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DE69609982T2 - Lipopolyamine als transfectionsmittel und ihre pharmazeutischen anwendungen - Google Patents

Lipopolyamine als transfectionsmittel und ihre pharmazeutischen anwendungen

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Publication number
DE69609982T2
DE69609982T2 DE69609982T DE69609982T DE69609982T2 DE 69609982 T2 DE69609982 T2 DE 69609982T2 DE 69609982 T DE69609982 T DE 69609982T DE 69609982 T DE69609982 T DE 69609982T DE 69609982 T2 DE69609982 T2 DE 69609982T2
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DE
Germany
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nhch2
lipopolyamine
product
nucleic acid
composition according
Prior art date
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Application number
DE69609982T
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Inventor
Gerardo Byk
Catherine Dubertret
Daniel Scherman
Bertrand Schwartz
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Publication date
Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
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Publication of DE69609982T2 publication Critical patent/DE69609982T2/de
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen aus der Familie der Lipopolyamine, die sie enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen, ihre Anwendung für die Transfektion von Nucleinsäuren in vivo und/oder in vitro sowie ihr Herstellungsverfahren.
  • Zahlreiche genetische Krankheiten sind mit einem Expressionsfehler und/oder einer anormalen Expression verbunden, das heißt, mit einer schwachen oder übermäßigen Expression von einer oder von mehreren Nucleinsäuren. Die Gentherapie hat hauptsächlich zum Ziel, diesen Typ von genetischen Anomalien über den Umweg der zellulären Expression von klonierten Genen in vivo oder in vitro zu korrigieren.
  • Heutzutage werden mehrere Methoden für die intrazelluläre Freisetzung dieses Typs von genetischer Information vorgeschlagen. Eine von ihnen beruht insbesondere auf der Anwendung von chemischen oder biochemischen Vektoren. Die synthetischen Vektoren besitzen zwei Hauptfunktionen, nämlich die zu transfektierende DNA zu verdichten und ihre zelluläre Fixierung sowie ihre Passage durch die Plasmamembran und gegebenenfalls durch die zwei nuklearen Membranen zu fördern.
  • Ein wesentlicher Fortschritt wurde bei dieser Art der Transfektion mit der Entwicklung einer Technologie erreicht, die auf der Verwendung eines kationischen Lipides basiert. Es wurde auf diese Weise festgestellt, daß ein positiv geladenes kationisches Lipid, das N-[1-(2,3-Dioleyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) in der Form von Liposomen oder kleinen Vesikeln spontan mit der DNA, die negativ geladen ist, interferieren würde, um Komplexe Lipid-DNA zu bilden, die fähig sind, mit den zellulären Membranen zu fusionieren und auf diese Weise die intrazelluläre Freisetzung der DNA ermöglichen würden. Obwohl dieses Molekül im Bereich der Transfektion wirksam ist, weist es jedoch den Nachteil auf, nicht biologisch abbaubar zu sein und im Hinblick auf die Zellen einen toxischen Charakter zu besitzen.
  • Seit dem DOTMA wurden bei diesem Strukturmodell auch andere kationische Lipide entwickelt: die lipophile Gruppe, assoziiert an eine Aminogruppe über einen Arm, den sogenannten "spacer". Unter diesen kann man ganz besonders diejenigen nennen, die als lipophile Gruppe zwei Fettsäuren oder ein Derivat von Cholesterol umfassen, und die außerdem gegebenenfalls als Aminogruppe eine quaternäre Ammoniumgruppe aufweisen. Die DOTAB, DOBT oder ChOTB können insbesondere in dieser Kategorie von kationischen Lipiden als repräsentativ genannt werden. Andere Verbindungen, wie die DOSC und ChOSC sind durch die Anwesenheit einer Cholin-Gruppe anstelle der quaternären Ammoniumgruppe gekennzeichnet. Im allgemeinen bleibt jedoch die transfektierende Aktivität dieser Verbindungen hinlänglich gering.
  • Eine weitere Kategorie von kationischen Lipiden, die Lipopolyamine, wurde ebenfalls beschrieben, insbesondere in dem Patent EP 349 111. Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck Lipopolyamin ein amphiphiles Molekül, das mindestens einen hydrophilen Bereich Polyamin umfaßt, assoziiert über einen sogenannten Spacer-Bereich an einen lipophilen Bereich. Der kationisch geladene Bereich Polyamin der Lipopolyamine ist fähig, sich in reversibler Weise mit der negativ geladenen Nucleinsäure zu assoziieren. Diese Wechselwirkung verdichtet die Nucleinsäure erheblich. Der lipophile Bereich macht diese ionische Wechselwirkung beim externen Milieu unempfindlich, indem er die gebildeten nucleolipidischen Teilchen mit einer lipidischen Umhüllung bedeckt. Bei diesem Typ von Verbindungen kann die kationische Grup pe durch den Rest L-5-Carboxyspermin dargestellt werden, der vier Ammoniumgruppen enthält, zwei primäre und zwei sekundäre. Die in EP 394 111 beschriebenen DOGS und DPPES bilden insbesondere dabei einen Teil. Diese Lipopolyamine sind bei der Transfektion von primären endokrinen Zellen ganz besonders wirksam.
  • Ein ideales synthetisches Mittel zur Transfektion wird nämlich ein hohes Niveau der Transfektion aufweisen, und dies bei einem breitenSpektrum von Zellen, und es wird keine oder notfalls eine sehr herabgesetzte Toxizität bei den verwendeten Dosierungen besitzen sowie schließlich biologisch abbaubar sein, um jede Nebenwirkung im Bereich der behandelten Zellen zu vermeiden.
  • Die vorliegende Erfindung hat genauer gesagt zum Gegenstand, neue Lipopolyamine vorzuschlagen, die durch ihre Polyamin-Fraktion originell und geeignet sind, in wirksamer Weise bei der Transfektion von Zellen in vitro oder in vivo und insbesondere bei der Vektorisation von Nucleinsäuren verwendet zu werden.
  • Die vorliegende Erfindung hat als erstes Lipopolyamine in der Form D, L oder LD und ihre Salze zum Gegenstand, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt werden:
  • in der
  • R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)q-NRR' darstellen, mit q, das zwischen 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 in unabhängiger Weise zwischen den verschiedenen Gruppen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; variieren kann, und R und R', die unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)q'-NH&sub2; bedeuten, wobei q' zwischen 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 in unabhängiger Weise zwischen den verschiedenen Gruppen R und R' variieren kann,
  • m, n und p, die unabhängig voneinander eine ganze Zahl darstellen, die zwischen 0 und 6 variieren kann, und wenn n höher als 1 ist, m verschiedene Werte und R&sub3; verschiedene Bedeutungen in der allgemeinen Formel (I) annehmen können, und R&sub4;, das eine Gruppe der allgemeinen Formel (II)
  • darstellt, in der
  • R&sub6; und R&sub7; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen bedeuten, wobei mindestens eine der beiden Gruppen von Wasserstoff verschieden ist,
  • u eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 darstellt, und wenn u eine ganze Zahl höher als 1 ist, R&sub5;, X, Y und r verschiedene Bedeutungen in den verschiedenen Struktureinheiten [X-(CHR&sub5;)r-Y] besitzen können,
  • X ein Atom von Sauerstoff oder Schwefel oder eine Gruppe Amino, monoalkyliert oder nicht, bedeutet,
  • Y eine Gruppe Carbonyl oder eine Gruppe Methylen darstellt,
  • R&sub5; ein Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure, gegebenenfalls substituiert, bedeutet, und r eine ganze Zahl ist, die zwischen 1 und 10 variiert, und wenn r gleich 1 ist, R&sub5; eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure darstellt und wenn r höher als 1 ist, R&sub5; ein Wasserstoffatom bedeutet.
  • Unter Seitenkette einer natürlichen Aminosäure versteht man insbesondere wie im Sinne der Erfindung bezeichnet solche Ketten, die Struktureinheiten Amidinium enthalten, wie beispielsweise die Seitenkette von Arginin. Wie vorstehend ausgeführt ist, kann diese Kette durch gesättigte oder ungesättigte, lineare, verzweigte oder cyclische Gruppen mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen substituiert sein, wie beispielsweise die Reste Cholesteryl, Arachidonyl oder Retinoyl oder die mono- oder polyaromatischen Gruppen, wie beispielsweise Benzyloxycarbonyl-, Benzylester- oder Rhodaminyl- Derivate, substituiert oder nicht.
  • Diese neuen Produkte der allgemeinen Formel (I) können in Form von nicht toxischen und pharmazeutisch akzeptablen Salzen vorliegen. Diese nicht toxischen Salze umfassen die Salze mit Mineralsäuren (Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure) oder mit organischen Säuren (Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Fumarsäure, Methansulfonsäure oder Oxalsäure) oder mit Mineralbasen (Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid, Kalk) oder organischen Basen (tertiäre Amine wie Triethylamin, Piperidin, Benzylamin).
  • Als repräsentative Verbindungen gemäß der Erfindung kann man ganz besonders die Verbindungen der folgenden allgemeinen Unterformeln nennen:
  • in denen R&sub4;, R&sub6; und R&sub7; die vorstehenden Bedeutungen besitzen. Vorzugsweise stellt dabei R&sub4; eine Gruppe NR&sub6;R&sub7; dar, mit R&sub6; und R&sub7;, wie sie in den Unterformeln (III) bis (XII) eine identische Gruppe bedeuten, ausgewählt unter (CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;, (CH&sub2;)&sub1;&sub1;CH&sub3;, (CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3; oder (CH&sub2;)&sub1;&sub2;CH&sub3;.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die beanspruchten Verbindungen außerdem ein Zielelement, das es ermöglicht, den Transfer der Nucleinsäure, an das es assoziiert ist, zu orientieren. Dieses Zielelement wird vorzugsweise bei der Verbindung der allgemeinen Formel (I) im Bereich der durch den Substituenten R&sub5; dargestellten Aminosäure-Seitenkette inkorporiert. In noch mehr bevorzugter Weise wird das Zielelement kovalent oder nicht kovalent mit der Verbindung gemäß der Erfindung verbunden.
  • Es kann sich um ein extrazelluläres Zielelement handeln, das es ermöglicht, den Transfer der Nucleinsäure über gewisse zelluläre Typen oder gewisse gewünschte Gewebe (tumorale Zellen, hepatitische Zellen, hämatopoetische Zellen usw.) zu orientieren. Zu diesem Zweck kann es sich um einen Liganden des zellulären Rezeptors handeln, der an der Oberfläche des zellulären Zieltyps anwesend ist, wie beispielsweise ein Zucker, ein Folat, ein Transfer rin, ein Insulin, ein asialo-orosomucoides Protein oder jedes bioaktive Molekül, das von den extrazellulären Rezeptoren erkannt wird. Es kann sich ebenfalls um ein intrazelluläres Zielelement handeln, das es ermöglicht, den Transfer der Nucleinsäure über gewisse bevorzugte zelluläre Abteilungen (Mitochondrien, Kern usw.) zu orientieren, wie beispielsweise eine Signalsequenz der nuklearen Lokalisation (nls), die die Akkumulation der transfektierten ADN in das Innere des Kerns privilegiert.
  • Im allgemeinen schließen die Zielelemente, die geeignet sind, im Rahmen der Erfindung eingesetzt zu werden, Zucker, Peptide, Oligonucleotide, Steroide oder Lipide ein. In bevorzugter Weise handelt es sich um Zucker und/oder Peptide wie Antikörpern oder Fragmente von Antikörpern, zelluläre Rezeptor-Liganden oder deren Fragmenten, Rezeptoren oder Fragmente von Rezeptoren usw. Insbesondere kann es sich um die Liganden von Rezeptoren der Wachstumsfaktoren, von Rezeptoren der Cytokine, von Rezeptoren der zellulären Lectine oder von Rezeptoren der Adhäsionsproteine wie die Integrine handeln. Man kann ebenfalls den Rezeptor des Transferrins und den von Lipiden HDL oder LDL nennen. Das Zielelement kann auch ein Zucker sein, der es ermöglicht, auf Lectine wie die asiaglycoproteinischen Rezeptoren zu zielen, oder ebenfalls ein Fragment Fab von Antikörpern, das das Zielen auf den Rezeptor des Fragmentes Fc der Immunoglobuline ermöglicht.
  • In gleicher Weise ist es möglich, die Assoziation an eine Verbindung der Formel (I) von einem Markierungsmittel, beispielsweise vom Typ Biotin, Rhodamin, Folat an die Seitenkette der Aminosäure R&sub5; ins Auge zu fassen. Dieses Markierungsmittel kann ebenfalls eine lineare oder cyclische peptidische oder pseudopeptidische Sequenz sein, die das Epitop Arg-Gly-Asp zur Wiedererkennung der primären und/oder sekundären Rezeptoren der Adhäsionsproteine vom Typ der Integrine umfaßt.
  • Zur Veranschaulichung der beanspruchten Lipopolyamine kann man ganz besonders die folgenden Verbindungen nennen, die detaillierter in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind:
  • H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
  • H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHC&sub2;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
  • H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArgN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
  • H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArg(Z)&sub2;N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
  • H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Rhodamin)N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
  • H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Biotinyl)N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
  • [H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;](CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
  • [H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;]&sub2;N(CH&sub2;)NH(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;](CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
  • [H&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
  • [H&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub2;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;]CH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLysN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys[Cl-Z]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys[CHO]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys[Cholesteryl]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys[Arachidonyl]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGluN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[N(CH&sub3;)&sub2;]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[O-Bz]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[Galactosamid]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[Glucosamid]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[Mannosamid]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;CONH(CH&sub2;)&sub5;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub1;CH&sub3;]&sub2;
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub2;CH&sub3;]&sub2; und
  • NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;]&sub2;
  • Als besonders repräsentative Verbindungen für die vorliegende Erfindung kann man ganz besonders diejenigen nennen, denen allgemeine Formel nachstehend dargestellt ist.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde außerdem eine originelle Methodologie in fester Phase zur Herstellung von asymmetrischen, funktionalisierten Polyaminen entwickelt, von denen sich die Lipopolyamine gemäß der Erfindung ableiten.
  • In klassischer Weise wird der Zugang zu den asymmetrischen, funktionalisierten Polyaminen durch die Notwendigkeit eingeschränkt, selektiv Modifizierungen in die linearen oder verzweigten symmetrischen Polyaminen einzubringen. Die chemischen Unterschiede zwischen den primären und sekundären Aminogruppen eines Polyamins erfordern eine große Selektivität, um Reaktionen wie Alkylierungen, Additionen vom Typ Michael oder Acylierungen durchzuführen. Außerdem ist die durch derartige chemische Unterschiede auferlegte Selektivität nicht mit einer selektiven Alkylierung in einer Gruppe von mehreren primären und sekundären Aminen kompatibel, wie man sie in den Polyaminen vorfindet. Die klassische Antwort auf solche Restriktionen ist der Aufbau von asymmetrischen funktionalisierten Polyaminen ausgehend von Blockmonomeren, die an einer Seite eine Aminogruppe tragen, die fähig ist, ein "Polyamin" zu sein und an der anderen Seite die in geeigneter Weise geschützte asymmetrische Funktion. Diese Annäherung erfordert daher eine lästige Strategie zur Synthese in mehreren Stufen und insbesondere einen ordnungsgemäßen Schutz der funktionellen Gruppen.
  • Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung entwickelte Methode hat genauer gesagt zum Gegenstand, sich von den Nachteilen zu befreien, denen man bis heute bei diesem Synthesetyp begegnet. Sie weist den deutlichen Vorteil auf, in bequemer und schneller Weise zu Polyaminen zu führen, die an einer einzigen primären Aminogruppe durch Alkylierung oder reduzierende Alkylierung der symmetrischen Polyamine selektiv funktionalisiert sind.
  • Das Prinzip des beanspruchten Verfahren beruht auf der Anwendung einer Synthesemethode in fester Phase, um eine bimolekulare Reaktion zwischen dem alkylierenden Reaktanden und dem Polyamin zu begünstigen, was dessen Polyalkylierung selbst verhindert. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kupplung von mindestens einer lipidischen Fraktion an mindestens eine asymmetrische Polyamin-Fraktion durchgeführt wird, wobei die genannte Polyamin-Fraktion zuvor durch bimolekulare Reaktion zwischen einem Alkylierungsmittel, das kovalent an einen festen Träger gebunden ist, und einem symmetrischen Polyamin erhalten wurde. Bei dieser Annäherung wird das alkylierende Reagens kovalent durch Veresterung oder Amidierung an einen polymeren Träger gebunden. Das symmetrische Polyamin reagiert mit dem Alkylierungs mittel in fester Phase durch eine bimolekulare Reaktion, die zu einem an einen Träger gebundenen mono-funktionalisierten, asymmetrischen Polyamin führt. Die freien Aminogruppen des Produktes werden üblicherweise in fester Phase durch Schutzgruppen vom Typ BOC oder Z geschützt und schließlich werden die Produkte vom Träger der festen Phase abgespalten. Diese polyaminierten Säuren werden wie empfohlen mit den lipidischen Fraktionen gekuppelt, um die gesuchten Mittel zur Transfektion zu erhalten. Bei dieser Kupplung ist es möglich, gebräuchliche peptidische Kupplungsmittel wie beispielsweise BOP, Pybop, BopCl und DCC einzusetzen. Die Methodologie ermöglicht ebenfalls, das Transfektionsmittel vollständig mit dem festen Träger zusammenzufügen, gegebenenfalls mit Einfügung von Tracer-Peptiden, Zuckern oder Fluoreszenzsonden in die Moleküle. Selbstverständlich erweist es sich als möglich, diesen Typ der Pfropfung an dem freien Lipopolyamin vorzunehmen. Die Durchführbarkeit der Methode wurde durch die Synthese von mehreren linearen oder verzweigten, asymmetrischen und funktionalisierten polyaminierten Säuren demonstriert.
  • Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls jede therapeutische Anwendung der wie vorstehend beschriebenen Lipopolyamine zum Gegenstand, entweder direkt oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen.
  • Wie vorstehend ausgeführt, erweisen sich die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ganz besonders interessant bei der Transfektion von Nucleinsäuren in vitro und in vivo. Sie verdichten in wirksamer Weise die DNA und weisen vorteilhafterweise eine sehr herabgesetzte Toxizität auf.
  • Um eine maximale Wirkung der Zusammensetzungen gemäß der Erfindung zu erhalten, werden die jeweiligen Verhältnisse von der Verbindung der allgemeinen Formel (I) und der Nucleinsäure vorzugsweise in der Weise bestimmt, daß das Verhältnis R, positive Ladungen des Lipopolyamins, betrachtet pro negative Ladungen der genannten Nucleinsäure, optimal ist. Dieses optimale Verhältnis, das insbesondere je nach der Anwendungsmethode, nämlich in vivo oder in vitro, und nach dem zu transfektierenden Zelltyp variiert, wird von Fall zu Fall optimiert. Diese Optimierung unterliegt der Zuständigkeit des Fachmannes.
  • In den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann das Polynucleotid auch eine Desoxyribonucleinsäure sowie eine Ribonucleinsäure sein. Es kann sich um Sequenzen natürlichen oder künstlichen Ursprungs handeln und insbesondere um genomische DNA, c-DNA, m-RNA, t-RNA, r-RNA, Hybridsequenzen oder synthetische oder halbsynthetische Sequenzen von Oligonucleotiden, modifiziert oder nicht. Diese Nucleinsäuren können menschlichen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen usw. Ursprungs sein. Sie können durch jede dem Fachmann bekannte Technik erhalten werden und insbesondere durch Screening von Banken, durch chemische Synthese oder auch nach gemischten Methoden, die eine chemische oder enzymatische Modifizierung der durch Aussieben von Banken erhaltenen Sequenzen einschließen. Sie können außerdem in die Vektoren, wie die plasmidischen Vektoren, inkorporiert werden.
  • Was ganz besonders die Desoxyribonucleinsäuren betrifft, so können sie aus einem einfachen oder doppelten Strang bestehen, in gleicher Weise wie Oligonucleotide kurz oder Sequenzen länger sind. Diese Desoxyribonucleinsäuren können therapeutische Gene, die Transcription oder die Replikation regulierende Sequenzen, modifizierte oder nicht modifizierte Antisens-Sequenzen, Bereiche der Bindung an andere zelluläre Bestandteile usw. tragen.
  • Im Sinne der Erfindung versteht man unter therapeutischem Gen insbesondere jedes Gen, das für ein proteinisches Produkt mit therapeutischer Wirkung kodiert. Das auf diese Weise kodierte proteinische Produkt kann ein Protein, ein Peptid usw. sein. Dieses proteinische Produkt kann gegenüber der Zielzelle (d. h. einem Produkt, das normalerweise in der Zielzelle exprimiert ist, wenn sie keinen pathologischen Zustand aufweist) homologiert werden. In diesem Fall ermöglicht die Expression eines Proteins beispielsweise, eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines inaktiven oder gering aktiven Proteins im Hinblick auf eine Modifizierung zu beseitigen oder auch das genannte Protein überzuexprimieren. Das therapeutische Gen kann auch für einen Mutanten eines zellulären Proteins mit einer gesteigerten Aktivität eine modifizierte Aktivität kodieren usw. Das proteinische Produkt kann ebenfalls gegenüber der Zielzelle heterologiert werden. In diesem Fall kann beispielsweise ein exprimiertes Protein vervollständigt werden oder eine schwache Aktivität in die Zelle einbringen, die ihr ermöglicht, gegen eine Pathologie vorzugehen oder eine immunitäre Antwortreaktion zu stimulieren.
  • Unter den im Sinne der vorliegenden Erfindung therapeutischen Produkten kann man ganz besonders nennen: die Enzyme, die Blutderivate, die Hormone, die Lymphokine: Interleukine, Interferone, TNF usw. (FR 9203120), die Wachstumsfaktoren, die Neurotransmitter oder ihre Vorläufer oder Syntheseenzyme, die trophischen Faktoren: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/Pleiotrophin usw., das Dystrophin oder ein Minidystrophin (FR 9111947), das Protein CFTR, assoziiert an Mukoviszidose, die Suppressor-Gene von Tumoren: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev usw. (FR 93 04745), die Gene, die für die bei der Koagulation eingebundenen Faktoren kodieren: Faktoren VII, VIII, IX, die Gene, die bei der Reparatur von DNA eingreifen, die Suizidgene (Thymidinkinase, Cytosin-deaminase), die Gene des Hämoglobins oder anderer proteinischer Transporteure, die Gene, die den beim Metabolismus von Lipiden einbezogenen Proteinen entsprechen, vom Typ der Apolipoproteine, ausgewählt unter den Apolipoproteinen A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J und (apo)a, die Metabolismus-Enzyme wie beispielsweise die Lipoprotein-lipase, die hepatische Lipase, die Lecithin-cholesterol-acyltransferase, die 7-alpha-Cholesterol-hydroxylase, die phosphatidische Säurephosphatase, oder auch Transfer-Proteine von Lipiden wie das Transfer-Protein der Cholesterol-Ester und das Transfer-Protein der Phospholipide, ein Bindungsprotein der HDL oder auch ein Rezeptor, beispielsweise ausgewählt unter den Rezeptoren LDL, den Rezeptoren von Chylomicrons-remnants und den Rezeptoren scavenger usw.
  • Die therapeutische Nucleinsäure kann ebenfalls ein Gen oder eine Antisens-Sequenz sein, deren Expression in die Zielzelle ermöglicht, die Expression des Gens oder die Transcription von zellulärer m-RNA zu kontrollieren. Derartige Sequenzen können beispielsweise in die Zielzelle in zusätzliche RNA von zellulärer m-RNA transkribiert werden und auf diese Weise ihre Übertragung in Protein blockieren, gemäß der in dem Patent EP 140 308 beschriebenen Technik. Die therapeutischen Gene umfassen ebenfalls Sequenzen, die für Ribozyme kodieren, die ihrerseits fähig sind, Ziel-RNA selektiv zu zerstören (EP 321 210).
  • Wie weiter oben angegeben, kann die Nucleinsäure ebenfalls ein oder mehrere Gene umfassen, die für ein antigenisches Peptid kodieren, das fähig ist, beim Menschen oder beim Tier eine Immunantwort zu erzeugen. In diesem besonderen Fall der Anwendung ermöglicht die Erfindung daher entweder die Realisierung von Vakzinen oder beim Menschen oder Tier angewendete immunotherapeutische Behandlungen, insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebs. Es kann sich insbesondere um spezifische antigenische Peptide des Virus von Epstein Barr, des Virus HIV, des Virus von Hepatitis B (EP 185 573), des Virus der Pseudotollwut, des "syncitia forming virus" und um andere oder noch spezifischere Viren von Tumoren handeln (EP 259 212).
  • In bevorzugter Weise umfaßt die Nucleinsäure ebenfalls Sequenzen, die eine Expression des therapeutischen Gens und/oder des Gens ermöglichen, das für das antigenische Peptid in der gewünschten Zelle oder in dem gewünschten Organ kodiert. Es kann sich um Sequenzen handeln, die natürlicherweise für die Expression des betrachteten Gens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen fähig sind, in der infizierten Zelle zu arbeiten. Es kann sich ebenfalls um Sequenzen verschiedener Herkunft (verantwortlich für die Expression von anderen Proteinen, oder sogar synthetischen) handeln. Insbesondere kann es sich um Promotorsequenzen von eucaryotischen oder viralen Genen handeln. Beispielsweise kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die vom Genom der Zelle stammen, die man zu infizieren wünscht. In gleicher Weise kann es sich um promotorische Sequenzen handeln, die vom Genom eines Virus stammen. In dieser Hinsicht kann man beispielsweise die Promotoren der Gene E1A, MLP, CMV, RSV usw. nennen. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Addition von Sequenzen zur Aktivierung, zur Regulierung usw. modifiziert werden. Es kann sich auch um Promotoren handeln, die inductibel oder repressibel sind.
  • Außerdem kann die Nucleinsäure ebenfalls insbesondere einen Vorläufer des therapeutischen Gens umfassen, eine Signalsequenz, die das synthetisierte therapeutische Produkt in die Sekretionswege der Zielzelle dirigiert. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produktes sein, aber es ist ebenfalls möglich, daß es sich um jede andere funktionelle Signalsequenz handelt oder auch um eine künstliche Signalsequenz. Die Nucleinsäure kann ebenfalls eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische Produkt in einen besonderen Raum der Zelle dirigiert.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die eine Nucleinsäure, ein wie beanspruchtes Lipopolyamin und einen Zusatzstoff umfassen, der fähig ist, sich an den Komplex Lipopolyamin/Nucleinsäure zu assoziieren und/oder dessen Transfektionsvermögen zu verbessern. Die Anmelderin hat nämlich gezeigt, daß das Transfektionsvermögen der Lipopolyamine in unerwarteter Weise in Anwesenheit von gewissen Zu satzstoffen (beispielsweise Lipide, Peptide oder Proteine) erhöht werden kann, die fähig sind, sich an den Komplex Lipopolyamin/Nucleinsäure zu assoziieren.
  • Unter diesem Gesichtspunkt können die Zusammensetzungen der Erfindung als Zusatzstoff ein oder mehrere neutrale Lipide umfassen. Derartige Zusammensetzungen sind besonders vorteilhaft, insbesondere wenn das Verhältnis R gering ist. Die Anmelderin hat nämlich gezeigt, daß die Zugabe eines neutralen Lipides ermöglicht, die Bildung von nucleolipidischen Teilchen zu verbessern und in überraschender Weise das Eindringen des Teilchens in die Zelle unter Destabilisierung ihrer Membran zu begünstigen.
  • In besonderer Weise sind die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten neutralen Lipide solche mit 2 Fettketten.
  • In besonders vorteilhafter Weise verwendet man natürliche oder synthetische, zwitterionische Lipide oder solche, die unter physiologischen Bedingungen von ionischer Ladung frei sind. Sie können insbesondere ausgewählt werden unter Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE), Oleyl-palmitoylphosphatidyl-ethanolamin (POPE), Di-stearoyl, -palmitoyl, -myristoyl phosphatidyl-ethanolaminen sowie ihren ein- bis dreimal N-methylierten Derivaten; den Phosphatidyl-glycerinen, den Diacyl-glycerinen, den Glycosyldiacyl-glycerinen, den Cerebrosiden (wie insbesondere den Galactocerebrosiden), den Sphingolipiden (wie insbesondere den Sphingomyelinen) und den Asialogangliosiden (wie insbesondere den asialoGMl und GM2).
  • Diese verschiedenen Lipide können entweder durch Synthese oder durch Extraktion von Organen (Beispiel: Gehirn) oder Eiern nach dem Fachmann bekannten klassischen Techniken erhalten werden. Insbesondere kann die Extraktion der natürlichen Lipide mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln realisiert werden (siehe ebenfalls Lehninger, Biochemistry).
  • Vor kurzem hat die Anmelderin gezeigt, daß es ebenfalls besonders vorteilhaft ist als Zusatzstoff eine Verbindung zu ver wenden, die im Bereich der Kondensation der genannten Nucleinsäure eingreift oder nicht direkt eingreift (WO 96/25508).
  • Die Anwesenheit eine derartigen Verbindung in einer transfektierenden Zusammensetzung auf der Basis eines Lipopolyamins ermöglicht es, die Menge an diesem Mittel in beträchtlicher Weise mit begünstigenden Konsequenzen herabzusetzen, die sich auf toxikologischem Gebiet ergeben, ohne jedoch irgendeine Beeinträchtigung bei der transfektierenden Aktivität der genannten Zusammensetzung mit sich zu bringen. Demgegenüber besitzt sie vorteilhafterweise ein hohes Niveau der Transfektion.
  • Unter Verbindung, die im Bereich der Kondensation der Nucleinsäure eingreift, versteht man eine Verbindung zu definieren, die direkt oder nicht direkt die Nucleinsäure verdichtet. Genauer gesagt kann diese Verbindung entweder direkt im Bereich der zu transfektierenden Nucleinsäure wirken oder im Bereich einer angelagerten Verbindung eingreifen, die ihr bei der Kondensation dieser Nucleinsäure vermittelt wird. Vorzugsweise wird sie direkt im Bereich der Nucleinsäure wirken.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform besteht dieses Mittel, das im Bereich der Kondensation der Nucleinsäuren eingreift, vollständig oder teilweise aus peptidischen Struktureinheiten (KTPKKAKKP) und/oder (ATPAKKAA), wobei die Anzahl der Struktureinheiten zwischen 2 und 10 variieren kann. In der Struktur der Verbindung gemäß der Erfindung können diese Struktureinheiten kontinuierlich wiederkehren oder nicht. So können sie durch Bindungen biochemischer Beschaffenheit, beispielsweise ein oder mehrere Aminosäuren, oder chemischer Beschaffenheit getrennt sein. Ein derartiges Mittel kann sich ebenfalls vollständig oder teilweise von einem Histon, einem Nucleolin, einem Protamin und/oder von einem ihrer Derivate ableiten.
  • In bevorzugter Weise umfassen die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung 0,01 bis 20 Äquivalente Zusatzstoff pro Äquivalent Nucleinsäuren (in Gew./Gew.) und vorzugsweise 0,5 bis 5 Äquivalente.
  • Die Zusammensetzungen können im Hinblick auf ihre Verabreichung auf topischem, kutanem, oralem, rektalem, vaginalem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem, transdermalem usw. Wege formuliert werden. Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung einen für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion in den Bereich des gewünschte Organs oder für eine Verabreichung auf topischem Wege (auf die Haut und/oder die Schleimhaut) pharmazeutisch akzeptablen Füllstoff. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder getrocknete, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen handeln, die je nach Fall durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Bildung von injizierbaren Lösungen gestatten. Die Dosierungen der pro Injektion verwendeten Nucleinsäure sowie die Anzahl der Verabreichungen können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern angepaßt werden, insbesondere in Abhängigkeit von der angewendeten Art der Verabreichung, der betreffenden Erkrankung, des zu exprimierenden Gens oder auch der Dauer der gewünschten Behandlung. Was ganz besonders die Art der Verabreichung betrifft, so kann es sich entweder um eine direkte Injektion in die Gewebe oder die Kreislaufwege handeln oder um eine Behandlung von Zellen in Kultur, gefolgt von ihrer Reimplantation in vivo durch Injektion oder Pfropfen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auf diese Weise eine besonders vorteilhafte Methode zur Behandlung von Erkrankungen, umfassend die Verabreichung einer Nucleinsäure in vivo oder in vitro, die, assoziiert an eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) unter den vorstehend definierten Bedingungen fähig ist, bei der genannten Erkrankung eine Besserung zu gewährleisten. Diese Methode ist ganz besonders bei solchen Erkrankungen anwendbar, die auf einer Defizienz eines proteinischen oder nucleinischen Produktes beruhen und die verabreichte Nucleinsäure kodiert für das genannte proteinische Produkt oder enthält das genannte nucleinische Produkt.
  • Sie erstreckt sich auf jede Anwendung eines Lipopolyamins gemäß der Erfindung bei der Transfektion von Zellen in vivo oder in vitro.
  • Die vorliegende Erfindung wird noch vollständiger mit Hilfe der folgenden Beispiele und Figuren beschrieben, die nur als veranschaulichend und nicht als einschränkend betrachtet werden sollen.
    • FIGUREN
  • Figur (1): Messung der Wirksamkeit der Transfektion nach Behandlung von Zellen NIH 3T3 (Embryonalzellen der Maus - Fibroblasten) durch verschiedene kationische Lipide.
  • Figur (2): Messung der Wirksamkeit der Transfektion nach Behandlung von Zellen SMC Kaninchen (primäre Kultur von muskulären Gewebezellen der Aorta vom Kaninchen) durch verschiedene kationische Lipide.
  • Figur (3): Messung der Wirksamkeit der Transfektion nach Behandlung von Zellen 3LL (Lungenkarzinom nach Lewis) durch verschiedene kationische Lipide.
  • Figur (4): Messung der Wirksamkeit der Transfektion nach Behandlung von Zellen NIH 3T3 (Embryonalzellen der Maus - Fibroblasten) durch verschiedene kationische Lipide.
  • Figur (5): Wirkung der Konzentration an DOPE auf die Wirksamkeit der Transfektion von Zellen 3LL.
  • Figur (6): Transfektion von Zellen NIH 3T3 mit variablen Mengen von DNA und einem konstanten Verhältnis Nanomol Lipofectant/ ug DNA.
    • ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE
  • AcOEt: Ethylacetat
  • BOC: t-Butoxycarbonyl
  • BOP: Benzotriazol-1-yloxytris-(dimethylamino) phosphonium-hexafluorphosphat
  • DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
  • DCU: Dicyclohexylharnstoff
  • DMAP: 4-Dimethylaminopyridin
  • DMF: Dimethylformamid
  • DMSO: Dimethylsulfoxid
  • DODA: Dioctadecylamin
  • EP: Petrolether
  • EtOH: Ethanol
  • NEt&sub3;: Triethylamin
  • Rf: Koeffizient der frontalen Retention
  • TFA: Trifluoressigsäure
  • THF: Tetrahydrofuran
  • TMS: Tetramethylsilan
  • UV: Ultraviolett
  • SPPS: Festphasen-Peptidsynthese
  • HPLC: Hochdruck-Flüssig-Chromatographie
  • Z: Benzyloxycarbonyl
  • ClZ: p-Chlorbenzyloxycarbonyl
    • A - MATERIALIEN UND METHODEN FÜR DIE CHEMISCHEN SYNTHESEN 1 - MATERIAL a) Verbindungen
  • - Die Polyamine als Ausgangsstoffe sind im Handel verfügbar, beispielsweise Spermidin, Spermin, tris-(2-Aminoethyl)-amin, Phenylendiamin, Diamino-ethan (Propan, Butan, Pentan, Hexan usw.) oder können nach klassischen Methoden synthetisiert werden, beispielsweise durch erschöpfende Cyanoethylierung von im Handel verfügbaren Aminen wie Diamino-ethan (Propan, Butan, Pentan, Hexan usw.) Amin, Spermidin, Spermin, um die verzweigten Polyamine zu ergeben.
  • - Die Alkylierungsmittel werden in Abhängigkeit von der Alkylierungsmethode wie folgt ausgewählt:
  • Für eine klassische Alkylierung: Bromessigsäure, ω-Halogencarbonsäuren,
  • Für eine reduzierende Alkylierung: eine ω-Aldehydcarbonsäure wie Glyoxalsäure, Semi-Aldehydbernsteinsäure usw. oder eine Ketosäure wie Acetessigsäure oder Brenztraubensäure usw.,
  • - Die verwendeten Polymere sind im Handel verfügbare Harze für die Peptidsynthese in fester Phase (Merrifield-Synthese), beispielsweise O-Chlortrityl-chlorid, Harz HMP, die Produkte mit freien Säurefunktionen liefern oder ein Harz vom Typ Rink. Die polyaminierten Säuren können direkt mit einem vorsynthetisierten Peptid in fester Phase synthetisiert werden, das eine Funktion Bromalkyl oder eine ω-Aldehydsäure trägt.
  • - Die Produkte Dioctadecylamin, Triethylamin, Trifluoressigsäure, BOP, DMAP, Chlorameisensäure-benzylester von Aldrich sind handelsüblich. Die Lösungen von NaCl und NaHCO&sub3; sind gesättigt; die Lösung KHSO&sub4; ist 0,5 M.
    • b) Physikalische Messungen
  • Die NMR-Spektren Proton wurden an Spektrometern Bruker 400 und 600 MHz aufgenommen.
  • Die Massenspektren wurden auf einem API-MS/III realisiert.
    • c) Chromatographie-Technik
  • Die Analysen HPLC wurden auf einem Apparat Merck-Hitachi realisiert, ausgestattet mit einem Autosampler AS-2000A, einer intelligenten Pumpe L-6200A und einem Detektor UV-vis L-4000, mit einer einstellbaren Wellenlänge, auf 220 nm für analytische Trennungen und auf 235 nm für präparative Trennungen. Die Kolonnen für die analytischen Trennungen sind Kolonnen BU-300 Aquapore Butyl 7 m, 300 A 300 · 4,6 mm von Perkin-Elmer und für die präparativen Trennungen Kolonnen Biosil C18 HL 90-10 250 · 10 mm von Biorad. Die mobilen Phasen sind H&sub2;O (0,1% TFA) und Acetonitril (0,1% TFA). Der Durchsatz für die analytischen Analysen wird auf 1 ml/min und für die präparativen auf 4 ml/min eingestellt.
  • Die Dünnschichtchromatographien (CCM) wurden auf Platten mit Kieselgel Merck von 0,2 mm Dicke durchgeführt.
  • Die Chromatographien auf Kolonne wurden auf Kieselgel 60 Merck mit einer Granulometrie von 0,063 - 0,200 mm durchgeführt.
  • Sie werden entweder bei UV (254 nm) mit Ninhydrin sichtbar gemacht, indem eine ethanolische Lösung von Ninhydrin (40 mg/ 100 ml EtOH) verdampft wird (leichtes Spray), um die Amine oder die Amide unter Erhitzen auf 150ºC zu sehen, oder mit Fluorescamin unter Verdampfen einer Lösung (40 mg/100 ml Aceton), um die primären Amine zu sehen, oder mit Iod, indem man die Platte mit Iodpulver bedeckt.
  • Die Chromatographien auf Kolonne wurden auf Kieselgel 60 Merck mit einer Granulometrie von 0,063 - 0,200 mm durchgeführt.
    • d) Technik der Synthese in fester Phase (SPPS)
  • Sie Synthese in fester Phase wird in einem manuellen Reaktor für die Peptidsynthese SPPS aus handwerklicher Fertigung realisiert und der Rührer ist ein Flask Shaker Modell A5-6021. Der Verlauf der Kupplung der Polyamine in fester Phase sowie der Verlauf des Schutzes der Polyamine in SPPS wird durch den Test von Kaiser verfolgt [Kaiser, E., Colescolt, D. L., Bossinger, C. D. and Cook, P. I. Anal. Biochem. 34(2), 595 (1970)].
  • Das in den Beispielen für die SPPS verwendete Harz ist Chlortritylchlorid-Harz von NOVABIOCHEM, Schweiz.
    • 2 - ALLGEMEINE VERFAHRENSWEISE a) - Synthese der symmetrischen Polyamine, veranschaulicht durch die Herstellung von (N,N,N',N'-Tetraaminopropyl)-1,4-diaminobutan
  • In einen Dreihalskolben von 2 Litern trägt man 147 g 1,4- Diaminobutan und 1000 ml entmineralisiertes Wasser ein. Dann wird die Lösung einem magnetischen Rühren unterzogen. Über das Zwischenstück eines isobaren Tropftrichters trägt man innerhalb von einer Stunde 443 g Acetonitril ein, wobei die Temperatur auf 38ºC gehalten wird. Anschließend bringt man einen Rückflußkühler an und hält die Masse auf einem Wasserbad eine Stunde lang bei 80ºC. Der Test mit Fluorescamin erweist sich als negativ und der Überschuß von Acetonitril wird im Vakuum bei 40ºC verdampft.
  • Man erhält zwei Phasen. Die untere organische Phase wird abgetrennt, mit 300 ml Wasser gewaschen und in einen Kolben von 1000 ml gegeben. Dann setzt man 170 ml einer Mischung Wasser/Methanol (1/1, V/V) hinzu und läßt über Nacht kristallisieren. Am nächsten Tag werden die Kristalle über eine Glasfritte der Porosität 3 von 500 ml. L filtriert.
  • Der Kuchen wird auf der Glasfritte mit Methanol (2 · 170 ml) und Ether (2 · 150 ml) gewaschen. Anschließend wird das Produkt auf der Platte eines Trockenapparates unter Vakuum (26 mm) über Nacht getrocknet. Man erhält auf diese Weise 461 g Produkt (Ausbeute 93%). Das Produkt wurde durch NMR und MS analysiert und die Analysen sind kompatibel. Dann wird das Produkt ohne weitere Reinigung hydriert.
  • In einen Autoklaven aus rostfreiem Stahl von 1 Liter trägt man 30 g des vorstehenden Polynitrils (0,1 Mol) ein. Gleichzeitig bereitet man in einem Becher eine Lösung von 140 ml Ethanol (95%) und 8 g Natriumhydroxid (0,2 Mol) zu. Wenn das Natriumhydroxid aufgelöst ist, trägt man diese Lösung in den Autoklaven ein. Anschließend wird Stickstoff in den Autoklaven eingelassen, dann trägt man 8 ml Raney-Nickel auf Kohle ein und verschließt den Autoklaven. Der Ausgangsdruck der Hydrierung beträgt 52 at und er fällt innerhalb von 5 Stunden bei Umgebungstemperatur auf 28,5 at ab. Dann wird die Suspension über Papier filtriert, das Filter mit Ethanol (2 · 25 ml) gewaschen und die Filtrate im Vakuum bis zur Trockne konzentriert. Das Öl wird mit 30 ml Wasser vermischt und mit 100 ml Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird unter MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und anschließend im Vakuum eingedampft. Man erhält ein gelbliches fluides Öl (27 g, Ausbeute 85%).
  • Das Produkt wurde durch CCM (Monofleck), NMR und MS analysiert und die Analysen waren kompatibel. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung verwendet.
    • b) - Methode A: Verankerung einer Säurefunktion auf dem Polymer- Träger
  • Das Harz Chlortrityl-chlorid (5 g, 1,2 mMol Cl/g Harz) wird in einen Reaktor SPPS eingetragen, eine Menge von 50 ml Methylenchlorid zugesetzt und die Mischung 5 min lang gerührt. Anschließend werden Bromessigsäure (1,05 g, 7 mMol) und danach DIEA (0,95 ml, 7,5 mMol) zugegeben. Dann wird der Reaktor zwei Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Flüssigkeit wird filtriert und das Harz mit Methylenchlorid, iPrOH (10 · 50 ml) und MeOH (2 · 50 ml) gewaschen. Schließlich wird das Harz unter einem Strom von Stickstoff getrocknet.
    • c) - Methode B: Reaktion der Polyamine mit Bromacetyl-Harz
  • Das Polyamin (10 Mol Überschuß) wird in 50 ml Methylenchlorid gelöst, das das nach Methode A erhaltene Produkt enthält. Dann wird der Reaktor 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel filtriert und das Harz mit Methylenchlorid und iPrOH (10 · 50 ml) gewaschen. Der Test nach Kaiser ist positiv.
    • d) - Schutz der Polyaminosäuren auf dem Harz Methode C
  • Das Di-tert.-Butyldicarbonat (48 mMol) und das DIEA (50 mMol) werden in Methylenchlorid (50 ml) gelöst und in den Reaktor eingetragen, der das nach Methode B erhaltene Produkt enthält. Dann wird der Reaktor über Nacht gerührt. Am nächsten Tag ist der Test nach Kaiser negativ. Das Lösungsmittel wird filtriert und das Harz alternativ mit Methylenchlorid und iPrOH (10 · 50 ml), MeOH (2 · 50 ml) und Ether (2 · 50 ml) gewaschen. Das Harz wird unter einem Strom von Stickstoff getrocknet. Der Test nach Kaiser ist immer negativ.
    • Methode D
  • Das nach der Methode B erhaltene Harz (1,5 g) wird in einen Kolben eingebracht und Methylenchlorid (20 ml) zugesetzt, gefolgt von DIEA (20 mMol). Anschließend wird die Mischung magnetisch gerührt und Chlorameisensäure-benzylester (14 mIviol) tropfenweise innerhalb von 5 min zugegeben. Durch Zugabe von DIEA wird der pH-Wert auf 11 gehalten. Nach einer Nacht wird das Harz in einen Reaktor SPPS überführt, filtriert und alternativ mit Methylenchlorid, iPrOH (10 · 20 ml) und Ether (2 · 20 ml) gewaschen. Anschließend wird das Harz unter einem Strom von Stickstoff getrocknet.
    • e) - Methode E: Abspaltung der geschützten Polyaminosäuren vom Harz
  • Die nach der Methode C und D erhaltenen Harze werden in einen Kolben von 250 ml eingetragen, der mit einem magnetischen Rührstab ausgestattet ist. Anschließend wird eine Lösung, zusammengesetzt aus 50 ml Methylenchlorid und 25 ml CF&sub3;CH&sub2;CH, zugegeben und die Mischung zwei Stunden lang gerührt. Dann wird die Lösung filtriert, das Harz mit Methylenchlorid (2 · 10 ml) gewaschen und die auf diese Weise erhaltenen organischen Phasen vereinigt sowie im Vakuum eingedampft. Anschließend werden die Produkte durch Flash-Chromatographie über SiO&sub2; mit CHCl&sub3;/MeOH (9/1) als Eluent gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden durch CCM identifiziert. (Für mehr umfassende Details siehe die nachfolgenden Beispiele).
    • f) - Methode F: Kupplung der aminierten Säuren mit Dilipidylaminen.
  • Boc-Säureamin (10 mMol) und Dilipidylamin C&sub1;&sub2;-C&sub2;&sub2; (10 mMol) werden in einen Kolben von 250 ml eingetragen. Dann wird Chloroform (100 ml) zugesetzt und die Mischung bis zur vollständigen Auflösung gerührt. Anschließend werden TEA (30 mMol) und BOP (33 mMol) zugegeben. Der pH-Wert wird mit TEA auf 10 gehalten und die Reaktionsmischung 2 Stunden lang gerührt. Nach Beendigung der Reaktion (CCM) wird das Chloroform verdampft und der Feststoff in Ethylacetat (300 ml) aufgenommen. Dann wird die organische Phase mit KHSO&sub4; (4 · 100 ml), NaHCO&sub3; (4 · 100 ml) und NaCl (4 · 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wird unter MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft. Die Produkte werden durch CCM, NMR und MS analysiert und ohne weitere Reinigungen weiterverwendet. Die Ausbeuten liegen in der Größenordnung von 90%.
    • g) - Kupplung der geschützten Polyaminosäuren mit Dilipidylsäureamiden und Abspaltung der Schutzgruppen Boc und Z Methode G
  • Das nach der Methode F erhaltene Produkt (9 mMol) wird in einen mit einem magnetischen Rührstab ausgestatteten Kolben eingetragen und kalte TFA (4ºC) zugesetzt (30 ml). Anschließend wird die Lösung eine Stunde lang gerührt und danach die TFA im Vakuum verdampft. Das Produkt wird durch Zugabe von Dimethylformamid (70 ml) aufgelöst. Dann setzt man TEA (30 mMol) hinzu und danach die nach Methode E erhaltene geschützte Polyaminosäure (9 mMol). Der pH-Wert wird auf 10 eingestellt und BOP (33 mMol) zugesetzt. Die Lösung wird zwei Stunden lang gerührt und durch CCM verfolgt. Nach Beendigung der Kupplung (CCM) wird eine Lösung von KHSO&sub4; (700 ml) zugegeben und das Produkt mit Ethylacetat (3 · 100 ml) extrahiert. Die organische Phase wird mit KHSO&sub4; (3 · 50 ml), NaHCO&sub3; (3 · 50 ml) und NaCl (3 · 50 ml) gewaschen, unter MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft. Die Produkte werden durch NMR, CCM und MS analysiert und ohne vorherige Reinigung die Schutzgruppen entfernt. Anschließend wird TFA (50 ml) zu dem Produkt gegeben, die Lösung 1,5 Stunden lang gerührt und die TFA verdampft. Wenn das Produkt noch Gruppen Z oder ClZ enthält, die nicht mit TFA abspaltbar sind, so wird die Methode H direkt angefügt. Die Endprodukte werden durch semipräparative HPLC gereinigt (siehe Beispiele).
    • Methode H
  • Die nach der Methode G erhaltenen Produkte, die Gruppen Z oder ClZ enthalten, werden in einen mit einem magnetischen Rührstab ausgestatteten Kolben eingetragen und in 10 ml MeOH/g Produkt gelöst. Dann werden Pd/C (10%, 1 g/g Produkt) und Ammoniumformiat (1 g/g Produkt) bei Umgebungstemperatur zugesetzt. Die Hydrierung wird mittels HPLC verfolgt. Nach zwei Stunden Reaktion ist sie beendet, die Mischung wird filtriert und das Filtrat mit 10 ml MeOH gewaschen. Anschließend wird doppelt destilliertes Wasser zugesetzt und die Lösung eingefroren und lyophilisiert. Die Endprodukte werden durch präparative HPLC gereinigt.
    • h) Methode I: Abspaltung der Schutzgruppen Boc
  • In einem Kolben wird Trifluoressigsäure (50 ml) zu dem Produkt gegeben, das Gruppen Boc (1 mMol) enthält. Dann wird die Lösung 1,5 Stunden lang gerührt und die TFA verdampft. Von dem Amin sind die Schutzgruppen vollständig entfernt und es ist ohne weitere Reinigung für die Verwendung bei den Kupplungen einsetzbar.
    • B - MATERIAL UND METHODE FÜR DIE BIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG 1 - Verwendete Plasmide für den Gentransfer in vitro
  • Das Plasmid pCMV-LUC ist eine entweder vom Plasmid pGL2-Basic Vector (Promega) oder vom Plasmid pGL2-Control Vector (Promega) durch Insertion eines Fragmentes Mlu I-Hind III, das den Promotor des humanen Cytomegalovirus (CMV) enthält, extrahiert vom Plasmid Vector pcDNA3 (Invitrogen), abgeleitete Konstruktion.
    • 2 - Herstellungsvorschrift der für die Transfektion verwendeten Lösungen
  • Die in der Erfindung beschriebenen Produkte werden zu 20 mM in Ethanol oder in Wasser in Lösung gebracht und anschließend in Wasser so verdünnt, daß die ethanolische Endkonzentration unter 10% liegt.
  • Die in physiologischem Serum (NaCl 0,15 M) verdünnten Lösungen von Nucleinsäure werden zu den Lösungen des Lipofectant in einem Verhältnis von 1/1 (V/V) gegeben. Nach der Homogenisierung mit Hilfe des Vortex und Inkubation 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur werden die Lösungen DNA/Lipofectant zu 9% (V/V) schließlich in Vertiefungen aufgeteilt, worin die Zellen mit einem von Proteinen (Serum) freien Wachstumsmilieu gewaschen und wieder in das Wachstumsmilieu zurückgebracht wurden, das von Serum frei ist oder nicht.
    • C - MATERIAL FÜR DIE UNTERSUCHUNGEN IN VIVO 1 - Materialien a) Experimentelle Modelle
  • - weibliche Mäuse C57/BL 6 erwachsen (> 8 Wochen)
  • - Tumore vom Typ 3LL (Lewis Lung carcinoma), erhalten durch Passage von Tumorfragmenten von Tier zu Tier, implantiert unter der Haut im Bereich der Seite.
    • b) verwendete Plasmide
  • pXL 2622: abgeleitet von pGL2 Basic (Promega), worin der Promotor des Cytomegalovirus (CMV), extrahiert von pCDNA3 (Invitrogen), oberhalb von dem Gen insertiert wurde, das für die Luciferase kodiert. Dieses Plasmid wird erhalten durch die Technik der Fällung mit PEG (Ausubel) und gelagert in Tris 10 mM EDTA 1 mM pH 8 bei 4ºC und einer Konzentration von etwa 10 ug DNA pro ul.
    • 2 - Arbeitsvorschriften
  • Injizierte Lösungen: Die zu transfektierende DNA wird zuerst in Puffer aufgelöst, das Peptid (KTPKKAKKP)&sub2; SEQ ID No. 1 zugesetzt und nach 20 Minuten eine Lösung von kationischen Lipiden hoher Konzentration (20 oder 40 mM) zu der Mischung gegeben. Nach der Zugabe aller Produkte enthält die Mischung außer der DNA (in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml) das Peptid (0,75 mg/ml) und das kationische Lipid, NaCl 150 mM, D-Glucose 5% und MES 5 mM, pH 6,2. Die Injektion wird 20 bis 30 Minuten nach der Herstellung der Lösung vorgenommen.
    • BEISPIEL 1 Synthese von H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (6) a - Synthese der {Boc-[3-(Boc-{4-[Boc(3-Boc-amino-propyl)-amino]- butyl}-amino)-propyl]-amino}-essigsäure (3)
  • Das nach der Methode A erhaltene Harz wird mit Spermin gemäß den Methoden B, C und E zur Reaktion gebracht. Das geschützte Produkt wird durch Chromatographie über SiO&sub2; gereinigt. Die Ausbeute beträgt 40%.
  • CCM: Rf = 0,32 (CHCl&sub3;/MeOH, 9/1)
  • HPLC: Rt = 4,22 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100])
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6 mit Zusatz einiger Tropfen CD&sub3;COOD d4, d in ppm]: 1,40 [4 s, 36H: C (CH&sub3;)&sub3;]; 1,46 (mt, 4H: CH&sub2;CH&sub2; zentral von Butyl); 1,64 und 1,74 (2 mts, 2H jeweils: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,96 (t, J = 7 Hz, 2H: CH&sub2;NCOO); 3,15 (mt, 8 H: CH&sub2;NCH&sub2;); 3,23 (t, J = 7,5 H z, 2 H: CH&sub2;NCOO); 3,83 (s, 2H: OCONCH&sub2;COO).
  • MH&spplus;: 661
    • b - Synthese der {Z-[3-(Z-{4-[Z(3-Z-amino-propyl)-amino]-butyl}- amino)-propyl]-amino}-essigsäure (4)
  • Das nach der Methode A erhaltene Harz wird mit Spermin gemäß den Methoden B, C und D zur Reaktion gebracht. Das geschützte Produkt wird durch Chromatographie über SiO&sub2; gereinigt. Die Ausbeute in der Größenordnung von 20%.
  • CCM: Rf = 0,85 (CHCl&sub3;/MeOH, 8/2)
  • HPLC: Rt = 6,92 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100])
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 413K, d in ppm]: 1,49 (mt, 4H: CH&sub2;CH&sub2; zentral von Butyl); 1,74 und 1,81 (2 mts, 2H jeweils: CH&sub2; zentral von den Propylen); 3,07 (q, J = 7 Hz, 2H: CH&sub2;NCOObenzyl); 3,15 bis 3,30 (mt, 8H: CH&sub2;NCH&sub2;); 3,33 (t, J = 7,5 Hz, 2H: NCH&sub2;COO); 3,70 (s, 2H: OCONCH&sub2;COO); 5,07 - 5,10 - 5,12 und 5,13 (4 s, 2H jeweils: ArCH&sub2;OCON); 6,65 (mf, 1H: NHCO); 7,25 bis 7,40 (mt, 20H: H aromatisch).
  • MH&spplus;: 797
    • c - Boc-Gly-Dioctadecylamid (5)
  • Das Boc-Gly wird mit Dioctadecylamin nach der Methode F gekuppelt, Ausbeute 90%.
  • CCM: Rf = 0,9 (CHCl&sub3;/MeOH, 9/1)
  • MH&spplus;: 679
  • NMR-Spektrum ¹H (300 MHz, CDCl&sub3;, d in ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3;); 1,29 (mt, 60H: CH&sub2; zentral von Fettketten); 1,49 [s, 9H: C(CH&sub3;)&sub3;]; 1,55 (mt, 4H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 3,15 und 3,33 (2 t, J = 7,5 Hz, 2H jeweils: NCH&sub2; der Fettketten); 3,95 (d, J = 5 Hz, 2H: OCONCH&sub2;CON); 5,57 (mf, 1H: CONH).
    • d - H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub8;]&sub2; (6)
  • Die Produkte (3) und (5) oder (4) und (5) werden nach der Methode G gekuppelt. Bei den Produkten sind die Schutzgruppen entfernt wie in der Methode G für das mit Boc geschützte Produkt und in der Methode H für das mit Z geschützte Produkt beschrieben ist. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 15,35 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100])
  • BYK 2 053 NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6 mit Zusatz einiger Tropfen CD&sub3;COOD d4, bei einer Temperatur von 300K, d in ppm]: 0,83 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3;); 1,23 (mt, 60H: CH&sub2; zentral von Fettketten); 1,43 und 1,53 (2 mts, 2H jeweils: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,63 (mt, 4H: CH&sub2;CH&sub2; zentral von Butyl); 1,96 (mt, 4H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,93 - 3,00 und 3,22 (3 mts, 16H insgesamt: NCH&sub2;); 3,83 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,03 (s, 2H: CONCH&sub2;CON). MH&spplus;: 821
    • BEISPIEL 2 Synthese von H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCR&sub2;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub8;]&sub2; (7)
  • Das Produkt (3) wird mit Dioctadecylamin nach der Methode F gekuppelt und nach der Methode G von den Schutzgruppen befreit. Anschließend wird es durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch HPLC analysiert.
  • HPLC: Re = 15,2 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100])
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, in einer Mischung 2/3 von CF&sub3;COOD und 1/3 von CD&sub3;COOD d4, d in ppm]: 0,78 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3;); 1,20 (mt, 60H: CH&sub2; zentral von Fettketten); 1,52 (mt, 4H jeweils: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,80 (mt, 4H: CH&sub2;CH&sub2; zentral von Butyl); 2,23 und 2,32 (2 mts, 2H jeweils: CH&sub2; zentral von den Propylen); 3,10 bis 3,40 (3 mts, 16H insgesamt: NCH&sub2;); 4,15 (s, 2H: NCH&sub2;CON).
  • MH&spplus;: 764
    • BEISPIEL 3 Synthese von H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;OCOArgN[(CH&sub2;)&sub1;&sub8;]&sub2; (9) a - Boc-Arg-(Z&sub2;)-dioctadecylamid (8)
  • Das Produkt wird durch Kupplung von BocArg(22) und Dioctadecylamin nach der Methode F mit einer Ausbeute von 91% synthetisiert.
  • CCM Rf = 0, 9 (CHCl&sub3;/MeOH, 9/1)
  • MH&spplus;: 1046
    • b - H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArgN[(CH&sub2;)&sub1;&sub8;]&sub2; (9)
  • Das Produkt (3) oder (4) wird mit dem Produkt (8) nach der Methode G gekuppelt und die Schutzgruppen nach der Methode G (Boc) und/oder der Methode H (Z) entfernt. Das Endprodukt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 13, 83 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100])
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, δ in ppm]: 0,90 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3;); 1,28 (mt, 60H: CH&sub2; von den Fettketten); 1,40 bis 1,80 (mt, 12H: CH&sub2;); 1,93 (mt, 4H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,80 bis 3,10 (mt, 16H: NCH&sub2; und NCH&sub2; von den Fettketten); 3,42 (mt, 2H: CH&sub2;N von Amido); 3,77 (mt, 2H: NCH&sub2;CON); 4,67 (mt, 1H: NCHCON); 6,80 bis 7,50 (mf ausgebreitet, 2H: NH&sub2;); 7,78 - 7,92 - 8,80 und 9,03 (jeweils mt und 3mfs, jeweils 1H - 2H- 4H und 1H: CONH - NH und NH&sub2;).
  • MH&spplus;: 920
    • BEISPIEL 4 Synthese von H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArg(Z)&sub2;N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (10)
  • Das Produkt (3) wird mit dem Produkt (8) nach der Methode G gekuppelt und die Schutzgruppen Boc nach der gleichen Methode abgespalten. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 17,75 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100])
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO, d in ppm]: 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3;); 1,25 (mt, 60H: CH&sub2; zentral von den Fettketten); 1,40 und 1,57 (2mts, 2H jeweils: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,65 (mt, 8H: CH&sub2;CH&sub2; zentral von den Butylen); 1,95 (mt, 4H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,85 bis 3,05 (mt, 14H insgesamt: NCH&sub2;); 3,23 (t, J = 7,5 Hz, 2H: NCH&sub2;); 3,75 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 3,85 und 3,95 (2mts, 1H jeweils: CH&sub2;NC); 4,67 (mt, 1H: CONCHCON); 5,07 und 5,25 (jeweils AB begrenzt und s, J = 13,5 Hz, 2H jeweils: NCOOCH&sub2;Ar); 7,25 bis 7,45 (mt, 10H: H aromatisch); 7,95 - 8,85 - 9,00 und 9,20 (4mfs: H austauschbar).
  • MH&spplus;: 1188
    • BEISPIEL 5 Synthese von H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Rhodamin)- N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (13) a - Boc-Lys(Z)-dioctadecylamid (11)
  • Das Produkt wurde durch Kupplung von BocLys(CIZ) mit Dioctadecylamin nach der Methode F mit einer Ausbeute von 89% synthetisiert.
  • CCM, Rf = ,92 (CHCl&sub3;/MeOH, 9/1)
  • MH&spplus;: 918
    • b - BocNH(CH&sub2;)&sub3;NBoc(CH&sub2;)&sub4;NBoc(CH&sub2;)&sub3;NBocCH&sub2;COLys(ClZ)-N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (12)
  • Das Produkt (3) wurde mit dem Produkt (11) nach der Methode G gekuppelt (ohne Abspaltung von Boc).
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO, d6, bei einer Temperatur von 423K, d in ppm]: 0,92 (t, J = 6,5 Hz, 6H: CH&sub3;); 1,32 (mt, 60H: CH&sub2; zentral von den Fettketten); 1,44 [2 s, 36H insgesamt: C(CH&sub3;)&sub3;]; 1,50 bis 1,80 (mt, 16H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette - CH&sub2;CH&sub2; zentral von Butyl -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2; und CH&sub2; zentral von Propyl); 3,00 (q, J = 6,5 Hz, 2H: CH&sub2;NCOO); 3,15 bis 3,40 (mt, 14H: NCH&sub2; von Fettketten -CH&sub2;NCH&sub2; und CH&sub2;NCH&sub2;CH&sub2;N); 3,80 (s, 2H: OCONCH&sub2;CON); 4,75 (mt, 1H CONCHCON); 5,15 (s, 2H: NCOOCH&sub2;Ar); 5,97 und 6,53 (2mts, 1H jeweils: OCONH und NHCOO); 7,08 (d, j = 7,5 Hz, 1H: CONH); 7,30 bis 7,50 (mts, 4H: H aromatisch).
    • c - H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Rhodamin)-N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2; (13)
  • Die Gruppe ClZ an dem Lysin des Produktes (12) wird nach der Methode H abgespalten, das auf diese Weise erhaltene Produkt wird unter Vakuum getrocknet, in Ether aufgenommen und mit NaHCO&sub3; und NaCl gespült. Der Ether wird über MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum eingedampft.
  • Eine Menge von 77 mg (60 um) des von den Schutzgruppen befreiten Produktes werden in 3 ml MeOH gelöst, DIEA (64 ul) und anschließend Tetramethyl-rhodamin-isothiocyanat (30 mg, 68 um) zugesetzt. Die Lösung wird 17 Stunden lang gerührt und die Reaktion durch CCM verfolgt. Am nächsten Tag wird die Lösung im Vakuum bis zur Trockne konzentriert. Danach wird TFA (4 ml) zugegeben und die Lösung eine Stunde lang gerührt. Die TFA wird verdampft und das rohe Produkt durch semipräparative HPLC mit einer Endausbeute von 30% gereinigt.
  • CCM, Rf = 0,05 (MeOH)
  • HPLC (semipräp.): Rt = 61,55 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [100/0], 3-45 min [0/100], 45-140 min [0/100])
  • MH&spplus;: 1335
    • BEISPIEL 6 Synthese von H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Biotinyl)- N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (14)
  • Bei dem Produkt (12) (271 mg, 0,21 mMol) werden nach der Methode H die Schutzgruppen entfernt und das Produkt in Dimethylformamid (10 ml) gelöst, DIEA (0,11 ml) und anschließend Biotin (56,4 mg, 0,23 mMol) sowie BOP (102 mg, 0,23 mMol) zugesetzt. Der pH-Wert wird auf 10 gehalten (DIEA) und das Ende der Reaktion durch den Test mit Fluorescamin ermittelt. Das Produkt wird wie in Methode F beschrieben gewonnen und ohne weitere Reinigung mit TFA (5 ml) während 1 Stunde die Schutzgruppen entfernt. Die TFA wird verdampft und das Produkt durch semipräparative HPLC mit einer Ausbeute von 50% gereinigt.
  • HPLC: Rt = 13,12 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100])
  • MH&spplus;: 1118
    • BEISPIEL 7 Synthese von [H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;](CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN- [(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2; (16) a - [BocNH(CH&sub2;)&sub3;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NHBoc](CH&sub2;)&sub3;NBocCH&sub2;COOH (15)
  • Das Produkt (1) wird nach der Methode B auf dem Polymer verankert, nach der Methode C geschützt und die Schutzgruppen von dem Harz nach der Methode E abgespalten. Das Produkt wird auf SiO&sub2; mit einer Ausbeute von 35% gereinigt.
  • CCM, Rf = 0,2 (CHCl&sub3;/MeOH, 8/2)
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO, d6, mit Zusatz einiger Tropfen CD&sub3;COOD d4, bei einer Temperatur von 433K, d in ppm]: 1,42 [2 s, 36H: C (CH&sub3;) 3]; 1,56 (mt, 4H: CH&sub2;CH&sub2; zentral von.Butyl); 1, 65 und 1,85 (mt, 8H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,76 [mt, 12H: CH&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;]; 3,06 (t, J = 6,5 Hz, 2H: OCONCH&sub2;); 3,29 (mt, 2H: NCH&sub2;); 3,86 (s, 2H: OCONCH&sub2;COO).
  • MH&spplus;: 775
    • b - [H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;]&sub2;N(CH&sub2;)N[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;](CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN-[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2; (16)
  • Das Produkt (15) wird mit dem Produkt (5) nach der Methode G gekuppelt. Das Produkt wird nach der Methode G von den Schutzgruppen befreit und durch semipräparative HPLC gereinigt. Die Fraktionen werden durch analytische HPLC analysiert und lyophilisiert. Ausbeute: 55%.
  • HPLC (semipräp.): Rt = 38,72 min (H&sub2;O/MeCN: 10 min [100/0], 10-45 min [0/100], 45-140 min [0/100])
  • NMR-Spektrum 1H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO, d6, bei einer Temperatur von 386K, d in ppm]: 0,90 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3;); 1,30 (mt, 60H: CH&sub2; zentral von den Fettketten); 1,55 (mt, 4H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,65 (mt, 4H: CH&sub2;CH&sub2; zentral von Butyl); 1,97 (mt, 8H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,80 bis 3,05 - 3,06 und 3,28 (jeweils mt und 2t, J = 7,5 Hz, 18H - 2H und 4H: NCH&sub2;); 3,80 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,03 (d, J = 5,5 Hz, 2H: CONCH&sub2;CON); 6,00 bis 9,00 (mf ausgebreitet: NH&sub2; und NH); 8,27 (mt, 1H: CONH).
  • MH&spplus;: 935
    • BEISPIEL 8 Synthese von [H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;](CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;CON- [(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2; (17)
  • Das Produkt wurde synthetisiert wie das Produkt (7), unter Verwendung des Produktes (15) anstelle von (3). Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert und lyophilisiert.
  • HPLC (semipräp.): Rt = 38 min (H&sub2;O/MeCN: 10 min [100/0], 10-45 min [0/100], 45-140 min [0/100])
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, mit Zusatz einiger Tropfen CD&sub3;COOD d4, d in ppm]: 0,88 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3;); 1,29 (mt, 60H: CH&sub2; zentral von den Fettketten); 1,52 (mt, 4H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,68 (mt, 4H: CH&sub2;CH&sub2; zentral von Butyl); 1,90 bis 2,10 (mt, 8H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,90 - 2,95 bis 3,15 - 3,18 und 3,15 (jeweils mt, t und 2t breit, J = 7,5 Hz, 24H insgesamt: NCH&sub2;); 4,02 (s, 2H: NCH&sub2;CON).
  • MH&spplus;: 878
    • BEISPIEL 9 Synthese von [H&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub2;COGlyN-[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2; (19) a - [BocNH(CH&sub2;)&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NBocCH&sub2;COOH (18)
  • Das Produkt wurde synthetisiert wie das Produkt (15), unter Verwendung von Tris-(Aminoethyl)-amin anstelle des Produktes (1).
  • Ausbeute: 29%.
  • CCM, Rf = 0,55 (CHCl&sub3;/MeOH, 8/2)
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 393K, d in ppm]: 1,44 [s, 27H: C(CH&sub3;)&sub3;]; 2,58 (t, J = 6,5 Hz, 4H: CH&sub2;NCH&sub2;); 2,66 (t, J = 7 Hz, 2H: NCH&sub2;); 3,04 (q, J = 6,5 Hz, 4H: OCONCH&sub2;); 3,28 (t, J = 7 Hz, 2H: OCONCH&sub2;); 3,76 (s, 2H: OCONCH&sub2;COO); 6,06 (mf, 2H: CONH).
  • MH&spplus;: 505
    • b - [H&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub2;COGlyN-[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2; (19)
  • Das Produkt wurde synthetisiert wie das Produkt (17), unter Verwendung von (18) anstelle von (15). Ausbeute: 65%.
  • HPLC: Rt = 122 min (H&sub2;O/MeCN: 10 min [100/0], 10-45 min [0/100], 45-140 min [0/100])
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, mit Zusatz einiger Tropfen CD&sub3;COOD d4, d in ppm]: 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3;); 1,15 bis 1,35 (mt, 60H: CH&sub2; zentral von den Fettketten); 1,45 und 1,55 (2 mts, 2H jeweils: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 2,64 (t, J = 5,5 Hz, 4H: CH&sub2;NCH&sub2;); 2,75 (t, J = 6 Hz, 2H: NCH&sub2;); 2,95 (t, J = 5,5 Hz, 4H: NCH&sub2;); 3,08 (t, J = 6 Hz, 2H: NCH&sub2;); 3,25 (mt, 4H: NCH&sub2; von den Fettketten); 3,88 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,06 (d, J = 5 Hz, 2H: CONCH&sub2;CON); 7,75 (mf ausgebreitet, Rest: NH); 8,68 (t Rest, J = 5 Hz, CONH).
  • MH&spplus;: 765
    • BEISPIEL 10 Synthese von [H&sub2;N(CH&sub2;)]&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub2;CON-[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2; (20)
  • Das Produkt wurde synthetisiert wie das Produkt (19), unter Verwendung von Dioctadecylamin anstelle von (5). Ausbeute: 73%. HPLC: Rt = 100, 1 min (H&sub2;O/MeCN: 10 min [100/0], 10-45 min [0/100], 45-140 min [0/100])
  • MH&spplus;: 708
    • BEISPIEL 11 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLysN-[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (21) (RPR 127888 A)
  • Das Produkt (12) wird nach der Methode H (Cl-Z), gefolgt von der Methode I, von den Schutzgruppen befreit. Das Endprodukt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 11,76 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 892
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 393K, d in ppm]: 0,91 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,31 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 1,35 bis 1,75 [mt, 10H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette, (CH&sub2;)&sub3; zentral von Lysyl]; 1,75 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl]; 2,00 (mt, 4H: CH&sub2; von den Propylen); 2,82 - 2,98-3,06 und 3,10 bis 3,50 (jeweils 2t - mt und 2mfs, J = 7 Hz, 18H insgesamt: NCH&sub2; von Lysyl - NCH&sub2; von Butyl - NCH&sub2; von den Propylen und NCH&sub2; von den Fettketten); 3,62 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,73 (q, J = 7 Hz, 1H: CONCHCON von Lysyl); 8,18 (d, J = 7 Hz, 1H: CONH von Lysyl).
    • BEISPIEL 12 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Cl-Z)N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (22) (RPR 122759 A)
  • Das Produkt (12) wird nach der Methode I von den Schutzgruppen befreit. Das Endprodukt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 16, 79 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 1060
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 373K, d in ppm]: 0,91 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,31 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 1,30 bis 1,75 [mt, 10H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette, (CH&sub2;)&sub3; zentral von Lysyl]; 1,72 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl]; 1,95 (mt, 4H: CH&sub2; von den Propylen); 2,98-3,06 und 2,90 bis 3,50 (jeweils 2 mts und mf, 18H insgesamt: NCH&sub2; von Lysyl - NCH&sub2; von Butyl - NCH&sub2; von den Propylen und NCH&sub2; von den Fettketten); 3,59 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,75 (q, J = 7 Hz, 1H: CONCHCON von Lysyl); 5,16 (s, 2H: COOCH&sub2;Ar); 6,85 (mf, 1H: OCONH); 7,35 bis 7,55 (mt, 5H: H aromatisch); 8,15 (mf, 1H: CONH von Lysyl).
    • BEISPIEL 13 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(CHO)N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (24) (RPR 122760 A) a - NHBoc(CH&sub2;)&sub3;NBoc(CH&sub2;)&sub4;NBoc(CH&sub2;)&sub3;NBocCH&sub2;COLysN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (23)
  • Das Produkt (12) wird nach der Methode H (Cl-Z) mit einer Ausbeute von 65% von den Schutzgruppen befreit und ohne weitere Reinigung weiterverwendet.
  • HPLC: Rt = 20,82 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
    • b - NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;CoLys(CHO)N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (24)
  • Das Produkt (23) wird mit Ameisensäure nach der Methode G gekuppelt. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 13,60 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 920
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 383K, d in ppm]: 0,92 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,31 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 1,35 bis 1,70 [mt, 10H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette, (CH&sub2;)&sub3; zentral von Lysyl]; 1,73 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl]; 1,98 (mt, 4H: CH&sub2; von den Propylen); 2,85 bis 3,50 (mt, 18H: NCH&sub2; von Lysyl - NCH&sub2; von Butyl - NCH&sub2; von den Propylen und NCH&sub2; von den Fettketten); 3,62 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,75 (mt, 1H: CONCHCON von Lysyl); 7,60 (mf, 1H: CONH); 8,05 (s breit, 1H: CH vom Aldehyd); 8,18 (mf, 1H; CONH von Lysyl)
    • BEISPIEL 14 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Cholesteryl)N- [(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (25) (RPR 128142 A)
  • Das Produkt (23) wird mit Cholesteryl-chloroformat nach der Methode G gekuppelt (ohne Anwendung des Reaktanden BOP). Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 21,66 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 1304
  • NMR-Spektrum ¹H [600 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, d in ppm]: 0,68 und 0,98 (2 s, 3H jeweils: CH&sub3; in 18 und CH&sub3; in 19 von Cholesteryl); 0,86 (mt, 12H: CH&sub3; von den Fettketten und CH&sub3; in 26 und 27 von Cholesteryl); 0,91 (d, J = 7 Hz, 3H: CH&sub3; in 21 von Cholesteryl); 1,31 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 0,80 bis 2,30 [mt, 42H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette - CH&sub2; in 1, 2, 4, 7, 11, 12, 15, 16, 22, 23 und 24 von Cholesteryl - CH in 8, 9, 14, 17, 20 und 25 von Cholesteryl - (CH&sub2;)&sub3; zentral von Lysyl und CH&sub2; von den Propylen); 1,65 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl]; 2,88 und 2,96 (2 mts, 14H insgesamt: NCH&sub2; von Lysyl - NCH&sub2; von Butyl - NCH&sub2; von den Propylen); 3,20 bis 3,50 (mt, 4H: NCH&sub2; von den Fettketten); 3,64 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,23 (mt, 1H: CH in 3 von Cholesteryl); 4,63 (mt, 1H: CONCHCON von Lysyl); 5,30 (mt, 1H: CH in 6 von Cholesteryl); 6,98 (mt, 1H: NHCOO); 7,90 (mt, 1H: CONH von Lysyl); 8,60 bis 9,10 (mfs austauschbar).
    • BEISPIEL 15 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Arachidonyl)N- [(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (26) (RPR 130605)
  • Das Produkt (23) wird mit Arachidonsäure unter einem Strom von Stickstoff und unter Lichtausschluß nach der Methode G gekuppelt. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 20,67 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 1177
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6 mit Zusatz einiger Tropfen CD&sub3;COOD d4, bei einer Temperatur von 393K, d in ppm]: 0,90 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 0,91 (t, J = 7 Hz, 3H: CH&sub3; von Arachidonyl); 1,31 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 1,35 bis 1,75 [mt, 18H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette - (CH&sub2;)&sub3; zentral und CH&sub2; zentral von Arachidonyl und (CH&sub2;)&sub3; zentral von Lysyl]; 1,75 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl]; 2,02 (mt, 4H: CH&sub2; von den Propylen); 2,10 (mt, 6H: COCH&sub2; und beide = CCH&sub2; von Arachidonyl); 2,80 - 2,97-3,06 und 3,10 bis 3,50 (jeweils mt - t - mt und 2 mfs, J = 7 Hz, 24H insgesamt: =CCH&sub2;C= von Arachidonyl - NCH&sub2; von Lysyl - NCH&sub2; von Butyl - NCH&sub2; von den Propylen und NCH&sub2; von den Fettketten); 3,62 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,73 (dd, J = 8 und 5 Hz, 1H: CONCHCON von Lysyl); 5,38 (mt, 8H: CH=CH von Arachidonyl).
    • BEISPIEL 16 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGluN-[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;OH&sub3;]&sub2; (28) (RPR 126097 A) a - Boc-Glu(O-Bz)-Dioctadecylamin (27)
  • Das Produkt wird durch Kupplung von Boc-Glu(OBz) und Dioctadecylamin nach der Methode F mit einer Ausbeute von 90% synthetisiert.
  • CCM, Rf = 0,88 (CHCl&sub3;/MeOH, 9/1)
    • b - NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGluN-[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (28)
  • Das Produkt (3) oder (4) wird mit dem Produkt (27) nach der Methode G gekuppelt, gefolgt von der Methode H (Abspaltung Cl-Z). Das Endprodukt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 14,64 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 893
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 383K, d in ppm]: 0,90 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,30 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 1,56 (mf, 4H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,60 bis 2,00 (mt, 2H: CH&sub2; zentral von Glutaryl); 1,73 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl]; 1,98 (mt, 4H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,32 (t, J = 7 Hz, 2H: COCH&sub2; von Glutaryl); 3,00 - 3,06 und 3,45 (jeweils t und 2mts, J = 7 Hz, 16H insgesamt: NCH&sub2; von Butyl - NCH&sub2; von den Propylen und NCHz von den Fettketten); 3,65 (s breit, 2H: NCH&sub2;CON); 4,85 (mt, 1H: CONCHCON von Glutaryl); 8,19 (s breit, 1H: CONH von Glutaryl).
    • BEISPIEL 17 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu(O-Bz)N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (29) (RPR 123027 A)
  • Das Produkt (3) wird mit dem Produkt (27) nach der Methode G gekuppelt und die Schutzgruppen (Boc) entfernt. Das Endprodukt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 16,02 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 983
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 413K, d in ppm]: 0,89 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,30 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 1,55 (mf, 4H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,72 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl; 1,75 bis 2,00 (mt, 2H: CH&sub2; zentral von Glutaryl); 1,99 (mt, 4H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,47 (t, J = 7 Hz, 2H: COCH&sub2; von Glutaryl); 2,95-3,05 und 3,40 (3mts, 16H insgesamt: NCH&sub2; von Butyl - NCH&sub2; von den Propylen und NCH&sub2; von den Fettketten); 3,62 (s breit, 2H: NCH&sub2;CON); 4,85 (mt, 1H: CONCHCON von Glutaryl); 5,14 (AB begrenzt, J = 12 Hz, 2H: CH&sub2; von Benzyl); 7,35 (mt, 5H: H aromatisch von Benzyl); 8,23 (mf, 1H: CONH von Glutaryl).
    • BEISPIEL 18 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu(Galactosamid)N- [(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (31) (RPR 130596 A) a - BocNH(CH&sub2;)&sub3;NBoc(CH&sub2;)&sub4;NBoc(CH&sub2;)&sub3;NBocCH&sub2;COGluN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (30)
  • Das Produkt (3) wird mit dem Produkt (27) gekuppelt, die Schutzgruppe OBz der Seitenkette nach der Methode H (Cl-Z) abgespalten und das Produkt ohne weitere Reinigung weiterverwendet. HPLC: Rt = 22,84 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 1293
    • b - NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu(Galactosamid)N-[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (31)
  • Das Produkt (30) wird mit D(+)-Galactosamin-Hydrochlorid nach der Methode G gekuppelt. Das Produkt wird durch semipräpara tive HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 13,71 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 1054
    • BEISPIEL 19 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu(Glucosamid)N- [(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (32) (RPR 130595 A)
  • Das Produkt (30) wird mit D(+)-Glucosamin-Hydrochlorid nach der Methode G gekuppelt. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 12,27 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 1054
    • BEISPIEL 20 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu(Mannosamid)N- [(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (33) (RPR 130598 A)
  • Das Produkt (30) wird mit D(+)-Mannosamin-Hydrochlorid nach der Methode G gekuppelt. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 12,98 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 1054
    • BEISPIEL 21 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[N(CH&sub3;)2]N- [(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (34) (RPR 131111 A)
  • Das Produkt (30) wird mit Dimethylamin nach der Methode G gekuppelt. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 14,44 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 920
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, d in ppm]: 0,89 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,25 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 1,43 und 1,60 (2mts, 2H jeweils: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,65 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl]; 1,65 und 1,85 bis 2,00 (2mts, 1H jeweils: CH&sub2; zentral von Glutaryl); 1,95 (mt, 4H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,32 (AB begrenzt, 2H: COCH&sub2; von Glutaryl); 2,80 und 2,92 [2 s, 3H jeweils: CON(CH&sub3;)&sub2;]; 2,85 bis 3,05 (mt, 12H: NH&sub2; von Butyl - NCH&sub2; von den Propylen); 3,00 - 3,22 - 3,45 und 3,58 (4 mts, 1H jeweils: NCH&sub2; von den Fettketten); 3,78 (AB, J = 16 Hz, 2H: NCH&sub2;CON); 4,75 (mt, 1H: CONCHCON von Glutaryl); 8,72 (d, J = 7,5 Hz, 1H: CONH von Glutaryl); 8,85 und 8,90 bis 9,15 (mfs austauschbar).
    • BEISPIEL 22 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub1;CH&sub3;]&sub2; (35) (RPR 122767 A)
  • Das Produkt wird in der gleichen Weise wie das Produkt (6) synthetisiert, jedoch unter Verwendung von Didodecylamin anstelle von Dioctadecylamin. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 9,54 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 653
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 403K, d in ppm]: 0,93 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,33 [mt, 36H: (CH&sub2;)&sub9; zentral von den Fettketten]; 1,58 (mt, 4H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,75 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl; 1,95 und 2,00 (2 mts, 2H jeweils: CH&sub2; zentral von den Propy len); 2,98 und 3,00 (2 mts, 12H insgesamt: NCH&sub2; von Butyl und NCH&sub2; von den Propylen); 3,30 (t, J = 7 Hz, 4H: NCH&sub2; von den Fettketten); 3,58 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,05 (s, 2H: CONCH&sub2;CON von Glycyl).
    • BEISPIEL 23 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub2;CH&sub3;]&sub2; (36) (RPR 122774 A)
  • Das Produkt wird in der gleichen Weise wie das Produkt (6) synthetisiert, jedoch unter Verwendung von Ditridecylamin anstelle von Dioctadecylamin. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 10,64 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 681
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 393K, d in ppm]: 0, 91 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,33 [mt, 40H: (CH&sub2;)&sub1;&sub0; zentral von den Fettketten]; 1,58 (mts, 4H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,75 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl; 2,00 (mt, 4H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,98 und 3,08 (2 t, J = 7 Hz, 12H insgesamt: NCH&sub2; von Butyl und NCH&sub2; von den Propylen); 3,32 (t, J = 7 Hz, 4H: NCH&sub2; von den Fettketten); 3,65 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,06 (d, J = 4 Hz, 2H: CONCH&sub2;CON von Glycyl); 8,60 (s breit, 1H: CONH von Glycyl).
    • BEISPIEL 24 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;]&sub2; (37) (RPR 122766 A)
  • Das Produkt wird in der gleichen Weise wie das Produkt (6) synthetisiert, jedoch unter Verwendung von Ditetradecylamin anstelle von Dioctadecylamin. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 9,92 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 709
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 393K, d in ppm]: 0,90 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,31 [mt, 44H: (CH&sub2;)&sub1;&sub1; zentral von den Fettketten]; 1,58 (mts, 4H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,76 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl; 2,00 (mt, 4H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,98 und 3,08 (jeweils mt und t, J = 7 Hz, 12H insgesamt: NCH&sub2; von Butyl und NCH&sub2; von den Propylen); 3,30 (t, J = 7 Hz, 4H: NCH&sub2; von den Fettketten); 3,65 (s, 2H: NCH&sub2;CON); 4,06 (d, J = 4 Hz, 2H: CONCH&sub2;CON von Glycyl); 8,10 (mf, 1H: CONH von Glycyl).
    • BEISPIEL 25 Synthese von NH&sub2;(CH2)3NH(CH2)4N(CH2)3NH2]CH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (39) (RPR 126096 A) a - Synthese von BocNH(CH&sub2;)&sub3;NBoc(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NHBoc]CH&sub2;CO&sub2;H (38)
  • Während der Synthese des Produktes (3) gewinnt man bei der Reinigung auf SiO&sub2; das Nebenprodukt (38). Die Ausbeute beträgt 8%.
  • CCM, Rf = 0,32 (CHCl&sub3;/MeOH, 9/1)
  • MH&spplus;: 561
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, d in ppm]: 1,30 bis 1,60 [mt, 4H: (CH&sub2;)2 zentral von Butyl]; 1,40 [s, 27H: C(CH&sub3;)&sub3;]; 1,56 (mt, 4H: CH&sub2; von den Propylen); 2,68 und 3,11 (jeweils t breit und t, J = 7 Hz, 4H jeweils: NCH&sub2; von Butyl und NCH&sub2; von den Propylen); 2,90 und 2,96 (2 q, J = 7 Hz, 2H jeweils: BocNHCH&sub2; von den Propylen); 3,18 (s, 2H: NCH&sub2;COO).
    • b - NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;]CH&sub2;]&sub3;NH&sub2;]CH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (39)
  • Die Produkte (38) und (5) werden nach der Methode G gekuppelt. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 13,60 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 821
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, mit Zusatz einiger Tropfen CD&sub3;COOD d4, d in ppm]: 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,28 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 1,46 und 1,54 (2 mts, 2H jeweils: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,63 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl]; 1,91 (mt, 4H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,85 bis 3,15 (mt, 12H: NCH&sub2; von Butyl und NCH&sub2; von den Propylen); 3,24 (mt, 4H: NCH&sub2; von den Fettketten); 3,76 (mf, 2H: NCH&sub2;CON); 4,05 (s breit, 2H: CONCH&sub2;CON von Glycyl).
    • BEISPIEL 26 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub3;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (41) (RPR 122786 A) a - BocNH(CH&sub2;)&sub3;NBoc(CH&sub2;)&sub4;NBoc(CH&sub2;)&sub3;NBoc(CH&sub2;)&sub3;CO&sub2;H (40)
  • Man synthetisiert das Produkt (40), indem man eine alkylierende Reduktion beim Spermin durchführt, in Anwesenheit von NaCNBH&sub3; und Bernsteinsäure-semialdehyd in Lösung.
  • In einen Kolben von 200 ml trägt man 1,8 g Spermin, 60 ml Methanol und 0,138 g NaCNBH&sub3; ein. Dann wird die Lösung einem kräftigen magnetischen Rühren unterzogen. Anschließend gibt man über das Zwischenstück eines isobaren Tropftrichters innerhalb von 100 Minuten eine Lösung von 5,5 ml Bernsteinsäure-semialdehyd (15%) mit 30 ml Methanol zu. Danach rührt man noch weitere 100 Minuten lang.
  • Man schützt die Amine durch die Gruppe Boc in der folgenden Art und Weise:
  • Man gießt in das Medium 2,8 ml TEA und anschließend 8,8 g Di-tert.-Butyldicarbonat, gelöst in 30 ml Methanol, und rührt das Ganze über Nacht. Dann wird das Medium im Vakuum konzentriert, das Produkt in Ethylacetat aufgenommen und mit drei Fraktionen von 50 ml NaHCO&sub3; extrahiert. Anschließend werden die wäßrigen Pha sen vereinigt und mit Ether (3 · 100 ml) gespült. Der pH-Wert der wäßrigen Phase wird durch KHSO&sub4; auf 3 abgesenkt und man nimmt eine Trübung wahr, die von der Ausfällung des Produktes (41) stammt. Die Mischung wird mit Ethylacetat (3 · 100 ml) extrahiert. Dann wird die organische Phase über MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung weiterverwendet.
    • b - NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub3;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (41)
  • Das Produkt (40) und Dioctadecylamin werden nach der Methode G gekuppelt. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 15,04 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 792
  • NMR-Spektrum ¹H [400 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, bei einer Temperatur von 383K, d in ppm]: 0,85 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,22 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 1,48 (mf, 4H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette); 1,72 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl; 1,88 (mt, 2H: CH&sub2; zentral von Aminopentanoyl); 1,99 (mt, 4H: CH&sub2; von den Propylen); 2,42 (t, J = 7 Hz, 2H: COCH&sub2; von Aminopentanoyl); 2,96-3,03 und 3,22 (3 mts, 18H insgesamt: NCH&sub2; von Aminopentanoyl - NCH&sub2; von Butyl - NCH&sub2; von den Propylen und NCH&sub2; von den Fettketten).
    • BEISPIEL 27 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;CONH(CH&sub2;)&sub5;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (42) (RPR 128506 A)
  • Das Produkt wird in der gleichen Weise wie das Produkt (6) synthetisiert, jedoch unter Verwendung von Boc-6-Aminocapronsäure anstelle von BocGly. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch HPLC analysiert.
  • HPLC: Rt = 13,94 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 877
  • NMR-Spektrum ¹H [300 MHz, (CD&sub3;)&sub2;SO d6, d in ppm]: 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH&sub3; von den Fettketten); 1,28 [mt, 60H: (CH&sub2;)&sub1;&sub5; zentral von den Fettketten]; 1,48 [mt, 10H: 1 CH&sub2; von jeder Fettkette und (CH&sub2;)&sub3; zentral von Aminohexanoyl]; 1,65 [mt, 4H: (CH&sub2;)&sub2; zentral von Butyl]; 1,95 (mt, 4H: CH&sub2; zentral von den Propylen); 2,27 (t, J = 7 Hz, 2H: COCH&sub2; von Aminohexanoyl); 2,85 bis 3,30 (mts, 18H: NCH&sub2; von Aminohexanoyl - NCH&sub2; von Butyl - NCH&sub2; von den Propylen und NCHz von den Fettketten); 3,70 (s breit, 2H: NCH&sub2;CON); 7,90 bis 9,10 (mfs, austauschbar).
    • BEISPIEL 28 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu(11-amid-undecanyl, hepta, O-acetyllactose)N-[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (43) (RPR 130765 A)
  • Das Produkt (30) wird mit 11-Amino-undecanyl-hepta-O-acetyllactose nach Methode G gekuppelt. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert.
  • HPLC: RC = 15,91 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 1680
    • BEISPIEL 29 Synthese von NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COAsm[β-NAc(Ac)&sub3;]N- [(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (45) (RPR 131283 A) a - Fmoc-Asm-β-Glc-NAc(Ac)&sub3;-dioctadecylamin (44)
  • Das Produkt wird durch Kupplung von Fmoc-Asm-β-Glc- NAc(Ac)&sub3;-OH mit Dioctadecylamin nach Methode F synthetisiert.
  • CCM, Rf = 0,67 (CHCl&sub3;/MeOH, 9/1)
  • HPLC: Rt = 25,31 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
    • b - NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COAsm[β-NAc(Ac)&sub3;]N-[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (45) Abspaltung der Schutzgruppe Fmoc von dem Produkt (45).
  • Man gießt auf 0,7 g Produkt (45) 20 ml Dimethylformamid und 2 ml Diethylamin. Nach 6 Stunden Rühren wird das Medium im Vakuum konzentriert.
  • Das erhaltene Produkt wird mit dem Produkt (3) nach der Methode G gekuppelt. Das Produkt wird durch semipräparative HPLC gereinigt und die Fraktionen durch analytische HPLC analysiert. HPLC: Rt = 15,35 min (H&sub2;O/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
  • MH&spplus;: 1207
    • BEISPIEL 30 Synthese in Lösung des Produktes (6) in großem Maßstab
  • Man synthetisiert das Produkt (6), indem man eine alkylierende Reduktion des Spermins in Anwesenheit von NaCNBH&sub3; und Glyoxylsäure in Lösung durchführt.
  • In einen Kolben von 2 l trägt man 18,2 g Spermin, 500 ml Methanol und 2 g NaCNBH&sub3; ein. Dann wird die Lösung einem kräftigen magnetischen Rühren unterzogen. Anschließend gibt man über das Zwischenstück eines isobaren Tropftrichters innerhalb von 100 Minuten eine Lösung von 8,45 g Glyoxylsäure in 300 ml Methanol hinzu und rührt das Ganze über Nacht.
  • Man schützt die Amine durch die Gruppe Boc in der folgenden Art und Weise:
  • Man gießt in das Medium 14 ml TEA und anschließend 100 g Ditert.-Butyldicarbonat, gelöst in 200 ml Tetrahydrofuran, und rührt das Ganze über Nacht. Dann wird das Medium im Vakuum konzentriert, das Produkt in Ethylacetat (250 ml) aufgenommen, mit KHSO&sub4; (6 · 100 ml) und anschließend mit einer gesättigten Lösung von NaCl (3 · 100 ml) gespült, über MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das Produkt wird über eine Kolonne mit Siliciumdioxid gereinigt, indem man als Eluent CHCl&sub3;/MeOH (9/1) verwendet. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden durch CCM identifiziert, vereinigt und im Vakuum eingedampft, um 10 g Produkt (6) zu ergeben (Ausbeute 17% für die Gesamtsynthese).
  • Die Analysen von analytischer HPLC, Massenspektrum und NMR sind mit denen des Produktes identisch, das nach der Methode in fester Phase erhalten wurde.
    • BEISPIEL 31 Einfluß des Chargenverhältnisses (Amine/Phosphate) auf die Effektivität der Transfektion (7) RPR 120534A, (6) RPR 120535A und (9) RPR 120531A
  • Es werden Proben von 1.10&sup5; Zellen [NIH 3T3, 3LL oder SMClapin] in exponentieller Wachstumsphase auf 2 cm² mit Lösungen Lipofectant/pCMV-LUC, die variable Chargenverhältnisse aufweisen, während 2 Stunden bei 37ºC unter 5% CO&sub2; behandelt, wobei jede Probe 2 ug Nucleinsäure erhält. Die Suche nach der übertragenen Expression des Gens wird nach Zugabe von Kälberfötusserum (8% final), gefolgt von einer Inkubation während 40 Stunden in einem Trockenschrank mit CO&sub2; durchgeführt.
  • Die Luciferase-Aktivität wird durch Emission von Licht [RLU = relative light unit] in Anwesenheit von Luciferin, Coenzym A und ATP während 10 Sekunden bestimmt und bezieht sich auf 2000 behandelte Zellen. Die erhaltenen Resultate sind in den Figuren (1), (2) und (3) aufgeführt.
  • Aus der Betrachtung dieser Figuren geht klar hervor, daß die Anwesenheit eines Glycins in dem Arm "spacer" zwischen dem lipidischen Teil und dem Polyamin ermöglicht, eine bessere Wirksamkeit der Transfektion für geringe Verhältnisse in Nanomol von kationischem Lipid/ug DNA zu erhalten.
    • BEISPIEL 32 Einfluß des Chargenverhältnisses (Amine/Phosphate) auf die Effektivität der Transfektion (20) RPR 120527A, (19) RPR 120528A, (17) RPR 120526A und (16) RPR 120525A
  • Es werden Proben von 1.10&sup5; Zellen NIH 3T3 in exponentieller Wachstumsphase auf 2 cm² mit Lösungen Lipofectant/pCMV-LUC, die variable Chargenverhältnisse aufweisen, während 2 Stunden bei 37ºC unter 5% CO&sub2; behandelt, wobei jede Probe 2 ug Nucleinsäure erhält. Die Suche nach der übertragenen Expression des Gens wird nach Zugabe von Kälberfötusserum (8% final), gefolgt von einer Inkubation während 40 Stunden in einem Trockenschrank mit CO&sub2; durchgeführt.
  • Die Luciferase-Aktivität wird an dem nach Lyse der Zellen erhaltenen aufschwimmenden Anteil durch Emission von Licht [RLU = relative light unit] während 10 Sekunden bestimmt und bezieht sich auf mg Protein. Die erhaltenen Resultate sind in der Figur (4) aufgeführt. Der Vorteil der Anwesenheit des Restes Glycin in dem Arm "spacer" ist in diesem Beispiel noch deutlicher.
    • BEISPIEL 33 Einfluß der Länge des Spacer auf die Effektivität der Transfektion (6) RPR 120535, (41) RPR 122786 und (42) RPR 128506
  • Es werden Proben von 1.10&sup5; Zellen [NIH3T3 und HeLa] in exponentieller Wachstumsphase auf 2 cm² mit Mischungen kationisches Lipid/pCVM-Luc, die variable Konzentrationen an kationischem Lipid aufweisen, während 2 Stunden bei 37ºC in feuchter Atmosphäre unter 5% CO&sub2; und in Abwesenheit von serischen Proteinen behandelt. Das Wachstumsmilieu der Zellen wird anschließend durch Kälberfötusserum (8% final) ergänzt und die Messung der Expression des Transgens nach zusätzlicher Inkubation während 40 Stunden in einem Trockenschrank mit CO&sub2; durchgeführt.
  • Die strukturellen Charakteristiken der Spacer sind wie folgt:
  • No. RPR Spacer
  • 122786 --
  • 120535 Gly
  • 128506 NH&sub2;(CH&sub2;)&sub5;CO
  • Die folgende Tabelle 1 zeigt die erhaltenen Resultate, ausgedrückt für die mit jedem der untersuchten Produkte erhaltenen maximalen Effektivitäten. TABELLE I
  • Die Effektivitäten der Transfektion werden in RLU/10s./2.103 behandelte Zellen angegeben. Zwischen den Klammern sind die Verhältnisse Nanomol Lipid/ug DNA aufgeführt.
  • In den Versuchen 1 und 2 wurden verschiedene Plasmide verwendet, in Dosierungen von 1 ug und 0,5 ug DNA/1.105 Zellen jeweils in den Versuchen 1 und 2.
    • BEISPIEL 34 Einfluß der Struktur des Spacer auf die Effektivität der Transfektion (6) RPR 120535
  • Unter identischen Versuchsbedingungen wie in dem vorstehenden Beispiel beschrieben, jedoch mit Einbringen einer zusätzlichen Linie (Zellen 3LL), wurde die Effektivität der mit dem kat ionischen Lipid (6) RPR 120535, modifiziert durch Substitution an dem "spacer" mit einer Gruppe vom Typ Arg, vom Typ Lys oder vom Typ Glu, erhaltenen Transfektion verglichen.
  • Die Strukturen der verschiedenen Spacer sind wie folgt:
  • Die Effektivitäten der Transfektion werden in RLU/10s./2.103 behandelte Zellen angegeben.
  • Die verschiedenen Plasmide wurden bei den Versuchen 1 und 2 in einer Dosierung 0,5 ug und 1 ug DNA/1.105 Zellen jeweils in den Versuchen 1 und 2 verwendet. Aus der Analyse der Ergebnisse geht hervor, daß bei den betrachteten Zellen die Anwesenheit einer vorzugsweise substituierten Aminosäurekette eine bessere Effektivität bei der Transfektion induziert. TABELLE II
    • BEISPIEL 34 Einfluß der Anwesenheit von DOPE in der Mischung Lipofectant/DNA (9) RPR 120531 A
  • Nach der gleichen Vorschrift wie in Beispiel 31 angewendet wird DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin) zu dem kationischen Lipid (9) RPR 120531 A gegeben, und zwar in variablen molaren Verhältnissen und vor der Zugabe der DNA in der Transfektionsmischung.
  • Die Luciferase-Aktivität wird in dem aufschwimmenden Anteil nach der Lyse der Zellen bestimmt und auf mg Protein bezogen (Fig. 5).
  • Die Anwesenheit von DOPE in den Lipofectant-Mischungen ermöglicht die Verbesserung der Effektivität der Transfektion, wenn die Konzentration an (9) RPR 120531 A gering ist.
    • BEISPIEL 35 Wirkung von Serum auf die Effektivität der Transfektion (6) RPR 120535 A, (9) RPR 120531 A und (10) RPR 121650 A
  • Es werden Proben von 1.10&sup5; Zellen [NIH 3T3 oder HeLa] in exponentieller Wachstumsphase auf 2 cm² mit Lösungen Lipofectant/pCMV-LUC (3 Nanomol Lipofectant/ug DNA), in Abwesenheit von Serum während 2 Stunen oder in Anwesenheit von Serum in dem Kulturmedium behandelt. In diesem Beispiel erhält die Probe 2 ug DNA. Die Expression der Luciferase wird in dem aufschwimmenden Anteil der Zell-Lysate gesucht, ausgedrückt in RLU/10s und bezogen auf mg Protein. Aus der Analyse der Resultate geht hervor, daß die Anwesenheit von Serum keinen nennenswerten Effekt auf die Transfektion hat.
    • BEISPIEL 36 Einfluß der Konzentration an Nucleinsäure in den Mischungen DNA/Lipofectant (20) RPR 120527 A, (19) RPR 150528 A, (17) RPR 120526 A und (16) RPR 120525 A
  • Unter den in Beispiel 31 beschriebenen Bedingungen wurden Proben von Zellen NIH3T3 unter Bedingungen transfektiert, wo die Verhältnisse Nanomol Lipofectant/ug DNA optimiert werden - siehe Beispiel 32 - [erhältnis = 6 für (20) RPR 120527 A und (19) RPR 120528 A - Verhältnis = 3 für (17) RPR 120526 A und (16) RPR 120525 A]. Die in jede Probe eingebrachten Mengen von DNA variieren von 0,5 bis 2 ug. Die Resultate sind in Fig. 6 aufgeführt.
  • Die Transfektion von 1.10&sup5; Zellen in exponentieller Wachstumsphase mit 1 ug plasmidischer DNA scheint eine gute Wahl zu sein. Die Erhöhung der Menge an verwendeter DNA zieht nämlich eine Erhöhung der Konzentration an kationischem Lipid in Kontakt mit den Zellen nach sich und daher in einigen Fällen Probleme der Toxizität. Bei geringeren Mengen an DNA wird die Proportionalität mit der Wirksamkeit der Transfektion nicht mehr erhalten.
    • BEISPIEL 37 Untersuchung der Transfektion in vivo mit den Lipopolyaminen gemäß der Erfindung
  • Man nimmt die Injektion einer Lösung, die ein Lipopolyamin gemäß der Erfindung erhält, hergestellt wie oben beschrieben, in den Tumor 7 Tage nach der Implantation vor, wobei die Maus mit einer Mischung Ketamin + Xylazin anästhesiert wurde. Zwei Tage nach der Injektion entnimmt man das tumorale Gewebe, das gewogen, zerkleinert und in 500 ul Puffer Lyse (Promega Cell Lysis Buffer E153 A) vermahlen wurde. Nach dem Zentrifugieren (20.000 g während 10 Minuten) entnimmt man 10 ul, die zur Bewertung der Luciferase-Aktivität durch Messung der totalen Lichtemission dienen, erhalten nach dem Mischen mit 50 ul Reagens (Promega Luciferase Assay Substrate) in einem Luminometer LB 9501 (Berthold), Inte gration auf 10 Sekunden. Die resultierende Aktivität wird in RLU (Relative Lights Units) ausgedrückt, geschätzt in der Gesamtheit des aufschwimmenden Anteils der tumoralen Lyse, oder in RLU pro ug injizierter DNA. Die Tabelle III berücksichtigt die erhaltenen Resultate. TABELLE III

Claims (31)

1. Lipopolyamin in der Form D, L oder LD und seine Salze, dadurch gekennzeichnet, daß es durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt wird:
in der
R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)q-NRR' darstellen, mit
q, das zwischen 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 in unabhängiger Weise zwischen den verschiedenen Gruppen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; variieren kann, und R und R', die unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)q'-H&sub2; bedeuten, wobei q' zwischen 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 in unabhängiger Weise zwischen den verschiedenen Gruppen R und R' variieren kann,
m, n und p, die unabhängig voneinander eine ganze Zahl darstellen, die zwischen 0 und 6 variieren kann, und wenn n höher als 1 ist, m verschiedene Werte und R&sub3; verschiedene Bedeutungen in der allgemeinen Formel (I) annehmen können, und
R&sub4;, das eine Gruppe der allgemeinen Formel (II)
darstellt, in der
R&sub6; und R&sub7; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen bedeuten, wobei mindestens eine der beiden Gruppen von Wasserstoff verschieden ist,
u eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 darstellt, und wenn u eine ganze Zahl höher als 1 ist, R&sub5;, X, Y und r verschiedene Bedeutungen in den verschiedenen Struktureinheiten [X-(CHR&sub5;)r-Y] besitzen können,
X ein Atom von Sauerstoff oder Schwefel oder eine Gruppe Amino, monoalkyliert oder nicht, bedeutet,
Y eine Gruppe Carbonyl oder eine Gruppe Methylen darstellt,
R&sub5; ein Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer natürlichen
Aminosäure, gegebenenfalls substituiert, bedeutet, und r eine ganze Zahl ist, die zwischen 1 und 10 variiert, und wenn r gleich 1 ist, R&sub5; eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure, substituiert oder nicht, darstellt und wenn r höher als 1 ist, R&sub5; ein Wasserstoffatom bedeutet.
2. Lipopolyamin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es durch eine der folgenden Formeln dargestellt wird:
in denen R&sub4;, R&sub6; und R&sub7; wie in Anspruch 1 definiert sind.
3. Lipopolyamin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß darin R&sub4; eine Gruppe NR&sub6;R&sub7; darstellt, mit R&sub6; und R&sub7;, wie sie in den Unterformeln (III) bis (XII) eine identische Gruppe bedeuten, ausgewählt unter (CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;, (CH&sub2;)&sub1;&sub1;CH&sub3;, (CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3; oder (CH&sub2;)&sub1;&sub2;CH&sub3;.
4. Lipopolyamin nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem extrazellulären oder intrazellulären Zielelement assoziiert ist.
5. Lipopolyamin nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es das Zielelement im Bereich der durch den Substituenten R&sub5; dargestellten Aminosäure-Seitenkette inkorporiert.
6. Lipopolyamin nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen zellulären Rezeptor-Liganden handelt, der sich an der Oberfläche des zellulären Zieltyps befindet.
7. Lipopolyamin nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Zielelement unter Zuckern, Peptiden wie Antikörpern oder Fragmenten von Antikörpern, zellulären Rezeptor- Liganden oder deren Fragmenten, Rezeptoren oder Fragmenten von Rezeptoren wie Liganden von Rezeptoren der Wachstumsfaktoren, von Rezeptoren der Cytokine, von Rezeptoren der zellulären Lectine oder von Rezeptoren der Adhäsionsproteine vom Typ der Integrine, vom Rezeptor des Transferrins, von Lipiden HDL oder LDL und/oder Oligonucleotiden ausgewählt wird.
8. Lipopolyamin nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Zielelement durch eine Signalsequenz der nuklearen Lokalisation dargestellt wird.
9. Lipopolyamin nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Markierungsmittel vom Typ Biotin, Rhodamin, Folat oder eine lineare oder cyclische peptidische oder pseudopeptidische Sequenz inkorporiert, die das Epitop Arg-Gly- Asp im Bereich der durch R&sub5; dargestellten Aminosäure-Seitenkette umfaßt.
10. Lipopolyamin nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt wird unter:
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHC&sub2;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArgN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArg(Z)&sub2;N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Rhodamin)N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Biotinyl)N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
[H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;](CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
[H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;](CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
[H&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
[H&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub2;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArgN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArg(Z)&sub2;N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;&submin;CH&sub3;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Rhodamin)N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys(Biotinyl)N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
[H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;](CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
[H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;](CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;CN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
[H&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
[H&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;]&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub2;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;-CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;]CH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLysN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys[Cl-Z]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys[CHO]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys[Cholesteryl]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COLys[Arachidonyl]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGluN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[N(CH&sub3;)&sub2;]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[O-Bz]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[Galactosamid]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[Glucosamid]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlu[Mannosamid]N[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;CONH(CH&sub2;)&sub5;CON[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub1;CH&sub3;]&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub2;CH&sub3;]&sub2; und
NH&sub2;(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;]&sub2;
11. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Lipopolyamin nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und mindestens eine Nucleinsäure enthält.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure ist.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure eine Ribonucleinsäure ist.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure chemisch modifiziert ist.
15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure eine Antisense-Nucleinsäure ist.
16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure ein therapeutisches Gen umfaßt.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Nucleinsäure, ein Lipopolyamin nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen Zusatzstoff, der fähig ist, sich an den Komplex Lipopolyamin/Nucleinsäure zu assoziieren und/oder dessen Transfektionsvermögen zu verbessern.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatzstoff aus einem oder mehreren neutralen Lipiden besteht.
19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die neutralen Lipide unter den synthetischen oder natürlichen, zwitterionischen oder den Lipiden ausgewählt werden, die unter physiologischen Bedingungen von ionischer Ladung frei sind.
20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die neutralen Lipide solche mit zwei Fettketten sind.
21. Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die neutralen Lipide unter Dioleylphosphatidyl-ethanolamin (DOPE), Oleyl-palmitoylphosphatidyl-ethanolamin (POPE), Di-stearoyl, -palmitoyl, -myristoyl phosphatidyl-ethanolamin sowie ihren ein- bis dreimal N-methylierten Derivaten; den Phosphatidyl-glycerinen, den Diacyl-glycerinen, den Glycosyldiacyl-glycerinen, den Cerebrosiden (wie insbesondere den Galac tocerebrosiden), den Sphingolipiden (wie insbesondere den Sphingomyelinen) und den Asialogangliosiden (wie insbesondere den asialoGM1 und GM2) ausgewählt werden.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatzstoff eine Verbindung ist oder eine Verbindung umfaßt, die im Bereich der Kondensation der genannten Nucleinsäure eingreift.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sich die genannte Verbindung vollständig oder teilweise von einem Histon, einem Nucleolin und/oder einem Protamin ableitet.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Verbindung vollständig oder teilweise aus peptidischen Struktureinheiten (KTPKKAKKP) und/oder (ATPAKKAA) besteht, wiederkehrend in kontinuierlicher Weise oder nicht, wobei die Anzahl der Struktureinheiten zwischen 2 und 10 variieren kann.
25. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,01 bis 20 Äquivalente Zusatzstoff pro Äquivalent Nucleinsäure (in Gew./Gew.) und vorzugsweise 0,5 bis 5 Äquivalente umfaßt.
26. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen für eine injizierbare Formulierung pharmazeutisch akzeptablen Füllstoff umfaßt.
27. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen für eine Anwendung auf der Haut und/oder den Schleimhäuten pharmazeutisch akzeptablen Füllstoff umfaßt.
28. Verwendung eines Lipopolyamins nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Arzneimittels, das für die Transfektion von Zellen vorgesehen ist.
29. Verfahren zur Herstellung eines Lipopolyamins nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Kupplung von mindestens einer lipidischen Fraktion an mindestens eine asymmetrische Polyaminfraktion dutchgeführt wird, wobei die genannte Polyaminfraktion zuvor durch biomolekulare Reaktion zwischen einem Alkylierungsmittel, das kovalent an einen festen Träger gebunden ist, und einem symmetrischen Polyamin erhalten wurde.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Kupplung der lipidischen Fraktion an die asymmetrische Polyaminfraktion im Bereich des festen Trägers durchgeführt wird, an den die genannte asymmetrische Polyaminfraktion fixiert ist, und dadurch, daß man das genannte, auf diese Weise erhaltene Lipopolyamin gewinnt.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß außerdem das Einbringen von Markierungsmitteln, Zuckern oder Fluoreszenzsonden in das Lipopolyamin durchgeführt wird, das an den festen Träger fixiert ist oder nicht.
DE69609982T 1995-11-14 1996-11-08 Lipopolyamine als transfectionsmittel und ihre pharmazeutischen anwendungen Expired - Lifetime DE69609982T2 (de)

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FR9513490A FR2741066B1 (fr) 1995-11-14 1995-11-14 Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
PCT/FR1996/001774 WO1997018185A1 (fr) 1995-11-14 1996-11-08 Lipopolymamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques

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ZA (1) ZA969489B (de)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2756491B1 (fr) * 1996-11-29 1999-01-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition transfectante utile en therapie genique associan t a un virus recombinant incorporant un acide nucleique exog ene, un agent de transfection non viral et non plasmidique
FR2750704B1 (fr) 1996-07-04 1998-09-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de production d'adn therapeutique
US6884430B1 (en) 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
FR2763943B1 (fr) * 1997-05-28 1999-07-09 Rhone Poulenc Rorer Sa Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules
JP2001515913A (ja) * 1997-09-08 2001-09-25 バレンティス・インコーポレーテッド 疎水性グリコシルアミン誘導体の組成物及び使用方法
FR2774394B1 (fr) * 1998-01-30 2002-04-26 Rhone Poulenc Rorer Sa Composes transfectants sensibles aux conditions reductrices, compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs applications
EP1049793B1 (de) 1998-01-30 2005-10-12 Aventis Pharma S.A. Für reduzierende bedingungen empfindliche transfektions-verbindungen, pharmazeutische zusammensezungen die diese enthalten und deren verwendung.
FR2777017B1 (fr) * 1998-04-02 2002-08-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications
KR20010042318A (ko) * 1998-04-02 2001-05-25 아방티 파르마 소시에테 아노님 신규 핵산 전달제, 이를 함유하는 조성물 및 용도
CA2327465C (en) 1998-04-08 2009-12-22 Celltech Therapeutics Limited Bipolar lipids capable of delivering polyanions to cells
GB9914045D0 (en) 1999-06-16 1999-08-18 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
GB9918670D0 (en) 1999-08-06 1999-10-13 Celltech Therapeutics Ltd Biological product
GB9919338D0 (en) * 1999-08-16 1999-10-20 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US20020091242A1 (en) 2000-10-11 2002-07-11 Michel Bessodes Acid-sensitive compounds, their preparation and uses
JP2004528309A (ja) * 2001-03-23 2004-09-16 ナプロ バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 癌治療用分子複合体
FR2824557B1 (fr) * 2001-05-14 2003-08-29 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques de polythiouree
JP4276439B2 (ja) * 2001-05-14 2009-06-10 サントリオン ポリチオ尿素の脂質誘導体
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
DE60232258D1 (de) * 2001-08-29 2009-06-18 Aventis Pharma Sa Lipid-aminoglykosid konjugate zur transfektion
FR2829136B1 (fr) 2001-08-29 2006-11-17 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques d'aminoglycosides
ES2635247T3 (es) 2002-01-17 2017-10-03 Alfa Laval Corporate Ab Evaporador sumergido que comprende un intercambiador de calor de placas y una carcasa cilíndrica en la que está dispuesto el intercambiador de calor de placas
US7220400B2 (en) * 2002-05-24 2007-05-22 Mirus Bio Corporation Compositions for delivering nucleic acids to cells
US20060211004A1 (en) 2005-02-15 2006-09-21 Ilsley Diane D Methods and compositions for determining non-specific cytotoxicity of a transfection agent
JP5777846B2 (ja) * 2005-06-15 2015-09-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アミン含有脂質およびその使用
US20100035974A1 (en) * 2006-10-04 2010-02-11 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs Compositions comprising a sirna and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivatives and uses thereof
US8678686B2 (en) * 2007-05-01 2014-03-25 Pgr-Solutions Multi-chain lipophilic polyamines
EP2331071A1 (de) 2008-09-05 2011-06-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Neue multimodulare anordnung zur intrazellulären abgabe
US8969353B2 (en) 2008-11-07 2015-03-03 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
FR2941152B1 (fr) 2009-01-20 2013-10-18 Centre Nat Rech Scient Vecteurs comprenant une macromolecule anionique et un lipide cationique pour l'administration de petits acides nucleiques.
EP3470395A1 (de) 2010-11-15 2019-04-17 Life Technologies Corporation Aminhaltige transfektionsreagenzien sowie verfahren zur herstellung und verwendung davon
US9238716B2 (en) 2011-03-28 2016-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
WO2013016058A1 (en) * 2011-07-22 2013-01-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel bis-nitrogen containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
JP6053688B2 (ja) 2011-10-07 2016-12-27 国立大学法人三重大学 キメラ抗原受容体
EA032088B1 (ru) 2011-10-27 2019-04-30 Массачусетс Инститьют Оф Текнолоджи Аминокислотные производные, функционализованные на n-конце, способные образовывать микросферы, инкапсулирующие лекарственное средство
CZ201220A3 (cs) * 2012-01-13 2013-07-17 Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i. Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému
US9840479B2 (en) 2014-07-02 2017-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
HRP20230494T1 (hr) 2015-06-19 2023-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Alkenil supstituirani 2,5-piperazindioni i njihova upotreba u pripravcima za isporuku sredstva subjektu ili stanici
EP3331905B1 (de) 2015-08-06 2022-10-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Gezielte proteindegradierung zur attenuierung adoptiver t-zell-therapie in zusammenhang mit unerwünschten entzündungsreaktionen
US11052111B2 (en) 2015-12-08 2021-07-06 Chimera Bioengineering, Inc. Smart CAR devices and DE CAR polypeptides for treating disease and methods for enhancing immune responses
EP4342978A3 (de) 2016-09-01 2024-07-03 Chimera Bioengineering Inc. Goldoptimierte car-t-zellen
CN111386263A (zh) 2017-02-08 2020-07-07 达纳-法伯癌症研究所有限公司 调节嵌合抗原受体
US20240216509A1 (en) 2018-05-07 2024-07-04 Children's Hospital Medical Center Chimeric polypeptides, nucleic acid molecules, cells, and related methods
SG11202111345PA (en) 2019-04-19 2021-11-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Chimeric receptor that recognizes engineered site in antibody
AU2020288499A1 (en) 2019-06-05 2022-01-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody cleavage site-binding molecule
MX2023001120A (es) 2020-07-31 2023-02-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica que comprende una celula que expresa un receptor quimerico.
JPWO2022196719A1 (de) 2021-03-17 2022-09-22
US20240366666A1 (en) 2021-04-08 2024-11-07 Phosphogam, Llc Methods and compositions for enhancing the cytotoxicity of gamma/delta-t cells

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3211692A (en) * 1961-11-06 1965-10-12 Gulf Oil Corp Ethylene polymeric compositions containing substituted ureas
US3965015A (en) * 1972-08-01 1976-06-22 Colgate-Palmolive Company Bleach-resistant fabric softener
DE2355026A1 (de) * 1973-11-03 1975-05-15 Henkel & Cie Gmbh Neue omega-amino-carbonsaeureamide, deren herstellung, sowie verwendung als antimikrobielle mittel
FR2369837A1 (fr) * 1976-11-04 1978-06-02 Labaz Derives actifs de l'uree, leur procede de preparation ainsi que les compositions therapeutiques les contenant
JPS60123451A (ja) * 1983-12-07 1985-07-02 Eisai Co Ltd ポリプレニル系化合物およびその製造方法ならびにそれを含有する医薬
CA1280414C (en) * 1985-03-15 1991-02-19 Saichi Matsumoto Isoprenoidamine derivatives and antiulcer agents
US4828982A (en) * 1985-05-28 1989-05-09 Becton, Dickinson & Company Vesticles and use thereof in an enzyme assay
EP0233101A1 (de) * 1986-01-13 1987-08-19 Ire-Celltarg S.A. Vinblastin-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
JPS6480282A (en) * 1987-09-22 1989-03-27 Nippon Oils & Fats Co Ltd Nonaqueous highly active enzyme
DK523288A (da) * 1987-10-06 1989-04-07 Hoffmann La Roche Aminosyrederivater
JP2720167B2 (ja) * 1988-04-11 1998-02-25 日本ケミファ株式会社 アルキレンジアミン誘導体
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
ES2066050T3 (es) * 1989-07-28 1995-03-01 Chemie Linz Gmbh Procedimiento para la obtencion de ureas asimetricamente substituidas, carbamatos, tiocarbamatos e isocianatos substituidos.
JP2620727B2 (ja) * 1990-10-26 1997-06-18 富士写真フイルム株式会社 ペプチド脂質
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
FR2714830B1 (fr) * 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
FR2730637B1 (fr) * 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations

Also Published As

Publication number Publication date
SK63198A3 (en) 1998-11-04
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FR2741066A1 (fr) 1997-05-16
AU718568B2 (en) 2000-04-13
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IL124411A (en) 2001-09-13
ES2151185T3 (es) 2000-12-16
CA2235721C (fr) 2009-07-14
MX9803761A (es) 1998-09-30
DK0861228T3 (da) 2000-10-23
NO981944D0 (no) 1998-04-29
AU7576896A (en) 1997-06-05
HUP9900605A3 (en) 1999-11-29
CA2235721A1 (fr) 1997-05-22
IL124411A0 (en) 1998-12-06
SK282173B6 (sk) 2001-11-06
NO981944L (no) 1998-04-29
HUP9900605A2 (hu) 1999-06-28
BR9611533A (pt) 1999-07-13

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