DE69618248T2

DE69618248T2 - Ersatzmaterial für modifizierte stärke in der papierherstellung

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Publication number: DE69618248T2
Application number: DE69618248T
Authority: DE
Inventors: E. Nichols
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1996-06-12
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2016-06-13
Also published as: JP2000512349A; EP0904453B1; WO1997047808A1; ATE211198T1; EP0904453A1; DE69618248D1; CA2257623A1; CA2257623C; AU6276896A; AU731253B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Papierherstellung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es gibt drei Hauptphasen bei der Papierherstellung, in denen Stärke als Ingrediens verwendet wird. Die erste ist die "Nasspartie", bei der Cellulosefasern mit Stärke in einer Aufschlämmung vermischt werden und die Aufschlämmung durch eine enge Öffnung auf ein Drahtband gedrückt wird. Das Wasser wird schnell entfernt, sowie die Formungsbahn über die Länge des Bandes bewegt wird. Nach einem Abstand von typischerweise fünf bis fünfzehn Meter auf dem Band wurde aus der Bahn genügend Wasser entfernt, so dass sie ihr eigenes Gewicht tragen kann. Die Papierbahn geht durch eine Reihe von Folien und Walzen, wobei noch mehr Wasser entfernt wird. Sie wird auf einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 11% getrocknet.
Die zweite Phase in der Papierherstellung, bei der Stärke involviert ist, ist der "Beleimungsschritt". Hier geht das Papier durch eine Leimpresse, in der eine Stärkeaufschlämmung auf die Bahn aufgebracht wird. Die Bahn geht erneut durch eine Reihe von Folien und Walzen. Sie wird an Walzen getrocknet und kann als fertiges Produkt aus der Presse entnommen werden. Der dritte Schritt beinhaltet die Beschichtung des Papiers mit einem Gemisch aus Stärke und einem thermoplastischen Molekül. Bei bestimmen Anlagen erfolgt dies nach der Beleimungsstufe. Die freiwerdende Walze kann auch entfernt werden und an einer anderen Presse zur Beschichtung installiert werden. Eine typische Beschichtungsvorrichtung hat zwei Messer, die über die Breite des Papiers laufen. Die Messer tragen das Beschichtungsmaterial auf zwei Walzentrommeln auf. Das Papier geht zwischen den Trommeln durch, und das Beschichtungsmaterial, das Stärke und das thermoplastische Mittel umfasst, kommt aus den Trommeln auf das Papier. Nach Verlassen der Trommeln geht das Papier durch eine Reihe von Trocknem. Wenn das Papier trocken ist, geht es zu einem "weichen Kalander", der zwei Trommeln umfasst, wovon eine aus einem Gewebe hoher Dichte hergestellt ist, und die andere eine erwärmte Stahltrommel ist. Das Papier geht zwischen den zwei Trommeln hindurch, und die erwärmte Stahltrommel ist ausreichend heiss, um thermoplastische Komponenten der Beschichtungsmischung zu schmelzen, wodurch auf dem Papier eine harte Glanzappretur bereitgestellt wird.
Die Cellulose-Holzstoff-Fasern, die typischerweise in dem oben beschriebenen Verfahren verwendet werden, sind anionischer Natur. Der Zusatz einer kationischen Stärke zu der "Nasspartie"-Aufschlämmung wirkt durch Vernetzung der Holzstofffasern durch Salzbindungen als Klebemittel. Auf diese Weise wird ein vernetztes polymeres Netzwerk hergestellt, das die Stärke- und Cellulosefasern umfasst. Typischerweise sind die kationischen Stärken, die in der "Nasspartie" verwendet werden, tertiäre oder quarternäre Amine. Diese Aminogruppen werden der Stärke durch Nassmahlmaschinen hinzugefügt.
Oberflächenbeleimungsstärken werden verwendet, um der Bahn nach Verlassen der "Nasspartie" sowohl Stärke wie auch ein glattes Finish zu verleihen. Solche Stärken präparieren die Papierbahn auch zur Aufnahme der verschiedenen Beschichtungen. Bei Papier billigerer Qualität und bei der Herstellung von Pappe wird als Beleimungsstärke einfach nichtmodifizierte Maisstärke eingesetzt. Für Papier höherer Qualitäten werden chemisch modifizierte Stärken verwendet. Dies ist für die Aufbringung einer glatten, einheitlichen, hochqualitativen Oberfläche auf das Papier wichtig.
Bei Stärken besteht die Tendenz, zu retrogradieren, d. h. hochgeordnete Strukturen (sowohl Helices wie auch Kristallite) in einer sonst gelatineartigen Stärkeaufschlämmung wieder herzustellen. Eine Abscheidung von retrogradierter Stärke auf hochqualitativem Papier verursacht regionale Ungleichmäßigkeiten auf dem Papier und ist nicht akzeptabel. Darüber hinaus kann retrogradierte Stärke in der Leimpresse ein Abstellen der Anlage zur Reinigung der Apparatur erfordern.
Die für Beleimungsanwendungen am häufigsten verwendete Stärke ist eine Stärke, die ein kovalent gebundenes neutrales Addukt hat, z. B. Hydroxyethylstärke. Diese wird durch Reaktion von Ethylenoxid mit Stärke, nachdem diese aus Nassmahlanlagen isoliert wurde, hergestellt. Die Funktion des Hydroxyethyl (oder ähnlichen)-Addukts ist von seiner chemischen Natur unabhängig; es dient eher zur Bereitstellung einer sterischen Hinderung, zur Hemmung der Bildung hochgeordneter Strukturen. Diese sterische Hinderung ist zur Verringerung der Retrogradation kritisch. Die periodischen vorstehenden Stellen, die durch das Addukt erzeugt werden, stören die Bildung höhergeordneter Strukturen, die zur Retrogration führt.
Geschwindigkeit ist bei der Papierherstellung von herausragender Bedeutung. Die Stärkekonsistenz ist bei der Geschwindigkeit einer Presse limitierend. Pressen laufen oft unter ihrer Vollleistungsgeschwindigkeit. In Abhängigkeit von der Anwendung haben Stärkeaufschlämmungen 3 bis 15% (üblicherweise 5 bis 6%) Feststoffe. Eine Erhöhung des Feststoffgehaltes würde notwendigerweise zu einer Abnahme der Wassermenge, die aus der Papierbahn, die hergestellt wird, zu entfernen ist, führen. Dies würde es erlauben, dass die Presse mit höheren Geschwindigkeiten arbeitet.
Hydroxyethylierte Stärke bildet auch höhergeordnete Strukturen, wenn die Temperatur abnimmt oder die Konzentration ansteigt. Die Bildung höhergeordneter Strukturen an der Papieroberfläche ist notwendig. Nach Auftragen auf die Papierbahn stellt sich die Stärke einige dieser höhergeordneten Strukturen wieder her und bildet eine gleichmäßige Oberfläche, die strukturelle Festigkeit verleiht und die Aufnahme von Tinten- und Farbstoffen erleichtert. Allerdings sollten sich die höhergeordneten Strukturen nicht in der Aufschlämmung oder in der Auftragungsvorrichtung bilden, da dies ein Abschalten der Produktionsanlage zur Entfernung retrogradierter Stärke erfordert.
Die Funktion der Hydroxyethylgruppe besteht darin, die Temperatur zu senken und/oder die Stärkekonzentration zu erhöhen, bei der eine Retrogradation auftritt. Da die Verfahrensanlagen bereits für eine besondere Temperatur der Stärkeaufschlämmung optimiert wurden, würde eine Verringerung der Tendenz, zu retrogradieren, einen höheren Kohlenhydratgehalt in der Aufschlämmung zulassen.
Das Gemisch, das im Beschichtungsverfahren auf die Papierbahn aufgetragen wird, enthält hydroxyethylierte Stärke und thermoplastische Moleküle. Die am häufigsten verwendeten thermoplastischen Moleküle sind Latices, z. B. Styrolbutadien. Die Funktion der Hydroxyethylstärke ist wie oben angegeben. Die Funktion des thermoplastischen Moleküls besteht darin, auf dem Papier eine Hochglanzappretur zu bilden. Dies bewirkt eine erhöhte Fähigkeit, Tinten und Farbstoffe aufzunehmen, und verbessert im Allgemeinen auf dem bedruckten Papier die Auflösung.
Die Verwendung von β-Glucanen in der Papierherstellung wird in JP-A-6 287 887 und JP-A-6 313 297 beschrieben.
Basierend auf den vorstehenden Ausführungen besteht in der Papierherstellung ein Bedarf an Ersatzstoffen für modifizierte Stärke, die funktionell modifizierter Stärke entsprechen. Es besteht weiter ein Bedarf an der Bereitstellung von Ersatzstoffen für modifizierte Stärke, die für eine Retrogradation weniger anfällig sind. Ferner besteht ein Bedarf an der Bereitstellung von Verfahren zur Papierherstellung, die schneller sind als die gängigen Verfahren und die es ermöglichen, dass Pressen mit einer Geschwindigkeit laufen, die näher an ihrer vollen Leistungskapazität liegt. Darüber hinaus besteht ein Bedarf an der Bereitstellung von Verfahren zur Papierherstellung, die umweltfreundlich sind und die keine Eingabematerialien umfassen, die eine chemische Behandlung erfordern.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung von Verfahren zur Papierherstellung, die Ersatzstoffe für modifizierte Stärke verwenden, die für eine Retrogradation weniger anfällig sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Papierherstellung, die schneller und effizienter als existierende Verfahren sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Papierherstellung, die Ersatzstoffe für Stärke verwenden, die keine teure chemische Modifikation erfordern, wie dies Stärke tut.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Papierherstellung, die umweltfreundlicher sind als existierende Verfahren.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Papierherstellung, die Ersatzstoffe für thermoplastische Moleküle verwenden, welche derzeit im Beschichtungsschritt während der Papierherstellung eingesetzt werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung, wie sie in den Ansprüchen beschrieben wird, betrifft Glucane, die als Ersatzstoffe für modifizierte Stärke und/oder Latices in der Papierherstellung eingesetzt werden können. Die erfindungsgemäß verwendeten Glucane werden durch Glucosyltransferase D ("GTF D")-Enzyme der Spezies Streptococcus mutans produziert und entsprechen funktionell der modifizierten Stärke, die derzeit in der Papierherstellung eingesetzt wird. Die erfindungsgemäß verwendeten Glucane weisen auch ähnliche physikalische Eigenschaften wie die thermoplastischen Moleküle auf, wie sie derzeit im Beschichtungsschritt während der Papierherstellung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Papierherstellung bereit, die existierende Glucane verwendet, welche Eingabematerialien darstellen, die biologisch produziert werden. Auf diese Weise sind die erfindungsgemäßen Verfahren kosteneffektiver und umweltfreundlicher als gängige Verfahren, die Eingabematerialien erfordern, die chemische Ausflüsse produzieren.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Papierherstellung, das Zusetzen von Glucan in einem Schritt oder mehreren Schritten dieses Verfahrens umfasst, wie auch ein Verfahren, um Papier während des Herstellungsverfahrens Glanz zu verleihen, das Zusetzen eines Glucans zu einem Beschichtungsschritt umfasst, bereitgestellt, wobei Glucan durch Synthese mit einem Glucosyltransferase-D-Enzym erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines Glucans in der Papierherstellung bereit, wobei das Glucan durch die Wirkung eines Glucosyltransferase-D-Enzyms auf ein Substrat erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Papier, das durch die Verfahren und Verwendungen der Erfindung erhältlich ist, bereit.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der Ausdruck "Glucan", wie er hier verwendet wird, meint ein Glucosepolymer mit Bindungen, die (1→3), (1→6) und Verzweigungen (1→3,6) sind.
Der Ausdruck "Amyloplast", wie er hier verwendet wird, meint eine stärkeakkumulierende Organelle im Pflanzenspeichergewebe.
Der Ausdruck "Vakuole", wie er hier verwendet wird, bezeichnet das celluläre Kompartiment, das durch die Vakuolenmembran gebunden ist.
Streptococcus mutans ist eine Spezies, die in der Mundhöhle endogen ist und die den Zahnschmelz besiedelt. Siehe z. B. Kuramitsu, "Characterization of Extracellular Glucosyl Transferase Activity of Streptococcus mutans", Infect. Immun., Bd. 12(4); S. 738-749 (1975); und Yamashita et al., "Role of the Streptococcus-Mutans-gtf Genes in Caries Induction in the Specific-Pathogen-Free Rat Model", Infect. Immun., Bd. 61(9), S. 3811-3817 (1993).
Die SpeziesStreptococcus mutans sekretiert Glucosyltransferase-D ("GTF D")-Enzyme, die Nahrungssaccharose zur Herstellung einer Vielzahl extrazellulärer Dextrane verwenden. Siehe z. B. Kametaka et al., "Purification and Characterization of Glucosyltransferase from Streptococcus mutans OMZ176 with Chromatofocusing", Microbios, Bd. 51(206), S. 29-36 (1978); und Honda et al., "Nucleotide Sequence of the Streptococcus mutans gtfD Gene Encoding the Glucosyltransferase-S Enzyme", J. Gen. Microbial., Bd. 136, S. 2099-2105 (1990).
Sowohl lösliche wie auch unlösliche Glucane werden synthetisiert, und die verantwortlichen Proteine wurden isoliert und charakterisiert. Siehe z. B. Aoki et al., "Cloning of a Streptococcus mutans Glucosyltransferase Gene Coding for Insoluble Glucan Synthesis", Infect. Immun., Bd. 53(3), S. 587-594 (1986); Shimamura et al., "Identification of Amino Acid Residues in Streytococcus mutans Glucosyltransferases Influencing the Structure of The Glucan Produced", J. Bacteriol., Bd. 176(16), S. 4845-4850 (1994); und Kametaka et al., "Purification and Characterization of Glucosyltransferase from Streptococcus mutans OMZ176 with Chromatofocusing", Microbios, Bd. 51(206), S. 29-36 (1987).
Die involvierten Proteine sind groß (~155 kDa) und katalysieren den Gruppentransfer des Glucosylteils von Saccharose zu einem Akzeptorglucan über (1→3)- und (1→6)- Bindungen. Siehe z. B. Wenham et al., "Regulation of Glucosyl Transferase and Fructosyl Transferale Synthesis by Continuous Cultures of Streptococcus-mutans", J. Gen. Microbiol., Bd. 114 (Teil 1), S. 117-124 (1979); ; Fu et al., "Maltodextrin Acceptor Reactions of Streptococcus mutans 6715 glucosyltransferases", Carbohydr. Res., Bd. 217, S. 210-211 (1991); und Bhattacharjee et al., "Formation of Alpha - (1→6), Alpha - (1→3) und Alpha - (1→2) Glycosidic Linkages by Dextransucrase from Streptococcus Sanguis in Acceptor-Dependent Reactions", Carbohydr. Res., Bd. 242, S. 191-201 (1993).
Die Gene, die bei der Glucansynthese involviert sind, wurden isoliert und sequenziert. Siehe Shimamura et al., oben zitiert; Russel et al., "Expresion of a Gene for Glucan-binding Protein from Streptococcus mutans in Escherichia-coli", J. Gen. Microbiol., Bd. 131(2), S. 295- 300 (1985); Russell et al., "Characterization of Glucosyltransferase Expressed from a Streptococcus-Sobrinus Gene Cloned in Escherichia-coli", J. Gen. Microbiol., Bd. 133(4), S. 935-944 (1987); und Shimamura et al., "Identification of Amino Acid Residues in Streptococcus mutans Glucosyltransferases Influencing the Structure of the Glucan Product", J. of Bacteriol., Bd. 176(16), S 4845-4850 (1994); und Shiroza et al., "Sequence Analysis of the GTF D Gene from Streytococcus mutans", J. Bacteriol., Bd. 169(9), S. 4263-4270 (1987).
Die Strukturen der verschiedenen Glucane, die durch GTF D-Enzyme produziert werden, sind bezüglich der Anteile der (1→3)-, (1→6)- und (1→3,6)-Verzweigungen, die in einem gegebenen Glucan vorhanden sind, ziemlich heterogen. Eine Transformation von Genen, die für natürlicherweise auftretende GTF-D-Proteine und Mutanten-GTF-D-Proteine codieren, in Pflanzen, wie z. B. Mais, liefert Amyloplasten und Vakuolen mit neuen Zusammensetzungen.
Die Aktivität des GTF-D-Enzyms, das in den Amyloplast und/oder die Vakuole eingebaut ist, führt zur Akkumulation von Stärke und Glucan in demselben Amyloplast und/oder derselben Vakuole. Eine Retrogradation tritt auf, wenn Teile von Stärkemolekülen wechselwirken und anschließend Interketten- oder Intraketten-Helices bilden. In einem Gemisch aus Stärke und Glucanen ist die Häufigkeit von Stärke-Stärke-Wechselwirkungen, die zu einer Helixbildung führt, verringert. Als Resultat ist eine Paste, die aus den gemischten Polymeren hergestellt ist, für eine Retrogradation weniger anfällig. Dies ist insbesondere bei Stärkeakkumulationsmutanten der Fall, die als Transformationsziele ins Auge gefasst wurden, bei denen der relative Stärkeanteil verringert ist.
Glucane, die in Maisamyloplasten und/oder -vakuolen durch die transgenen GTF D- Enzyme produziert werden, können bei der Papierherstellung ohne chemische Modifikation, wie sie für Stärke notwendig ist, wirken. Die Polymerlösung hat folglich veränderte rheologische Eigenschaften und ist für eine Retrogradation, die durch Stärke erfolgt, weniger anfällig. Die Glucane sind verzweigt und unregelmäßig und geeignet, modifizierte Stärke mit vergleichbarer oder überlegener Wirksamkeit zu ersetzen. Sie erfordern keine teure chemische Modifikation, wie dies Stärke tut. Für Beschichtungsanwendungen weisen die erfindungsgemäßen Glucane zusätzlich zu den obigen Vorzügen thermoplastische Eigenschaften auf.
Die Wildtyp-GTF- und Mutanten davon, die bei der Herstellung erfindungsgemäßer Glucane verwendbar sind, werden nachfolgend aufgeführt. Dabei wird der folgende Code verwendet:

Aminosäure Ein-Buchstaben-Code

Alanin A
Asparagin N
Asparaginsäure D
Gultamin Q
Glutaminsäure E
Isoleucin I
Lysin K
Threonin T
Tyrosin Y
Valin V
Die Nomenklatur, die zur Identifizierung der Mutanten-GTF-D-Enzyme verwendet wird, welche zur Herstellung der vorliegenden Glucane verwendet werden, ist wie folgt: Die Zahl bezieht sich auf die Aminosäureposition in der Polypeptidkette; der erste Buchstabe bezieht sich auf die Aminosäure im Wildtyp-Enzym; der zweite Buchstabe bezieht sich auf die Aminosäure im mutierten Enzym; und bei Enzymen mit mehreren Mutationen ist jede Mutation durch / getrennt.
Die Mutanten-GTF-D-Enzyme, die zur Herstellung von Glucanen für die Papierbeschichtung vewendet werden, werden vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus dem Wildtyp des Enzyms; T589D; T589E; N471D, N471D/T589D und N471D/T589E; bevorzugter aus der Gruppe, bestehend aus dem Wildtyp; N471D; N471D/T589D und N471D/T589E; noch bevorzugter aus der Gruppe, bestehend aus dem Wildtyp und N471D, ausgewählt. Der Wildtyp des Enzyms wird am stärksten bevorzugt.
Die Mutanten-GTF-D-Enzyme, die zur Herstellung von Glucanen zur Papierleimung verwendet werden, werden vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus dem Wildtyp des Enzyms, T589D, T589E, N471D, N471D/T589D und N471D/T589E, bevorzugter aus der Gruppe, bestehend aus N471D, N471D/T589D, N471D/T589E, ausgewählt; am günstigsten ist N471D.
Die Glucane der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in transgenem Mais, Kartoffeln, Maniok, Süßkartoffeln, Roggen, Gerste, Weizen, Sorghum, Hafer, Hirse, Triticale, Zuckerrohr oder Reis produziert. Bevorzugter werden die vorliegenden Glucane in Mais, Kartoffeln, Maniok oder Süßkartoffeln produziert. Noch bevorzugter werden die vorliegenden Glucane in Mais oder Kartoffeln produziert. Am vorteilhaftesten werden die vorliegenden Glucane in Mais produziert.
In einer äußerst bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Maislinien, die eine unzureichende Stärke-Biosynthese haben, mit Mutanten-GTF-D-Genen transformiert. Solche Linien können natürlich auftretende Maismutanten (d. h. sh&sub2;, bt&sub2;, bt&sub1;) oder transgener Mais, der so verändert wurde, dass er im Vergleich zum Mais des Wildtyps geringe Stärkemengen im Endosperm akkumuliert, sein. Siehe z. B. Müller-Röber et al., "Inhibition of the ADP-Glucose Pyrophosphorylase in Transgenic Potatoes Leads to Sugar-Storin Tubers and Influences Tuber Formation and Expression of Tuber Storage Protein Genes", The EMBO Journal, Bd. 11(4), S 1229-1238 (1992); und Creech, "Carbohydrate Synthesis in Maize", Advances in Agronomy, Bd. 20, S. 275-322 (1968).
Die Produktion der vorliegenden Glucane wird nach Transformationsverfahren durchgeführt, die auf dem Gebiet gut bekannt sind und somit nicht Teil dieser Erfindung sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch Insertion einer Expressionskassette synthetisiert, welche ein synthetisches Gen enthält, das, wenn es transkribiert und translatiert wird, ein GTF-D-Enzym oder eine Mutante, das (die) das gewünschte Glucan produziert, liefert. Solche leeren Expressionskassetten, die geeignete Regulationssequenzen zur Pflanzenexpression der gewünschten Sequenz bereitstellen, sind wohlbekannt, und die Nukleotidsequenz für das synthetische Gen, entweder RNA oder DNA, kann leicht unter Verwendung von Standardtexten und bereitgestellten Referenzen aus der Aminosäuresequenz für das Protein abgeleitet werden. Die oben genannten synthetischen Gene verwenden vorzugsweise pflanzenbevorzugende Codons, um die Expression des gewünschten Proteins zu verstärken.
Die folgende Beschreibung erläutert die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung und die Verfahren zur Herstellung und zur Verwendung derselben beispielhaft. Allerdings ist es selbstverständlich, dass andere Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet als äquivalente Verfahren bekannt sind, eingesetzt werden können.
Die Gene, die für die vorliegenden Mutanten codieren, können in eine geeignete Expressionskassette insertiert werden und in Zellen einer Pflanzenspezies eingeführt werden. So beinhaltet eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens Insertieren einer DNA- Sequenz, die für eine Mutante oder den Wildtyp codiert, in das Genom der Pflanze in einem geeigneten Leserahmen zusammen mit Transkriptionspromotor- und Initiator-Sequenzen, die in der Pflanze aktiv sind. Transkription und Translation der DNA-Sequenz unter Kontrolle der Regulationssequenzen bewirken eine Expression der Proteinsequenz in Konzentrationen, die eine erhöhte Menge des Proteins in den Geweben der Pflanze bereitstellen.
Synthetische DNA-Sequenzen können dann hergestellt werden, die für die geeignete Aminosäuresequenz eines GTF D-Proteins codieren, und diese synthetische DNA-Sequenz kann in eine geeignete Pflanzenexpressionskassette insertiert werden.
Ebenso sind zahlreiche Pflanzenexpressionskassetten und Vektoren auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Mit dem Ausdruck "Expressionskassette" ist ein vollständiger Satz aus Kontrollsequenzen gemeint, der Promotor-, Initiations- und Terminationssequenzen einschließt, die in einer Pflanze wirken, wenn sie ein Strukturgen im geeigneten Leseraster flankieren. Expressionskassetten enthalten vorzugsweise und häufig eine Zusammenstellung aus Restriktionsstellen, die zur Spaltung und Insertion eines beliebigen gewünschten Strukturgens geeignet sind. Es ist wichtig, dass das clonierte Gen ein Startcodon im korrekten Leseraster für die Struktursequenz hat.
Mit dem Ausdruck "Vektor" ist hier eine DNA-Sequenz gemeint, die fähig ist, ein fremdes Gen in einer Wirtszelle zu replizieren und zu exprimieren. Typischerweise hat der Vektor eine oder mehrere Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen, die durch Verwendung des geeigneten Enzyms in vorhersagbarer Weise geschnitten werden können; solche Vektoren sind vorzugsweise so aufgebaut, dass sie zusätzliche Strukturgensequenzen umfassen, die Antibiotika- oder Herbizid-Resistenz verleihen, die dann als Marker zur Identifizierung und Trennung transformierter Zellen dienen. Bevorzugte Marker/Selektionsagentien umfassen Kanamycin, Chlorosulfuron, Phosphonothricin, Hygromycin und Methotrexat. Eine Zelle, in der das fremde genetische Material in einem Vektor funktionell exprimiert ist, wurde durch den Vektor "transformiert" und wird als "Transformant" bezeichnet.
Ein besonders bevorzugter Vektor ist ein Plasmid, womit ein rundes doppelsträngiges DNA-Molekül, das nicht Teil der Chromosomen der Zelle ist, gemeint ist.
Wie oben erwähnt wurde, können sowohl genomische DNA wie auch cDNA, die für das interessierende Gen codieren, in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Der interessierende Vektor kann auch partiell aus einem cDNA-Clon und partiell aus einem genomischen Clon aufgebaut sein. Wenn das interessierende Gen isoliert wurde, werden genetische Konstrukte hergestellt, die die notwendigen Regulationssequenzen enthalten, um für eine effiziente Expression des Gens in der Wirtszelle zu sorgen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das genetische Konstrukt (a) eine genetische Sequenz, die für das Protein oder die interessierende Sequenz codiert, und (b) eine oder mehrere Regulationssequenzen, die funktionell an einer Seite des interessierenden Strukturgens gebunden sind, enthalten. Typischerweise werden die Regulationssequenzen aus der Gruppe bestehend aus Promotoren und Terminatoren ausgewählt. Die Regulationssequenzen können aus autologen oder heterologen Quellen stammen.
Die Expressionskassette, die das Strukturgen für eine Mutante der vorliegenden Erfindung funktionell an die gewünschten Kontrollsequenzen gebunden umfasst, kann in einen geeigneten Clonierungsvektor ligasiert werden. Im Allgemeinen werden Plasmid- oder virale (Bakteriophagen-)-Vektoren verwendet, die Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, die von Spezies stammen, die mit der Wirtszelle verträglich sind. Der Clonierungsvektor wird typischerweise einen Replikationsursprung wie auch spezifische Gene tragen, die fähig sind, phenotypische Selektionsmarker in transformierten Wirtszellen bereitzustellen. Typischerweise werden Gene verwendet, die Resistenz gegenüber Antibiotika oder ausgewählten Herbiziden verleihen. Nachdem das genetische Material in die Zielzellen eingeführt ist, können erfolgreich transformierte Zellen und/oder Zellkolonien durch Selektion auf der Basis dieser Marker isoliert werden.
Typischerweise wird eine Zwischenwirtszelle in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet, um die Copy-Zahl des Clonierungsvektors zu erhöhen. Mit einer erhöhten Copy- Zahl kann der Vektor, der das interessierende Gen enthält, in beachtlichen Mengen zur Einführung in die gewünschten Pflanzenzellen isoliert werden. Wirtszellen, die bei einer Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Prokarioten, einschließlich Bakterienwirte, wie z. B. E. coli, S. typhimurium und Serratia marcescens. Eukaryotische Wirte, wie z. B. Hefen oder Fadenpilze, können ebenfalls in der Erfindung verwendet werden. Da diese Wirte auch Mikroorganismen sind, wird es essentiell sein, sicherzustellen, dass Pflanzenpromotoren, die keine Expression des Proteins in Bakterien verursachen, im Vektor verwendet werden.
Der isolierte Clonierungsvektor wird dann in die Pflanzenzelle eingeführt werden, wobei eine beliebige zweckdienliche Technik, einschließlich Elektroporation (in Protoplasten), Retroviren, Bombardement und Mikroinjektion in Zellen aus Monokotylidonen oder Dicotyledonen in Zell- oder Gewebekultur eingeführt werden, um transformierte Pflanzenzellen bereitzustellen, die als Fremd-DNA mindestens eine Kopie der DNA-Sequenz der Pflanzenexpressionskassette enthalten. Unter Verwendung bekannter Techniken können Protoplasten regeneriert werden, und es kann eine Zell- oder Gewebekultur regeneriert werden, um ganze fruchtbare Pflanzen zu bilden, die das Gen für ein Protein gemäß der vorliegenden Erfindung tragen und exprimieren. Entsprechend ist eine hochbevorzugte Ausführungsform der Erfindung eine transformierte Maispflanze, deren Zellen als Fremd-DNA mindestens eine Kopie der DNA-Sequenz einer Expressionskassette des GFT-D-Proteins enthalten.
Von einem Fachmann auf diesem Gebiet wird erkannt werden, dass die hier bereitgestellten Pflanzenvektoren auch in Agrobacterium tumefaciens eingeführt werden können, das dann zur Übertragung des Vektors in empfängliche Pflanzenzellen, vornehmlich aus Dicotylidonen-Spezies, verwendet werden kann. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Einführung von GTF D in für Agrobacterium tumefaciens anfällige Dicotyledonen-Pflanzen bereit, wobei die Expressionskassette in die Zellen eingeführt wird, indem die Zellen mit Agrobacterium tumefaciens, bei dem ein Plasmid modifiziert wurde, um eine Pflanzenexpressionskassette der vorliegenden Erfindung zu enthalten, infiziert werden.
Beispielsweise kann die Kartoffelpflanze über Agrobacterium tumefaciens transformiert werden, um die vorliegenden Glucane zu produzieren. Die Transformationskassette umfasst einen Patatin-Promotor, gefolgt von der relevanten GTF D-codierenden Sequenz und der Neomycin-Phosphotransferase-Polyadenylierungsstelle/Terminator. Siehe z. B. Utsumi et al., "Expression and Accumulation for Normal and Modified Soybean Glycinins in Potato Tubers", Plant Science, Bd. 102(2), S. 181-188 (1994); (Limerick). Die transgene Kassette wird in einen Transformationsvektor gebracht. Zur Transformation mit Agrobacterium tumefaciens sind z. B. BIN19 oder Derivate davon, verwendbar. Siehe z. B. Visser et al., "Transformation of Homozygous Diploid Potato with an Agrobacterium tumefaciens Binary Vector System by Adventitious Shoot Regeneration on Leafand Stem Segments", Plant Mol. Biol., Bd. 12(3), S. 329-338 (1989).
Für Maistransformationsvektoren umfassen die Promotoren einen beliebigen Promotor, dessen Expression spezifisch und auf Endospermzellen beschränkt ist. Eingeschlossen sind die, die für 22 kDa Zein, Opaque2, Gamma-Zein und Wachsmais codieren. Diese leiten das GTF D- Gen ein, und daran schließt sich der endogene Terminator oder der heterogene PI!!INIII- Terminator an.
Das GTF D-Protein ist unter Verwendung einer geeigneten Transitsequenz auf den Mais-Endospermamyloplasten gerichtet. Transitsequenzen, die verwendbar sind, um das Enzym zur Akkumulation innerhalb des Amyloplasten in den Amyloplasten zu steuern, umfassen Ribulosebiphosphatcarboxylase-kleine Untereinheit, Wachs-, Brittle-1- und Chlorophyll AB- Bindungsprotein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Transitsequenzen sind zwischen dem Promotor und der GTF D-codierenden Sequenz angeordnet und im Translationsleseraster mit der GTF D-Gruppierung fusioniert. Transitsequenzen, die zur Steuerung des Enzyms in die Vakuole zur Akkumulation innerhalb der Vakuole geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Bezüglich des Vakuolen-Targetings siehe z. B. Ebskamp et al., "Accumulation of Fructose Polymers in Transgenic Tobacco", Bio/Technology, Bd. 12, S. 272-275 (1994).
Was die Mais-Transformation und -Regeneration angeht, so wird z. B. auf Armstrong, C., (1994), "Regeneration of Plants from Somatic Cell Cultures: Applications for in vitro Genetic Manipulation", The Maize Handbook, Freeling et al. Herausgeber, S. 663-671, verwiesen.
Sobald eine gegebene Pflanze einmal transformiert ist, können die synthetisierten Glucane nach Standardverfahren, die einem Fachmann auf diesem Fachgebiet bekannt sind, isoliert werden. Die Glucane, die auf diese Weise in der transgenen Pflanze erhalten werden, können modifizierte Stärken ersetzen und in Beleimungs- und/oder Beschichtungsschritten verwendet werden. Bezüglich Rezepturen, die im Beschichtungsschritt verwendbar sind, siehe z. B. Heiser et al., "Starch Formations", Starch and Starch Products in Paper Coating, Kearney et al., Herausgeber, S. 147-162 (1990); Tappi Press.
Sowohl bei der Beleimung wie auch bei der Beschichtung werden die vorliegenden Glucane in einer Menge von etwa 4-15% Gew./Vol., bevorzugter von etwa 5-12% Gew./Vol., noch bevorzugter von etwa 6-8% Gew./Vol., verwendet. Gewichtsprozent ist definiert als Gramm Moleküle pro 100 ml Lösung.
Die vorliegenden Glucane werden verwendet, um die Stärke und/oder Latexmoleküle vollständig zu ersetzen, oder aber es wird ein Stärke-Glucan- oder ein Latex-Glucan-Gemisch in der Aufschlämmung verwendet. Bei der Beleimungsanwendung liegt das Glucan : Stärke- Verhältnis von etwa 10 : 90 bis etwa 100 : 0; bevorzugter von etwa 40 : 60 bis etwa 100 : 0; noch bevorzugter von etwa 60 : 40 bis etwa 100 : 0; und ist am günstigsten etwa 100 : 0.
In der Beschichtungsanwendung liegt das Glucan : Stärke-Verhältnis im Bereich von etwa 10 : 90 bis etwa 100 : 0; bevorzugter von etwa 40 : 60 bis etwa 100 : 0; noch bevorzugter von etwa 60 : 40 bis etwa 100 : 0; und ist am günstigsten etwa 100 : 0. Das Glucan : Latex-Verhältnis liegt im Bereich von etwa 10 : 90 bis etwa 100 : 0; bevorzugter von etwa 40 : 60 bis etwa 100 : 1; noch bevorzugter von etwa 60 : 40 bis etwa 100 : 0; und ist am günstigsten etwa 100 : 0.

Claims

1. Verfahren zur Papierherstellung, das Zusetzen von Glucan in einem oder mehreren Schritten dieses Verfahrens umfaßt, wobei Glucan durch Synthese mit einem Glucosyltransferase-D-Enzym erhältlich ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Glucan in einem Naßpartie-, Beleimungs- oder Beschichtungsschritt zugesetzt wird.

3. Verfahren, um Papier während der Herstellung Glanz zu verleihen, das Zusetzen von Glucan in einem Beschichtungsschritt umfaßt, wobei das Glucan durch Synthese mit einem Glucosyltransferase-D-Enzym erhältlich ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Glucan im Beschichtungsschritt zugesetzt wird und die verwendete Glucan-Menge 4 bis 15 Gew.-% der Aufschlämmung, die beim Auftragen der Beschichtung verwendet wird, beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die verwendete Glucan- Menge 5 bis 12 Gew.-% der Aufschlämmung, die beim Aufbringen der Beschichtung verwendet wird, ausmacht.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Glucan durch die Wirkung eines Mutanten- Glucosyltransferase-D-Enzyms, das in einer Position, ausgewählt aus T589D; T589E; N471D; N471D/T589D und N471D/T589E eine Veränderung aufweist, auf ein Substrat erhältlich ist.

7. Verwendung eines Glucans bei der Papierherstellung, wobei das Glucan durch die Wirkung eines Glucosyltransferase-D-Enzyms auf ein Substrat erhältlich ist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, um Papier während der Herstellung Glanz zu verleihen.

9. Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Glucan mindestens ein partieller Ersatzstoff für modifizierte Stärke oder Latex ist.

10. Papier, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, oder durch die Verwendung eines Glucans, das durch die Wirkung eines Glucosyltransferase-D-Enzyms auf ein Substrat erhältlich ist, wobei die Verwendung einem der Ansprüche 7 bis 9 entspricht.