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Die Erfindung betrifft die Verhütung von allergischen
Reaktionen auf Milchprodukte.
Beschreibung des Stands der Technik
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Es ist bekannt, dass Allergien gegenüber Kuhmilch oder
gegenüber Kuhmilch enthaltenden Milchsorten, die an die Bedürfnisse
von Kleinkindern angepasst sind, dadurch entstehen, dass die
Proteine der Kuhmilch sich von den Proteinen der Muttermilch
unterscheiden und dass sie deshalb Allergene bilden können.
Von den Proteinen der Molke sind die wichtigsten bekannten
Allergene im Wesentlichen α-Lactalbulmin (αLA) und
β-Lactoglobulin (βLG) und in einem geringerem Maß die Immunglobuline,
insbesondere die IgG und Serumalbumin (SAB). In diesem
Zusammenhang haben Fritsché et al. nachgewiesen, dass die Fähigkeit
der Milchzusammensetzungen zur Allergieauslösung in
überwiegendem Maß mit dem Vorhandensein von βLG verbunden ist (Int.
Arch. Aller and Appl. Imm., 93, 289-293, 1990).
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Es wurden Versuche durchgeführt, um das
Allergisierungsvermögen der oben genannten Allergene auszuschalten, indem sie
durch Hydrolyse in Peptide umgewandelt werden.
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Im Patent US 4 293 571 stellt man beispielsweise ein
Proteinhydrolysat durch Pankreashydrolyse her, erhitzt das
Hydrolysat, um die nicht hydrolysierten Proteine zu koagulieren, und
unterzieht das Hydrolysat einer Ultrafiltration, um die
Restproteine und die koagulierten Makropeptide zu entfernen, die
Allergene bilden können.
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In EP 22 019 wird ferner vorgeschlagen, Molkeproteine direkt
in einer Ultrafiltrationsanlage zu hydrolysieren und die
Peptide zu sammeln, wenn sie sich bilden. Es erscheint jedoch,
dass es selbst unter diesen Bedingungen praktisch nicht
möglich ist, alle Molkeproteine vollständig zu hydrolysieren.
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US 5 039 532 beschreibt schließlich ein Verfahren, bei dem man
Molke einer partiellen enzymatischen Hydrolyse mit Hilfe von
proteolytischen Enzymen unterzieht. Das Hydrolysat wird
anschließend einer Wärmebehandlung unterzogen, um die kürzeren
Proteine zu denaturieren und sie auf diese Weise für einen
darauf folgenden enzymatischen Abbau zugänglich zu machen. Das
erwärmte Hydrolysat wird dann gekühlt und dann nacheinander
einer zweiten Hydrolyse und wieder einer thermischen
Behandlung unterzogen, um das Enzym zu inaktivieren.
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Es hat sich schnell gezeigt, dass die Hydrolyse der
Milchproteine bis zu einem gewissen Hydrolysegrad oder einer
Molekulargewichtsgrenze keine ausreichende Bedingung ist, um eine
hydrolysierte Milch für allergische Personen, insbesondere
Säuglinge, ausreichend hypoallergen zu machen. Es ist auch
noch erforderlich, dass die Proteine in einer bestimmten Weise
hydrolysiert werden, damit die allergische Reaktion stark
verringert wird. In diesem Zusammenhang legt die europäische
Richtlinie 96/4/EC fest, dass allergisierende Proteine in
einer hypoallergenen Milch immunologisch mindestens 100 mal
weniger erfassbar sein müssen als in einer nichthydrolysierten
Milch (Off. J. Europ. Comm., NoL49/12, Anhang Punkt 5.a,
1996).
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Eine Methode zur Erfassung des Allergisierungsvermögens von
Milch wurde von Fritsché et al. entwickelt (Int. Arch. Aller
and Appel. Imm., 93, 289-293, 1990). Diese Methode kann auch
im Rahmen der europäischen Richtlinie 96/4/EC angewandt
werden. Fritsché et al. haben aufgezeigt, dass das
Allergisierungsvermögen von Kuhmilchzusammensetzungen in vitro durch die
Fähigkeit der normalen Rattenmastozyten, die durch Antikuhmilchprotein-Antikörper
der Ratte passiv sensibilisiert
wurden, zur Auslösung der ³H-Serotonin-Freisetzung bestimmt werden
kann. Man hat dabei festgestellt, dass verschiedene
Zusammensetzungen von hydrolysierter Kuhmilch gegenüber einer
Standardmilchzusammensetzung stark reduzierte Fähigkeiten der
Aktivierung der Mastozyten aufweisen. Man stellt beispielsweise
fest, dass die handelsübliche Säuglingsmilch BEBA-HA®, die
eine hydrolysierte Molkezusammensetzung mit einem Hydrolysegrad
von 18% (weniger als 10000 Dalton) ist, wie in US 5 039 532
beschrieben wird, eine Fähigkeit der Mastozytenaktivierung
besitzt, die 1000 mal kleiner als die der Standardmilch ist. Es
zeigt sich übrigens, dass die Hypoallergenität dieser Milch um
so höher sein kann, je intensiver die Hydrolyse der Milch ist.
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Daneben ist die orale Verabreichung von intakten Proteinen als
wirksames Mittel erkannt worden, um in bestimmten Situationen
eine immunologische Toleranz gegenüber diesen Proteinen zu
induzieren. Es wurden nur wenige Untersuchungen der oralen
Toleranz bei Menschen durchgeführt. Als Beispiele sind zu nennen
die Artikel von Husby S. et al. (J. Immunol. 4667-70, 1994),
von Michael J. G. (Immunol. Invest. 18, 1049-45, 1989), von
Hachimura S. et al. (Biosc. Biotech. Biochem. 57, 1674-77,
1993), von Pesce A. J. et al. (Int. Arch. Allergy Appl.
Immunol., 88-93, 1990) und von Muckerheide A. et al. (J. Immunol.
199, 1340-45, 1977).
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Im Bereich der oralen Toleranz gegenüber Milch behauptet EP
629 350, hypoallergene Formulierungen zu beschreiben, die
tatsächlich eine Toleranz gegenüber Kuhmilchproteinen bei Kindern
induzieren würden, die eine Kuhmilchallergie haben können.
Über den Hydrolysegrad der Milchproteine, der eine Toleranz
induzieren kann, wird ausgeführt, dass er vorzugsweise im
Intervall von 20% bis 32% liegt. Dies sind jedoch nur
Behauptungen, die durch keine Versuche gestützt werden, die eine
tatsächliche Toleranzaktivität beweisen. Außerdem behauptet EP
269 350, dass die Induktion der oralen Toleranz um so höher
sei, je höher das hypoallergene Vermögen ist, das heißt, je
höher der Hydrolysegrad ist.
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JP 3-181681 beschreibt schließlich ein ähnliches Verfahren zur
Hydrolyse von Milch, wie es in US 4 293 571 beschrieben wird.
Die auf diese Weise erhaltenen Hydrolysate von weniger als
10000 Dalton sind außerdem in der Lage, bei Ratten eine orale
Toleranz zu induzieren. Obwohl diese Hydrolysate eine gewisse
Hypoallergenität besitzen, ist zu bemerken, dass sie nicht der
europäischen Richtlinie 96/4/EC entsprechen. Die immunitäre
Erfassung des hydrolysierten Proteins βLG durch Antikörper
gegen den N-Peptid-Terminus von βLG ist nämlich nur etwa 10 mal
kleiner als die des nativen Proteins βLG (siehe Fig. 2 und 3).
Im Unterschied zu EP 629 350 behauptet EP 3-181 681, je
nativer ein allergisches Protein sei, wobei es dennoch leicht
hydrolysiert ist, um etwas hypoallergen zu werden, umso mehr
könne dieses hydrolysierte Protein eine Toleranz gegenüber dem
nativen Protein induzieren. Diese Argumentation schließt an
die oben erwähnten Arbeiten von Husby S. et al. an, in denen
die orale Verabreichung von intakten Proteinen als ein
wirksames Mittel erkannt wurde, um eine immunologische Toleranz
gegenüber diesen Proteinen zu induzieren.
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Angesichts der Begrenzungen und der Unvollkommenheiten der
bisherigen Technik zur Herstellung von Milchhydrolysaten mit
einem stark reduzierten Allergisierungsvermögen, die bei einem
Patienten eine Toleranz gegenüber Kuhmilch induzieren können,
liegt es auf der Hand, dass noch ein Bedarf besteht, die
anallergisierenden Milchhydrolysate zu identifizieren, die für die
Induzierung einer Toleranz gegenüber Kuhmilch am geeignetsten
sind. Ziel der Erfindung ist es insbesondere, einen Mittelweg
zwischen den beiden in EP 629 350 und JP 3-181681 entwickelten
Vorgehensweisen zu finden.
Zusammenfassung der Erfindung
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Zu diesem Zweck betrifft die Erfindung die Verwendung von
Molke mit einem Grad der enzymatischen Hydrolyse von 15-19%
und einem Anteil an immunologisch nachweisbaren allergenen
Proteinen, der mindestens 100 mal kleiner als der von nicht
hydrolysierter Molke ist, für die Herstellung einer
Zusammensetzung, die dazu bestimmt ist, bei Säugern, die gegenüber
Kuhmilch allergisch sein können, eine orale Toleranz zu
induzieren.
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Entgegen der EP 629 350 und JP 3-181 681 und wider alles
Erwarten werden die besten Ergebnisse der Induzierung einer
Toleranz gegenüber Kuhmilch bei mittel hydrolysierten
hypoallergenen Milchsorten erhalten.
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Je mehr nämlich die Hydrolyse auf Grade über 20% getrieben
wird, um so weniger signifikant ist die Induktion einer oralen
Toleranz.
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Je weniger stark andererseits die Hydrolyse ist, das heißt
unterhalb eines Hydrolysegrads von 15%, um so weniger erhält
man eine gute Induktion einer Toleranz und eine
Hypoallergenität gemäß der Richtlinie 96/4/EC. JP 3-181681 zeigt nämlich,
dass nichthypoallergene hydrolysierte Molke eine solche
Toleranz induzieren kann, dass das Niveau von Anti-βLG-Antikörpern
nur 5 bis 10 mal kleiner als der Kontrollwert ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt, dass die gleiche dosisabhängige orale Toleranz
in Hinblick auf die IgE erhalten wird, wenn man verschiedene
Mengen einer nichthydrolysierten Zusammensetzung
(Standardzusammensetzung: NAN®) oder einer erfindungsgemäßen
hydrolysierten Zusammensetzung (präventive Zusammensetzung: BEBA-HA®)
einnimmt.
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Fig. 2 zeigt, dass die Standardzusammensetzung (NAN®) und die
präventive Zusammensetzung (BEBA-HA®) die wirksamste
unterdrückende Aktivität in spezieller Hinsicht auf das anti-βLG-
spezifische IgE haben.
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Fig. 3 zeigt, dass Kurven der dosisabhängigen Freisetzung mit
Mastozyten erhalten werden können, die mit Serum von Tieren
passiv sensibilisiert wurden, die mit der therapeutischen
Zusammensetzung oder mit Wasser gefüttert wurden, während die
Mastozyten, die mit Hilfe von Serum von Ratten, die mit NAN®
oder mit BEBA-HA® gefüttert wurden, passiv sensibilisiert
wurden, kein ³H-Serotonin freisetzen, wenn sie mit Hilfe von βLG
ausgelöst werden.
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Fig. 4 zeigt das tolerisierende Vermögen von
Alcalasehydrolysat HALAL-HA® gegenüber dem Trypsinhydrolysat BEBA-HA®.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Zum besseren Verständnis der Erfindung wird die folgende
Terminologie definiert:
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- Toleranz: Zustand der spezifischen immunologischen
Nichtantwort. Die beiden Wege, und zwar der humorale Weg
(Antikörper) und der zellvermittelte Weg (Lymphozyten, ...) der
Immunantwort können durch Einführung einer Toleranz
unterdrückt werden. Ein Ausfall der oralen Toleranz wird als
tieferliegende Ursache der Nahrungsmittelallergie betrachtet.
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- Allergen: Protein oder Makropeptid, das beim Menschen,
insbesondere bei empfindlichen Säuglingen und Neugeborenen,
allergische Reaktionen auslösen kann.
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- Hypoallergen: Zustand von hydrolysierter Milch, die der
europäischen Richtlinie 96/4/EC entspricht.
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Das Ausgangsmaterial zur Herstellung von erfindungsgemäßer
Molke kann von der Käseherstellung stammende Molke,
insbesondere Süßmolke, wie sie bei der Koagulierung von Kasein durch
Lab entsteht, Sauermolke, die von der Koagulation von Kasein
durch eine Säure oder ansäuernde Fermente kommt, oder auch
gemischte Molke sein, die sich durch die Koagulation durch eine
Säure und durch Lab ergibt.
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Diese Molke kann mit Hilfe von Trypsin hydrolysiert werden,
wie in dem Patent US 5 039 532 ausführlich beschrieben wird.
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Ein alternatives erfindungsgemäßes enzymatisches Hydrolysat
ist dasjenige, das durch Behandlung von Molkeproteinen mit dem
Enzym Alcalase erhalten wird. Alcalase (Subtilisin A) ist
bakteriellen Ursprungs (Bacillus licheniformis). Sie kann in
dem Verfahren von US 5 039 532 verwendet werden.
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Die bevorzugten Produkte haben einen Hydrolysegrad von etwa 16
-19% und einen Gesamtgehalt an Stickstoff (Nt) von etwa 3-
4%. Die Analyse durch SDS-PAGE-Elektrophorese muss
vorzugsweise das Fehlen von Proteinbanden bestätigen. Insbesondere
stellt man keine Bande fest, die dem SAB, den H- und L-Ketten
des IgG, dem αLA und dem βLG entspricht.
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Ein bevorzugtes Produkt enthält hydrolysiertes
Molkeproteinmaterial, aus dem Allergene, die aus einer Gruppe von Allergenen
ausgewählt sind, die aus α-Lactalbumin, β-Lactoglobulin,
Serumalbumin und den Immunglobulinen besteht, nicht beseitigt
wurden und bei dem das hydrolysierte Proteinmaterial,
einschließlich der hydrolysierten Allergene, in Form von
Hydrolyserückständen mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als etwa
10000 Dalton vorliegt, so dass das hydrolysierte Material im
Wesentlichen frei von allergenen Proteinen und von von
Proteinen stammenden Allergenen ist.
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Durch die Analyse von hypoallergenen Molken, die nach dem
Verfahren von US 5 039 532 hergestellt werden können und
verschiedene Hydrolysegrade besitzen, konnte nachgewiesen werden,
dass die besten Toleranzaktivitäten bei Molken erhalten
werden, die einen Hydrolysegrad von 15-19% besitzen, wobei der
Hydrolysegrad aus dem Verhältnis der Anzahl von freien NH&sub2;-
Gruppen zu der Gesamtanzahl von NH- und NH&sub2;-Gruppen,
multipliziert mit 100, errechnet wird (vgl. EP 629 350, S. 4, 1.1-5).
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Die Hypoallergenität von erfindungsgemäßer Molke kann in
Abhängigkeit von dem Anteil an immunologisch nachweisbaren
allergenen Proteinen bestimmt werden, der mindestens 100 mal
kleiner als der von nicht hydrolysierter Molke sein muss.
Dieser Nachweis kann einfach mit Hilfe eines Elisa-Tests mit
Antikörpern gegen allergisierende Kuhmilchproteine, wie
beispielsweise das native Protein βLG, durchgeführt werden.
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Die Hypoallergenität von erfindungsgemäßer Molke kann
insbesondere in Abhängigkeit von dem Vermögen der erfindungsgemäßen
Molke bestimmt werden, eine ³H-Serotonen-Freisetzung aus
Mastozyten, die durch ein Antikuhmilchprotein-Antiserum passiv
sensibilisiert wurden, in einem Ausmaß zu bewirken, das
mindestens 200 mal geringer als das bei denselben Mastozyten durch
eine nicht hydrolysierte Milch erhaltene Ausmaß ist. Die
besten erfindungsgemäßen hypoallergenen Molken werden erhalten,
wenn dieses Ausmaß beispielsweise 500 mal kleiner ist. Der
Fachmann verfügt über die von Fritsché et al. entwickelte
Technik zur Bestimmung dieser verschiedenen
Serotoninfreisetzungsgrade.
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Wider alles Erwarten besitzen die erfindungsgemäßen
hypoallergenen Molken mit den besten Fähigkeiten der Induktion einer
Toleranz gegenüber Kuhmilch einen Hydrolysegrad von
beispielsweise 16 bis 19%. Diese Einführung einer oralen Toleranz
gegenüber Kuhmilch hat vorzugsweise ein solches Ausmaß, dass das
Niveau von IgE gegen allergisierende Kuhproteine, das als
Reaktion auf eine Verabreichung von allergisierenden
Kuhproteinen erzeugt wird, mindestens beispielsweise 100-fach oder
sogar 500-fach reduziert ist.
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Das erfindungsgemäße Hydrolysat kann beispielsweise durch
Sprühtrocknung oder durch Lyophilisierung getrocknet werden.
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Es wird in zahlreiche Nahrungsmittelzubereitungen zu
diätetischen Zwecken eingearbeitet, insbesondere in Nahrungsmittel
für Sädglinge oder in leicht resorbierbare Nahrungsmittel zur
Verwendung für an Allergien leidenden Personen. Die im Handel
befindliche Pulverzusammensetzung BEBA-HA® (Société des
Produits Nestlé, Schweiz), ist beispielsweise ein erfindungsgemäßes
Produkt, das eine orale Toleranz induzieren kann.
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Die Zusammensetzung wird auf dieselbe Weise wie die
klassischen anallergisierenden Milchformulierungen verabreicht. Für
eine maximale Induktion der Toleranz muss die enzymatisch
hydrolysierte Molke jedoch verabreicht werden, bevor ein
allergener Angriff eine spezifische immunologische
Sensibilisierung gegenüber Kuhmilchproteinen induziert.
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Die Erfindung wird in der nachstehenden Beschreibung
ausführlicher beschrieben, die sich auf Beispiele des Nachweises
einer Induktion einer oralen Toleranz durch erfindungsgemäße
Molken bezieht. Die Prozentsätze beziehen sich, sofern nicht
anders angegeben, auf das Gewicht. Diese Beispiele dienen
natürlich nur der Veranschaulichung des Gegenstands der
Erfindung und begrenzen diese in keiner Weise.
Beispiel 1
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Die erfindungsgemäßen hypoallergenen Kuhmilchzusammensetzungen
können das Auftreten von Antikörpern mit einer Reaktivität
gegen Kuhmilchproteine verhüten, wenn sie vor und während der
allergenen Sensibilisierung oral verabreicht werden. Diese
Induktion einer oralen Toleranz ist bei Ratten im Fall von
präventiven hypoallergenen Zusammensetzungen nachgewiesen worden,
jedoch nicht im Fall von den therapeutischen hypoallergenen
Zusammensetzungen, die einen hohen Hydrolysegrad besitzen.
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Zur Überprüfung der Induktion der Toleranz werden Sprague-
Dawley-Ratten (5 bis 6 Wochen alt), die mit "milchfreier" Kost
aufgezogen wurden, mit fester körniger "milchfreier" Nahrung
und nach Belieben mit verschiedenen experimentellen flüssigen
Milchzusammensetzungen in Flaschen an den Tagen 1 bis 19
gefüttert. Man immunisiert alle Tiere (subkutan) mit Hilfe von
βLG + OVA + Al(OH)&sub3; am Tag 5 und blutet sie am Tag 19 aus. Man
bestimmt mit Hilfe von ELISA den Titer der spezifischen
Ratten-IgE und -IgG anti-βLG und anti-OVA.
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Man bestimmt auch die Mastozytenaktivierung mit Hilfe von
peritonealen Mastozyten von normalen Ratten, die durch Gruppen
von Seren von Ratten passiv sensibilisiert wurden, die mit
verschiedenen Milchzusammensetzungen gefüttert wurden. Die
sensibilisierten und gewaschenen Zellen werden mit ³H-Serotonin
markiert und zur Freisetzung des Mediators gemäß dem Protokoll
von Fritsché et al. (Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 93,
289-93, 1990) stimuliert, indem verschiedene Mengen an
Auslösemitteln (βLG) zugesetzt werden.
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a) Spezifische Unterdrückung von Antikörpern durch Einnahme
von Milchzusammensetzungen: Fig. 1 zeigt, dass man dieselbe
dosisabhängige orale Toleranz hinsichtlich der IgE erhält,
wenn man verschiedene Mengen von nicht hydrolysierter
Standardmolke NAN® (Société des Produits Nestlé, Schweiz) oder
präventiver Molke BEBA-HA® gibt. Man kann sehen, dass die
orale Verabreichung der beiden Milchpräparate mit 120 g/Liter die
stärkste Unterdrückung von Antikörpern induziert (Reduzierung
um mehr als das 200-fache des Gehalts an
Anti-βLG-IgE-Antikörpern), wenn man mit den Kontrolltieren vergleicht (mit Wasser
gefütterte Tiere). Außerdem werden die Antikörper eines nicht
in Betracht stehenden Antigens (OVA) durch Einnahme von
Milchzusammensetzungen nicht unterdrückt, was zeigt, dass diese
Induktion einer oralen Toleranz für das Allergen spezifisch ist.
Die durch die Molke BEBA-HA® induzierte orale Toleranz ist
also für die Milchallergene spezifisch. Diese Toleranz ist
vergleichbar mit der, die man mit nativer Molke erhält, jedoch
ohne die Nachteile der Auslösung einer Allergie.
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b) Vergleich der Induktion einer Toleranz mit verschiedenen
Zusammensetzungen: Man vergleicht verschiedene Eigenschaften
von Kuhmilchzusammensetzungen hinsichtlich der Induktion einer
oralen Toleranz, und zwar von handelsüblicher nicht
hydrolysierter Molke NAN®; von hypoallergener präventiver Molke mit
18% Hydrolyse BEBA-HA®; von hypoallergener präventiver Molke
HALAL-HA® (Société des Produits Nestlé, Schweiz) mit etwa 21%
Hydrolyse, hergestellt nach dem in US 5 039 532 beschriebenen
Protokoll mit Alcalase; und von therapeutischer hypoallergener
Molke ALFARE® mit 28% Hydrolyse. Alle diese Milcharten sind
hypoallergen, das heißt entsprechen der europäischen
Richtlinie 96/4/EC. Sie erfüllen auch die nach dem Protokoll von
Fritsché et al. definierte Bedingung der Hypoallergenität
(mindestens 200 mal weniger Serotoninfreisetzung gegenüber
einem Kontrollwert).
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Fig. 2 zeigt, dass die Standardzusammensetzung NAN® und die
präventive Zusammensetzung BEBA-HA® die wirksamste
unterdrückende Aktivität gegenüber dem spezifischen Niveau von Anti-βLG-
IgE haben, und zwar induzieren sie eine Verringerung der IgE-
Reaktion um einen Faktor 100.
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Dagegen hat die therapeutische Zusammensetzung ALFARE®
(Societe des Produits Nestlé, Schweiz), die eine hypoallergene Molke
mit einem Hydrolysegrad von 28% ist, praktisch keine
tolerogene Aktivität, wenn man sie mit Kontrolltieren vergleicht
(Ernährung mit Wasser).
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Die Wirkung der verabreichten Zusammensetzungen auf die
Reaktion des Anti-βLG-IG ist schwächer, aber man stellt dasselbe
Vergleichsschema fest, wie es bei der Modulation von IgE
beobachtet wird.
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Die Gehalte an Vergleichsantikörpern Anti-OVA-IgE und -IgG
bleiben unverändert.
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Wie Fig. 4 zeigt, unterdrücken Ratten, die zuvor mit dem
Alcalasehydrolysat HALAL-HA® gefüttert wurden, die spezifische
Anti-βLG-IgE- und -IgG-Reaktion, während die Reaktion auf ein
nicht in Betracht stehendes Antigen (OVA) nicht verändert
wird. Verglichen mit BEBA-HA® ist die Unterdrückung von Anti-
βLG schwächer, wenn die Ratten mit HALA-HA® tolerant gemacht
wurden (Verringerung des IgE um etwa das 25-fache). Dies kann
mit der Tatsache verbunden sein, dass man in den
Alkalasehydrolysaten gegenüber den Trypsinhydrolysaten kleinere
Peptide erhält oder dass mehrere tolerogene Peptide fehlen.
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c) Unterdrückung der in-vitro-Sekretion der Mastozyten: Man
markiert Mastozyten von normalen Ratten mit ³H-Serotonin und
sensibilisiert sie passiv mit Hilfe von Seren von Ratten, die
durch eine Ernährung mit Milchzusammensetzungen tolerant
gemacht würden. Die Auslösung der Mediatorfreisetzung wird mit
βLG vorgenommen. Fig. 3 zeigt, dass dosisabhängige
Freisetzungskurven bei Mastozyten erhalten werden können, die mit
Seren von Tieren passiv sensibilisiert wurden, die mit
therapeutischer Zusammensetzung oder mit Wasser gefüttert wurden,
während die Mastozyten, die mit Seren von Ratten passiv
sensibilisiert wurden, die mit der Standardzusammensetzung oder der
präventiven Zusammensetzung BEBA-HA® gefüttert wurden, kein
³H-Serotonin freisetzen, wenn sie durch βLG aktiviert werden.
Beispiel 2
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Man füttert Dunkin-Hartley-Meerschweinchen vom Tag 1 bis zum
Tag 35 Mit BEBA-HA® oder Wasser. Man behandelt dann alle Tiere
oral (Tage 36 bis 49) mit NAN®. Die Ergebnisse zeigen, dass
die zuvor mit BEBA-HA® gefütterten Meerschweinchen, verglichen
mit den zuvor mit Wasser gefütterten Tieren, die Titer an auf
Molkeproteine reagierenden Antikörpern unterdrückt haben.
Beispiel 3
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Man führt dieselben Tests wie in Beispiel 1 durch, wobei man
jedoch die Antikasein-Antikörper nachweist. Die Ergebnisse
sind ähnlich und führen zu dem Schluss, dass bei den durch BE-
BA-HA® tolerisierten Ratten zusätzlich zur Unterdrückung der
Reaktion auf βLG auch die Reaktion auf Kasein unterdrückt
wurde.
Beispiel 4
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Man stellt gemäß dem in US 5 039 532 beschriebenen Protokoll
Molken her, die einen enzymatischen Hydrolysegrad von etwa
11%, 13%, 15%, 23% oder 25% aufweisen. An diesen Molken
wurden ähnliche Versuche wie in Beispiel 1 durchgeführt.
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Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass das Ausmaß der Induktion
einer oralen Toleranz gegenüber βLG um so mehr abnimmt, je mehr
man die Hydrolyse über einen Grad von 20% hinaus steigert.
Diese Ergebnisse entsprechen den in Beispiel 1 erhaltenen
Ergebnissen, in dem man eine weniger gute Toleranz mit Molke HA-
LAL-HA® und so gut wie keine Reaktion mit der Molke ALFARE®
erhält, verglichen mit der mit BEBA-HA® erhaltenen Reaktion.
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Ferner zeigen die Ergebnisse, dass es unter einem
Hydrolysegrad von 15% nicht wirklich möglich ist, eine
Hypoallergenität gemäß der europäischen Richtlinie 96/4/EC zu erreichen.
Das Ausmaß der Induktion der Toleranz durch Molken mit einem
Hydrolysegrad von 11% bis 13% ist vergleichbar mit dem in
JP3-181681 bei einer nicht hypoallergenen hydrolysierten Molke
beschriebenen Wert.
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Zu allen vorhergehenden Beispielen lässt sich zusammenfassend
sagen:
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(1) Die orale Verabreichung von hypoallergenen Molken mit
einem Hydrolysegrad von 15-20% vor dem allergenen Angriff
induziert eine spezifische immunologische Toleranz gegenüber
Kuhmilchproteinen.
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(2) Die Reaktionen der Antikörper (IgE, IgG) sowie die der
Mastozyten (peritoneal, intestinal) werden unterdrückt.
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(3) Die orale tolerogene Aktivität dieser Zusammensetzungen
ist mit den tryptischen Peptiden verbunden (1-10 kd).
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(4) Eine stark hydrolysierte Zusammensetzung (ALFARE®)
induziert keine orale Toleranz.
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Die letzte Schlussfolgerung zeigt ziemlich unerwartet, dass
das höchste nicht allergisierende Vermögen sich nicht in einer
maximalen Fähigkeit, eine Toleranz gegenüber Milch zu
induzieren, äußert.