischer Reagenzien in Reagenz-Patronen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenz- Patronen so in einer Kassette angeordnet sind, daß ihre Anzahl und Positionen die Anzahlen und Positionen oder Bruchteile der Anzahlen und Positionen von Reaktionsgefäßen widerspiegeln, die als Mulden bekannt sind und in einem Multi-Proben-Halter enthalten sind.

10. System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenz-Patronen in Reihen und Spalten entsprechend dem konventionellen Mikrotiterplatten-Format oder anderen Standardformaten angeordnet sind.

11. System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Reagenzien in Form eines Konzentrationsgradienten bereitgestellt wird, indem die Reagenzien in verschiedenen Konzentrationen in verschiedenen Reagenz-Patronen angeordnet werden.

12. System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien ausgewählt sind für eine spezielle Reaktion, die eine der Reaktionen Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction), Ligase-Kettenreaktion (LCR, ligase chain reaction), "Lücken-LCR-Reaktion" ("gapped-LCR reaction"), Amplifikation auf Nucleinsäuresequenz-Basis (NASBA, nucleic acid sequencebased amplification), selbsterhaltende Sequenz-Replikation (3SR, self-sustained sequence replication), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA, transcription mediated amplification), Strangversetzung (SDA, strand displacement), Ziel-Amplifikation, Signal-Amplifikation oder eine Kombination irgendwelcher der obigen Reaktionen ist.

13. System nach Anspruch 12 zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nucleotid-Sequenz oder von Nucleotid-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleotid-Sequenz oder -Sequenzen Teil irgendeiner der folgenden Arten von Nucleinsäuren ist (sind): ein Virus-Genom, aus Bakterienzellen oder Eukaryontenzellen hervorgehende Nucleinsäuren oder kodierende Bereiche von Zellen von Wirbeltieren, die zur Gewebebestimmung verwendet werden.

14. System nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Verwendung beim Nachweis irgendeines der folgenden Viren: Immunschwächevirus des Menschen (HIV), Papillomavirus des Menschen, Hepatitis-Viren, Cytomegaloviren oder ähnliche Viren.

15. System nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Verwendung beim Nachweis von Zellen irgendeiner der folgenden Gattungen: Chlamydia, Rickettsia, Mycobacterium, Haemophilus, Neisseria, Streptococcus, Listeria, Cryptococcus, Coccoides, Blastomyces, Histoplasma oder ähnliche.

16. System nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Verwendung beim Nachweis von Krebszellen.

17. Verfahren zum Verteilen biochemischer Reagenzien, die verwendet werden bei Analysen, die Reaktionsgefäße in Multi-Proben-Platten verwenden, dadurch gekennzeichnet, daß

- mindestens zwei Reagenzien physisch getrennt voneinander in eine Reagenz-Patrone nach Anspruch 1 mit mindestens zwei getrennten, bestimmten Reagenz-Räumen und einer Abdichtung in mindestens einem der Räume abgefüllt werden,

- mindestens eine der Reagenz-Patronen in einer Kassette angeordnet wird, wobei die Anzahlen und Positionen der Reagenz-Patronen zu den Anzahlen und Positionen oder Bruchteilen der Anzahlen und Positionen der Reaktionsgefäße in einer Multi-Proben-Platte wie einer Mikrotiterplatte passen,

- mindestens eine Probe in mindestens einem Reaktionsgefäß in einem Multi-Proben-Halter angeordnet wird,

- die Kassette, die die Reagenz-Patronen enthält, so mit einem Multi-Proben-Halter kombiniert wird, daß jede Reagenz-Patrone mindestens einem Reaktionsgefäß entspricht,

- die Reagenz-Patronen durch Zentrifugieren ihrer Inhalte entleert werden.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Patronen in mehreren Schritten entleert werden, jeweils mindestens ein Reagenz.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Patronen entleert werden durch aufeinanderfolgende Erhöhung der Temperatur, Anwendung einer äußeren Kraft oder eine Kombination davon, gefolgt von Zentrifugieren.