DE69609061T2

DE69609061T2 - Verfahren zur reinigung von glykoproteinen wie erythropoietin

Info

Publication number: DE69609061T2
Application number: DE69609061T
Authority: DE
Inventors: Armando Grigoletto; Ermenegildo Restelli; Giacomo Sarubbi; Adolfo Soffientini; Dino Zanette
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Sanofi Aventis SpA
Priority date: 1995-04-14
Filing date: 1996-04-09
Publication date: 2000-11-09
Anticipated expiration: 2016-04-10
Also published as: NO974524L; EA199700314A1; IL117849A0; AR001622A1; KR19980703851A; TW421652B; NZ307173A; HUP9802038A2; CN1181759A; EP0820468A1; NO974524D0; JP3998156B2; WO1996032413A1; KR100442076B1; DK0820468T3; EA000694B1; CZ291770B6; CA2216130A1; NO317188B1; AU693693B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein einfaches und effizientes Verfahren zur Gewinnung eines biologisch aktiven Glycoproteins aus einer biologischen Flüssigkeit, in der es enthalten ist.
Spezieller ist das Verfahren der Erfindung geeignet für die Gewinnung von hoch glycosylierten Proteinen, d. h. Glycoproteinen und Glycopeptiden mit einem Zuckergehalt von mehr als etwa 30% ihres Molekulargewichtes.
Ein spezielles und bevorzugtes Beispiel für Glycoprotein, das entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren bequem gereinigt werden kann, ist Erythropoietin.
Über die Herstellung von Erythropoietin aus verschiedenen Quellen, einschließlich genetisch manipulierter Zellen, wird in mehreren europäischen Patentanmeldungen oder Patenten berichtet, etwa EP-148605, EP-205564, EP-209539, EP-267678, EP-649464 und EP-672160.
Der Begriff "Erythropoietin" oder "Erythropoietinprodukt", wie er hier verwendet wird, soll natürlich vorkommendes Erythropoietin, aus Urin gewonnenes Human- Erythropoietin sowie nicht natürlich vorkommende Polypeptide einschließen, welche eine Aminosäuresequenz und Glycosylierung besitzen, die derjenigen von natürlich vorkommendem Erythropoietin hinreichend entspricht, so dass sie in vivo biologische Eigenschaften besitzen, die bewirken, dass Knochenmarkzellen die Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutkörperchen steigern, und er umfasst auch Erythropoietin, das aus Säugetier- Zellkulturflüssigkeiten beim Einführen eines intakten Erythropoietin-Kodierungsgens in die Säugetierzellen erhalten wird, oder Erythropoietin, das aus Säugetier-Zellkulturflüssigkeiten bei Aktivierung des/der endogenen Erythropoietin-Gen(e) erhalten wird, einschließlich "gen-aktiviertem" Erythropoietin, etwa demjenigen, das beschrieben ist in der Veröffentlichung der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 93/09222, welche als PCT/US 92/09627 eingereicht wurde, worin auch US benannt wird, oder in WO 94/12650, welche die Priorität von US s.n. 07/985,568 beansprucht, welche hiermit alle durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für die Aufbereitung von Erythropoietin, das in einer Kulturflüssigkeit einer Erythropoietin erzeugenden Zellkultur enthalten ist.
Der Begriff "Kulturflüssigkeit", wie er hier verwendet wird, soll sich vorzugsweise auf irgendeine Flüssigkeit künstlichen Ursprungs beziehen, etwa die Zellkulturflüssigkeit von Säugetierzellen und insbesondere von genetisch transformierten Säugetierzellen.
Vorzugsweise ist die "Kulturflüssigkeit", auf die sich diese Patentanmeldung bezieht, eine Kulturflüssigkeit, welche durch Filtration oder Ultrafiltration von Zellen und Zellbruchstücken getrennt wurde, wie es auf diesem Fachgebiet üblich ist. Darüber hinaus wird in der vorliegenden Offenbarung der Begriff "filtrierte Kulturflüssigkeit" verwendet, um eine Kulturflüssigkeit zu bezeichnen, welche durch Filtration oder Ultrafiltration, wie auf diesem Fachgebiet üblich, von Zellen und Zellbruchstücken getrennt wurde.
"Produzierende Zellen" sind vorzugsweise stabilisierte oder nicht-stabilisierte Zell-Linien von eukaryontischer oder vorzugsweise von Säugetierherkunft, die in der Lage sind, bei Kultivierung in einem geeigneten Medium das gewünschte Glycoprotein in einer gewinnungsfähigen Menge zu erzeugen. Zu repräsentativen Beispielen fir diese Zellen gehören Fibroblasten, Keratinozyten, Epithelzellen (z. B. Brustepithelzellen, Intestinalepithelzellen), Endothelzellen, Gliazellen, Neuralzellen, erzeugte Bestandteile des Blutes (z. B. Lymphozyten, Knochenmarkzellen), Muskelzellen und Vorstufen dieser somatischen Zelltypen. Wie erwähnt stammen diese Zellen vorzugsweise von Säugern (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen, Katze, Hund, Schwein, Rind, Vogel, Schaf, Ziege, Pferd, Affe, Mensch) und am stärksten bevorzugt sind sie von Primaten und Menschen. Insbesondere umfasst der Begriff "produzierende Zellen" auch transfizierte primäre, sekundäre sowie immortalisierte Zellen, abstammend von Wirbeltieren, speziell abstammend von Säugetieren, und am stärksten bevorzugt abstammend von Primaten oder Menschen, wobei die Zellen mit exogenem genetischem Material transfiziert sind, welches direkt oder indirekt bewirkt, dass die Zellen gewinnungsfähige Mengen von Erythropoietin produzieren, wie jene, die in der vorstehend genannten Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. WO 93/09222 oder WO 94/12650 beschrieben sind.
Beispiele für immortalisierte Humanzell-Linien, die für die Erzeugung von Erythropoietin nützlich sind, sind weit bekannt und erhältlich und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, HeLa-Zellen und Derivate von HeLa-Zellen (etwa ATCC CCL 2, 2.1 und 2.2), MCF-7 Brustkrebszellen (etwa ATCC HTB 22), K-562 Leukämiezellen (etwa ATCC CCL 234), KB Karzinomzellen (etwa ATCC CCL 17), 2780AD Ovarkarzinomzellen [Van der Blick, A. M. et al., Cancer Res., 48 (1988), 5927-5932], Raji-Zellen (ATCC CCL 86), Jurkat-Zellen (ATCC TIB 152), Namalwa-Zellen (ATCC CRL 1432), HL-60-Zellen (ATCC CCL 240), WiDr-Zellen (ATCC CCL 218), HT1080-Zellen (ATCC CCL 1219), Daudi-Zellen (ATCC CCL 213), RPMI-8226-Zellen (ATCC CCL 155), U-937-Zellen (ATCC CRL 1593), Bowes Melanom-Zellen (ATCC CRL 9607), WI-38VA13-Zellen der Sublinie 2R4 (ATCC CCL 75.1) und MOLT-4-Zellen (ATCC CRL 1582). Sekundäre Human-Fibroblaststämme, wie WI-38 (ATCC CCL 75) und MRC-5 (ATCC CCL 171) können ebenfalls verwendet werden.
Wie erwähnt, ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet für die Gewinnung des gewünschten Glycoproteins aus irgendeiner derartigen Kulturflüssigkeit und produzierenden Zellen.
Die umfangreiche Anwendung der Gentechnologie auf die Herstellung von biologisch aktiven Proteinen in großem Maßstab hat die Aussichten, sie in Mengen zu erhalten, die ihren hohen Bedarf befriedigen, wesentlich gesteigert. In einigen Fällen ist jedoch ihre Gewinnung aus der Kulturflüssigkeit schwierig, beschwerlich und teuer. Dies ist insbesondere der Fall, wenn das Protein hoch glycolisiert ist, wie vorstehend erwähnt. Speziell in diesen Fällen besteht auf dem Fachgebiet weiterhin ein Bedarf an einfachen und effizienten Gewinnungsverfahren, die für die Produktion in großem Maßstab geeignet sind.
Wenn in dieser Patentbeschreibung auf die spezifische Aktivität von Erythropoietin Bezug genommen wird, so soll diese gemäß einem ELISA-Verfahren ermittelt sein (z. B. dem in dieser Patentanmeldung berichteten: ELISA-Verfahren für Human-Erythropoietin, R & D Systems, Inc.), während der Proteingehalt der Proben mit dem BCA-Protein-Assay gemessen wird. Diese Analyseverfahren sind nachstehend genauer beschrieben unter der Überschrift: "Analyseverfahren".
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist demnach, einen geeigneten chromatographischen Schritt in einem Gesamt-Reinigungsverfahren bereitzustellen, bei welchem Dihydroxyboronyl-Reste tragende Chromatographiematrices eingesetzt werden.
Dieser chromatographische Schritt kann, wegen seiner Effizienz und Vielseitigkeit, der erste oder ein nachfolgender Schritt in einem Mehrschrittverfahren sein. Als ein erster chromatographischer Schritt wird die Dihydroxyboronyl-Chromatographie vorzugsweise mit einem Schritt der Ionenaustauschchromatographie verknüpft, wie nachstehend genauer beschrieben, während sie als ein nachfolgender chromatographischer Schritt in einem beliebigen Stadium eines Mehrschrittverfahrens eingesetzt werden kann.
Dieses Mehrschrittverfahren kann geeigneterweise zusätzlich irgendeinen aus einer Vielzahl chromatographischer Schritte einschließen, umfassend die Chromatographieschritte über Ionenaustausch, Größenausschluss, hydrophobe Wechselwirkung und Affinität.
Als ein nachfolgender Chromatographieschritt in einem Mehrschrittverfahren wird die Dihydroxyboronyl-Chromatographie vorzugsweise ausgeführt, indem ein teilgereinigtes Material auf eine preäquilibrierte Dihydroxyboronyl-Reste tragende chromatographische Matrix aufgebracht wird. Das teilgereinigte Material wird ebenfalls in dem Matrix-Äquilibrierungspuffer äquilibriert, bevor es auf die Matrix aufgebracht wird. Dieser Äquilibrierungspuffer wird bisher als "erster äquilibrierender Puffer" bezeichnet und wird nachstehend genauer definiert. Dieser Verfahrensschritt ist besonders geeignet für die Reinigung von Erythropoietin.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Reinigungsverfahren, umfassend:
a) Inkontaktbringen einer filtrierten Kulturflüssigkeit, die das zu isolierende Glycoprotein enthält, mit einer preäquilibrierten, Dihydtoxyboronyl-Reste tragenden chromatographischen Matrix,
b) Eluieren mit einem ersten eluierenden Puffer und direktes Inkontaktbringen dieses Eluats mit einer Anionenaustauschermatrix, die quartäre Ammonium-funktionelle Reste trägt, und
c) Eluieren des Glycoproteins mit einem zweiten eluierenden Puffer.
Wie beim vollständigen Lesen der vorliegenden Offenbarung deutlich wird, gestatten diese Verfahrensschritte eine mehrfache Reinigung eines in einem Kulturmedium enthaltenen Glycoproteins, und deshalb werden sie wirkungsvoll als ein erster Reinigungsschritt in einem Mehrschrittverfahren verwendet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Kulturflüssigkeit, die das zu isolierende Glycoprotein enthält, einem Verfahren unterzogen, welches umfasst:
a) Inkontaktbringen einer filtrierten Kulturflüsssigkeit mit einer Dihydroxyboronyl- Reste tragenden chromatographischen Matrix,
b) Eluieren mit einem ersten eluierenden Puffer und direktes Inkontaktbringen dieses Eluats mit einer Anionenaustauschermatrix, die quartäre Ammonium-funktionelle Reste trägt,
c) Eluieren mit einem zweiten eluierenden Puffer,
d) Ultrafiltrieren auf einer 5000-30000 D Cut-off-Membran,
e) gegebenenfalls Diafiltrieren zum Austausch des Puffers gegen einen für den nächsten Schritt geeigneten, und
f) Gelitrieren auf einem Trennharz mit einem Trennbereich zwischen 5000 und 250000 D.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren:
a) Inkontaktbringen einer auf einen pFl-Wert von 7,5-9,0 eingestellten Kulturflüssigkeit mit einer Dihydroxyboronyl-Reste tragenden chromatographischen Matrix, welche mit einem ersten äquilibrierenden Puffer äquilibriert wurde, der ein wässeriger Puffer mit einer Konzentration von 25-100 mM, einer Ionenstärke zwischen 2 und 20 mS/cm² und einem pI-I-Wert zwischen 7,5 und 9,0 ist,
b) darauffolgendes Waschen mit dem ersten äquilibrierenden Puffer und danach mit dem ersten äquilibrierenden Puffer, der von 10 bis 100 mM einer eine 1,2-cis- Diolgruppe enthaltenden niedermolekularen Substanz enthält,
c) Eluieren mit einem ersten eluierenden Puffer, der ein wässeriger Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7,5 und 11,0 ist, welcher eine Verbindung mit 1-Hydroxy-2- aminoresten in einer Konzentration von 20-200 mM enthält, möglicherweise in der Gegenwart eines chaotropen Agens mit 2 bis 8 M, eines Cyanat-Akzeptors mit 2-40 mM und eines grenzflächenaktiven Mittels von 0,01% bis 0,1% (w/w),
d) Inkontaktbringen dieses Eluats mit einer quartäre Ammonium-funktionelle Reste tragenden Anionenaustauschermatrix, die in einem zweiten äquilibrierenden Puffer, der ein wässeriger Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7,5 und 11,0 ist und von 0,01% bis 0,1% (w/w) eines grenzflächenaktiven Mittels enthält, äquilibriert wurde,
e) darauffolgendes Waschen mit dem zweiten äquilibrierenden Puffer und demselben Puffer, der zusätzlich bis zu 50 mM Salz enthält,
f) Eluieren mit einem zweiten eluierenden Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7,5 und 11,0 in der Gegenwart von 0,01% bis 0,1% (w/w) eines grenzflächenaktiven Mittels und von 150 bis 350 mM Salz,
g) Ultrafiltrieren auf einer 5000 - 30000 D Cutt-off-Membran,
h) gegebenenfalls Diaflitrieren zum Austauschen des Puffers gegen einen, der für den nächsten Gelfiltrationsschritt geeignet ist, und
i) Gelfiltrieren auf einem Trennharz mit einem Trennbereich zwischen 5000 und 250000 D.
"Dihydroxyboronyl-Reste tragende chromatographische Matrices" bedeuten irgendeine bekannte chromatographische Matrix, die eine Boronat-Funktion trägt, in der das Boratom stabil an eine Kette von Kohlenstoffatomen gebunden ist, in welcher das benachbarte Kohlenstoffatom genügend freie Elektronendichte bereitstellt, um unter den verschiedenen Einsatzbedingungen an das Boratom gebunden zu bleiben. Am stärksten bevorzugt ist dieses benachbarte Kohlenstoffatom ein aromatisches Kohlenstoffatom, zum Beispiel ein Kohlenstoffatom, das zu einem gegebenenfalls substituierten Benzolring gehört. Besonders bevorzugt für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind die sogenannten Phenylboronatharze. Über Beispiele für diese Harze ist in den U. S. -Patenten 4,562,251, 4,778,888 und 4,269,605 berichtet. Unter diesen sind gegenwärtig Phenylboronatagarose-Matrices die bevorzugtesten. Diese Matrices sind zur Zeit unter dem Handelsnamen MATREX GEL, einschließlich MATREX GEL PBA-10, PBA-30 und PBA- 60, z. B. von Amicon Inc. oder Grace Inc., kommerziell erhältlich. Gegenwärtig ist die am stärksten bevorzugte Phenylboronat-Agarose für die Anwendung als ein erster Reinigungsschritt die als MATREX GEL PBA-60 vertriebene, bei der es sich um diejenige handelt, in der m-Aminophenylboronsäure kovalent mit Agarose verbunden ist, wobei deren kugelförmige Perlen einen Größenbereich von 50-150 um im Durchmesser und ein Verhältnis von 60-100 uM Boronsäure/ml Gel haben. Als ein nachfolgender Reinigungsschritt wird jedoch eine Phenylboronatagarose-Matrix wie MATREX GEL PBA- 30 bevorzugt, bei dem es sich um dasjenige handelt, in dem m-Aminophenylboronsäure kovalent mit Agarose verbunden ist, wobei deren kugelförmige Perlen einen Größenbereich von 50-150 um im Durchmesser und ein Verhältnis von 30-50 uM Boronsäure/ml Gel haben.
Gegenwärtig liegt die am stärksten bevorzugte Verwendung dieser chromatographischen Matrices in Säulenchromatographiesystemen, wenngleich absatzweise arbeitende oder andere Systeme nicht vollständig ausgeschlossen sind.
Wenn sie in Säulenchromatographiesystemen verwendet wird, wird die Dihydroxyboronyl-Reste tragende chromatographische Matrix vorzugsweise bei Raumtemperatur eingesetzt, vorzugsweise zwischen 5 und 25ºC, und am stärksten bevorzugt zwischen 10 und 20ºC, wobei etwa 15ºC die am stärksten bevorzugte Temperatur ist.
Der vorstehend erwähnte "erste äquilibrierende Puffer" ist vorzugsweise ausgewählt aus Glycin, Phosphat, Trialkylammoniumbicarbonat und 4-(2-Hydroxyethyl)-1- piperazinoethan-sulfonsäure (HEPES) mit dem angegebenen Konzentrationsbereich, der Jonenstärke und dem pH-Wert. Eine besonders bevorzugte Konzentration für diesen ersten äquilibrierenden Puffer ist eine Konzentration von etwa 50 mM, während ein besonders bevorzugter pH-Wert etwa 8,5 ist und eine bevorzugte Leitfähigkeit etwa 2,5 mS/cm² beträgt. Dies sind bevorzugte Bedingungen sowohl im Fall der Reinigung im ersten Schritt als auch in einem nachfolgenden Schritt.
Die vorstehend erwähnte "eine 1,2-cis-Diolgruppe enthaltende Substanz" ist irgendeine der bekannten niedermolekularen Verbindungen mit funktionellen 1,2-cis- Diolgruppen, d. h. mit mindestens zwei Hydroxygruppen an benachbarten Kohlenstoffatomen, die in einer coplanaren oder quasi-coplanaren Konfiguration gehalten werden oder diese annehmen können. Repräsentative Beispiele für diese Verbindungen, die in jedem Fall allgemein auf dem Fachgebiet bekannt sind, sind kleine offenkettige Polyole, wie Sorbit, Mannit, Adonit, Arabit, Glycerin, Erythrit und cis-Inosit, und geschlossenkettige Monosaccharide, wie Ribose und Mannose, wobei Sorbit gegenwärtig am stärksten bevorzugt ist. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von einer eine 1,2-cis-Diolgruppe enthaltenden niedermolekularen Substanz mit einer Konzentration von etwa 50 mM im Fall eines ersten Reinigungsschrittes, während in einem nachfolgenden Reinigungsschritt gegenwärtig eine Konzentration von 20-100 mM bevorzugt ist, wobei 100 mM die am stärksten bevorzugte ist.
Die vorstehend erwähnte "Verbindung mit 1-Hydroxy-2-aminoresten", welche der Hauptbestandteil des "ersten eluierenden Puffers" ist, ist irgendeine Verbindung, die solche funktionellen Reste trägt und in der Lage ist, einen wässerigen Puffer in dem vorstehend angegebenen pH-Bereich zu erzeugen. Repräsentative Beispiele für irgendwelche derartige Verbindungen sind: 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol, das auch als TRIS oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan bekannt ist; Bis(hydroxymethyl)- aminoethan; N-[2-Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethylethyl)]glycin, das auch als Tricin bekannt ist; und N,N-bis(2-Hydroxyethyl)glycin, das auch als Bicin bekannt ist. Sie werden vorzugsweise im Falle eines ersten Reinigungsschrittes in einer Konzentration von etwa 20- 100 mM eingesetzt, wobei etwa 50 mM gegenwärtig am stärksten bevorzugt ist. Vorzugsweise wird der erste eluierende Puffer auf einen pH-Wert von etwa 8,5 eingestellt.
Für die Anwendung als ein nachfolgender Reinigungsschritt beträgt der bevorzugte Konzentrationsbereich 20-150 mM, wobei 100 mM am stärksten bevorzugt ist. Außerdem ist für diese Anwendung TRIS der gegenwärtig bevorzugte Puffer.
Wenn Phenylboronat-Chromatographie als ein zweiter chromatographischer Schritt angewandt wird, schließen bevorzugte Eluierungsbedingungen einen eluierenden Puffer ein, der TRIS 100 mM und Sorbit 100 mM enthält.
Vorzugsweise haben der "zweite äquilibrierende Puffer" und der "zweite eluierende Puffer" die vorstehend definierte Verbindung mit 1-Hydroxy-2-aminoresten als ihre Hauptkomponente. In diesem Fall liegt ihre bevorzugte Konzentration zwischen 20 und 200 mM.
Ein "chaotropes Mittel" ist ein Mittel, welches die Einsalzung eines proteinartigen Materials, und somit seine Solubilisierung in einem wässerigen Medium, begünstigt, im allgemeinen wegen seiner dissoziierenden Eigenschaften.
Repräsentative Beispiele für chaotrope Mittel sind Harnstoff und seine Derivate sowie Guanidin. Das chaotrope Mittel wird, falls vorhanden, in einer Konzentration zwischen 2 und 8 M eingesetzt, wobei etwa 4-6 M bevorzugt ist.
Ein Cyanat-Akzeptor ist irgendeine der bekannten Substanzen, die in der Lage sind, CNO- - Ionen, die als Folge der Hydrolyse von Harnstoff entstehen können, leicht zu binden. Glycin ist als Cyanat-Akzeptor bevorzugt. Für seine Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Glycin vorzugsweise in einer Konzentration von 2 bis 40 mM und am stärksten bevorzugt etwa 20 mM eingesetzt.
Der Begriff "grenzflächenaktives Mittel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf irgendeine der bekannten Substanzen, die die Oberflächenspannung, d. h. die Kraft, die an der Oberfläche von Flüssigkeiten zur Reduzierung ihres Oberflächenbereiches wirkt, verringern. Bevorzugte Beispiele für grenzflächenaktive Mittel sind die Polyoxyethylensorbit-Derivate von Fettsäuren, die als "Tween®" bekannt sind, wobei "Tween 20" (d. h. Polyoxyethylensorbitmonolaureat) gegenwärtig bevorzugt wird. Gegenwärtig wird das grenzflächenaktive Mittel, falls vorhanden, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,01-0,1% (w/w) eingesetzt, wobei etwa 0,01% gegenwärtig am stärksten bevorzugt sind.
Die vorstehend erwähnte quartäre Ammonium-funktionelle Reste tragende Anionenaustauschermatrix ist irgendeine der bekannten und im Handel erhältlichen Anionenaustauschermatrices mit den funktionellen Resten. Bevorzugt für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Matrices auf Agarose- oder Cellulosebasis, etwa mikrokristalline Cellulose oder vernetzte Agarose. Ebenfalls besonders bevorzugt sind jene Matrices, die funktionelle Diethylaminoethyl-, Triethylaminomethyl- oder Trimethylaminomethyl-Gruppen tragen.
Eine besonders bevorzugte Anionenaustauschermatrix ist Trimethylaminomethyl-vernetzte Agarose, die im Handel z. B. als Q-Sepharose® (Pharmacia AB) erhältlich ist. Der chromatographische Schritt, bei dem diese Matrices beteiligt sind, wird am stärksten bevorzugt als Säulenchromatographie ausgeführt, welche bei Raumtemperatur vorgenommen wird.
Wenn einem Wasch- oder Elutionspuffer wie vorstehend berichtet ein Salz zugesetzt wird, wird es zugesetzt, um die Jonenstärke des Puffers zu erhöhen, wie auf dem Fachgebiet üblich. Irgendeines der üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendeten Salze kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu diesem Zweck eingesetzt werden, wobei NaCl eines derjenigen ist, die am häufigsten und bequemsten verwendet werden.
Der Ultrafiltrationsschritt wird wie auf dem Fachgebiet üblich durchgeführt, wobei ein Tangentialfließsystem oder ein System mit gerührter Zelle verwendet wird. Vorzugsweise ist die Membran eine Polysulfonmembran oder eine Membran aus regenerierter Cellulose der kommerziell erhältlichen Typen, z. B. von Millipore Inc. oder Amicon Inc.. Gegenwärtig sind für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren jene Membranen bevorzugt, die eine Ausschlussgrenze (Cut-off) von 10000 haben.
Das Ultrafiltrat wird dann gegebenenfalls einer Diafiltration gemäß den per se auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren unterzogen, vorzugsweise in demselben Puffer, der für den nächsten Gelfiltrationsschritt verwendet werden soll. Dieser Gelfiltrationspuffer ist ein wässeriger Puffer mit einem pH-Wert zwischen 6 und 8. Das Salz liegt vorzugsweise von 100 bis 200 mM in diesem Puffer vor und noch stärker bevorzugt ist das Salz 100 mM und der pH-Wert ist etwa 7,4-7,5.
Die gebräuchlichen Gelfiltrationsmatrices können in diesem Verfahrensschritt bequem verwendet werden. Repräsentative Beispiele für diese Matrices sind mit Acrylamiden vernetzte Polydextrane, etwa hydrophile Komposit-Gele hoher mechanischer Festigkeit, die durch kovalentes Vernetzen von Allyldextran mit N,N'-Methylenbisacrylamid hergestellt werden, und vernetzte Cellulosegele. Kommerziell erhältliche vernetzte Dextran-Acrylamide sind unter dem Handelsnamen SEPHACRYL bekannt und sind von Pharmacia AB erhältlich. Ein bevorzugtes SEPHACRYL-Gel ist SEPHACRYL 5- 200 HR, welches eine Perlengröße von 25-75 um besitzt, und seine Vernetzung ist so gesteuert, dass es einen Fraktionierungsbereich für globulares Protein von 5000-250000 D hat.
Beispiele für vernetzte Cellulosegele sind jene kommerziell erhältlichen vernetzten porösen Cellulosegele, z. B. GLC 300 (mittlere Teilchengröße 44-125 um) oder GLC 1000 (mittlere Teilchengröße 53-125 um), die von Amicon Inc. erhältlich sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für eine Produktion in großem Maßstab, da es aus einer Folge von Schritten besteht, die ohne die hauptsächlichen Nachteile der bekannten Verfahren leicht im Maßstab zu ändern sind.
Darüber hinaus verwendet es nur wässerige Lösungsmittel, und dies stellt einen weiteren Vorteil dar, wie es dem Fachmann geläufig ist.
Außerdem gestattet es den Übergang von seinem ersten chromatographischen Schritt (d. h. demjenigen mit der Dihydroxyboronyl-Matrix) zu seinem zweiten chromatographischen Schritt (d. h. demjenigen mit der Anionenaustauschermatrix) durch direktes Transferieren des Eluats aus dem ersten Schritt in den zweiten, ohne dass ein Lösungsmittelaustausch oder eine Anpassung erforderlich ist.
Zusätzlich dazu, dass die gesamte Handhabung vereinfacht wird, trägt diese Eigenschaft des erfindungsgemäßen Verfahrens dazu bei, die Ausbeuten der Gewinnung zu verbessern.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet in der Tat die Gewinnung eines Erythropoietinproduktes mit einer mittleren spezifischen Aktivität von 145000-175000 ELISA-Einheiten/mg, ausgehend von einer filtrierten Zellflüssigkeit mit einer mittleren spezifischen Aktivität von 500-2000 ELISA-Einheiten/mg.
Darüber hinaus gestatten der kombinierte erste und zweite chromatographische Schritt eine 60- bis 100-fache Reinigung der anfänglichen Kulturflüssigkeit, mit einem Gesamtreinigungsfaktor von 110- bis 150-fach für das vollständige Verfahren.
Wie im Falle von Erythropoietin kann das am Ende des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnene Glycoproteinprodukt nach Entfernen des Salzes und Gefriertrocknung, wie auf dem Fachgebiet üblich, als Feststoff isoliert werden, oder die erhaltene Lösung kann einem Lösungsmittelaustausch unterzogen werden, z. B. durch Diafiltration, um eine zur pharmazeutischen Formulierung geeignete Lösung zu haben, etwa eine der in EP 430200 beschriebenen.
Die nachstehenden Beispiele sind lediglich veranschaulichend und sollen den Anspruchsbereich der Erfindung nicht einschränken.

BEISPIEL 1

Phenylboronat-Chromatographie als erster Reinigungsschritt bei der Reinigung von Erythropoietin

Die überstehende Flüssigkeit einer Kultur von Human-Erythropoietin produzierenden Zellen, die wie in Beispiel 21 aus WO 93/09222 oder in WO 94/12650 beschrieben erhalten wurden, welche ungefähr 20 mg Erythropoietin enthält, wird mit einer Mischmembranpatrone (1, 2 und 0,5 um; Opticap, Millipore Inc.) filtriert und dann mit einer 30000 D-Spiralpatrone aus regenerierter Cellulose SIY30 (Amicon Inc.) ultrafiltriert sowie diafiltriert mit Wasser und 0,05 M HEPES pH 8,5 mit einer Leitfähigkeit von 2,5 mS/cm². Das Ultrafiltrat wird auf eine Chromatographiesäule aus Phenylboronatagarose (120 ml gequollenes Harz; PBA 60, Amicon Inc.), die mit 0,05 M HEPES pH 8,5, enthaltend 0,01 % Tween 20 (Puffer A, äquilibriert wurde, gegeben und mittels Wasserkühlung bei etwa 10-15ºC gehalten. Die Fließgeschwindigkeit wird auf etwa 2-4 Säulenvolumina (CV)/Std. eingestellt. Nachdem mit Puffer A bis zur Stabilisierung der Basislinie [optische Dichte (OD) bei 280 nm] gewaschen wurde, wird weiter mit 0,05 M HEPES pH 8,5, enthaltend 0,01% Tween 20 und 0,05 M Sorbit (Puffer B), gewaschen. Das Eluieren wird mit 0,02 M TRIS pH 8,5, enthaltend 6 M Harnstoff, 0,02 M Glycin und 0,01% Tween 20 (Puffer C), durchgeführt und die eluierte Peakfraktion (OD bei 280 nm) wird gesammelt (etwa 4-5 CV; Ausbeute 70-80%, Reinigungsfaktor etwa 20-fach) und direkt auf ein Anionenaustauscherharz aus Trimethylaminomethyl-vernetzter Agarose gegeben (25 ml gequollenes Harz; Q-Sepharose FF, Pharmacia AB), das mit 0,02 M TRIS pH 8,5, enthaltend 0,01% Tween 20 Puffer D), äquilibriert war. Nach dem Waschen mit Puffer D bei konstanter Fließgeschwindigkeit bis zur Stabilisierung der Basislinie und dann mit Puffer D, der noch 0,05 M NaCl enthält (Puffer E), wird das Eluieren mit 0,02 M TRIS pH 8,5, enthaltend 0,01% Tween 20 und 0,15 M NaCl Puffer F), vorgenommen. Die Peakfraktion (OD 280 nm) wird gesammelt (Rückgewinnung etwa 80%) und durch Ultrafiltration in einer gerührten Zelle mit einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 10000 D (YM 10, Amicon) konzentriert.
Die konzentrierte Lösung wird auf eine Filtersäule aus vernetztem Dextran- Acrylamid-Gel (Sephacryl 5 200; Pharmacia AB) gegeben, die mit 0,02 M TRIS pH 7,4, enthaltend 0,15 M NaCl (Puffer G), äquilibriert wurde, und mit dem gleichen Puffer eluiert. Es werden Fraktionen gesammelt, und jene, die das Erythropoietinprodukt enthalten (ELISA-Test) werden vereinigt und wie vorstehend beschrieben mit Ultrafiltration konzentriert.

BEISPIEL 2

Phenylboronat-Chromatographie als ein nachfolgender Reinigungsschritt bei der Reinigung von Erythropoietin

Eine Lösung von teilgereinigtem Human-Erythropoietin (aus produzierenden Zellen, die wie in Beispiel 21 aus WO 93/09222 oder in WO 94/12650 beschrieben erhalten wurden), welche ungefähr 20 mg Erythropoietin enthält, wird mit Wasser und 0,05 M HEPES pH 8,5 sowie 0,15 M NaCl, Leitfähigkeit etwa 18 mS/cm², diafiltriert oder dialysiert und auf eine Chromatographiesäule aus Phenylboronat-Agarose (120 ml gequollenes Harz; PBA 30, Amicon Inc.) gegeben, die mit 0,05 M HEPES pH 8,5, enthaltend 0,15 M NaCl (Puffer A'), äquilibriert worden ist, und mittels Wasserkühlung bei etwa 10-15ºC gehalten. Die Fließgeschwindigkeit wird auf etwa 2-4 Säulenvolumina (CV)/ Std. eingestellt. Nachdem mit Puffer A' bis zur Stabilisierung der Basislinie [optische Dichte (OD) bei 280 nm] gewaschen wurde, wird das Eluieren mit 0,10 M TRIS pH 8,5, enthaltend 0,1 M Sorbit Puffer B') vorgenommen und die eluierte Peakfraktion (OD bei 280 nm) wird gesammelt (etwa 4-5 CV; Ausbeute etwa 90%).

Analyseverfahren:

ELISA:

Die spezifische Aktivität des Erythropoietinproduktes, das gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wird mit dem Human-EPO-ELISA- Verfahren gemessen, welches als QUANTIKINE IVD (R&D SYSTEMS Inc.) bekannt und im Handel erhältlich ist.

Protein-Assay:

Der Protein-Assay wird mittels dem BCA-Protein-Assay-Reagenzverfahren (Pierce Chemical Co.) durchgeführt, welches ein Verfahren ist, das die Biuret-Reaktion (Reduktion von Cu²&spplus; zu Cu¹&spplus; durch Protein in einem alkalischen Medium) mit der hochspezifischen Reaktion von Bicinchoninsäure (BCA) mit Cu¹&spplus; kombiniert.

Spezifische Aktivität:

Die spezifische Aktivität für Proben wird mit folgender Formel berechnet:
Spezifische Aktivität = Gesamteinheiten von Erythropoietin aus ELISA / Gesamtprotein in mg aus BCA-Assay. Ein gereinigtes Präparat aus Erythropoietin hat eine spezifische Aktivität von etwa 200000 ELISA-Einheiten/mg Protein aus BCA-Assay. Die spezifische Aktivität unter Verwendung des ELISA-Tests zur Quantifizierung der Erythropoietin- Einheiten ist nur indirekt mit der eigentlichen biologischen Aktivität von Erythropoietin verknüpft. Ein allgemein durchgeführter Test zur Bestimmung von spezifischer Aktivität in vivo ist der exhypoxische polyzythämische Maus-Bioassay, der dem Fachmann bekannt ist (ein solcher Assay kann die spezifische Aktivität als IU/mg bestimmen, wie dem Fachmann bekannt).

HPLC-Analyse:

Instrument: Waters 616 LC-System, ausgestattet mit einem PDA-Detektor, Modell 996 Säule: Vydac-Protein-C4, 3 um, 4,6 · 250 mm
Mobile Phase: A) 0,1%-ige wässerige Trifluoressigsäure: Acetonitril, 95 : 5, B) 0,1%- ige wässerige Trifluoressigsäure: Acetonitril, 5 : 95
Gradient: Min (%B): 5 (5), 50 (95)
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/Min.

SDS-PAGE-Analyse:

Die SDS-PAGE-Analyse wird auf einem Phast-System, Pharmacia AB, vorgenommen und die Densitometrie-Messungen werden mit einem Flying Spot Rasterdensitometer C5-9301 PC, Shimadzu Co., entsprechend den Vorschriften des Herstellers und den allgemeinen Kenntnissen auf diesem Gebiet durchgeführt. Analytische Daten und Ergebnisse: ·
Anhand der gesammelten Daten aus mehreren Durchgängen ergab sich die spezifische Aktivität des Erythropoietinproduktes aus dem Zellüberstand im Bereich 500 - 2000 ELISA-Einheiten/mg; die spezifische Aktivität des nach dem ersten chromatographischen Schritt zurückgewonnenen Erythropoietinproduktes beträgt etwa 35000 - 95000 ELISA-Einheiten /mg; die spezifische Aktivität des Erythropoietinproduktes, das am Ende des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens zurückgewonnen wurde, beträgt im Mittel etwa 145000 - 175000 ELISA-Einheiten/mg.
Die HPLC-Analyse wie auch die SDS-PAGE-Analyse, die gemäß den vorstehend dargelegten Verfahren durchgeführt wurden, zeigten, dass das am Ende des Verfahrens zurückgewonnene Erythropoietinprodukt einen Hauptpeak aufwies, der mehr als 92% der Fläche unter der Kurve (AUC) ausmachte.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin, umfassend die folgenden Schritte:

a) Aufbringen eines Erythropoietin enthaltenden Materials auf eine mit einem ersten äquilibrierenden Puffer preäquilibrierte chromatographische Dihydroxyboronyl-Matrix,

b) Waschen mit dem äquilibrierenden Puffer und

c) Eluieren mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7, 5 und 11, der eine Verbindung mit 1-Hydroxy-2-aminoresten und einen eine 1,2- cis-Diolgruppe enthaltenden Stoff enthält.

2. Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin, umfassend:

a) Inkontaktbringen einer das zu isolierende biologisch aktive Glycoprotein enthaltenden filtrierten Kulturflüssigkeit mit einer mit einem ersten äquilibrierenden Puffer preäquilibrierten, Dihydroxyboronyl-Reste tragenden chromatographischen Matrix,

b) Eluieren mit einem ersten eluierenden Puffer und direktes Inkontaktbringen des Eluats mit einer quartäre Ammonium-funktionelle Reste tragenden Anionenaustauschermatrix,

c) Eluieren des Glycoproteins mit einem zweiten eluierenden Puffer und es Auffangen.

3. Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin, umfassend:

a) Inkontaktbringen einer das zu isolierende Glycoprotein enthaltenden filtrierten Kulturflüssigkeit mit einem mit einem ersten äquilibrierenden Puffer preäquilibrierten, Dihydroxyboronyl-Reste tragenden chromatographischen Träger,

b) Eluieren mit einem ersten eluierenden Puffer,

c) direktes Inkontaktbringen dieses Eluats mit einer quartäre Ammoniumfunktionelle Reste tragenden Anionenaustauschermatrix,

d) Eluieren mit einem zweiten eluierenden Puffer,

e) Ultrafiltrieren auf einer 5000-25000 D Cut-off-Membran,

f) gegebenenfalls Diafiltrieren zum Austausch des Puffers gegen einen für den nächsten Schritt geeigneten und

g) Gelitrieren auf einem Trennharz mit einem Trennbereich zwischen 5000 und 250000 D.

4. Verfahren zur Reinigung von Eythropoietin, umfassend:

a) Inkontaktbringen einer auf einen pH-Wert 7,5-9,0 eingestellten, filtrierten Kulturflüssigkeit mit einem mit einem ersten äquilibrierenden Puffer, der ein wäßriger Puffer mit einer Konzentration von 25-100 mM, einer Ionenstärke zwischen 2 und 20 mS/cm² und einem pH-Wert zwischen 7,5 und 9,0 ist, äquilibrierten, Dihydroxyboronyl-Reste tragenden chromatographischen Träger,

b) darauffolgendes Waschen mit dem ersten äquilibrierenden Puffer und anschließend mit dem ersten äquilibrierenden Puffer, welcher 10 bis 100 mM eines eine 1,2-cis-Diolgruppe enthaltenden niedermolekularen Stoffs enthält,

c) Eluieren mit einem ersten eluierenden Puffer, der ein wäßriger Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7, 5 und 11,0 ist, welcher eine Verbindung mit 1- Hydroxy-2-aminoresten in einer Konzentration von 20-200 mM enthält, möglicherweise in der Gegenwart eines chaotropen Agens mit 2 bis 8 M, eines Cyanat-Akzeptors mit 2-40 mM und eines grenzflächenaktiven Mittels von 0,02% bis 0,1% (w/w),

d) Inkontaktbringen dieses Eluats mit einer quartäre Ammonium-funktionelle Reste tragenden, in einem zweiten äquilibrierenden Puffer, der ein wäßriger Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7, 5 und 11,0 ist und von 0,01% bis 0,1 (w/w) eines grenzflächenaktiven Mittels enthält, äquilibrierten Anionenaustauschermatrix,

e) darauffolgendes Waschen mit dem zweiten äquilibrierenden Puffer und demselben Puffer, der zusätzlich bis zu 50 mM Salz enthält,

f) Eluieren mit einem zweiten eluierenden Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7, 5 und 11,0 in Gegenwart von 0,01% bis 0,1% (w/w) eines grenzflächenaktiven Mittels und von 150 bis 350 mM Salz,

g) Ultrafiltrieren auf einer 5000-30000 D Cut-off-Membran,

h) gegebenenfalls Diafiltrieren zum Austauschen des Puffers gegen einen, der für den nächsten Gelfiltrationsschritt geeignet ist und

i) Gelitrieren auf einem Trennharz mit einem Trennbereich zwischen 5000 und 250000 D.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, in dem der Dihydoxyboronyl- Reste tragende chromatographische Träger eine Phenylboronat-Agarose ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, in dem der erste äquilibrierende Puffer aus Glycin, Phosphat, Trialkylammoniumbicarbonat und 4- (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinoethan-sulfonsäure ausgewählt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, in dem der erste äquilibrierende Puffer 4-(2- Hydroxyethyl)-1-piperazinoethan-sulfonsäure mit einer Konzentration von etwa 0,05 M ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in dem der pH-Wert des ersten äquilibrierenden Puffers etwa 8, 5 ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 4 bis 8, in dem der eine 1,2-cis- Diolgruppe enthaltende niedermolekulare Stoff aus kleinen offenkettigen Polyolen wie Sorbit, Mannit, Adonit, Arabit, Glycerin, Erythrit und cis-Inosit, und geschlossenkettigen Monosacchariden, wie Ribose und Mannose ausgewählt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, in dem der eine 1,2-cis-Diolgruppe enthaltende niedermolekulare Stoff Sorbit ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, in dem der eine 1,2-cis-Diolgruppe enthaltende niedermolekulare Stoff in einer Konzentration von etwa 0,05 M anwesend ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 4 bis 11, in dem der zweite äquilibrierende Puffer eine Verbindung mit 1-Hydroxy-2-aminoresten in einer Konzentration von 0,02-0,2 M enthält.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 4 bis 1 I, in dem der zweite eluierende Puffer eine Verbindung mit 1-Hydroxy-2-aminoresten in einer Konzentration von 0,05 M enthält.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 13, in dem die Verbindung mit 1- Hydroxy-2-aminoresten aus 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol, Bis- (hydroxymethyl)aminoethan, N-[2-Hydroxy-1,I-bis(hydroxymethyl)ethyl]glycin und N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycin ausgewählt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, in dem das chaotrope Agens aus Harnstoff und seinen Derivaten und Guanidin ausgewählt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, in dem das chaotrope Agens 6 M Harnstoff ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 16, in dem der Cyanat-Akzeptor Glycin ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 17, in dem die quartäre Ammoniumfunktionelle Reste tragende Anionenaustauschermatrix aus mikrokristalliner Cellulose oder vernetzten Agarosematrices, welche Diethylaminoethyl-, Triethylaminomethyl- oder Trimethylaminomethyl-funktionelle Reste tragen, ausgewählt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, in dem die Anionenaustauschermatrix Trimethylaminomethyl-Agarose ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 19, in dem die Gelitration mit einer vernetzten Dextran-Acrylamid-Gelmatrix mit festgelegter Porengröße durchgeführt wird.