DE69634558T2

DE69634558T2 - Verfahren zur analyse von allergenen

Info

Publication number: DE69634558T2
Application number: DE69634558T
Authority: DE
Inventors: Tadashi Fuchu-shi MATSUNAGA
Original assignee: Asahi Denka Kogyo KK
Current assignee: Adeka Corp
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2016-09-21
Also published as: DE69634558D1; EP0794434B1; EP0794434A4; WO1997011368A1; EP0794434A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung auf ein Allergen. Erfindungsgemäß kann ein Allergen in einer Probe immunologisch untersucht werden, indem ein markierter Antikörper und ein einfaches Verfahren zum Abtrennen eines Komplexes aus dem Allergen und dem markierten Antikörper durch Ionenaustauschchromatographie angewendet wird und die Signale von dem abgetrennten Komplex aus dem Allergen und dem markierten Antikörper gemessen werden.
STAND DER TECHNIK FÜR DIE ERFINDUNG
Allergien sind heutzutage ein ernsthaftes soziales Problem geworden, und die Verhütung oder Behandlung von Allergien hat beträchtliche Aufmerksamkeit gewonnen. So sind beispielsweise Allergen-reduzierte oder Allergenfreie Lebensmittel für Patienten, die an einer Lebensmittelallergie leiden, als ein Mittel zur Verhütung oder Behandlung von Allergien entwickelt worden. Dementsprechend ist eine Untersuchung auf Allergene in Lebensmitteln oder dergleichen ein sehr wichtiger technischer Gegenstand geworden.
Verfahren, die üblicherweise zur Messung eines Allergens in einem Lebensmittel angewendet werden, umfassen beispielsweise einen RAST (Radioallergosorbens-Test), in welchem ein mit einem radioaktiven Isotop markierter Antikörper verwendet und eine Allergen-Antikörper-Reaktion indirekt gemessen wird, einen ELISA (enzyme linked immuno-sorbent assay), in welchem ein mit einem Enzym markierter Antikörper verwendet und eine Allergen-Antikörper-Reaktion indirekt gemessen wird, und eine PCA (passive kutane Anaphylaxie), in welcher eine allergische Reaktion im in-vivo-Maßstab auf der Haut von Ratten detektiert wird. Dennoch sind, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten, die Vorgänge in diesen Verfahren umständlich und zeitraubend (einige Stunde bis zu 1 Tag). Weiterhin ist es notwendig, wenn viele Proben zu untersuchen sind, die Proben in Gruppen aufzuteilen und chargenweise zu behandeln, weshalb ein solches Verfahren noch umständlicher wird.
In EP 0 357 869 A1 ist die Reaktion eines Analyten, beispielsweise eines Antigens, in einer Probe mit einer Substanz, die gegenüber dem Analyten eine Affinität hat, beispielsweise einem Antikörper, um ein Reaktionsgemisch zu erhalten, beschrieben. Danach wird der freie Antikörper von dem Komplex aus dem Antigen und dem Antikörper durch HPLC auf der Basis unterschiedlicher Elutionszeiten abgetrennt.
Wie weiter oben festgestellt, gab es bisher noch kein geeignetes Verfahren für die schnelle und einfache Messung von in Lebensmitteln enthaltenen Allergenen, weshalb die Qualitätskontrolle, die bei der Herstellung von Lebensmitteln für Patienten, die an einer Lebensmittelallergie leiden, erforderlich ist, ein Problem war. Ein Verfahren zum elektrochemischen Nachweis eines Allergens, in welchem eine tierische Zelle und Serotonin verwendet werden, das ein chemischer Mediator einer allergischen Reaktion ist und als ein Marker verwendet wird, ist in der ungeprüften japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 6-288976 offenbart.
Deshalb liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Allergens bereitzustellen, das gegenüber herkömmlichen Verfahren zur Untersuchung auf ein Allergen einfacher und schneller ist.
Weiterhin liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das die Vorbereitung tierischer Zellen, im Gegensatz zu dem zuvor beschriebenen elektrochemischen Detektionsverfahren, nicht erfordert.
Weitere erfindungsgemäße Aufgaben und Vorteile werden anhand der folgenden Beschreibung erläutert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Aufgabe kann durch die Erfindung gelöst werden, die ein Verfahren zur Untersuchung auf ein Allergen betrifft, das die Stufen:

1) In-Berührung-Bringen einer Probe, die möglicherweise ein zu untersuchendes Allergen enthält, mit einem für das zu untersuchende Allergen spezifischen markierten Antikörper unter Bedingungen, bei welchen eine Antigen-Antikörper-Reaktion des zu untersuchenden Allergens mit dem markierten Antikörper stattfinden kann,
2) Entfernen des nicht an das zu untersuchende Allergen gebundenen, markierten Antikörpers aus einem Reaktionsgemisch durch Ionenaustauschchromatographie, um dadurch einen eluierten Komplex aus dem zu untersuchenden Allergen und dem markierten Antikörper zu erhalten, wobei die Ionenaustauschchromatographie unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass der Komplex aus zu untersuchendem Allergen und dem markierten Antikörper zu erhalten, wobei die Ionenaustauschchromatographie unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass der Komplex aus zu untersuchendem Allergen und markiertem Antikörper an einen Ionenaustauscher nicht innerhalb eines Bereichs adsorbiert wird, in welchem der nicht umgesetzte markierte Antikörper an den Ionenaustauscher adsorbiert wird, und
3) Messen eines Signals des eluierten Komplexes aus dem zu untersuchenden Allergen und dem markierten Antikörper

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In den Figuren zeigt
1 eine Strukturformel des Fluoresceinisothiocyanats (FITC),
2 eine Gleichung der Reaktion von FITC mit einem IgE-Antikörper,
3 ein Diagramm, in welchem die Veränderung der Menge von (DNP-BSA)-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten im Laufe der Zeit dargestellt ist,
4 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von (DNP-BSA)-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten FITC-markierten IgE-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
5 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von (DNP-BSA)-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten markierten IgE-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
6 ein Diagramm, in welchem die Reaktionsspezifität eines FITC-markierten Anti-DNP-IgE-Antikörpers dargestellt ist,
7 eine Standardkurve, durch welche die quantitative Veränderung der Fluoreszenzstärke, die von einem (DNP-BSA)-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugat abgeleitet ist, dargestellt ist,
8 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Weizenallergen-alkalische-Phosphatase-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgE-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
9 eine Standardkurve, durch welche die quantitative Veränderung der Fluoreszenzstärke, die von einem Weizenallergen-alkalische-Phosphatase-markierten-IgE-Antikörper-Konjugat abgeleitet ist, dargestellt ist,
10 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von (β-Lactoglobulin)-alkalische-Phosphatase-markierten-IgG-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgG-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
11 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Eiallergen-alkalische-Phosphatase-markierten-IgG- Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgG-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
12 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Reisallergen-alkalische-Phosphatase-markierten-IgG-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgG-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
13 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Weizenallergen-alkalische-Phosphatase-markierten-IgG-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgG-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
14 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Buchweizen-(Soba-)Allergen-alkalische-Phosphatasemarkierten-IgG-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgG-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
15 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Sojabohnenallergen-alkalische-Phosphatase-markierten-IgG-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgG-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
16 eine Standardkurve, durch welche die quantitative Veränderung der Fluoreszenzstärke, die von einem (β-Lactoglobulin)-alkalische-Phosphatase-markierten-IgE-Antikörper-Konjugat abgeleitet ist, dargestellt ist,
17 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von (β-Lactoglobulin)-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgE-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
18 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Eiallergen-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgE-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
19 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Reisallergen-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgE-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
20 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Weizenallergen-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgE-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
21 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Buchweizenallergen-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgE-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
22 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von Sojabohnenallergen-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit alkalischer Phosphatase markierten IgE-Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie dargestellt ist,
23 eine Standardkurve, durch welche die quantitative Veränderung der Fluoreszenzstärke, die von (DNP-BSA)-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten abgeleitet ist, die kontinuierlich auf eine Säule aufgegeben werden, dargestellt ist, und
24 ein Diagramm, in welchem die Abtrennung von (DNP-BSA)-FITC-markierten-IgE-Antikörper-Konjugaten von nicht umgesetzten mit FITC markierten IgE-Antikörpern durch Anionenaustauschchromatographie dargestellt ist.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird anschließend näher erläutert.
Die Probe, die durch das erfindungsgemäße Verfahren untersucht werden kann, ist nicht besonders beschränkt, solange die Möglichkeit besteht, dass sie ein Allergen enthält. Beispiele dafür sind fast alle Lebensmittel, die wahrscheinlich von Patienten verzehrt werden, die an einer Allergie leiden, beispielsweise Milchprodukte (wie Milch, Käse oder Joghurt), Eier (wie Hühnereier), Körner (wie Weizen oder Reis), Bohnen (wie Sojabohnen), Gemüse, Obst, Fisch, Algen, Fleisch oder verarbeitete Lebensmittel daraus, Pollen (wie Pollen von Zedern, Reis oder Greiskraut), Arzneimittel (wie Impfstoffe oder Penicillin), Tierhaare (wie von Hund oder Katze), Zecken (wie Dermatophagoides farinae oder Dermatophagoides pteronyssinus), Insekten (wie Mücken), Schimmel (wie Candida), Fasermaterialien (wie Seide) oder Hausstaub. Das erfin dungsgemäße Verfahren ist besonders für die Untersuchung von Lebensmitteln geeignet.
Eine flüssige Probe kann ohne weitere Behandlung, nach Verdünnung oder Extraktion mit einer geeigneten Flüssigkeit, beispielsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder ein Puffer, verwendet werden. Eine feste Probe kann nach Verdünnung oder Extraktion mit einer geeigneten Flüssigkeit, beispielsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder ein Puffer, verwendet werden.
Das Allergen, das durch das erfindungsgemäße Verfahren untersucht werden kann, ist nicht beschränkt, solange es ein solches ist, das eine Allergosie verursacht. So sind beispielsweise in verschiedenen Lebensmitteln enthaltene Proteine wie β-Lactoglobulin oder Ovomucoid zu nennen. Proteine, die nicht als Allergen isoliert worden sind, können in Form eines Lebensmittelextrakts untersucht werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst ein Antikörper hergestellt, der gegenüber dem zu untersuchenden Allergen spezifisch ist.
Die Immunoglobulinklasse der Antikörper, die gegenüber dem zu untersuchenden Allergen spezifisch sind, ist nicht beschränkt, sondern es können beispielsweise IgG, IgE, IgA, IgD oder IgM und vorzugsweise IgG oder IgE verwendet werden. Unter dem Gesichtspunkt der Einfachheit der Herstellung des Antikörpers ist IgG bevorzugt und unter dem Gesichtspunkt einer höheren Sensitivität der allergischen Reaktion ist IgE bevorzugt.
Der für das zu untersuchende Allergen spezifische Antikörper kann entsprechend einem bekannten geeigneten Verfahren hergestellt werden. So kann beispielsweise ein Antiserum einem immunisierten Tier (insbesondere einem Säugetier wie einer Ratte, Maus oder einem Kaninchen) nach Immunisierung des Tieres durch parenterale Verabreichung des zu untersuchenden Allergens als Immunogen für das Tier entnommen werden. Weiterhin kann ein monoklonaler Antikörper hergestellt werden, indem dem immunisierten Tier Milzzellen entnommen und mit Myelomzellen fusioniert werden. Darüber hinaus kann ein Proteinextrakt aus einem Material (wie Lebensmittel oder Pollen), das Allergien verursacht, als Immunogen verwendet werden, um ein Antiserum herzustellen, woraus ein Anti-Weizenallergen-Antikörper oder ein Anti-Zederpollenallergen-Antikörper hergestellt werden kann.
Der erhaltene Antikörper kann durch bekannte Verfahren markiert werden. Dabei ist die Markierung, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, nicht besonders beschränkt. So kann beispielsweise eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein radioaktives Material verwendet werden.
In einem Fluoreszenzversuch, in welchem die fluoreszierende Verbindung als Markierung verwendet wird, braucht nur Licht mit einer anregenden Wellenlänge auf die Probe gesendet zu werden, weshalb die Untersuchung innerhalb einer kürzeren Zeit beendet werden kann. Eine Emissionsanalyse unter Verwendung des Enzyms hat eine überlegene Sensitivität. Ein Versuch, in welchem ein radioaktives Material verwendet wird, hat eine überlegene Versuchszeit und Sensitivität. Dementsprechend variiert im erfindungs gemäßen Verfahren die Markierung mit dem zu untersuchenden Objekt oder einer quantitativen Beschränkung.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können fluoreszierende Verbindungen, die im Allgemeinen in einem immunologischen Assay eingesetzt werden, verwendet werden. Als Verbindung, die als eine Markierung durch Bindung an eine Aminogruppe eines Proteins verwendet werden kann, sind beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat (anschließend mitunter als FITC abgekürzt), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TMRITC), Dansylchlorid, Rhodaminisothiocyanat, Fluorescamin und Chlornitrobenzoxadiazol zu nennen. Als Verbindung, die als Markierung durch Bindung an eine Thiolgruppe eines Proteins verwendet werden kann, sind (Iodacetylaminoethyl)nephthylaminschwefelsäure (AEANS), Difluoresceincystin, Fluoresceinquecksilberessigsäure oder S-Quecksilber-N-dansylcystein zu nennen.
Als Enzym kann eines für eine Emission, das im Allgemeinen in einem immunologischen Assay eingesetzt wird, verwendet werden. Das Enzym wird in Kombination mit einem Substrat und einer färbenden Verbindung auf bekannte Weise verwendet. Als Enzym sind beispielsweise alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase, Meerrettichperoxidase oder Catechol-o-methyltransferase zu nennen.
Als radioaktives Material kann eines, das im Allgemeinen in einem immunologischen Assay eingesetzt wird, verwendet werden. Beispiele für das radioaktive Material sind ¹²⁵I bzw. ¹³¹I.
Von den zuvor genannten fluoreszierenden Verbindungen und den Enzymen für eine Emission ist Fluoresceinisothiocyanat (FITC) besonders bevorzugt, da es stabil ist, keine Aktivität des Antikörpers hemmt, sich leicht markieren lässt, eine gute Löslichkeit und spektroskopisch vorteilhafte Eigenschaften hat, nämlich, dass die maximale Absorptionswellenlänge weit von der maximalen Fluoreszenzwellenlänge entfernt ist. Die Struktur des FITC ist in 1 gezeigt.
Die zuvor genannten Markierungen lassen sich durch bekannte geeignete Verfahren an den Antikörper binden.
So reagieren beispielsweise, wenn FITC mit einem Antikörper (Protein) unter alkalischen Bedingungen umgesetzt wird, Isothiocyanatgruppen des FITC mit Aminogruppen des Antikörpers, hauptsächlich Aminogruppen in Lysingruppen, wobei sich stabile Dicarbamidbindungen bilden. Das Reaktionsschema ist in 2 gezeigt.
Deshalb kann, wenn FITC als fluoreszierende Markierung verwendet wird, die Inkubation unter alkalischen Bedingungen, vorzugsweise bei pH 8 bis 9, zwei Stunden oder länger, vorzugsweise zwei bis acht Stunden lang, bei Raumtemperatur oder darunter, vorzugsweise 15 bis 25°C, oder über Nacht oder länger, vorzugsweise acht bis 20 Stunden lang, bei etwa 4°C derart durchgeführt werden, dass das Molverhältnis von FITC zu Antikörper vorzugsweise 3 bis 5:1 wird.
Die Markierung des Antikörpers mit dem für die Emission vorgesehenen Enzym kann durch ein bekanntes geeignetes Verfahren durchgeführt werden. So ist beispielsweise ein Verfahren zum Modifizieren des Antikörpers durch reduzierende Hydroxygruppen in Zuckerketten des Enzyms und Bildung von Schiffschen Basen mit Aminogruppen des Antikörpers oder ein Verfahren, in welchem Disulfidbindungen in der Gelenkregion des Antikörpers reduziert und die Aminogruppen des Enzyms danach mit den gebildeten Thiolgruppen gebunden oder vernetzt werden, bekannt. In diesen Verfahren ist es bevorzugt, ein Vernetzungsmittel zu verwenden, da eine sterische Behinderung zwischen dem für die Emission vorgesehenen Enzym und dem Antikörper vermindert und die Schwankung des Bindungsmolverhältnisses von Antikörper zu dem für die Emission vorgesehenen Enzym verringert wird. Dabei ist das Vernetzungsmittel nicht besonders beschränkt, wobei jedoch beispielsweise N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) verwendet werden kann.
Die Markierung mit dem radioaktiven Material kann durch ein bekanntes geeignetes Verfahren wie das Chloramin-T-Verfahren durchgeführt werden. Insbesondere wird der Antikörper im Allgemeinen in einem Puffer mit dem pH-Wert 7 gelöst und radioaktives Iod zugegeben. Zu der erhaltenen Lösung wird eine Lösung von Chloramin T (N-Chlor-p-toluolsulfonamid) (500 μg/ml) mit einem Anteil von 10 mg Chloramin T auf 1 mg Antikörper zugegeben und die radioaktive Iodierung 10 Minuten lang durchgeführt. Danach wird Natriumthiosulfat (10 μg/1 mg Antikörper) zugegeben, um die Umsetzung zu unterbrechen, und nicht umgesetztes radioaktives Iod durch Dialyse entfernt.
Die markierten Antikörper werden dann von den nicht umgesetzten Markierungen abgetrennt und gereinigt. Als Abtrennungs- und Reinigungsverfahren kann ein beliebiges geeignetes Verfahren wie die Dialyse oder die Gelpermeationssäulenchromatographie angewendet werden.
So kann beispielsweise der mit FITC markierte Antikörper durch Behandlung der Reaktionsflüssigkeit, welche die FITC-markierten Antikörper nach Inkubation enthält, durch Dialyse mit einem Puffer mit einem neutralen bis etwa alkalischen pH-Wert, vorzugsweise einem pH-Wert von 6 bis 9, um das nicht umgesetzte FITC zu entfernen, aufgereinigt werden. Alternativ können die FITC-markierten Antikörper von dem nicht umgesetzten FITC durch Gelpermeationssäulenchromatographie abgetrennt werden. Wird die Abtrennung durch Gelpermeationssäulenchromatographie durchgeführt, kann ein vernetzender Träger mit einer derartigen Porengröße, dass das FITC (Molekulargewicht = 389,4) und der Antikörper (Molekulargewicht von IgE = etwa 180 000, Molekulargewicht von IgG = etwa 150 000) getrennt werden können, als Gelpermeationsträger verwendet werden. Der vernetzende Träger kann beispielsweise ein Dextranpolymer, Agarose, Polyacrylamid oder ein Agarose-Polyacrylamid-Gemisch sein. Als mobile Phase kann ein neutraler oder alkalischer Puffer, vorzugsweise ein solcher mit einem pH-Wert von 7 bis 8, beispielsweise ein Malonat-, Phosphat-, Carbonat-, Citrat-Natriumhydroxid-, Acetat-, Borat-Natriumhydroxid-, Glycin-Natriumhydroxid- und Tris-Hydrochlorid-Puffer verwendet werden. Die FITC-markierten Antikörper können durch Messung der Absorption des Eluats aus der Gelpermeationssäulenchromatographie bei 280 nm bei einer vom Antikörper abgeleiteten Ultraviolettabsorption und bei 520 nm bei einer von FITC-ausgehenden Fluoreszenzabsorption gemessen werden, wobei dann die Fraktion genommen wird, bei welcher sich die Peaks überlappen.
Der FITC-markierte Antikörper, der durch Aufreinigung durch Dialyse oder Gelpermeationssäulenchromatographie hergestellt wird, hat kein konstantes Bindungsmolverhältnis (FITC/Antikörper) von FITC zu Antikörper, sondern ist ein Gemisch aus den markierten Antikörpern mit verschie denen Bindungsmolverhältnissen. Deshalb ist es nach dieser Aufreinigung durch Dialyse oder Gelpermeationssäulenchromatographie bevorzugt, das aufgereinigte Produkt durch Anionenaustauschchromatographie zu fraktionieren und dadurch ein Produkt mit einem konstanten Bindungsmolverhältnis (FITC/Antikörper) von FITC zu Antikörper zu erhalten. Wird der markierte Antikörper mit einem konstanten Bindungsmolverhältnis verwendet, können zuverlässigere Daten erhalten werden, verglichen mit Daten, die aus dem Gemisch aus den markierten Antikörpern mit verschiedenen Bindungsmolverhältnissen erhalten werden. Dabei ist dieses Bindungsmolverhältnis per se nicht besonders beschränkt, beträgt aber vorzugsweise 1 bis 2.
Beispiele für einen Anionenaustauschträger, der verwendet werden kann, sind ein schwacher Anionenaustauschträger, der Agarosekügelchen als Träger enthält, ein Träger mit Diethylaminoethyl-(DEAE-)Gruppen, ein Träger mit Cellulosegel als Träger oder ein Träger mit Dextran als Träger. Als mobile Phase kann ein neutraler oder schwach alkalischer Puffer, vorzugsweise ein Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 8, beispielsweise ein Malonat-, Phosphat-, Carbonat-, Citrat-Natriumhydroxid-, Acetat-, Borat-Natriumhydroxid-, Glycin-Natriumhydroxid- und Tris-Hydrochlorid-Puffer verwendet werden.
Die Abtrennung des mit dem Enzymmarkierten Antikörpers von dem nicht umgesetzten Enzym oder des mit dem radioaktiven Material markierten Antikörpers von dem nicht umgesetzten radioaktiven Material kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren wie die Dialyse oder Gelpermeationsäulenchromatographie durchgeführt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren umfasst die nächste Stufe das In-Berührung-Bringen der Probe, die möglicherweise das zu untersuchende Allergen enthält, mit dem markierten Antikörper.
Wie weiter oben erwähnt, ist die Probe, die möglicherweise das zu untersuchende Allergen enthält, ein ganz unterschiedliches Material, das ein an einer Allergie leidender Patient vorfinden kann, insbesondere Lebensmittel, die ein an einer Allergie leidender Patient isst, beispielsweise Milchprodukte, Eier, Weizen oder verarbeitete Lebensmittel davon. Dabei wird die Probe mit dem markierten Antikörper in beispielsweise einer schwach sauren bis schwach alkalischen Flüssigkeit, vorzugsweise in einer Flüssigkeit mit einem pH-Wert von 5 bis 9, in Berührung gebracht. So ist es beispielsweise bevorzugt, wenn fester Weizen untersucht wird, die Probe durch Behandlung mit einer 0,5 M (oder niedrigerer) Kochsalzlösung vorzubereiten, um die Proteine zu solubilisieren. Wenn die zu untersuchende Flüssigkeit vergorene Milch ist, ist es bevorzugt, die Probe durch Einstellung des pH-Werts vorzubehandeln.
Die Probe wird mit dem markierten Antikörper unter Bedingungen in Berührung gebracht, dass eine Antigen-Antikörper-Reaktion des in der Probe zu untersuchenden Allergens mit dem markierten Antikörper stattfinden kann. So können beispielsweise die Probe und der markierte Antikörper unter schwach sauren bis schwach alkalischen Bedingungen, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 5 bis 9, bei 37°C oder darunter, vorzugsweise 25 bis 37°C, 20 Minuten oder länger und vorzugsweise 20 bis 30 Minuten lang inkubiert werden. Insbesondere sollten Bedingungen gewählt werden, dass der Antikörper oder das Enzym im markierten Antikörper nicht deaktiviert und die Markierung nicht freigesetzt wird.
So wird beispielsweise, wenn ein aufgereinigter FITC-markierter Antikörper verwendet wird, ein Gemisch aus dem FITC-markierten Antikörper und der Probe bei 37°C oder darunter, vorzugsweise 25 bis 37°C, 20 Minuten und vorzugsweise 20 bis 30 Minuten lang inkubiert, sodass der Antikörper nicht deaktiviert wird.
Wenn die Probe mit dem markierten Antikörper in Berührung gebracht wird, beispielsweise durch Inkubieren, wie zuvor beschrieben, bildet sich ein Konjugat aus dem Allergen und dem markierten Antikörper in der Reaktionsflüssigkeit im Verhältnis zu der in der Probe vorhandenen Menge des Allergens, falls das zu untersuchende Allergen darin vorhanden ist.
Im erfindungsgemäßen Verfahren besteht die anschließende Stufe in einer Behandlung der resultierenden Reaktionsflüssigkeit durch Ionenaustauschchromatographie, um das Allergen-markierte-Antikörper-Konjugat von dem nicht umgesetzten markierten Antikörper abzutrennen.
Die Ionenaustauschchromatographie, die erfindungsgemäß angewendet werden kann, ist nicht besonders beschränkt. Es sollte ein Ionenaustauscher ausgewählt werden, der den nicht umgesetzten markierten Antikörper in Relation zu dem isoelektrischen Punkt des verwendeten markierten Antikörperproteins und zu dem pH-Wert des als mobile Phase eingesetzten Puffers adsorbieren kann. So ist beispielsweise, wenn der isoelektrische Punkt des verwendeten markierten Antikörpers 7 und der pH-Wert des als mobile Phase verwendeten Puffers 5 beträgt, der markierte Antikör per positiv geladen. Deshalb wird ein Kationenaustauscher verwendet. Wird ein Kationenaustauscher verwendet, ist es notwendig, einen Puffer mit einem pH-Wert von über 7 als mobile Phase zu verwenden und dem markierten Antikörper eine negative Ladung mitzuteilen. Weiterhin ist, wenn die Markierung ein Enzym ist, darauf zu achten, sicherzustellen, dass der Ionenaustauscher den markierten Antikörper auf der Seite des Enzyms nicht adsorbiert, wobei insbesondere der isoelektrische Punkt des Enzyms, mit welchem der Antikörper markiert ist, zu berücksichtigen ist. Im Allgemeinen ist ein Antikörper gegenüber Alkalien nicht beständig. Deshalb ist es bevorzugt, einen Kationenaustauscher zu verwenden, in welchem eine saure mobile Phase eingesetzt wird, um die Aktivität des Antikörpers aufrecht zu erhalten. Dabei ist es möglich, den optimalen pH-Wert des als mobile Phase verwendeten Puffers einzustellen, wobei die Kombination aus dem isoelektrischen Punkt des markierten Antikörpers und einem Austausch-pH-Bereich des Ionenaustauschers berücksichtigt wird. In diesem Fall ist es erforderlich, sicherzustellen, dass die Bedingungen derart sind, dass eine Deaktivierung von Antikörper oder Markierung, Freisetzung der Markierung aus dem Antikörper und/oder Dissoziierung des Allergen-Antikörper-Konjugates bei dem pH-Wert des Puffers nicht stattfinden. Weiterhin sind die Bedingungen so zu wählen, dass das Allergen-Antikörper-Konjugat an den Ionenaustauscher in dem Bereich nicht adsorbiert wird, in welchem der nicht umgesetzte markierte Antikörper am Ionenaustauscher adsorbiert wird. Wenn der Antikörper an das Allergen bindet, um das Konjugat zu bilden, ändert sich die Ladung des Antikörpers, weshalb die Differenz der elektrostatischen Kräfte zwischen dem Antikörper und dem Ionenaustauscher kleiner oder die Ladung des Antikörpers umgekehrt wird. Deshalb wird das Adsorptionsvermögen zwi schen dem Konjugat und dem Ionenaustauscher geringer als das zwischen dem markierten Antikörper und dem Ionenaustauscher, weshalb es möglich ist, den markierten Antikörper an den Ionenaustauscher zu adsorbieren und ausschließlich das Konjugat zu eluieren.
Der Kationenaustauschträger, der erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist nicht besonders beschränkt, er kann beispielsweise hergestellt werden, indem eine Kationenaustauschgruppe, die aus verschiedenen funktionellen Gruppen wie einer Carboxymethyl-, Sulfomethyl-, Sulfoethyl- oder Phosphorsäuregruppe ausgewählt ist, in einen Träger wie Agarosekügelchen, Cellulosegel oder Dextran eingeführt wird. Als mobile Phase kann ein schwach saurer Puffer, vorzugsweise ein Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 6, beispielsweise ein Malonat-, Phosphat-, Carbonat-, Citrat-Natriumhydroxid- oder Acetatpuffer, verwendet werden.
Der Anionenaustauscher, der erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist nicht besonders beschränkt, er kann hergestellt werden, indem eine Anionenaustauschgruppe wie eine Aminoethyl-, Diethylaminoethyl- oder Guanidinoethylgruppe in den zuvor genannten Träger eingeführt wird.
Wenn die Reaktionsflüssigkeit, die in der obigen Stufe des In-Berührung-Bringens erhalten worden ist, durch Ionenaustauschchromatographie behandelt wird, wird ausschließlich das Allergen-markierter-Antikörper-Konjugat eluiert. Der nicht umgesetzte markierte Antikörper wird an den Träger im Ionenaustauscher gebunden und nicht eluiert. Deshalb wird das Konjugat aus dem zu untersuchenden Allergen und dem markierten Antikörper, d.h. das Konjugat aus dem zu untersuchenden Allergen und dem mit dem fluoreszierenden Material markierten Antikörper, das Konjugat aus dem zu untersuchenden Allergen und dem mit dem Enzym für eine Emission markierten Antikörper oder das Konjugat aus dem zu untersuchenden Allergen und dem mit dem radioaktiven Material markierten Antikörper, leicht von dem nicht umgesetzten markierten Antikörper abgetrennt.
Der nicht umgesetzte markierte Antikörper, der an den Träger gebunden ist, kann mit einer wässrigen Lösung wie einer wässrigen Natriumchloridlösung, die das Salz mit einer Konzentration von 0,2 M oder darüber, beispielsweise 0,2 bis 1 M, enthält, eluiert werden. Deshalb kann ein Zyklus, der die Zugabe der Probe, die Elution des Konjugates aus dem zu untersuchenden Allergen und dem markierten Antikörper, d.h. des Zielmaterials des Versuchs, die Elution des nicht umgesetzten markierten Antikörpers, d.h. des Nicht-Zielmaterials des Versuches, und ein Äquilibrieren der Säule mittels Durchlauf eines schwach sauren Puffers umfasst, nacheinander in einer Säule wiederholt werden. Deshalb kann die Probe sukzessive auf die Säule aufgegeben und analysiert werden.
Innerhalb der Ionenaustauschkapazität der Ionenaustauschsäule ist es nicht erforderlich, den nicht umgesetzten markierten Antikörper, d.h. das Material, das nicht das Ziel des Versuchs ist, zu eluieren und die Säule mittels Durchlauf des schwach sauren Puffers zu äquilibrieren. Deshalb ist es möglich, sukzessive aufeinander folgende Proben aufzugeben, nachdem das Konjugat aus dem zu untersuchenden Allergen und dem markierten Antikörper, d.h. das Zielmaterial des Versuchs, aus der vorhergehenden Probe innerhalb der Ionenaustauschkapazität der Ionenaustauschsäule eluiert worden ist. In diesem Fall kann die Elution des nicht umgesetzten markierten Antikörpers, d.h. des Materials, das nicht das Ziel des Versuchs ist, und die Äquilibrierung der Säule mittels Durchlauf des schwach sauren Puffers weggelassen und eine höhere Effizienz erreicht werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Signale von den Markierungen, die in dem Konjugat aus dem zu untersuchenden Allergen und dem markierten Antikörper enthalten sind, nämlich Fluoreszenz von der aus einer fluoreszierenden Verbindung bestehenden Markierung, Emission aus dem Enzym für die Farbgebung oder Radioaktivität von dem radioaktiven Material, aus dem Eluat detektiert, das durch die Ionenaustauschchromatographie eluiert worden ist und das Konjugat aus dem zu untersuchenden Allergen und dem markierten Antikörper enthält. Dabei kann eine Standardkurve erhalten werden, indem derselbe Vorgang durchgeführt wird, außer dass eine bekannte Menge des Allergens verwendet wird. Weiterhin ist es möglich, das Vorhandensein des Allergens in der Probe zu detektieren.
Die Fluoreszenz von der aus der fluoreszierenden Verbindung bestehenden Markierung kann durch ein beliebiges bekanntes Verfahren detektiert oder gemessen werden, wobei ein automatisches Analyseverfahren unter Verwendung eines beliebigen bekannten Gerätes wie eines Fluoreszenzspektralphotometers bevorzugt ist.
Die Emission aus der Enzymmarkierung kann durch Zugabe eines geeigneten Substrats und Detektieren oder Messen des Lichts mit einer Wellenlänge, die dem Substrat entspricht, durch ein beliebiges bekanntes Verfahren, vorzugsweise durch ein automatisches Analyseverfahren, unter Verwendung eines beliebigen bekannten Gerätes wie eines Lumineszenzanzeigegerätes, d.h. eines Emissionsanalysators, detektiert oder gemessen werden. Wird eine alkalische Phosphatase als das Enzym für die Emission verwendet, kann das verwendete Substrat beispielsweise Fluoresceindiphosphorsäure, 4-Methylumbelliferylphosphorsäure, 3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxycetan (AMPPD), D-Luciferin-o-phosphat (LUCP) oder o-Aminophthalylhydrazid-o-phosphat (Luminal-o-phosphat, LUMP) sein. Wird β-D-Galactosidase als das Enzym für die Emission verwendet, kann das verwendete Substrat beispielsweise 3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-β-D-galactopyranosyloxy)-phenyl-1,2-dioxycetan (AMPGD) oder o-Aminophthalylhydrazid-β-D-galactosid (Luminol-β-D-galactosid, LUMG) sein. Wird Meerrettichperoxidase als das Enzym für die Emission verwendet, kann das verwendete Substrat beispielsweise Homovanillinsäure, Tyramin, p-Kresol, p-Hydroxyphenylessigsäure oder p-Hydroxyphenylpropionsäure (HPPA) sein. Wird Catechol-o-methyltransferase als Enzym für die Emission verwendet, kann das verwendete Substrat beispielsweise 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)naphtho[1,2-d] thiazol (DNT) sein.
Die Radioaktivität von der aus dem radioaktiven Material bestehenden Markierung kann beispielsweise durch einen Szintillationszähler gemessen werden.
Es kann eine Vielzahl von Proben chargenweise behandelt werden, beispielsweise, indem

1) für alle zu untersuchenden Proben zunächst die Stufe des In-Berührung-Bringens der Probe mit dem markierten Antikörper,
2) für alle zu untersuchenden Proben die Stufe der Entfernung des nicht umgesetzten markierten Antikörpers durch Ionenaustauschchromatographie und
3) für alle zu behandelnden Proben die Stufe der Detektion der Signale aus dem Allergen-markierten-Antikörper-Konjugat

Alternativ kann eine Vielzahl von Proben nacheinander derart behandelt werden, dass der Analysevorgang sukzessive mit der jeweiligen der Vielzahl von Proben nach einem geeigneten Intervall begonnen und die Probe nacheinander der zuvor beschriebenen Stufe 1 des In-Berührung-Bringens, der zuvor beschriebenen Entfernungsstufe 2 bzw. der zuvor beschriebenen Detektionsstufe 3 unterworfen wird. Das heißt, die erste Probe wird kontinuierlich durch die Stufe 1 des In-Berührung-Bringens, die Entfernungsstufe 2 und die Detektionsstufe 3 behandelt, und nach einem geeigneten Zeitraum nach dem Beginn der Analyse der ersten Probe wird die Analyse der zweiten Probe begonnen und werden die weiter oben beschriebene Stufe 1 des In-Berührung-Bringens, die weiter oben beschriebene Entfernungsstufe 2 bzw. die weiter oben beschriebene Detektionsstufe 3 mit der zweiten Probe durchgeführt. Durch dieses kontinuierliche Verfahren kann Reaktions- und Wartezeit für die Messung verkürzt und der Versuch zum Nachweis eines Allergens leichter automatisiert werden.
BEISPIELE
Die Erfindung wird anschließend anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1: Herstellung eines Konjugates aus einem Allergen und einem markierten Antikörper
1) Herstellung eines mit FITC markierten Anti-DNP-IgE-Antikörpers
Zu 15 ml 0,5 M Carbonatpuffer (pH 9) wurden 10 mg FITC (Fluoresceinisothiocyanat) und 50 mg Anti-DNP-(Dinitrophenyl-)IgE-Antikörper (Seikagaku-Kogyo, Flüssigkeit) zugegeben, und das Ganze wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 15 ml der erhaltenen Flüssigkeit 72 Stunden lang bei 4°C in 3 Liter 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9) dialysiert, um das nicht umgesetzte FITC zu entfernen.
2) In-Berührung-Bringen mit der Probe
Nachdem 100 μl des in Beispiel 1 1) hergestellten 1,8 ng/μl FITC-markierten IgE-Antikörpers [in 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9)] mit 100 μl eines Versuchsallergens, d.h. DNP-BSA (dinitrophenyliertes Rinderserumalbumin) [in 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9)], vermischt worden waren, wurde das Ganze bei 37°C inkubiert. Die Inkubations-(Reaktions-)Zeit betrug 1, 5, 10, 20, 30, 40 bzw. 60 Minuten und die Konzentration des Versuchsallergens DNP-BSA 0,6 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,3 mg/ml bzw. 2,0 mg/ml. Die Menge des Allergen-markierten-Antikörper-Konjugates, die sich mit der Zeit gebildet hatte, wurde bestimmt, die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. In 3 zeigt ? die Ergebnisse von 2 mg/ml DNP-BSA, Ä die Ergebnisse von 1,3 mg/ml DNP-BSA, ? die Ergebnisse von 1 mg/ml DNP-BSA und ? die Ergebnisse von 0,6 mg/ml DNP-BSA. 3 ist zu entnehmen, dass die Fluoreszenzintensität bei jeder DNP-BSA-Konzentration konstant ist, wenn die Inkubations-(Reaktions-)Zeit 20 Minuten oder mehr beträgt.
3) Fraktionierung des Allergen-markierten-Antikörper-Konjugates durch Ionenaustauschchromatographie
Auf eine Kationenaustauschsäule (HITRAP^TMSP-Sepharose Fast Flow, Durchmesser = 16 × 25 mm, hergestellt von Pharmacia) wurden 200 μl der Reaktionsflüssigkeit (Inkubationszeit = 20 Minuten, Konzentration von DNP-BSA = 2 mg/ml), hergestellt in Beispiel 1 2), aufgegeben. Als mobile Phase wurden 50 mM Malonatpuffer (pH 5,0) mit einem Durchfluss von 1 ml/min verwendet. Ein Fluoreszenz-Spektralphotometer (F-2000, hergestellt von Hitachi Ltd.) wurde verwendet, um die von dem FITC kommende Fluoreszenzintensität zu messen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Wie 4 zu entnehmen, wurde ausschließlich das Allergen-markierte-Antikörper-Konjugat in der von dem Malonatpuffer eluierten Fraktion eluiert. Nach Elution des Allergen-markierten Antikörper-Konjugates wurde eine wässrige 0,5 M NaCl-Lösung durch die Säule geschickt und, wie in 5 gezeigt, der nicht umgesetzte markierte IgE-Antikörper eluiert.
Beispiel 2: Reaktionsspezifität des mit FITC markierten Anti-DNP-IgE-Antikörpers
In diesem Beispiel wurde die Reaktionsspezifität eines mit FITC markierten Anti-DNP-IgE-Antikörpers bestimmt. Als Antigenprobe wurden das in Beispiel 1 verwendete DNP- BSA, BSA (hergestellt von Sigma, Pulver), IgG (hergestellt von Sigma, Flüssigkeit) und HSA (humanes Serumalbumin, hergestellt von Seikagaku Kogyo, Pulver) verwendet. Die Antigenprobe wurde mit dem in Beispiel 1 1) hergestellten FITC-markierten IgE-Antikörper 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Danach wurde das Ganze auf die in Beispiel 1 3) verwendete Ionenaustauschsäule aufgegeben und die Fluoreszenzintensität von dem Antigenprobemarkierten-Antikörper-Konjugat, das von dem in Beispiel 1 3) verwendeten Malonatpuffer eluiert worden war, gemessen. Es wurde ein Kontrollversuch (Negativkontrolle) durchgeführt, in welchem anstelle der zuvor genannten Antigenproben eine phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Bei BSA, IgG und HSA wurde keine Erhöhung der Fluoreszenzintensität beobachtet, während bei DNP-BSA eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität beobachtet wurde. Deshalb ist es offensichtlich, dass ein Allergen selektiv durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen werden kann.
Beispiel 3: Quantifizierbarkeit
Um die Quantifizierbarkeit (Möglichkeit der quantitativen Bestimmung) und den quantitativen Bereich des erfindungsgemäßen Verfahrens zu bestimmen, wurde eine flüssige Probe, die DNP-BSA als Versuchallergen mit einer Konzentration von 0, 0,6, 1,0, 1,3, 2,0 und 5,0 mg/ml in einem 0,05 M Malonatpuffer (pH 5) enthielt, hergestellt. Nachdem 100 μl DNP-BSA-Lösung und 100 μl der in Beispiel 1 1) verwendeten 1,8 ng/μl FITC-markierten IgE-Antikörper-Flüssigkeit vermischt worden waren, wurde das Gemisch 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsflüssigkeit wurde durch denselben Vorgang wie in Bei spiel 1 3) behandelt und die Fluoreszenzintensität des eluierten Antigenprobe-markierten-Antikörper-Konjugates gemessen. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Es wurde eine lineare Korrelation festgestellt, wenn sich die Allergenkonzentration im Bereich von 0 bis 2 mg/ml befand.
Beispiel 4: Nachweis eines Weizenallergens mit mit alkalischer Phosphatase markiertem IgE-Antikörper
1) Herstellung eines Weizenallergenextrakts
Weizenmehl (hakuriki-ko) (10 g) wurde mit 100 ml Diethylether gewaschen und drei Minuten lang mit 2000 g zentrifugiert. Der Wasch- und der Zentrifugiervorgang wurden dreimal wiederholt. Zu dem gesamten Präzipitat wurden 100 ml 0,1 M phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (pH 7,4) zugegeben, und das Ganze wurde zwei Stunden lang gerührt. Danach wurde der Überstand in 3 Liter 0,05 M phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,4) 72 Stunden lang bei 4°C dialysiert, wobei ein Weizenallergenextrakt (35 μg/ml) erhalten wurde.
2) Herstellung eines mit alkalischer Phosphatase markierten IgE-Antikörpers
Auf herkömmliche Weise wurden 2 ml eines Anti-Weizenallergen-Antiserums von Ratten erhalten, die mit dem in Beispiel 4 1) hergestellten Weizenallergenextrakt immunisiert worden waren. Zu dem Antiserum wurde Natriumsulfat gegeben, bis dessen Konzentration 18 Gew./Vol.-% betrug. Das erhaltene Präzipitat wurde in zwei Litern 0,01 M Phosphatpuffer (pH 8,0) 48 Stunden lang dialysiert. Danach wurde die erhaltene dialysierte Lösung auf eine schwach basische DEAE-Anionenaustauschsäule (5 ml, Hitrap column, hergestellt von Pharmacia) gegeben und mit einem Phosphatpuffer (pH 8), der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,01 M bis 0,2 M Phosphorsäure eluiert, um eine Anti-Weizenallergen-IgE-Antikörper-Fraktion zu erhalten.
Die erhaltene Anti-Weizenallergen-IgE-Antikörper-Fraktion wurde mit alkalischer Phosphatase durch folgendes Verfahren markiert.
Alkalische Phosphatase (hergestellt von Sigma) (0,45 mg) wurde in 1 ml 0,1 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0), der 0,1 mM MgCl₂ und 0,1 mM ZnCl₂ enthielt, gelöst. Zu 1 ml der Lösung wurde 0,5 mg eines Vernetzungsmittels, d.h. N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (anschließend als SPDP bezeichnet, hergestellt von Pharmacia), gegeben und das Ganze zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde das nicht umgesetzte SPDP durch eine entsalzende Säule entfernt, um SPDP-gebundene alkalische Phosphatase zu erhalten. Anschließend wurde 1 ml einer Anti-Weizenallergen-IgE-Antikörper-Fraktion (1,1 mg/ml), worin die Disulfidbindungen in der Gelenkregion mit Dithiothreitol (DTT) reduziert worden waren, mit 1 ml der SPDP-gebundenen alkalischen Phosphatase vermischt und das Ganze 12 Stunden lang bei 4°C inkubiert, um die Aminogruppen der alkalischen Phosphatase und die Thiolgruppen in dem Anti-Weizenallergen-IgE-Antikörper mit SPDP zu vernetzen. Die erhaltene Reaktionsflüssigkeit wurde auf eine Gelpermeationssäule aufgegeben, um den mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-Weizenallergen-IgE-Antikörper von dem nicht umgesetzten IgE-Antikörper oder der nicht umgesetzten SPDP-gebundenen alkalischen Phosphatase zu trennen und eine Fraktion aus einem mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-Weizenallergen-IgE-Antikörper (7 μg/ml) zu erhalten.
3) In-Berührung-Bringen mit einer Probe
Der in Beispiel 4 1) hergestellte Weizenallergenextrakt (35 μg/ml, 50 μl) wurde mit 50 μl des in Beispiel 4 2) hergestellten mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-Weizenallergen-IgE-Antikörper vermischt und das Ganze 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion auszulösen.
4) Fraktionierung eines Allergen-markierten Antikörper-Konjugates durch Ionenaustauschchromatographie
Nach Beendigung der Antigen-Antikörper-Reaktion wurden 100 μl des Gemischs auf die in Beispiel 1 3) verwendete Kationenaustauschsäule aufgegeben. Die Säule wurde mit 50 mM Malonatpuffer (pH 5,0) als mobile Phase zwei Minuten lang mit einem Durchfluss von 1 ml/min eluiert, wonach eine wässrige Natriumchloridlösung mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,15 M hindurchgeleitet wurde. Die eluierten Lösungen wurden in Fraktionen zu 0,25 ml aufgeteilt.
Für die Analyse wurden 300 μl 3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxycetan (AMPPD) als Substrat für die Emission zugegeben, und das Ganze wurde 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Emissionsintensität mit einem Lumineszenzanzeigegerät (BLR301, Aloka) gemessen. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. 8 ist zu entnehmen, dass ausschließlich das Allergen-markierte-Antikörper-Konjugat (Peak A) in der von dem Malonatpuffer eluierten Fraktion eluiert worden war, und dass der nicht umgesetzte mit alkalischer Phosphatase markierte Anti-Weizenallergen-IgE-Antikörper (Peak B) nach Durchlauf der wässrigen NaCl-Lösung mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,15 M eluiert wurde. Das heißt, dass das Produkt der Antigen-Antikörper-Reaktion und der nicht umgesetzte, mit alkalischer Phosphatase markierte Anti-Weizenallergen-IgE-Antikörper ordnungsgemäß voneinander getrennt worden waren. Deshalb ist zu erkennen, dass ein Allergen durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen werden kann.
Beispiel 5: Bewertung der Quantifizierbarkeit
Die Quantifizierbarkeit (Möglichkeit der quantitativen Bestimmung) wurde ermittelt, indem die in den Beispielen 4 3) und 4 4) beschriebenen Vorgänge unter Verwendung der bekannten Mengen an Weizenallergen und mit mit alkalischer Phosphatase markiertem Anti-Weizenallergen-IgE-Antikörper aus Beispiel 4 2) durchgeführt wurden. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. In 9 ist die relative Emissionsintensität, bezogen auf die 100%ige Emissionsintensität, die nach Aufgabe der gesamten Probe auf die Säule erhalten worden war, gezeigt.
Es wurde eine lineare Relation beobachtet, in welcher die Konzentration des Weizenallergens 0 bis 60 μg/ml betrug. Wie weiter oben gezeigt, wurde das Weizenallergen durch das erfindungsgemäße Verfahren quantitativ bestimmt.
Beispiel 6: Messung eines Allergens durch einen mit alkalischer Phosphatase markierten IgG-Antikörper
1) Messung eines Allergens durch den Anti-β-Lactoglobulin-IgG-Antikörper
Gemäß einem herkömmlichen Verfahren wurden 2 ml eines Anti-β-Lactoglobulin-Antiserums aus Ratten erhalten, die mit einem Milchallergen, d.h. β-Lactoglobulin (hergestellt von SIGMA, Pulver, hergestellt durch dreimaliges Auskristallisieren), immunisiert worden waren. Das erhaltene Antiserum wurde auf eine Protein-A-Säule aufgegeben, um eine IgG-Antikörper-Fraktion zu erhalten. Der Vorgang von Beispiel 4 2) wurde wiederholt, außer dass die resultierende IgG-Antikörper-Fraktion verwendet wur de, um einen mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-β-Lactoglobulin-IgG-Antikörper zu erhalten.
50 μl des resultierenden mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-β-Lactoglobulin-IgG-Antikörpers (20 μg/ml in einem 0,05 M Phosphatpuffer) und 50 μl β-Lactoglobulin (30 μg/ml in einem 0,05 M Phosphatpuffer) wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Antigen-Antikörper-Reaktion stattfinden zu lassen.
Getrennt davon wurde Reis, Weizen, Buchweizen oder Sojabohnen zermahlen, und nachdem eine wässrige 3%ige Natriumchloridlösung zugesetzt worden war, das zermahlene Produkt homogenisiert, zentrifugiert und weiter zentrifugiert, um das Natriumchlorid zu entfernen, wonach ein Extrakt erhalten wurde. Weiterhin wurde Albumin (Eiweiß) mit dem gleichen Volumen an Wasser verdünnt, um verdünntes Albumin herzustellen. Danach wurden 50 μl des resultierenden Extrakts oder der verdünnten Flüssigkeit (30 μg Protein/ml) und 50 μl des mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-β-Lactoglobulin-IgG-Antikörpers (20 μg/ml) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Antigen-Antikörper-Reaktion stattfinden zu lassen.
100 μl der Reaktionsflüssigkeit wurden entsprechend dem Vorgang in Beispiel 4 4) fraktioniert, und die Emissionsintensität wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. In 10 zeigen ? die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die β-Lactoglobulin-Lösung (Milch) war, | zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die verdünnte Albuminflüssigkeit war, ? zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Weizenextrakt war, x zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Buchweizenextrakt war, * zeigt die Ergebnisse, wenn die unter suchte Probe der Sojabohnenextrakt war, und – zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Reisextrakt war.
Wenn die Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch) war, wurde ausschließlich das Allergen-(β-Lactoglobulin)-markierte-Antikörper-Konjugat (Peak A) in der durch den Malonatpuffer eluierten Fraktion eluiert und der nicht umgesetzte, markierte Anti-β-Lactoglobulin-IgG-Antikörper (Peak B) nach Durchlauf der wässrigen NaCl-Lösung mit einem linearen Konzentrationsgradien von 0 bis 0,15 M eluiert. Weiterhin wurde, wenn die Probe die verdünnte Albuminflüssigkeit, der Weizenextrakt, der Buchweizenextrakt, der Sojabohnenextrakt oder der Reisextrakt war, ausschließlich der nicht umgesetzte, markierte Anti-β-Lactoglobulin-IgG-Antikörper eluiert. Wie weiter oben wurden das Produkt der Antigen-Antikörper-Reaktion und der nicht umgesetzte markierte Antikörper ordnungsgemäß voneinander getrennt, wobei nur der Antigen-Antikörper analysiert werden konnte.
2) Messung des Allergens mit dem Anti-Albuminallergen-IgG-Antikörper
Der Vorgang von Beispiel 6 1) wurde wiederholt, außer dass die in Beispiel 6 1) hergestellte verdünnte Albuminflüssigkeit anstelle des β-Lactoglobulins als Antigen verwendet wurde, um eine Anti-Albuminallergen-IgG-Antikörper-Fraktion zu erhalten. Danach wurde unter Verwendung der resultierenden IgG-Antikörper-Fraktion ein mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-Albuminallergen-IgG-Antikörper hergestellt. Mit der verdünnten Albuminflüssigkeit, der β-Lactoglobulinlösung, dem Weizenextrakt, dem Buchweizenextrakt, dem Sojabohnenextrakt oder dem Reisextrakt, hergestellt in Beispiel 6 1), wurde eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfinden gelassen und der Antigen-Antikörper analysiert.
Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. In 11 zeigt ? die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die verdünnte Albuminflüssigkeit war, | zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch) war, ? zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Weizenextrakt war, x zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Buchweizenextrakt war, * zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Sojabohnenextrakt war, und – zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Reisextrakt war. Wenn der Anti-Albuminallergen-IgG-Antikörper verwendet wurde, wurde das Albuminallergen-markierte-Antikörper-Konjugat ordnungsgemäß von dem nicht umgesetzten markierten Antikörper getrennt, weshalb das Allergen-markierte-Antikörper-Konjugat analysiert werden konnte. Weiterhin wurde, wenn die Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch), der Weizenextrakt, der Buchweizenextrakt, der Sojabohnenextrakt oder der Reisextrakt war, ausschließlich der nicht umgesetzte, markierte Anti-Albuminallergen-IgG-Antikörper eluiert.
3) Messung des Allergens mit dem Anti-Reisallergen-IgG-Antikörper
Der Vorgang von Beispiel 6 1) wurde wiederholt, außer dass der in Beispiel 6 1) hergestellte Reisextrakt anstelle des β-Lactoglobulins als Antigen verwendet wurde, um eine Anti-Reisallergen-IgG-Antikörper-Fraktion zu erhalten. Danach wurde unter Verwendung der resultierenden IgG-Antikörper-Fraktion ein mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-Reisallergen-IgG-Antikörper hergestellt. Mit der verdünnten Albuminflüssigkeit, der β-Lactoglobulinlösung, dem Weizenextrakt, dem Buchweizenextrakt, dem Sojabohnenextrakt oder dem Reisextrakt, hergestellt in Beispiel 6 1) wurde eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfinden gelassen und der Antigen-Antikörper analysiert.
Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. In 12 zeigt ? die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Reisextrakt war, | zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch) war, ? zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die verdünnte Albuminflüssigkeit war, x zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Weizenextrakt war, * zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Buchweizenextrakt war, und – zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Sojabohnenextrakt war. Wenn der Anti-Reisallergen-IgG-Antikörper verwendet wurde, wurde das Reisallergen-markierte-Antikörper-Konjugat ordnungsgemäß von dem nicht umgesetzten markierten Antikörper getrennt, weshalb das Allergen-markierte-Antikörper-Konjugat analysiert werden konnte. Weiterhin wurde, wenn die Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch), die verdünnte Albuminflüssigkeit, der Weizenextrakt, der Buchweizenextrakt oder der Sojabohnenextrakt war, ausschließlich der nicht umgesetzte, markierte Anti-Reisallergen-IgG-Antikörper eluiert.
4) Messung des Allergens mit dem Anti-Weizenallergen-IgG-Antikörper
Der Vorgang von Beispiel 6 1) wurde wiederholt, außer dass der in Beispiel 6 1) hergestellte Weizenextrakt anstelle des β-Lactoglobulins als Antigen verwendet wurde, um eine Anti-Weizenallergen-IgG-Antikörper-Fraktion zu erhalten. Danach wurde unter Verwendung der resultierenden IgG-Antikörper-Fraktion ein mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-Weizenallergen-IgG-Antikörper hergestellt. Mit der verdünnten Albuminflüssigkeit, der β-Lactoglobulinlösung, dem Weizenextrakt, dem Buchweizenextrakt, dem Sojabohnenextrakt oder dem Reisextrakt, hergestellt in Beispiel 6 1) wurde eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfinden gelassen und der Antigen-Antikörper analysiert.
Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. In 13 zeigt ? die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Weizenextrakt war, | zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch) war, ? zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die verdünnte Albuminflüssigkeit war, x zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Buchweizenextrakt war, * zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Sojabohnenextrakt war, und – zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Reisextrakt war. Wenn der Anti-Weizenallergen-IgG-Antikörper verwendet wurde, wurde das Weizenallergen-markierte-Antikörper-Konjugat ordnungsgemäß von dem nicht umgesetzten markierten Antikörper getrennt, weshalb das Allergen-markierte-Antikörper-Konjugat analysiert werden konnte. Weiterhin wurde, wenn die Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch), die verdünnte Albuminflüssigkeit, der Buchweizenextrakt, der Sojabohnenextrakt oder der Reisextrakt war, ausschließlich der nicht umgesetzte markierte Anti-Weizenallergen-IgG-Antikörper eluiert.
5) Messung des Allergens mit dem Anti-Buchweizenallergen-IgG-Antikörper
Der Vorgang von Beispiel 6 1) wurde wiederholt, außer dass der in Beispiel 6 1) hergestellte Buchweizenextrakt anstelle des β-Lactoglobulins als Antigen verwendet wurde, um eine Anti-Buchweizenallergen-IgG-Antikörper-Fraktion zu erhalten. Danach wurde unter Verwendung der resultierenden IgG-Antikörper-Fraktion ein mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-Buchweizenallergen-IgG-Antikörper hergestellt. Mit der verdünnten Albuminflüssigkeit, der β-Lactoglobulinlösung, dem Weizenextrakt, dem Buchweizenextrakt, dem Sojabohnenextrakt oder dem Reisextrakt, hergestellt in Beispiel 6 1) wurde eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfinden gelassen und der Antigen-Antikörper analysiert.
Die Ergebnisse sind in 14 gezeigt. In 14 zeigt ? die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Buchweizenextrakt war, | zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch) war, ? zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die verdünnte Albuminflüssigkeit war, x zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Weizenextrakt war, * zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Sojabohnenextrakt war, und – zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Reisextrakt war. Wenn der Anti-Buchweizenallergen-IgG-Antikörper verwendet wurde, wurde das Buchweizenallergen-markierte-Antikörper-Konjugat ordnungsgemäß von dem nicht umgesetzten markierten Antikörper getrennt, weshalb das Allergen-markierte-Antikörper-Konjugat analysiert werden konnte. Weiterhin wurde, wenn die Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch), die verdünn te Albuminlösung, der Weizenextrakt, der Sojabohnenextrakt oder der Reisextrakt war, ausschließlich der nicht umgesetzte markierte Anti-Buchweizenallergen-IgG-Antikörper eluiert.
6) Messung des Allergens mit dem Anti-Sojabohnenallergen-IgG-Antikörper
Der Vorgang von Beispiel 6 1) wurde wiederholt, außer dass der in Beispiel 6 1) hergestellte Sojabohnenextrakt anstelle des β-Lactoglobulins als Antigen verwendet wurde, um eine Anti-Sojabohnenallergen-IgG-Antikörper-Fraktion zu erhalten. Danach wurde unter Verwendung der resultierenden IgG-Antikörper-Fraktion ein mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-Sojabohnenallergen-IgG-Antikörper hergestellt. Mit der verdünnten Albuminflüssigkeit, der β-Lactoglobulinlösung, dem Weizenextrakt, dem Buchweizenextrakt, dem Sojabohnenextrakt oder dem Reisextrakt, hergestellt in Beispiel 6 1) wurde eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfinden gelassen und der Antigen-Antikörper analysiert.
Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt. In 15 zeigt ? die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Sojabohnenextrakt war, | zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch) war, ? zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe die verdünnte Albuminflüssigkeit war, x zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Weizenextrakt war, * zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Buchweizenextrakt war, und – zeigt die Ergebnisse, wenn die untersuchte Probe der Reisextrakt war. Wenn der Anti-Sojabohnenallergen-IgG-Antikörper verwendet wurde, wurde das Sojabohnenallergen-markierte-Antikörper-Konjugat ord nungsgemäß von dem nicht umgesetzten markierten Antikörper getrennt, weshalb das Allergen-markierte-Antikörper-Konjugat analysiert werden konnte. Weiterhin wurde, wenn die Probe die β-Lactoglobulinlösung (Milch), die verdünnte Albuminflüssigkeit, der Weizenextrakt, der Buchweizenextrakt oder der Reisextrakt war, ausschließlich der nicht umgesetzte markierte Anti-Sojabohnenallergen-IgG-Antikörper eluiert.
Beispiel 7: Bewertung der Quantifizierbarkeit
Die Quantifizierbarkeit (Möglichkeit der quantitativen Bestimmung) wurde ermittelt, indem die in den Beispielen 4 3) und 4 4) beschriebenen Vorgänge unter Verwendung der Lösung, die die bekannten Menge an β-Lactoglobulin und mit mit alkalischer Phosphatase markiertem Anti-β-Lactoglobulinallergen-IgG-Antikörper von Beispiel 6 2) enthielt, durchgeführt wurden. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt. In 16 ist die relative Emissionsintensität, bezogen auf die 100%ige Emissionsintensität, die nach Aufgabe der gesamten Probe auf die Säule erhalten worden war, gezeigt.
Es wurde eine lineare Relation in dem Bereich beobachtet, in welchem die Konzentration des β-Lactoglobulins 0 bis 80 μg/ml betrug. Wie weiter oben wurde gezeigt, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren ein Allergen quantitativ bestimmt werden kann.
Beispiel 8: Nachweis von Lebensmittelallergenen mit FITC-markierten IgE-Antikörpern
Der Vorgang von Beispiel 4 2) wurde wiederholt, außer dass Serum von Patienten verwendet wurde, die an einer Milch-, Albumin-, Reis-, Weizen-, Buchweizen- oder Sojabohnenallergie litten, wodurch der entsprechende IgE-Antikörper erhalten wurde. Weiterhin wurde der Vorgang von Beispiel 1 1) wiederholt, außer dass der resultierende IgE-Antikörper verwendet wurde, um einen FITC-markierten IgE-Antikörper zu erhalten.
Als Probe wurde Milch bzw. die verdünnte Albuminflüssigkeit, der Weizenextrakt, der Buchweizenextrakt, der Sojabohnenextrakt bzw. der Reisextrakt, hergestellt in Beispiel 6 1), verwendet. Der FITC-markierte IgE-Antikörper (1,5 ng) von einem Patienten, der an einer Allergie litt, wurde mit der Probe (2 mg Allergenprotein) 20 Minuten lang bei 37°C umgesetzt, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfinden zu lassen. Gemäß dem Vorgang in Beispiel 1 3) wurde die Fluoreszenzintensität des Allergenmarkierten-Antikörper-Konjugates von jeder Reaktionsflüssigkeit gemessen.
In 17 sind die Ergebnisse gezeigt, wenn der FITC-markierte IgE-Antikörper verwendet wurde, der aus dem IgE-Antikörper hergestellt worden war, der von dem an einer Milchallergie leidenden Patienten gewonnen worden war. Die Symbole in 17 haben dieselbe Bedeutung wie in 10. Wie in 17 gezeigt, wurde, wenn der FITC-markierte IgE-Antikörper verwendet wurde, der aus dem IgE-Antikörper hergestellt worden war, der von dem an einer Milchallergie leidenden Patienten gewonnen worden war, die Fluoreszenz aus dem Allergen-markierten-Antikörper-Konjugat ausschließlich für Milch detektiert. Somit wurde festgestellt, dass der Patient an einer Milchallergie litt.
Die Ergebnisse, wenn der FITC-markierte IgE-Antikörper verwendet wurde, der aus dem IgE-Antikörper hergestellt worden war, der von den entsprechenden Patienten, die an einer Ei-, Reis-, Weizen-, Buchweizen- oder Sojabohnenallergie litten, gewonnen worden war, sind in 18 (wenn der IgE-Antikörper von dem Patienten, der an einer Eiallergie litt, verwendet worden war), in 19 (wenn der IgE-Antikörper von dem Patienten, der an einer Reisallergie litt, verwendet worden war), in 20 (wenn der IgE-Antikörper von dem Patienten, der an einer Weizenallergie litt, verwendet worden war), in 21 (wenn der IgE-Antikörper von dem Patienten, der an einer Buchweizenallergie litt, verwendet worden war) und in 22 (wenn der IgE-Antikörper von dem Patienten, der an einer Sojabohnenallergie litt, verwendet worden war) gezeigt.
Wie in den 18 bis 22 gezeigt, wurde, wenn der FITC-markierte IgE-Antikörper verwendet wurde, der aus dem IgE-Antikörper hergestellt worden war, der von dem Patienten gewonnen worden war, der an einer Ei-, Reis-, Weizen-, Buchweizen- oder Sojabohnenallergie litt, die Fluoreszenz von dem Allergen-markierten-Antikörper-Konjugat ausschließlich für Ei, Reis, Weizen, Buchweizen oder Sojabohnen detektiert, wodurch die Allergie, an welcher der Patient litt, identifiziert wurde.
Beispiel 9: Allergennachweis durch sukzessive Aufgabe auf eine Säule
100 μl eines in Beispiel 1 1) hergestellten 1,8 ng/μl FITC-markierten Anti-DNP-IgE-Antikörpers und 100 μl dinitrophenyliertes Rinderserumalbumin (DNP-BSA, 0,6 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,3 mg/ml oder 2,0 mg/ml) wurden vermischt, und das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 37°C inku biert. Als Kontrollversuch (Negativversuch) wurde derselbe Vorgang wiederholt, außer dass anstelle der wässrigen DNP-BSA-Lösung Wasser verwendet wurde. Danach wurden 100 μl der Reaktionsflüssigkeit auf eine Kationenaustauschsäule, die mit 0,5 mM Malonatpuffer (pH 5,0) äquilibriert und in Beispiel 1 3) verwendet worden war, in Abständen von 20 Minuten aufgegeben. Zwischen dem Aufgeben der Proben wurde die Säule nicht mit Kochsalzlösung gewaschen. Die jeweiligen DNP-BSA-Proben wurden viermal mit jeder Konzentration aufgegeben. Als mobile Phase wurde ein 50 mM Malonatpuffer (pH 5,0) mit einem Durchfluss von 1 ml/min verwendet. Die eluierte Flüssigkeit wurde in Fraktionen zu 0,25 ml aufgeteilt. Zur Messung der Fluoreszenzintensität der eluierten Flüssigkeit wurde ein Fluoreszenzspektralphotometer (F-2000, hergestellt von Hitachi Ltd.) verwendet.
Die resultierende Fluoreszenzintensität des eluierten Antigen-Antikörper-Konjugates war wie in 23 gezeigt. In 23 bedeutet "T" den Zeitpunkt, zu welchem die jeweilige Reaktionsflüssigkeit zugegeben wurde, "A" bedeutet die Zugabe der Reaktionsflüssigkeit, gemischt mit 2,0 mg/ml DNP-BSA, "B" bedeutet die Zugabe der Reaktionsflüssigkeit, gemischt mit 1,3 mg/ml DNP-BSA, "C" bedeutet die Zugabe der Reaktionsflüssigkeit, gemischt mit 1,0 mg/ml DNP-BSA, "D" bedeutet die Zugabe der Reaktionsflüssigkeit, gemischt mit 0,6 mg/ml DNP-BSA, und "E" bedeutet die Zugabe der Reaktionsflüssigkeit, gemischt mit Wasser. Bei jeder Konzentration von DNP-BSA wurden stabile Werte beobachtet. Es wurde bestätigt, dass, selbst wenn die Säule bei einer aufeinander folgenden Aufgabe der Proben nicht mit Kochsalzlösung gewaschen wurde, eine quantitative Bestimmung innerhalb des Bereichs erreicht werden konnte, in welchem das verwendete Ionenaustausch harz in der Lage war, die nicht umgesetzten FITC-markierten IgE-Antikörper zu adsorbieren.
Beispiel 10: Nachweis nicht umgesetzter Antikörper durch eine Anionenaustauschsäule
Der Anti-DNP-IgE-Antikörper wurde durch den Vorgang von Beispiel 1 1) mit FITC markiert. Danach wurden 100 μl des FITC-markierten Anti-DNP-IgE-Antikörpers (1,8 ng/μl) und 100 μl DNP-BSA (Versuchsallergen, 2 mg/ml) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt.
Die Reaktionsflüssigkeit wurde auf eine Anionenaustauschsäule (HILOAD Q Sepharose Fast Flow, Durchmesser = 16 × 25 mm, hergestellt von Pharmacia) aufgegeben, die mit einem 50 mM Glycin-Natriumchlorid-Natriumhydroxid-Puffer (pH 9) äquilibriert worden war. Als mobile Phase wurde der für die Äquilibrierung verwendete Puffer (pH 9,0) mit einem Durchfluss von 1 ml/min 2,5 Minuten lang verwendet. Danach wurde eine wässrige NaCl-Lösung mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,5 M durchgeleitet. Die eluierte Flüssigkeit wurde in Fraktionen zu 0,25 ml aufgeteilt und ein Fluoreszenzspektralphotometer (F-2000, hergestellt von Hitachi Ltd.) für die Messung der Fluoreszenzintensität der eluierten Flüssigkeit verwendet. Die Ergebnisse sind in 24 gezeigt. Wie in 24 gezeigt, wurde nur das Allergen-markierte-Antikörper-Konjugat (Peak A) in der mit 50 mM Glycin-Natriumchlorid-Natriumhydroxid-Puffer eluierten Fraktion eluiert und der nicht umgesetzte FITC-markierte IgE-Antikörper (Peak B) eluiert, wenn die wässrige NaCl-Lösung mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,15 M durchgeleitet wurde. Das heißt, wenn der Anionenaustauscher anstelle des Kationenaustauschers verwendet worden war, wurde das Produkt der Antigen-Antikörper-Reaktion und das nicht umgesetzte markierte Antigen ordnungsgemäß voneinander getrennt, und es konnte ausschließlich das Antigen-Antikörper-Konjugat analysiert werden.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Erfindungsgemäß kann ein Allergen im Unterschied zu herkömmlichen Verfahren leicht und schnell quantitativ bestimmt werden.
Die Erfindung ist unter Bezugnahme auf spezielle Ausführungsformen erläutert worden, wobei jedoch Modifizierungen und Verbesserungen, die für den Fachmann offensichtlich sind, ebenfalls im erfindungsgemäßen Umfang enthalten sind.

Claims

Verfahren zur Untersuchung auf ein Allergen, dadurch gekennzeichnet, dass es die Stufen: 1) In-Berührung-Bringen einer Probe, die möglicherweise ein zu untersuchendes Allergen enthält, mit einem für das zu untersuchende Allergen spezifischen markierten Antikörper unter Bedingungen, bei welchen eine Antigen-Antikörper-Reaktion des zu untersuchenden Allergens mit dem markierten Antikörper stattfinden kann, 2) Entfernen des nicht an das zu untersuchende Allergen gebundenen, markierten Antikörpers aus einem Reaktionsgemisch durch Ionenaustauschchromatographie, um dadurch einen eluierten Komplex aus dem zu untersuchenden Allergen und dem markierten Antikörper zu erhalten, wobei die Ionenaustauschchromatographie unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass der Komplex aus zu untersuchendem Allergen und markiertem Antikörper an einen Ionenaustauscher nicht innerhalb eines Bereichs adsorbiert wird, in welchem der nicht umgesetzte markierte Antikörper an den Ionenaustauscher adsorbiert wird, und 3) Messen eines Signals des eluierten Komplexes aus dem zu untersuchenden Allergen und dem markierten Antikörper umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein radioaktives Material ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Fluoresceinisothiocyanat als fluoreszierende Verbindung verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase, Meerrettichperoxidase oder Catechol-o-methyltransferase als Enzym verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Kationenaustauschromatographie als Ionenaustauschromatographie angewendet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der nicht umgesetzte markierte Antikörper an einen Kationenaustauscher adsorbiert und der Komplex aus dem zu untersuchenden Allergen und dem markierten Antikörper mit einem sauren Puffer eluiert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der pH-Wert des sauren Puffers 4,5 bis 6 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Anionenaustauschromatographie als Ionenaustauschromatographie angewendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der Antikörper IgE oder IgG ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Stufen 1) bis 3) kontinuierlich wiederholt werden.