DE69614105T2

DE69614105T2 - Lagerstabile hämoglobinlösungen

Info

Publication number: DE69614105T2
Application number: DE69614105T
Authority: DE
Inventors: A. Kerwin; L. Looker
Original assignee: Baxter Biotech Technology SARL
Current assignee: Baxter Biotech Technology SARL
Priority date: 1995-05-02
Filing date: 1996-05-01
Publication date: 2002-03-21
Anticipated expiration: 2016-05-02
Also published as: CA2216382A1; US5929031A; EP0826004B1; EP0826004A1; AU5852096A; DE69614105D1; ATE203546T1; JPH11507016A; AU708264B2; WO1996034889A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft lagerungsbeständige Hämoglobinlösungen und speziell Lösungen, die teilweise desoxidiertes Hämoglobin und Reduktionsmittel enthalten.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der sauerstofführende Anteil der roten Blutzellen ist Hämoglobin, ein tetrameres Proteinmolekül, das aus zwei identischen Alphaglobinen (α&sub1;, α&sub2;), zwei identischen Betaglobinen (β&sub1;, β&sub2;) und vier Hämmolekülen besteht. Ein Hämmolekül ist in jedes der Alpha- und Betaglobine eingebaut, um Alpha- und Beta-Untereinheiten zu ergeben. Häm ist ein makrocyclisches organisches Molekül, das in seinem Zentrum ein Eisenatom enthält; jedes Häm kann sich reversibel mit einem Ligandenmolekül, beispielsweise Sauerstoff, vereinigen.
In einem Hämoglobintetramer ist jeder Alpha-Untereinheit eine Beta-Untereinheit zugeordnet unter Bildung von zwei stabilen Alpha-/Betadimeren, die sich ihrerseits assoziieren, um das Tetramer (ein Homodimer) zu bilden. Die Untereinheiten sind nichtkovalent durch Van-der-Waals-Kräfte, Wasserstoffbindungen und Salzbrücken assoziiert.
Im Nicht-Liganden-Zustand (im desoxidierten oder "Desoxy"- Zustand) bilden die vier Untereinheiten eine quarternäre Struktur, die als "T"-Zustand (T = tense) bekannt ist. Während der Ligandenbindung bleiben die α&sub1;β&sub1;- und α&sub2;β&sub2;- Grenzflächen relativ fixiert, wogegen die α&sub1;β&sub2;- und α&sub2;β&sub1;- Grenzflächen erhebliche Bewegung zeigen. Wenn ein Ligand an das Hämoglobinmolekül gebunden ist, bewegen sich die Globine relativ zueinander, und infolgedessen werden die Distanzen zwischen den Untereinheiten relativ zu den desoxidierten Distanzen größer.
Wenn daher ein Ligand an die Hämgruppen gebunden ist, nimmt das Molekül die entspannte oder quaternäre "R"-Struktur (R = relaxed) an, also die thermodynamisch stabile Form des Moleküls, wenn Liganden an drei oder mehr Häme gebunden sind.
Liganden und insbesondere Sauerstoff binden reversibel an die reduzierte Form des Eisens (Eisen(II), Fe&spplus;²) in dem Häm. Wenn das Eisen in dem Häm zu Fe&spplus;³ (der Eisen(III)-Form von Eisen) oxidiert wird, können Sauerstoff und einige andere Liganden nicht an das Eisen des Häms binden, und das Hämoglobin ist in bezug auf den Sauerstofftransport nichtfunktionell.
Das Eisen in den Hämgruppen kann auf verschiedene Weise oxidiert werden. Beispielsweise kann das Eisen auf einem Weg, der durch Bindung eines Wassermoleküls an das Hämeisen vermittelt wird, oxidieren, so daß Methämoglobin erzeugt wird ("Autoxidation"). Autoxidation kann durch die Anwesenheit von Spurenmetallen in Lösung verstärkt werden.
Methämoglobin kann auch als Ergebnis einer direkten Oxidation durch Chemikalien mit höheren Redoxpotentialen, wie etwa Ferricyanid oder über indirekte Oxidation durch Reduktionsmittel auf einem durch Wasserstoffperoxid vermittelten Weg erzeugt werden (C. E. Castro et al. in: Biochemical and Clinical Aspects of Hemoglobin Abnormalities, Academic Press, Inc., S. 495-503, 1978). Ferner kann Desoxihämoglobin durch Chemikalien, wie Ferricyanid, selbst in Abwesenheit von Sauerstoff zu Methämoglobin oxidiert werden. Das Protein selber kann ebenfalls oxidiert werden, und zwar ohne gleichzeitige Oxidation des Eisens in den Hämgruppen.
Beispielsweise kann Hämoglobin durch Chemikalien, wie etwa Hydrazin, oxidativ denaturiert werden, ohne eine Methämglobin-Zwischenstufe zu durchlaufen (siehe H. F. Bunn und B. G. Forget, Hemoglobin: Molecular, Genetic and Clinical Aspects, W. B. Saunders Company, Philadelphia, S. 634-662, als Übersicht).
Ungeachtet der Produktionsweise ist Methämoglobin eine nichtfunktionelle Form von Hämoglobin, das Sauerstoff oder Kohlenmonoxid nicht binden kann und deutlich veränderte Stickstoffoxid-Bindungscharakteristiken zeigt. Methämoglobinmoleküle sind anfällig für beschleunigten Abbau infolge von Hämichrombildung, Hämverlusten, Ausfällung, Reaktion mit Wasserstoffperoxid unter Bildung von toxischen Radikalen und dergleichen.
Zusätzlich zu der Abnahme der Funktionalität einer Hämoglobinlösung durch die Ausbildung von Methämoglobin können die Proteinanteile des Hämoglobinmoleküls durch oxidative Beschädigung modifiziert und verändert werden. Beispielsweise führt die Oxidation des Eisens des Häms zu der Erzeugung von Wasserstoffperoxid (H. A. Watkins, Bioc. Biophys. Res. Comm. 132: 742-748, 1985) sowie Hyperoxid (J. Thillet und A. M. Michelson, Free Rad. Res. Comms. 1: 89-100, 1985).
Diese aktivierten Sauerstoffspezies können dann das Hämoglobinprotein beispielsweise dadurch beschädigen, daß sie eine Polymerisierung des Moleküls bewirken (J. Thillet, a. a. O.), oder es kann durch einzelne Aminosäuren beschädigt werden, so daß die tertiäre Struktur zerstört wird (R. P. Stefek und M. J. Thomas, Free Rad. Res. Comms. 12-13: 489-497, 1991).
Diese Veränderungen können in einer erhöhten Immunogenität resultieren (M. Riechlin, Adv. Immunol. 20: 71-132, 1975; R. W. Noble et al., Bioc. 11: 3326-3332, 1972). Schließlich kann eine Beschädigung, die aus aktivierten Sauerstoffspezies unabhängig von der Quelle resultiert, zu einer oxidativen Denaturierung des Moleküls und seiner Ausfällung führen.
Daher ist bei der Lagerung von Hämoglobinlösungen die Vermeidung einer Oxidation, und zwar entweder des Proteins selbst oder der Hämgruppen innerhalb des Proteins, erforderlich, um die Funktionalität und die tertiäre und quarternäre Struktur von Hämoglobin in Lösung aufrechtzuerhalten und die Immunogenität zu begrenzen.
Es ist seit langem bekannt, daß Hämoglobinlösungen Methämoglobin langsamer bilden, wenn sie unter desoxidierten Bedingungen anstelle von oxidierten Bedingungen gelagert sind (Antonini und Brunori, Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands, North Holland Publishing Company, Amsterdam 13-39, 1971; E. E. Di Iorio, Meth. Enzymol. 76: 57- 72, 1981).
Die Konservierung von Hämoglobin unter desoxidierten Bedingungen ist jedoch mit erheblichen technischen Schwierigkeiten behaftet (E. E. Di Iorio, Meth. Enzymol. 76: 57-72, 1981) oder verlangt die Zugabe von potentiell toxischen Chemikalien. Ferner ist die Wahl von exogenen chemischen Mitteln äußerst schwierig, weil diese Additive in Abhängigkeit von den Bedingungen der Lösung und von unvorhersehbaren Protein/Agens-Wechselwirkungen als Oxidantien oder Reduktionsmittel wirken können (M. J. Akers, J. Parent. Sci. Tech. 36: 222-228, 1982).
Im Fall von Hämoglobinlösungen wird die Wahl eines exogenen chemischen Mittels, das als Reduktionsmittel wirkt, weiter dadurch kompliziert, daß nicht alle Reduktionsmittel Hämoglobin reduzieren können und einige Reduktionsmittel in einer gegebenen Hämoglobinformulierung als Oxidantien wirken können (P. Eyer, Mol. Pharmacol. 11: 326-334, 1974 K. Kikugawa, Chem. Pharm. Bulletin 29: 1382-1389, 1981; L. P. Stratton, Hemoglobin 12: 353-368, 1988).
Wenn das exogene chemische Mittel tatsächlich so wirkt, daß es die Bildung von Methämoglobin in Lösung reduziert, können unerwartete Nebenreaktionen auftreten, die die Proteinstruktur beeinträchtigen können (Antonini und Brunori, Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands, North Holland Publishing Company, Amsterdam 13-39, 1971).
Um die Notwendigkeit von exogenen Reduktionsmitteln während der Lagerung zu verringern oder zu beseitigen, hat Nho (PCT- Dokument WO 92/08478) eine Vorrichtung konstruiert, die die rasche Desoxidation von Hämoglobinlösungen gestattete. Hämoglobinlösungen wurden desoxidiert, indem die Lösung durch eine Seite einer Gasaustauscheinrichtung geleitet und ein Inertgas, Stickstoff, an der anderen Seite einer gasdurchlässigen Membran vorbeigeleitet wurde.
Das Hämoglobin wurde im Kreislauf geführt, bis es zu mindestens 90% desoxidiert war. Der Hämoglobinlösung wurden keine exogenen Reduktionsmittel zugefügt; die Oxidation wurde zwar nicht vollständig eliminiert, aber sie wurde durch sorgfältiges Entfernen von Sauerstoff in der Hämoglobinlösung verlangsamt.
Es gab somit keine Einleitung von chemischen Reduktionsmitteln, die zu unvorhersehbaren biologischen Antworten führen könnten, wenn sie in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden, oder die mit dem Hämoglobin selber auf unvorhersehbare Weise in Reaktion treten könnten.
Eine andere Möglichkeit der Lagerung von Hämoglobinlösungen wurde von R. L. Kandler und J. C. Spicuzza (US-PS 5 352 773 und PCT-Veröffentlichung WO 92/02239) beschrieben. Sie verwendeten die Eigenfähigkeit einer gereinigten, Diaspirinvernetzten Hämoglobinlösung zur "Autoreduktion" in Abwesenheit aller exogenen chemischen Reduktionsmittel.
Bei ihren Lösungen wurden Methämoglobinkonzentrationen dadurch reduziert, daß die Lösungen in sauerstoffundurchlässigen Behältern, die eine Umverpackung hatten, gelagert wurden. Einige dieser umverpackten Behälter enthielten Sauerstoff-Fängerbeutel, die zwischen der Umverpackung und dem inneren Behälter angeordnet waren.
Methämoglobinkonzentrationen bis zu 50% konnten auf Werte bis hinunter zu 1,5% nur durch Lagerung verringert werden, solange während der Lagerdauer der Lösung Sauerstoff rigoros von den Behältern ausgeschlossen wurde. Diese Verfahrensweise war nicht davon abhängig, ob die Ausgangslösung vor der Lagerung desoxidiert wurde oder nicht.
Obwohl also diese Verfahrensweise keine Zugabe von exogenen Reduktionsmitteln erforderte, wurde das Material doch über lange Zeiträume gehalten, um sicherzustellen, daß Methämoglobin auf klinisch akzeptable Werte verringert wurde, und/oder es wurde bei relativ hohen Temperaturen gehalten. Eine verlängerte Lagerdauer oder die Lagerung bei erhöhten Temperaturen könnte in Modifikationen der Hämoglobinstruktur oder dem Wachstum von Mikroorganismen resultieren, wenn die Sterilisation unzureichend ist.
Die Desoxidation von Hämoglobinlösungen allein kann den Hämoglobinlösungen keine ausreichende Stabilität verleihen, um eine Langzeitlagerung insbesondere bei Raumtemperatur zuzulassen. Beispielsweise hat DeVenuto (F. DeVenuto, J. Lab. Clin. Med. 92: 946-952, 1978) festgestellt, daß desoxidierte Hämoglobinlösungen eine raschere Methämoglobinbildung zeigten als vergleichbare Lösungen, die in Anwesenheit von Sauerstoff gelagert wurden. Ferner konnte er keine Lösung zeigen, die bei Raumtemperatur Stabilität aufwies.
Ascorbat (Ascorbinsäure oder Vitamin C) wird im allgemeinen sowohl in pharmazeutischen Zusammensetzungen als auch als ein Reagens zur Desoxidation oder wegen seiner Wirkung als Antioxidans in Hämoglobinzusammensetzungen eingesetzt. Als Arzneimittel wird Ascorbat direkt verabreicht, um Methämoglobinämie in vivo zu behandeln (M. Kiese, Methemoglobinemia: A Comprehensive Treatise, CRC Press, Inc., Cleveland, Ohio, S. 23, 1974; J. Deeny et al., Br. Med. J. 1: 721-723, 1943).
Ascorbat wird als Konservierungsmittel und Stabilisator in vielen Proteinlösungen, insbesondere in Proteinen, die aus Blutprodukten abgeleitet sind, eingesetzt. Beispielsweise hat G. P. Wiesehahn et al. (US-PS 4 727 027) die Dekontaminierung von Lösungen von biologisch wirksamen Proteinen, die von Blut oder Blutbestandteilen abgeleitet waren, insbesondere Faktor VIII, durch Fotodekontaminierung beschrieben.
Dort wurden Lösungen von Faktor VIII vor der Fotodekontaminierung durch Desoxidation der Lösungen entweder durch die Zugabe hoher Konzentrationen von Sauerstoffängern wie etwa 10 mM Ascorbat, durch Spülen mit Inertgasen oder sowohl durch Zugabe von Sauerstoffängern als auch Spülen mit Inertgas stabilisiert. Österber et al. (PCT-Veröffentlichung WO 94/26286) beschreibt ebenfalls eine stabilisierte desoxidierte Formulierung von Faktor VIII, verstärkt mit Antioxidantien, wie Glutathion, Acetylcystein, Methionin, Tocopherol, Butylhydroxytoluol, Butylhydroxyanisol oder Phenolverbindungen.
Diese Antioxidantien sind zwar für den Einsatz in niedrigen Dosierungen geeignet und eignen sich somit für die kleinen Dosisvolumen von Faktor VIII, viele dieser Antioxidantien können jedoch in hohen Dosen toxisch sein und eignen sich daher nicht zum Einsatz in Formulierungen, in denen hohe Volumen eines Therapeutikums, beispielsweise Hämoglobin, verabreicht werden könnten.
Außerdem erwähnt die Anmeldung nichts über die Wechselwirkung zwischen den Antioxidantien und Hämoglobin. Es ist zu beachten, daß Österber et al. berichten, daß die Zugabe von Ascorbat zu einer desoxidierten Lösung von Faktor VIII in einer verringerten Stabilität von Faktor VIII resultierte.
Bereits in den 1940er Jahren wurden hohe Ascorbatkonzentrationen eingesetzt, um Methämoglobin in Hämoglobinzusammensetzungen zu verringern (Q. H. Gibson, Bioc. J. 37: 615-618, 9143). Die Wechselwirkungen zwischen Ascorbat und Hämoglobin sind jedoch unvorhersehbar. Beispielsweise bemerken Kikugawa et al. (K. Kikugawa et al., Chem. Pharm. Bull. 29: 1382-1389, 1981), daß Ascorbat als Prooxidans wirkt und tatsächlich die Oxidation verstärkte, wenn es oxidierten Formulierungen von Hämoglobin hinzugefügt wurde.
Kramlov et al. (M. Kramlovä et al., Haematologia 10: 365-371, 1976) und Stratton et al. a. a. O. wiesen darauf hin, daß die Zugabe von Ascorbat zu Hämoglobinlösungen ebenfalls zu einer verstärkten Oxidation anstatt in inem Schutz vor Oxidation führte.
Ascorbat in relativ hohen Konzentrationen wird mit einigem Erfolg zur Stabilisierung von desoxidierten Hämoglobinläsungen eingesetzt. Beispielsweise verwendeten Bonhard et al. (US-PS 4 777 244) Ascorbat als einen Sauerstoffänger in einer Hämoglobinlösung, bevor das desoxidierte Hämoglobin vernetzt wurde. Sie betonten die Notwendigkeit der Verwendung großer Mengen Ascorbat (wenigstens 4 mol Ascorbat je Mol Hämoblogin), um sicherzustellen, daß der gesamte Sauerstoff in der Hämobloginlösung entfernt wurde.
Kothe et al. (N. Kothe, B. Eichentopf und K. Bonhard, Surg Gyn. Obst. 161: 563-569, 1985) verwendeten ebenfalls Ascorbat, um eine desoxidierte Hämoglobinlösung zu stabilisieren. Diese Autoren verwendeten 5,45 mM Ascorbat in einer 8,5 g/dl Hämoglobinlösung (-4 Mol Ascorbat pro Mol Hämoglobin) und berichteten über keine signifikante Ausbildung von Methämoglobin in der Hämoglobinlösung nach Lagerung für ein Jahr bei 4ºC.
Clerc et al. (Y. Clerc et al., Service de Sante des Armees Trav. Scient. 8: 211, 1987) berichteten ähnliche niedrige Werte der Methämoglobinbildung in einer Formulierung, die auf der Kothe-Lösung basierte (4 : 1 Molverhältnis Ascorbat zu Hämoglobin), während der Lagerung über 11 Monate bei 4ºC.
Kikugawa et al. a. a. O. berichteten, daß verdünnte (250 mg/dl) desoxidierte Hämoglobinlösungen, die mit 5 mM Ascorbat (~13 : 1 Molverhältnis Ascorbat zu Hämoglobin) behandelt wurden, während der 60 Minuten ihrer Untersuchung stabil waren. Eine Langzeitstabilität von desoxidierten, Ascorbat enthaltenden Lösungen wurde von diesen Autoren nicht erörtert.
Nho et al. (US-PS 5 234 903) verfolgten die Bildung von Methämoglobin in einer desoxidierten Rinderhämoglobinlösung von 5-6 g/dl und fanden, daß 30 mM Cystein zur Verhinderung der Bildung von Methämoglobin fünfmal wirksamer war als die gleiche Menge Ascorbat (-35 : 1 Molverhältnis Ascorbat: Hämoglobin). Ferner führte die Zugabe von Ascorbat zu ihrer Hämoglobinlösung zu einer erheblichen Freisetzung von freiem Eisen.
Tatsächlich erörterte Estep das Erfordernis, daß Reduktionsmittel, die Hämoglobinlösungen zugefügt werden, höhere Redoxpotentiale haben müssen als Ascorbat, um diese Lösungen unter desoxidierten Bedingungen zu halten; Ascorbat ist einfach nicht ausreichend reduzierend, um die Desoxidierung von Hämoglobinlösungen aufrechtzuerhalten (T. N. Estep, US-PS 4 861 867). Es ist zu beachten, daß alle Zusammensetzungen, die Ascorbat als ein Antioxidans oder als Sauerstoffänger eingesetzt haben, mindestens ein 4 : 1-Molverhältnis von Ascorbat : Hämoglobin verwendeten.
Die Lagerhaltung von bereits bekannten Hämoglobinformulierungen bei Raumtemperatur hat sich als problematisch erwiesen (P. E. Keipert und T. M. S. Chang, Biomat., Art. Cells, Art. Org., 16: 185-196, 1988; S. M. Christensen et al., J. Bioc. Biophys. Meth. 17: 143-154, 1988; G. L. Moore et al., Artif. Organs 16: 513-518, 1992). Vor kurzem konnten jedoch Kandler und Spicussa (PCT-Veröffentlichung WO 92/02239) und Nho (PCT-Veröffentlichung WO 92/08478) die langsame oder nicht vorhandene Bildung von Methämoglobin in Hämoglobinlösungen zeigen, die unter desoxidierten Bedingungen ohne Zugabe von exogenen chemischen Reduktionsmitteln bei Raumtemperatur für Zeiträume bis zu 10 Monaten gelagert wurden. Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, daß Hämoglobin signifikante Modifikationen erfährt, die physiologische Implikationen haben können, und zwar sogar vor dem Auftreten von signifikanten Mengen an Methämoglobin. Ferner wurde erkannt, daß eine Beziehung zwischen der Sauerstoffmenge in einer Hämoglobinformulierung und der Menge an Ascorbat besteht, die zur Stabilisierung des Hämoglobins erforderlich ist. Ferner wurde überraschend erkannt, daß bestimmte Verhältnisse von Hämoglobin, Reduktionsmittel und Sauerstoff die Stabilität von Hämoglobin während der Lagerhaltung verbessern.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft lagerungsbeständige Hämoglobinzusammensetzungen, die teilweise desoxidierte Hämoglobinlösungen und weniger als 4 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hämoglobin, bevorzugt weniger als 3 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hämoglobin, und besonders bevorzugt weniger als 2 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hämoglobin aufweisen.
Das Reduktionsmittel ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus Dithionit, Natriumborhydrid und Ascorbat besteht, und ist am meisten bevorzugt Ascorbat. Die teilweise desoxidierte Hämoglobinlösung enthält weniger als 5000 ppm Sauerstoff, bevorzugt weniger als 500 ppm Sauerstoff, am meisten bevorzugt weniger als 150 ppm.
Die lagerungsstabile Hämoglobinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist für mindestens drei Monate, stärker bevorzugt für mindestens sechs Monate und am meisten bevorzugt für mindestens ein Jahr lagerungsstabil. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können bei Temperaturen von weniger als ca. 40ºC, stärker bevorzugt bei weniger als ca. 25ºC oder ca. 4ºC oder weniger in Abhängigkeit von dem beabsichtigten Gebrauch und den gewünschten Lagerungsbedingungen gelagert werden.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung Formulierungen bereit, die teilweise desoxidiertes Hämoglobin, weniger als 4 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hämoglobin, pharmazeutisch akzeptable Träger und Chelatbildner mit einem pH-Wert zwischen ca. 6,5 und 9,5, bevorzugt pH-Wert 6,6 bis 7,8, am meisten bevorzugt pH-Wert 6,8 bis 7,6, aufweisen. Bevorzugt ist der Chelatbildner EDTA oder DTPA, stärker bevorzugt ist der Chelatbildner EDTA.
Die vorliegende Erfindung gibt Verfahren für die Herstellung der lagerungsbeständigen Hämoglobinzusammensetzung der Erfindung an, die das Vereinigen eines Reduktionsmittels mit teilweise desoxidierten Hämoglobinlösungen in Verhältnissen von weniger als 4 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hämoglobin aufweisen. Verfahren zur teilweisen Desoxidation einer Hämoglobinlösung umfassen Gas-Flüssigkeit-Kontaktverfahren. Außerdem gibt die vorliegende Erfindung Systeme zur Lagerung von Hämoglobinlösungen an. Die Systeme umfassen die lagerungsbeständigen Hämoglobinzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in geeigneten Behältern.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Diagramm des Beta/Dialpha-Verhältnisses auf der y-Achse und der Ascorbatkonzentration in mM auf der x-Achse. Die Beta/Dialpha-Verhältnisse wurden aus Umkehrphase-HPLC-Chromatogrammen bestimmt. Proben wurden 21 Tage nach Lagerung mit 150 ppm Sauerstoff (-o-), 1000 ppm Sauerstoff (-·-), 5000 ppm Sauerstoff (- -) und 15.000 ppm Sauerstoff (- -) analysiert. Niedrigere Werte für das Beta/Dialpha- Verhältnis bedeuten eine größere Menge an modifiziertem Betaglobin.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft lagerungsbeständige Hämoglobinlösungen, die teilweise desoxidiert sind und weniger als 4 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hämoglobin enthalten, und Verfahren zum Herstellen solcher lagerungsbeständigen Hämoglobinlösungen.
Hämoglobin kann frei in Lösung oder in Lösung in einer natürlich vorkommenden oder künstlichen Zelle (z. B. Liposomen) sein und kann aus natürlichen, synthetischen oder Rekombinationsquellen gewonnen werden. Beispielsweise erzeugen Schlachthöfe sehr große Mengen an Hämoglobin enthaltendem Blut. Bestimmte Spezies oder Rassen von Tieren, die ein Hämoglobin erzeugen, das für einen bestimmten Gebrauch besonders geeignet ist, können speziell gezüchtet werden, um Hämoglobin zu liefern.
Transgene Tiere können produziert werden, die nichtendogenes Hämoglobin exprimieren (J. S. Logan et al., PCT-Anmeldung PCT/US92/05000). Humanhämoglobin kann aus menschlichem Blut, dessen Verfallsdatum abgelaufen ist und das nach einem bestimmten Ablaufdatum beseitigt werden muß, gewonnen werden.
Zusätzlich zu der Extraktion aus tierischen Quellen können die Gene, die für Untereinheiten eines gewünschten natürlich auftretenden oder Mutantenhämoglobins codieren, geklont werden, in einem geeigneten Exprimierungsvektor plaziert und in einen Organismus, wie etwa einen Mikroorganismus, ein Tier oder eine Pflanze oder in gezüchtete tierische oder pflanzliche Zellen oder Gewebe eingebracht werden.
Diese Organismen können unter Anwendung von üblichen Rekombinations-DNA-Techniken erzeugt werden, und das von diesen Organismen erzeugte Hämoglobin kann dann exprimiert und gesammelt werden, wie beispielsweise von S. J. Hoffman und K. Nagai in US-PS 5 028 588 und Hoffman et al., WO 90/13645, die beide summarisch eingeführt werden, beschrieben wird.
Die Reinigung von Hämoglobin von jeder Quelle kann unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann Hämoglobin aus menschlichen Erythrozyten, deren Verfallsdatum abgelaufen ist, durch Hämolyse von Erythrozyten, gefolgt von Chromatographie, (K. Bonhard et al., US-PS 4 439 357; J. L. Tayot et al. EP-Veröffentlichung 0 132 178; J. C. Hsia, EP-Patent 0231 236 B1), durch Filtration (S. F. Rabiner (1967) et al., J. Exp. Med. 126 : 1127-1142; N. Kothe und B. Eichentopf, US-PS 4 562 715), Erhitzen (T. N. Estep, PCT-Veröffentlichung PCT/US89/014890, T. N. Estep, US-PS 4 861 867), Ausfällung (R. S. Simmonds und W. P. Owen, US-PS 4 401 652; R. W. Tye, US-PS 4 473 494) oder Kombinationen dieser Techniken (C. W. Rausch und M. Feola, EP 0 277 289 B1) isoliert und ausgereinigt werden.
Rekombinationshämoglobine, die in transgenen Tieren erzeugt wurden, sind durch Chromatofokussieren gereinigt worden (T. M. Townes und McCune, PCT-Veröffentlichung PCT/US/09624), während solche, die in Hefe und Bakterien erzeugt wurden, durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt wurden (S. J. Hoffman und K. Nagai in US-PS 5 028 588 und Hoffman et al., WO 90/13645).
Das Hämoglobin kann durch genetische oder chemische Mittel für spezielle Einsatzzwecke entweder vor, während oder nach der Ausreinigung modifiziert werden. Beispielsweise kann die Sauerstoffaffinität durch chemische Modifikation oder genetische Modifikation des Hämoglobins durch die Einführung von geeigneten Mutationen verändert werden.
Das Hämoglobin kann chemisch vernetzt oder genetisch gekoppelt oder sowohl chemisch vernetzt als auch genetisch gekoppelt werden, um die Dissoziation des Moleküls in Alpha/Beta- Untereinheiten (Dimerisation) zu verhindern, Hämverluste zu vermeiden oder das Molekül zu vergrößern.
Hämoglobinlösungen können durch alle im Stand der Technik bekannten Mittel teilweise desoxidiert werden. Die Behandlung von Hämoglobinlösungen mit einem Inertgas wie etwa Stickstoff oder Argon ist eine solche Möglichkeit. Dies kann erreicht werden unter Anwendung von Gas-Flüssigkeit- Kontaktierungsverfahren, wobei Sauerstoff aus einer Lösung in eine Nichtsauerstoff-Gasphase transportiert wird.
Einige Optionen für die Gas-Flüssigkeit-Kontaktierung umfassen die folgenden: Füllkörperkolonnen, in denen das Nichtsauerstoffgas nach oben geleitet wird, während eine Lösung durch ein Füllkörperbett nach unten tröpfelt; Bodenkolonnen ähnlich Füllkörperkolonnen, die jedoch eine Serie von horizontalen Platten enthalten, die die Lösung auffangen; Kolonnen mit benetzten Wänden, in denen eine Lösung als Film an einer Anordnung von vertikalen Röhren nach unten fällt; Gasaustauschmembranen, wobei Sauerstoff über eine dünne Membran transportiert wird, die auf der einen Seite Flüssigkeit und auf der anderen Seite ein Nichtsauerstoffgas zurückhält; gasbesprühte Behälter, in denen Nichtsauerstoffgasblasen durch einen die Lösung enthaltenden Behälter nach oben steigen; zyklische Druckbeaufschlagung, wobei ein die Lösung enthaltender Behälter zyklisch mit einem Nichtsauerstoffgas unter Druck gesetzt und dann gelüftet wird, um das Gas freizusetzen und die Bildung von Blasen in der Lösung zu induzieren; und Flüssigkeitszerstäubung, wobei die Lösung in eine Kammer gesprüht wird, die ein Nichtsauerstoffgas enthält.
Eine weitere Möglichkeit zur Desoxidation sind Flüssig- Flüssig-Kontaktierungsverfahren, wobei zwei nichtmischbare Flüssigkeiten miteinander vermischt werden, von denen eine keinen gelösten Sauerstoff enthält, wobei aber Sauerstoff in dieser Flüssigkeit leicht gelöst wird. Nachdem die zweite Flüssigkeit den Sauerstoff absorbiert hat, können die Flüssigkeiten mittels Schwerkraft oder in einer Zentrifuge getrennt werden.
Eine dritte Möglichkeit zur Desoxidation ist die Sorption, wobei Feststoffteilchen mit einer großen inneren Oberfläche, die gelösten Sauerstoff adsorbieren, beispielsweise Molekularsiebe, einer Lösung zugefügt werden. Nach der Sorption können die Feststoffteilchen mit einer Zentrifuge oder einem Filter aus der Lösung abgeschieden werden.
Von diesen Techniken ist eine besonders brauchbare Technik die Anwendung einer Füllkörperkolonne, wobei die Lösung dadurch desoxidiert wird, daß man eine mit Sauerstoff angereicherte Hämoglobinlösung über die Kolonne fließen läßt, während gleichzeitig ein Inertgas im Gegenstrom zu dem Strom der Hämoglobinlösung geleitet wird. Das Inertgas ist irgendein Gas, das nicht an die Hämgruppe eines Hämoglobinmoleküls gebunden wird, beispielsweise Argon- oder Stickstoffgas.
Bei einer anderen Ausführungsform wird die Lösung desoxidiert, indem eine Hämoglobinlösung wiederholt evakuiert und die Hämoglobinformulierung mit einem Inertgas, wie etwa Argon- oder Stickstoffgas gespült wird, bis die gewünschte Restsauerstoffkonzentration erreicht ist, um eine teilweise desoxidierte Hämoglobinlösung zu erzeugen.
Eine teilweise desoxidierte Hämoglobinlösung ist eine solche, die weniger als ca. 5000 ppm Sauerstoff im Kopfraum enthält. Der Restsauerstoff in der Hämoglobinlösung ist bevorzugt weniger als ca. 1000 ppm, stärker bevorzugt weniger als ca. 500 ppm und noch stärker bevorzugt weniger als ca. 150 ppm.
Der Restsauerstoff im Kopfraum kann mit allen im Stand der Technik bekannten Mitteln gemessen werden, beispielsweise durch Probenahme im Kopfraum und Messung des Sauerstoffs im Kopfraum unter Verwendung eines geeignet ausgestatteten Gaschromatographen oder eines Zirkon-basierten Detektors. Beispielsweise kann die Restsauerstoffkonzentration durch Probenahme der Füllumgebung unter Verwendung eines "MOCON"- Analysators (Mocon, Minneapolis, MN) bestimmt werden.
Die Füllumgebung ist diejenige Umgebung, in der das Hämoglobin für die Lagerung vorbereitet wird, wie etwa in Beispiel 2 beschrieben wird. Füllumgebungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Manipulationskammern, Handschuharbeitskästen oder jede geeignete Umgebung, in der die Restsauerstoffwerte kontrolliert werden. Der Kopfraum über der Hämoglobinformulierung wird als im Gleichgewicht mit der Füllumgebung betrachtet.
Wenn im Behälter kein Kopfraum vorhanden ist, wird die Lösung als unmittelbar mit der Füllumgebung im Gleichgewicht betrachtet. Wenn die Lösung in einen Behälter eingebracht ist, der vor dem Befüllen evakuiert wurde, wird das Hämoglobin als im Gleichgewicht mit dem letzten Gas, mit dem es in Kontakt war, betrachtet.
Zusätzlich zu dem teilweise desoxidierten Hämoglobin enthalten die Lösungen der vorliegenden Erfindung auch Reduktionsmittel. Solche Reduktionsmittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Dithionit, Eisen(II)-Salze (beispielsweise Eisen(II)-Pyrophosphat), Natriumborhydrid sowie andere Borhydride, Alphatocopherol und Ascorbat oder Salze davon.
Wenn die Hämoglobinlösung der vorliegenden Erfindung ein Pharmazeutikum ist, dann ist das Reduktionsmittel bevorzugt ein pharmazeutisch akzeptables Reduktionsmittel. Wenn die Hämoglobinlösung der vorliegenden Erfindung auf einem nichtpharmazeutischen Gebiet anzuwenden ist, dann kann das Reduktionsmittel jedes Reduktionsmittel sein, wobei es keine Rolle spielt, ob es pharmazeutisch akzeptabel ist. Bevorzugt ist das Reduktionsmittel Natriumascorbat.
Das Reduktionsmittel kann vor oder nach der teilweisen Desoxidation zugefügt werden. Bevorzugt wird das Reduktionsmittel nach Erreichen des Soll-Restsauerstoffwerts in der Hämoglobinformulierung zugefügt. Das Reduktionsmittel kann zwar in flüssiger oder fester Form vorliegen, es ist jedoch besonders gut brauchbar, wenn es in einer gründlich desoxidierten konzentrierten flüssigen Lösung vorliegt. Die Reduktionsmittelmenge in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist geringer als 4 Mol/Mol Hämoglobin, stärker bevorzugt geringer als 2 Mol Reduktionsmittel/Mol Hämoglobin.
Die Formulierungen können zusätzlich zu der teilweise desoxidierten Hämoglobinlösung weitere Bestandteile und eines oder mehrere Reduktionsmittel aufweisen. Die Hämoglobinlösung der Erfindung kann in jeder Zusammensetzung formuliert sein, die für pharmazeutische oder nichtpharmazeutische Einsatzzwecke geeignet ist.
Beispielsweise kann eine parenterale therapeutische Zusammensetzung sterile isotonische Kochsalzlösung aufweisen, die zwischen 0,001% und 90% (w/v) Hämoglobin enthält. Geeignete Zusammensetzungen können auch 0-200 M von einem oder mehreren Puffern (beispielsweise Acetat-, Phosphat-, Citrat-, Hydrogencarbonat- oder Good-Puffer) aufweisen. Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumacetat, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid können ebenfalls in den Zusammensetzungen der Erfindung in Konzentrationen von 0-2 M enthalten sein.
Außerdem können die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung 0-2 M von einem oder mehreren Kohlenhydraten (beispielsweise reduzierende Kohlenhydrate, wie Glukose, Maltose, Laktose, oder nichtreduzierende Kohlenhydrate, wie Saccharose, Trehalose, Raffinose, Mannitol, Isosaccharose oder Stachyose) und 0-2 M von einem oder mehreren Alkoholen oder Polyalkoholen (wie Polyethylenglykole, Propylenglykole, Dextrane oder Polyole) aufweisen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können außerdem 0,005-1% von einem oder mehreren Tensiden und 0-200 uM von einem oder mehreren Chelatbildnern (beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ethylenglykol-bis (β-aminoethylether)N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA), o-Phenanthrolin, Diethylamintriaminpentaessigsäure (DTPA (auch als Pentaessigsäure bekannt))und dergleichen aufweisen. Die Zusammensetzungen der Erfindung können ferner einen pH-Wert-Wert von ca. 6,5-9,5 haben.
Bei einer anderen Ausführungsform enthält die Zusammensetzung 0-300 mM von einem oder mehreren Salzen, beispielsweise Chloridsalzen, 0-100 mM von einem oder mehreren nichtreduzierenden Zuckern, 0-100 mM von einem oder mehreren Puffern, 0,01-0,5% von einem oder mehreren Tensiden und 0-150 uM von einem oder mehreren Chelatbildnern.
Bei noch einer anderen Ausführungsform enthält die Zusammensetzung 0-150 mM NaCl, 0-10 mM Natriumphosphat und 0,01- 0,1% Tensid, sowie 0-50 pE von einem oder mehreren Chelatbildnern, pH-Wert 6,6-7, 8. Am meisten bevorzugt weist die Hämoglobin enthaltende Zusammensetzung 5 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 0,025% bis 0,08% Polysorbat 80 und 25 uM EDTA, pH-Wert 6,8-7,6, auf.
Weitere Additive zu der Formulierung können Bakterienschutzmittel, onkotische Druckmittel (z. B. Albumin oder Polyethylenglykole) und andere für die Formulierung akzeptable Salze, Zucker und Arzneimittelträger sein, die auf dem Gebiet bekannt sind. Jede Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich Bestandteile aufweisen, die Träger, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze und andere Materialien, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, umfassen, wobei deren Wahl von dem speziellen zu erreichenden Zweck und den Eigenschaften solcher Additive abhängt, die vom Fachmann ohne weiteres bestimmt werden können.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können mit jedem bekannten Verfahren formuliert werden. Solche Formulierungsverfahren umfassen beispielsweise einfaches Vermischen, sequentielle Zugabe, Emulgierung, Diafiltration und dergleichen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können beispielsweise zur subkutanen, intravenösen oder intramuskulären Injektion, zur topischen oder oralen Verabreichung, als großvolumige parenterale Lösungen, die als Blutersatzmittel brauchbar sind, usw. einsetzbar sein. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können auf jede herkömmliche Weise, wie etwa durch orale oder Aerosol-Verabreichung, durch transdermale oder Schleimhaut-Adsorption oder durch Injektion verabreicht werden.
Nichtpharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können beispielsweise als Referenzstandards für analytische Instrumente, die solche Referenzstandards benötigen, als Reagenzlösungen, zur Kontrolle des Gasgehalts von Zellkulturen, beispielsweise durch in-vitro-Abgabe von Sauerstoff an eine Zellkultur, und zum Entfernen von Sauerstoff aus Lösungen brauchbar sein.
Bei einer Ausführungsform können die Zusammensetzungen zum Gebrauch bei therapeutischen Anwendungen formuliert sein. Beispielsweise können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung in Zusammensetzungen verwendet werden, die als Ersatz für Erythrozyten auf jedem Anwendungsgebiet, auf dem Erythrozyten eingesetzt werden, dienen.
Solche Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung, die als Erythrozytenersatz formuliert sind, können für die Behandlung von Blutungen eingesetzt werden, bei denen Blutvolumen verlorengeht und sowohl Fluidvolumen als auch die Sauerstofführungskapazität ersetzt werden müssen.
Da die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung pharmazeutisch akzeptabel gemacht werden können, können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung ferner nicht nur als Blutersatzstoffe, die Sauerstoff abgeben, sondern auch als einfache Volumenvergrößerer eingesetzt werden, die aufgrund der Anwesenheit des großen Hämoglobinproteinmoleküls onkotischen Druck liefern.
Eine typische Dosis von Hämoglobin als Blutersatzstoff ist zwischen 10 mg und 5 g oder mehr von extrazellulärem Hämoglobin pro Kilogramm Körpergewicht eines Patienten. Somit liegt eine typische Dosis für einen menschlichen Patienten zwischen einigen Gramm und mehr als 350 Gramm.
Es versteht sich, daß der in einer individuellen Dosis jeder Dosierungsform enthaltene Einheitsgehalt an wirksamen Bestandteilen nicht selbst eine wirksame Menge bilden muß, da die erforderliche wirksame Menge durch Verabreichung einer Vielzahl von Gaben als Injektionen usw. erreicht werden könnte.
Die Dosiswahl ist von der angewandten Dosierungsform, dem behandelten Zustand, dem jeweiligen zu erreichenden Ziel entsprechend der Bestimmung durch den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet abhängig.
Die Verabreichung von extrazellulärem Hämoglobin kann über einen Zeitraum von Sekunden bis Stunden in Abhängigkeit von dem Zweck des Hämoglobineinsatzes erfolgen. Beispielsweise ist im Fall des Gebrauchs als Blutabgabevehikel der gewöhnliche Zeitablauf der Verabreichung so rasch wie möglich. Typische Infusionsraten für Hämoglobinlösungen als Blutersatzstoffe können zwischen ca. 100 ml und 3000 ml/h liegen. Bei Verwendung zur Stimulation der Blutbildung kann die Verabreichung jedoch zwischen nur einigen Sekunden und fünf Minuten liegen, und daher können die Verabreichungsraten langsamer sein, weil die Hämoglobindosierung wesentlich kleiner als im Fall von Dosierungen ist, die zur Behandlung von Blutverlusten erforderlich sein können.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann die Formulierung der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Anämie eingesetzt werden, indem sowohl eine zusätzliche Sauerstofführungskapazität bei einem an Anämie leidenden Patienten als auch eine Stimulation der Blutbildung erfolgt. Da außerdem die Verteilung des Hämoglobins im Gefäßsystem nicht durch die Größe der Erythrozyten begrenzt ist, kann das Hämoglobin der vorliegenden Erfindung zum Transport von Sauerstoff in Gebiete genutzt werden, in die Erythrozyten nicht eindringen können.
Diese Bereiche können alle Gewebsbereiche umfassen, die an der Abstromseite von Obstruktionen des Erythrozytenflusses liegen, wie etwa Bereiche an der Abstromseite von Thromben, Sichelzellenokklusionen, Arterienokklusionen, Angioplastieballonen, chirurgischen Instrumenten oder allen Geweben, die entweder an einem Sauerstoffmangel leiden oder hypoxisch sind. Ferner können unter Einsatz der vernetzten Hämoglobine gemäß der vorliegenden Erfindung alle Arten von Gewebsischämie behandelt werden.
Solche Gewebsischämien umfassen beispielsweise Schlaganfall, entstehenden Schlaganfall, vorübergehende ischämische Anfälle, Herzmuskelbetäubung und Hibernation, akute oder instabile Angina pectoris, entstehende Angina pectoris, Herzinfarkt und dergleichen. Wegen der breit gestreuten Verteilung im Körper können die Hämoglobine der vorliegenden Erfindung auch zur Abgabe von Arzneistoffen und für die Abbildung in vivo eingesetzt werden.
Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch als Ersatz für Blut eingesetzt werden, das während Operationen entfernt wird, wobei das Blut des Patienten entfernt und zur Reinfundierung am Ende der Operation oder während der Erholungsphase aufbewahrt wird (akute normovolämische Blutverdünnung oder Blutvermehrung).
Da das Hämoglobin der vorliegenden Erfindung Stickstoffoxide und andere Nichtsauerstoffliganden sowie Sauerstoff binden kann, sind die Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung auch für die Bindung oder Abgabe von Stickstoffoxid oder Nichtsauerstoffliganden einsetzbar.
Diese Nichtsauerstoffliganden können sowohl in vivo als auch in vitro gebunden oder abgegeben werden. Beispielsweise kann das Hämoglobin der vorliegenden Erfindung dazu dienen, überschüssiges Stickstoffoxid aus einem lebenden System zu entfernen. Überschüssiges Stickstoffoxid liegt bei Zuständen vor, die von Hypotonie bis zu septischem Schock reichen.
In diesen Fällen kann das Hämoglobin der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um überschüssiges Stickstoffoxid oder irgendeinen anderen Liganden zu entfernen, der in toxischem Überschuß festgestellt wird und an das Hämoglobin binden kann. Ebenso können Stickstoffoxid oder andere Nichtsauerstoffliganden einem System zugeführt werden, um einen Krankheitszustand zu mildern.
Beispielsweise könnte Stickstoffoxid dem Gefäßsystem zugeführt werden, um Hypertension zu behandeln. Andere therapeutische Einsatzmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung können die Abgabe von Arzneistoffen und die Abbildung in vivo umfassen.
Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch für eine Reihe von Anwendungen in vitro verwendet werden. Beispielsweise kann die Abgabe von Sauerstoff durch die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Steigerung von Zellwachstum in Zellkulturen eingesetzt werden, um den Sauerstoffpegel in vitro aufrechtzuerhalten. Ferner kann das Hämoglobin der vorliegenden Erfindung dazu dienen, Sauerstoff aus Lösungen zu entfernen, bei denen das Entfernen von Sauerstoff erforderlich ist, sowie als Referenzstandards für analytische Assays und Instrumente dienen.
Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können bei Temperaturen unterhalb 40ºC über Zeiträume von 12 Monaten oder länger gelagert werden. Bevorzugt kann das Hämoglobin der vorliegenden Erfindung bei 25ºC über Zeiträume von 12 Monaten oder länger gelagert werden. Stärker bevorzugt kann die Lösung bei 25ºC über Zeiträume von mindestens sechs Monaten gelagert werden, und am meisten bevorzugt kann die Lösung der vorliegenden Erfindung bei 25ºC für wenigstens drei Monate gelagert werden.
Bei einer anderen Ausführungsform können die Lösungen der vorliegenden Erfindung bei 4ºC für mindestens sechs Monate, stärker bevorzugt 12 Monate gelagert werden. Bei einer weiteren Ausführungsform können die Lösungen der vorliegenden Erfindung bei Temperaturen unterhalb 4ºC für mindestens drei Monate gelagert werden.
Die Hämoglobinlösungen gemäß der vorliegenden Erfindung können in sauerstoffundurchlässigen Behältern, beispielsweise Behältern aus rostfreiem Stahl, sauerstoffundurchlässigen Kunststoffbeuteln oder Kunststoffbeuteln, die eine Umverpackung von gering sauerstoffdurchlässigen Kunststoffbeuteln haben, wobei zwischen dem inneren Kunststoffbeutel und dem Umverpackungs-Kunststoffbeutel ein Sauerstoffänger angeordnet ist, gelagert werden.
Bei einer anderen Ausführungsform können die lagerungsbeständigen Hämoglobinlösungen in sauerstoffdurchlässigen oder sauerstoffundurchlässigen Behältern in einer in bezug auf Sauerstoff kontrollierten Umgebung gelagert werden.
Solche in bezug auf Sauerstoff kontrollierten Umgebungen können beispielsweise Manipulationskammern, Handschuh- Arbeitskästen, Inkubatoren und dergleichen sein. Bevorzugt ist der Sauerstoffanteil der in bezug auf Sauerstoff kontrollierten Umgebung relativ zu atmosphärischen Sauerstoffkonzentrationen niedrig.
Die Stabilität der Hämoglobinlösungen gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit allen im Stand der Technik akzeptierten Einrichtungen bestimmt werden. Im allgemeinen kann die Stabilität durch Messen des Abbaus des Hämoglobins bestimmt werden, beispielsweise durch die Bildung von Oxidation, proteolytischen oder Entamidierungsprodukten, Änderungen der Molekulargewichtsverteilung, Änderungen der Potenz, Änderungen der Funktionalität, Zunahme an Unlöslichem, wie Aggregaten, oder Modifikation des Produkts infolge der Anwesenheit von Trägern, wie etwa nichtenzymatische Glykation.
Außerdem kann die Stabilität bestimmt werden als Sterilitätsverlust oder als Änderungen der Konzentration beispielsweise aufgrund von Verflüchtigung, Adsorption, chemischer Modifikation und dergleichen.
Bevorzugt wird die Stabilität von Hämoglobinlösungen bestimmt durch Messen der Funktionalität, Messung von Oxidationsprodukten, Änderungen der Molekulargewichtsverteilung und Zunahme von Abbauprodukten. Ein solcher Abbau kann durch Änderungen des Verhältnisses von Betaglobin zu Alphaglobin überwacht werden, wie etwa in Beispiel 1 beschrieben wird.
Dementsprechend sind lagerungsbeständige Hämoglobinlösungen solche Lösungen von Hämoglobin, die einen Hämoglobinabbau von weniger als 10%, eine unter 10% liegende Änderung der Molekulargewichtsverteilung zeigen oder weniger als 5% Methämoglobin enthalten. Lagerungsbeständige Lösungen können ferner jede Kombination dieser Charakteristiken zeigen.
Das Hämoglobin, das die lagerungsbeständige Lösung aufweist, kann die für eine bestimmte Anwendung erforderliche Funktionalität haben. Wenn beispielsweise das lagerungsbeständige Hämoglobin der vorliegenden Erfindung als Blutersatzstoff eingesetzt wird, sollte es einen P&sub5;&sub0; - Wert größer als ca. 27 mmHg oder einen nmax - Wert größer als ca. 1,7 haben.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sollen bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschreiben, ohne den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.

BEISPIEL 1

TECHNIKEN DER STABILITÄTSMESSUNG

Messung der Molekulargewichtsverteilung

Die Molekulargewichtsverteilung der Hämoglobinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung wurde wie folgt bestimmt.
Hämoglobinlösungen wurden zu ungefähr 4 mg/ml Konzentrationen in 5 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH-Wert 7,6 verdünnt. Gleiche Teilmengen (25 ul) wurden chromatographisch getrennt unter Verwendung einer Größenausschlußkolonne Pharmacia "SUPEROSE" 12 (Piscataway, New Jersey). Die Kolonnen wurden mit dem gleichen Puffer wie der Verdünnungspuffer mit einer Durchflußrate von 0,5 ml/min eluiert. Das Absorptionsmaß wurde bei 280 nm überwacht.

Messung der Globinzusammensetzung

Der Abbau des Hämoglobinmoleküls kann durch Überwachen der Modifikation des Betaglobins bestimmt werden. Ein einfaches Verfahren zur Mengenbestimmung der Betaglobinmodifikation ist die Bestimmung von Änderungen der relativen Globinzusammensetzung (d. h. Betaglobinanteile gegenüber Alpha- oder Dialphaglobinanteil). Bei der Analyse kann entweder der Alphaglobin-Peakbereich oder der Dialphaglobin-Peak genutzt werden. Die Nutzung des jeweils geeigneten Peaks hängt von der Zusammensetzung des untersuchten Hämoglobins ab.
Die Globinzusammensetzung (Betaglobin und Dialphaglobin) des Hämoglobins wurde wie folgt bestimmt. Häm wurde aus Hämoglobinlösungen entfernt durch Ausfällen mit einer kalten Säure- Acetonlösung (0,6% HCl/Aceton). Hämoglobin wurde auf ungefähr 10 ug/pl mit Wasser von HPLC-Güte verdünnt. 100 ul dieser verdünnten Hämoglobinlösung wurde mit dem kalten Säure- Acetongemisch vermischt, zum Ausfällen gebracht und mikrozentrifugiert, um die Fraktionen zu trennen. Der Überstand wurde abgesaugt und entsorgt; das Pellet wurde mit einem Argonstrom getrocknet und bei -20ºC bis zur chromatographischen Analyse aufbewahrt.
HPLC wurde durchgeführt unter Verwendung einer HPLC- Analysekolonne Zorbax C3 (MAC-MOD Analytical, Inc., Chadds Ford, Pennsylvania). Vor der Analyse wurde das Pellet in 0,5 ml 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) erneut suspendiert und ergab eine Endkonzentration von ungefähr 2 mg/ml. Das gesamte restliche ungelöste Material wurde entfernt durch Schleudern der Probe für 10 min in einer Mikrozentrifuge vor dem Aufbringen auf die Analysekolonne.
Ungefähr 100 ug Protein wurde auf der Zorbax-Kolonhe unter Anwendung des folgenden Trennschemas abgetrennt: 35% Lösungsmittel B für fünf Minuten, dann linearer Anstieg auf 49% Lösungsmittel B während der nächsten 45 min. wobei Lösungsmittel A 0,1% TFA in Wasser von HPLC-Güte und Lösungsmittel B 0,1% TFA in Acetonitril war. Die Durchflußrate für die Trennung war 1 ml/min. Das Absorptionsmaß wurde bei 215 nm überwacht.
Der Bereich des Betapolypeptid-Peaks änderte sich signifikant unter bestimmten Bedingungen. Beispielsweise hatte der Bereich des Beta-Peaks für Hämoglobin, das unter Hochsauerstoffbedingungen in Anwesenheit von zunehmenden Ascorbatkonzentrationen gelagert war, während 21 Tagen Lagerung deutlich abgenommen. Die Abnahme im Bereich des Beta-Peaks resultierte in einer Verminderung des Verhältnisses des Betaglobin-Peakbereichs zu dem Dialphaglobin-Peakbereich.
Aufgrund von geringfügigen Unterschieden im anfänglichen Alphagehalt einer gegebenen Hämoglobinlösung ergab das Verhältnis des Bereichs des Beta-Peaks zu dem Dialpha-Peak ein Maß für den Abbau der Hämoglobinlösungen, das zum Vergleich der Wirksamkeit unterschiedlicher Lagerungsbedingungen für unterschiedliche Hämoglobinlösungen genutzt werden konnte.
Wie die Tabelle 1 zeigt, schienen Lösungen, die entsprechend dem Beispiel 2 hergestellt und wie oben beschrieben in bezug auf das Beta/Dialpha-Peakverhältnis analysiert worden waren, bei Beta/Dialpha-Verhältnissen von größer 0,9 stabil zu sein, wenn die Methämoglobinbildung unter Kontrolle war. Ein Beta/Dialpha-Verhältnis von 0,9 wird als äquivalent einem ungefähr 10% Abbau von Hämoglobin angesehen.

Bestimmung von P&sub5;&sub0; - und nmax - Werten

Die Werte von P&sub5;&sub0; und nmax, die funktionelle Eigenschaften des Hämoglobins angeben, wurden durch Sauerstoffgleichgewichts-Bindungsexperimente bestimmt unter Anwendung eines HEMOX-Instruments (TCS, Inc.), wie von Hoffman und Nagai in der US-PS 5 028 588 beschrieben, die hier summarisch eingeführt wird. Die Werte von P&sub5;&sub0; und nmax wurden bei 37ºC, 50 mM HEPES, 100 mM CL, pH-Wert 7,4 bestimmt.

Methämoglobinkonzentration

Methämoglobin ist Hämoglobin, in dem eines oder mehrere der Eisen der prosthetischen Hämgruppen im Fe&spplus;³(Eisen(III))- Oxidationszustand sind. Das hier beschriebene Meßverfahren für Methämoglobin mißt den Oxidationszustand einzelner Hämeisen. Somit reflektiert der berichtete Prozentsatz von Methämoglobin den Prozentsatz von Hämen, die in der Hämoglobinprobe oxidiert sind.
Fünf Mikroliter Hämoglobinlösungen wurden 500 ul 0,1 M Trispuffer, pH-Wert 8,0, zugefügt. 200 ul der verdünnten Hämoglobinlösung wurde dann 2,8 ml 0,1 M Trispuffer, pH-Wert 8,0, in einer 4,5 ml-Küvette für eine Endverdünnung von 1 : 1500 zugefügt. Die sauerstoffangereicherte Probe (Hb) wurde dann spektrophotometrisch in einem Hewlett-Packard- Spektrophotometer Modell HP 8452A analysiert.
Absorptionswerte bei 436, 425, 420, 404, 400 nm wurde gesammelt und in einem Datenspeichersytem gespeichert. Die Küvette wurde dann aus dem Spektrophotometer entnommen und jedesmal für 15 s zweimal mit Kohlenmonoxid gespült. Die Küvette wurde zwischen jeder Spülung fünfmal umgedreht.
Die Probe wurde dann erneut in das Spektrophotometer eingesetzt, und eine zweite Gruppe von Spektren wurde gesammelt, die Kohlenmonoxid-Hämoglobin (HbCO) entsprach. Die Küvette wurde dann erneut aus dem Spektrophotometer entnommen, und 30 ul 0,1 M KCN in 0,1 M Trispuffer, pH-Wert 8,0, wurde der Probe zugefügt.
Die Probe wurde dann dreimal umgedreht, für 5 min inkubiert und für eine letzte spektrophotometrische Analyse (HbCN) erneut in das Spektrophotometer eingebracht. Der Prozentsatz von Methämoglobin wurde dann wie folgt errechnet:
mit A = das Absorptionsmaß bei der im unteren Index bezeichneten Wellenlänge für die im oberen Index bezeichnete Hämoglobinspezies.

BEISPIEL 2

Herstellung von Hämoglobinlösungen für Stabilitätsuntersuchungen

Hämoglobin wurde wie in der eigenen PCT-Patentanmeldung PCT/US94/13034, angemeldet am 14. November 1994 mit dem Titel "Purification of Hemoglobin", die hier summarisch eingeführt wird, beschrieben exprimiert, präpariert und ausgereinigt. Das Hämoglobin wurde dann durch Diafiltration auf eine Konzentration von 100 mg/ml eingeengt, und Polysorbat 80 wurde bis auf eine Endkonzentration von 0,03% (w/v) zugefügt.
Die Hämoglobinlösung wurde dann desoxidiert durch Leiten von sauerstofffreiem Stickstoffgas über die Hämoglobinlösung für ungefähr 2 h in einem Kolben mit rundem Boden. Die Lösung wurde mit Stickstoff desoxidiert und dann mit dem für die Untersuchung ausgewählten Sauerstoffgemisch ins Gleichgewicht gebracht.
Ascorbat wurde als eine 0,5 M Grundlösung hergestellt. Die Ascorbatlösung wurde dann durch wiederholtes Evakuieren der Grundlösung und Spülen mit sauerstofffreiem Stickstoffgas über vier bis fünf Zyklen desoxidiert. Die Ascorbatlösungen wurden für jedes hier beschriebene Experiment frisch hergestellt.
Nach dem Herstellen der Ascorbatlösung wurde diese zusammen mit der desoxidierten Hämoglobinlösung in einen Manipulationskasten (die "Füllumgebung") verbracht, und der Manipulationskasten wurde auf den erforderlichen Restsauerstoffpegel im Kopfraum des Manipulationskastens durch wiederholte Evakuierungen und Spülen mit dem geeigneten Sauerstoff/Stickstoffgemisch äquilibriert.
Die Restsauerstoffkonzentration im Manipulationskasten wurde unter Verwendung einer "MOCON"-Vorrichtung wie oben beschrieben bestimmt. Nach Äquilibrierung des Manipulationskastens wurden das Ascorbat und die Hämoglobinlösung geöffnet, und Ascorbat wurde auf Endkonzentrationen von 0,5 bis 5 mM zugegeben. Die Ascorbat enthaltenden Hämoglobinlösungen wurde als Teilmengen von 0,5 ml in 2 ml-Glasfläschchen eingebracht.
Die Fläschchen wurden mit grauen Butylkautschukstoppern versehen und durch Einfalzen dicht verschlossen. Die Lösungen wurden aus dem Manipulationskasten entnommen und in temperaturgeregelten Inkubatoren entweder bei 4ºC oder bei 25ºC unter Umgebungsgasbedingungen gelagert.
Die Lösungen wurden bis zu drei Monaten gelagert. Fläschchen wurden zu geeigneten Zeitpunkten für einen gegebenen Stabilitätstest entnommen. Diese Tests umfaßten die Umkehrphasen- HPLC-Analyse zur Bestimmung des Beta- und Dialpha-Gehalts, die Molekulargewichtsverteilung durch Hochleistungs- Größenausschluß-Chromatographie (HP-SEC), Funktionalitätsbestimmungen unter Anwendung von P&sub5;&sub0;- und nmax-Werten sowie die Methämoglobinkonzentration.

BEISPIEL 3

Sauerstoff/Ascorbat-Titrationsuntersuchungen: Auswirkung auf Beta/Dialpha-Verhältnis und Methämoglobinkonzentration Um die Auswirkung der Ascorbatkonzentration auf die Stabilität des Hämoglobins über die Zeit zu bestimmen, wurden Hämoglobinlösungen wie oben beschrieben hergestellt. Diese Lösungen enthielten 150, 1000, 5000 und 15.000 ppm Sauerstoff im Kopfraum und entweder 0,5, 1, 2 oder 5 mM Konzentrationen von Ascorbat in der Lösung (Verhältnisse von 0,3 : 1, 0,6 : 1, 1,3 : 1 und 3,2 : 1 Ascorbat : Hämoglobin, jeweils Molverhältnisse). Die Lösungen wurden für drei Wochen bei 4ºC gelagert. Das Beta/Dialpha-Verhältnis und der Prozentsatz Methämoglobin in den Lösungen wurden am Ende der Lagerungsperiode bestimmt.
Die größte Änderung des Beta/Dialpha-Verhältnisses wurde in Proben beobachtet, die hohe Werte sowohl von Ascorbat als auch Restsauerstoff enthielten, während die größte Zunahme des Methämoglobinprozentsatzes in Formulierungen beobachtet wurde, die Sauerstoff und wenig Ascorbat enthielten (Tabelle 1).
Bei niedrigen Restsauerstoffwerten (1000 ppm und weniger) ergab sich nur wenig Änderung des Beta/Dialpha-Verhältnisses, und zwar ungeachtet des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Ascorbat in der Formulierung. Wenn jedoch die Formulierung kein Ascorbat enthielt, ergaben sich hohe Methamoglobinwerte in der Formulierung am Ende der Lagerungsperiode.
Bei hohen Restsauerstoffwerten (5000 und 15.000 ppm) zeigten die Formulierungen mit hohem Ascorbatanteil (Ascorbat größer als ungefähr 0,5 mM) größere Änderungen des Beta/Dialpha- Verhältnisses (siehe Fig. 2 und Tabelle 1) als die Formulierungen mit niedrigem Ascorbatanteil. Außerdem erfolgte eine merkliche Ausbildung von Methämoglobin in Formulierungen mit hohem Restsauerstoff.
Es ist zu beachten, daß am Ende der Lagerungsperiode Methämoglobin auf niedrigen Werten gehalten wurde mit Ausnahme in Anwesenheit von mehr als 5000 ppm Sauerstoff und weniger als 1 mM Ascorbat. Selbst wenn also keine merkliche Ausbildung von Methämoglobin in der Hämoglobinformulierung erfolgte, gab es eine Modifikation der Polypeptid-Untereinheiten. Tabelle 1: Beta/Dialpha-Verhältnisse und % Methämoglobin in Hämoglobinlösungen, die für 21 Tage bei 4ºC gelagert wurden

BEISPIEL 4

Sauerstoff/Ascorbat-Titrationsuntersuchungen: Auswirkung auf die Funktionalität

Um die Auswirkung der Ascorbatkonzentration auf die Funktionalität von Hämoglobin über die Zeit zu bestimmen, wurden Hämoglobinlösungen wie oben in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die Funktionalität des Hämoglobins in der Lösung wurde am Ende der dreiwöchigen Lagerungsperiode durch Bestimmung der Werte von P&sub5;&sub0; und nmax wie oben beschrieben ermittelt.
Es gab minimale Unterschiede in den P&sub5;&sub0;- und nmax-Werten bei den Restsauerstoffwerten von 150 und 1000 ppm für die verschiedenen Ascorbatkonzentrationen (Tabelle 2). Bei 5000 und 15.000 ppm Restsauerstoffkonzentration waren jedoch höhere Ascorbatkonzentrationen von Erhöhungen der P&sub5;&sub0;-Werte begleitet. Ferner nahm bei 15.000 ppm Restsauerstoffkonzentration nmax mit zunehmender Ascorbatkonzentration ab (Tabelle 2). Tabelle 2 Sauerstoffkonzentration im Kopfraum

BEISPIEL 5

Langzeitlagerung bei Raumtemperatur von teilweise desoxidierten, Ascorbat enthaltenden Hämoglobinformulierungen

Vier verschiedene desoxidierte Formulierungen, die sämtlich 100 mg/ml Hämoglobin und 2mM Ascorbat enthielten und gemäß Beispiel 2 hergestellt waren, wurden für 3 Monate bei 25ºC gelagert. Die Formulierungen enthielten sämtlich 150 mM NaCl, 5 mM Natriumphosphat, 2 mM Ascorbat, 0,03% Polysorbat 80 (Standardformulierung) und unterschieden sich wie folgt:
(1) Standardformulierung, pH-Wert 6,75
(2) Standardformulierung, pH-Wert 7,21
(3) Standardformulierung, 25 uM EDTA, pH-Wert 6,75
(4) Standardformulierung, 25 uM EDTA, pH-Wert 7,21
Während der gesamten Lagerungsperiode und am Ende der dreimonatigen Lagerungsperiode wurden Proben auf den Methämoglobingehalt, Änderungen des Molekulargewichts, gemessen als Hochmolekulargewicht-Hämoglobin (HMWHb), Beta/Dialpha- Verhältnis, Aggregatbildung sowohl durch dynamische Lichtstreu- und Lichtabdeck-Techniken und Funktionalität (P50 und nmax) analysiert. Am Ende der Lagerungsperiode ergab sich keine klinisch relevante Änderung irgendeines der Parameter, die während der gesamten Untersuchungsperiode überwacht wurden (Tabelle 3). Tabelle 3

Claims

1. Lagerungsbeständige Hämoglobinzusammensetzung, die eine Hämoglobinlösung, die weniger als 5000 ppm Sauerstoff enthält, und ein Reduktionsmittel aufweist, wobei weniger als 4 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hämoglobin vorhanden sind, um die lagerungsbeständige Hämoglobinlösung zu bilden.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die teilweise desoxidierte Hämoglobinlösung weniger als 1000 ppm Sauerstoff enthält.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die teilweise desoxidierte Hämoglobinlösung weniger als 500 ppm Sauerstoff enthält.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die teilweise desoxidierte Hämoglobinlösung weniger als 150 ppm Sauerstoff enthält.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Reduktionsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dithionit, Natriumborhydrid und Ascorbinsäure oder Salzen davon besteht.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Reduktionsmittel aus Ascorbinsäure oder Salzen davon besteht.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Reduktionsmittel weniger als 3 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hämoglobin ausmacht.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Reduktionsmittel weniger als 2 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hämoglobin ausmacht.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das lagerungsbeständige Hämoglobin für mindestens drei Monate lagerungsbeständig ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das lagerungsbeständige Hämoglobin für mindestens sechs Monate lagerungsbeständig ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das lagerungsbeständige Hämoglobin für mindestens ein Jahr lagerungsbeständig ist.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das lagerungsbeständige Hämoglobin bei etwa 4ºC lagerungsbeständig ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das lagerungsbeständige Hämoglobin bei etwa 25ºC lagerungsbeständig ist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das lagerungsbeständige Hämoglobin bis zu 40ºC lagerungsbeständig ist.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Reduktionsmittel Ascorbat ist und die teilweise desoxidierte Hämoglobinlösung weniger als etwa 150 ppm Sauerstoff enthält.

16. Verfahren zum Herstellen einer lagerungsbeständigen Hämoglobinzusammensetzung, das das Vereinigen einer Hämoglobinlösung, die weniger als 5000 ppm Sauerstoff enthält, mit weniger als 4 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hämoglobin umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, das ferner das teilweise Desoxidieren einer Hämoglobinlösung umfaßt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Desoxidieren durch Gas-Flüssigkeits- Kontaktverfahren erfolgt.

19. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, die ferner einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der Träger mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträger enthält.

21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 sowie 19 und 20, die ferner einen pH-Wert zwischen etwa 6,5 und etwa 9,5 hat.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, die einen pH-Wert zwischen etwa 6,6 und etwa 7,8 hat.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, die einen pH-Wert zwischen etwa 6,8 und etwa 7,6 hat.

24. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 sowie 19 und 20 bis 23, die ferner einen Chelatbildner aufweist.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei der Chelatbildner aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus EDTA und DTPA besteht.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei der Chelatbildner EDTA ist.

27. System für die Lagerung von lagerungsstabilen Hämoglobinlösungen, das folgendes aufweist:

eine Hämoglobinlösung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 sowie 19 und 20 bis 26; und

einen Behälter für die Lagerung der Hämoglobinlösung.