DE19607686A1

DE19607686A1 - Neue metabolisierbare Lipopolyamine, deren Darstellung und Anwendung

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Publication number: DE19607686A1
Application number: DE1996107686
Authority: DE
Inventors: Stephan Dr Koenig; Roland Dr Kloesel
Original assignee: CHEMICON LAB GmbH
Current assignee: CHEMICON LAB GmbH
Priority date: 1996-02-29
Filing date: 1996-02-29
Publication date: 1997-09-04
Also published as: WO1997031934A3; WO1997031934A2

Description

Positiv geladene Lipide (J.P.Behr, Bioconjugate Chem. 5 382-389 (1994)) werden in Form von Liposomen oder als solche zur Einschleusung von biologisch aktiven Substanzen wie Peptiden, Proteinen, antiviralen Wirkstoffen insbesondere aber DNA, RNA, Antisense- DNA/RNA oder Ribozymen in eukariotische Zellen (zum Beispiel Säuger-, Pflanzen-, Insekten-Zellen) eingesetzt. Lipopolyamine sind eine spezielle Klasse von kationischen Lipiden, die vergleichsweise hervorragende Transfektionseigenschaften zeigen. Unter Transfektion versteht man die Einschleusung von Erbmaterial in eukariotische Zellen.

Die Notwendigkeit DNA (zum Beispiel Plasmide, Cosmide, einzelsträngig oder doppelsträngig), RNA oder verwandte Stoffklassen, wie Antisense-DNA/RNA oder Ribozyme in eukariotische Zellen einzuführen, um beispielsweise erfolgreich Gentherapie betreiben zu können, führte zur Entwicklung einer Vielzahl von Transfektionsmethoden. Zur Einführung von Nukleinsäuren in eukariotische und insbesondere in Säugerzellen ist eine Vielzahl von Verfahren, wie zum Beispiel die CaPO₄-Präzipitationsmethode, die DEAE-Dextran-Methode, Methoden, welche die rezeptorvermittelte Endoeytose nutzen, Elektroporation, Mikroinjektion und Verfahren, die virale Capside als DNA-Carrier benutzen, bekannt. Eine weitere Methode wird Lipofektion (P.L.Felgner et al., Proe.Natl.Aead.Sei. USA 74, 7413 (1987)) genannt. Diese nützt die Tatsache, daß synthetische kationisehe Lipide in Form von Liposomen oder als solche mit der negativ geladenen DNA Komplexe bilden. Stellt man die Mengenverhältnisse von DNA und kationisehem Lipid so ein, daß die resultierenden Komplexe eine positive Nettoladung tragen, so besitzen sie eine hohe Affinität zu der negativ geladenen Membranoberfläche eukariotischer Zellen. Treffen solche DNA/Lipid-Komplexe auf Zellen, so kommt es zu einer Einschleusung des genetischen Materials in die Zelle. Der genaue Mechanismus, wie die DNA in die Zellen gelangt, ist noch weitgehend unbekannt, man vermutet jedoch, daß es entweder zu einer Fusionierung der kationischen Lipide mit der anionischen Zellmembran bei gleichzeitiger Ausschüttung der DNA in das Zellinnere kommt, oder daß die DNA/Lipid-Komplexe als ganzes über einen natürlichen Transportmechanismus der Zellen, die sogenannte Endozytose, in die Zelle gelangen und danach die DNA freigesetzt wird.

Liposomen sind kugelartige Anordnungen von Lipiden in wäßrigen Lösungen mit,"Bilayer- Struktur" und werden typischerweise in drei Klassifikationen eingeteilt (siehe N.Y. Aeademy Seiences Meeting: "Liposomes and their use in Biology and Medieine" von Dezember 1977): Multilamellare Vesikel (MLV, bis zu 1000 nm), kleine unilamellare Vesikel (SUV, 20-50 nm) und große unilamellare Vesikel (LUV, 600-30000 nm). Eine Reihe von Herstellungsmethoden für Liposomen ist bekannt und in "Liposome Teehnology" (Gregoriadis, CFC Press, N.Y. 1984) in "Liposomes" (Ostro, Marcel Dekker, N.Y. 1987) oder in Übersichtsartikeln von Lichtenberg et al. (Methods Biochem. Anal. 33 337-462, 1988), Pagano und Weinstein (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. 7 435-68, 1978), oder Szoka und Papahadjopoulos (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. 9, 467-508, 1980) beschrieben. Bekannte Methoden sind beispielsweise die "reverse-phase evaporation"-Methode und die Extrusionsmethode, bei der eine Lipidlösung durch eine mikroporöse Membran gepreßt wird.

Liposomen werden typischerweise auch auf folgendem Weg hergestellt: Die Lipide werden in einem organischen Lösungsmittel aufgenommen. Durch Verdampfen des Lösungsmittels unter einem Strom von Stickstoff wird an der Glasgefaßwand ein dünner Lipidfilm erzeugt. Zugabe von Wasser oder wäßriger Pufferlösung hydratisiert diesen Film. Die erhaltene Lösung wird zuletzt mit Ultraschall behandelt.

Kationische Lipide gewinnen zunehmende Bedeutung in der Gentherapie. Dabei werden in vivo mit verschiedenen Verfahren Körperzellen transfektiert, indem Komplexe aus Carrier und DNA intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, intranasal, in Liquorräume oder direkt in Tumore verabreicht werden oder Körperzellen entnommen, transfektiert und wieder reimplantiert werden. Eine in diesem Zusammenhang favorisierte Methode war bis vor einiger Zeit die Einbringung des genetischen Materials durch virale Carrier. Diese Methode besitzt jedoch die Gefahr der Rückmutation zu einem pathogenen Virus. Desweiteren wird die eingeschleuste DNA stabil in das Erbgut eingebaut, so daß eine Steuerung der Therapie oder eine Rückkehrung der Zellen in ihren ursprünglichen Zustand nicht mehr möglich ist. Zudem besitzen virale Carrier Restriktionen bezüglich der Größe der einzuschleusenden DNA. Modifizierte DNA oder RNA wird durch Viren nicht übertragen.

Außerdem können nur sich teilende Zellen auf diesem Wege transfektiert werden.

Die Transfektion mit kationischen Lipiden ist diesen Restriktionen hingegen nicht unterworfen. Die Transfektion verläuft in der Regel transient, das heißt die transfektierte DNA oder RNA wird nur für eine bestimmte Zeit exprimiert, da sie nicht in das Erbgut eingebaut wird, sondern nur ins Cytoplasma transportiert und dort durch Nukleasen mit der Zeit abgebaut wird. Auf diese Weise kann Gentherapie dosiert und reversibel gemacht werden. Restriktionen bezüglich der Größe der DNA bestehen nicht und modifizierte DNA oder RNA kann mittels kationiseher Lipide in Zellen eingeschleust werden. Auch sieh nicht teilende Zellen, wie zum Beispiel Nervenzellen, können durch kationische Lipide transfektiert werden.

Während die in vivo-Anwendung von Mikroinjektion und Elektroporation aus Verfahrensgründen nicht möglich erscheinen, besitzen die CaPO₄- und DEAE-Dextran- Methoden verglichen mit der Lipofektion eine schlechtere Transfektionseffizienz.

Unter den kationischen Lipiden gibt es eine Klasse, die die bekannt hohe Affinität zwischen Spermin und DNA zur Transfektion ausnützt, in dem das bei einem physiologischen pH-Wert positiv geladene Spermin mit einem hydrophilen Rest, in manchen Fällen über einen Spacer, verknüpft wird. Spermin bildet besonders stabile Komplexe mit DNA und ähnlichen Verbindungen, indem es über Wasserstoffbrückenbindung in der Furche der DNA gebunden wird.

Die ersten solchen Liposperminderivate wurden von Behr, J. P.et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982-6986; EP 0394111 synthetisiert. Dabei verknüpften sie Carboxyspermin über einen Spacer mit zwei unterschiedlichen hydrophilen Resten. Die Struktur des dabei erhaltenen 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) ist:

DOGS ist als Transfectam^TM (Promega) kommerziell erhältlich. Die zweite von Behr et al. entwickelte Verbindung ist Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-5- carboxyspermylamid (DPPES):

wobei R = CR₃(CH₂)₁₅ ist.

Ein weiteres Liposperminderivat wird von P.L.Felgner et al. in WO 9116024 unter der Bezeichnung L-Spermin-5-earboxyl-3-(DL-1,2-dioleoyldimethylaminopropyl-β-hydroxyethyl amin) beansprucht. In der Patentschrift beschrieben ist jedoch L-Spermin-5-carboxyl-3-(DL- 1,2-dipalmitoyl-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylamin):

Gebeyehu, G. et al. beschreiben in WO 9405624 die Verbindung N-[N-(5- Carboxyspermyl)aminoethyl]N,N-dimethyl-2,3-bis(9-octadecenyloxy) 1-propanammonium tetra(trifluoracetat), welches kommerziell als Lipofectamin^TM (Gibco-BRL: Life Technologies Inc.) erhältlich ist.

Trotz großer Fortschritte auf diesem Gebiet, verbleibt ein Bedarf an einer größeren Auswahl an kationischen Lipiden. Bis heute wurde kein kationisches Lipid gefunden, daß mit allen Zelltypen befriedigende Ergebnisse liefert. Da verschiedene Zelltypen sich in ihrer Membranzusammensetzung unterscheiden, ist es nicht verwunderlich, daß verschiedene Kompositionen von Lipiden und verschiedenartige Lipidtypen für eine effektive Transfektion unterschiedlicher Zellen benötigt werden.

Von besonderer Bedeutung ist die Metabolisierbarkeit und Toxizität der Lipide und ihrer Abbauprodukte. Diese sind die bestimmenden Faktoren für die Verträglichkeit der Lipide für die Zellen. Die Metabolisierbarkeit wird hauptsächlich durch die in den Lipiden enthaltenen chemischen Verknüpfungen bestimmt.

Da über den eigentlichen Transfektionsschritt bis heute noch wenig bekannt ist, ist die Entwicklung von neuen kationischen Lipiden weitgehend empirisch. Wichtige zu beachtende Punkte für das Design solcher Lipide sollte ihre Toxizität gegenüber den zu transfektierenden Zielzellen, desweiteren ihre Stabilität, Metabolisierbarkeit, die Möglichkeit einer in vivo- Anwendung und einfache Synthesewege sein.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen der allgemeinen Formel I:

die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-, L- oder DL-Form vorliegen, einschließlich ihrer Salze, wobei a, b, e, d, e und f unabhängig voneinander 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sind und wobei a nur dann 0 ist, wenn b 0 ist und e nur dann 0 ist, wenn f0 ist, R₁ ein Rest der allgemeinen Formel II ist:

in welcher g 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, h 0,1,2 oder 3 ist, wobei g 0 ist, wenn h 0 ist und h 1 ist, wenn g 0 ist, X -O- oder -NH-, alle Positionen der Steroid-Substitnenten α- oder β- konfiguriert sein können, die C-Atome 5 und 6 oder die C-Atome 8 und 9 über eine Doppelbindung verknüpft sind, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkyl- oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkenyl- oder ein substituierter oder unsubstituierter Aryl- oder Aralkyfrest sind, R₄ H oder Methyl ist, oder R₁ ein Rest der allgemeinen Formel III ist:

wobei alle chirale Zentren in D-, L- oder als Racemat vorliegen, m 0,1,2 oder 3 ist, k 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, wobei k 0 ist, wenn m 0 ist und m 1 ist, wenn k 0 ist, n, p und q unabhängig voneinander 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sind, R₂ wie vorstehend definiert ist, X₁, X₂, und X₃ unabhängig voneinander

sind,
R₅ und R₆ unabhängig voneinander verzweigte oder unverzweigte Alkyl- oder Alkenylreste mit 5-30 Kohlenstoffatomen sind.

Die erfindungsgemäßen Lipide enthalten also Polyamine als DNA-affine Kopfgruppen, die gegebenenfalls über einen Spacer an Lipidstrukturen gebunden sind. Die Kopfgruppe wird dabei über biologisch abbaubare Verbindungen an das Restmolekül gebunden, welches wiederum aus biologisch abbaubaren Verbindungen aufgebaut ist. Eine Vielzahl der erfindungsgemäßen Lipide läßt sich aus nicht oder nur wenig toxischen Verbindung einfach durch Aufbau über Amid- und Urethanverknüpfungen herstellen. Damit erreicht man eine Kombination von guter Metabolisierbarkeit, niedriger beziehungsweise gar keiner Toxizität und hoher Stabilität, sowie einen Zugang zu einfach durchführbaren Synthesewegen.

Der besondere Wert der erfindungsgemäßen Lipide liegt in ihrer Stabilität in Lösung, bei gleichzeitiger Metabolisierbarkeit durch die Zelle, da die Lipide zu einem wesentlichen Anteil aus Amidverknüpfungen aufgebaut sind.

Von ganz besonderem Interesse sind Lipopolyamine der Formel I, worin a, d, e = 3, b, f = 1 und c = 0 sind.

Von ganz besonderem Interesse sind außerdem Verbindungen der Formel I, wobei a, d, e = 3, b, f= 1 und c = 0 sind, R₁ die Formel H aufweist, wobei die Reste und Indizes wie vorstehend definiert sind und direkt oder über einen Spacer, wie zum Beispiel Aminosäuren, verknüpft sein können. Dies entspricht Verbindungen der Formel II, wobei h = 0 oder 1, g (falls h = 1 ist) 1, 2, 3, 4, 5 oder 6,
R₂ = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-(1-Methyl-)propyl oder Benzyl und
R₃=

ist.

Weiterhin von besonderem Interesse sind Verbindungen der Formel I, wobei a, d, e = 3, b, f= 1 und c = 0 ist und die allgemeine Formel IV, V oder VI aufweist:

oder

Von ganz besonderem Interesse sind dabei solche Verbindungen, in denen das Grundgerüst der Lipidkomponente, welche die Formel IV, V oder VI aufweist, aus natürlich vorkommenden Aminosäuren besteht, wie zum Beispiel Ornithin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, an die zwei von natürlich vorkommenden Fettsäuren, zum Beispiel Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Myristoylsäure etc., abgeleitete Alkylketten über Peptidbindungen verknüpft sind. Die Lipidkomponente kann wiederum direkt oder über einen Spacer an den Polyamin- Rest, welcher der Formel 1 entspricht, wobei a, d, e = 3, b, f= 1 und c = 0 ist, gebunden sein. Dies bedeutet in Formel IV, daß n = 0, m = 0 oder 1, für m = 1 und k = 1 der Spacer ebenfalls aus einer natürlich vorkommenden Aminosäure aufgebaut ist, so daß R₂ = Wasserstoff Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-(1-Methyl-)propyl oder Benzyl sein kann, für m = 1 und k = 2, 3, 4, 5, oder 6 der Spacer die Verbindungen Homoalanin, Aminocapronsäure usw. darstellen kann, q = 3, und p = 0, R₅ = -(CH₂)₁₇CH₃ und R₆ = -(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃ sein kann.

Dies bedeutet in Formel V, daß n = 0, p = 3, q = 0, k = 2, 3, 4, 5 oder 6, der Spacer somit aus der Diaminokomponente, wie Ethylendiamin, Propylendiamin, Butylendiamin, Siaminopentan, Diaminohexan, besteht, R₅ und R₆ = (CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃ sein kann.

Dies bedeutet für Formel VI, daß n = 0, m = 0 oder 1, q = 0, p = 0, 1 oder 2, k = 1 (falls m = 1) R₂ = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-(1-Methyl-)propyl oder Benzyl sein kann, für m = 1 und k = 2, 3, 4, 5 oder 6 der Spacer die Verbindungen Homoalanin, Aminocapronsäure usw. darstellen kann, R₅ und R₆ = -(CH₂)₁₇H₃ ist.

Nachstehend werden allgemeine Synthesewege der folgenden ganz besonders interessanten Verbindungen erläutert.

Zunächst zwei Verbindungen, die durch die Formeln I und II gekennzeichnet sind. Als Ausgangsverbindung dient in beiden Fällen 5-Cholesten-3-amin, wobei durch allgemein bekannte Peptidverknüpfungsmethoden einerseits über die Spacer-Gruppe Glycin, andererseits direkt der Sperminrest an die Aminofunktion der Ausgangsverbindung gebunden wird. Als Endprodukte erhält man N-[2,5-Bis (3-aminopropyl)amino-1-oxopentyl]cholesteryl-3-amid und N-(2,5-Bis(3-aminopropyl)amino]-1-oxopentylglycylcholesteryl-3-amid.-

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Steroid-Grundgerüste und Spacer bestehen:

a) Steroidgrundgerüste: Cholesterin-3-amin, Lanosterin-3-amin, Campesterin-3-amin, Stigmast-5-en-3-amin, Stigmasta-5,22-dien-3-amin.
b) Spacer: Glycin, Alanin, β-Alanin, 4-Aminobuttersäure, 5-Aminopentansäure, 6-Aminocapronsäure, 7-Aminoheptansäure.

Das nächste Beispiel beschreibt die Synthese eines Lipopolyamins, welche durch die Formeln I und VI gekennzeichnet ist:
Als Edukt wird Asparaginsäure eingesetzt, weiche über allgemein bekannte Peptidverknüpfungsmethoden an den Carboxyfunktionen, in diesem Falle jeweils mit Stearylamin und nach der Entschützung der Aminofunktion direkt an 2,5-Bis (3-aminopropyl) amino-1-carboxypentyl-Rest gebunden wird. Als Endprodukt erhält man N-[2,5-Bis(3- aminopropyl)amino-1-oxopentylasparagyldistearylamid

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgerüste, Spacer und Aminen, deren Alkylrest sich aus den folgenden aufgelisteten Fettsäuren ableitet, bestehen:

a) Aminosäuregrundgerüste: Asparaginsäure, Glutaminsäure, α-Aminomalonsäure.
b) Spacer: Glycin, Alanin, β-Alanin, 4-Aminobuttersäure, 5-Aminopentansäure, 6-Aminocapronsäure, 7-Aminoheptansäure.
c) Fettsäuren: Ölsäure, Palmitinsäure, Myristinsäure, Stearinsäure, Laurinsäure, Palmitoleinsäure, Linolensäure, Linolsäure, Arachidonsäure, Arachinsäure, Lignocerinsäure.

Im nächsten Beispiel wird die Synthese einer weiteren Verbindung vorgestellt, welche durch die Formel I und V gekennzeichnet ist. Hierbei wird als Grundgerüst die an der Carboxyfunktion als tert-Butylester geschützte α-Aminosäure Ornithin eingesetzt. Ebenfalls durch allgemein bekannte Peptidverknüpfungsmethoden wird jene Verbindung in diesem Falle mit Ölsäure und nach der Entschützung der Carboxyfunktion über den Spacer Ethylendiamin an 2,5-Bis(3-aminopropyl)amino-1-carboxypentyl-Rest gebunden. Als Endprodukt erhält man N-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino-1-oxopentyl]-N′-[(N-α-,N-δ-dioleoyl)ornithyl]ethylen diamin.

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgerüste, Spacer und den aufgelisteten Fettsäuren bestehen:

a) Aminosäuregrundgerüste: Lysin, Ornithin.
b) Spacer: Ethylendiamin, Propylendiamin, Butylendiamin, Pentamethylendiamin, Hexamethylendiamin.
c) Fettsäuren: Ölsäure, Palmitinsäure, Myristinsäure, Stearinsäure, Laurinsäure, Palmitoleinsäure, Linolensäure, Linolsäure, Arachidonsäure, Arachinsäure, Lignocerinsäure.

Im nächsten Beispiel, welches die Synthese einer Verbindung, charakterisiert durch die Formel I und IV, beschreibt, wird als Grundkörper wiederum die α-Aminosäure Ornithin verwendet, wobei die α-Aminofunktion durch die basenlabile Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe und die δ-Aminofunktion durch die bekannterweise säurelabile tert-Butoxycarbonyl-Gruppe geschützt sind. Durch allgemein bekannte Peptidverknüpfungsmethoden wird zunächst die α- Carboxyfunktion mit Stearylamin, dann nach Entschützung der δ-Aminofunktion jene mit Ölsäure und im darauffolgenden Schritt die α-Aminogruppe nach deren Entschützung direkt mit der Polyaminkomponente gekennzeichnet durch den 2,5-Bis(3-aminopropyl) amino-1- carboxypentyl-Rest gekuppelt. Als Endprodukt erhält man N-α-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl]-N-δ-oleoylomithylstearylamid

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgerüste, Spacer, Aminen, deren Alkylrest sich aus den folgenden aufgelisteten Fettsäuren ableitet, und den Fettsäuren als solche bestehen:

a) Aminosäuregrundgerüste: Ornithin, Lysin
b) Spacer: Glycin, Alanin, β-Alanin, 4-Aminobuttersäure, 5-Aminopentansäure, 6-Aminocapronsäure, 7-Aminoheptansäure.
c) Fettsäuren: Ölsäure, Palmitinsäure, Myristinsäure, Stearinsäure, Laurinsäure, Palmitoleinsäure, Linolensäure, Linolsäure, Arachidonsäure, Arachinsäure, Lignocerinsäure.

Als letztes Beispiel wird die Synthese einer Lipopolyamin-Verbindung ausgeführt, welche in der Formel I und in enthalten ist. Als Grundgerüst dient hier die an beiden Aminofunktionen durch die allgemein angewendete Benzyloxycarbonylgruppe geschützte α-Aminosäure Ornithin. Zunächst wird über Curtius-Abbau die Carboxyfunktion in die primäre Aminfunktion übergeführt, welche mit an den Aminofunktionen des pergeschützten 2,5-Bis (3-aminopropyl) amino-1-carboxypentyl-Restes über allgemein bekannte Peptidwerknüpfungsmethoden gekuppelt wird. Nach Entschützung der Aminofunktionen werden jene nach gleicher Methodik jeweils mit Ölsäure verknüpft. Als Endprodukt erhält man 1,4-Dioleoylarnido-1-[2,5-Bis (3- aminopropyl)amino-1-oxopentyl]amidobutan

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als solche in wäßriger oder wäßriger Puffer- oder ethanolischer Lösung angewendet werden. Es können jedoch auch Liposomen mit oben genannten Lipiden allein, oder in Kombination mit anderen Lipiden wie zum Beispiel Cholesterol, Cholesterylamin, Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder Dioleoylphospatidylcholin (DOPC) formuliert werden.

Um die Transfektionseffizienz der erfindungsgemäßen Lipide zu steigern, besteht die Möglichkeit, Zellen in Gegenwart von Substanzen zu transfektieren, die die enzymatische Aktivität in den Lysosomen inhibieren, sogenannte lysosomatotrope Substanzen, wie zum Beispiel Chloroquin oder von Viren abgeleitete lysosomatropisch wirkende Proteine.

Die erfindungsgemäßen Lipopolyamine sind bei physiologischem pH positiv geladen und können daher mit negativ geladenen Makromolekülen, insbesondere mit DNA und verwandten Stoffklassen stabile Aggregate bilden. Die mit den Lipopolyaminen bemäntelten und positivierten Makromoleküle wechselwirken mit der negativ geladenen Zellmembran auf eine Weise, die zu einer Einschleusung der Makromoleküle in die Zelle führt. Dabei sind in vitro als auch in vivo Anwendungen möglich. Analoges gilt für Liposomenformulierungen der erfindungsgemäßen Lipide.

Im Vergleich zur zielgerichteten rezeptorvermittelten Endocytose (Wu et al., J. Chem. 262, 4429-4432 (1987)), in denen Polykationen, welche auch DNA-Binder genannt werden (zum Beispiel Polylysin etc.) an sogenannte Internalisierungsfaktoren (zum Beispiel bestimmte Glykoproteine) gebunden sind, die zielgerichtet an Oberflächenrezeptoren bestimmter Zellen binden, besitzen die erfindungsgemaßen Lipide, bzw. deren Liposomenformulierungen keine Zellspezifität. Eine zielgerichtete Lieferung durch die erfindungsgemäßen Lipide bzw. derer Liposomenformulierungen kann dadurch erreicht werden, daß die Ladungen von Lipiden und den zu transportierenden Biomolekülen ausgeglichen werden und zusätzlich an das Aggregat zwischen Biomolekül und Lipiden Intemalisierungsfaktoren angebracht werden. Dies kann zum Beispiel durch Liposomenformulierung mit Colipiden erreicht werden, falls die Colipide als Kopfgruppe solche Intemalisierungsfaktoren tragen. Eine andere Möglichkeit ist ein auf Ladungsneutralität abgestimmtes Aggregat aus Biomolekül, Lipiden und Internalisierung faktoren. Sogenannte Internalisierungsfaktoren sind Transferrin, Galactose, Mannose, Mannose-6-phosphat, Asialglycoprotein, Conalbumin, Lectine, Transcobalamin, α-2- Makroglobulin, Biotin, Folat, mannosylierte Glycoproteine. Weitere sind in EP 0535576, EP 0544292, WO 9421808 zu entnehmen, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden. Analog wie Internalisierungsfaktoren, können auch zellspezifische Antikörper eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zu Therapiezwecken eingesetzt werden. Insbesondere können solche Verbindungen für die Gentherapie von zum Beispiel Cystischer Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie, Methylmalonazidamie, Adenosindeaminasemangel und Hypercholesterinamie, Hämophilie, β- Thalassämie genutzt werden. Gentherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant, wenn Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxine oder immunomodulierend wirkende Proteine im Organismus synthetisiert werden sollen. Für die oben genannten Zwecke können DNA-Fragmente mittels dieser Lipide in Zellen gebracht werden, in denen diese DNA die gewünschte Wirkung entfalten soll. Die gewünschte Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA-Bereiche oder die Inhibition von DNA-Bereichen (zum Beispiel Antisense-DNA/RNA), die die Erkrankung auslösen, im erkrankten Zelltyp sein. Auf diese Weise können tümorunterdrückende Gene in der Krebs-Therapie eingesetzt werden oder durch die Einführung cholesterolregulierender Gene eine Beitrag zur Vorbeugung von Herz- und Blutgefaßkrakkheiten geleistet werden. Weiters können DNA, welche Ribozyme kodiert, oder Ribozyme selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die Translation jener DNA erzeugt aktive Ribozyme, die an spezifischen Stellen m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise die Transkription verhindern. Auf diese Weise kann zum Beispiel virale m-RNA gespalten werden, ohne eine andere zelluläre m-RNA in Mitleidenschaft zu ziehen. Der Vermehrungszyklus von Viren (HIV, Herpes, Hepatitis) kann auf diesem Wege unterbrochen werden.

Auch in der Krebstherapie spielt Transfektion zur Herstellung von Krebsvakzinen eine immer größer werdende Rolle. Damit ist jene auch mögliches Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäßen Verbindungen.

Eine weitere Anwendung können solche Lipide zum Beispiel in Impfverfahren finden, die auf der Basis der Expression von DNA, welche immunogene Peptide kodiert, im Körper von Mensch und Tier funktionieren. Dazu werden Lipid/DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt.

Die Einschleusung der DNA in die Körperzellen führt zur Expression des immunogenen Peptids und löst somit die Innunantwort aus.

Abgesehen von DNA können auch andere Makromoleküle, wie zum Beispiel Peptide oder Proteine, in Zellen eingeschleust werden. Zu diesem Zweck können sie mit den erfindungsgemäßen Lipopolyaminen als solche bemäntelt werden oder in Liposomen, welche als Komponente die erfindungsgemaßen Lipopolyamine enthalten, eingeschlossen oder an deren Oberfläche adsorbiert werden. Bringt man derartige Aggregate mit Zellen in Kontakt, so findet ein Transport dieser Moleküle durch die Zellwand statt. Therapeutische Peptide haben einen günstigen Einfluß auf zahlreiche Erkrankungen. Solche Peptide oder Proteine sind zum Beispiel Lymphokine, Interleukine, Tumore Nekrose Faktoren oder Interferone, weiterhin Wachstumsfaktoren, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor-VIII: c, Granulocyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, Erythropoietin, Insulin, Calcitonin, Thymidinkinase und andere. Auch toxische Peptide wie Ricin, Diphteriatoxin und andere können therapeutisch gewinnbringend eingesetzt werden.

Die Lipide werden aufgrund ihrer positiven Ladung vorwiegend dazu eingesetzt, negativ geladene Moleküle wegen ihrer negativen Ladung zu komplexieren und in Zellen einzuschleusen. Durch sogenannte "self assembling Systems" können jedoch auch positiv geladene Moleküle transportiert werden, in dem zunächst negativ geladene Liposomen mit diesem positiv geladenen Molekülen komplexiert werden. Wählt man die Verhältnisse so, daß eine negative Nettoladung verbleibt, können diese Komplexe mit diesen erfindungsgemäßen Lipopolyaminen als solche oder in Form von Liposomen positiviert werden, in dem die gegensätzlich geladenen Komponenten in Kontakt gebracht werden. Die resultierenden positiv geladenen Gesamtkomplexe werden von den Zellen aufgenommen.

Weitere Anwendungsmöglichkeiten für kationische Lipide sind den Veröffentlichungen WO 9011092, WO 9116024, WO 9303768, Science 258, 744-746 (1992) zu entnehmen, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.

Beispiele der für derzeit als therapeutisch aussichtsreich angesehene Sequenzen für genetisches Material sind in der Übersicht von F.W.Anderson, Science 256, 808 (1992) entnehmbar, die ebenfalls hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.

Beispiele

Bezugsquellen:
1. Plasmide pCH1 10 (enthält β-Gal als Reportergen) und pMSGCAT: Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala, Schweden
L-[2,5-Bis (3-aminopropyl)amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan(tetra--BOC- ACP) wurde nach J.-P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, pp. 6982-6986, (1998) synthetisiert.
5-Cholesten-3-amin wurde nach H. Brunner, G. Sperl; Bull. Soc. Chim. Belg. 101, 935 (1992) synthetisiert.

Beispiel 1 Synthese von N-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino-1-oxopentyl]cholesteryl-3-amid

Zu einer Lösung von 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy carboxy-1-oxopentan und 385 mg (1 mmol) 5-Cholesten-3-amin in 10 ml THF (Tetrahydroturan) oder DMF (N,N-Dirnethylförmamid) werden 206 mg (Immol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) gegeben. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren des Reaktionsgemisches durchgeführt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem Dicyclohexylharnstoff (DCH) abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines Trifluoressigsäure (TFA)/CH₂CH₂-Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.

Beispiel 2 Synthese von N-(2,5-Bis(3-aminopropyl)amino]-1-oxopentylglycylcholesteryl-3-amid

Zu einer Lösung von 175 mg (1 mmol) N-Boc-Glycin und 385 mg (1 mmol) 5-Cholesten-3- amin in 10 ml THF oder DMF werden 206 mg (1 mmol) DCCI gegeben und bei RT 12 h gerührt. Danach wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen.

Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren des Gemisches wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des geschützten Vorläuferproduktes wird durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt. Danach wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopen-tan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt und bei RT für 12 h gerührt. Danach wird das ausgefallene DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt. Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.

Beispiel 3 Synthese von N-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino-1-oxopentylasparagyldistearylamid

Zu einer Lösung von 233 mg (1 mmol) N.Boc-Asparaginsäure und 540 mg (2 mmol) Stearylamin in 10 ml THF oder DMF werden 412 mg (2 mmol) DCCI gegeben. Die Reaktion wird bei RT und Rühren des Reaktionsgemisches durchgeführt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des geschützten Vorläuferproduktes wird durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt. Danach wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxipen-tan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Die Reaktion wird wiederum bei RT und unter Rühren ausgeführt und nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und die Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.

Beispiel 4 Synthese von N-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino-1-oxopentyl]-N′-[(N-α-, N-δ-dioleoyl)- ornithyl]ethylendiamin

Zu einer Lösung von 455 mg (1 mmol) Ornithin-OtBu und 566 mg (2 mmol) Ölsäure in 10 ml THF oder DMF werden 412 mg (2 mmol) DCCI gegeben. Die Reaktion wird bei RT 12 h lang gerührt. Danach wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung wird bei RT eine 95%ige wäßrige Lösung von TFA gegeben. Nach 2 h Rühren wird von überschüssigem TFA/H20 abgezogen. Danach wird zusammen mit 160 mg (1 mmol) N-Boc-Ethylendiamin in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei RT gerührt und nach einer Reaktionszeit von 12 h von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird von überschüssigem TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das erhaltene TFA-Salz wird durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt. Danach wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis(3- aminopropyl)amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.

Beispiel 5 Synthese von N-α-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino-1-oxopentyl]-N-δ- oleoylornithylstearylamid

Zu einer Lösung von 455 mg (1 mmol) N-α-Fmoc-N-δ-Boc-Ornithin und 270 mg (1 mmol) Stearylamin in 10 ml THF oder DMF werden 206 mg (1 mmol) DCCI gegeben. Der bei RT und unter Rühren durchgeführte Reaktionsansatz wird nach einer Reaktionszeit von 12 h vom ausgefallenem DCH filtriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂Cl₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂Cl₂ abgezogen. Danach wird zusammen mit 283 mg (1 mmol) Ölsäure in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und die Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung wird bei RT eine Lösung von 10% Diethylamin in DMF zugegeben. Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromatographie wird das erhaltene Produkt zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino]- tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.

Beispiel 6 Synthese von 1,4-Dioleoylamido-1-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino-1-oxopentyl] amidobutan

Zu einer Lösung von 400 mg (1 mmol) N-α-N-δ-di-CBz-Ornithin in 20 ml CH₂Cl₂ werden 140 µl NEt₃ und 119 mg SOCl₂ tropfenweise zugegeben, wobei das Reaktionsgemisch 0°C nicht übersteigen sollte. Nach Erwärmen des Gemisches auf RT werden 0.33-0.65 g NaN₃ (5- 10 facher Überschuß) zusammen mit Tetra-n-Butylammoniumhydrogensulfat (10 mol% bezüglich Edukt) zugegeben. Nach ca. 6 h unter Rückfluß wird mit gesättigter, wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser mehrmals gewaschen. Das erhaltene Rohprodukt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.

Das erhaltene Produkt wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis(3-aminopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (X mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.

Nach Abspaltung der Cbz-Gruppen durch Hydrogenolyse bei RT und Rühren mit 5% Pd auf Aktivkohle in Methanol wird das Lösungsmittel abgezogen, danach wird der Rückstand zusammen mit 565 mg (2 mmol) Ölsäure in 10 m THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 412 mg (2 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.

Beispiel 7 Liposomenformulierung

Dioleoylphosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin, Cholesterol und Cholesteryl amin werden in einem organischen Lösungsmittel gelöst. Die Lipide aus den Beispielen 1-6 werden als solche oder in Form ihrer Salze, zum Beispiel Trifluoracetat-Salze in einem organischen Lösungsmittel gelöst Durch Kombination verschiedener Mengen der unterschiedlichen Lösungen werden verschiedene Kompositionen aus einzelnen Lipiden aus den Beispielen 1-6 oder Lipidgemische aus Colipiden und Lipiden aus den Beispielen 1-6 hergestellt. In einem Glaskolben wird mit Hilfe eines Rotationsverdampfers ein dünner Lipidfilm erzeugt. Dieser wird im Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit. Der Film wird mit soviel Wasser oder wäßriger Pufferlösung hydratisiert, daß die Konzentration 1mg Lipid pro ml Lösung beträgt. Danach wird unter Kühlung mit Ultraschall behandelt. Die Liposomenformulierung wird durch einem Filter (Porenweite 0.2 µm) sterilfitriert.

Beispiel 8 Lipidlösungen

Die Lipide aus den Beispielen 1-6 werden als solche und in Form ihrer TFA-Salze zu einer Konzentration von 1-2.5 mg/ml in Wasser, Ethanol und einem Gemisch aus Wasser und Ethanol verschiedener Zusammensetzung gelöst.

Beispiel 9 Zellkulturen

Die Zelllinien COS-7, Hela und BHK-21 werden in "Dulbecco′s-moditied Eagle′s medium" (DMEM), das 10% fötales Kälberserum (FBS), 2mM L-Glutamin (Gin), 0. 1 mM nicht essentielle Aminosäuren (NEAA), 100U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin enthält, in einem Inkubator (5% CO₂-Atmosphäre) kultiviert.

Beispiel 10 Transfektion

Die Zellen werden auf einer 96-well-Mikrotiterplatte ausplattiert und über Nacht zu annähernd 60% Konfluenz inkubiert. Um die Zellen in einem "well" zu transfizieren, werden 1-2 µg von pCHl 10 oder pMSGCAT in 100 µl Opti-MEM 1 gelöst. Das kationische Lipid als ethanolische Lösung oder Liposomenformulierung wird ebenfalls in 100 µl Opti-MEM I gelöst. Die beiden Lösungen werden in einem Polystyrolbehälter gemischt, für 10-15 min stehengelassen, um die Bildung des Lipid/DNA-Komplexes zu ermöglichen. Danach wird auf 1 ml aufgefüllt indem 0.8 ml Opti-MEM I oder DMEM mit 5% FBS, 2 mM GIn, 0.5 mM NEAA ohne Antibiotika zugegeben werden.

Die Zellen werden einmal mit Opti-MEM 1 oder serumfreien DMEM gewaschen und der DNA/Lipid-Komplex wird direkt zu den Zellen gegeben. Nach 6 h Inkubationszeit bei 37°C wird der Transfektionskomplex entfernt und 2 ml DMEM mit 10% FBS, 2 mM GIn, 0.2 mM NEAA, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin zu jedem "well" hinzugegeben. Die Zellen werden weitere 48 h kultiviert und durch ein bis zweimaliges Frieren und Tauen in 300 µl 0.1 M Tris-HCl (pH 7.8-8.0), welches 0. 1 0% Triton X-100 enthält, lysiert. Die Zelllysate werden auf β-Galactosidase oder Chloramphenicolacetyltransferase getestet. Diese Tests werden mit kommerziell erhältlichen ELISA-Testkits nach den Anweisungen der Hersteller durchgeführt.

Claims

1. Verbindungen der allgemeinen Formel I: die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-, L- oder DL-Form vorliegen, einschließlich ihrer Salze, wobei a, b, c, d, e und f unabhängig voneinander 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sind und wobei a nur dann 0 ist, wenn b 0 ist und e nur dann 0 ist, wenn f 0 ist, R₁ ein Rest der allgemeinen Formel II ist: in welcher g 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, h 0,1,2 oder 3 ist, wobei g 0 ist, wenn h 0 ist und h 1 ist, wenn g 0 ist, X -O- oder -NH- ist, alle Positionen der Steroid-Substituenten α- oder β- konfiguriert sein können, die C-Atome 5 und 6 oder die C-Atome 8 und 9 über eine Doppelbindung verknüpft sind, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkyl- oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkenyl- oder ein substituierter oder unsubstituierter Aryl- oder Aralkyfrest sind, R₄ H oder Methyl ist oder R₁ ein Rest der allgemeinen Formel III ist: wobei alle chiralen Zentren unabhängig voneinander in D- oder L-Form vorliegen, m 0,1,2 oder 3 ist, k 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, wobei k 0 ist, wenn m 0 ist und m 1 ist, wenn k 0 ist, n, p und q unabhängig voneinander 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sind, R₂ wie vorstehend definiert ist, X₁, X₂, und X₃ inabhängig voneinander sind,
R₅ und R₆ unabhängig voneinander verzweigte oder unverzweigte Alkyl- oder Alkenylreste mit 5-30 Kohlenstoffatomen sind.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei a, d und e 3 sind, b und f 1 sind und c 0 ist.

3. Verbindungen nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei h 0 oder 1 ist und g (falls h 1 ist) 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, R₂ = Wasserstoff- Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-(1-Methyl-)propyl oder Benzyl und
R₃ = ist.

4. Verbindungen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin R₁ ein Rest der allgemeinen Formel IV ist: worin k, m, n, p, q, R₂, R₅, und R₆ wie in Anspruch 1 definiert sind.

5. Verbindungen nach Anspruch 4, wobei n = 0, in = 0 oder 1, q = 3, und p = 0, k (falls m = 1) = 1,2, 3, 4, 5 oder 6, R₂ Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-(1-Methyl-)propyl oder Benzyl, R₅ = -(CH₂)₁₇CH₃ und R₆ = -(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃ ist.

6. Verbindungen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin R₁ ein Rest der allgemeinen Formel V ist: worin k 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist und n,p, q, R₅ und R₆ wie in Anspruch 1 definiert sind.

7. Verbindungen nach Anspruch 6, in denen n = 0, p = 3, q = 0, k = 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, R₅ und R₆ = -(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃ sind.

8. Verbindungen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin R₁ ein Rest der allgemeinen Formel VI ist: worin k, m, n, p, q, R₂, R₅, und R₆ wie in Anspruch 1 definiert sind.

9. Verbindungen nach Anspruch 8, in denen n 0 ist, in 0 oder 1 ist, q 0 ist, p 0, 1 oder 2 ist, k 0 ist, wenn in 0 ist, k, falls in I ist, I, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, R₂ = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-(1-Methyl-)propyl oder Benzyl, R₅ und R₆ = -(CH₂)₁₇CH₃ ist.

10. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei ein Polyaminderivat der Formel VII: wobei a, b, c, d, e und f wie in Anspruch 1 definiert sind,
gegebenenfalls mit einem Spacer, der aus Aminoalkylensäurederivaten oder Diaminoalkylenderivaten der Formel VIII bestehen kann: wobei k, in und R₂ wie in Anspruch 1 definiert sind und X₄ -COOH oder -NH₂ sein kann,
und mit einem Steroidgerüst der Formel IX: wobei R₃ und R₄ wie in Anspruch 1 definiert sind, alle Positionen am Steroid-Grundgerüst α- oder β-konfiguriert sein können, die C-Atome 5 und 6 oder die C-Atome 8 und 9 über eine Doppelbindung verknüpft sind, X₅ -NH₂ oder -OH sein kann,
oder einem trifunktionellen Grundgerüst der Formel X: wobei n, p, q, X₂, X₃, R₅ und R₆ wie in Anspruch 1 definiert sind und X₆ -NH₂ oder -COOH entspricht, umgesetzt wird.

11. Liposomenformulierungen mit Verbindungen nach einem der Ansprüche 1-9 mit oder ohne Colipide.

12. Verfahren zum Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-DNA, Antisense-RNA, Peptiden und Proteinen in eukariotische Zellen, wobei Verbindungen oder Formulierungen nach einem der Ansprüche 1-9 oder 11 mit den einzubringenden Verbindungen und die entstandenen Komplexe mit eukariotischen Zellen in vivo oder in vitro in Kontakt gebracht werden.

13. Verwendung der Verbindungen oder Formulierungen nach einem der Ansprüche 1-9 oder 11 als Reagenz zur Einbringung von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-DNA, Antisense-RNA, Peptiden und Proteinen in vivo oder in vitro in eukariotische Zellen.