DE69713431T2

DE69713431T2 - Zubereitungen enthaltend l-carnitin oder derivate davon und antioxidations-mittel

Info

Publication number: DE69713431T2
Application number: DE69713431T
Authority: DE
Inventors: Claudio Cavazza
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-06
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2017-03-07
Also published as: US5998474A; EP0797993B1; MX9702280A; ZA972671B; ITRM960199A0; ES2177843T3; DE69713431D1; CA2200540C; PT797993E; ITRM960199A1; KR100489371B1; CA2200540A1; EP0797993A1; IT1283967B1; JPH1087483A; DK0797993T3; KR970064603A; ATE219360T1

Description

Diese Erfindung betrifft eine neue therapeutische Verwendung von L-Carnitin, einigen Alkanoyl-L-carnitinen und den pharmakologisch akzeptablen Salzen davon zur Verhinderung und Behandlung von Störungen und Erkrankungen, die durch oxidative Beanspruchung verursacht werden, was durch freie Sauerstoffradikale verursacht wird.
Mehr spezifisch betrifft diese Erfindung die koordinierte Verwendung von L-Carnitin oder einem Alkanoyl-L-carnitin oder den pharmakologisch akzeptablen Salzen davon mit natürlichen lipophilen Antioxidantien wie Vitamin E oder Vitamin A und/oder natürlichen hydrophilen Antioxidantien wie Vitamin C, Glutathion (GSH) oder Selen.
Mehrere therapeutische Verwendungen von L-Carnitin und Alkanoyl-L- carnitin sind bereits bekannt, jedoch betrifft keine die hierin offenbarte Verwendung.
Erfindungsgemäß ist mit der koordinierten Verwendung der genannten Verbindungen die gemeinsame Verabreichung, d. h. die im wesentlichen gleichzeitige Zufuhr von L-Carnitin, Alkanoyl-L-carnitin oder einem pharmakologisch akzeptablen Salz davon und einem natürlichen lipophilen Antioxidans wie Vitamin E oder Vitamin A oder einem natürlichen hydrophilen Antioxidans wie Vitamin C, GSH oder Selen oder die Verabreichung eines Kombinationspräparates oder einer Zumischung der genannten aktiven Bestandteile zusätzlich zu geeigneten Exzipienten, falls notwendig, gemeint.
Diese Erfindung betrifft daher ebenfalls oral, parenteral, rektal oder transdermal verabreichbare pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Behandlung von Erkrankungen und Pathologien geeignet sind, die mit der oxidativen Beanspruchung von Körperproteinen und Fettsäuren im Zusammenhang stehen, die als aktive Bestandteile L-Carnitin, ein Alkanoyl-L-carnitin oder ein pharmakologisch akzeptables Salz davon und ein natürliches lipophiles Antioxidans wie Vitamin E oder Vitamin A und/oder ein natürliches hydrophiles Antioxidans, wie Vitamin C, GSH oder Selen umfassen.
Die Störungen und Erkrankungen, die mit der Protein-Oxidation zusammenhängen, umfassen Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Parkinson, Trauma, zerebrale Kinderlähmung, diabetische Neuropathie und die Alterung; periphere Nervensystemerkrankungen wie diabetische periphere Neuropathie und traumatische Nervenstörung; Erkrankungen des kardiovaskulären Systems wie intermittierenden Claudicatio, Schädigung der ischämischen Reperfusion und Schlaganfall; und Abnormalitäten des Immunsystems unter Bedingungen einer geringen Sauerstoffspannung.
Obwohl lange postuliert wurde, daß die Bildung von freien Radikalen die mögliche Verursachung einer ischämischen Störung ist, war es schwer, direkt zu beweisen, daß eine solche Bildung auftrat und/oder daß sie ausreichend ausgesprochen wurde, um die antioxidative Abwehr der Gewebe zu überwinden, wie von Curran et al., Mol. Cell. Biol. 5, 167-172, 1985 berichtet wird.
In vielen Fällen gehen die oxidierten Gewebe eine Schädigung ein, die sogar permanent sein kann, wenn sie ischämisch werden, und werden dann wieder durchblutet.
Molekulare Sauerstoff-Reduktionsprodukte (MORP) werden als für die Zellschädigung während der Ischämie und postischämischen Reperfusion von Organen wie Gehirn, Herz, Darm und Nieren verantwortlich angesehen [Braughler, J. M. und Hall, E. D. (1989) Free Rad. Biol. Med. 6, 289-301].
Darüber hinaus ist bekannt, daß bei Entzündungen, dem Altern und anderen wichtigen biologischen Verfahren MORP Mediatoren und/oder Modulatoren von verschiedenen Zell-Antworten sind [Turner, E., et al. (1988) Science 242, 939-941].
Mehrere therapeutische Protokolle wurden hauptsächlich zur Eliminierung der toxischen Wirkungen von MORP bei biologischen Zielstrukturen wie Zellmembran entwickelt. Die am allgemeinsten angewandte Annäherung ist die Verwendung von Molekülen, die die gutbekannte antioxidative Wirkung von natürlichen Verbindungen nachahmen, die den Teil der sogenannten primären Antioxidationsfront bilden [Bolli, T. (1989) J. Am. Coll. Cariol. 12, 239- 249]. Die hauptsächlich verwendeten Substanzen sind z. B. Superoxiddismutase, ein Enzym, das spezifisch das Superoxid-Anion entfernen kann, und Vitamin E, ein Molekül, das zur Tocopherol-Familie gehört und in der Lage ist, gefährliche oxidative Reaktionen zu unterbrechen, die polyungesäuerte Fettsäuren beeinflussen. In den letzten Jahren erfolgte der Verkauf von OTC-Produkten, worin verschiedene Kombinationen der nichtenzymatischen Antioxidantien (Vitamin E, Vitamin A, Vitamin C, Selen, Glutathion, etc.) vorhanden sind. Natürlich richtet sich diese Art der Annäherung ausschließlich auf die Entfernung von MORP oder anderen reaktiven Molekülen, die durch die Wechselwirkung von MORP mit Makromolekülen vom biologischen Interesse erzeugt werden. Diese Strategie berücksichtigt nicht die biologischen Abnormalitäten, die beginnen, selbst wenn es möglich ist, das ursprüngliche toxische Potential von MORP zu reduzieren. Pathologische Vorfälle mit nicht vorhersehbarem Beginn, wie Organischämie ermöglichen weiterhin häufig keine wirksame therapeutische Intervention, die die antioxidative Wirkung von MORP bewältigen soll. Somit ist es notwendig, den Zellreparationsmechanismus zu sensibilisieren und/oder zu potenzieren, um die toxischen Wirkungen aufgrund der schädigenden Wirkung von MORP zu minimieren.
Der Ausschluß einer direkten Antioxidationswirkung, d. h. vom primären Typ, von L-Carnitin und dessen Estern gegen MORP wurde bereits reichlich bewiesen [Arduini, A. et al. (1990) Free Rad. Res. Commun. 10, 325-332].
Das typische Ziel von MORP während der oxidativen Beanspruchung ist die Plasma-Membran, deren Integrität für das Überleben der Zellen essentiell ist. Die polyungesäuerten Fettsäuren von Membran-Phospholipiden sind insbesondere für die oxidierende Wirkung von MORP empfindlich. Diese Fettsäuren können die peroxidativen Reaktionen fortsetzen, die durch MORP verursacht werden, wodurch die radikalischen Zwischenspezies stabilisiert werden [Mead. J. F. (1976) in "Free Radicals in Biology" (Pryor W. A. Hrsg.) Bd. 1, S. 51-80, Academic Press, New York]. Die Peroxidation der biologischen Membrane kann verschiedene Oxidationsprodukte erzeugen, die signifikante Änderungen der Membranstruktur und -funktion verursachen [Arduini, A. et al. (1989) Arch. Biochem. Biophys. 273, 112-119].
Die hierin beschriebene Erfindung basiert auf der überraschenden synergistischen Wirkung, die zwischen L-Carnitin oder einem Alkanoyl-L- carintin (wie es nachfolgend spezifiziert wird) oder einem pharmakologisch akzeptablen Salz davon und einem lipophilen natürlichen Antioxidans wie Vitamin E oder Vitamin A und/oder einem hydrophilen natürlichen Antioxidans, wie Vitamin C, GSH oder Selen auftritt. Diese synergistische Wirkung ist insbesondere angesichts des oben erwähnten Fehlens einer direkten Antioxidationswirkung von L-Carnitin und den genannten Derivaten überraschend.
Es wurde nun festgestellt, daß die koordinierte Verwendung von L-Carnitin, einem Alkanoyl-L-carnitin oder den pharmakologisch akzeptablen Salzen davon und den genannten Antioxidationsmitteln unter Eliminierung der toxischen Wirkung, die durch MORP gegenüber den biologischen Zielstrukturen der Zellen verursacht werden, nicht nur die Zellschädigung verhindert, sondern ebenfalls das Verfahren der Zellwiederherstellung verstärkt, wodurch ermöglicht wird, daß beachtliche therapeutische Ergebnisse erzielt werden.
Die Alkanoyl-L-carnitine, die für die neue therapeutische Verwendung dieser Erfindung nützlich sind, sind solche, worin die Alkanoyl-Gruppe eine geradkettige oder verzweigte Gruppe mit 2 bis 8, bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
Insbesondere bevorzugt sind Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Valeryl- und Isovaleryl-L-carnitin.
Pharmazeutisch akzeptable Salze von Carnitin oder Alkanoyl-L-carnitin umfassen zusätzlich zu den inneren Salzen alle pharmazeutisch akzeptablen Salze, die durch Zugabe einer Säure zu L-Carnitin hergestellt sind und die keine unerwünschten toxischen oder Nebenwirkungen ergeben.
Die Bildung von pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalzen ist den Experten auf dem pharmazeutischen und Pharmaziegebiet gut bekannt.
Nicht beschränkende Beispiele von geeigneten Salzen umfassen die Chlorid-, Bromid-, Orotat-, sauren Aspartat-, sauren Citrat-, sauren Phosphat-, Fumarat-, sauren Fumarat-, Lactat-, Maleat-, sauren Maleat-, sauren Oxalat-, sauren Sulfat-, Glucosephosphat-, Tartrat- und sauren Tartratsalze.
Der Einfachheit und der Klarheit wegen wird nachfolgend nur auf L-Carnitin Bezug genommen, wobei jedoch zu verstehen ist, daß sich jede Offenbarung im Zusammenhang mit L-Carnitin gleichermaßen auf die oben angegebenen Alkanoyl-L-carnitine und pharmakologisch akzeptablen Salze davon erstreckt.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung erweisen sich insbesondere als wirksam bei der Inhibition der toxischen Wirkung von MORP, indem sie sowohl als primäre als auch sekundäre Antioxidantien agieren, mit dem Ergebnis, daß sie auf dem pharmazeutischen Gebiet zur Verhinderung oder Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Parkinsonkrankheit, zerebrale Kinderlähmung und diabetische Neuropathie; periphere Nervensystemerkrankungen wie diabetische periphere Neuropathie und traumatische Nervenstörung; Erkrankungen des kardiovaskulären Systems wie Schlaganfall, Ischämie-Reperfusionsschädigung und intermettierender Claudicatio; und Schädigung des Immunsystems bei geringer Sauerstoffspannung verwendet werden können.
Die Wirksamkeit der koordinierten Verwendung dieser Erfindung wurde durch verschiedene pharmakologische Versuche bestätigt, von denen einige nachfolgend angegeben werden.

Pharmakologische Versuche

I) Index der oxidativen Störung durch Auswertung von Thiobarbitursäure-Reaktionsprodukten (TBARS), die durch Erythrozyten erzeugt sind Tierbehandlung

Für diese Studie wurden 20 männliche Wistar-Ratten mit einem Alter von 3 Monaten verwendet. Alle Tiere wurden mit einer Mischung aus primären Antioxidantien (200 UI/kg Vitamin E und 30 mg/kg Ascorbinsäure), die oral für 30 aufeinanderfolgende Tage verabreicht wurde, behandelt. In einer Subgruppe von 10 Ratten wurde L-Carnitin (50 mg/kg) zu der Grundbehandlung oral gegeben. Die Studie wurde entsprechend dem offenen experimentellen Design durchgeführt, und die Wahl der Untergruppe der Tiere, die die Kombination aus Antioxidans plus L-Carnitin erhielten, wurde unter Verwendung eines statistischen Verfahrens durchgeführt.

Rotes Blutzellenpräparat

Am Ende der Behandlung wurden venöse Blutproben in Teströhren mit Heparin aufgenommen. Leukozyten und Plättchen wurden über eine chromatographische Säule mit Cellulose und alpha-Cellulose (1 : 1, G/G) entfernt. Die roten Blutzellen wurden dann dreimal mit Salzlösung gewaschen.

Inkubationsbedingungen

Alle Inkubationen erfolgten in einem Oszillationsbad bei 37ºC. Für Experimente mit intakten Zellen wurden die roten Blutzellen ein letztes Mal mit Krebs-Inkubationspuffer (NaCl 120 mM; KCl 5 mM; MgSO&sub4; 1 mM; NaH&sub2;PO&sub4; 1 mM; Sucrose 40 mM; Glucose 5 mM; Tris-HCl 10 mM; pH 7,4) gewaschen und im gleichen Puffer bei einem Hämatokriten von 5% resuspendiert. Die Erythrozyten wurden mit tert-Butylhydroperoxid (t-BOOH), einem chemischen Mittel, das ein lipoperoxidatives Phänomen in der Erythrozyten-Membran erzeugen kann, bei einer Konzentration von 2 mM behandelt. Am Ende der Behandlung mit t-BOOH wurden die Erythrozyten dreimal mit dem Inkubationspuffer gewaschen. Alle Waschungen erfolgten bei 4ºC.

Bestimmung des Indexes der oxidativen Schädigung

Der gewählte oxidative Schädigungsindex war der Thiobarbitursäure- Reaktionsprodukt (TBARS)-Index. Zur Bestimmung und Quantifizierung von durch die Erythrozyten erzeugten TBARS wurde das von Tsun-Yee Chiu and Claster [Methods in Haematology Bd. 19, S. 203-236, Churchill Livingston, New York] beschriebene Verfahren angewandt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 angegeben.

II) Index der oxidativen Beanspruchung durch Auswertung des Verhältnisses von Phosphatidylethanolamin/Sphingomyelin

Tiere wurden wie beim vorhergehenden Test behandelt und die roten Blutzellen ebenso hergestellt. Die Inkubationsbedingungen waren ebenfalls identisch zu denen des oben genannten Tests.

Extraktion und Trennung von Phospholipiden

Die Lipid-Komponenten der Erythrozyten-Membran wurden entsprechend dem Verfahren von Rose und Oklander [Rose, H. G. und Oklander, M., 3. Lipid Res. (1965) 6 : 428-431] extrahiert. Zur Verhinderung des oxidativen Phänomens wurde Butylhydroxytoluol (BHT 0,1%) zu den Extraktions-Lösungsmitteln gegeben. Der Lipid-Extrakt wurde unter Stickstofffluß getrocknet und mit Toluol resuspendiert. Zur Trennung der individuellen Phospholipid-Klassen wurde eine zweidimensionale Dünnschichtchromatographie verwendet [Rouser, G. et al., Lipids (1970) 5: 494-496]. Die Phospholipid-Klassen wurden mit Joddämpfen hervorgehoben. Die individuellen Phospholipid-Klassen wurden durch Verwendung von Standards identifiziert. Die Bestimmung von in den individuellen Phospholipid-Klassen vorhandenem Phosphor erfolgte gemäß Bottcher [Bottcher, C. J. F. et al., Anal. Chim. Acta (1961) 24 : 203-208).
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.

III) Hämolyse während der oxidativen Beanspruchung

Tiere wurden wie beim obengenannten Test behandelt und die roten Blutzellen ebenso hergestellt. Die Inkubationsbedingungen waren ebenfalls denen des vorher genannten Tests identisch.

Hämolysebestimmung

Die Erythrozytenhämolyse wurde durch Messen der Hämoglobin-Menge während der Inkubation mit dem Oxidationsmittel ausgewertet.
Am Ende der Inkubation wurden die Erythrozyten zentrifugiert, und die Crusta Phlogistika wurde zur Bestimmung von Hämoglobin verwendet, das während der oxidativen Beanspruchung freigesetzt wurde.
Die Hämoglobinbestimmung erfolgte spektrophotometrisch entsprechend dem Verfahren von Winterbourn, C. Handbook of Methods for Oxygen Radical Research (Hrsg. R. Greenward), S. 13-41, CRC Press, Boca Raton, 1985.
Die Ergebnisse sind in Fig. III dargestellt.
Die Zugabe von L-Carnitin zu der antioxidativen Mischung vermindert signifikant die oxidative Schädigung der Zellmembran. Die Quantität von TBARS wurde in Erythrozyten, die von den Ratten erhalten wurden, die mit L-Carnitin und den Antioxidantien behandelt wurden, im Vergleich zu jenen signifikant vermindert, die mit den Antioxidantien allein behandelt wurden (Fig. 1). Nach der oxidativen Beanspruchung wurde das Verhältnis von Phosphatidylethanolamin/Sphingomyelin der Erythrozyten in den nur mit Antioxidantien behandelten Tieren in einem größeren Ausmaß vermindert als bei den Erythrozyten, die mit Antioxidantien plus L-Carnitin behandelt wurden (Fig. 2). Schließlich wurde die Hämolyse, die während der oxidativen Beanspruchung gemessen wurde, in den Erythrozyten der Tiere, die nur mit Antioxidantien behandelt wurden, im Vergleich zu jenen, die mit Antioxidantien plus L-Carnitin behandelt wurden, signifikant erhöht (Fig. 3).
Eine angemessene pharmazeutische Zusammensetzung in Einheitsdosierungsform umfaßt ungefähr 0,3 bis ungefähr 0,5 g L-Carnitin oder eine äquivalente Menge an Alkanoyl-L-carnitin oder deren pharmakologisch akzeptablen Salzen und ungefähr 50 bis ungefähr 2000 U/I oder bevorzugt ungefähr 300 bis ungefähr 1000 U/I Vitamin E und/oder ungefähr 50 bis ungefähr 500 mg oder bevorzugt ungefähr 100 bis 300 mg Vitamin C.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können weiterhin Polyphenole, Anthocyanine, Anthocyanoside, Mineralsalze und pflanzliche Fasern enthalten.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele zeigen einige erfindungsgemäße Zusammensetzungen.

Beispiele

1) L-Carnitin 500 mg; Vit. E 1000 U/I; Vit. C 300 mg
2) Acetyl-L-carnitin 500 mg; Vit. E 1000 U/I; Vit. C 300 mg
3) Propionyl-L-carnitin 500 mg; Vit. E 1000 U/I; Vit. C 300 mg
4) Isovaleryl-L-carnitin 500 mg; Vit. E 1000 U/I; Vit. C 300 mg
5) Valeryl-L-carnitin 500 mg; Vit. E 1000 U/I; Vit. C 300 mg
6) Butyryl-L-carnitin 500 mg; Vit. E 1000 U/I; Vit. C 300 mg
7) L-Carnitin 500 mg; Vit. A 1000 mg; Vit. C. 300 mg
8) Acetyl-L-carnitin 500 mg; Vit. A 1000 mg; Vit. C 300 mg
9) Propionyl-L-carnitin 500 mg; Vit. A 1000 mg; Vit. C. 300 mg
10) Isovaleryl-L-carnitin 500 mg; Vit. A 1000 mg; Vit. C. 300 mg
11) Valeryl-L-carnitin 500 mg; Vit. A. 1000 mg; Vit. C. 300 mg
12) Butytryl-L-carnitin 500 mg; Vit. A. 1000 mg; Vit. C. 300 mg
13) L-Carnitin 500 mg; Vit E 1000 U/I; GSH 500 mg
14) L-Carnitin 500 mg; Vit. E 1000 U/I; Vit. C. 300 mgM GSH 500 mg
15) L-Carnitin 500 mg; Vit. A 100 mg; Vit. C 300 mg; Selen 40 mg.

Claims

1. Verwendung von:

a) L-Carnitin oder einem Alkanoyl-L-carnitin, ausgewählt aus Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Valeryl- und Isovaleryl-L-carnitin oder die pharmakologisch akzeptablen Salze davon in Kombination und Zumischung mit

b) einem lipophilen Antioxidans, ausgewählt aus Vitamin E und Vitamin A, und/oder

c) einem hydrophilen Antioxidans, ausgewählt aus Vitamin C, Glutathion (GSH) und Selen,

zur Herstellung einer oral, parenteral, rektal oder transdermal verabreichbaren Zusammensetzung, die eine synergistische Wirkung im Hinblick auf die antioxidative Wirkung des lipophilen und/oder hydrophilen Antioxidans entfalten kann, zur Verhinderung und Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Parkinson, Trauma, zerebraler Kinderlähmung, diabetischen Neuropathiestörungen, Erkrankungen des peripheren Nervensystems wie diabetische periphere Neuropathie und traumatische Nervenschädigung; Erkrankungen des kardiovaskulären Systems wie intermittierenden Claudicatio, ischämische Reperfusionsschädigung und Schlaganfall.

2. Oral, parenteral, rektal oder transdermal verabreichbare Zusammensetzung zur Verhinderung und Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Parkinson, Trauma, zerebraler Kinderlähmung, diabetischen Neuropathiestörungen, Erkrankungen des peripheren Nervensystems wie diabetische periphere Neuropathie und traumatische Nervenschädigung; Erkrankungen des kardiovaskulären Systems wie intermittierenden Claudicatio, ischämische Reperfusionsschädigung und Schlaganfall umfassend:

a) ein Alkanoyl-L-carnitin, ausgewählt aus Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Valeryl- und Isovaleryl-L-carnitin oder ein pharmakologisch akzeptables Salz davon in Kombination und Zumischung mit

c) einem hydrophilen Antioxidans, ausgewählt aus Vitamin C, Glutathion (GSH) und Selen.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2 in Einheitsdosierungsform, umfassend 0,3 bis 0,5 g eines Alkanoyl-L-carnitins und 50 bis 2000, bevorzugt 300 bis 1000 U/I Vitamin E.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2 in einer Einheitsdosierungsform, umfassend 0,3 bis 0,5 g L-Carnitin oder ein Alkanoyl-L-carnitin und 300 bis 500 mg Vitamin C.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 2, umfassend:

i) 500 mg eines Alkanoyl-L-carnitins, ausgewählt aus Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Valeryl- und Isovaleryl-L-carnitin;

ii) 1000 U/I Vitamin E; und

iii) 300 mg Vitamin C.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 2, umfassend:

ii) 1000 U/I Vitamin A; und

iii) 300 mg Vitamin C.

7. Oral, parenteral, rektal oder transdermal verabreichbare Zusammensetzung zur Verhinderung und Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Parkinson, Trauma, zerebraler Kinderlähmung, diabetischen Neuropathiestörungen und Altern, Erkrankungen des peripheren Nervensystems wie diabetische periphere Neuropathie und traumatische Nervenschädigung; Erkrankungen des kardiovaskulären Systems wie intermittierenden Claudicatio, ischämische Reperfusionsschädigung und Schlaganfall, umfassend:

i) 500 mg L-Carnitin;

ii) 500 mg GSH;

iii) 1000 U/I Vitamin E.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, weiterhin umfassend 300 mg Vitamin C.

9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend Polyphenole, Anthocyanine, Anthocyanoside, Mineralsalze und pflanzliche Fasern.