DE69615909T2

DE69615909T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Verringerung asymetrischer Fehler in amperometrischen Sensoren

Info

Publication number: DE69615909T2
Application number: DE69615909T
Authority: DE
Inventors: Marvin A. Genshaw; Dijia Huang; Matthew K. Musho; Kin-Fai Yip
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1995-05-05
Filing date: 1996-04-23
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2016-04-24
Also published as: JP3413323B2; EP0741186A2; JPH08304340A; CA2170660A1; EP0741186A3; DK0741186T3; CA2170660C; ATE207113T1; US5620579A; US5653863A; AU5205896A; ES2162643T3; EP0741186B1; DE69615909D1; AU701303B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein einen Biosensor und insbesondere ein neues und verbessertes Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Verringerung des Fehlers in amperometrischen Sensoren.

Hintergrund der Erfindung

Die quantitative Bestimmung von Analyten in Körperflüssigkeiten ist von großer Bedeutung bei der Diagnose und Überwachung bestimmter physiologischer Abnormalien. Beispielsweise sollten Lactat, Cholesterin und Bilirubin bei bestimmten Personen überwacht werden. Insbesondere ist die Bestimmung von Glucose in Körperflüssigkeiten von großer Bedeutung für Diabetiker, die häufig den Glucose-Gehalt in ihren Körperflüssigkeiten als Maßnahme zur Regulierung der Glucose-Aufnahme in ihrer Diät überprüfen müssen. Indem im übrigen die nun folgende Beschreibung auf die Bestimmung von Glucose gerichtet ist, sollte es klar sein, dass das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung auch zur Bestimmung weiterer Analyte bei entsprechender Auswahl des entsprechenden Enzyms angewandt werden können. Die ideale Diagnosevorrichtung zum Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten muss einfach sein, um kein allzu hohes technisches Geschick auf Seiten des Technikers erforderlich zu machen, der den Test durchführt. In vielen Fällen werden diese Tests vom Patienten selbst durchgeführt, der ferner Wert auf einen Test legt, der leicht und einfach durchzuführen ist. Ausserdem sollte eine Vorrichtung auf Elementen beruhen, die hinreichend stabil sind, um Situationen einer verlängerten Lagerung und Aufbewahrung standzuhalten.
Verfahren zur Bestimmung einer Analyt-Konzentration in Flüssigkeiten können auf der elektrochemischen Reaktion zwischen dem Analyt und einem für den Analyt spezifischen Enzym sowie auf einem Mediator (einer Vermittlersubstanz) beruhen, der das Enzym in seinem anfänglichen Oxidationszustand hält. Geeignete Redox-Enzyme schließen Oxidasen, Dehydrogenasen, Katalayse und Peroxidase ein. Ist beispielsweise Glucose der Analyt, kann die Reaktion mit Glucose-Oxidase und Sauerstoff gemäß Gleichung (A) dargestellt werden:
In einem kolorimetrischen Assay ergibt das freigesetzte Wasserstoffperoxid in der Gegenwart einer Peroxidase eine Farbänderung in einem Redox-Indikator, die proportional zum Glucose-Gehalt in der Testflüssigkeit ist. Zwar können kolorimetrische Tests halb-quantitativ unter Verwendung von Farbkarten zum Vergleich der Farbänderung des Redox-Indikators mit der mit Testflüssigkeiten bekannter Glucose-Konzentration erhaltenen Farbänderung durchgeführt und durch Ablesen der Ergebnisse mit einem spektrofotometrischen Gerät in hohem Maße quantifiziert werden, die Ergebnisse sind aber im allgemeinen nicht so genau und werden auch nicht so rasch erhalten, wie diejenigen, die mit einem Biosensor erhalten werden. Wie hier verwendet, soll sich der Begriff "Biosensor" auf eine Analyse- Vorrichtung beziehen, die selektiv auf Analyte in einer entsprechenden Probe reagiert und deren Konzentration in ein elektrisches Signal über die Kombination eines biologischen Erkennungssignals und eines physiko-chemischen Überträgers umwandelt. Neben seiner größeren Genauigkeit ist ein Biosensor ein Instrument, das ein elektrisches Signal direkt erzeugt und dadurch einen vereinfachten Aufbau erleichtert. Grundsätzlich ist alles, was ein Biosensor tun muss, die Zeit zu messen und den Strom abzulesen. Ferner bietet ein Biosensor den Vorteil niedriger Materialkosten, da lediglich eine Dünnschicht aus Chemikalien an den Elektroden abgeschieden und nur wenig Material vergeudet werden.
Bezüglich der obigen Gleichung (A), vermag eine geeignete Elektrode die Bildung von H&sub2;O&sub2; durch Einleitung von Elektronen in die Testflüssigkeit gemäß Gleichung (B) zu messen:
H&sub2;O&sub2; → O&sub2; + 2H&spplus; + 2e&supmin; (B).
Der Elektronenfluss wird dann in das elektrische Signal umgewandelt, das direkt mit der Glucose-Konzentration korreliert.
In der Anfangsstufe der durch Gleichung (A) dargestellten Reaktion überführt Glucose, die in der Testprobe vorliegt und vorhanden ist, das oxidierte Flavinadenindinucleotid(FAD)- Zentrum des Enzyms in seine reduzierte Form (FADH&sub2;). Weil diese Redox-Zentren im wesentlichen elektrisch isoliert innerhalb des Enzym-Moleküls sind, tritt ein direkter Elektronentransfer zur Oberfläche einer herkömmlichen Elektrode bei Abwesenheit einer unakzeptabel hohen Zell-Spannung in einem messbaren Grad nicht auf. Eine Verbesserung dieses Systems beinhaltet die Anwendung einer nicht-physiologischen Redox-Kupplung zwischen der Elektrode und dem Enzym, um Elektronen zwischen dem (FADH&sub2;) und der Elektrode pendeln zu lassen. Dies wird durch das folgende Schema dargestellt, worin der in typischer Weise als Mediator bezeichnete Redox-Kuppler durch M dargestellt ist:
Glucose + GO(FAD) → Gluconolacton + GO(FADH&sub2;)
GO(FADH&sub2;) + 2Mox → GO(FAD) + 2Mred + 2H&spplus;
2Mred → 2Mox + 2e&supmin; (an der Elektrode).
In dem Schema stellt GO(FAD) die oxidierte Form von Glucose- Oxidase dar, und GO(FADH&sub2;) zeigt deren reduzierte Form an. Die mediierenden (vermittelnden) Species Mox/Mred lassen Elektronen aus dem reduzierten Enzym zur Elektrode pendeln, wodurch das Enzym oxidiert und dessen Regeneration in situ verursacht werden, was aus Gründen der Wirtschaftlichkeit natürlich wünschenswert ist. Der Hauptzweck zur Anwendung eines Mediators ist es, das Arbeitspotential des Sensors herabzusetzen. Ein idealer Mediator würde an der Elektrode bei einem niedrigen Potential reoxidiert werden, unter welchem eine Verunreinigung in der chemischen Schicht und störende Substanzen in der Probe nicht oxidiert würden, wodurch Interferenzen bzw. Störungen minimiert würden.
Viele Verbindungen eignen sich als Mediatoren wegen ihrer Befähigung zur Aufnahme von Elektronen aus dem reduzierten Enzym und deren Übertragung auf die Elektrode. Unter den zur Verwendung als Elektronenübertragungsmittel in analytischen Bestimmungsverfahren bekannten Mediatoren sind die substituierten Benzo- und Naphthochinone gemäß US 4.746.607, die N-Oxide, Nitroso-Verbindungen, Hydroxylamine und Oxime, die spezifisch in EP 0 354 441 offenbart sind, die Flavine, Phenazine, Phenothiazine, Indophenole, substituierten 1,4- Benzochinone und Indamine gemäß EP 0 330 517 sowie die in US 3 791 988 beschriebenen Phenazinium/Phenoxazinium-Salze. Eine zusammenfassende Übersicht elektrochemischer Mediatoren biologischer Redox-Systeme ist in Analytica Clinica Acta 140 (1982), S. 1-18, zu finden.
Unter den wichtigeren Mediatoren befindet sich Hexacyanoferrat, das auch als Ferricyanid bekannt ist, das von Schläpfer et al in Clinica Chimica Acta 57 (1974), S. 283-289, diskutiert ist. In US 4 929 545 ist die Verwendung einer löslichen Ferricyanid-Verbindung in Kombination mit einer löslichen Eisen(III)verbindung in einer Zusammensetzung zur enzymatischen Bestimmung eines Analyt in einer Probe offenbart. Bei Ersatz von Sauerstoff durch das Eisensalz Ferricyanid in Gleichung (A) ergibt sich:
wobei das Ferricyanid zum Ferrocyanid durch dessen Aufnahme von Elektronen aus dem Glucose-Oxidase-Enzym reduziert wird.
Eine weitere Darstellung dieser Reaktion liefert die folgende Gleichung (C):
Glucose + GO(FAD) → Gluconolacton + GO(FADH&sub2;)
GO(FADH&sub2;) + 2Fe(CN)³&supmin;&sub6; → GO(FAD) + 2Fe(CN)&sup4;&supmin;&sub6; + 2H&spplus;
2Fe(CN)&sup4;&spplus;&sub6; → 2Fe(CN)³&supmin;&sub6; + 2e (an der Elektrode). (C)
Die freigesetzten Elektronen sind direkt äquivalent zur Glucosemenge in der Testflüssigkeit und können darauf durch Messung der Stromstärke bezogen werden, die durch die Flüssigkeit hindurch bei Anlegen eines entsprechenden Potentials erzeugt wird. Die Oxidation des Ferrocyanids an der Anode erneuert den Zyklus.
Wie aus der obigen Beschreibung ersichtlich, ist ein notwendiges Merkmal eines Mediators seine Befähigung, den oxidierten Zustand unter den an der Elektrodenoberfläche vorliegenden Bedingungen vor der Anwendung des Sensors beizubehalten. Eine Reduktion des Mediators erhöht die Hintergrund-Stromstärke, was im Biosensor dazu führt, dass die Ablesung fehlerhaft ist. Es ist herausgefunden worden, dass diese Mediatoren dazu neigen, mit der Zeit reduziert zu werden, insbesondere unter Belastungsbedingungen, wodurch die Verwendbarkeit der dann angewandten Sensoren vermindert wird.
In der veröffentlichten WO 92/15704 ist die Verwendung von Kallumdichromat als Oxidiermittel in einem kolorimetrischen Reagenzstreifen offenbart. Der Zweck des Oxidiermittels ist es, Verunreinigungen in weiteren Reagenzkomponenten zu oxidieren, um die Stabilität des kolorimetrischen Sensors zu verbessern. Diese Veröffentlichung nennt USSN 07/451671 (nunmehr US 5 288/636) und beschreibt ein System, worin ein reduzierter Mediator durch Anlegen eines Potentials reoxidiert und die Stromstärke nach einer spezifischen Zeit gemessen werden, um die Konzentration des Analyt zu bestimmen. Insbesondere macht das, Patent '636 die vollständige Oxidation der Glucose durch Glucose-Oxidation erforderlich. Indem das Enzym durch die Glucose reduziert wird, reagiert das Ferricyanid mit Enzym, um Ferrocyanid zu erzeugen. Das durch diese enzymatische Reaktion erzeugte Ferrocyanid kommt zum bei der Lagerung bzw. Aufbewahrung erzeugten Ferrocyanid hinzu. Dies letztere Ferrocyanid ist das Ergebnis einer Reaktion zwiwschen Ferricyanid und Verunreinigungen, die in Materialien vorgefunden werden, die mit der Glucose-Oxidase und Ferricyanid abgeschieden werden. Das Patent '636 macht keine Unterscheidung zwischen Ferrocyanid, das zwischen diesen zwei Quellen erzeugt wird.
In EP-A-0 342 820 ist ein Verfahren zur Messung der Konzentration einer Substanz in einer Proben-Lösung offenbart, wobei man (i) die Test-Lösung mit der Probe und einem Überschuss von Redox-Mediator zubereitet, (ii) die Test-Lösung einer ersten Elektrode vorlegt, um sicherzustellen, dass der Redox-Mediator vollständig oxidiert wird, (iii) die Test- Lösung durch einen Enzym-Kanal laufen lässt, wobei eine geringe Menge des Redox-Mediators reduziert wird, und man (iv) die Test-Lösung zu einer zweiten Elektrode laufen lässt, um die genannte Menge des Redox-Mediators zu re-oxidieren, wobei die diesem Verfahrensablauf entsprechende Ladung gemessen wird.
In WO-A-91/09139 ist ein amperometrischer Biosensor offenbart, der eine Arbeits- und Gegenelektrode umfasst, die teilweise mit einem Reagens mit einer hinreichenden Menge Redox-Mediator und mit einem Enzym bedeckt sind. Die Konzentration von Analyt in einer Probe wird mit diesem Biosensor nachgewiesen, indem man (i) die Proben-Lösung zum Reagens gibt, (ii) den Analyt mit dem Enzym vollständig reagieren (oxidieren/reduzieren) lässt, wobei eine gewisse Menge Redox-Mediator reduziert/oxidiert wird, und man (iii) eine Potentialdifferenz zwischen beiden Elektroden so anlegt, dass der Mediator elektro-reoxidiert/reduziert und die beim Verfahren erzeugte Stromstärke gemessen werden.
Es wäre wünschenswert und ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben und zur Verfügung zu stellen, bei dem die unerwünschte Reduktion von Mediator- Verbindungen, die an einer Elektrodenoberfläche vorliegen und lagern, rückgängig gemacht werden kann, um deren Auswirkung auf die Abschätzung der Analyt-Werte in flüssigen Testproben bei sehr niedrigen Analyt-Konzentrationen zu minimieren.
Eine weitere Aufgabe ist es, ein derartiges Verfahren anzugeben, bei dem die Genauigkeit der Analyt-Bestimmung erhöht ist.
Noch eine Aufgabe ist es, ein derartiges Verfahren anzugeben, worin der Analyt Glucose ist.
Eine zusätzliche Aufgabe ist es, mathematische Mittel zur weiteren Steigerung der Genauigkeit der Analyt-Bestimmung anzugeben.
Noch eine weitere Aufgabe ist es, eine Vorrichtung zur genauen Bestimmung der Analyt-Werte bereitzustellen.
Schließlich ist es noch eine Aufgabe, eine derartige Vorrichtung bereitzustellen, die einfach aufgebaut und wirtschaftlich herzustellen ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyt in einer flüssigen Testprobe, wobei die Testprobe auf die Oberfläche einer Arbeitselektrode aufgegeben wird. Die Elektrode weist auf ihrer Oberfläche eine Zusammensetzung aus einem für den Analyt spezifischen Enzym und einen Mediator auf, der als Ergebnis einer Reaktion zwischen dem Analyt und dem Enzym reduziert wird und einer Teilreduktion in seinen reduzierten Zustand unterzogen worden ist, und zwar als Ergebnis davon, dass er Umgebungsbedingungen ausgesetzt war. Es wird hier eine Verbesserung für ein Verfahren offenbart, das Stufen enthält, in denen man:
a) einen positiven Potentialpuls an die Elektrode anlegt, um mindestens einen Teil des Mediators in seine oxidierte Form zu oxidieren. Diese Stufe verringert einen Hintergrund-Fehler in der Elektrode. Der Hintergrund-Fehler kann ferner dadurch verringert werden, dass man:
a) die Stromstärke (i&sub1;) während dem Anlegen des positiven Pulses und die Stromstärke (i&sub2;) am Ende der Ablesezeit bestimmt, und man
b) die korrigierte Analyt-Gehaltsmenge G durch Lösen der Gleichung (1) berechnet:
worin Int und Steigung das Interzept (der Abschnitt) und die Steigung von i&sub2; und Δ(i&sub1;, i&sub2;) ein Fehlerkorrekturterm sind, der proportional zum Hintergrund-Fehler ist, der berechnet wird als:
worin
s&sub1; = Steigung von i&sub1;,
i&sub1;_lo = i&sub1; bei niedrigem Analyt-Gehalt,
i&sub2;_lo = i&sub2; bei niedrigem Analyt-Gehalt, und
k = ein ausgewählter Normierungsfaktor.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die vorliegende Erfindung kann zusammen mit den obigen und weiteren Gegenständen und Vorteilen am besten aus der nun folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verstanden werden, die auch in den Zeichnungen dargestellt sind, in denen:
Fig. 1 ein Diagramm ist, worin Potential und Stromstärke gegen die Zeit gemäß dem Verfahren der Erfindung dargestellt sind;
Fig. 2 eine Blockdiagramm-Darstellung einer Vorrichtung zur Bestimmung von Analyt-Werten ist, die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung angewandt wird; und
Fig. 3 ein Fließschema ist, das die nach einander ablaufenden Stufen darstellt, die mit einem Prozessor von Fig. 2 gemäß dem Verfahren der Erfindung durchgeführt werden.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren, das den wegen oxidierbarer Verunreinigungen auftretenden Hintergrund-Fehler in einem amperometrischen Sensor verringert, der zur Messung eines spezifischen Analyt, wie von Glucose in Blut, angewandt wird. Die Hintergrund-Stromstärke eines solchen Sensors steigt, wenn dieser über einen langen Zeitraum oder unter Belastung (Hitze, Feuchtigkeit, usw.) gelagert wird, wegen des erhöhten Vorliegens von reduziertem Mediator oder weiterer reduzierter Verunreinigungen an, die dann im Sensor vorhanden sind und vorliegen, wie Enzym-Stabilisiermittel, z. B. Glutamat, und Tenside mit reduzierenden Äquivalenten. Beispielsweise wird in einem Ferricyanid-basierten amperometrischen Sensor der Hintergrund-Fehler durch das Vorliegen von Ferrocyanid (aus der Reduktion von Ferricyanid) nahe der Elektrodenoberfläche verursacht. Dieses angehäufte Ferrocyanid wird, im Gegensatz zum Ferrocyanid, das bei Anwendung des Sensors erzeugt wird (frisches Ferrocyanid), zu Ferricyanid rückoxidiert, um den Hintergrund-Fehler, den es verursacht, zu verringern und dadurch die Sensor-Haltbarkeit (bzw. -Lagerbeständigkeit) zu verlängern. Zur Lösung dieser Aufgabe wendet das Verfahren einen elektrochemischen Lösungsansatz an. Der Hintergrund-Fehler wird ferner verringert, wenn zum elektrochemischen Lösungsansatz eine algorithmische Korrektur hinzukommt.
Bezüglich Fig. 1, beinhaltet das Verfahren der Erfindung, dass man zuerst einen positiven Potential-Puls (bezeichnet als "Abbrenn"-Puls) anlegt, der dem normalen Potential-Profil beim Einsatz des Sensors vorausgeht. Dies wird in typischer Weise durch Anlegen eines positiven Potentials von 0,1 bis 0,9 Volt (vorzugsweise von 0,3 bis 0,7 Volt) zwischen der Arbeits- und Referenzelektrode des Sensors über eine Dauer von 1 bis 15 Sekunden (vorzugsweise von 5 bis 10 s) bewerkstelligt. Der Abbrenn-Puls oxidiert das anfängliche Ferrocyanid (oder eine andere oxidierbare Verunreinigung), so dass der Sensor den Assay mit einem sauberen Hintergrund beginnen kann. In typischer Weise ist der Hintergrund nicht vollkommen sauber, da nur ein Teil der oxidierbaren Verunreinigung durch den Abbrenn-Puls oxidiert wird. Dies deshalb, weil die chemische Schicht sowohl die Arbeits- als auch die Referenzelektroden bedeckt. Das anfängliche Ferrocyanid liegt in der chemischen Schicht vor, da es aus Ferricyanid kommt. Werden Probenflüssigkeit angewandt und die chemische Schicht re- hydratisiert, wird das Ferrocyanid nahe der Arbeitselektrode re-oxidiert. Der Rest des Ferrocyanids diffundiert in die Probenflüssigkeit und wird mit der Glucose vermischt. Dieser Teil des anfänglichen Ferrocyanids kann nicht re-oxidiert werden, ohne die Glucose zu beeinflussen. Das anfängliche Ferrocyanid liegt nahe der Elektrode eine sehr kurze Zeit (einige Sekunden) lang nach Anwendung der flüssigen Testprobe vor. Der Grund dafür ist, dass die Chemikalien (Enzyme und Ferricyanid usw.) als eine Dünnschicht auf den Arbeits- und Referenzelektroden abgeschieden werden. Die Abbrenn-Technik zieht daraus einen Vorteil, da eine signifikante Menge des anfänglichen Ferrocyanids ohne erkennbare Verringerung der Analyt-Konzentration in der flüssigen Testprobe abgebrannt werden kann, von der das meiste nicht in direkten Kontakt mit der Elektrode gelangt. Versuche haben belegt, dass der Hintergrund-Fehler eines belasteten Sensors um 40% bei sauberer Anwendung des Abbrenn-Pulses verringert werden kann.
Der Hintergrund-Fehler kann ferner durch die Anwendung eines Hintergrund-Korrekturalgorithmus verringert werden, der mit dem Abbrenn-Puls zusammenhängt. Der Algorithmus beruht darauf, dass man 2 Stromstärke-Ablesungen vornimmt. Die erste Ablesung (i&sub1;) wird beim Abbrenn-Puls und die zweite (i&sub2;) wird am Ende der Ablesezeit vorgenommen, d. h. nach der Zeit, die von dem Augenblick an, als der zweite Potentialpuls angelegt wurde, bis zu dem Augenblick verstrichen ist, als die Stromstärke i&sub2; gemessen wurde. Die Dauer der Ablesezeit ist t&sub3;-t&sub2;, wie in Fig. 1 gezeigt. Die Analyt-Konzentration wird dann aus den zwei Stromstärke-Ablesungen i&sub1; und i&sub2; berechnet. Tests an Sensoren haben gezeigt, dass der Hintergrund-Korrekturalgorithmus mindestens 80% des verbleibenden Hintergrund-Fehlers zu beseitigen vermag, und die Sensor-Stabilität kann, als Ergebnis, verbessert werden, um eine signifikante Verlängerung bei der Lagerzeit zu ergeben.
Ein amperometrischer Glucose-Sensor des Typs zur Anwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung wird wie folgt konstruiert: 2 Kohlenstoffelektroden werden auf ein Polymer- Substrat gedruckt. Als nächstes wird eine Schicht aus chemischen Komponenten auf den Elektroden abgeschieden und getrocknet. Eine bevorzugte chemische Zusammensetzung sind 5 uL eines Mediums, enthaltend 55 mM Ferricyanid (Kaliumsalz), 8,5 Einheiten Glucose-Oxidase, 0,53% Poly(ethylenoxid), 0,40% Cremophor als Tensid und 83 mM Phosphat-Puffer von pH = 7,2. Beim Glucose-Assay wird ein Potential-Profil, das aus drei aufeinander folgenden Zeitspannen besteht, am Sensor angelegt. Diese Zeitspannen sind, in Abfolge, die Abbrenn-Zeit (in typischer Weise 0,4 Volt 10 s lang), die Aufschubdauer (offener Stromkreis 15 s lang) und die Ablese-Zeit (0,4 Volt, 5 s lang). Die genaue Zeit der Verzögerung ist nicht kritisch, liegt normalerweise aber im Bereich von 10 bis 40 s. Diese Verzögerungszeitspanne ermöglicht eine genügende Zeit für die Reaktion, um genügend Ferricyanid aufzubauen, um es zu ermöglichen, dass die aus der Reoxidation des Ferrocyanids resultierende Stromstärke ohne Schwierigkeiten gemessen wird. Diese Zeitspannen sind in Fig. 1 dargestellt, worin Potential und Stromstärke gegen die Zeit aufgetragen sind. Stromstärkemessungen werden am Ende der Abbrenn-Zeitspanne (i&sub1;) und der Ablese-Zeit (i&sub2;) vorgenommen, worauf die entsprechende Glucose-Konzentration mit Gleichung 1 berechnet wird. Die Konstanten in der Gleichung, z. B. Steigungen und Interzepte, sind vorbestimmte Werte.
Die folgende Diskussion betrifft eine flüssige Testprobe, worin Glucose der nachzuweisende Analyt ist und einen Sensor beinhaltet, worin Ferricyanid der Mediator ist. Allerdings ist diese Diskussion in gleicher Weise auch auf Systeme zur Bestimmung anderer Analyte anwendbar, wobei sich die oxidierbaren Species dann von Ferrocyanid unterscheiden.
Die Abbrenn-Technik, d. h. die Anwendung eines positiven Potential-Pulses an die Elektrode, um mindestens einen Teil des Mediators zurück in seine oxidierte Form zu oxidieren, ist in Fig. 1 dargestellt. In Fig. 1, worin die Potential- und Stromstärke-Profile aufgetragen sind, verläuft die Zeit wie folgt:
t&sub0; - Probe wird nachgewiesen, Abbrenn-Zeitspanne beginnt. Probe wird durch Einbringung des Sensors in das Gerät nachgewiesen, was das unmittelbare Anlegen eines Potentials von 0,4 Volt bewerkstelligt. Die Stromstärke wird kontinuierlich geprüft, um zu sehen, ob ein größerer als der vorbestimmte Schwellenwert (z. B. 250 nA) gemessen wird. Wird, eine größere Stromstärke als der Schwellenwert erfasst und nachgewiesen, ist eine Probe nachgewiesen worden, mit der die Abbrenn- Zeitspanne begonnen wird.
t&sub1; - Ende der Abbrenn-Dauer und Stromstärke i&sub1; werden gemessen. Die Dauer der Abbrenn-Zeitspanne t&sub1;-t&sub0; beträgt gewöhnlich 5 bis 10 s. Das Potential beträgt 0,4 Volt bei t&sub1;, springt aber auf einen offenen Stromkreis oder auf ein Potential über, das die Stromstärke wesentlich verringert, um den Umsatz der elektrochemischen Reaktion an der Arbeitselektrode eine festgelegte Verzugszeitdauer lang nach der Abbrenn-Zeitspanne zu minimieren.
t&sub2; - Ende der festgelegten Verzugszeitspanne. Die Dauer der Wartezeit t&sub2;-t&sub1; beträgt normalerweise 10 bis 40 s. Ein Ablese- Potential von 0,4 Volt wird bei t&sub2; angelegt.
t&sub3; - Ende der Ablese-Zeit, wenn die Stromstärke i&sub2; gemessen wird. Die Dauer der Ablese-Zeit t&sub3;-t&sub2; beträgt 5 bis 10 s.
Der Abbrenn-Puls, d. h. das Anlegen des Potentials von 0,4 Volt von t&sub0; bis t&sub1;, ist geplant, um einen Teil des anfänglichen Ferrocyanids (des angehäuften Ferro(Eisen(II)) oder weiterer oxidierbarer störender Substanzen in der Enzym-Schicht zu eliminieren.
Mit dem Abbrenn-Algorithmus wird die Glucose-Konzentration aus zwei Stromstärkemessungen i&sub1; und i&sub2; gemäß Gleichung 1 berechnet:
worin:
Gleichung (1) ist ein Teilkorrekturalgorithmus, der einen Kompromiss zwischen der Verringerung eines Belastung-bezogenen Hintergrund-Fehlers und der Bewahrung der Systempräzision herstellen soll. Das grundlegende Schema ist es, i&sub2; als eine Glucose-Ablesung einzusetzen:
worin Int und Steigung das Interzept bzw. die Steigung von i&sub2; sind. Der Term Δ(i&sub1;, i&sub2;) ist die geschätzte Hintergrund- Steigerung wegen Belastung oder anderer Ursachen, abgeleitet aus der Stromstärke i&sub1; und i&sub2;. Für frische Sensoren liegt dieser Term nahe 0. Der Parameter k wird selektiv vorgegeben oder auf einen Wert von 0 bis 1 festgelegt. Es gibt keine Hintergrund-Korrektur, wenn k auf 0 gesetzt ist. Andererseits kann eine volle Korrektur durchgeführt werden, wenn k 1 ist. In den folgenden Beispielen wird k auf 0,8 für eine Teilkorrektur festgelegt, weil herausgefunden worden ist, dass die Abweichung von i&sub1; größer als die von i&sub2; ist, wenn mehrere Sensoren unter der gleichen Glucose-Konzentration getestet werden. Verglichen mit dem aus i&sub2; allein berechneten Glucose- Wert, k = 0 in Gleichung (1), wird der Glucose-Wert, verbunden berechnet aus i&sub1; und i&sub2;, geringfügig niedriger bei der Präzision sein (größere Standardabweichung), und es stellt sich natürlich ein viel kleinerer Hintergrund-Fehler ein. Ein Abgleich zwischen der Präzision und dem Fehler kann durch Wahl des passenden k-Wertes bewerkstelligt werden. Wenn k = 0, gibt es keine Hintergrund-Korrektur, und i&sub1; wird nicht angewandt. In diesem Fall kann die höchste Präzision erhalten werden, aber sie geht einher mit einem hohen Hintergrund-Fehler. Wenn k = 1, wird die volle Hintergrund-Korrektur angewandt, wodurch der niedrigste Fehler erzielt werden kann, dies aber auf Kosten der Präzision. Der k-Wert wird auf 0,8 im Beispiel festgelegt, um einen Kompromiss zwischen Präzision und Fehler herbeizuführen.
Die Parameter in diesen Gleichungen sind:
Int - Interzept (Abschnitt) des Ablese-Stroms i&sub2;, nA.
Steigung - Steigung des Ablese-Stroms i&sub2;, nA · dL/mg.
i&sub1;_lo - Durchschnitts-Abbrenn-Strom i&sub1;, nA, bei niedriger Glucose-Eichgehaltsmenge, d. h. von 50 mg/dL.
i&sub2;_lo - Durchschnitts-Ablesezeit-Strom i&sub2;, nA, bei niedriger Glucose-Eichgehaltsmenge. Tatsächlich ist i&sub2;_lo kein unabhängiger Parameter. Er lässt sich aus Int und Steigung berechnen:
i&sub1;_lo = Int + Steigung · 50.
s&sub1; - Steigung auf Abbrenn-Strom, nA · dL/mg.
k - gesetzt auf 0,8 für Teilkorrektur.
Int, Steigung, i&sub1;_lo und s&sub1; sind örtliche Parameter; jedes Sensor-Los weist seine eigenen Parameterwerte auf, die experimentell bestimmt werden. Der Algorithmus benötigt zwei bekannte Stromstärkewerte, einen für i&sub1; und einen für i&sub2; für normale (unbelastete) Sensoren. Die Werte für i&sub1;_lo und i&sub2;_lo sind verfügbar, da sie bei der Bestimmung des Interzepts (Int) und der Steigungen (s&sub1; und Steigung) eingesetzt werden. Natürlich kann die Stromstärke bei anderen Glucose- Gehaltsmengen in den Algorithmus eingesetzt werden. Dies würde allerdings die Sonderstufe einführen, um zwei zusätzliche unabhängige Parameter zuzufügen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele dargelegt:

Beispiel I

Die folgenden Stufen werden vorgenommen, um die Los- Parameterwerte zu ermitteln und zu bestimmen, die beim Algorithmus notwendig sind:
A. Test von 16 Sensoren aus dem Los bei einem niedrigen Eich- Gehalt von 50 mg/dL, wobei die Durchschnittsstromstärken i&sub1;_lo bzw. i&sub1;_lo des Abbrenn-Stroms bzw. Ablese-Stroms erhalten werden. Es ist festgestellt worden, dass i&sub1;_lo = 1951,2 nA und i&sub2;_lo = 1952,3 nA.
B. Test von 16 Sensoren bei einem hohen Eich-Gehalt von 400 mg/dL, wobei die Durchschnittsstromstärke i&sub1;_hi und i&sub2;_hi erhalten wird. Es ist festgestellt worden, dass i&sub1;_hi = 6003,3 nA und i&sub2;_hi = 8831,7 nA
C. Berechnung der Parameterwerte:
Daher wird Gleichung (I)

Beispiel II

Es ist herausgefunden worden, dass der Abbrenn-Puls allein den Hintergrund-Fehler signifikant herabsetzt, und dies sogar ohne die Anwendung des Hintergrund-Korrekturalgorithmus.
In diesem Versuch wurden 10 Sensoren mit 30ºC und 91% Feuchtigkeit 3 h lang belastet. Die wässrige Glucose mit 50 mg/dL wurde als Probe eingesetzt. 5 belastete Sensoren wurden mit einem Abbrenn-Puls von 10 s und 5 ohne den Puls getestet. Ausserdem wurden 10 unbelastete Sensoren als Vergleich getestet (5 mit dem Abbrennen über 10 s und 5 ohne), und es wurde der Fehler mit der folgenden Gleichung (3) berechnet:
Es ist festgestellt worden, dass der Fehler 30,6% ohne den Abbrenn-Puls und 18,0% mit ihm betrug, was belegt, dass der Abbrennpuls allein den Hintergrund-Fehler um ca. 40% verringert.

Beispiel III

Dieses Beispiel erläutert, wie der Algorithmus einen Hinterrund-Fehler korrigiert:
8 Sensoren wurden unterhalb -20ºC 2 Wochen lang gelagert, und weitere 8 Sensoren wurden bei ca. 50ºC belastet. Alle 16 Sensoren wurden mit Gesamtblut mit einer Glucose-Konzentration von 100 mg/dL getestet. Die Parameterwerte wurden aus frischen Sensoren bestimmt und ermittelt. Die Glucose-Ablesungen G wurden wie folgt berechnet:
A. Kein Hintergrundfehler-Korrekturalgorithmus: Gleichung 1 mit k = 0
B. Teilkorrektor: Gleichung 1 mit k = 0,8.
Der Fehler in Prozent wird mit Gleichung 4 berechnet, wobei die Ergebnisse in Tabelle 1 angegeben sind: Tabelle 1: Fehler bei 100 mg/dL
Eine Vorrichtung zur Durchführung der Erfindung ist in Fig. 2 dargestellt. Bezüglich Fig. 2, ist eine Blockdiagramm- Darstellung einer Vorrichtung zur genauen Bestimmung von Analyt-Werten skizziert, die als Ganze mit der Bezugsziffer 10 bezeichnet und gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung angeordnet ist. Vorrichtung 10 schließt einen Mikroprozessor 12 zusammen mit einer Speichervorrichtung 14 ein. Mikroprozessor 12 ist in geeigneter Weise programmiert, um das in Fig. 3 dargestellte Verfahren der Erfindung durchzuführen. Verschiedene im Handel erhältliche Vorrichtungen, wie ein DS5000-Mikrosteuerungsgerät, hergestellt von Dallas Semiconductor, können für den Mikroprozessor 12 und den Speicher 14 eingesetzt werden. Speicher 14 kann im Mikroprozessor 12 enthalten oder getrennt davon vorgesehen sein, wie dies in Fig. 2 dargestellt ist.
Digitaldaten aus dem Mikroprozessor 12 werden in einem Digital-zu-Analog (D/A)-Wandler 16 eingegeben. D/A-Wandler 16 wandelt die Digitaldaten in ein Analogsignal um. Ein Verstärker 18, der an den D/A-Wandler 16 gekoppelt ist, verstärkt das Analogsignal. Der verstärkte Analogsignal- Ausstoß von Verstärker 18 wird an einen Sensor 20 angelegt.
Sensor 20 ist an einen Verstärker 22 gekoppelt. Das verstärkt erfasste Signal wird an einen Analog-zu-Digital (A/D)-Wandler 24 angelegt, der das verstärkte, analoge Sensorsignal in ein Digitalsignal umwandelt. Das Digitalsignal wird an den Mikroprozessor angelegt.
Verschiedene im Handel erhältliche Vorrichtungen können für den D/A-Wandler 16, die Verstärker 18 und 20 und den A/D- Wandler 24 eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Vorrichtungstyp PM-752F4FS, hergestellt von PMI, für den D/A- Wandler 16 verwendet werden. Der Betriebsverstärkervorrichtungstyp TL074AC, hergestellt und verkauft von Linear Technology, kann für die Verstärker 18 und 22 eingesetzt werden. Ein Vorrichtungstyp MAX 135 CWI, hergestellt und verkauft von Maxum, kann für den A/D-Wandler 24 verwendet werden.
In Fig. 3 sind die aufeinanderfolgenden Stufen zur genauen Analyt-Bestimmung der Erfindung dargestellt. Anfänglich legt der Mikroprozessor 12 einen Abbrenn-Puls, z. B. ein Potential von 0,4 Volt, an den Sensor 20 an, wie in Block 300 angezeigt. Dann prüft der Mikroprozessor, um eine Probe zu identifizieren, die einem erfassten Sensor-Schwellenstromwert entspricht, wie im Entscheidungsblock 302 angezeigt. Wird eine Probe bei Block 302 erfasst und nachgewiesen, wird ein vorbestimmtes Abbrenn-Zeitintervall, wie von 10 s, an einem Entscheidungsblock 304 identifiziert. Als nächstes wird die Stromstärke i&sub1; gemessen, wie an einem Block 306 angezeigt, und es wird ein offener Stromkreis an den Sensor 20 angelegt, wie an einem Block 308 angezeigt. Dann werden eine festgelegte Verzugszeit oder ein vorbestimmtes Wartezeitintervall, wie von 15 s, an einem Entscheidungsblock 310 identifiziert. Nach der festgelegten Verzugszeit werden ein Ablese-Puls oder ein Potential von 0,4 Volt an den Sensor 20 angelegt, wie an einem Block 312 angezeigt. Dann wird ein vorbestimmtes Ablese- Zeitintervall für den Ablese-Puls, wie von 5 s, an einem Entscheidungsblock 314 identifiziert, und es wird die Stromstärke i&sub2; gemessen, wie an einem Block 316 angezeigt. Als nächstes erhält der Mikroprozessor 12 die gespeicherten Parameter für einen besonderen Sensor 20, einschließlich Int, Steigung, i&sub1;_lo, i&sub2;_lo, s&sub1; und k, wie an einem Block 320 angezeigt. Der Korrekturterm Δ(i1, i&sub2;) wird mit den gespeicherten Parametern und der gemessenen Abbrenn- Stromstärke i&sub1; und Ablese-Stromstärke i&sub2; berechnet, wie in Block 322 angezeigt. Als nächstes wird der Analyt-Wert, wie eine Glucose-Ablesung G, mit der Ablese-Stromstärke i&sub2; berechnet, und es wird der berechnete Korrekturterm Δ(i&sub1;, i&sub2;) mit dem ausgewählten Normierungswert k multipliziert, wie bei einem Block 324 angezeigt.

Claims

1. Verfahren zur Steigerung der Genauigkeit der Bestimmung der Konzentration eines Analyt in einer flüssigen Testprobe, wobei man

die flüssige Testprobe auf der Oberfläche einer Arbeitselektrode vorlegt, die elektrochemisch mit einer Bezugselektrode verbunden ist, wobei die Oberfläche eine Zusammensetzung aufweist, umfassend

ein für den Analyt spezifisches Enzym,

einen Mediator, der in Reaktion auf eine Reaktion zwischen dem Analyt und dem Enzym reduziert wird und schon einer Teilreduktion unterzogen worden war,

und man dann die Konzentration des Analyt in der flüssigen Testprobe als Funktion der Stromstärke bestimmt, die durch die flüssige Testprobe hindurchgeht,

indem man die Stromstärke zwischen der Arbeits- und Bezugselektrode misst, welche aus der Menge des reduzierten Mediators resultiert, der während der Lagerung des Sensors bei Umgebungsbedingungen und während der Zeitdauer vor der Stromstärkenmessdauer erzeugt worden war,

dadurch gekennzeichnet, dass

a) ein erstes Potential zwischen den Elektroden angelegt wird, um zumindest einen Teil des Mediators zurück in seine oxidierte Form zu bringen, und

b) das System auf einen offenen Stromkreis oder auf ein Potential übertragen wird, das die Stromstärke herabsetzt, um den Umsatz der elektrochemischen Reaktion an der Arbeitselektrode für eine festgelegte Verzugszeitspanne zu minimieren, und

c) ein zweites Potential zwischen der Arbeits- und Bezugselektrode angelegt wird, um den reduzierten Mediator bei einem Zeitintervall zu oxidieren, das normalerweise im Bereich von 10 bis 40 s nach Anlegen des Potentials liegt, und

d) die Stromstärke an der Arbeitselektrode gemessen wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Genauigkeit der Analyt-Bestimmung weiter gesteigert wird durch:

a) Bestimmung der Stromstärke (i&sub1;) am Ende des Anlegens des ersten Potentialstoßes und der Stromstärke (i&sub2;) am Ende des Anlegens des zweiten Potentialstoßes, und

b) Berechnung der korrigierten Analyt-Gehaltsmenge G durch Lösen der Gleichung:

worin Int das Interzept (der Abschnitt) der Linearfunktion von Stromstärke (i&sub2;) gegen die Konzentration des Analyt und Steigung die Steigung der Linearfunktion von Stromstärke i&sub2; gegen die Konzentration des Analyt, k ein Parameter mit einem Wert von 0 bis 1 und Δ(i1, i&sub2;) ein Fehlerkorrekturterm proportional zum Hintergrund-Fehler sind, der berechnet wird als:

worin: s&sub1; = Steigung der Linearfunktion der Stromstärke i&sub1; gegen die Konzentration des Analyt,

i&sub1;_lo = i&sub1; bei niedrigem Analyt-Gehalt zur Bestimmung von s&sub1; und

i&sub2;_lo = i&sub2; bei niedrigem Analyt-Gehalt zur Bestimmung der Steigung.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Mediator ein Ferricyanid-Salz ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Analyt Glucose ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Stufe des Anlegens des genannten oxidierenden Potentials zwischen den Elektroden die Stufen einschließt, in denen man eine Spannungspotentialselektivität anwendet, die im Bereich von 0,1 bis 0,9 Volt vorgesehen ist, man die gemessene Stromstärke mit einem Schwellenwert vergleicht und ein vorbestimmtes Zeitintervall zum Anlegen des genannten Spannungspotentials identifiziert, das auf eine gemessene Stromstärke reagiert, die größer als der genannte Schwellewert ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die genannte Stufe zur Identifizierung eines vorbestimmten Zeitintervalls einschließt, dass ein festgelegtes Zeitintervall identifiziert wird, das selektiv in einem Bereich von 1 bis 15 s vorgesehen ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die genannte Stufe zur Vorgabe eines ausgewählten Zeitverzugs die Stufe einschließt, dass ein ausgewählter Zeitverzug in einem Bereich von 10 bis 40 s abgewartet wird, bevor das genannte zweite Potential angelegt wird, und wobei das genannte zweite Potential eine ausgewählte Zeitspanne lang in einem Bereich von 5 bis 10 s angelegt wird, bevor die Stufe zur Messung der genannten Stromstärke durchgeführt wird.