DE69612090T2

DE69612090T2 - Verfahren zur herstellung von kalzium d-pantothenat

Info

Publication number: DE69612090T2
Application number: DE69612090T
Authority: DE
Inventors: Junichi Matsumoto; Hiroshi Miki; Sunao Nishimura; Kosaku Shibutani; Hideo Yada
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1995-04-21
Filing date: 1996-04-10
Publication date: 2001-10-25
Anticipated expiration: 2016-04-11
Also published as: ES2157436T3; CN1074791C; WO1996033283A1; DE69612090D1; DK0822989T3; US6013492A; ATE199742T1; GR3035984T3; EP0822989A1; AU5287396A; EP0822989B1; SK282858B6; KR100282076B1; KR19990007911A; PT822989E; CN1187854A; SK141897A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Calcium-D-pantothenat aus einer Fermentationsbrühe von D-Pantothensäure, welche direkt mit einem Mikroorganismus hergestellt wurde. Calcium-D-pantothenat wird in breitem Maße als Vitamin in Arzneimitteln, Nahrungsmitteln, Futtermitteln usw. verwendet.

Hintergrund der Erfindung

Konventionelle Verfahren zur Herstellung von Calciumpantothenat können grob in chemische Syntheseverfahren und direkte Gärungsverfahren eingestuft werden. Eine chemisches Syntheseverfahren, das in breitem Maße in der industriellen Produktion verwendet wird, umfasst das Durchführen einer optischen Auflösung mit D,L-Pantolacton, das aus der Ausgangsverbindung Isobutyraldehyd hergestellt wurde, durch ein chemisches oder enzymatisches Verfahren, und die Kondensation des sich ergebenden D-Pantolactons mit β-Alanin-Calcium, um Calcium-D-Pantothenat zu erhalten. Als direktes Fermentationsverfahren hat JP-A- 6-261772 kürzlich ein neues Verfahren zur direkten Herstellung von D- Pantothensäure aus einem Saccharid und β-Alanin mit einem Mikroorganismus offenbart. Insbesondere offenbart es ein Verfahren zur Herstellung von Calcium-D-Pantothenat aus einer direkten Fermentationsbrühe von D-Pantothensäure, umfassend die Durchführung eines Entsalzens der Fermentationsbrühe durch Ionaustauschchromatographie, die anschließende Neutralisation, um die D-Pantothensäure als Calciumsalz einzuengen, und die Zugabe von Methylalkohol (Methylalkohol-Konzentrafiion: 83 v/v %), um Kristalle von Calcium-D-Pantothenat auszufällen.
Direkte Fermentationsverfahren sind wirksamer als chemische Syntheseverfahren, da sie keine optische Auflösung usw. erfordern. Die Fermentationsbrühe enthält jedoch zusätzlich zur D-Pantothensäure unlösliche Materialien, wie Mikrobenzellen usw. und verschiedene lösliche Verunreinigungen, wie Monosaccharide, Oligosaccharide, organische Säuren, Proteine, anorganische Salze (Kationen, Anionen) usw. Daher besteht das wichtigste Problem jetzt darin, wie man Calcium-D-pantothenat auf wirksame Weise von der Fermentationsbrühe in hoher Ausbeute und Reinheit abtrennt und reinigt. Wie oben beschrieben wurde, offenbart JP- A-6-261772 ein Verfahren zur Erzeugung von Calcium-D-pantothenat aus einer direkten Fermentationsbrühe von D-Pantothensäure, umfassend das Durchführen einer Entsalzung mit der Fermentationsbrühe durch Ionaustauschchromatographie, die anschließende Neutralisation, um die D-Pantothensäure als Calciumsalz einzuengen, und die Zugabe von Methylalkohol (Methylalkohol-Konzentration: 83 v/v %), um Kristalle von Calcium-D-pantothenat auszufällen. Dieses Verfahren hat jedoch die folgenden Nachteile. (i) Die Behandlung mit einem Ionaustauschharz kann Monosaccharide oder Oligosaccharide nicht entfernen, die in der Fermentationsbrühe enthalten sind, und die rohe Kristallisationslösung enthält dieselben in Mengen von etwa 10%, bezogen auf Pantothensäure. Diese zurückbleibenden Monosaccharide oder Oligosaccharide verursachen eine Entfärbung durch die Wärme während des Einengens der Lösung der Ionaustauschbehandlung oder eine Reduktion der Kristallisationsausbeute während der Kristallisation. (ii) Um eine hohe Kristallisationsausbeute zu erhalten, muss die durch Ionaustausch behandelte Lösung eingeengt werden, um eine hohe Konzentration (etwa 50%) von Calcium-D-pantothenat zu erhalten, bevor Methylalkohol zugefügt wird, so dass die Konzentration von Calcium-D-pantothenat in der rohen Kristallisationslösung nicht kleiner als 7 w/v % wird, und die Methylalkohol-Konzentration etwa 90 v/v % wird. Die Calcium-D-pantothenat-Lösung hat in einer solchen Konzentration eine sehr hohe /iskosität, was das Einengen der Lösung erschwert.
EP-A-0590857 offenbart die Isolierung von D-Pantothensäure oder ihres Salzes durch Entfernen mikrobieller Zellen aus einer Kulturbrühe, die D- Pantothensäure oder ihr Salz enthält, und die Behandlung der Brühe durch eine an sich bekannte Behandlung, welche die adsorbierende Behandlung mit Aktivkohle einschließt. Die Adsorbens-Behandlung mit Aktivkohle dient nur der Entfärbung. EP-A-0493060 enthält eine ähnliche Offenbarung, wie diejenige von EP-A-0590857. SU-A-0403670 offenbart ein herkömmliches Verfahren zur Herstellung von Calcium-D-pantothenat.
GB-A-0866488 offenbart die Verwendung von Aktivkohle zur Absorption von Vitaminen und bezieht sich auf die Herstellung von Vitaminen der Gruppe B&sub1;&sub2;.
SU-A-0188397 offenbart die Reinigung von Lysergsäure durch eine Entfärbungsbehandlung mit Aktivkohle.
GB-A-1562794, JP-A-54-101412 und JP--A-51-55803 offenbaren die Nützlichkeit von Aktivkohle zur Absorption eines breiten Bereichs von Vitaminen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Diagramm eines Festbetts, in dem die Säulen A und B, die mit Aktivkohle gepackt sind, in Reihe verbunden sind. Die Symbole (i) bis (vi) stellen Durchflüsse dar.
Fig. 2 zeigt Durchbruchkurven, die erhalten wurden, wenn die zu behandelnde Flüssigkeit durch eine LH2C-Kohlenstoffsäule geleitet wurde. Die dünne durchgezogene Linie A stellt die Durchbruchkurve von D- Pantothensäure dar. Die dicke durchgezogene Linie B stellt eine Durchbruchkurve von Sacchariden dar. (a) ist der Durchbruch-Adsorptionspunkt von D-Pantothensäure. (b) ist der Sättigungsadsorptionspunkt von D- Pantothensäure.
Fig. 3 zeigt Eluierungskurven, die bei der Eluierung einer LH2C-Kohlenstoffsäule unter Verwendung von Methylalkohol als Eluierungsmittel erhalten wurden. Die dünne durchgezogene Linie A, die dicke durchgezogene Linie B und die gestrichelte Linie C stellen Eluierungskurven von D-Pantothensäure, Wasser bzw. Sacchariden dar.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensive Untersuchungen durchgeführt, um ein Verfahren zur wirksamen Herstellung von hochqualitativem Calcium-D-pantothenat in hoher Ausbeute aus einer Kulturlösung zu erhalten, die zusätzlich zur D-Pantothensäure Saccharide usw. enthält, und welche durch ein direktes Fermentationsverfahren erhalten wird. Als Ergebnis wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Calcium-D-pantothenat bereit, umfassend:
das Entfernen unlöslicher Feststoffe aus einer Fermentationsbrühe von D-Pantothensäure, die direkt durch mikrobielle Fermentation hergestellt wurde;
das Entfärben der Fermentationsbrühe mit Aktivkohle, um eine D-Pantothensäure enthaltende Lösung zu erhalten;
das Einstellen des pH der D-Pantothensäure enthaltenden Lösung auf 1 bis 5;
das In-Kontakt-Bringen der D-Pantothensäure enthaltenden Lösung mit körniger Aktivkohle, an welche Saccharide ein geringeres Adsorptionsvermögen haben als D-Pantothensäure und welche in wenigstens zwei Säulen gepackt ist, die kontinuierlich in Reihe verbunden sind, um die D-Pantothensäure bis zum Sättigungsadsorptionspunkt an der Aktivkohle zu adsorbieren;
das Eluieren der D-Pantothensäure mit einem hydrophilen, organischen Lösu ngsmittel;
das Neutralisieren des Eluats mit einem Calcium enthaltenden, alkalischen Agens, um Calcium-D-pantothenat auszufallen und das Gewinnen des Calcium-D-pantothenata.
Wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, ist die D-Pantothensäure enthaltende Lösung vorzugsweise eine Fermentationslösung, aus der unlösliche Materialien entfernt sind. Der pH der Lösung, welche die D- Pantothensäure enthält, ist vorzugsweise 1 bis 5. Vorzugsweise wird die D-Pantothensäure enthaltende Lösung mit Aktivkohle, die in wenigstens 2 in Reihe verbundenen Säulen gepackt ist, auf kontinuierliche Weise bis zu einem Sättigungsadsorptionspunkt in Kontakt gebracht. Das hydrophile, organische Lösungsmittel ist vorzugsweisse ein Niederalkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt Methylalkohol. Das Calcium enthaltende Alkalireagens ist vorzugsweise Calciumhydroxid. Vorzugsweise ist das hydrophile, organische Lösungsmittel Methylalkohol, das Calcium enthaltende Alkali-Reagens ist Calciumhydroxid und Calcium-D-pantothenat wird in Form von Kristallen gewonnen, die 4 Moleküle Methylalkohol und 1 mol Wasser enthalten.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die D-Pantothensäure enthaltende Lösung, die in der vorliegenden Erfindung durch mikrobielle Fermentation direkt hergestellt wurde, kann - wie in JP-A 6 261772 offenbart wird - durch Kultivieren eines Mikrorganismus, der D-Pantothensäure herstellen kann, wie der Darm-Bakterienstamm Escherichia coli 814/pFV 31 (IFO 15374, FERM BP-4401), in einem Medium, das eine Saccharid-Quelle, wie Glucose, enthält, und das In- Kontakt-Bringen des Bakterienstamms mit β-Alanin erhalten werden. Zu diesem Zeitpunkt ist die Menge der hergestellten D-Pantothensäure normalerweise 40 g/l,. Es wird bevorzugt, dass unlösliche Feststoffe, wie Bakterienzellen, durch herkömmliche Verfahren zum Entfernen unlöslicher Materialien in einer Flüssigkeit, wie Zentrifugation, Filtration usw., von der Lösung entfernt werden, um eine Verunreinigung von Kohlenstoff in der späteren Behandlung mit Aktivkohle zu verhindern und die Lebensdauer des Kohlenstoffs usw. zu verlängern.
Die D-Pantothensäure enthaltende Lösung, aus der unlösliche Feststoffe, wie Bakterienzellen usw., entfernt wurden, wird normalerweise mit einer anorganischen Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure usw., auf einen pH von 1 bis 5, vorzugsweise von 2 bis 4 eingestellt. Wenn der pH kleiner als 1 ist, wird D-Pantothensäure leicht zersetzt und ihre Ausbeute reduziert. Wenn der pH 5 übersteigt, wird die Menge der an Aktivkohle adsorbierten D-Pantothensäure reduziert, während diejenige der Saccharide zunimmt, und die Abtrennbarkeit der Saccharide reduziert wird.
Die in der Erfindung zu verwendende Aktivkohle ist nicht speziell eingeschränkt. Alle handelsüblichen Aktivkohle-Produkte zur Verwendung in Flüssigphasen-Trennungen können verwendet werden. Bevorzugte Beispiele der Aktivkohle schließen Aktivkohlen ein, in denen das gesamte Porenvolumen von Poren mit einem Durchmesser von nicht mehr als 30 nm (300 Å) (nachstehend als "Porenvolumen" bezeichnet) nicht kleiner als 0,4 cm³/g ist, und der durchschnittliche Porendurchmesser von Poren mit einem Durchmesser von nicht mehr als 30 nm (300 Å) (nachstehend als "durchschnittlicher Porendurchmesser" bezeichnet) nicht kleiner als 17 Å ist. Aktivkohlen mit solchen Poreneigenschaften können z. B. 1) durch das Eintauchen von Holzmaterialien, wie Holzstücken, Kokosnussschalen usw., in eine Chemikalie, wie Zinkchlorid, Phosphorsäure, Calciumchlorid usw., und das anschließende Sintern bei etwa 600 bis 700ºC, und das Abwaschen der Chemikalie mit einer Säure, wie Hypochlorid usw., oder 2) die Behandlung eines mineralischen Materials, wie Kohle, Erdölpech usw., mit einem Alkali, die anschließende Aktivierung mit Dampf, Kohlendioxidgas usw. bei 750 bis 900ºC erhalten werden. Die Aktivkohle kann in pulverförmiger oder körniger Form vorliegen. Wenn sie jedoch zur Anwendung in Säulen gepackt wird, liegt sie vom Gesichtspunkt der Steuerung des Säulendrucks aus gesehen vorzugsweise in körnigen Formen vor. Beispiele der Aktivkohle schließen ein: körnige Shirasagi KLH (hergestellt von Takeda Chemical Industries. Ltd., Porenvolumen: 1,09 cm³/g, durchschnittlicher Porendurchmesser: 3,2 nm (32 Å); körnige Shirasagi W (hergestellt von Takeda Chemical Industries. Ltd., Porenvolumen: 0,49 cm³/g, durchschnittlicher Porendurchmesser: 1,8 nm (18 Å); körnige Shirasagi LH2C (hergestellt von Takeda Chemical Industries. Ltd., Porenvolumen: 0,74 cm³/g, durchschnittlicher Porendurchmesser: 1,9 nm (19 Å); CAL (hergestellt von Calgon Corporation, Porenvolumen: 0,55 cm³/g, durchschnittlicher Porendurchmesser: 2,1 nm (21 Å); körnige Aktivkohle Daiahope 008 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation, Porenvolumen: 0,61 cm³/g, durchschnittlicher Porendurchmesser: 2,0 nm (20 Å) usw.
Die zu behandelnde Flüssigkeit wird vorzugsweise durch die Festbett- Adsorptionsmethode mit Aktivkohle in Kontakt gebracht, worin die zu behandelnde Flüssigkeit durch in einer Säule gepackte Aktivkohle geleitet wird. Diese Methode erlaubt die chromatographische Abtrennung von Verunreinigungen und erleichtert die Fraktionierung des Eluats von D- Pantothensäure mit einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel. Ein bevorzugtes Verfahren zur praktischen Anwendung ist die sogenannte Adsorption in Reihe, worin die zu behandelnde Flüssigkeit durch wenigstens zwei in Reihe geschaltete Säulen geleitet wird, die mit Aktivkohle gepackt sind, um D-Pantothensäure an der Aktivkohle zu adsorbieren.
Die Adsorptionsbehandlung unter Verwendung zweier Säulen wird in Form eines nachstehenden Beispiels erklärt. Wie in Fig. 1 gezeigt wird, sind die mit Aktivkohle gepackten Säulen A und B in Reihe verbunden, und die zu behandelnde Flüssigkeit wird in der folgenden Reihenfolge:
(i) → (ii) → (iv) → (v) → (vi) durch die Säulen geleitet. Das Strömen wird fortgesetzt, bis die Pantothensäure-Konzertration am Auslass der Säule A derjenigen am Einlass der Säule A gleich wird. Sobald die Konzentrationen am Auslass und am Einlass gleich sind, werden die Säulen A und B voneinander getrennt, das Strömen wird auf die Säule B umgeschaltet, und eine andere Aktivkohle-Säule wird mit der Säule B in Reihe verbunden. Das Strömen wird fortgesetzt, bis die Pantothensäure-Konzentrationen am Auslass der Säule B und am Einlass der Säule B einander gleich werden.
Fig. 2 zeigt Durchbruch-Kurven von D-Pantothensäure und Sacchariden, wenn die direkte Fermentationsbrühe, die vorhergehend einer Abtrennung von Bakterienzellen, einer Entfärbung mit Aktivkohle und einer Einstellung des pH-Werts auf 3 mit Salzsäure unterzogen wurde, durch die LH2C- Kohlenstoffsäule geführt wurde. Der Punkt, an dem die Konzentrationen der Pantothensäure am Auslass und Einlass der Säule A gleich werden, ist der Sättigungsadsorptionspunkt (b). Am Sättigungsadsorptionspunkt (b) wird D-Pantothensäure in einer Menge (etwa 200 g/l, - LH2C) adsorbiert, die etwa das 1,5fache derjenigen am Durchbruchadsorptionspunkt (a) darstellt, an dem keine Pantothensäure ausströmt. Die D-Pantothensäure, welche nach dem Durchbruchadsorptionspunkt ausströmt, wird in der nächsten Säule adsorbiert. Saccharide oder andere Verunreinigungen, die auch in der zu behandelnden Flüssigkeit existieren, weisen ein geringeres Adsorptionsvermögen gegenüber D-Pantothensäure auf und werden daher zur Elution durch D-Pantothensäure gezwungen, und das Durchbruchverhältnis der Saccharide oder anderer Verunreinigung erreicht 250%. Es wurde gefunden, dass, wenn die Behandlung bis zum Sättigungsadsorptionspunkt fortgeführt wird, wenigstens 90% der Saccharide in der zu behandelnden Flüssigkeit abgetrennt und entfernt werden können. Dies ist ein neues für den Fachmann unerwartetes Ergebnis. Anorganische Salze, die in der zu behandelnden Flüssigkeit enthalten sind, strömen aus zum Adsorptionsabfallmaterial, da sie sich nicht an Aktivkohle adsorbieren. Die anorganischen Salze können somit abgetrennt und entfernt werden.
Dann wird die D-Pantothensäure eluiert, indem man ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel durch die Säule mit Aktivkohle leitet, an der D-Pantothensäure in gesättigter Weise adsorbiert ist. Bevorzugte Beispiele der hydrophilen, organischen Lösungsmittel schließen Niederalkohole mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie Methylalkohol, Ethylalkohol, Isopropylalkohol usw. ein. Insbesondere Methylalkohol wird für die spätere Kristallisationsstufe bevorzugt. D. h. die Kristalle von Calcium-D-Pantothenat weisen Polymorphie auf und existieren als α-, β- und γ-Kristalle, Kristalle, die 4 Moleküle Methylalkohol (MeOH) und I Molekül H&sub2;O (4 MeOH·1 H&sub2;O-Kristalle) aufweisen, oder das Calcium-D-Pantothenat weist in Abhängigkeit von der Lösungsmittel-Umgebung amorphe Formen auf. Körnige 4 Me- OH&sub4;H&sub2;O- Kristalle werden aus der rohen Kristallisationslösung kristallisiert, wenn Methylalkohol als Kristallisationslösungsmittel verwendet wird, und das Abtrennungsvermögen ist sehr hoch. Die Temperatur für die Elution ist 10 bis 30ºC, vorzugsweise 20 bis 30ºC.
Die Elution von D-Pantothensäure aus einer Aktivkohle-Säule unter Verwendung von Methylalkohol wird nachstehend unter Bezugnahme auf z. B. Fig. 3 erklärt, welche die Elutionskurven des Beispiels 1 zeigt.
Die erste Fraktion (0,7 Volumen gegen das LH2C-Kohlenstoffvolumen) enthielt Wasser, welches in der Säule zurückbehalten und zur Elution gezwungen wurde. Die Konzentration der D-Pantothensäure in dieser Fraktion betrug nur 0,4 w/v %. Die zweite Fraktion (1,5 Volumen) enthielt 8,7 w/v % D-Pantothensäure und 7,5 w/v % Wasser. Da die D- Pantothensäure-Konzentration in der zu behandelnden Flüssigkeit 2,6 w/v % betrug, wurde die D-Pantothensäure in dieser Fraktion auf das 3,4fache aufkonzentriert. Die letzte Fraktion (0,8 Volumen) enthielt 0,9 w/v % D-Pantothensäure und 0,05 w/v % Wasser. Die Rückgewinnung von D-Pantothensäure betrug in den drei Fraktionen 2%, 90% bzw. 4%.
Hinsichtlich der Wirksamkeit der Kristallisation in der späteren Kristallisation ist die Konzentration des hydrophilen, organischen Lösungsmittels in dem Eluat normalerweise 80 bis 98 v/v %, vorzugsweise 85 bis 95 v/v %, mehr bevorzugt 90 bis 92 v/v %, und die Konzentration der D-Pantothensäure ist vorzugsweise nicht geringer als 7 w/v %. Daher kann das obige 1,5 Volumen der eluierten Fraktion neutralisiert werden, um die rohe Kristallisationslösung zu erhalten.
Dann wird das Eluat mit einem Calcium-enthaltenden, alkalischen Reagens neutralisiert. Jedes alkalische Reagens kann verwendet werden, solange es Calcium in einer ausreichenden Menge enthält, um die in dem Eluat enthaltende D-Pantothensäure zu neutralisieren. Insbesondere wird Calciumhydroxid bevorzugt. In praktischeren Anwendungen wird pulverförmiges Calciumhydroxid in fast den gleichen Stoffmengen gegenüber D-Pantothensäure zu dem Eluat gegeben. Wenn nichtumgesetztes Calciumhydroxid-Mikropulver zurückbleibt, wird es bevorzugt, dasselbe abzufiltrieren. Die Temperatur der Flüssigkeit während der Neutralisation wird vorzugsweise bei nicht weniger als 15ºC gehalten, um eine Kristallisation von Calcium-D-pantothenat zu vermeiden.
Nachdem die so hergestellte rohe Kristallisationslösung auf nicht mehr als 10ºC, vorzugsweise nicht mehr als 5ºC, gekühlt ist, werden Impfkristalle in einer Menge von etwa 0,2 w/w %, bezogen auf Calcium-D-pantothenat, zugegeben und die Mischung wird nicht weniger als 10 Stunden unter Rühren bei 0 bis 5ºC stehengelassen, um Calcium-D-pantothenat-Kristalle in hoher Ausbeute zu erhalten. Die Kristallisationsaufschlämmung wird mit einer herkömmlichen Entwässerungszentrifuge zentrifugiert oder mit einer Filterpresse filtriert, um feuchte Kristalle zu erhalten.
Wenn Methylalkohol als Eluierungsmittel verwendet wird, enthalten die feuchten Kristalle etwa 25 v/v % Methylalkohol und etwa 5 v/v % Wasser. Die feuchten Kristalle können unter reduziertem Druck bei 70ºC bis 80ºC getrocknet werden, um den Wassergehalt auf etwa 0,5% zu reduzieren. Nötigenfalls können die feuchten Kristalle unter Verwendung feuchtigkeitsklimatisierter Luft (80ºC, RF 20%) getrocknet werden, um den Wassergehalt auf etwa 2% zu steuern. Auf diese Weise kann Calcium-Dpantothenat-Pulver, das im wesentlichen keinen Methylalkohol enthält, erhalten werden. Alternativ dazu werden die feuchten Kristalle in Wasser gelöst, die sich ergebende Lösung wird durch Verdampfen des Lösungsmittels so eingeengt, dass die Calcium-D-pantothenat-Konzentration 50 w/v % beträgt, und mit einem konventionellen Sprühtrockner sprühgetrocknet, um Calcium-D-pantothenat-Pulver zu erhalten. Alle kristallinen Formen des getrockneten Produkts wurden in amorphe Formen umgewandelt.
Wie oben beschrieben wurde, ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein sehr wirksames Verfahren zur Erzeugung von Calcium-D-pantothenat in hoher Ausbeute. In diesem Verfahren wird eine D-Pantothensäure enthaltende Lösung durch eine Aktivkohle-Säule geschickt, damit D- Pantothensäure auf sättigende Weise an der Aktivkohle adsorbiert wird, und gleichzeitig anorganische Ionen und Saccharide auf wirksame Weise abgetrennt und entfernt werden, und die D-Pantothensäure mit einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, eluiert wird. Falls eine geeignete, eluierte Fraktion im Hinblick auf die Lösungsmittel- Konzentration und die D-Pantothensäure-Konzentration ausgewählt wird, kann die Fraktion per se als rohe Ausgangsflüssigkeit für die Neutralisations- und Kristallisationsschritte verwendet werden. Zusätzlich dazu kann Calcium-D-pantothenat nach der Kristallisation leicht abgetrennt und gewonnen werden.

Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern weiterhin die vorliegende Erfindung auf ausführliche Weise, sollen aber den Umfang der Erfindung nicht einschränken.

Beispiel 1

Der Escherichia coli-Stamm IFO 814/pFV 31 wurde durch ein herkömmliches Verfahren in einem Medium, das Glucose als Kohlenstoffquelle enthält, in einem 5 I Flaschenfermenter kultiviert, um eine D-Pantothensäure-Direkt-Fermentationsbrühe (2,5 I) zu erhalten. Die Fermentationsbrühe wurde durch ein keramisches Filter (hergestellt von Toshiba Ceramic) mit einem Porendurchmesser von 0,1 um bei 40ºC filtriert, um ein Filtrat (1,67 I) zu erhalten, aus dem unlösliche Feststoffe, wie Bakterienzellen, entfernt wurden. Dieses Filtrat enthielt D-Pantothensäure (38,5 mg/ml (64,3 g)), Saccharide (die Gesamtmenge wurde durch die Phenol- Schwefelsäure-Methode bestimmt: 10,3 mg/m) (etwa 27%, bezogen auf D-Pantothensäure)). Dieses Filtrat wurde dlurch eine Säule (Innendurchmesser: 70 mm, Höhe 130 mm, Packvolurnen: 500 ml) geführt, die mit Aktivkohle K-1 für die Entfärbung (hergestellt von Takeda Chemical Industries. Ltd., Porenvolumen: 1,12 cm³/g, durchschnittlicher Porendurchmesser: 3,2 nm (32 Å) gepackt ist, um eine Flüssigkeit (2,4 l) (Entfärbungsverhältnis: 99,5%) zu erhalten, die das Wasser zum Waschen enthält. Konzentrierte Salzsäure (56 ml) wurde zu dieser Lösung gegeben, um den pH auf 3,0 einzustellen, und die Flüssigkeit wurde auf kontinuierliche Weise durch zwei Säulen (Säulen A und B; Innendurchmesser: 50 mm, Höhe: 100 mm, Packvolurnen: 200 ml) geleitet, die in Reihe verbunden sind und mit Aktivkohle gepackt sind, für eine Flüssigphasentrennung (LH2C Kohlenstoff, körnig, dampfaktivierter Kohlenstoff, hergestellt von Takeda Chemical Industries. Ltd.). Die Menge der Rohflüssigkeit, die durch die Säule A bis zum Sättigungsadsorptionspunkt durchgeleitet wurde, betrug 2, 2 I. Die Säule A adsorbierte bei diesem Arbeitsgang 29 g (145 g/l- LH2C Kohlenstoff) D-Pantothensäure. Nach dem Sättigungsadsorptionspunkt wurde die Säule A von der Säule B abgetrennt, und die verbleibende Flüssigkeit wurde durch die Säule B geleitet. Säule A wurde mit 600 ml Wasser gewaschen, und dann wurde D-Pantothensäure mit Methylalkohol eluiert. Das erste 0,7 Volumen (140 ml) wurde verworfen und das zweite 1,5 Volumen (300 ml) wurde in der späteren Kristallisationsstufe verwendet. Das letzte 0,8 Volumen (160 ml) wurde als Eluierungsmittel der nächsten Säule verwendet, um D-Pantothensäure zu gewinnen.
Die Konzentrationen der D-Pantothensäure, der gesamten Saccharide und des Methylalkohols in der zweiten Fraktion waren 8,7 w/v % (26,3 g), 0,43 w/v % (1,3 g) bez. 92,5 v/v %. Zu dieser Fraktion wurde Calciumhydroxid-Pulver (4,8 g) gegeben, und die Mischung wurde gut gerührt. Folglich wurde D-Pantothensäure neutralisiert, um ein Calciumsalz (Calcium-D-pantothenat: 28,6 g) zu erhalten. Die Flüssigkeit wurde durch einen Nutschentrichter filtriert, der vorher mit Diatomeenerde beschichtet wurde. Diese Arbeitsgänge wurden bei 20 bis 25ºC durchgeführt. Das Filtrat wurde als rohe Kristallisationslösung verwendet. Die rohe Kristallisationslösung wurde in einen Rundkolben überführt, der mit einem Rührer versehen ist, und auf 5ºC abgekühlt. Impfkristalle (0,2 w/w %, bezogen auf Calcium-D-pantothenat) wurden zugefügt, und die Mischung wurde auf 2ºC gekühlt und 15 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Auf diese Weise wurde die Kristallisation durchgeführt. Die Kristallisationsaufschlämmung wurde durch ein 3G Glasfilter filtriert, und Methylalkohol wurde bei 5ºC zum Waschen versprüht, um feuchte Kristalle (36,6 g) (Calcium-D-pantothenat: 34,4 g, Kristallisationsausbeute: 90%) zu erhalten, die 4 Moleküle MeOH (MeOH-Gehalt: 26%) und ein Molekül H&sub2;O (Wassergehalt: 4%) enthalten. Mit den feuchten Kristallen wurde ein konventionelles Trocknen unter reduziertem Druck bei 80ºC und ein Trocknen mit feuchtigkeitsklimatisierter Luft (60ºC, RF 20%) durchgeführt, um getrocknete Pulver (26,1 g, Wassergehalt: 2,4%) von Calcium-D-pantothenat zu erhalten. Dieses Produkt erfüllt die japanischen, US- und UK-Normen hinsichtlich der Klarheit, der Farbe, des Calciumgehalts, des Stickstoffgehalts, der spezifischen Drehung, der Kristallformen usw.
Wie oben beschrieben wurde, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf wirksame Weise Verunreinigungen, insbesondere Saccharide, entfernen, indem man eine Lösung, die direkt durch mikrobielle Fermentation hergestellte D-Pantothensäure enthält, mit Aktivkohle in Kontakt bringt, um in sättigender Weise D-Pantothensäure an der Aktivkohle zu adsorbieren. Die anschließende Eluierung mit einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, wie Methylalkohol usw. und die nachfolgende Kristallisation können Calcium-D-pantothenat guter Qualität aus dem Fermentationsfiltrat in hoher Ausbeute und auf sehr wirksame Weise bereitstellen.

Claims

1, Verfahren zur Herstellung von Calcium-D-pantothenat, umfassend:

das Entfernen unlöslicher Feststoffe aus einer Fermentationsbrühe von D-Pantothensäure, die direkt durch mikrobielle Fermentation hergestellt wurde;

das Entfärben der Fermentationsbrühe mit Aktivkohle, um eine D- Pantothensäure enthaltende Lösung zu erhalten;

das Einstellen des pH der D-Pantothensäure enthaltenden Lösung auf 1 bis 5;

das In-Kontakt-Bringen der D-Pantothensäure enthaltenden Lösung mit körniger Aktivkohle, an welche Saccharide ein geringeres Adsorptionsvermögen haben als D-Pantothensäure und welche in wenigstens zwei Säulen gepackt ist, die kontinuierlich in Reihe verbunden sind, um die D-Pantothensäure bis zum Sättigungsadsorptionspunkt an der Aktivkohle zu adsorbieren;

das Eluieren der D-Pantothensäure mit einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel;

das Neutralisieren des Eluats mit Einem Calcium enthaltenden, alkalischen Agens, um Calcium-D-pantothenat auszufällen und das Calcium-D-pantothenat zu gewinnen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das hydrophile, organische Lösungsmittel ein Niederalkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der Niederalkohol Methylalkohol ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Calcium enthaltende, alkalische Agens Calciumhydroxid ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das hydrophile, organische Lösungsmittel Methylalkohol ist, das Calcium enthaltende, alkalische Agens Calciumhydroxid ist und das Calcium-D-pantothenat in Form von Kristallen gewonnen wird, die 4 Moleküle Methylalkohol und 1 Molekül Wasser enthalten.