DE10128780A1

DE10128780A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen

Info

Publication number: DE10128780A1
Application number: DE10128780A
Authority: DE
Inventors: Thomas Hermann; Birgit Witteck; Mechthild Rieping; Daniela Kruse
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-06-13
Filing date: 2001-06-13
Publication date: 2002-12-19
Also published as: AU2002316917A1; WO2002101055A3; WO2002101062A2; WO2002101066A2; EP1395662A2; US20040259214A1; ATE305974T1; US20030124681A1; AU2002316916A1; DK1395661T3; WO2002101067A2; ATE305973T1; EP1395661B1; AU2002312930A1; WO2002101066A3; US20030119151A1; DE60206622T2; WO2002101065A3; US20030109012A1; WO2002101065A2

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der für das Gen bfr, hns, pgm, mdh, cycK, fda, dldH, pepB, aldH oder adk kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) in den Mikroorganismen verstärkt, insbesondere überexprimiert.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Mischungen unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen mindestens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe bfr, hns, pgm, mdh, cysK, fda, dldH, pepB, aldH und adk verstärkt wird.

Stand der Technik

Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Es wird unter anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet. Ein großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die Ernährung von Nutztieren wie Geflügel und Schweine verwendet. Der Bedarf steigt.

Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, in weiteren Verfahrensschritten das racemische Gemisch aufgetrennt, das D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so D-Pantothensäure erhalten.

Die typische Handelsform ist das Calcium-Salz der D- Pantothensäure. Das Calcium-Salz des racemischen Gemisches der D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich.

Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.

Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EP-A 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei E. coli durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β- Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert wird.

EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 beschreiben von E. coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite wie Salizylsäure, α- Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren in einer Nährlösung, die Glucose enthält, Pantoinsäure, und in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährlösung D-Pantothensäure. In EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 wird weiterhin angegeben, daß nach Amplifikation der Pantothensäure- Biosynthesegene panB, panC und panD, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sein sollen, in den oben genannten Stämmen in Glucose-haltigen Nährlösungen, die Produktion von D- Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und β- Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure verbessert wird.

Weiterhin wird in der WO97/10340 über die förderliche Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die Produktion von D-Pantothensäure berichtet. In der EP-A- 1001027 wird schließlich über die Wirkung der Verstärkung des panE-Gens auf die Bildung der D-Pantothensäure berichtet.

Nach dem Stand der Technik wird die D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert und gereinigt (EP-A-0590857 und WO96/33283) und dementsprechend in gereinigter Form verwendet oder die D- Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe wird insgesamt getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als Futtermitteladditiv verwendet.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von D- Pantothensäure und/oder deren Salzen bzw. diese enthaltende Tierfuttermittel-Additive bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits D- Pantothensäure produzieren, und in denen mindestens eine oder mehrere der für das bfr-Gen, hns-Gen, pgm-Gen, mdh- Gen, cysK-Gen, fda-Gen, dldH-Gen, pepB-Gen, aldH-Gen und adk-Gen kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen mindestens eine oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe bfr, hns, pgm, mdh, cysK, fda, dldH, pepB, aldH und adk verstärkt, insbesondere überexprimiert werden, gegebenenfalls in Kombination mit der Abschwächung oder Verstärkung weiterer Gene,
b) gegebenenfalls in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen, wobei diese in vorzugsweise stöchiometrischen Mengen kontinuierlich oder diskontinuierlich der Fermentationsbrühe hinzugefügt werden,
c) Anreicherung der D-Pantothensäure bzw. des entsprechenden Salzes im Medium bzw. der Fermentationsbrühe oder gegebenenfalls in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae und
d) nach Abschluß der Fermentation Isolieren der D- Pantothensäure, und/oder der (des) entsprechenden Salze(s).

Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem nach Abschluß der Fermentation die Biomasse teilweise oder insgesamt (≘ 0 bis 100%) in der Fermentationsbrühe verbleibt, und die so erhaltene Brühe gegebenenfalls nach dem Aufkonzentrieren zu einer festen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Mischung, die bevorzugt weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält, verarbeitet wird.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene, des ORFs bzw. der ORFs erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel oder ORF verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli zu nennen. Innerhalb der Art Escherichia coli sind die sogenannten K-12 Stämme, wie z. B. die Stämme MG1655 oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) oder der Escherichia coli Wildtypstamm IF03547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon abgeleitete Mutanten geeignet, die die Fähigkeit besitzen D-Pantothensäure zu produzieren.

Geeignete D-Pantothensäure produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31,
Escherichia coli FV5069/pFV202,
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3.

Es wurde gefunden, daß Enterobacteriaceae nach Verstärkung, insbesondere Überexpression eines oder mehrerer der Gene ausgewählt aus der Gruppe bfr, hns, pgm, mdh, cysK, fda, dldH, pepB, aldH und adk in verbesserter Weise D- Pantothensäure produzieren.

Die Nukleotidsequenzen der Gene oder offenen Leserahmen (ORF) von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.

bfr-Gen

Bezeichnung: Bacterioferrin, Eisen Speicher Homoprotein
Referenz: Andrews et al., Journal of Bacteriology 171: 3940- 3947 (1989)
Accession No.: AE000409

hns-Gen

Bezeichnung: DNA-Bindeprotein HLP-II (HU, BH2, HD, NS); pleiotroper Regulator
Referenz: Pon et al., Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988)
Accession No.: AE000222

pgm-Gen

Bezeichnung: Phosphoglucomutase
alternativer Genname: pgmU
EC-Nr.: 5.4.2.1
Referenz: Lu und Kleckner, Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994)
Accession No.: AE000172

mdh-Gen

Bezeichnung: Malat Dehydrogenase
EC-Nr.: 1.1.1.37
Referenz: Sutherland und McAlister-Henn, Journal of Bacteriology 1985 163: 1074-1079 (1985)
Accession No.: AE000403

cysK-Gen

Bezeichnung: Cystein Synthase A, O-Acetylserin Sulfhydrylase A
alternativer Genname: cysZ
EC-Nr.: 4.2.99.8
Referenz: Boronat et al., Journal of General Microbiology 130: 673-685 (1984)
Accession No.: AE000329

fda-Gen

Bezeichnung: Fructose Bisphosphat Aldolase (Klasse II)
alternativer Genname: fba, alf
EC-Nr.: 4.1.2.13
Referenz: Alefounder et al., Biochemical Journal 257: 529-34 (1989)
Accession No.: AE000376

dldH-Gen

Bezeichnung: Lipoamid Dehydrogenase (NADH-abhängig); Komponente der 2-Oxodehydrogenase und E3 Komponente des Pyruvat-Dehydrogenase Komplexes; L-Protein des Glycin Spaltungskomplexes
alternativer Genname: lpdA
EC-Nr.: 1.8.1.4
Referenz: Stephens et al., European Journal of Biochemistry 135: 519-527 (1983)
Accession No.: AE000121

pepB-Gen

Bezeichnung: Peptidase
Referenz: Hermsdorf et al., International Journal of Peptide and Protein Research 13: 146-51 (1979)
Suzuki et al. Journal of Fermentation and Bioengineering 82: 392-397 (1996)
Accession No.: AE000339

aldH-Gen

Bezeichnung: Aldehyd-Dehydrogenase, NADP-abhängig
alternativer Genname: dhaL
EC-Nr.: 1.2.1.3
Referenz: Heim und Strehler, Gene 99: 15-23 (1991)
Accession No.: AE000228

adk-Gen

Bezeichnung: Adenylat Kinase
alternative Gennamen: plsA, dnaw
EC-Nr.: 2.7.4.3
Referenz: Brune et al., Nucleic Acids Research 13: 7139-7151 (1985)
Accession No.: AE000153

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Gene oder offenen Leserahmen können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Gene oder offene Leserahmen verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben, wobei die Aktivität des Proteins im wesentlichen nicht verändert wird.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen D-Pantothensäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in PCT/US 97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.

In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolomé et al.; Gene 102, 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem oder mehreren Plasmidvektoren transformierten Stamm einsetzen, wobei der (die) Plasmidvektoren mindestens eine der für die Gene bfr, hns, pgm, mdh, cysK, fda, dldH, pepB, aldH und adk kodierende Nucleotidsequenzen trägt (tragen).

Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrerer der Gene ausgewählt aus der Gruppe bfr, hns, pgm, mdh, cysK, fda, dldH, pepB, aldH und adk eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon (WO 97/10340)
- das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panE-Gen (US-A-5,518,906),
- das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen (EP-A-1001027)
- das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen (US-A-5,518,906),
- das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (US-A-5,518,906),
- das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen (Plamann et al (Nucleic Acids Research 11 (7): 2065-2075 (1983))),
- die für das Glycin-Spaltungssystem (glycine-cleavage system) kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP (Okamura- Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539- 548 (1993)), und
- das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC- Gen (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234: 49-57 (1986))

einzeln oder gemeinsam zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.

Schließlich kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrerer der Gene ausgewählt aus der Gruppe bfr, hns, pgm, mdh, cysK, fda, dldH, pepB, aldH und adk eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Transaminase C kodierende avtA-Gen (EP-A- 1001027)
- das für die Pyruvat Oxidase kodierende poxB-Gen (Grabau und Cronan, Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449-5460 (1986))
- das für die PEP-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Medina et al., Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990))

einzeln oder gemeinsam abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder auf niedrigem Niveau zu exprimieren.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure vorteilhaft sein, neben der Überexpression eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe bfr, hns, pgm, mdh, cysK, fda, dldH, pepB, aldH und adk unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt werden, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der D- Pantothensäure wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt.

Es ist gleichfalls möglich, zur Darstellung der Erdalkalisalze der Pantothensäure, insbesondere des Calciumsalzes oder Magnesiumsalzes, während der Fermentation die Suspension oder Lösung einer Erdalkali- haltigen anorganischen Verbindung wie beispielsweise Calciumhydroxid oder MgO oder einer organischen Verbindung wie dem Erdalkalisalz einer organischen Säure beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder diskontinuierlich zu zu versetzen. Zu diesem Zweck wird das zur Darstellung des gewünschten Erdalkalisalzes der D- Pantothensäure nötige Kation direkt in der gewünschten Menge, bevorzugt in einer Menge von 0,95 bis 1,1 Äquivalenten, in die Fermentationsbrühe eingetragen.

Die Salze können jedoch auch nach Abschluß der Fermentation durch Zugabe der anorganischen oder organischen Verbindungen zur Fermentationsbrühe gebildet werden, aus der gegebenenfalls die Biomasse zuvor entfernt wurde.

Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff- haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D- Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die in der Fermentationsbrühe enthaltene D-Pantothensäure bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure können anschließend nach dem Stand der Technik isoliert und gereinigt werden.

Es ist ebenso möglich, die D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise zunächst durch bekannte Separationsmethoden wie zum Beispiel der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus vollständig oder zum Teil von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu belassen. Im allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise aufkonzentriert und anschließend beispielsweise mit Hilfe eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver im allgemeinen durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren z. B. auch Aufbaugranulation in ein gröberkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt mit einer Korngrößenverteilung von bevorzugt 20 bis 2000 µm, insbesondere 100 bis 1400 µm überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder Stearaten.

Alternativ kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne weitere der üblichen Fermentationsbestandteile auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.

Gegebenenfalls wird in einer geeigneten Verfahrensstufe während oder nach der Fermentation D-Pantothensäure und/oder das gewünschte Salz der D-Pantothensäure oder eine diese Verbindungen enthaltende Zubereitung hinzugefügt, um den in dem Produkt gewünschten Gehalt an Pantothensäure oder dem gewünschten Salz zu erzielen bzw. einzustellen.

Der gewünschte Gehalt an Pantothensäure und/oder dem gewünschten Salz liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (bevorzugt auf die gesamte Trockenmasse).

Die Konzentration an Pantothensäure kann mit bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) oder mikrobiologischen Verfahren wie z. B. dem Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10^th Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.

Claims

1. Verfahren zu Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Erdalkalisalzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) in den Mikroorganismen mindestens eine oder mehrere der für das bfr-Gen, hns-Gen, pgm-Gen, mdh-Gen, cysK-Gen, fda-Gen, dldH-Gen, pepB-Gen, aldH-Gen oder adK-Gen kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) verstärkt, insbesondere überexprimiert,
b) die D-Pantothensäure und/oder deren Salze im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert und
c) die gewünschten Produkte nach Abschluß der Fermentation isoliert, wobei man die Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe in dem Produkt beläßt oder gegebenenfalls vollständig oder teilweise abtrennt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in Gegenwart von Erdalkalisalzen durchführt, wobei diese kontinuierlich oder diskontinuierlich in insbesondere stöchiometrischen Mengen zugeführt werden, und ein Erdalkalisalze der D-Pantothensäure enthaltendes oder daraus bestehendes Produkt gewinnt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae der Gattung Escherichia angehören.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli stammen.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe, verstärkt, insbesondere überexprimiert: 5.1 das für die Acetohydroxysäure- Synthase II
kodierende ilvGM-Operon

1. 5.2 das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen,
2. 5.3 das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen
3. 5.4 das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen
4. 5.5 das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen
5. 5.6 das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen
6. 5.7 die für das Glycin Spaltungssystem kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP, einzeln oder gemeinsam.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern, und insbesondere das für die Transaminase C kodierende avtA-Gen abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit einem oder mehreren Plasmidvektoren transformierten Stamm einsetzt, und der (die) Plasmidvektor(en) mindestens eine oder mehrere der für die Gene ausgewählt aus der Gruppe bfr, hns, pgm, mdh, cysK, fda, dldH, pepB, aldH und adk kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) trägt.

8. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Futtermittel-Additiven, gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man

a) aus einer durch Fermentation gewonnenen D- Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe, gegebenenfalls vollständig oder teilweise, die Biomasse und/oder einen Teil der Inhaltsstoffe (= 0 bis 100%) abtrennt,
b) das so erhaltene Gemisch gegebenenfalls aufkonzentriert, und
c) das die Pantothensäure und/oder das Pantothenat enthaltende Futtermitteladditiv durch geeignete Maßnahmen in eine rieselfähige Form überführt, und
d) durch geeignete Maßnahmen ein rieselfähiges Tierfuttermittel-Additiv mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 µm gewinnt.

9. Verfahren zur Herstellung von Tierfuttermittel- Additiven gemäß Anspruch 8 mit einem Gehalt an D- Pantothensäure und/oder deren Salze ausgewählt aus der Gruppe Magnesium- oder Calziumsalz aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte

a) gegebenenfalls Entfernen von Wasser aus der Fermentationsbrühe (Aufkonzentration),
b) Entfernen der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von ≧ 0 bis 100%,
c) gegebenenfalls Zusatz von einer oder mehreren der genannten Verbindungen zu den gemäß a) und b) erhaltenen Fermentationsbrühen, wobei die Menge der zugesetzten Verbindungen so bemessen ist, dass deren Gesamtkonzentration im Tierfuttermittel-Additiv bevorzugt im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% liegt, und
d) Gewinnung des Tierfuttermittel-Additivs in der gewünschten Pulver- oder bevorzugt Granulatform.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Fermentationsbrühe gegebenenfalls nach Zusatz von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen und gegebenenfalls nach Zusatz von organischen oder anorganischen Hilfsstoffen durch

a) Trocknen und Kompaktieren, oder
b) Sprühtrocknen, oder
c) Sprühtrocknen und Granulieren, oder
d) Sprühtrocknen und Aufbaugranulieren,

ein Tierfuttermittel-Additiv mit der gewünschten Korngröße gewinnt.