DE69625682T2

DE69625682T2 - Verfahren zur behandlung von entzündungen und zusammensetzungen dafür

Info

Publication number: DE69625682T2
Application number: DE69625682T
Authority: DE
Inventors: Alexandra Lucas; Grant Mcfadden
Original assignee: Viron Therapeutics Inc
Current assignee: Viron Therapeutics Inc
Priority date: 1995-03-27
Filing date: 1996-03-26
Publication date: 2003-10-02
Anticipated expiration: 2016-03-27
Also published as: ATE230609T1; US5939525A; ES2187646T3; CA2214988A1; WO1996030042A2; EP0817646B1; PT817646E; US5917014A; DE69625682D1; AU5323396A; DK0817646T3; WO1996030042A3; EP0817646A2; JPH11503122A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines viralen Proteins SERP-1, seiner Analoge und biologisch aktiven Fragmente für die Herstellung eines Medikaments für die Verhinderung und Behandlung von entzündlichen und Immunreaktionen, assoziiert mit vielzähligen Verletzungen und Krankheitszuständen.
Die Entzündung ist die Reaktion des Körpers auf eine Verletzung und Infektion. Drei Hauptereignisse sind an der Entzündung beteiligt: (1) erhöhte Blutzufuhr zu dem verletzten oder infizierten Bereich; (2) erhöhte Kapillarpermeabilität, ermöglicht durch den Rückzug von Endothelzellen und (3) Wanderung von Leukozyten aus den Kapillaren und in das umgebende Gewebe (hiernach bezeichnet als zelluläre Infiltration). Roitt et al., Immunology, Grower Medical Publishin, New York, 1989.
Die erhöhte Kapillarpermeabilität ermöglicht größeren Molekülen, das Endothel zu überqueren, die in der Regel nicht in der Lage sind, dies zu tun, wodurch lösliche Mediatoren einer Immunität, wie z. B. Leukozyten, eine verletzte oder infizierte Stelle erreichen können. Leukozyten, primär neutrophile Polymorphe (auch bekannt als polymorphonukleäre Leukozyten, Neutrophile oder PMNs) und Makrophagen wandern zur verletzten Stelle durch ein Verfahren, das als Chemotaxis bekannt ist. An der Entzündungsstelle führt die Gewebsverletzung und Komplementaktivierung zur Freisetzung von chemotaktischen Peptiden, wie z. B. C5a. Id. Die Komplementaktivierungs- Produkte sind auch für die Auslösung einer Degranulierung phagozytischer Zellen, Mastzellen und Basophilen, eine Kontraktion der glatten Muskeln und Anstiege der vaskulären Permeabilität verantwortlich. Mulligan et al. 1991 J. Immunol. 148: 1479-1485.
Die Überquerung von Leukozyten aus dem Blutstrom zu extravaskulären Stellen einer Entzündung oder Immunreaktion involviert eine komplexe aber koordinierte Abfolge von Ereignissen. An der extravaskulären Infektionsstelle oder der Gewebsverletzung werden Signale erzeugt, wie z. B. bakterielle Endotoxine, aktivierte Komplementfragmente oder proinflammatorische Cytokine, wie z.B Interleukin 1 (IL-1), Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor (TNF), die die Leukozyten und/oder Endothelzellen aktivieren, und dazu führen, daß einer oder beide dieser Zelltypen adhäsiv werden. Zunächst werden die Zellen übergangsweise adhäsiv (was sich durch ein Rollen (rolling) manifestiert) und später werden diese Zellen festhaftend (was sich durch Ankleben manifestiert). Festhaftende Leukozyten wandern über die Endothelzelloberfläche, verteilen sich zwischen Endothelzellen und wandern durch die Subendothelmatrix zur Entzündungsstelle oder der Stelle der Immunreaktion. Harlan et al., Adhesion-Its role in Inflammatory Disease, W. H. Freemen & Co., New York, 1992.
Obwohl die Leukozytenüberquerung von Gefäßwänden in ein extravaskuläres Gewebe für die Wirtsverteidigung gegen fremde Antigene und Organismen notwendig ist, haben die Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen häufig nachteilige Konsequenzen für den Wirt. Während des Ablaufs der Adhärens und der Transendothelialwanderung setzen die Leukozyten z. B. Oxidantien frei, wie auch Proteasen und Cytokine, die das Endothel direkt schädigen oder eine Endothel-Falsch-Funktion auslösen. Sobald sie an der extravaskulären Stelle angekommen sind, tragen die emigrierten Leukozyten weiterhin zum Gewebsschäden bei, indem sie eine Vielzahl von Entzündungsmediatoren freisetzen.
Außerdem sind einzelne Leukozyten, die im Kapillarlumen festhaften oder die Aggregation von Leukozyten innerhalb von größeren Gefäßen, für einen mikrovaskulären Verschluß und eine Ischämie verantwortlich. Eine Leukozyten-vermittelte vaskuläre und Gewebsverletzung ist an der Pathogenese einer großer Vielzahl klinischer Störungen beteiligt, wie z. B. akuter und chronischer Allograft-Abstoßung, Vaskulitis, rheumatoider und anderer Formen einer auf Entzündung basierenden Arthritis, entzündliche Hauterkrankungen, respiratorisches Störungssyndrom bei Erwachsenen, Ischämie-Reperfusionssyndrome, wie z. B. Myokardinfarkt, Schock, Schlaganfall, Organtransplantation, Zerstörungsverletzung und Gliedmaßenreplantationen. Id.
Viele andere ernstlich bedrohliche klinische Zustände involvieren zugrundeliegende entzündliche Prozesse bei Menschen. Die multiple Sklerose (MS) ist z. B. eine entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems. Bei der MS infiltrieren zirkulierende Leukozyten ein entzündetes Gehirnendothel und schädigen das Myelin, mit resultierender beeinträchtigter Nervenleitung und Paralyse. Yednock et al., 1992 Nature 366: 63-66. Systemischer Lupus erythematosus (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Gegenwart von Gewebsschaden gekennzeichnet ist, der durch ein gegen Antikörper gerichtetes Selbstantigen ausgelöst wird. Auto-Antikörper, gebunden an Antigene verschiedener Organe, führen zu Komplement-vermittelten und entzündlichen zellvermittelten Gewebsschäden. Theofilopoubs, A. N. 1992 Encyclopedia of Immunology, S. 1414-1417.
Eine Reperfusionsverletzung ist ein anderer Zustand, der mit der Aktivierung des entzündlichen Systems und einer erhöhten Leukozyten- Endothel-Zell-(EC)-Adhäsion assoziiert ist. Es gibt viele Beweise, daß die die Adhäsion unterstützenden Moleküle die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen erleichtern und eine wichtige Rolle bei einer akuten entzündlichen Reaktion und der sie begleitenden Gewebsverletzung spielen. Bei einer akuten Lungenverletzung, ausgelöst durch Ablagerung von IgG-Immunkomplexen oder nach einer Bolus. i.v.-Infusion von Cobra-Giftfaktor (CVF) führte z. B. die Aktivierung von Neutrophilen und die Erzeugung von toxischen Sauerstoffmebatoliten zu akuten Verletzungen. Mulligan et al., 1992 J. Immunol. 150(6):2401-2405. Neutrophile (PMNs) sind bekanntlich auch Mediatoren für eine Ischämie/Reperfusionsverletzung am Skelett und Herzmuskel, den Nieren und anderen Geweben. Pemberton et al., 1993, J. Immunol. 150: 5104-5113.
Die Infiltration der Luftwege durch entzündliche Zellen, insbesondere Eosinophile, Neutrophile und T-Lymphozyten sind charakteristische Merkmale von atopischen oder allergischem Asthma. Cotran et al., Pathological Basis of Disease, W. B. Saunders. Philadelphia, 1994. Die zelluläre Infiltration des Pankreas mit einer daraus resultierenden Zerstörung von Inse3-beta- Zellen ist die zugrundeliegende Pathogenese, assoziiert mit Insulin-abhängiger Diabetes mellitus. Burkly et al., 1994 Diabetes 43: 529-534. Die Aktivierung von Entzündungszellen, deren Produkte eine Gewebsverletzung auslösen, liegt der Pathologie der entzündlichen Verdauungsorganerkrankkungen zugrunde, wie z. B. der Crohn'schen Erkrankung und der Kolitis ulzerosa. Cotran et al., 1994. Neutrophile, Eosinophile, Mastzellen, Lymphozyten und Makrophagen tragen zu der entzündlichen Reaktion bei. Sehr kleine Mikroabszesse von Neutrophilen in den oberen Epithelschichten der Dermis begleiten die charakteristische epidermale Hyperplasie/Verdickung und das Abschuppen bei der Psoriasis.
Verschiedene antientzündliche Medikamente sind zur Zeit für die Verwendung und für die Behandlung von Zuständen erhältlich, die zugrundeliegende entzündliche Prozesse involvieren. Ihre Wirksamkeit ist jedoch sehr variabel und es verbleibt ein signifikanter, klinisch soweit nicht erfüllter Bedarf. Dies gilt insbesondere für die vorstehenden Erkrankungen, wo die erhältliche Therapie entweder nur begrenzt wirksam oder von unerwünschten Nebenwirkungen begleitet ist. Weiterhin sind nur wenige klinische Mittel erhältlich, die die zelluläre Infiltration direkt inhibieren, wobei es sich um einen der Hauptgründe für den Gewebsschaden handelt, der mit der Entzündung assoziiert ist. Daher besteht ein Bedarf an einem sicheren und wirksamen klinischem Mittel für die Verhinderung und Verbesserung der zellulären Infiltration und darauffolgender pathologischer Zustände, die mit entzündlichen Erkrankungen, Verletzungen und resultierenden Störungen der Cytokin-Netzwerke assoziiert sind.
Serinprotease-Inhibitoren (hiernach bezeichnet als "Serpine") bilden eine Superfamilie von verwandten Proteinen und es wurde festgestellt, daß sie von Poxviren vier unterschiedlicher Gattungen codiert werden, Das Myxoma-Virus (MYS) ist ein Leporipoxvirus, das eine virulente systemische Infektion, die Myxomatose, beim europäischen Kaninchen auslöst (Oryctolagus cuniculus). Die Myxomatose ist signifikant durch eine schnellverteilte Infektion gekennzeichnet, durch eine Immunsuppression und die Gegenwart von sekundären, gram-negativen Infektionen. Das damit eng verwandte Leporipoxvirus Shope fibroma-Virus (SFV) löst nur eine lokalisierte Infektion beim selben Wirt aus. SFV unterscheidet sich vom virulenten Myxoma-Virus darin, daß es nur einen fragmentierten offenen Leserahmen (ORF) für einen korrespondierenden Myxoma-Virus ORF enthält, der als SERP-1 bezeichnet wird. Eine Störung des SERP-1 ORF beim Myxoma-Virus oder bei dem verwandten malignen Kaninchen-Firbroma-Virus (MRV) führt zu einer Attenuierung der Viruspathogenität bei 0. cuniculus. Macen et al., 1993 Virology 195 : 348-363. Daher wurde allgemein angenommen, daß SERP-1 an der komplexen Reaktion auf die Leporipoxvirus-Infektion bei dem natürlichen Wirt O. cuniculus beteiligt ist. Obwohl die Abwesenheit von SERP-1 aus dem Myxoma-Virus offensichtlich eine erhöhte Immunreaktion beim Kaninchen auslöst, war der Mechanismus, über der SERP-1 als Virulenzfaktor wirkt, unklar.
Kürzlich wurde demonstriert, daß das SERP-1 Polypeptid die Intima- Fettzellulärproliferation verringert, die mit einer Restenose bei Kaninchen, folgend auf einer Ballon-Angioplastie, assoziiert ist. Lucas et al., 1994, J. Cell. Biochem. Suppl. 18A:286; Liu et al., 1993.Circulation 88:I- 81.
Die WO 95/27503 (EP 0 754 054A1), die gültig in die regionale Phase vor dem EPA eingetreten ist und daher Stand der Technik im Sinne von Art. 54(3) EPÜ bildet, betrifft ein Verfahren zur Behandlung von primärer und wiederauftretender atheromatöser Plaqueentwicklung. Das Verfahren involviert die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge SERP-1, vermischt in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger an die Intima oder Lumenschicht von Arterienwänden. Biologisch aktive SERP-1-Analoge werden auch bereitgestellt.
Es wurde in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung entdeckt, daß SERP-1, SERP-1-Analoge und biologisch aktive Fragmente davon in der Lage sind, die Infiltration von Gewebe durch entzündliche Zellen, die für einen Gewebsschaden bei entzündlichen Erkrankungen und Störungen verantwortlich sind, direkt zu inhibieren.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde überraschend festgestellt, daß das Protein SERP-1, ein Serinprotease-Inhibitor, erzeugt von dem malignen Kaninchen-Fibroma-Virus (MRV) und Myxoma-Virus (MYX) seine Analoge und biologisch aktiven Fragmente davon eine Infiltration entzündlicher Zellen in verletzte und erkrankte Gewebe verhindert und reduziert und auch bei Tieren außer dem Kaninchen für klinische Manifestationen, die keinen viralen Ursprung aufweisen. Die vorliegende Erfindung ist daher wirksam für die Verhinderung und Reduktion einer entzündlichen Zellinfiltration in einem erkrankten oder verletzten Gewebe eines betroffenen Subjekts und der physiologischen Symptome, die damit assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krankheiten und Verletzungen bereit, an denen entzündliche und Immunreaktion beteiligt sind. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sollten die SERP-1, SERP-1- Analoge und biologisch aktiven Fragmente davon einem Betroffenen, der einer solchen. Behandlung bedarf, für eine Zeitspanne und unter ausreichenden Bedingungen zur Verhinderung, Inhibition und/oder Verbesserung der entzündlichen oder Immunreaktionen verabreicht werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist auf die Verhinderung, Inhibition und/oder Verbesserung entzündlicher und Immunreaktionen gerichtet, assoziiert mit Zuständen, einschließlich hyperaktiven Luftwegen, wie z. B. bei Asthma. Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist auf die Verhinderung, Inhibition und/oder Verbesserung entzündlicher und Immunreaktionen gerichtet, assoziiert mit systemischen Lupus erythematosus. Eine weitere Ausführungsform ist auf die Verhinderung, Inhibition und/oder Verbesserung entzündlicher und Immunreaktionen gerichtet, assoziiert mit multipler Sklerose. Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist auf die Verhinderung, Inhibition und/oder Verbesserung entzündlicher und Immunreaktionen gerichtet, assoziiert mit entzündlicher Arthritis. Bei allen diesen Ausführungsformen der Erfindung werden das SERP-1, SERP-1-Analog oder biologisch aktive Fragmente davon in einer Weise verabreicht, die mit konventionellen Verfahrensweisen konsistent ist, die mit der Behandlung von Asthma, systemischem Lupus erythematosus, multipler Sklerose und entzündlicher Arthritis assoziiert sind, wie z. B. intravenös, intraartikulär, intraperitoneal, intraarteriell, intramuskuläre, intrarektal, subkutan oder durch Aerosol-Inhalation um eine entzündliche und Immunreaktion, assoziiert mit solchen Erkrankungen, zu inhibieren oder zu verbessern.
Andere Ausführungsformen der Erfindung sind auf die Verhinderung, Inhibition und/oder Verbesserung von entzündlichen und Immunreaktionen gerichtet, assoziiert mit Verletzungen und Krankheiten wie z. B.: Koronararterienverschluß, Herzarrhythmien, Herzinfarkt, Kardiomyopathie, Bronchitis, akute allergische Reaktionen und Hypersensibilität, Neutrotrauma, entzündlichen Verdauungsorganerkrankungen, Psoriasis, systemische Schockverletzung, Graft/Transplantat-Abstoßung, Myokarditis, insulinabhängige Diabetes und Schlaganfall. Bei diesen Ausführungsformen der Erfindung wird das SERP-1, SERP-1-Analog oder biologisch aktive Fragment davon in einer Weise verabreicht, die mit den konventionellen Verfahrensweisen konsistent ist, die mit der Behandlung der jeweiligen Verletzung oder Krankheitsbedingung assoziiert ist, wie z. B. intravenös, intraartikulär, intraarteriell, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär, intrarektal, topisch oder die Aerosol-Inhalation, um die entzündlichen und Immunreaktionen, assoziiert mit solchen Erkrankungen, zu inhibieren und zu verbessern.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die SERP-1, seine Analage oder biologisch aktiven Fragmente, vermischt mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, beinhalten.
Gemäß einer, weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf einen Herstellungsartikel gerichtet, umfassend Verpackungsmaterial und SERP-1, ein SERP-1-Analog oder biologisch aktives Fragment davon in dem Verpackungsmaterial, wobei das pharmazeutische Mittel wirksam ist zur Behandlung von entzündlichen Zuständen, wie z. B. Arthritis, entzündliche Verdauungsorganerkrankungen, systemischem Lupus erythematosus und multipler Sklerose und wobei das Verpackungsmaterial ein Schild umfaßt, das angibt, daß das pharmazeutische Mittel für die Behandlung solcher entzündlicher Zustände verwendet werden kann.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden durch die Verabreichung von SERP-1, seiner Analoge und biologisch aktiver. Fragmente in ausreichenden Mengen zum Erhalt der gewünschten therapeutischen Wirkung bewirkt.
Fig. 1 zeigt die Nukleotid- und korrespondierende Aminosäuresequenz des Myxoma-Virus (MYX) SERP-1 offenen Leserahmens (SEQ ID NO: 1).
Fig. 2 ist eine Photographie, die die elektrophoretischen Wanderungsmuster des reifen, verarbeiteten SERP-1-Proteins und der Vaccine- Vektorkontrolle in einem mit Silber gefärbten SDS-Polyacrylamid-Gel darstellt. Spur 1 zeigt das Elektrophoresemuster von Mono-Q-gereinigtem VV-601 (Kontrollvektor). Spur 2 zeigt das elektrophoretische Muster des Mono-Q-gereinigten SERP-1-Proteins, sezerniert aus Baby-Zellen von der Niere des Grünaffen (BGMK) infiziert mit VV-S1. Spur 3 zeigt das Elektrophoresemuster von SERP-1, weiter zur Homogenität gereinigt unter Verwendung von Superdex 75.
Fig. 3A zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit glatter Muskelzell-(alpha Actin-Antikörper)-Verteilung an der primären Stelle, 24 Stunden nach einer 3 ng SERP-1-Infusion (260-fache Vergrößerung).
Fig. 3B zeigt einen immunogefärbten Bereich der. Kaninchen-Aorta mit einer glatten Muskelzell-(alpha-Actin-Antikörper)-Verteilung an der Primärstelle, 24 Stunden nach einer Kontroll-Salzlösungsinfusion (260-fache Vergrößerung).
Fig. 3C zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit mononukleären Leukozyten (CD11B-Antikörper positiv)-Verteilungen an der Primärstelle, 24 Stunden nach einer 30 ng SERP-1-Infusion (260-fache Vergrößerung).
Fig. 3D zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit mononukleären Leukozyten (CD11B-Antikörper positiv)-Verteilungen an der Primärstelle, 24 Stunden nach einer Kontroll-Salzlösungsinfusion (260-fache Vergrößerung).
Fig. 3E zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit einer T-Lymphozyten-(anti CD25 positiven)-Verteilung an der Primärstelle, 24 Stunden nach einer 30 ng SERP-1-Infusion (400-fache Vergrößerung).
Fig. 3F zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit einer T-Lymphozyten-(anti CD25 positiven)-Verteilung an der Primärstelle, 24 Stunden nach einer Kontroll-Salzlösungsinfusion (400-fache Vergrößerung).
Fig. 3G zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit Makrophagen-(RAM11 positiv)-Verteilung an einer Primärstelle, 24 Stunden nach einer 3 ng SERP-1-Infusion (400-fache Vergrößerung).
Fig. 3H zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit Makrophagen-(RAM11 positiv)-Verteilung an einer Primärstelle, 24 Stunden nach einer Salzlösungsinfusion (400-fache Vergrößerung).
Fig. 4A zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit einer glatten Muskelzell-(alpha-Actin-Antikörper)-Verteilung an der Primärstelle, 4 Wochen nach einer 3 ng SERP-1-Infusion (400-fache Vergrößerung).
Fig. 4B zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit einer glatten Muskelzell-(alpha-Actin-Antikörper)-Verteilung an der Primärstelle, 4 Wochen nach einer Kontroll-Salzlösungsinfusion (260-fache Vergrößerung).
Fig. 4C zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit mononukleären Leukozyten-(CD11B Antikörper positiv)-Verteilung an der primären Stelle, 4 Wochen nach einer 30 ng SERP-1-Infusion (260-fache Vergrößerung).
Fig. 4D zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit mononuklearen Leukozyten-(CD11B Antikörper positiv)-Verteilung an der primären Stelle, 4 Wochen nach einer Kontroll-Salzlösungsinfusion (260- fache Vergrößerung).
Fig. 4E zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit einer T-Lymphozyten-(anti-CD25-positiv)Verteilung an der primären Stelle, 4 Wochen nach einer 30 ng SERP-1-Infusion (Vergrößerung 260-fach).
Fig. 4F zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit einer T-Lymphozyten-(anti-CD25-positiv)Verteilung an der primären Stelle, 4 Wochen nach einer Kontroll-Salzlösungsinfusion (Vergrößerung 260-fach).
Fig. 4G zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit einer Makrophagen-(RAM11-positiv)-Verteilung an einer primären Stelle, 4 Wochen nach einer 3 ng SERP-1-Infusion (260-fache Vergrößerung).
Fig. 4H zeigt einen immunogefärbten Bereich der Kaninchen-Aorta mit einer Makrophagen-(RAM11-positiv)-Verteilung an einer primären Stelle, 4 Wochen nach einer Salzlösungsinfusion (260-fache Vergrößerung).
Fig. 5A ist eine Säulengraphik, die relative zelluläre Populationen demonstriert, nachgewiesen an primären und sekundären Stellen, 24 Stunden nach einer Ballonverletzung und einer Wolinsky-Katheterinfusion von SERP-1 in eine Kaninchen-Aorta. Die Primär (P)-Stelle bezeichnet die Stelle der Wolinsky-Infusion von gereinigtem SERP-1-(+)- oder Salzlösung (-)- und die Sekundär-(S)-Stelle ist eine stromaufwärts gelegener ballongeschädigter aber nicht infundierter Bereich in der oberen Arteria thoracica. Die angefärbten Zellpopulationen waren glatte Muskelzellen (SMC), CDllb positive mononukleäre Leukozyten (MNL), T-Lymphozyten (T) und Makrophagen (M).
Fig. 5B ist Säulengraphik, die relative zelluläre Populationen demonstriert, nachgewiesen an primären und Sekundärstellen, 4 Wochen nach einer Ballonverletzung und einer Wolinsky-Katheterinfusion von SERP-1 in eine Kaninchen-Aorta. Die Primär-(P)-Stelle bezeichnet die Stelle der Wolinsky-Infusion von gereinigtem SERP-1 (+) oder Salzlösung (-) und die Sekundär-(S)-Stelle ist ein stromaufwärts gelegener ballongeschädigter, aber nicht infundierter Bereich in der oberen Arteria thoracica. Die gefärbten Zellpopulationen waren glatte Muskelzellen (SMC), CD11b-positive mononukleäre Leukozyten (MNL), T-Lymphozyten (T) und Makrophagen (M).
Fig. 6A zeigt einen Bereich eines Kaninchen-Synovial-Gewebes (erhalten auf Stufe B), der eine Synovialentzündung vier Wochen nach intraartikulärer Verabreichung von TGF-beta-2 und Ovalbumin bei einem Kochsalz-behandelten Tier zeigt.
Fig. 6B zeigt einen Bereich des Kaninchen-Synovial-Gewebes (erhalten in Schritt B), der eine Synovialentzündung zeigt, und Riesenzellen (Pfeil) 4 Wochen nach einer intraartikulären Verabreichung von TGF-beta-2 und Ovalbumin bei einem Salzlösung-behandelten Tier.
Fig. 7 zeigt einen Bereich des Kaninchen-Synovial-Gewebes, der eine Auflösung der Synovitis bei Schritt B SERP-1-behandelten Tieren sechs Wochen nach intraartikulärer Verabreichung von TGF-beta-2 und Ovalbumin aufweist.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde überraschend entdeckt, daß das Protein SERP-1, ein von malignem Kaninchen-Fibroma-Virus (MRV) und Myxoma-Virus (MYX) erzeugter Serinprotease-Inhibitor, seine Analoge und seine biologisch aktiven Fragmente, die Infiltration von entzündlichen Zellen in verletzte und erkrankte Gewebe inhibieren, verhindern und reduzieren, und zwar auch bei Tieren, bei denen es sich nicht um Kaninchen handelt, für klinische Manifestationen, die nicht-viralen Ursprungs sind. Die vorliegende Erfindung ist daher geeignet zur Verhinderung, Inhibition und/oder Verbesserung von entzündlichen und Immunreaktionen, assoziiert mit verschiedenen Verletzungs- und Erkrankungsbedingungen.
Insbesondere soll in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eine therapeutische wirksame Menge SERP-1, SERP-2-Analoge oder biologisch aktive Fragmente einem Subjekt verabreicht werden, das einer solchen Behandlung bedarf, für eine Zeitspanne und unter ausreichenden Bedingungen, um die entzündliche oder Immunreaktion zu verhindern, zu inhibieren und/oder zu verbessern. Die Bezeichnung "Subjekt", wie hier verwendet, soll jeden Säugetierpatienten bezeichnen, dem die Zusammensetzungen der Erfindung verabreicht werden können. Subjekte, für die die Behandlungen mit den Zusammensetzungen und Verfahrensweisen der vorliegenden Erfindung besonders beabsichtigt ist, beinhalten Menschen, wie auch nicht-menschliche Primaten, Schafe, Pferde, Rinder, Ziegen, Schweine, Hunde, Katzen, Kaninchen, Meerschweinchen, Geflügel, Hamster, Ratten und Mäuse, wie auch die Organe, Tumoren und Zellen, die von diesen Wirten abgeleitet sind oder von diesen stammen.
Die vorliegende Erfindung ist daher für die Behandlung einer Vielzahl klinischer Zustände geeignet, die entzündliche Pathologien involvieren wie z. B. Asthma. Asthma ist durch eine Hyperreaktion des Tracheobronchialbaums gegenüber verschiedenen Stimuli charakterisiert, wie z. B. Allergenen, Anstrengung, Temperatur, Chemikalien und Sporen. Das häufigste Asthma ist ein atopisches oder allergisches Asthma und involviert eine Direktreaktion aufgrund einer Mastzellen-Histaminfreisetzung und einer Freisetzung entzündlicher Modulatoren, die Eosinophile, Neutrophile und Lymphozyten heranziehen. Die Akutreaktion führt zu einer Bronchokonstriktion, Ödemen, erhöhter Mucus-Sekretion, Erröten und in einigen Fällen einer Hypotension. Eine Spät-Phasenreaktion, die 4 bis 8 Stunden später auftritt, und bis zu 24 Stunden anhält, tritt aufgrund der Gegenwart der größen Population herangeführter entzündlicher Zellen auf, die weitere Mediatoren der Bronchokonstriktion freisetzen, was zu Ödem und Epithelschaden führt.
Das respiratorische Störungssyndrom bei Erwachsenen (ARDS) ist ebenfalls mit Zusammensetzungen und Verfahrensweisen der vorliegenden Erfindung behandelbar. ARDS ist ein entzündlicher Zustand, der durch eine erhöhte Kapillar-Permeabilität, interstitielle und intra-alveoläres Ödem, Fibrinexudation und Bildung von Hyalinmembran gekennzeichnet ist. Entzündliche Zellen und Mediatoren, einschließlich Leukozyten, Cytokinen, Sauerstoffradikalen, Komplement und Arachidonat-Metaboliten schädigen das kapillare Endothel und ermöglichen es, daß Flüssigkeit und Protein über die Kaprillaren leckt.
Die vorliegende Erfindung ist auch für die Verhinderung, Inhibition und/oder Verbesserung von entzündlichen Immunreaktionen, assoziiert mit systemischem Lupus erythematosus (SLE) geeignet. SLE ist eine klassische Multisystem-Autoimmunerkrankung, gekennzeichnet durch die Anwesenheit von Gewebsschaden aufgrund von Antikörpern, die gegen Eigen-Antigen gerichtet sind. Auto-Antikörper, gebunden an Antigene in verschiedenen Organen, führen zu einem Komplement-vermittelten und durch entzündliche Zellen vermittelten Gewebsschaden. Die Haut, Bindegewebe, Blutgefäße und Gelenke werden von dieser chronischen, wiederauftretenden und durch Rückfall gekennzeichneten Krankheit betroffen, jedoch ist ein Nierenversagen aufgrund einer durch Antikörper vermittelten Glomerulonephritis die wesentliche und lebensbedrohende Komplikation. Die vorliegende Erfindung ist geeignet für die Behandlung anderer Autoimmunerkrankungen, wie z. B. dem Skleroderm, verschiedener Formen der Vaskulitis, der entzündlichen Autimmunmyositis und der Autoimmunthyroiditis.
Die Zusammensetzungen und Verfahrensweisen der vorliegenden Erfindung sind auch für die Behandlung der multiplen Sklerose (MS) geeignet. MS ist durch das Eindringen von zirkulierenden Leukozyten über die Bluthirnschranke gekennzeichnet, was zu einer Demyelinisierung in verschiedenen Teilen des Gehirns führt, sowie zu beeinträchtigter Nervenleitung und schließlich zur Paralyse. Bestimmte T-Zell-Klone, die mit dem Myelin- basischen Protein reaktiv sind, lokalisieren sich im zentralen Nervensystem und initiieren die Entzündung.
Die vorliegende Erfindung ist auch wirksam für die Behandlung unterschiedlicher Formen der entzündlichen Arthritis. Es gibt viele verschiedene Typen der Arthritis, die klinisch erkannt werden, wobei die häufigste die rheumatoide Arthritis ist. Der entzündliche Weg, der für die Pathogenese der rheumatoiden Arthritis relevant ist, ist jedoch vermutlich auch relevant für die Pathogenese anderer Arten der Arthritis, z. B. Osteo-, psoriatische und Spondyloarthropathien, da die Synovialpathologien bei allen diesen Arthritisformen in vielen Fällen dieselben sind.
Bei den vorstehenden Ausführungsformen der Erfindung wird SERP-1, das SERP-1-Analog oder das biologisch aktive Fragment davon in einer Weise zugeführt, die mit den konventionellen Verfahrensweisen konsistent ist, die mit der Behandlung von Asthma, systemischem Lupus erythematosus, entzündlicher Autoimmunmyositis, Autoimmunthyroiditis, multipler Sklerose und Arthritis assoziiert sind, wie z. B. intravenös, intraartikulär, intrarektal, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan oder durch Aerosol- Inhalation, um die mit diesen Erkrankungen assoziierten entzündlichen und Immunreaktionen zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung ist für die Behandlung vieler anderer klinischer Zustände, die entzündliche Prozesse involvieren, geeignet. Z. B. sind die entzündlichen Nahrungsorganerkrankungen, einschließlich des Morbus Crohn und der ulzerativen Kolitis spontane chronische Entzündungen des Gastrointestinaltrakts, die eine Aktivierung entzündlicher Zellen involvieren, deren Produkte eine Gewebsverletzung auslösen. Neutrophile, Eosinophile, Mastzellen, Lymphozyten und Makrophagen tragen zu der entzündlichen Reaktion bei.
Die Psoriasis, die - unter anderen Symptomen - von einer Epidermis- Hyperplasie/Verdickung und kleinen Mikroabszessen von Neutrophilen in den oberen Epithelschichten der Dermis gekennzeichnet ist, ist ebenfalls durch die Zusammensetzungen und Verfahrensweisen der vorliegenden Erfindung behandelbar. Es wird angenommen, daß die Psoriasis durch eine Autoimmunentzündungsreaktion auf ein Antigen-Set in der Haut ausgelöst wird. Eine erhöhte autologe T-Zellreaktion wird bei Zellen, die von der psoriatischen Läsion stammen, beobachtet.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf die Behandlung von systemischem Schock und viele daraus resultierende klinische Zustände, die damit assoziiert sind, gerichtet. Der systemische. Schock tritt häufig als Komplikation von schwerem Blutverlust, einer schweren lokalisierten bakteriellen Infektion, einem Ischämie/Reperfusionstrauma auf und ist ein Hauptgrund für den Tod auf Intensivstationen. Viele Fälle des septischen Schocks werden durch Endotoxine induziert (d. h. bakterielle Zellwand-Lipopolysacchairde oder LPS) aus gram-negativen Bazillen oder Toxine (d. h. toxisches Schocktoxin 1) aus gram-positiven koccen-förmigen Bakterien. Die Freisetzung von LPS in den Blutstrom führt zu einer Freisetzung von Entzündungsmediatoren (Entzündungscytokine, Blutplättchen-aktivierender Faktor, Komplement, Leukotriene, Sauerstoffmetaboliten und ähnliches), die zu einer Myokard-Dysfunktion, einer Vasodilatation, einer Hypotension, einer Endothelverletzung, einer Leukozyten-Adhäsion und -Aggregation, und einer disseminierten intravaskulären Koagulation, sowie dem Atmungsstörungssydrom bei Erwachsenen (ARDS), einem Versagen von Leber, Nieren und zentralem Nervensystem (ZNS) führen. Ein Schock aufgrund eines Blutverlustes involviert auch eine Freisetzung von Entzündungsmediatoren. In jedem Fall werden die entzündlichen Reaktionen an der Ursprungsstelle des Traumas induziert und ebenfalls in der Veraderung und entfernten vaskularisierten Stellen.
Die Myokardischämie ist mit einer Aktivierung des Komplementsystems assoziiert, die die Herzverletzung mit einer Verstärkung einer Reihe entzündlicher Ereignisse unterstützt. Ein lebensbedrohlicher lokaler und auch entfernter Gewebsschaden tritt während chirurgischen Eingriffen, Trauma und Schlaganfall auf, wenn Hauptadern für eine Zeitspanne der Sauerstoffbeladung entzogen werden (Ischämie), und dann wieder auf normale Zirkulation zurückgeführt werden (Reperfusion). Die Reperfusionsverletzung ist durch eine vaskulare Permeabilität gekennzeichnet, die zu einem Ödem sowie zu einer Infiltration entzündlicher Zellen führen kann. Neutrophile tragen signifikant zu einem Reperfusionsschaden durch die Erzeugung von Oxidantien oder die Freisetzung von Proteasen bei, die die Mikrovaskulatur oder benachbartes Gewebe schädigen. Der Zelltod und der Gewebsschaden aufgrund von Komplement und entzündlichen Zellmechanismen führt zu einem Organversagen oder einer verminderten Organfunktion. Die Aktivierung von Mediatoren durch eine lokale Verletzung kann auch eine entfernte Verletzung an hochvaskularisierten Organen auslösen. Die Zusammensetzungen und Verfahrensweisen der vorliegenden Erfindung sind für die Behandlung von Ischämie und Reperfusionsverletzung geeignet.
Ein Entzündungsreaktionsschaden tritt auch bei der Glomerulonephritis auf, wie auch bei einer Erkrankung der Tubuli. Die Infiltration entzündlicher Zellen (insbesondere von Makrophagen) ist mit einer Proteinurie verbunden, die histologisch von einer Hyperzellularität und ansteigender Bildung in Glomeruli begleitet wird. Über einen längeren Zeitraum ist die Infiltration der entzündlichen Zellen mit einer Anhäufung einer extrazellulären Matrix und einer Sklerose und einer chronischen Beeinträchtigung der Nierenfunktion assoziiert. Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls wirksam für die Behandlung der Glomerulonephritis und der Erkrankung der Tubuli.
Es gibt viele andere Erkrankungen und Verletzungszustände, die aus den Zusammensetzungen und Verfahrensweisen der vorliegenden Erfindung Nutzen ziehen können, wie z. B. eine Koronararterienokklusion, Herzrhythmusstörungen, Herzversagen, Kardiomyopathie, Bronchitis, akute allergische Reaktionen und Hypersensitivität, Neutrotrauma, Graft/Transplantat-Abstoßung, Myokarditis, Insulin-abhängige Diabetes und Schlaganfall.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden die vorstehenden Erkrankungs- und Verletzungszustände durch Verabreichung des SERP-1-, SERP-1-Analog- oder biologisch aktiven Fragments in einer Weise behandelt, die mit den konventionellen Verfahrensweisen konsistent ist, die mit der Behandlung der jeweiligen Erkrankung oder des Verletzungszustandes assoziiert sind, wie z. B. intravenös, intraartikulär, intraperitoneal, topisch, intrarektal, interarteriell, intramuskulär, subkutan oder durch Aerosol-Inhalation um die entzündlichen und Immunreaktionen, die mit einer solchen Erkrankung oder einem Verletzungszustand assoziiert sind, zu inhibieren oder zu verbessern.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird das SERP-1- Protein, SERP-1-Analog oder biologisch aktive Fragment zunächst isoliert und gereinigt, so daß Verunreinigungen entfernt werden. Bei einem bevorzugten Verfahren für die Erzeugung des SERP-1-Proteins, -Analogs oder biologischen Fragments der vorliegenden Erfindung wird ein Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Molekül oder Segment, das die codierende Sequenz für ein SERP-1, SERP-1-Analog oder biologisch aktives Fragment definiert, d. h. in der Lage ist, es zu exprimieren, verwendet. DNA für SERP-1 kann aus MRV und MYX und verwandten Viren unter Verwendung konventioneller Mittel isoliert werden. Ein SERP-1-Nukleotid und seine korrespondierende Aminosäuresequenz ist veröffentlicht (Upton et al. 1990, Virology 179: 618-631) und ist ebenfalls in Fig. 1 dargestellt (SEQ ID NO: 1).
Das Myxoma-Virus kann von der American Type Culture Collection (ATCC), Katalog-Nr. VR-115 erhalten werden. Die DNA kann aus dem Myxoma- Virus durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren extrahiert werden. Der gesamte SERP-1-ORF oder ein Fragment davon kann durch wohlbekannte Verfahren, wie z. B. die Polymerase-Kettenrektion (PCR) vervielfältigt werden. Auf diese Weise wird der gesamte SERP-1-ORF oder ein Teil davon erhalten.
Ein DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz, die das betroffene Protein codiert, enthält, kann auch hergestellt werden indem geeignete Restriktionsfragmente verschiedener Plasmide, die an anderer Stelle beschrieben sind, operativ verbunden werden. Siehe z. B. Upton, et al., 1990 Virology 179; 6.18-321; Macen et al., 1993 Virology 195: 348-363. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Ribonukleinsäure (RNA)-Äquivalente der oben beschriebenen Moleküle.
Auf diese Weise wird das SERP-1, SERP-1-Analog oder biologisch aktive Fragment durch ein rekombinantes DNA-Molekül erzeugt, das einen Vektor beinhaltet, der für die Replikation und/oder Expression mit einer codierenden Sequenz für das Ziel-SERP-1-Protein operativ verbunden ist. Die Bezeichnung "Vektor" wie hier verwendet, betrifft ein DNA-Molekül, das zur autonomen Replikation in einer Zelle in der Lage ist und an das ein anderes DNA-Segment operativ gebunden werden kann, um die Replikation des gebundenen Segments herbeizuführen. Vektoren, die in der Lage sind, die Expression eines Gens zu steuern, das von einem Ziel-DNA-Segment beliefert wird, werden als "Expressionsvektoren" bezeichnet.
Ein Verfahren zur Erzeugung des Zielproteins der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Vektors, umfassend ein prokaryotisches Replikon, d. h. eine DNA-Sequenz mit der Fähigkeit, die autonome Replikation zu steuern und Erhalt des rekombinanten DNA Moleküls extrachromosomal in einer prokaryotischen Wirtszelle, wie z. B. einer bakteriellen Wirtszelle, die hiermit transformiert ist. Solche Replikons sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Zusätzlich beinhaltet ein Expressionsvektor einen prokaryotischen Promotor, der in der Lage ist, die Expression (Transkription und Translation) des Ziel-SERP-1-Proteins, SERP-1-Analogs oder biologisch aktiven Fragments zu steuern. Promotorsequenzen, die mit bakteriellen Wirten kompatibel sind, werden typischerweise in Plasmid-Vektoren bereitgestellt, die geeignete Restriktionsstellen für die Insertion eines DNA-Segments enthalten, das für das Ziel-SERP-I-Protein, Analog oder biologisch aktive Fragmente codieren. Ein typisches Beispiel für einen bakteriellen Expressionsvektor ist pEX29, der den pL-Promotor verwendet (Klinkert et al., 1985 Infection and Immunity 49: 329; Remaut et al., 1981 Gene 15: 81) und der eine Expression in einem E. coli-Wirtsstamm wie z. B. W3110 (ATTC-Zugangs-Nr. 27325) ermöglicht.
Bevorzugte Expressionsvektoren für die Erzeugung von SERP-1, einem SERP-1-Analog oder einem biologisch aktiven Fragment sind mit eukaryontischen Zellen kompatibel und sind vorzugsweise mit Säugerzellen kompatibel. Die Expression des SERP-1, SERP-1-Analog oder biologisch aktiven Fragments in eurkaryontischen Zellen wird bevorzugt, da solche Zellen in der Lage sind, das SERP-1-Protein zu glycosylieren. Bei einigen Säuger-Expressionsvektoren kann die SERP-1-DNA-Sequenz Veränderungen enthalten, um kryptische Splice-Stellen zu inaktivieren, die eine akkurate Expression der SERP-1-Boten-RNA ausschließen. Eukaryontische Zellexpressionsvektoren sind auf dem Gebiet wohlbekannt und sind von verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich: Typischerweise umfassen solche Vektoren geeignete Stellen für die Insertion eines gewünschten DNA- Segments. Beispiele für kommerziell erhältliche Expressionsvektoren mit geeigneten Restriktionsstellen sind pSVL und pKSV-10 (Pharmacia) pBPV-1pML2d (IBI) und pTDT1 (ATCC Zugangs-Nr. 31255). Andere bevorzugte Vektoren beinhalten pSAB132 und pJOD-S und die Derivate pMDR901 und pMDR902 (Barsoum, 1990 DNA und Cell Biology 9: 292; Miller et al., 1993 J. Exp. Med. 178: 211).
Die mit eukaryontischen Zellen kompatiblen Expressionsvektoren, die verwendet werden um die SERP-1-Expressionsvektoren für die Erzeugung des SERP-1-Proteins zu konstruieren, können einen Selektionsmarker beinhalten, der in einer eukaryontischen Zelle wirksam ist, vorzugsweise einen Arzneimittelresistenz-Selektionsmarker. Ein Beispiel für einen Arzneimittelresistenz-Selektionsmarker ist die Neomycin-Resistenz, erhalten durch Expression des Neomycinphosphotransferase-Gens.
Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen beinhalten Hefe-, Insekten- und Wirbeltierzellen, vorzugsweise Säugerzellen, wie z. B. diejenigen aus Maus-, Ratte-, Affe-, oder menschlichen Fibroblasten-Zellinien. Beispiele für eukaryontische Wirtszellen beinhalten die Eizellen des Chinesischen Hamsters (CHO), erhältlich von der ATCC als CCL61 und NIH-Schweizer-Mäuse- Embryozellen NIH/3T3, erhältlich von der ATCC als CRL1658. Die Transformation geeigneter Zellwirte mit einem rekombinanten DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung wird durch wohlbekannte Verfahren bewirkt, die typischerweise von der Art des verwendeten Vektors abhängen. Transformationsverfahren prokaryontischer Zellen sind in Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972) beschrieben. Die Transformation eukaryontischer Wirtszellen einschließlich der Wirbeltierzellen wird in Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NX; und Barsoum, 1990 DNA and Cell Biology 9: 292, Barsoum 1995 (im Druck) Methods in Molecular Biology XX: Electroporation Protocols, Hrsg. Nickoloff, Humana Press Inc., Totowa, NJ beschrieben,
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen die ein rekombinantes DNA-Molekül enthalten, das für SERP-1, ein SERP-1-Analog oder biologisch aktives Fragment davon codieren, können durch wohlbekannte Verfahren identifiziert werden. Z. B. können Zellen, resultierend aus der Einführung von rDNA-Vektoren, enthaltend codierende Sequenzen für SERP-1, SERP-1- Analog oder biologisch aktive Fragmente davon kloniert und vervielfältigt werden, um monoklonale Kolonien zu erzeugen. Zellen aus diesen Kolonien können geerntet, lysiert und ihr DNA-Gehalt kann auf das Vorliegen von SERP-1-DNA analysiert werden, unter Verwendung eines Verfahrens, wie z. B. das, das von Southern, J. Mol. Biol., 98-503 (1975) oder Brent et al., Biotech., 3: 208 (1985) beschrieben wird.
Neben einem direkten Assay auf Gegenwart von SERP-1-DNA, können erfolgreiche Transformanten durch wohlbekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rDNA in der Lage ist, die Expression des Zielproteins zu steuern. Zellen, die mit einem Expressionsvektor erfolgreich transformiert sind, umfassend codierende Sequenzen für SERP-1, erzeugen sezerniertes SERP-1, SERP-1-Analog oder biologisch aktive Fragmente davon. Proben von Zellen, von denen man annimmt, daß die transformiert sind, werden geerntet und auf Gegenwart von SERP-1-Antigenizität unter Verwendung von Anti-SERP-1-Antikörpern untersucht.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird BV12-10a, ein M13-Klon, der für die Sequenzierung des Myxoma-Virus BamEI U3-Fragments verwendet wird (Upton et al., 1990 Virology, 179: 618-631), der den intakten SERP-1 ORF (SEg ID NO: 1) enthält, in E. coli CJ236 (dut-, ung-) gezüchtet. Die Verfahren und Verfahrensweisen, die in der Upton et al-Referenz verwendet werden, sind hier durch Inbezugnahme eingeschlossen. Eine Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wird durchgeführt, wie beschrieben in Kunkel et al., 1987, Methods Enzymology, 154: 367-382, um eine BamHI-Stelle direkt 5' zu de SERP-1-Initiationscodon (GGATCCATG) zu inserieren. Der resultierende Phage wird in E. coli JM103 propargiert. Ein 1301-bp BamHI/HindIII-Fragment von diesem Phagen, enthaltend den intakten SERP-1 ORF wird in pMTL22 subkloniert (Chambers et al., 1988 Gene 68 : 139-149). Ein 1344-bp BamhI/BGII-Fragment wird dann in die BamHI-Stelle des Vaccinia- Expressionsplasmids pMJ601 ligiert (Davidson et al., 1990 Nucleic Acids Res. 18: 4285-4286) was es dem SERP-1 ermöglicht, in das TK-Gen des Vaccinia-Virus unter Kontrolle eines starken, synthetischen späten Promotors inseriert zu werden. Rekombinantes Vaccinia-Virus (Stamm WR) wird auf TK H143-Zellen in Gegenwart von 25 pg/ml BUdR selektioniert und Plaque-gereinigt. Die Expression des SERP-1-Protein von dem rekombinanten Virus (bezeichnet als VV-S1) wird durch ein Immunoblotting unter Verwendung von Anti-SERP-1-Antiserum bestätigt. Das Kontrollvirus (das den SERP-1-ORF nicht enthält) wird durch Erzeugung von TK- Rekombinanten des Vaccinia-WR unter Verwendung des Stamm pMHJ601-Plasmids hergestellt.
SERP-1, erzeugt von VV-S1 wird von den Überständen von Affen-BGMK- Zellen 24 Stunden nach Infektion mit dem Virus mit einer Multiplizität der Infektion von 1 PBU pro Zelle wie beschrieben geerntet (Macen et al., 1993 Virology 195: 348-363). Die Verfahren und Arbeitsweisen, die in dem Macen et al.-Artikel verwendet werden, werden hier durch Inbezugnahme inkorporiert.
Um das in W-51 erzeugte serzernierte SERP-1-Glycoprotein zu sammeln und zu reinigen, wird das Wachstumsmedium, das die sezernierten viralen Proteine enthält, gesammelt, durch Zentrifugation geklärt und gegen 25 mM Tris pH 8,0 dialysiert und das Protein kann z. B. mit einer Amicon Centriprep-10-Vorrichtung konzentriert werden. Die dialysierten Proben werden dann auf eine MonoQ-Säule (Pharmacia) geladen und Protein wird unter Verwendung eines linearen Salzgradienten (0-300 mM NaCl) eluiert. Das auf diese Weise gereinigte SERP-1-Protein ist halb gereinigt. Vorzugsweise wird das SERP-1-Protein dann weiter durch eine Superdex-75-Säulenchromatographie gereinigt. Das weiter auf diese Weise gereinigte SERP-1-Protein wird als höher gereinigt angesehen und zeigt eine höhere biologische Aktivität.
SERP-1-enthaltende Fraktionen können durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) analysiert werden. Gesamtprotein-Konzentrationen können durch wohlbekannte Verfahren, wie z. B. dem Bradford-Assay, bestimmt werden. Protein-Konzentrationen können ebenfalls durch densitrometrische Scans von Silber gefärbten Gels oder Western Blotting unter Verwendung von bakteriell exprimierten SERP-1-Protein als Kontrollstandards eingestellt und bestimmt werden. Der Kontroll-Vaccinia- Vektor, dem der SERP-1-ORF fehlt, kann ebenfalls aus dem BGMK-Zellüberstand in identischer Weise geerntet und gereinigt werden.
Nach Reinigung zu einem halbreinen oder vorzugsweise dem noch höher reinen Zustand kann das SERP-1 dann mit sterilem Wasser und Salzlösung oder einem anderen pharmazeutisch akzeptablen Träger auf eine Konzentration im Bereich von 1 pg/ml bis 10 mg/ml und vorzugsweise zwischen 1 pg/ml und 1 u/ml vermischt werden. Alternativ kann das SERP-1, SERP-1-Analog oder biologisch aktive Fragment davon als lyophilisiertes Pulver gelagert oder eingefroren werden und kann dann später in sterilem Wasser oder Salzlösung oder einem anderen pharmazeutisch akzeptablen Träger auf die oben aufgeführten Konzentrationen gelöst werden.
Das SERP-1 der vorliegenden Erfindung kann einem menschlichen Patienten vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzung in einer therapeutisch effektiven Menge verabreicht werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten eine therapeutisch effektive Dosis des SERP-1-Proteins, der Homologe oder Analoge davon oder enthalten ansonsten ein biologisch aktives Fragment des SERP-1-Proteins, Homologe oder Analoge davon, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Bezeichnung "therapeutisch wirksame Menge " bedeutet, daß die für eine effektive Behandlung einer zellulären Infiltration und der begleitenden Cytokin-Netzwerkveränderungen, die mit einer Vielzahl entzündlicher Erkrankungen und Verletzungen assoziiert sind, benötigte Dosis bezeichnet wird. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung beinhalten die Bezeichnungen "behandeln" oder "Behandlung" die Verhinderung, Inhibition, Reduktion des Auftretens von und/oder Verbesserung der physiologischen Effekte des behandelten entzündlichen Zustands.
In dem vorliegenden Zusammenhang bedeutet "Analoge" auch Substitutionen oder Veränderungen in der Aminosäuresequenz des SERP-1-Proteins, wobei diese Substitutionen oder Veränderungen (z. B. Additionen und Deletionen) die antientzündlichen Eigenschaften des Proteins aufrecht erhälten, wenn sie der Entzündungsstelle zugeführt werden, entweder gerichtet gegen die Stelle, d. h. lokal oder systemisch. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Bezeichnung "Analog" Aminosäure- Insertions-Derivate von SERP-1, wie z. B. Amino- und/oder Carboxyl-terminale Fusionen, wie auch Intrasequenz-Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren. Insertions-Aminosäuresequenz-Varianten sind diejenigen, bei denen ein oder mehrere Aminosäure-Reste in eine bestimmte Stelle im Protein eingeführt werden. Eine willkürliche Insertion ist mit einem geeigneten Screening des resultierenden Produkts ebenfalls möglich. Deletionsvarianten sind durch eine Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz gekennzeichnet. Substitutions-Aminosäurevarianten sind diejenigen, bei denen mindestens ein Rest in der Sequenz entfernt wurde und ein anderer Rest an seiner Stelle inseriert wurde. Wenn das Protein durch eine Aminosäure-Substitution derivatisiert ist, werden Aminosäuren im allgemeinen durch andere Aminosäuren mit ähnlichen physikalischen chemischen Eigenschaften, wie z. B. Hydrophobozität, Hydrophilizität, Elektronegativität, geräumige Seitenketten und ähnlichem ersetzt. Beispiele für konservative Substitutionen beinhalten die Substitution eines nicht-polaren (hydrophoben) Restes, wie z. B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin gegen einen anderen. Ähnlich umfaßt die vorliegende Erfindung die Substitution eines polaren (hydrophilen) Rests, wie z. B. zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutamin und Asparagin und zwischen Glycin und Serin.
Zusätzlich wird auch die Substitution eines basischen Rests, wie z. B. Lysin, Arginin oder Histidin gegen einen anderen oder die Substitution eines sauren Restes, wie z. B. Asparaginsäure oder Glutaminsäure, gegen einen anderen umfaßt.
Im vorliegenden Zusammenhang umfaßt die Bezeichnung "Analoge", ebenfalls Homologe von SERP-1, d. h. korrespondierende Aminosäuresequenzen, abgeleitet von anderen SERP-1-Proteinen und mit derselben oder im wesentlichen denselben antientzündlichen Eigenschaften. In dem vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck "biologisch aktive Fragmente" Fragmente von SERP-1 oder SERP-1-Analogen, die nicht die Gesamtlänge des SERP-1-Polypeptids beinhalten, die jedoch dennoch die antientzündlichen Eigenschaften des gesamten SERP-1-Polypeptids oder seiner Analoge erhalten, wenn sie einer Entzündungsstelle entweder an der Stelle selbst (d. h. lokal) oder systemisch zugeführt werden.
SERP-1-Aminosäure-Varianten können einfach unter Verwendung von auf dem Gebiet wohlbekannten Peptid-Syntheseverfahren hergestellt werden, wie z. B. der Festphasen-Peptidsynthese (Merrifield-Synthese) und ähnlichen oder durch rekombinante DNA-Verfahren, die wohlbekannt sin. Verfahren zur Herstellung von Substitutionsmutationen an bestimmten Stellen in der DNA beinhalten z. B. die M13-Mutagenese. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten werden in geeigneter Weise an anderer Stelle beschrieben, wie z. B. bei Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung beinhalten Analoge von SERP-1 auch einfache oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen von irgendeinem Bestandteil (Bestandteilen), die natürlich oder künstlich mit dem SERP-1 assoziiert sind, wie z. B. Kohlehydrat, Lipid und/oder andere Protein-artige Bestandteile. Alle diese Molekül werden durch die Bezeichnung SERP-1-Analoge umfaßt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann der Cystein-Rest an Position 244 durch einen anderen Aminosäure-Rest, z. B. Alanin ersetzt werden, um die spezifische Aktivität des hergestellten SERP-1-Proteins zu erhöhen. Eine solche Substitution führt dazu, daß das SERP-1-Protein biologisch aktiver wird, da Cys&sub2;&sub4;&sub4; die vorherbestimmte Position für die SERP-1-Dimerbildung über Disulfid-Brücken ist. Da Cy&sub2;&sub4;&sub4; sehr nah an dem reaktiven Zentrum des SERP-1-Protein liegt, nimmt man an, daß die SERP-1- Dimere ein gestörtes und verwirrtes Zentrum aufweisen, wodurch sie biologisch inaktiv werden. Lomas et al., 1993 J. Biol. Chem. 268 (1): 516- 521. Eine Mutation an der Stellung 244 verhindert die Bildung von SERP-1- Dimeren bei der Herstellung von SERP-1 durch rekombinante DNA-Mittel. Eine Abnahme in Gegenwart von SERP-1-Dimeren in einer präparativen Probe ist nützlich, da die spezifische Aktivität des isolierten Proteins sich erhöhen wird und daher weniger Protein für eine pharmazeutische Präparation benötigt werden wird.
Die inhibitorische Aktivität von Serpinen auf Serin-Proteinasen ist vermutlich mit der langsamen Dissoziation des Serpins von der Serin- Protease nach Spaltung des Serpins zwischen dem P1- und P1'-Resten im aktiven Bereich verbunden. Upton et al. 1990 Virology 179 : 618-631. Die Aminosäuresequenz Arg/Asp wurde kürzlich an der vorhergesagten SERP-1 P1-P1'-Stelle lokalisiert (Aminosäure-Reste 319 und 320) und ist die vorhergesagte Stelle für die Spaltung durch Serin-Proteasen.
Substitutionen von einer oder beider dieser zwei Aminosäuren erzeugen SERP-1-Analoge mit variierenden biologischen Aktivitäten, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
Die Formulierung pharmazeutischer Zusammensetzungen ist auf dem Gebiet allgemein bekannt und es wird Bezug genommen auf das Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania. Die Formulierung des SERP-1-Proteins, von Analogen oder Fragmenten davon zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung muß unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und muß auch gegenüber einer kontaminierenden Wirkung von Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien und Pilzen, konserviert werden. Die Absicherung gegenüber einer Kontamination mit Mikroorganismen kann durch Zugabe von verschiedenen antibakteriellen und Antipilzmitteln erreicht werden.
Die pharmazeutischen Formen von SERP-1, die für eine Infusion geeignet sind, beinhalten sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die extemporäre Präparation von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muß die Form steril sein und muß flüssig in einem Ausmaß sein, daß sie einfach spritzbar ist. Typische Träger beinhalten ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium, das z. B. wassergepufferte wäßrige Lösungen (z. B. biokompatible Puffer), Ethanol, Polyole, wie z. B. Glycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol, geeignete Mischungen davon, Tenside oder pflanzliche Öle enthält. Die Sterilisierung kann durch jedes auf dem Gebiet anerkannte Verfahren bewirkt werden, einschließlich einer Filtration oder Addition von antibakteriellen oder Antipilzmitteln, z. B. Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure oder Thimerosal, ist jedoch nicht hierauf begrenzt. Weiterhin können isotonische Mittel, wie z. B. Zucker oder Natriumchlorid in die Zielzusammensetzungen eingebaut werden.
Die Erzeugung steriler injizierbarer Lösungen, enthaltend das Ziel- SERP-1, wird durch Inkorporation dieser Verbindungen in der benötigten Menge in den geeigneten Lösungsmitteln mit den verschiedenen oben aufgezählten Bestandteilen je nach Bedarf, gefolgt von Sterilisation, vorzugsweise Filtersterilisation, besorgt. Um ein steriles Pulver zu erhalten, werden die obigen Lösungen vakuumgetrocknet oder gefriergetrocknet, je nach Bedarf.
Die Ziel-SERP-1-Proteine oder -Analoge und Fragmente davon werden so für die geeignete und effektive Verabreichung in pharmazeutisch wirksamen Mengen mit einem geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger in einer therapeutisch wirksamen Dosierung vermischt.
Wie hier verwendet beinhaltet die Bezeichnung "pharmazeutisch akzeptabler Träger und/oder Verdünnungsmittel" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, antibakterielle und Antipilzmittel, Mikrokapseln, Liposomen, kationische Lipidträger, isotonische und Absorptionsverzögernde Mittel und ähnliche, die mit den aktiven Bestandteilen nicht inkompatibel sind (SERP-1, SERP-1-Analoge und Fragmente davon). Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf dem Gebiet wohlbekannt. Zusätzliche aktive Bestandteile können ebenfalls in die Zusammensetzungen inkorporiert werden und in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die genaue therapeutisch wirksame Menge des SERP-1-Proteins, Analogs oder Fragments davon, das in den Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, und die einem Menschen verabreicht werden, können von dem gewöhnlichen Fachmann unter Rücksichtnahme auf individuelle Unterschiede im Hinblick auf Alter, Gewicht, Ausmaß der zellulären Infiltration durch Entzündungszellen und Zustand des Patienten bestimmt werden. Es kann allgemein festgehalten werden, daß die pharmazeutische SERP-1-Präparation der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in einer Menge von mindestens ungefähr 30 pg pro Infusionsdosis, noch bevorzugter in einer Menge von bis zu ungefähr 300 mg pro Dosis verabreicht werden sollte.
Es ist besonders vorteilhaft, die parenteralen Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsformen zu formulieren aufgrund der einfachen Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung. Die Dosierungseinheitsform wie hier verwendet bezeichnet physikalische diskrete Einheiten, die als einheitliche Dosierungen für Säugersubjekte, die behandelt werden sollen, geeignet sind; jede Einheit enthält dabei eine bestimmte Menge des aktiven Materials, berechnet um eine gewünschte therapeutische Wirkung zu erzeugen, in Assoziation mit dem benötigen pharmazeutischen Träger. Die Beschreibung für die neue Dosierungseinheitsform der Erfindung wird von den einzigartigen Charakteristiken des aktiven Material diktiert und hängt davon direkt ab (z. B. SERP-1-Protein, SERP-1-Analoge oder Fragmente davon) und den Begrenzungen, die dem Fachgebiet der Vermischung inhärent sind, wie z. B. das aktive Material für die Behandlung der zellulären Infiltration wie hier im Detail offenbart.
Der hauptaktive Bestandteil wird für eine geeignete und effektive Verabreichung in effektiven Mengen mit einem geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger in Dosierungseinheitsform wie oben offenbart vermischt. Eine Einheitsdosierungsform kann z. B. den aktiven Hauptbestandteil in Mengen von 30 pg bis ungefähr 30 mg enthalten. Im Fall von Zusammensetzungen, die zusätzliche aktive Bestandteile enthalten, werden die Dosierungen durch Referenz auf die gewöhnliche Dosis und die Art der Verabreichung der Bestandteile bestimmt.
Das verwendete Verpackungsmaterial, um den SERP-1-aktiven Bestandteil zu verpacken, kann Glas, Kunststoff, Metall oder ein anderes geeignetes inertes Material umfassen, solange das Verpackungsmaterial nicht mit einem der darin enthaltenen Bestandteile chemisch reagiert.
Das SERP-1-Protein, Analoge oder Fragmente davon, können in einer Weise verabreicht werden, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist und in einer derartigen Menge, die therapeutisch effektiv sein wird. Die Zusammensetzungen der Erfindung können auf jede Weise verabreicht werden, die medizinisch akzeptabel ist, die von der Erkrankung oder dem Verletzungszustand, der behandelt werden soll, abhängen kann. Mögliche Verabreichungswege beinhalten Injektionen, parenterale Wege, wie z. B. intravaskulär, intravenös, intraarteriell, subkutan, intramuskulär, in einen Tumor, intraperitoneal, intraventrikulär, intraepidural oder andere, wie auch oral, nasal, in das Auge, rektal, topisch oder durch Inhalation. Die Zusammensetzungen können ebenfalls direkt auf die Gewebeoberfläche während eines chirurgischen Eingriffs aufgebracht werden. Eine Verabreichung mit verzögerter Freisetzung ist ebenfalls spezifisch in der Erfindung beinhaltet, wie z. B. durch Depotinjektionen oder erodierbare Implantate.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden spezifischen Beispiele illustriert, die jedoch in keiner Weise den Umfang der Erfindung begrenzen sollen.

Beispiel 1

Reinigung des Myxoma-SERP-1-Proteins

Der Vaccinia-Vektor (W-51), der das Myxoma-SERP-1 überexprimert wurde früher beschrieben (Macen et al., 1993 Virology 195: 348-363) und die in Macen et al. verwendeten Verfahren und Arbeitsweisen sind hier durch Inbezugnahme inkorporiert. Das SERP-1-Protein wurde aus dem Überstand von BGMK-Zellen geerntet, die mit VV-S1 infiziert waren und wurde durch Säulenchromatographie gereinigt. Zellen in Rollflaschen wurden mit VV-S1 oder VV-601 (ein Kontrollvirus, das SERP-1 nicht exprimiert) für 1 bis 2 Stunden bei 37ºC adsorbiert, mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und mit Dulbecco's modifiziertem Eagl-Medium (15 ml/Flasche) ohne Serum inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium geerntet, bei 10 000 U für 10 Minuten geklärt, 10-mal mit einem Centriprep 10 (Amicon)- Konzentrator konzentriert, gegen 25 mm Tris-HCl, pH 8,0 dialysiert und auf eine MonoQ (Pharmacia)-Säule geladen. Die Proteine wurden mit einem linearen 0 bis 1,0 M NaCl-Gradienten eluiert und Fraktionen, die SERP-1 enthielten, wurden durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel- Elektrophorese (SDS-PAGE) identifiziert und unter Verwendung von einem Immunoblotting unter Verwendung von Anti-SERP-1-Antiserumg (Macen et al. 1992, Virology 195: 348-363) und auf eine Superdex G-75 (Pharmacia) FPLC- Säule geladen, diemit 25 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl äquilibriert war. Die Vaccinia-Vektor-Kontrollproteine, die aus dem mit einem Vaccinia- Konstrukt, dem SERP-1 fehlte (VV-601) sezernierten, wurden parallel zu dem rekombinanten Vaccinia gereinigt, das SERP-1 überexpremiert (VV-S1). Das vorstehende Reinigungsschema stellte SERP-1, gereinigt auf anscheinende Homogenität bereit (Fig. 2, Spur 3).

Beispiel 2

Infusion von SERP-1 an der Stelle einer ballonvermittelten Verletzung

38 Kaninchen (Stamm Neuseeland weiß) wurden mit einer 2% Cholesterin in 10% Erdnußöl-Diät vier Tags pro Woche gefüttert, zwei Wochen vor einer Ballon-Angioplastie, die wie folgt durchgeführt wurde. Ein 3 bis 3,5 mm- Angioplastie-Ballonkatheter (≥ 1 : 1-Verhältnis des Ballons zum Aortendurchmesser) wurde über einen Femoralarterienschnitt, folgend auf eine Anästhesie (40 mg/kg Ketalean, 8 mg/kg Xylol und 0,5 mg/kg Acepromazin durch intramuskuläre Injektion) eingeführt. Der Ballon wurde auf einen 8 bar Druck in der distalen Abdominalaorta aufgeblasen und retrograd zur distalen Aorta thoracica vorgeführt. Der Ballon wurde dreimal in jedem Kaninchen vorgeführt und zurückgezogen und zwar unter fluoroskopischer Kontrolle um eine Endothel-Denudation sicherzustellen. Heparin (400 Einheiten wurden direkt nach Erhalt des Femoralzugangs zur Verminderung einer Katheter-assoziierten Thrombose verabreicht.
Superdex G-75 gereinigtes SERP-1 (Fig. 2, Spur 3) mit einer Protein- Dosierung von 30 pg bis 30 ng pro Probe wurde direkt nach der ballonvermittelten Verletzung in der distalen Abdominalaorta infundiert. Kontrolltieren wurde ein ähnliches Volumen einer Salzlösung verabreicht. Jedes Infusat wurde über einen Wolinsky-Katheter wie vorher beschrieben verabreicht (Stadius et al. 1993 Am. Heart J. 126: 47-55; Wolinsky et al., 1990 J. Am. College Cardiol. 15: 475-481; Santonian et al., 1993 Cath. Cardiovascular Diag. 30: 348-354) in einem Gesamtvolumen von 10 ml verdünnt in steriler 0,9%iger Salzlösung, direkt folgend auf die ballonvermittelte Verletzung. Alle Infusionen erfolgten über einen 3,25 mm Wolinsky-Ballon (aufgeblasen zu einem Enddruck von 6 ± 1 bar für 2 Minuten) in der Abdominalaorta proximal zur Iliac-Verzweigung. Der Wolinsky-Ballon wurde direkt oberhalb der Iliac-Verzweigung unter fluoroskopischer Kontrolle positioniert, so daß der Perfusionsballon routinemäßig 015 bis 2,5 cm oberhalb der Verzweigung lokalisiert war und wurde als primäre Infusionsstelle bezeichnet. Stromaufwärts gelegene sekundäre Stellen wurden in dem Bereich ungefähr 2,5 cm proximal zur Iliac-Verzweigung definiert.

Beispiel 3

Immunohistochemische Analyse von SERP-1 und kontrollbehandelten Geweben

Eine immunohistochemische Färbung wurde verwendet um Veränderungen der Zellpopulationen an vaskulären Stellen einer Intimaverletzung der Kaninchen-Aorta nach SERP-1 und Salzlösungsinfusion wie beschrieben in Beispiel 2 zu bestimmen. Zwei Zeitpunkte wurden für die Analyse gewählt: 24 Stunden nach der Infusion wurden Proben genommen und verwendet um das Niveau der akuten zellulären Infiltration in Reaktion auf die Wolinsky- Infusion zu bestimmen und Proben vier Wochen nach der Infusion wurden verwendet, um chronische Reaktionen zu überprüfen. Die Kaninchen- Zellpopulationen, die gemessen wurden, waren vaskuläre glatte Muskelzellen (Antiactin-Antikörper), mononukleäre Leukozyten (Anti-CD-11b-Antikörper), aktivierte T-Lymphozyten (Anti-CD-25-Antikörper) und Makrophagen (RAM11- Antikörper).
Die immunohistochemische Analyse wurde an der Primärstelle der Wolinsky-Infusion in der distalen Abdominalaorta durchgeführt, die die primäre Infusionsstelle darstellte, wie definiert durch die ursprüngliche Positionierung des Perfusionsballons und an stromaufwärts gelegenen sekundären Stellen, definiert in dem Bereich oberhalb 2,5 cm proximal zu der Iliac-Verzweigung unter Verwendung der Verfahren, die in Gown et al. 1986, Am. J. Pathol. 125: 191-207 beschrieben sind. Kurz gefaßt wurden Formalin- fixierte Aortabereiche in 5 um-Sektionen geschnitten und unter Verwendung des indirekten Peroxidase-markierten Antikörperverfahrens, wie beschrieben von Naish S. J., Hrsg. 1989 Handbook of Immunochemical Staining methods, Dako Corp., Carpinteria, CA. gefärbt. Paraffin-Sektionen wurden aus der Formalin-fixierten Kaninchen-Aorta genommen und mit Sigma-Diagnostica (St. Louis, MO) Maus-anti-alpha-humanem glatten Muskelactin-Antikörper für glatte Zellen (der mit glatten Kaninchen-Muskelzellen kreuzreagiert) immunogefärbt, mit dem Ratten-anti-Maus-CD-11b-monoklonalen Antikörper, der mit Kaninchen kreuzreagiert (Spring Valley Laboratories Ic., Woodbine, MD) für Kaninchen-mononukleäre Zellen, mit Maus-anti-Kaninchen-CD25-spezifischen monoklonalem Antikörper (Spring Valley Laboratories Inc.) für aktivierte Kaninchen-T-Lymphozyten und mit Maus-Ascites-RAM11-monoklonalen Antikörper (erhalten von E. Raines, U. Washington, Seattle) für Kaninchen- Makrophagen. Jeder primäre Antikörper-behandelte Bereich wurde dann mit biotinyliertem Ziegen-anti-Maus oder anti-Ratten-Antikörper für 30 Minuten und mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC) für 40 Minuten inkubiert. Jede Sektion wurde mit DAB für 5 Minuten entwickelt. Negativkontrollen für jedes Färbeverfahren wurden durch Substitution des primären und/oder sekundären Antikörpers mit neutraler oder gepufferter Salzlösung durchgeführt. Positive Kontrollen bestanden aus humanen arteriellen glatten Muskelzellen und Kaninchen-Dünndarm (für alpha-Actin), Kaninchen-Mandeln und -Milz (für CD11b) und Kaninchen-Mandeln (für CD25). Jede Sektion wurde mit 20% normalen Ziegenserum vor der primären Antikörperaddition zur Verminderung nicht-spezifischer Färbung inkubiert. Die Prozentzahl der positiven Färbung wurde bestimmt, indem 3 bis 5 repräsentative hochwertige Bereiche pro Objektträger bewertet wurden und indem die Anzahl der positiven Rahmen, geteilt durch die Anzahl von Quadraten in den Rahmen, abgedeckt durch den Bereich der Intimahyperplasie oder Media, quantifiziert wurde.
Die Sektionen, die 24 Stunden nach einer Infusion akute Reaktionen zeigten, zeigten keine signifikanten Unterschiede bei der Anzahl der glatten Muskelzellen an den primären Stellen der SERP-1-Infusion (Fig. 3A) gegenüber der Salzlösungs-Kontrolle (Fig. 3B), jedoch signifikante Reduktionen der Infiltration von CD11b&spplus;-mononukleären Zellen (Fig. 3C und 3D), aktivierten T-Lymphozyten (Fig. 3E und 3F) und Makrophagen (Fig. 3G und 3H) in die primären Stellen, perfundiert durch gereinigtes SERP-1-Protein wurden im Vergleich mit den Salzlösungskontrollen beobachtet. Wenn vergleichbare Sektionen aus Infusionsstellen für diese selben Zellpopulationen vier Wochen nach der Infusion gefärbt wurden, wurde ein ähnliches Profil für die glatten Muskelzellen beobachtet (Fig. 4A und 4B), jedoch wurden wiederum deutliche Reduktionen für die CD11B&spplus;- mononukleären Zellen (Fig. 4C und 4D), die aktivierten T-Lymphozyten (Fig. 4E und 4F) und die Makrophagen (Fig. 4 G und 4H) beobachtet. Um die Wirkung von der SERP-1-Infusion auf die zelluläre Infiltration an primären infundierten Stellen in demselben Tier zu vergleichen, wurden die Prozentzahlen der positiv gefärbten Zellen für jeden der vier Antikörper an den primären und sekundären Stellen quantifiziert. Wie dargestellt in Fig. 5A, gab es nach 24 Stunden nach der Infusion keine signifikanten Unterschiede der glatten Muskelzellpopulationen (smc) entweder an den primären oder sekundären Stellen, während Reduktionen der Infiltration von CD11b-positiven mononukleären Leukozyten (MNL), CD25-positiven T-Zellen (T) und Makrophagen (M) auf die primären (P)-Stellen der SERP-1-Infusion begrenzt waren, jedoch nicht bei den Salzlösungskontrollen und sie wurden nicht an den sekundären (S)-Stellen beobachtet und zwar in jedem Fall. Wenn dieselbe Analyse an vier Wochen-Proben durchgeführt wurde (Fig. 5B), wurde keine deutliche Wirkung von SERP-1 auf die glatte Muskelzell-Population im Plaque beobachtet, jedoch blieben die chronischen Niveaus der Infiltration von CD11b-positiven mononukleären Leukozyten, CD25-positiven T-Zellen und Makrophagen an den Stellen einer primären SERP-1-Infusion im Vergleich mit irgendwelchen an den sekundären Stellen niedrig. So gab es 24 Stunden nach der SERP-1-Infusion eine signifikante Abnahme des Einflusses von CD11b- positiven mononukleären Zellen (p < 0,0001), CD-25-positiven T-Lymphozyten (p < 0,0001) und RAM11-positiven Makrophagen (p < 0,003) im Vergleich mit der Salzlösungsinfusion an den Stellen der primären Wolinsky-Infusion oder an irgendeiner der sekundären Stellen. Ähnlich blieb bei den chronischen Proben die mononukleäre Zellfärbung (p < 0,0004), die aktivierte T-Zellfärbung ((p < 0,0037) und die Makrophagenfärbung (p < 0,0001) signifikant vier Wochen später niedrig an den Stellen der primären SERP-1-Infusion, sowohl in dem Körper der Intimaplaques als auch in den tieferen Medialschichten der Gefäßwand.
Diese Ergebnisse demonstrieren mehrere Feststellungen im Hinblick auf den Schutzmechanismus des SERP-1-Proteins an den perfundierten Stellen. An der primären Stelle der SERP-1-Infusion gibt es eine dramatische Abnahme der lokalen Infiltration reaktiver entzündlicher Leukozyten innerhalb der ersten 24 Stunden nach der SERP-1-Infusion, gefolgt von einer Abnahme der chronischen entzündlichen Zellinfiltration, die bis mindestens 4 Wochen nach der SERP-1-Infusion anhält. SERP-1 reguliert daher die pro-entzündlichen Signale direkt an der primären Infusionsstelle herab.

Beispiel 4

Behandlung von Antigen-induzierter Arthritis (AIA) mit SERP-1

15 Kaninchen (Charles River, Kanada), die 2,5 bis 3,0 kg wogen, wurden mit einem Rompun-Cocktail (Ketamin, Rompun, Acepromazin) anästhetisiert und mit 10 mg Ovalbumin, emulgiert mit einem gleichen Volumen des Freunds kompletten Adjunvas (Sigma) immunisiert, das intramuskulär sowie subkutan an mehreren Stellen an der Spitze des Nacken verabreicht wurde. Zwei Wochen später erhielten alle Kaninchen eine intraarikuläre (IA) Injektion von 1 mg Ovalbumin und 1 ml einer sterilen, pyrogenfreien Salzlösung. Eine Beobachtung zwei Wochen nach der IA- Injektion ergab einen minimalen klinischen Nachweis einer Arthritis. Dementsprechend wurden zwei aufeinanderfolgende tägliche IA-Injektionen von 5 mg Ovalbumin und 65 ng rekombinantem humanem Transformations-Wachstumsfaktor (TGF) beta 2 (Genzyme) in das hintere Gliedmaßengelenk verabreicht, um die Induktion der Arthritis zu erleichtern, wie beschrieben von Fava et al. 1991, J. Exp. Med. 173: 1121-1132). Ein Kaninchen starb am zweiten Tag während der Induktion der Anästhesie und die Postmortem-Überprüfung ergab einen kongenitalen Herzdefekt. Die Synovialhistologie der verbliebenen Kaninchen ergab eine extensive Entzündung mit PMN-Infiltration, prominenter Vaskulitis und Bereichen einer fibrinoiden Nekrose.
Die verbliebenen 14 Tiere wurden willkürlich einer von drei Gruppen zugeordnet: Gruppe A erhielt 0,5 ml einer sterilen pyrogenfreien Salzlösung durch IA-Injektion. Gruppe B erhielt 100 pg eines gereinigten SERP-1- Proteins durch IA-Injektion und Gruppe C erhielt 1 ng des SERP-1-Proteins durch IA-Injektion. Die IA-Injektionen wurden zwei Wochen nach der letzten IA-Injektion des Ovalbumins und TGF-beta und in dasselbere hintere Gliedmaßengelenk wie die Ovalbumin- und TGF-beta-Injektion ergeben. Zwei Wochen nach der IA-Injektion des SERP-1 wurden zwei Tiere von jeder Gruppe durch Verabreichung von Natriumphenobarbital (100 mg/kg) getötet. Die Synovialflüssigkeitzählungen wurden erhalten und das Synovialgewebe wurden für eine histologische Analyse entfernt (Stufe A). Die verbliebenen Tiere in jeder Gruppe erhielten eine zweite IA-Injektion entweder aus Salzlösung oder SERP-1 in der vorher verabreichten Dosierung. Die Tiere wurden zwei Wochen später getötet und eine Synovialhistologie durchgeführt (Stufe B).
Um die Schwere der chronischen Arthritis bei SERP-1-behandelten und nicht-behandelten Kaninchen zu überprüfen wurden die Synovialmembranen hinausgeschnitten und Proben in gepuffertem Formalin fixiert und für die Routinehistologie verarbeitet. Mindestens drei Synovialproben wurden analysiert um jeden Variationsgrad einer Synovitis in einem bestimmten Gelenk zu kompensieren. Histopathologische Feststellungen wurden blind überprüft und qualitative Eigenschaften wurden wie in Tabelle I aufgeführt zugeordnet. Unterschiede unter den experimentellen Gruppen wurden unter Verwendung des U-Mann-Whitney-Tests getestet.
Die Synovialhistologie der Stufe A-behandelten Tiere ergab eine Abnahme der Synovialflüssigkeits-PMN-Zahl und Histologiebewertung in Vergleichen mit den Salzlösungskontrollen (Tabelle II), Diese Feststellung war bei Tieren, die eine 100 pg-Dosierung SERP-1 erhielten, deutlicher ausgebildet.
Eine makroskopische Überprüfung der Gelenke bei Tieren, die mindestens zwei TA-Injektionen entweder von Kochsalzlösung oder SERP-1 erhielten (Stufe B-behandelten Tiere) ergab eine deutliche Verringerung der Synovialhypertrophie und der artikulären Cartilage-Erosion bei SERP-1- behandelten Tieren (Tabelle III), die bei 1 ng deutlicher auftrag (P = 0,05, einschwänziger Test gegenüber Salzkontrollen) als bei der 100 pg-Dosierung (P = 0,2 gegenüber den Salzlösungskontrollen) (Tabelle III). Cartilage- Erosionen wurden nur bei einem von fünf Gelenken von behandelten Tieren sechs Wochen nach der intraartikulären Injektion von Antigen gegenüber zwei von drei Salzlösungs-behandelten Tieren beobachtet. Makroskopische Veränderungen simmten mit der Synovialhistologie überein und eine dosisabhängige Wirkung war eindeutig. Die Fig. 6A und 6B illustrieren die Synovialentzündung bei Salzlösungs-behandelten Tieren mit einer Riesenzellbildung. Demgegenüber illustriert Fig. 7 eine Auflösung der Synovitis, die allgemein bei SERP-1-behandelten Tieren beobachtet wird. Es wurde bei den behandelten Tieren keine Toxizität beobachtet.
Diese Ergebnisse demonstrieren, daß die Verabreichung von gereinigtem SERP-1 bei einem Tiermodell der Arthritis mit den menschlichen chronischen Synovitisergebnissen in einer deutlichen Verringerung der chronischen entzündlichen Zellinfiltration wie auch einer deutlichen Verringerung des Grads der Synovialhyperplasie und Cartilage-Erosion korrelierte.

Tabelle 1: Bewertung der Antigen-induzierten Arthritis

A: Überlick postmortem

0: normales Gelenk
1: vermehrte Gelenksflüssigkeit, keine anscheinende Synovialverdickung/Entzündung
2: Synovialverdickung/Entzündung bis 1 mm
3: Synovialverdickung/Entzündung 1 bis 3 mm
4: Synovialverdickung/Entzündung 1 bis 4 mm perisynoviales Granulationsgewebe
5: alles von 1 bis 4 oben mit einer Erosion der Gelenkscartilage

B: Histologie

Synovial-Auskleidungsschicht-Hyperplasie (0 bis 3+)
Intensität des Subsynovial-zellulären Infiltrats (0 bis 3+)
Gegenwart von neutrophilem Infiltrat (0 bis 3+)
Pannusgewebe +(3) oder -(0)
Cartilage-Erosion +(3) oder -(0) Tabelle II: Synovial-Flüssigkeitszellzahlen und Histologiebewertungen. Wirkungen der Behandlung mit einer 1A-Injektion von SERP-1 bei etabliertem A1A*
* Rohdaten pro Tier
** Gesamtzahl für 3 Synovialproben pro Gelenk Tabelle III: Makroskopische und histologische Bewertungen. Wirkungen der Behandlung mit zwei 1A-Injektionen von SERP-1 bei etabliertem AlA*
* Rohdaten pro Tier
** Gesamtzahl für 3 Synovialproben pro Gelenk

Beispiel 5

Wirkung von SERP-1 auf die Entzündung und ein Herzversagen, assoziiert mit einem Koronararterienverschluß

Ein Koronararterienverschluß mit einem resultierenden Mangel an einem Blutfluß zum Herzen, einer Ischämie und folgender Myokardschädigung und Nekrose wird bei Mischlingshunden durch das folgende Verfahren induziert. Unter sterilen Bedingungen werden Mischlingshunde (28 bis 35 kg) unter Verwendung von intravenösem Pentobarbital (30-35 mg/kg) anästhesiert und unter Verwendung einer kontinuierlichen Infusion Pentobarbital mit einer Rate von ungefähr 0,05 mg/kg pro Minute so erhalten. Succinylcholin (1 mg/kg) wird ebenfalls intravenös zum Zeitpunkt der Induktion der Anästhesie verabreicht. Die Tiere werden dann mit einem abgedichteten Endotracheal-Rohr inkubiert und mit warmer, angefeuchteter Raumluft und Sauerstoff durch einen Ventilator, wie z. B. einem Siemens 900-Ventilator ventiliert. Eine Femoral-Linie wird inseriert und der systemische Druck wird kontinuierlich dargestellt. Arterielle Blutproben werden periodisch zum Erhalt des pHs, des pO&sub2; und des pCO&sub2; innerhalb physiologischer Grenzen genommen. Die Körpertemperatur wird bei 37ºC mit warmer, angefeuchteter ventilierter Luft und einer Wärmelampe, die über dem Thorax angeordnet ist, aufrecherhalten. Die Temperatur wird unter Verwendung einer YSI 73A- Temperaturkontrollvorrichtung (Yellow Springs Instrument Company, Yellow Springs, OH) überwacht, die einen Thermistor aufweist, positioniert im mittleren Ösophagus. Elektrokardiographische Führungen werden für eine kontinuierliche ECG-Überwachung angewandt. 10 Tage alte und 4 Wochen alte Infarkte werden wie folgt erzeugt. Das Herz wird unter sterilen Bedingungen durch eine begrenzte (4 cm) linke Thorakotomie im vierten Interkostalraum exponiert. Das Perikard wird geöffnet um die proximale linke vordere abführende (LAD)-Arterie zu exponieren und wird so proximal zu seinem Ursprung wie möglich seziert und ein Nasenokkluder wird angebracht. Die partielle Okklusion wird für 30 Minuten aufrechterhalten und eine vollständige Okklusion wird für 90 Minuten aufrechterhalten. Der Nasenokkluder wird entfernt und man läßt eine Reperfusion auftreten. Ein Brustrohr wird inseriert und die Brust in Schichten geschlossen. Die Tiere können sich 4 bis 10 Tage lang erholen. Damit ein akurater Vergleich zwischen normalen und Infarktherzen durchgeführt werden kann, werden Kontrollhunde (die in Gruppen unterteilt sind, die entweder SERP-1-Infusionen erhalten oder nicht infundiert werden) einer Sham-LAD-Okklusion unterzogen um mögliche verwirrende Faktoren zu eliminieren, die einer LAD-Okklusion sekundär anhaften, wie auch einer Chirurgie, Thorakotomie, Perikardiotomie, Adhäsion und ähnlichem.
Nach 10 Tagen wird SERP-1 in Dosierungen im Bereich von 3 pg/kg bie 3 mg/kg durch eine Koronararterien-Infusion gegeben, um die Wirkung auf die Entzündung und das Herzversagen bei Hunden mit induzierter koronarer Okklusion zu überprüfen. Ähnliche Dosierungen von SERP-1 werden durch intraperitoneale (i. p.), subkutane (s. c.) und intravenöse Verabreichungen (iv) verabreicht.
Die Hunde werden in gewählten Zeitabständen über eine Periode von 2 bis 6 Monaten danach überwacht. Eine Echokardiographie wird verwendet, um die linke ventrikuläre Funktion zu überprüfen. Routinemäßige Hämatoxylin- und Eosinfärbung des Myokards wird verwendet, um die Wirkung von SERP-1 auf die Myokardentzündung zu überprüfen.
Eine immunohistochemische Färbung des Myokards, wie beschrieben in den Beispielen 3 und 4 wird verwendet, um die Wirkung von SERP-1 auf eine Myokardinfiltration durch entzündliche Zellen zu überwachen, Chavanash et al., 1992, Circulation 85: 680-698.

Beispiel 6

Wirkung von SERP-1 auf induzierte Herzarrhythmien

Hunde mit induzierten arteriellen Okklusionen (Beispiel 5) läßt man sich 6, 30 und 60 Tage erholen und sie werden dann einem zweiten chirurgischen Eingriff für die Induktion von Herzarrhythmien unterzogen. Nach einer Anästhesie mit Pentobarbital, ähnlich zu derjenigen des ersten chirurgischen Eingriffs (Beispiel 5), beginnt ein zweites chirurgisches Verfahren. Eine Mittellinien-Sternotomie und Perikardialbügel (pericardial crodle) wird unter ähnlichen hämodynamischen Überprüfungen und intravenösen Infusionen wie in Beispiel 5 durchgeführt. Eine anodale Titanmaschen- Defibrillationspatch-Elektrode (Medtronics TX-7, reduziert auf 4,5 cm²) wird in den rechten Atrium/Vena cava-Spuerior-Verbindungsbereich eingenäht. Ein kathodischer Defibrillationspatch (Medtronics TX-7, 15 cm²) wird in den linken ventrikulären Apex eingenähr. Intervenktionsschocks wie auch therapeutische Defibrillationsschocks werden durch Positionierung einer dritten Titan-Maschendefibrillationspatch-Elektrode (Medtronics TX-7, reduziert auf 4,5 cm²) im Bereich des RV-Ausflußstroms verabreicht. Der Aorta-Wurzelfett-Pad wird freigelegt und eine 4,0 mm Ag/AgCl-Referenzelektrode wird in die Aortawurzel eingenäht, um als Referenz für alle DC- gekoppelten unipolaren Aufzeichnungen zu dienen. Für die anfängliche globale Epikardmappierung der Spannungsgradientenfelder und Aktivierungen wird ein Epikardjacket, das einheitlich positionierte und einfach wieder positionierbare tripolare Knopfelektroden enthält, um das Herz angeordnet. Nach einem globalen Mappieren zum Bestimmen der Stellen einer frühen Aktivierung, wird eine größere Dichte von Aufzeichnungselektroden um die Frühaktivierungsstellen, einschließlich dem Infarkt und Grenzzonen konzentriert. Vorher beschriebene transmurale und septale Aufzeichnungselektroden können ebenfalls für die Spannungsgradientenbestimmungen durch das Herz verwendet werden. Nachdem alle Elektroden plaziert sind, wird das Herz mit einem 4 · 4-Schwamm, angefeuchtet mit warmer Salzlösung, betupft. Das Sternum wird angenähert und mit einem Kunststofftuch bedeckt und einem feuchten Handtuch, um das Herz in einer feuchten und konstanten Temperaturumgebung zu erhalten. Eine ventrikuläre Fibrillation wird durch 60 Hz Wechselstrom außerhalb und innerhalb der Infarktzone wie auch durch schnelles ventrikuläres Pacing in der Infarktzone induziert.
SERP-1 in Dosierungen im Bereich von 3 pg/kg bis 3 mg/kg wird durch Koronarinfusion am Tag der arteriellen Okklusionschirurgie oder später zur Überprüfung der Wirkungen einer globalen Veränderung der passiven Eigenschaften der Leitung wie auch der lethalen ventrikulären Arrhythmien verabreicht. Der Zeitverlauf der Veränderung der passiven Eigenschaften der Myokardleitung in Reaktion auf die Verabreichung von SERP-1 wird unter Verwendung von mikroskopischer Endokardaufzeichnung bestimmt und mit der Verschlechterung der LV-Funktion und der Entwicklung ventrikulärer Arrhythmien korreliert. Wikowski et al., 1993, Circulation Research 72: 424- 439.

Beispiel 7

Wirkung von SERP-1 auf Herzversagen und Kardiomyopathie

Ein Herzinfarkt und eine Kardiomyopathie wird bei Mischlingshunden wie folgt induziert. Unter sterilen Bedingungen werden Mischlingshunde (28- 35 kg) unter Verwendung von intravenösem Pentobarbital (30-35 mg/kg) anästhesiert und unter Verwendung einer kontinuierlichen Infusion Pentobarbital mit einer Rate von ungefähr 0,05 mg/kg pro Minute so erhalten. Succinylcholin (1 mg/kg) wird ebenfalls intravenös zum Zeitpunkt der Anästhesieinduktion verabreicht. Ein Schrittmacher wird in den rechten Ventrikulärbereich des Herzens inseriert und auf eine hohe Rate im Bereich von 100 bis 280 Schlägen pro Minute eingestellt. Nach 14 bis 30 Tagen wird SERP-1 in Dosierungen zwischen 3 pg/kg und 3 mg/kg entweder durch Koronarinfusion, intraperitoneale (ip) subkutane (sc) oder intravenöse Verabreichung (iv) verabreicht. Die Hunde werden auf die Wirkung von SERP-1 auf die Myokardentzündung und ein Herzversagen nach gewählten Zeitspannen über eine 2- bis 6-monatige Beobachtungsperiode überwacht. Eine Echokardiographie wird verwendet, um die linke ventrikuläre Funktion zu bestimmen. Routine-Hämatoxylin- und Eosin-Färbung des Myokards wird verwendet, um die Wirkung von SERP-1 auf die Myokardentzündung zu überprüfen. Eine immunohistochemische Färbung des Myokards wird verwendet, um die Wirkung von SERP-1 auf die Myokard-Infiltration durch entzündliche Zellen zu überwachen. Zusätzlich werden konfokale und Elektronenmikroskop-Studien durchgeführt, um Unterschiede in der räumlichen Verteilung und molekularen Eigenschaften von Lückenverbindungen bei SERP-1-behandelten myopathischen und normalen Herzen zu überwachen.

Beispiel 8

SERP-1-Behandlung von Zuständen, die mit akuter pulmonarer Entzündung assoziiert sind

Sensibilisierung von Tieren

Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 8 bis 12 Wochen werden 2 Wochen vor einer SERP-1-Behandlung mit 1 mg Ovalbumin (OA) Grad V und 200 mg (Al(OH)&sub3; in 1 ml Salzlösung (subkutane Verabreichung) und 1 ml Bordetellpaertussis-Vakzin (2 · 10&sup9;) Bazillen (intraperitoneale Verabreichung) als Adjuvans zur Verstärkung der IgE-Antikörperproduktion sensibilisiert. Die so sensibilisierten Sprague-Dawley-Ratten werden für die Überwachung der Wirkungen von SERP-1 auf Zustände verwendet, die mit hyperaktiven Luftwegen, wie z. B. bei Asthma und Bronchitis, assoziiert sind.
Mit dem Nematoden Nippostrongylus brasiliensis infizierte Sprague- Dawley-Ratten werden verwendet, um die Wirkung von SERP-1 auf akute allergische Reaktionen zu überwachen, die spezifisch das pulmonare System betreffen, wie z. B. Allergie und Hypersensibilität. Mit N. brasiliensis sensibilisierte Ratten, wertvoll bei der Überwachung von Allergen-induzierter pulmonarer Entzündung, einschließlich lokaler Neutrophilie, Eosinophilie und alveolärer Makrophagenanhäufung und Funktion werden im Detail in Ramaswamy et al., 1991 J. Parasitology 77: 302-313 und Mathison et al., 1992 Br. J. Pharmacology 106: 263-266 beschrieben, inkorporiert hier durch in Bezugnahme.

SERP-1-Verabreichung und Wirkungen auf akute pulmonare Entzündung

SERP-1 wird nach gewählten Zeitspannen nach Sensibilisierung (Bordetella pertussis Vakzin oder N. brasiliensis) durch Aerosol, subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Infusionen in Dosierungen im Bereich von 3 pg bis 3 pg Totaldosierung pro Experimentaltier verabreicht. Sensibilzsierte Ratten werden mit demselben Volumen einer Salzlösung als Experimentkontrolle versehen. Die Wirkung der SERP-1-Behandlung wird durch Histologie und immunhistochemische Analyse (durchgeführt wie in Beispiel 3) von Gewebe von pulmonaren Proben überwacht.
Um die Wirkungen von SERP-1 auf die alveoläre Makrophagenfunktion zu überwachen werden sensibilisierte Ratten und in einigen Fällen sensibilisierte Ratten, die eine SERP-1-Infusion wie oben beschrieben erhalten haben, Aerosolen gegenüber exponiert und zwar unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Aerosole werden unter Verwendung der Wright-Zerstäubungsvorrichtung von Roxon Medi-Tech Lte (Montreal PQ) unter Verwendung von komprimierter Luft mit einem Druck, der einen Auslaß von 0,1 bis 0,2 ml/min erzeugt, in eine Plexiglas-Box geführt. Salzlösung oder OA (2% in Salzlösung) wird fünf Minuten über den anästhesierten Ratten zerstäubt, wodurch Ag in Aerosol-Form zugeführt wird.
Nach der Aussetzung gegenüber den Aerosols wird SERP-1 über Aerosol oder subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Infusion in Dosierungen zwischen 0,3 pg bis 3 mg Totaldosierung pro Experimentaltier verabreicht. Den dem Aerosol exponierten Ratten werden ebenfalls ein vergleichbares Volumen Salzlösung als Experimentkontrolle verabreicht. Nach 0, 6, 10, 30, 60 und 90 Tagen werden Ratten, die zwischen 190 und 250 g wiegen, anästhesiert, die Trachea wird exponiert und mit einer Metall-Trachealkanüle versehen, mit der drei andere Metallrohre verlötet sind. Ein Rohr ist mit einer Druckübertragungsvorrichtung (wie z. B. einem Validyne MP45 ± 50 cm H&sub2;O) zur Messung des Luftwegdrucks verbunden. Die anderen beiden Rohre, die ein "Y" bilden, ermöglichen eine Verbindung zu den belüfteten und entlüfteten Wegen eines Ventilators, wie z. B. dem Harvard Rodent- Ventilator. Der Ventilator ist so eingestellt, daß er ein Flutungsvolumen von 8 bis 10 ml/kg mit einer Räte von 50 bis 60 Luftzügen pro Minute zuführt.
Nach der chirurgischen Vorbereitung wird jede tracheotomisierte Ratte in eine 30 · 15 · 10 cm Kunststoffbox plaziert und die Trachea wird mit dem Ventilator und dem Luftwegdruckübertrager verbunden. Der Entilator wird gestartet und der Boxdeckel geschlossen. Sowohl der Luftwegdruck als auch der Boxendruck werden zu einem Computer geleitet und in Lotus-1,2,3 gespeichert. Messungen werden über 10 Sekunden-Zeitspannen genommen, während derer die Ergebnisse von 7 bis 10 kompletten Flutungsluftzügen gesammelt werden. Das Boxendrucksignal repräsentiert Volumenveränderungen aufgrund der Ventilation und das Signal wird differenziert, um die eingeatmete und ausgeatmete Flußrate bereitzustellen. Ein Spread-Sheet wird daher erzeugt, daß Daten für Luftwegdruck, Flutungsvolumen und Flutungsfluß bereitstellt. Aus diesen Daten wird die respiratorische Systemresistenz und die dynamische Compliance (oder Elastizität) berechnet, wodurch eine Messung des Grads der Bronchokonstriktion sowohl für die Kontrolle (infundiert mit Salzlösung) als auch für die experimentellen (infundiert mit SERP-1) Ratten bereitgestellt wird.
Es ist bekannt, daß Schafe sowohl frühe als auch späte Bronchialreaktionen gegenüber inhaliertem Ascaris suum-Antigen entwickeln und daher für die Überwachung von SERP-I-Wirkungen auf entzündliche Zustände wie Asthma und Bronchitis geeignet sind. Siehe Abraham et al., 1993 Am. Rev. Respir. Dis. 128: 839-844 und Abraham et al., 1994, J. Chlin. Invest. 93: 776-787, die hier durch Bezugnahme inkorporiert sind. Nach einer topischen Anästhesie der Nasalpassagen wird ein Ballonkatheter durch ein Nasenloch in den unteren Ösophagus eingeführt und die Tiere werden mit einem abgedichteten Endotracheal-Röhrchen durch das andere Nasenloch intubiert. Der Pleuraldruck wird mit dem mit ungefähr 1 ml Luft gefüllten Ösophagus-Ballonkatheter gemessen. Der Lateraldruck in der Trachea wird mit einem Katheter, benachbart zur Spitze des Endotracheal-Rohrs gemessen und sowohl Pleural- als auch Trachealkatheter werden mit einem Differentialdruckübertrager verbunden, wie z. B. dem Validyne MP45, Northridge, CA. Der Transpulmonaldruck wird als Unterschied zwischen den beiden Drücken bestimmt. Der Luftfluß wird durch Verbindung des proximalen Endes des Endotrachealrohrs mit einem Pneumotachographen gemessen (Fleis, Dyna Science, Inc., Blue Beil PA). Der pulmonale Flußwiderstand wird als temporäre Veränderung des transpulmonalen Drucks bestimmt, geteilt durch die Veränderung das Luftflusses bei mittströmigen Volumen. Eine Bronchoalveolar- Lavage wird unter Verwendung eines fiberoptischen Bronchoskops mit Aliquots von pH 7,4 gepufferter Salzlösung durchgeführt.
Antigen (im typischen Fall Ascaris suum-Extrakt, erhältlich von Greer Diagnostics, Lenoir NC) wird über eine konventionelle medizinische Zerstäubungsvorrichtung, verbunden mit einem Dosimetersystem, umfassend ein Solenoid-Ventil, eine Quelle für komprimierte Luft und einen Respirator, eingeführt.
Grundlinienluftweg-Reaktionseigenschaften und eine Bronchoalveolar- Lavage wird einige Tage vor dem experimentellen Lauf durchgeführt. Am Tag des Experiments wird wiederum die Luftwegsreaktion gemessen und dann wird Myxoma-SERP-1 über eine intravenöse Infusion von ungefähr 3 pg/kg bis 3 mg/kg oder ein äquivalentes Volumen Salzlösung eingeführt. Nach Verabreichung von SERP-1 werden die Luftwegsreaktionsfähigkeit (spezifische Lungenresistenz, mittlerer pulonaler Flußwiderstand und ähnliches) überprüft und das Tier wird dann einem Antigen ausgesetzt. Bestimmungen der Luftwegsreaktion und einer Bronchoalveolar-Lavage nach der Antigenaussetzung werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Antigenaussetzung durchgeführt. Kontroll- und Polypeptid-Versuche werden durch mindestens drei Wochen voneinander getrennt, ein ausreichendes Zeitintervall, damit die Schafe sich von früheren Antigenaussetzungen erholen können. Gemäß einem anderen Protokoll wird die Wirkung der Verabreichung von SERP-1 nach einer Antigenaussetzung überprüft.
In vitro-Parameter, die gemessen werden, um die Wirksamkeit von SERP-1 zu überprüfen, beinhalten Differential-Zellzählungen in der Lavage- Flüssigkeit von Epithelzellen, Makrophagen, Lymphozyten, Neutrophilen, Basophilen, Eosinophilen und Monozyten.
Meerschweinchen können ebenfalls auf die Wirkungen von SERP-1 auf hyperaktive Luftwege, wie z. B. bei Asthma, überprüft werden. Siehe z. B. Pretolani et al 1994 J. Exp. Med. 180: 795-805. Männliche Hartley-Meerschweinchen werden durch aerolisiertes Albumin (Miles, Naperville, IL) sensibilisiert. Das Verfahren wird 48 Stunden später wiederholt und die Tiere werden Ovalbumin-Aerosollösungen 14 bis 17 Tage nach der ersten Inhalation ausgesetzt. Kontrolltiere werden wie oben sensibilisiert, werden jedoch einer Salzlösung nach 14 bis 17 Tagen ausgesetzt. SERP-1-Polypeptid wird sensibilisierten Meerschweinchen ungefähr 1 Stunde und ungefähr 4 Stunden nach der Antigenaussetzung verabreicht.
Die Wirkung der SERP-1-Polypeptid-Verabreichung auf eine Antigeninduzierte Bronchialhyperaktivität und zelluläre Infiltration wird durch eine Anzahl von Möglichkeiten überprüft. Veränderungen der Bronchialresistenz gegenüber einer Lungeninflation werden durch einen Drucküberträger gemessen, der zwischen der Trachea und einer Respirationspumpe angeordnet ist und werden kontinuierlich auf einem Dynographen aufgezeichnet. Die Bronchialreaktivität wird durch wiederholte Verabreichung von Methacholin (Sigma Chemical Co.) überprüft. Aliquots von arteriellem Blut werden gesammelt, um die Gesamtzahl der Leukozyten zu zählen, und zwar unter Verwendung eines Coulter-Counters und für Differentialzählungen nach Färbung. Bronchoalveolar-Zellen werden in sukzessiven Lavages unter Verwendung von Aliquots von steriler Salzlösung gesammelt und durch eine Polyethylen-Trachealkanüle injiziert und gewonnen. Differentialzellzählungen und die Messung von eosinophiler Peroxidase wird ebenfalls in den Lavage-Flüssigkeiten durchgeführt. Immunohistochemische Studien werden an seziertem Lungengewebe, das zunächst in Chloroform-Acetaon fixiert wurde, durchgeführt. Die Sektionen werden mit einer Vielzahl von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für T-Zellen sind und mit aktivierten Eosinophilen gefärbt, unter Verwendung konventioneller Verfahren wie z. B. denjenigen, die von Pretolani et al. 1994 beschrieben wurden.

Beispiel 9

SERP-1-Behandlung von sekundärer immunvermittelter Verletzung folgend auf ein Neurotrauma

Eine reproduzierbare Verletzung des Thorax-Spinalrohrs bei Lewis- Ratten wird über eine elektromechanische Aufschlagvorrichtung wie vorher beschrieben induziert (Stokes et al., 1991 J, Neurotrauma 9: 187-195; Popovich et al. (1993) J. Neurotrauma 10: 37-46; Popovich et al., 1994 Brain Research 633: 348-352). Kurz gefaßt wird die elektromechanische Aufschlagvorrichtung verwendet, um kurze kontusive Verletzungen dem Spinalrohr des Nagers zuzufügen (< 25 m5 Gesamtdauer). Die Tiere werden routinemäßig mit Ketamin (60 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesiert und eine einzelne Segment-Laminektomie wird auf dem spinalen Niveau T8 oder T9 durchgeführt. Die Spinalrohre werden mit der Vorrichtung durch schnelles Versetzen des Spinalrohrs 1,1 mm von der ursprünglichen Rohroberfläche kontusioniert und sowohl Versetzen als auch Kraft werden kontinuierlich aufgezeichnet. Oberflächliche Wunden werden dann in Schichten geschlossen und die verletzten Tiere dürfen sich erholen.
Den verletzten Ratten wird SERP-1 über intravenöse Wege (0,3 pg bis 3 mg Dosierungen) und durch Intraspinalinjektionen (0,3 pg bis 3 mg Dosierungen) verabreicht. Verletzten Ratten in einer Kontrollgruppe wird ein ähnliches Volumen Salzlösung verabreicht. 1, 6, 14, 30, 60 und 90 Tage nach der SERP-1-Infusion werden die Ratten durch Verabreichung von Natriumphenobarbital (100 mg pro kg) getötet. Die Wirkungen der SERP-1-Behandlung auf die progressive Gewebsnekrose folgend auf die traumatische Verletzung wird durch histologische, biochemische, immunologische und Verhaltenskriterien überwacht, von denen bekannt ist, daß sie mit einem Neurotrauma bei Lewis-Ratten assoziiert sind. Z. B. wird ein Parenchym-microglia des zentralen Nervensystems und die Infiltration reaktiver Leukozyten, von denen bekannt ist, daß sie einen extensiven Zelltod nach einem Trauma vermitteln, wie folgt überwacht.
Eine immunohistochemische Analyse wird an den Formalin-fixierten Sektionen durchgeführt, die aus verletzten Bereichen des Thorax-Spinalrohrs geschnitten wurden. Paraffin-Sektionen, die aus dem fixierten Kaninchen- Spinalrohr genommen wurden, werden mit einer Vielzahl standardisierter Oberflächenmarker immunogefärbt, wie z. B. MHC-Marker, CD-Marker für die spezifischen Zell-Subtypen und ähnliches, die das Ausmaß der Mikroglia- Aktivierung und das Niveau der Leukozyten-Infiltration in das Spinalparenchym im Bereich der Kontusion-Läsion messen, die durch die spinale Verletzungsvorrichtung erzeugt wurde. Zusätzlich wird eine Bewertung der lokalen Extraktion von Standardentzündlichen Cytokinen, wie z. B. TNF und IL1 durch RT-PCR und Northern-Blotting-Analyse durchgeführt. Die Lymphozyten-Aktivierung in den geeigneten Drainage-Lymphoid-Geweben wird durch Lymphozyten-Proliferations-Assay gemessen und durch die adoptive Übertragung von spinalverletzungs-aktivierten Lymphozyten.

Beispiel 10

Wirkung von SERP-1 auf entzündliche Verdauungsorganerkrankungen, Arthritis und Psoriasis

Transgene Ratten, die das menschliche Klasse I-Haupthistokompatibilitäts-Allel, HLA-B27 exprimieren (Hammer et al., 1990, Cell 63: 1099-1112) werden verwendet, um die Wirkung von SERP-1 auf entzündliche Verdauungsorganerkrankungen, Arthritis und Psoriasis zu überwachen. Virtuell alle HLA-B27-Ratten entwickeln eine chronische gastrointestinale Entzündung im Alter von 16 Wochen, während ungefähr 70% eine Arthritis entwickeln und eine wesentliche Anzahl entwickelten Psoriasis im selben Zeitrahmen. Zusätzlich werden auch Cotton-Top Tamarins (CTT) verwendet, um die Wirkungen von SERP-1 auf die spontane und akute Kolitis, die der ulzerativen Kolitis und den Morbus Crohn ähnelt, zu überwachen. Siehe Podolsky et al., 1993 J. Clin. Invest. 92: 372.
Den HLA-B27-Ratten und den Cotton-Top Tamarins wird SERP-1 über eine Vielzahl von Wegen verabreicht: intravenös (0,3 pg bis 3 mg), subkutan (0,3 pg bis 3 mg), intraperitoneal (0,3 pg bis 3 mg), intraartikulär (0,3 pg bis 3 mg) und intrarektal (0,3 pg bis 3 mg). Nach 1 bis 30 Tagen werden Gewebeproben zur Analyse der entzündlichen Parameter gesammelt. Nach einer Bestimmung der SERP-1-Wirkungen wird die Anzahl der SERP-1- Injektionen je nach Bedarf optimiert.
Eine makroskopische Überprüfung der Rattengelenke wird wie in Beispiel 4 diskutiert durchgeführt. Eine Darmpathologie von HLA-B27-Mäusen und Cotton-Top Tamarins wird makroskopisch und mikroskopisch unter Verwendung etablierter Kriterien der Entzündung, wie z. B. den in Tabelle IV aufgezählten, eingeteilt, adaptiert von Kellen et al. 1986, Radiation Res. 105: 84-96. SERP-1-Wirkungen auf die Psoriasis werden durch eine Überprüfung von psoriatischen Läsionen und eine Beobachtung von Veränderungen der Gradierungszahlen, der Epidermis-Verdickung, der Hyperplasie und einer Färbung von assoziierten entzündlichen Zellen (im wesentlichen Lymphozyten) bei der Maus überwacht.
Entzündliche Verdauungsorganerkrankungen beim Kaninchen werden durch eine Colon-Verabreichung von Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) induziert, wie beschrieben bei Percy et al., 1993 Gastroenterology 104: 369-376 oder durch chemotaktisches Peptid, f-met-leu-phe, wie beschrieben von LeDuc et al., 1990, Gastroenterology 98: 929-935. Weiße Neuseeland-Kaninchen (3-4 kg) werden durch intramuskuläre Verabreichung von Xylazin und Ketamin anästhesiert. Ein Foley-Katheter wird ungefähr 15 cm in das Colon inseriert und mit 3 ml Luft aufgeblasen und vorsichtig zurückgezogen, um eine muskuläre Clearance von distalen fäkalen Stoffen zu induzieren. Eine Dialysetasche (8-10 cm, n. 7, 10 mm Durchmesser, Spectrum Medical Industries, Housten, TX) mit 3 bis 4 ml 150 mg/ml TNBS in 50% Ethanol wird in das distale Colon inseriert und für eine Stunde an diesem Platz gelassen. Die Tasche wird dann entfernt und die Tiere werden mit intravaskulären, intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen oder durch ein Suppositorium verabreichten SERP-1 (3 pg/kg bis 3 mg/kg) oder einer Salzlösungskontrolle behandelt. Die Behandlung erfolgt entweder in Einzeldosierung, direkt folgend auf die TNBS-Entfernung, eine Stunde folgend auf die TNBS-Entfernung, einen Tag folgend auf die TNBS-Entfernung oder täglich für 5 Tage, folgend auf die TNBS-Entfernung. Die Tiere wurden mit Pentobarbital (60 mg/kg) 5 Tage nach der TNBS-Behandlung getötet. Die distalen 5 cm des Colons wurden auf entzündliche Verdauungsorganerkankungen hin analysiert. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Coloninfektionen wurden auf ein Auftreten von Ulzerationen der Lamina propria, Submucosa, Muscularis mucosae und Mucosa sowie deren cryptische Abszesse, Neutrophilen- Aggregation und die Gegenwart von entzündlichem Infiltrat in die Muscularis Propria hin untersucht. Colitis ist definiert als Gegenwart akuter und chronischer entzündlicher Zellen in der Lamina propria und durch akute intraepitheliale entzündliche Zellen.

Tabelle IV

MORPHOLIGISCHE PARAMETER*
Cryptentiefe, um
Villushöhe, um
Villusbreite bei halber Höhe, um
Villusbodenbreite, um
Villusoberflächenbereich um¹/Villus
Anzahl der Zellen/Villus
Anzahl der Villi/mm Serosalänge
Anzahl der Villi/mm² Serosa
Mucosaoberflächenbereich mm²/mm² Serosa
Microvillushöhe, um
Anzahl der Microvilli/um

Beispiel 11

Wirkung von SERP-1 auf Psoriasis

Zusätzlich zur Verwendung von HLA-B27-Ratten, wie diskutiert in Beispiel 10, wurden die Wirkungen von SERP-1 auf Psoriasis bei Mäusen überprüft, die die flockenartige Haut (fsn)-Mutation trugen. Psoriasis- Läsionen können auch als Hauttransplantate auf normalen Wurfgeschwistern oder nackten Mäusen erhalten bleiben, so daß die pathologischen Merkmale des fsn-Phänotyps unabhängig von dem Wirts-Thymus-abgeleiteten Immunsystem persistieren können. Sundberg et al., 1944, J. Invest. Dermatol. 102: 781- 788.
SERP-1 wird den fsn/fsn-Mäusen oder nomalen Wurfgenossen oder nackten Mäusen, die Hauttransplante von fsn/fsn-Mäusen tragen, über eine Vielzahl von Wegen verabreicht: intravenös (0,3 pg bis 3 mg), subkutan (0,3 pg bis 3 mg), intraperitoneal (0,3 pg his 3 mg) und intraartikulär (0,3 pg bis 3 mg). Nach 0, 6, 14, 30, 60 und 90 Tagen werden Gewebeproben zu Analyse im Hinblick auf entzündliche Parameter gesammelt. Nach einer Bewertung der SERP-1-Wirkungen kann die Anzahl der SERP-1-Injektionen je nach Bedarf erhöht werden.
Die SERP-1-Wirkungen auf die Psoriasis werden durch Überprüfung der Psoriasis-Läsionen und Beobachtung von Veränderungen der Skalierungszahlen, der Epidermisverdickung, durch die Hyperplasie und eine Färbung auf assoziierte entzündliche Zellen (im wesentlichen Lymphozyten) bei der Maus überwacht. Die Epidermis-Hyperplasie wird als Anstieg der DNA-Synthese gemessen, geschätzt durch Nachweis einer erhöhten ³H-Thymidin-Aufnahme in die Zellen von Psoriasis-Läsionen.
Die Messung autoreaktiver T-Zellaktivierung durch Antigen-präsentierende Zellen von menschlichen Psoriasis-Läsionen wird ebenfalls verwendet, um die SERP-1-Wirkungen auf menschliche Psoriasis-Zellfunktionen in vitro zu überwachen. Epidermis-Zellsuspensionen werden sowohl von frischen Hautbiopsien normaler Individuen als auch von Individuen, die an Psoriasis leiden, hergestellt. T-Zellen von denselben Individuen werden gleichzeitig gereinigt und die Epidermiszellen, die die Antigen-präsentierenden Zellen enthalten, werden mit autologen, CD4-positiven T-Zellen von demselben Individium zur Initiation der T-Zellaktivierung co-kultiviert. Autoreaktive Reaktionen werden unter Verwendung konventioneller Verfahren bewertet, wie z. B. der Messung der Aufnahme von Tritium-behandeltem Thymidin oder durch Quantifizierung der relativen Mengen an mRNA für Lymphokine, wie z. B. IL-2, ganima-Interferon und IL-4.
Die Fähigkeit von SERP-1, verschiedene Antigen-präsentierende Zellen in der Läsions- (oder normalen)-Haut bei der Aktivierung von T-Zellen oder der Aktivierung distinkter Typen von Cytokinen zu verringern, wird durch direkte Zugabe von SERP-1 zu der Zell/T-Zellkultur geprüft. Die Inhibition von Tritium-behandelter Thymidinaufnahme in der Antigen-präsentierenden Zell/T-Zell-Co-Kultur zeigt eine SERP-1-Inhibition des autoreaktiven Prozesses an. Diese Daten werden mit den Ergebnissen verglichen, die mit Puffer und normalen Hautzellkontrollen erhalten werden.

Beispiel 12

Wirkungen von SERP-1 auf Graft/Transplantat-Abstoßung

Männliche Cynomolgus-Affen, die während einer Ketamin-Hydrochlorid/Diazepam-Anästhesie heterotrophe Nierenallografts erhielten, (Cosimi et al. 1990, J. Immunology 144: 4604-4612) werden verwendet um die Wirkungen von SERP-1 auf die Verbesserung einer Transplantat-Abstoßung zu überwachen. Die SERP-1-Therapie wird am Tag der Transplantation oder zu einem geeigneten Zeitpunkt danach begonnen. SERP-1 wird über eine Vielzahl von Wegen verabreicht: intravenös (3 pg bis 3 mg), subkutan (3 pg bis 3 mg), intraperitoneal (3 pg bis 3 mg) und intraartikulär (3 pg bis 3 mg). Die Allografts werden seriell durch eine offene Keilbiopsie ungefähr in wöchentlichen Intervallen, beginnend in der Woche nach der Transplantation, genommen. Autopsien werden zum Zeitpunkt des Todes durchgeführt und Herz, Leber, Lungen, Milz, Lymphknoten und das Allograft werden als Proben genommen. Die Proben werden entweder im gepufferten 4%igen Formalin fixiert und routinemäßig für die mikroskopische Überwachung verarbeitet oder aber bei -70ºC für eine Immunperoxidase-Analyse eingefroren.
Gewebssektionsproben werden mikroskopisch überprüft und im Hinblick auf zelluläre Infiltration durch Auszählung der Anzahl von infiltrierenden mononuklearen Zellen in einem Quadratraster unter Verwendung von 2 bis statistischen Feldern bewertet. Das Ausmaß und der Grad der Infiltration, die Proliferation oder Nekrose des artiellen Endothels und der Media wird in der Kontrolle (keine SERP-1-Behandlung) und den experimentellen Proben festgehalten.
Die SERP-1-Wirkungen werden auch durch Überprüfung der Expression von Leukozyten-Antigenen, einschließlich dem intrazellulären Adhäsionsmolekül-1 (CD54) und ICAM-1 im vaskulären Endothel der Nieren und anderer Organe unter Verwendung wohlbekannter Verfahrensweisen, die z. B. der FACS-Analyse und einer immunohistochemischen Färbung überprüft.
Männliche Lewis-Ratten werden ebenfalls verwendet, um die Wirkungen von SERP-1 auf die Vermittlung einer Graft-Abstoßung zu überwachen. (LEW · BFN)F&sub1;-Herzen werden heterotop in die Abdominalhöhlung von LEW-Rezipienten wie vorher beschrieben transplantiert (Paul et al., 1992 Transplantation 53: 157). Die Empfängerratten werden statistisch verteilt, um entweder keine Behandlung (Kontrolle) oder SERP-1-Infusionen zu erhalten, verabreicht durch eine Vielzahl von Wegen: intravenös (3 pg bis 3 mg), subkutan (3 pg bis 3 mg), intraperitoneal (3 pg bis 3 mg) und intraartikulär (3 pg bis 3 mg). Das Ausmaß der interstitiellen zellulären Infiltration ist durch eine Immunocyctochemie charakterisiert, unter Verwendung des Makrophagen mAb ED1, ED2, ED3 und EG5 (ein monoklonaler Antikörper, der mit T- Lymphozyten und einer Subpopulation von B-Zellen reagiert). Siehe Paul et al., 1992, Transplantation 53: 157.
Bei einem anderen Verfahren der Überwachung der Wirkungen von SERP-1 auf die Verbesserung einer Graft-Abstoßung werden weiße Neuseeland- Kaninchen einer Interposition-Venentransplantation der Carotid-Arterie unterzogen. Beginnend 0, 6, 30, 60 und 90 Tage nach dem chirurgischen Eingriff werden die Tiere statistisch einer Kontrolle oder einer SERP-1- behandelten Gruppe zugeordnet. SERP-1-Infusionen werden über eine Vielzahl von Wegen verabreicht: intravenös (3 pg bis 3 mg), subkutan (3 pg bis 3 mg), intraperitoneal (3 pg bis 3 mg) und intraartikulär (3 pg bis 3 mg). Die Tiere werden getötet und die Gefäße werden für die Intima- Hyperglasie-Analyse geerntet. Die Tntima-Hyperplasie in den Carotid- Arterien und den Venen-Transplantaten sowohl von den experimentellen als auch den Kontrollproben werden durch eine Computerbild-Analyse, wie diskutiert bei Wilson et al., 1994 Eur. J. Vas. Surg. 8(1):60-64 gemessen.
Die bessernden SERP-1-Wirkungen auf die Thrombusbildung werden ebenfalls durch Verabreichung von SERP-1 an Schweine mit thrombogenen vaskulären Transplantaten, eingelagert in arteriovenöse Shunts, gemessen. Die vaskulären Schweine-Transplantat/arteriovenösen Shunts sind früher diskutiert worden, Scott et al., 1994 Circulation 90(4):1951-1955. Die SERP-1-Verabreichungswege, -Dosierungen und -Thrombusmessungen sind im wesentlichen die selben wie oben diskutiert.

Beispiel 13

Wirkungen von SERP-1 auf Myokarditis

Die Autoimmunmyokarditis wird bei Lewis-Ratten durch Immunisierung mit einer Herzmyosin-Fraktion wie vorher bei Kodoma et al., 1994 Circ. Res. 75 (2): 278-284 beschrieben, induziert.
Die immunisierten Ratten werden statistisch einer Kontroll- oder SERP-1 behandelten Gruppe zugeordnet. Die SERP-1-Infusionen werden durch eine Vielzahl von Wegen verabreicht, intravenös (3 pg bis 3 mg), subkutan (3 pg bis 3 mg), intraperitoneal (3 pg bis 3 mg) und intraartikulär (3 pg bis 3 mg). Die Tiere werden getötet und die Herzen werden für routinemäßige histologische und immunologische Analysen entfernt. Die SERP-1-modulierenden Wirkungen auf die Autoimmunmyocarditis werden durch Feststellung der reduzierten Größe une Entfärbung der Herzen bei SERP-1-behandelten Tieren im Vergleich mit unbehandelten Kontrolltieren und durch Festhaltung der reduzierten Verhältnisse von Herzgewicht zu Körpergewicht bei Hetzen aus SERP-1-behandelten Tieren im Vergleich mit unbehandelten Kontrolltieren überwacht. Zusätzlich werden auch die verbessernden SERP-1-Wirkungen auf den Myokardmuskelverlust und die Ersatzfibrose durch Radionuklid-Bewertung und Thermoverdünnungs-Farbstoffbewertung des Herz-Outputs wie auch durch routinemäßige hämodynamische Messung und das Myokardgewicht gemessen.
Eine virale Myokarditis wird bei Mäusen durch Infektion mit Coxsackievirus B3 (rCVB3) induziert, wie vorher diskutiert bei Zhang et al., 1994, Int. J. Exp. Pathol. 75(2):99-110. Die SERP-1-modulierenden Wirkungen auf die Myokarditis werden wie oben diskutiert überwacht.

Beispiel 14

Wirkung von SERP-1 auf die Insulin-abhängige Diabetes

Splenozyten aus nicht-übergewichtigen Diabetes (NOD)-Mäusen, die Zeichen einer Diabetes zeigten, wurden geerntet und von roten Zellen befreit parallel zu den Splenozyten aus nicht-diabetischen Mäusen, wie beschrieben von Burkly et al., 1994 Diabetes 43: 529-534. Splenozyten aus NOD-Mäusen werden (a) mit SERP-1 vorbehandelt oder (b) mit nichtspezifischem Isotyp-gepaarten Immunoglobulin vorbehandelt oder (c) nicht behandelt. Die Splenocyten werden dann intravenös (2-3 · 10&sup7; Zellen in 0,2 ml PBS) den nicht-diabetischen Mäusen injiziert. Kontrollen beinhalten Nicht-Diabetes-Mäuse, die gepufferte Salzlösung erhalten oder Splenozyten aus nicht-Dibates-Mäusen.
Gemäß einem alternativen Verfahren wird SERP-1 0, 6, 14, 30, 60 und 90 Tage nach dem Splenozyten-Transfer verabreicht, anstelle einer Vorbehandlung der Splenozyten aus NOD-Mäusen. Die SERP-1-Infusionen werden über eine Vielzahl von Wegen verabreicht: intravenös (3 pg bis 3 mg), subkutan (3 pg bis 3 mg), intraperitoneal (3 pg bis 3 mg) und intraartikulär (3 pg bis 3 mg). Die SERP-1-bessernden Wirkungen auf die Diabetes werden durch Routine-Assays im Urin und Plasmaglucose-Niveaus überwacht. Die Tiere werden getötet und der Pankreas wird in 10%igem Formalin-PBS für eine Paraffineingebettete Sektionierung, gefolgt von Hämatoxylin- und Eosin- Färbung für die Histologie geernetet. Die Inseln werden in einem Blitzexperiment bewertet und mindestens 25 Inseln werden pro Individuum überprüft. Der Grad der Insulitis wird wie beschrieben von Burkly et al., 1987 bewertet: Grad 0: keine Insulitss, Grad 1: Peri-Insulitis, Grad II: die Läsion der Zellinfiltration nimmt weniger als 25% des Inselbereichs ein, Grad III: 25-50% infiltriert und Grad IV: mehr als 50% infiltriert. Die Prozentzahl der nicht-infiltrierten Inseln (Grad 0), der mäßig infiltrierten Inseln (Grad I-III) und der sehr stark infiltrierten Inseln (Grad III-IV) wird in Beziehung zu der Gesamtzahl der Inseln, überwacht für jedes Individuum, berechnet.

Beispiel 15

Wirkung von SERP-1 auf Schlaganfall

Die modulierende Wirkung von. SERP-1 auf die Zentralnervensystem- Ischämie wird unter Verwendung von Gerbils, Kaninchen oder Ratten überprüft. Die Induktion einer einzelnen oder sich wiederholenden Ischämie bei Gerbils wurde früher von Wishart et al., 1994, Neuroreport 5(12): 1541-1544 beschrieben.
Eine reversible Spinalrohrischämie wird bei dem Kaninchen durch temporäre Okklusion der Abdominalaorta induziert. Eine irreversible Zerebralischämie bei Kaninchen wird durch Injektion von Kunststoff- Mikrosphären (50 Mikrons) in die innere Carotid-Arterie induziert, so daß sich die Kügelchen in den zerebralen Adern festsetzen. Siehe Bowes et al., 1994, Storke 25 (11): 2253-2257.
SERP-1 wird nach Initiation der Ischämie entweder durch Infusion mit einem Dosierungsbereich von 3 pg bis 3 mg pro kg Körpergewicht oder als Austauschtransfusion in einem Dosierungsbereich von 3 pg bis 3 mg pro kg Körpergewicht verabreicht. Die Wirkungen von SERP-1 werden bei den Tieren überwacht, die eine reversible Ischämie durchmachen, indem die Leistungsunterschiede in einer Wasser-Labyrinth-Aufgabe bei SERP-1-behandelten und kontrollbehandelten Tiere festgehalten werden. Die SERP-1-Wirkungen werden bei Tieren überwacht, die eine irreversible zerebrale Ischämie durchmachen, indem die Dauer der Ischämie gemessen wird, die benötigt wird, um eine permanente Paralyse zu erzeugen.
Eine fokale Ischämie wird bei Ratten durch Okklusion einer Zerebralarterie initiiert, wie beschrieben von Davis et al. 1994 Acta. Neurochir. Suppl. 60 : 282-284. Vor der Initiation der fokalen Ischämie werden die Ratten statistisch in experimentelle Gruppen geordnet, die eine SERP-1- Vorbehandlung erhalten, die subkutan, intravenös, intraarteriell, intraperitoneal oder in die Spinalflüssigkeit mit Dosierungen von 0,3 pg bis 300 ug verabreicht wird oder eine Kontrollgruppe, die Salzlösung erhält (oder keine Vorbehandlung). Die SERP-1-Wirkungen werden durch die histologische Bewertung des Infarktvolumens und die Analyse der relativen Dichte als Index als Zerebralödems unter Verwendung wohlbekannter Verfahrensweisen überwacht.

Beispiel 16

Wirkung von SERP-1 auf multiple Sklerose

Eine experimentelle Autoimmunenzephalitis (EAE) ist ein MS-ähnliches Syndrom und wird durch Injektion von experimentellen Tieren intraperitoneal mit CD-4-positiven T-Zell-Klonen, die spezifisch für Myelin-basische Protein sind, induziert. Injizierte T-Zell-Klöne, die mit dem Myelin- basischen Protein reaktiv sind, lokalisieren sich im zentralen Nervensystem und initiieren die Entzündung. Siehe Ben-Nun et al., 1981 Dur. J. Immunol., 11: 195-199; Hickey et al., 1991, J. Neurosci. Res., 28: 254-260, die hierin durch Bezugnahme inkorporiert sind. Endogene Monozyten und Lymphozyten penetrieren die entzündeten Gefäße im Gehirnstamm und im Spinalrohr.
EAE wird durch Injektion von ungefähr 8 · 106 Zellen des geeigneten T-Zell-Klons intraperitoneal in Lewis-Ratten induziert. Die Produktion und der Erhalt des T-Zell-Klons ist wie beschrieben bei Ben-Nun et al. 1981 Eur. J. Immunol. 11: 195-199. Ratten entwickeln im typischen Fall eine Paralyse der hinteren Beine und des Schwanzes und zwar innerhalb von 4 bis 5 Tagen. Yednock et al. 1991 Nature 356: 63-66. Kurz gefaßt werden die Lewis-Ratten mit Myelin-basischem Protein, emulgiert in Salzlösung und kompletten Feund's Adjuvans immunisiert. Nach ungefähr 9 Tagen werden die Drainage-Lymphknoten entfernt, in supplementiertem Eagles-Medium resuspendiert und in Petrischalen mit zugefügtem Myelin-basischem Protein kultiviert. Die Lymphoblasten werden dann abgetrennt und in einem Schritt auf einem Ficoll-Dichtegradienten konzentriert. Die Lymphoblasten-Fraktion wird gewonnen, gewaschen und in vitro in Eagles-Medium, versetzt mit Concanavalin-A-stimulierten Milzzellen, Pferdeserum, Aminosäuren, Pyruvat, 2-Mercaptoethanol und Antibiotika propagiert. Die T-Lymphozyten werden durch limitierende Verdünnung in Mikrotitervertiefungen selektioniert, die bestrahlte syngene Thymuszellen und Myelin-basisches Protein enthalten. Ben-Nun et al., 1981.
Die bessernden SERP-1-Wirkungen auf MS können ebenfalls bei mit Maus- Hepatatitis-Virus (JHM-Koronavirus) infizierten Mäusen überwacht werden. JHM wird intrazerebral in junge Mäuse mit folgender Krankheitsprogression injiziert (Lucas et al. 1979 Cell 12: 553-560; Robb et al.; 1979 Virology 94: 352-370). SERP-1 wird vor oder gleichzeitig mit der Verabreichung des T-Zellklons oder mit der JHM-Stamminfektion verabreicht. Die bessernden SERP-1-Wirkungen auf die Entzündung werden unter Verwendung von routinemäßiger Hämatoxylin- und Eosin- und immunohistochemischer Färbung und einem in vitro-Adhäsions-Assay überwacht, wie vorher beschrieben von Yednock et al. 1991 Nature 356: 63-66. Sektionen von 5 Tage EAE - oder JHM-infizierten Gehirn werden auf die Fähigkeit, eine Leukozytenanhaftung zu stützen, getestet. Stamper und Woodruff, J. Exp. Med., 144: 828-833 (1976). Leukozyten, z. B. menschlich monozytische Zellen der Linie U937 werden in einer Konzentration von ungefähr 107 Zellen pro ml über frisch geschnittene nicht-fixierte 10 um-Sektionen eines EAE-Rattenhirns geschichtet, das mit SERP-1 exprimiert (experimentell) oder nicht-exprimiert (Kontrolle) ist. Angehaftete Leukozyten werden als dunkler gefärbt als sektioniertes Gehirngewebe erkannt und in einer unterschiedlichen fokalen Ebene lokalisiert.
Die bessernden SERP-1-Wirkungen auf die zelluläre Infiltration werden immunohistochemisch unter Verwendung von Zentralnervensystem-Sektionen, genommen von experimentellen und Kontrollbehandlungen und unter Verwendung einer Vielzahl von erhältlichen Antikörpern, wie z. B. denjenigen, die in Tabelle 1 von Yednock et al., 1992, Nature, 356: 63-66, durch Inbezugnahme inkorporiert, aufgezählt sind, überwacht. Das Verfahren mit markierten Antikörpern wird in Naish S. J., Hrsg. 1989 Handbook of Immunochemical Staining Methods, Dako Corp., Carpinteria, CA. beschrieben. Z. B, werden experimentelle und Kontrollsektionen mit monoklonalem Antikörper OX-1 (gegen CD45, das auf allen Leukozyten exprimiert wird) behandelt oder mit dem monoklonalen Antikörper ED1, der zirkulierende Monozyten erkennt. Unterschiede in der Anzahl der reaktiven Leukozyten und Monozyten zwischen Kontrolle und experimentellen Sektionen werden festgehalten.

Beispiel 17

SERP-1-Wirkungen aus systemischen Lupus erythematosus (SLE)

NZB/NZW F1-Hybride und MRL (lpr/lpr)-Mäuse sind zwei Maulstämme, die spontane SLE-ähnliche Erkrankungen entwickeln. Die weibliche Nachkommenschaft von Neuseeland-Schwarz-Weiß-Kreuzungen entwickeln schwere Immunkomplexnephritis, Anti-DNA-Antikörper und durchlaufen eine schwere generalisierte Lymphozyten-Dysfunktion innerhalb von einigen Monaten nach der Geburt und sterben in der Regel vor 9 Monaten. Siehe Howie und Helyer 1968 Adv. Immunol. 9.:215, hier inkorporiert.
Ähnlich, entwickeln MRL (lpr/lpr)-Mäuse eine fatale Immunkomplex- Glomerulonephritis innerhalb von 6 Monaten nach der Geburt, begleitet von massiver Lymphoproliferation mit vergrößerten peripheren Lymphknoten und einer beachtlichen Splenomegalie. Ungefähr 10 bis 20% der MRL-Mäuse entwickeln auch eine progressive rheumatoide Arthritis und vaskulitische Hautläsionen vor dem Tod. Siehe z. B. Theofilopolous und Dixon, 1985 Adv. Immunol. 37: 269-390 durch Inbezugnahme eingeschlossen. Im allgemeinen sind Mäuse, die jünger als ungefähr 10 Wochen sind, krankheitsfrei und Mäuse, die älter sind als ungefähr 16 Wochen entwickeln die Erkrankung.
Kurz nach der Geburt wird damit begonnen, beiden Mausstämmen SERP-1 in einer Dosierung von 1 ng bis 3 pg/kg bis 3 mg/kg über intravenöse und intraperitoneale Wege, durch Zeitintervalle beabstandet, die von einer Woche bis einem Monat variieren, zu verabreichen. Die Wirkung von SERP-1 auf eine Verbesserung der Immunpathologie, assoziiert mit SLE wird monatlich überwacht, wobei die folgenden standardisierten Kriterien verwendet werden: (i) Nierenfunktion, manifestiert durch Proteinurie, Harnstoffniveaus im Urin, glomeruläre Filtrationsraten und Niveaus der subkapsulären Nierenhämorrhagie; (ii) Anzahl von Foci einer Glomerulonephritis in Nierenbereichen; (iii) Lymphozyteninfiltration von Tränen- und Parotis-Drüsen; (iv) Niveaus von Anti-Erythrozyten und Anti-DNA und anti-nukleären Antikörpern; (v) Niveaus einer IgM-Hypergamma-Globulinämie; (vi) Verlust der Thymusfunktion, z. B. IL-2-Produktion aus isolierten Lymphozyten; (vii) Nierenmorphologie, z. B. Vergrößerung von glomerulären Ablagerungen, (viii) vermehrtes Plasma TNF/IL-6 und vermehrte Concanavalin-A-induzierte und spontane Cytokin-Sekretion durch T-Zellen.
Die vorstehenden Kriterien werden durch Assays gemessen, wie beschrieben von Morrow et al., 1976 Autoimmune Rheumatic Disease, Blackwell Scientific Pub., Oxford, hier durch in Bezugnahme eingeschlossen. Die SERP-1-Administraion wird durch multiple (wöchentliche und monatliche) Injektionen je nach Bedarf erhöht.
Bei einem alternativen Mausmodell für SLE werden den Mäusen zum Zeitpunkt der Geburt semi-allogene Lymphoid-Zellen injiziert. Die injizierten Mäuse entwickeln ein Lupus-ähnliches Autoimmunsyndrom, bei dem die Donor B-Zellen polyklonal durch wirts-alloerotische CD4&spplus;-T-Zellen aktiviert werden, und Autoantikörper und Immunkomplex-vermittelte Glomerulonephritis erzeugen. Siehe Ramos et al., 1994 Immunology 82: 287- 293, durch Inbezugnahme hier eingeschlossen. Die SERP-1-Verabreichung und Überwachung der Wirkungen sind wie oben beschrieben.

Beispiel 18

Wirkung von SERP-1 auf eine Lungenverletzung

Ein Tiermodell einer akuten Lungenverletzung (z. B. ARDS) wird von Doershuk, et al., 1990, J. Immunol. 144: 2327-2333 beschrieben. Die verbessernden SERP-1-Wirkungen auf die Lungenverletzung werden wie folgt überwacht. Zunächst werden weiße Neuseeland-Kaninchen, die 1 bis 4 kg wiegen, mit Ketamin (25-40 mg/kg iv) und Acepromazinmaleat (2-3 mg/kg) anästhesiert. Folgend auf eine Tracheotomie wird ein enger flexibler Schlauch inseriert und in die peripheren Bronchien unter Verwendung von Fluoroskopie eingeführt. Die Kaninchen werden mit intravaskulärem, intraperitonealem, subkutanen, inhaliert aerolisierten SERP-1 in Dosierungen von 3 pg bis 3 mg/kg (oder einer Salzlösungskontrolle) 20 Minuten vor oder 20 Minuten folgend auf eine Einführung der entzündlichen Stimuli behandelt. Die Lungenentzündung wird durch eine intrabronchsale Infusion von einer von drei Arten von Stimuli induziert: S. pneumonia (0,15 ml/kg, 109 Organismen/ml Salzlösung mit 7% kolloidalem Kohlenstoff), Salzsäure (0,15 ml/kg, 10 pg/ml Salzlösung mit 10% Monasteralblau) oder Phorbolmyristatacetat (25 ug/kg mit 10% Monasteralblau). Der Schlauch wird dann entfernt und der Einschnitt wird genäht. Die Lungenentzündung wird bei 20 Minuten, 1, 2, 4, 6 und 12 Stunden nach der Einführung des entzündlichen Stimulus durch Entfernung der Lunge, Präparation von Gewebessektionen, gefärbt mit Eosin/Hämatoxylin und morphometrische Quantifizierung von PMN oder PMN gegen rote Blutzellen (RB) Infiltration in die Alveoli überwacht. Die Katheter werden während der Anästhesie (5-10 mg/kg Ketamin mit lokal 1% Lidocain) entfernt. Die Tiere werden unter Standardbedingungen in Käfigen gehalten und täglich im Hinblick auf Gewicht, Hct und arterielle Blutgase überwacht. Fünf Tage nach der Hämorrhagie werden die Tiere durch Pentobarbital-Überdosierung getötet und eine Nekropsie wird durchgeführt. Die Organe werden auf einen groben Nachweis von Verletzung von Gewebssektionen, gefägt mit Hämatoxylin und Eosin hin untersucht. Die Lungen werden histologisch analysiert und die Bronchial-Alveolar-Lavageflüssigkeit wird auf Zellzahlen und Leukozyteninfiltration hin analysiert.
Tiermodelle von septischen und endotoxischen Schock werden von Harlan et al. 1992 J. Applied Physiol. 73(4):1510-1516 beschrieben. Unter Verwendung dieser Modelle werden 3 pg bis 300 pg-Dosierungen SERP-1 den Tieren vor und/oder folgend auf eine Endotoxin-Infusion oder Appendektomle täglich für drei Tage über intravaskuläre, intramuskuläre, subkutane, Inhalationsaerosol- oder intraperitoneale Verabreichung verabreicht. Die SERP-1- Wirksamkeit für die Verhinderung von Schock wird bei getöteten Tieren an den Tagen 1 bis 5 folgend auf eine Endotoxin-Infusion oder Appendektomie unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren überwacht.
Ein zusätzliches Modell einer Lungenverletzung aufgrund endotoxischem Schocks bei Ratten wird von Rabinovici et al., 1992, J. Immunol. 149: 1744- 1750 beschrieben und die SERP-1-Verabreichung und Analyse der Lungen- oder Organverletzung wird bei diesem Modell wie oben beschrieben durchgeführt.

Beispiel 19

Wirkung von SERP-1 auf Ischämie und Reperfusionsverletzung

Zwei Modelle einer lokalen Ischämie/Reperfusionsverletzung werden von Mihelcic et al., 1994 Blood 84: 2322-2328 und Kelly et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 812-816 beschrieben. Ein lokales und entferntes Ischämie/Reperfusionsverletzungsmodell wird von Hill et al. 1992 J. of Immunol. 149: 1723-1728 beschrieben.
Weiße Neuseeland-Kaninchen (1,5 bis 3 kg) werden mit intravenösem Ketamin und Xylazin anästhesiert. Eine periphere Ohrvene wird mit einer Kanüle versehen und ein lokaler Nervblock durch Injektion von Lidocain an der Basis des Ohrs bewirkt. Diese Ohr wird dann an seiner Basis transeziert, wobei nur die Zentralarterie, die Zentralvene und ein kleiner Bereich Stützknorpel intakt gelassen werden. Alle Nerven zu dem distalen Segment des Ohrs werden geschnitten, wodurch das Ohr vollständig anästhesiert wird. Ein mikrovaskulärer Clip wird dann an die Zentralarterie des linken Ohrs zur Erzeugung einer vollständigen Ischämie plaziert. Das Ohr wird dann wieder durch Vernähen angebracht und der mikrovaskuläre Clip kann durch die Wunde auswandern. Das Ohr wird durch Entfernung des Clips nach 6 Stunden reperfusioniert. Zum Zeitpunkt der Reperfusion wird eine Bolus-Injektion von SERP-1 mit Dosierungen von 3 pg/kg bis 3 mg/kg entweder intravenös, intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär verabreicht. Eine Umgebungstemperatur zwischen 23,5 und 24ºC wird während des Verfahrens aufrecht erhalten.
Eine Verletzung, die sich durch ein Ödem manifestiert, wird durch Untertauchen des Ohrs in einen Wasserkolben bis zur Nahtlinie und Messung des Versetzens bestimmt. Eine Gewebsnekrose wird als Prozentanteil eines nekrotischen Bereichs im Vergleich mit dem Gesamtoberflächenbereich bestimmt. Diese Messungen werden durch einen nicht-betroffenen Beobachter durchgeführt. Die Neutrophilen-Infiltration wird unter Verwendung des Myeloperoxidase-Assays unter Verwendung eines Gewebeextrakts von dem Kaninchenohr gemessen.
Männliche Sprague-Dawley-Ratten, die 1,6 bis 1,9 kg wiegen, müssen 12 Stunden vor der Chirurgie fasten. Nach einer Natriumpentobarbital (65 mg/kg) und nach 6 ml 0,9%igen NaCl für die Anästhesie werden die Renalarterie und -vene chirurgisch exponiert und bilateral 30 Minuten mit Mikroaneurysmen-Klammern verschlossen. SERP-1 wird in Dosierungen von 3 pg/kg bis 3 mg/kg durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane oder intramuskuläre Injektion bei Freisetzung der geklammerten Nierengefäße verabreicht. Zum Zeitpunkt zwischen 0 und 72 Stunden nach der Reperfusion werden Blutproben aus der Schwanzvene genommen und im Hinblick auf Harnstoffstickstoff (BUN) analysiert und eine Standard-Urease- Assay/Leitfähigkeits-Assay und Kreatinin unter Verwendung von Picrinsäure- Reaktionen werden durchgeführt. Für die histochemische Analyse der Verletzung werden die Ratten 0,5 bis 72 Stunden später getötet und ein Nierengewebe wird in Formalin fixiert, sektioniert und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die Prozentzahl der Tubuli in der äußeren Medulla, die eine Epithelnekrose oder nekrotischen Abfall aufweisen, werden durch Blind- Beobachter quantifiziert. Myeloperoxidase-Assays werden an dem Nierengewebe durchgeführt, das zu Zeitpunkten genommen wurde, zwischen 0,5 und 72 Stunden nach der Reperfusion zur Messung der neutrophilen Infiltration.

Beispiel 20

Wirkung von SERP-1 auf Nierenversagen

Eine Glomerulonephritis wird durch einen antiglomerulären Basismembran-Antikörper bei Ratten induziert. WKY-Ratten (300-350 kg) werden durch infraperitoneale Injektion von Ketamin (25-30 mg/kg) und Natriumpentobarbital (50 mg/kg) anästhesiert. SERP-1 in Dosierungen von 3 pg/kg bis 3 mg/kg wird entweder durch intravaskuläre, intramuskuläre, intraperitoneale oder subkutane Injektion verabreicht. Schaf-anti-Rattenglomeruläres Basismembran-IgG oder Kontroll-IgG (0-10 mg) wird intravenös verabreicht. Die Ratten werden dann in Stoffwechselkäfigen für 24 Stunden in Intervallen bis zu 10 Tagen folgend auf Anti-GBM zur Messung einer Proteinurie untergebracht. Das Gesamturin-Protein wird unter Verwendung von Standard-Lowry-Assays gemessen. Einige Tiere erhalten zusätzlich zu der anfänglichen Verabreichung von SERP-1 tägliche Dosierungen von SERP-1 von 3 pg/kg bis 3 mg/kg, die durch intravaskuläre, intramuskuläre, intraperitoneale oder subkutane Injektion verabreicht werden. Die Tiere werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten getötet und die Nieren werden entfernt, fixiert und seziert. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte oder Toluidinblaugefärbte Sektionen des Nierengewebes werden im Hinblick auf eine entzündungszelluläre Infiltration, Halbmondbildung, Hyperzellularität und sklerotisches Gewebe hin analysiert. Extrazelluläre Matrixbildungen, können durch Färbung mit Antifibronektin und Antitenascin-Antikörper nachgewiesen werden.
Ein weiteres Modell einer Ratten-Glomerulosklerose bei Sprague- Dawley-Ratten unter Verwendung von Antithymocyten-Serum wird im Detail von Okuda et al., 1990, J. Clin. Invest. 86: 453-462 beschrieben. Unter Verwendung dieses Modells wird SERP-1 in Dosierungen von 3 pg/kg bis 3 mg/kg durch intravaskuläre, intramuskuläre, intraperitoneale oder subkutane Injektion auf einer täglichen Basis folgend auf eine Seruminfusion für bis zu 7 Tagen verabreicht. Histologische Sektionen des Nierengewebes für 0 bis 7 Tage nach der Seruminfusion werden mit Hämatoxylin und Eosin oder Antitenascin-Antikörpern gefärbt, um eine grobe Verletzung bestimmen zu können wie auch die Entzündungszellinfiltration und die Sklerose.

Beispiel 21

Wirkung von SERP-1 aus systemischen Schock

Weiße Neuseeland-Kaninchen, die 1 bis 1,5 kg wiegen, werden mit Ketamin (30 mg/kg iv) anästhesiert. Unter sterilen Bedingungen werden Zentralvenen und mit Thermistor-Spitzen versehene Aorta-Katheter (et. Modell 94-011, American Edwards Laboratories, Santa Ana, CA) durch einen offenen Femoral-Eingang mit lokaler 1%iger Lidocain-Versetzung plaziert. Der arterielle Blutdruck (BP), zentralvenöse Druck und der Kerntemperatur werden kontinuierlich überwacht. Periodische Bestimmungen werden von den arteriellen Blutgasen, dem Hematokrit (Hct), der Auszählung der weißen Blutzellen (WBC) und dem relativen Thermoverdünnungs-Herzausgang (CO) unter Verwendung eines Herausgabe/Lungen-Wasser-Computers (American Edwards Laboratories) durchgeführt. Nach Erholung aus der Anästhesie wird jedes Tier intravenös, intramuskulär, subkutan oder intraperitoneal mit SERP-1 von 3 pg/kg bis 3 mg/kg oder einer Salzlösungskontrolle 30 Minuten vor und oder folgend auf eine Blutung behandelt. Ein hämorrhagischer Schock wird durch Entzug von Blut über den venösen Katheter in eine Heparin-versetzte (10 ug/ml) Polypropylen-Spritze zum Erhalt eines mittleren BP von 45 Tott und eines mittleren CO von 30% Grundlinie für eine Stunde bewirkt. Die Tiere werden dann mit dem Gesamtvolumen des Schafbluts plus Lactatversetzter Ringer-Lösung, titriert, um einen normalen CO wieder herzustellen, wiederbelebt. Die Wiederbelebung wird 3 Stunden durchgeführt, zu welchem Zeitpunkt die Katheter während einer Anästhesie entfernt werden (5- 10 mg/kg Ketamin mit lokal 1% Lidocain).
Tiere, die unter Standardbedingungen in Käfigen gehalten werden, werden täglich im Hinblick auf Gewicht, Hct und arterielle Blutgase hin untersucht. 5 Tage nach einer Blutung werden die Tiere durch Dentobarbital- Überdosierung getötet und eine Nekropsie wird durchgeführt. Die Organe werden für Grobnachweise einer Verletzung überprüft und ein histologischer Nachweis einer Verletzung von Gewebssektionen, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin wird durchgeführt.
Tiermodelle für septischen und endotoxischen Schock werden von Thomas et al. 1992, J. Applied Physiol 73(4):1510-1516 beschrieben. Unter Verwendung dieser Modelle werden 3 pg/kg bis 3 mg/kg Dosierung SERP-1 den Tieren vor und/oder folgend auf eine Entotoxin-Infusion oder Appendektomie täglich für drei Tage über intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Verabreichung verabreicht. Die SERP-1-Wirksamkeit für die Verhinderung von Schock wird bei getöteten Tieren an den Tagen 1 bis 5 folgend auf die Endotoxin-Infusion oder Appendektomie überwacht.

Claims

1. Verwendung von SERP-1, einem SERP-1-Analog oder einem biologisch aktiven Fragment davon für die Herstellung eines Medikaments für die Reduktion oder Verhinderung einer Infiltration entzündlicher Zellen bei einem Säuger.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament durch intravenöse, intraaterielle, intraartikuläre, subkutane, intraperitoneale, intraspinale, intrarektale, intramuskuläre Infusion oder Aerosolinhalation zugeführt wird.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das SERP-1, SERP-1- Analog oder ein biologisch aktives Fragment davon eine andere Aminosäure als Cystein an Stellung 244 umfaßt.

4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das SERP-1, SERP-1-Analog oder biologisch aktive Fragment davon eine Aminosäure an Stellung 244 umfaßt, die nicht Cystein ist.

5. Verwendung von SERP-1, SERP-1-Analog oder einem biologisch aktiven Fragment davon für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines medizinischen Zustands, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus entzündlicher oder rheumatoider Arthritis, entzündlicher Verdauungsorganerkrankung, Autoimmunsyndromen, wie z. B. Lupus erythematosus, multipler Sklerose, Asthma, Transplantatabstoßung, Ischämie oder Reperfusions-Entzündungsverletzung bei einem Säuger.

6. Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das Medikament an der Entzündungsstelle, die durch diesen medizinischen Zustand ausgelöst wird, verabreicht wird.

7. Verwendung gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei das SERP-1 eine Aminosäuresequenz aufweist, umfassend SEQ ID NO: 1.

8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Säuger menschlich ist.

9. Verwendung von SERP-1, einem SERP-1-Analog oder einem biologisch aktiven Fragment davon für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines medizinischen Zustands, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Vaskulitis, entzündlicher Autoimmunmyositis, entzündlicher Autoimmunthyroiditis, Psoriasis, systemischem Schock, Glomerulonephritis, entzündlicher Tubuluserkrankung, Respirationsstörungssyndrom bei Erwachsenen, Koronararterienverstopfung, Herzarrhythmie, Herzinfarkt, Kardiomyopathie, Bronchitis, akuten allergischen Reaktionen und Hypersensibilität, Neurotrauma, Myocarditis, inusulinabhängiger Diabetes und Schlaganfall bei einem Säuger.