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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Umwandeln eines
Fusionsproteins von Motilin-Analogen in eine aktive Form sowie ein Verfahren zum Reinigen der
Analogen und mehr im besonderen das Umwandeln des Fusionsproteins, das tandemartig
wiederholte, menschliche Motilin-Analoge enthält, die in transformierten Mikroorganismen
exprimiert sind, in eine biologisch aktive Form menschlicher Motilin-Analoger und Reinigen der
Motilin-Analogen in einem solchen Ausmaß, daß das Analoge als ein wirksamer Bestandteil zum
Zubereiten eines Arzneimittels eingesetzt werden kann.
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Motilin ist eines der Peptidhormone, das zuerst aus der Schleimhaut des Dünndarms von
Schweinen isoliert und dessen Aminosäuresequenz durch J.C. Brown et al. ["Gastroenterology",
Band 62, Seiten 401-404 (1972) und "Can. J. Biochem.", Band 52, Seiten 7-10 (1974)] bestimmt
wurde. Das Schweine-Motilin besteht aus 22 Aminosäureresten und hat ein Molekulargewicht
von etwa 2.700.
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Einige der vorliegenden Erfinder haben geklonte cDNA isoliert, die für menschlichen
Motilin-Vorläufer codiert, wobei deren Nucleotidsequenz einen Teil einschließt, der für die
gleiche Aminosäuresequenz wie der des Schweine-Motilins codiert, so daß es deutlich gemacht
wurde, daß das menschliche Motilin die gleiche Aminosäuresequenz wie das Schweine-Motilin
hat [Jap. Pat. Nr. Sho 63-276489(A), entsprechend der US-Patentanmeldung Serial-Nummer
07/190,849 und der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 289 995 (A1)].
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Als physiologische Wirkungen des Motilins waren eine Hypermotilität des
Verdauungstraktes und eine Kontraktion der glatten Gastroduodenalmuskulatur und des Dickdarms
bekannt. Als Hypermotolität wurde berichtet, daß die Rate der Magenentleerung verkürzt ist
["Gastroentorology", Band 80, Seiten 456-460 (1981)] und als Kontraktion der glatten
Muskulatur des Verdauungstraktes war bekannt, daß Motilin, unabhängig von einem Nervensystem,
eine starke Kontraktion des gastromtestinalen Traktes bei Kaninchen und Mensch zeigt. Darüber
hinaus gab es keine Berichte über irgendwelche spezifischen Nebenwirkungen. Es wurde daher
angenommen, daß Motilin brauchbar ist zum Heilen von Gastroenteropathien nach der
Operation und für deren Diagnose. In Verbindung damit ist darauf hinzuweisen, daß Prostagrandin in
weitem Rahmen zum Heilen der Gastroenteropathien eingesetzt wurde, obwohl das Arzneimittel
relativ starke Nebenwirkungen zeigt.
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Es wurde auch berichtet, daß ein chemisch synthetisiertes Motilin-Analoges - der
Methioninrest in Position 13 von natürlichem Motilin wurde durch den Leucin- oder Norleucinrest
ersetzt - biologische Wirkungen ähnlich denen von reinem, natürlichen Schweine-Motilin zeigt
["Scand. J. Gastroentorology", Band 11, Seiten 119-203 (1976) und andere]. Es wurde daher
davon ausgegangen, daß der Methioninrest in Position 13 fast keinen Einfluß auf die brauchbaren
Wirkungen des Motilins hat.
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Weiter haben die vorliegenden Erfindder deutlich gemacht, daß Motilin-Analoge mit
einem Homoserin- oder Homoserin-Lacton-Rest am C-Ende im gleichen oder höheren Maße
biologische Wirkungen zeigen, wie das natürliche Motilin (JP-Anmeldung Nr. Sho 64 (1989) - 286,
entsprechend einem Teil der US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/459,236 und der europäischen
Patentveröffentlichung Nr.0 378 078 (A1)]. In diesen Literaturstellen ist ein Verfahren zum
Herstellen der Motilin-Analogen bei vernünftigen Kosten unter Anwendung rekombinanter
DNA-Techniken angegeben.
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Gemäß weitgehend akzeptiertem Stand der Technik wurde Motilin durch Extraktion von
Schweineorgan-Gewebe erhalten, und es war daher recht schwierig, es in einer großen Menge zu
erhalten. Da das Motilin ein aus 22 Ainosäureresten bestehendes Polypeptid ist, ist eine
Produktion im großen Maßstab schwierig und die Kosten dafür höher, selbst wenn eine chemische
Synthese möglich sein sollte. Wegen seiner duftigen Herstellbarkeit wurde Motilin nicht für
klinische Verwendung eingesetzt, obwohl eine Wirksamkeit als Arzneimittel zum Heilen von
Gastroenteropathien und anderem erwartet wurde.
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Es wurden daher verschiedene Untersuchungen zur Herstellung von Polypeptiden mit
motilin-artigen, biologischen Wirkungen zu vernünftigen Kosten, unter Anwendung der
sogenannten "Biotechnologie", ausgeführt [JP Nr. Sho 63 (1988) - 71195(A) und 63
(1988) -208006(A), entsprechend der US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/390,149 und der europäischen
Patentveröffentlichung Nr. 0 355 720 (A1)].
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Alle diese Verfahren unter Anwendung der Biotechnologie umfassen eine Stufe der
Spaltung einer Polypeptidkette eines Fusionsproteins mit Bromcyan sowie eine Stufe der Entfernung
einer überschüssigen Peptidkette, die einen Homoserin- oder Homoserin-Lacton-Rest am C-Ende
aufweist, unter Einsatz von teurem(n) Enzym(en). Die enzymatische Behandlung verringert die
Ausbeute eines erwünschten Motilin-Analogen unter Erhöhung der Kosten, was eine Produktion
des Motilin-Analogen im großen Maßstab schwierig macht. In Verbindung damit haben die
vorliegenden Erfinder festgestellt, daß, wie oben ausgeführt, die Polypeptide mit einem
Homoserin- oder Homoserin-Lacton-Rest am C-Ende, die durch die Spaltung mit Bromcyan erhalten werden
können, per se gleiche oder stärkere, biologische Wirkungen als natürliches, reines Motilin
aufweisen [JP-Anmeldung Nr. Sho 64 (1989) - 286, entsprechend einem Teil der
US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/459,236 und der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 378 078 (A1)].
Weiter haben die vorliegenden Erfinder ein Expressionsplasmid mit einem Einsatz hergestellt,
der für das Polypeptid mit einem Methioninrest am C-Ende codiert, und sie haben einen durch
das Plasmid transformierten Mikroorganismenwirt (Escherichia coli) geschaffen, um ein
Verfahren zum Herstellen der Motilin-Analogen in einfacher Weise und zu vernünftigen Kosten zu
entwickeln [JP-Anmeldung Nr. Hei 1 (1989) - 216034, entsprechend einem Teil der
US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/459,236 und der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 378
078(A1)].
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Eine Hauptaufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Umwandeln eines
Fusionsproteins, umfassend ein Polypeptid, das in transformierten Mikroorganismen exprimiert ist, in
individuelle, biologisch aktive, menschliche Motilin-Analoge zu schaffen und die aktiven
menschlichen Motilin-Analogen in einem solchen Ausmaß zu reinigen, daß sie als ein
Bestandteil zum Herstellen eines Arzneimittels eingesetzt werden können.
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Eine zusätzliche, aber wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
zum Herstellen menschlicher Motilin-Analoger mit guter Wirksamkeit und zu vernünftigen
Kosten zu schaffen, um deren industrielle Produktion zu ermöglichen.
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Die vorliegenden Erfinder haben bereits ein System geschaffen, um in transformierten
Mikroorganismen ein Polypeptid als ein Fusionsprotein zu exprimieren, das für mehrere,
menschliche Motilin-Analoge in Tandemanordnung codiert. Gemäß dem durch die Erfinder
entwickelten, früheren Verfahren wird das Fusionsprotein, falls notwendig, gereinigt, nachdem
es mit einem Denaturierungsmittel gelöst wurde und dann mit Bromcyan in einer Säurelösung,
wie 70%-iger Ameisensäurelösung, behandelt, um das Fusionsprotein in einzelne, aktive
Polypeptidfragmente zu spalten, die jeweils für das motilin-analoge Gen codieren. Die resultierende
Reaktionslösung kann jedoch nicht einer konventionellen Operation zur Abtrennung von
Protein, wie verschiedenen Chromatographien, unterworfen werden. In anderen Worten, sollte die
Ameisensäure vor der Abtrennung des Proteins entfernt werden, um ein erwünschtes
Polypeptid, das für menschliches Motilin-Analoges codiert, zu erhalten. Als ein Verfahren zum
Entfernen von Ameisensäure ist es denkbar, die Reaktionslösung mit einem Alkali, wie
Natriumhydroxid, zu neutralisieren, um unlösliche Materialien darin zu entfernen und die Lösung einer
Gelfiltration zu unterwerfen. Dieses Verfahren ist jedoch nicht geeignet, da die Gelfiltration
einer Lösung, die Bromcyan enthält, eine große Menge toxischer Abfallösung ergibt, und eine
Ausrüstung zur Abtrennung der Neutralisationslösung in großer Menge für eine industrielle
Produktion in großem Maßstab erforderlich ist. Die Reaktionslösung wurde daher zur
Entfernung der Ameisensäure lyophilisiert.
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Wird das Fusionsprotein unter Einsatz von Bromcyan in die Polypeptidfragmente
gespalten, gibt es viele Fälle, bei denen, zusätzlich zu den erwünschten Polypeptidfragmenten
unerwünschte Analoge gebildet werden. Es ist schwierig, die unerwünschten Analogen von den
erwünschten Polypeptidfragmenten unter Anwendung konventioneller
Ionenaustausch-Chromatographie oder der ähnlichen Niederdruck-Säulenchromatographie zu trennen, so daß eine
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) erforderlich ist. In diesem Falle ergibt ein
Elutionsverfahren, unter Anwendung eines Konzentrationsgradienten eines organischen
Lösungsmittels, eine Beschränkung in der Menge abtrennbaren Polypeptids. Ein isochores
Verfahren, unter Anwendung eines organischen Lösungsmittels in konstanter Konzentration, gestattet
eine Abtrennung in relativ großer Menge, ergibt jedoch eine Beschränkung hinsichtlich der
Menge abtrennbaren Polypeptids innerhalb einer Zeiteinheit, da ein Elutions-Lösungsmittel in
großer Menge erforderlich ist, und die erforderliche Elutionszeit daher langer wird.
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Die Erfinder haben daher weitere Untersuchungen hinsichtlich eines einfachen
Verfahrens zum Isolieren des erwünschten Polypeptids aus dem Fusionsprotein, das in transformierten
Mikroorganismen exprimiert ist, und hinsichtlich dessen Reinigung zu einem solchen Ausmaß
ausgeführt, daß das Polypeptid, das für das Motilin-Analoge codiert, als ein wirksamer
Bestandteil für Arzneimittel benutzt werden kann, und sie haben festgestellt, daß ein Rohprodukt des
erwünschten Polypeptids erhalten werden kann durch Behandeln der Mikroorganismen selbst,
die das Fusionsprotein enthalten, mit Bromcyan, Neutralisieren der Reaktionslösung mit einem
Alkali, wie Natriumhydroxid, um verschiedene, unerwünschte Materialien, die aus den
Mikroorganismen stammen, unlöslich zu machen und zu entfernen, und Ausführen einer hydrophoben
Chromatographie an dem resultierenden Überstehenden zur Entsaizung. Diese Operationen
können in einer kurzen Zeitdauer und ohne spezielle Ausrüstung ausgeführt werden, selbst
wenn die Produktion zu einem industriellen Maßstab vergrößert wird. Sie haben weiter
festgestellt, daß das Rohpolypeptid leicht an einem harzartigen Träger für die
Ionenaustausch-Chromatographie adsorbiert werden kann durch Elektrodialysieren der Rohlösung, unter Einsatz
einer Ionenaustauschmembran, und daß das erwünschte Motilin-Analoge bis zu einer
erwünschten Reinheit gereinigt werden kann, indem man eine Ionenaustausch-Chromatographie und
dann eine Umkehrphasen-Chromatographie ausführt, die ein isochores, zweistufiges
Elutionsverfahren, unter Anwendung von zwei in der Konzentration unterschiedenen Lösungsmitteln
benutzt, was die vorliegende Erfindung ausmacht.
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Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Herstellen eines Motilin-Analogen der
folgenden Formel I in industriellem Maßstab.
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Phe-Val- A -Ile-Phe-Thr-Tyr- B -Glu-Leu- C -Arg- X -Gln-Glu-Lys-Glu-Arg- D -Lys-Gly- E - Y
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worin A ein Rest von Aminosäuren ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pro, Gly, Asn
und Ser; B ein Rest von Aminosäuren ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gly, Pro,
Asn und Ser; C ein Rest von Aminosäuren ist, ausgewahlt aus der Gruppe bestehend aus Gln,
Glu und Asp; D ein Rest von Aminosäuren ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Asn,
Glu und Asp; E ein Rest von Aminosäuren ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gin,
Lys und Arg; X ein Rest von anderen Aminosäuren als Met ist und Y ein Homoserinrest ist
(einschließlich Homoserin-Lacton und bezeichnet durch das Symbol "Hse") oder eines
wahlweisen Polypeptids, das aus zehn nicht übersteigenden Aminosäureresten besteht und Hse am C-
Ende aufweist.
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Wie ausgeführt, haben die Erfinder ein System zum Exprimieren eines Polypeptids als
Fusionsprotein in transformierten Mikroorganismen geschaffen, das für eine Mehrzahl von
Aminosäuresequenzen ähnlich Formel I codiert, und es gibt einen Methioninrest zwischen den
benachbarten Aminosäuresequenzen [JP-Anmeldung Nr. Sho 64 (1989) - 286, entsprechend
einem Teil der US-Patentanmeldung Serial Nr.07/459,236 und der europäischen
Patentveröffentlichung Nr. 0 378 078 (A1)]. Jedes der Polypeptide kann durch Spalten des Fusionsproteins mit
Bromcyan erhalten werden. In Verbindung damit ist darauf hinzuweisen, daß die
Bromcyan-Behandlung das Spalten des Fusionsproteins an der Position des Met-Restes verursacht, um den
Met-Rest in den Hse-Rest umzuwandeln.
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Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Umwandlung des in transformierten
Mikroorganismen exprimierten Fusionsproteins, das ein Polypeptid umfaßt, das für mehrere
menschliche Motilin-Analoge in Tandemanordnung codiert, in einzelne, aktive Motilin-Analoge und
Reinigen der aktiven Motilin-Analogen umfaßt Stufen des Sterilisierens und Entfettens der
Mikroorganismen,
die das Fusionsprotein exprimiert enthalten, Futrieren derselben, um sterilisierte
Mikroorganismen zu erhalten, Zerkleinern derselben, um einen Einschlußkörper zu erhalten;
Auflösen des Einschlußkörpers in einer wässerigen Lösung von Ameisensäure; Hinzugeben von
Bromcyan, um das Fusionsprotein in einzelne Polypeptid-Fragmente zu spalten, deren jedes für
das Motilin-Analoge codiert; Neutralisieren der resultierenden Reaktionsmischung mit einem
Alkali; Zentrifugieren der Reaktionsmischung zum Entfernen von Feststoffen; hydrophobes
Chromatographieren des Überstehenden; Eluieren mit einer sauren, wässerigen Lösung oder
Wasser, um eine Fraktion zu erhalten, die die Polypeptid-Fragmente enthält; Entsalzen der
Fraktion; Ausführen einer Ionenaustausch-Chromatographie an der resultierenden Lösung, um
eine Fraktion zu erhalten, die die Polypeptid-Fragmente enthält; Ausführen einer
Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie an der Fraktion unter Einsatz von zwei sauren,
wässerigen Lösungen, die jeweils Acetonitril enthalten, aber in deren Konzentrationen daran
unterschiedlich sind; Konzentrieren und Lyophilisieren einer Fraktion und dann Entsalzen der
Fraktion.
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Bei dem Verfahren der Erfindung können die das expremierte Fusionsprotein
enthaltenden Mikroorganismen durch Ultraschall-Wellen oder unter Einsatz eines
Hochdruck-Homogenisators zerkleinert und dann zentrifugiert werden, um einen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff
wird mit der Ameisensäure enthaltenden Lösung behandelt. Es ist bevorzugt, die Ameisensaure
in einer Konzentration von 50-80 Gew.-% zu benutzen. Es ist nicht erforderlich, in diesem
Stadium eine das erwünschte Polypeptid enthaltende, flüssige Phase und die als Feststoffe
verbleibenden, unerwünschten Materialien zu trennen, da die unerwünschten Materialien durch die
nach der folgenden Neutralisation auszuführende Zentrifugenbehandlung entfernt werden
können. Als das Alkali können Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder ähnliche benutzt werden. Es
ist bevorzugt, den pH der neutralisierten Mischung auf 3 - 3,5 einzustellen. Ist der pH größer als
3,5, dann wird die Menge unlöslicher Materialien größer und verursacht eine Verringerung der
Ausbeute des erwünschten Polypeptids aufgrund der hohen Salzkonzentration darin. Ist der pH
geringer als 3, dann kann die Mischung eine Korrosion des Gefäßes, wie eines Behälters aus
korrosionsbeständigem Stahl, verursachen, und es gibt eine Möglichkeit der ungenügenden
Ausfällung der unerwünschten Materialien. Ist der pH der neutralisierten Mischung geringer als
10, dann können die von den Mikroorganismen stammenden, unerwünschten Materialien, unter
Zurücklassung des erwünschten Polypeptids in der flüssigen Phase, ausgefällt werden, indem
man die Salzkonzentration auf ein geringes Niveau einstellt, doch wird in diesem Falle die
Menge der das toxische Bromcyan enthaltenden Lösung größer, und es ist eine Zugabe eines
Salzes, wie Ammoniumsulfat, erforderlich, um die Adsorption des erwünschten Polypeptids auf
einem Träger in einer nachfolgenden Stufe der hydrophoben Chromatographie zu ermöglichen.
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Die neutralisierte Lösung, aus der durch eine Abtrennung, mittels Zentrifuge oder
ähnlichem, Feststoffe enfemt wurden, wird auf die Säule zur hydrophoben Chromatographie gegeben,
deren Träger im allgemeinen in eine Säule gepackt ist. Als Träger werden vorzugsweise solche
ausgewählt, die reich an Alkylgruppen, wie Butyl, Octyl oder ähnlichen, oder funktionellen
Phenylgruppen sind und mit einem Träger aus Polyvinyl oder ähnlichem, synthetischem
Polymer
oder Dextran, Agarose, Cellulose oder einem ähnlichen Polysaccharid. Als auf dem Markt
erhältliche Träger können folgende aufgeführt werden: Butyl Toyo Pean, Octyl Sepharose CL-
4B, Phenyl Sepharose, Butyl Sepharose 4B, Agarose-Hexan, Agarose-Octylamin, Sepabeads FP-
PH, Sepabeads FP-OT und Sepabeads FP-Bu. Von diesen ist Butyl Toyo Pean am meisten
bevorzugt.
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Um die Elution des erwünschten Polypeptids bei der hydrophoben Chromatographie zu
verursachen, genügt es, die Konzentration des Salzes darin zu verringern. Es kann daher
gereinigtes Wasser als ein Elutionsmittel eingesetzt werden, und es ist bevorzugt, den pH der
Lösung auf einen Wert weg vom isoelektrischen Punkt des zu reinigenden Polypeptids
einzustellen. Falls erforderlich, und es keinen nachteiligen Einfluß auf die folgende Trennoperation gibt,
kann ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel, wie Acetonitril, hinzugegeben werden. Ein
Eluat hat eine relativ hohe Salzkonzentration, so daß dessen Entsalzung mit einer Gelfiltration,
Elektrodialyse oder einem ähnlichen Verfahren ausgeführt werden soll.
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Wird die Elektrodialyse benutzt, ist es bevorzugt, eine semipermeable Membran mit
einem fraktionellen Molekulargewicht von 100 - 500 zu benutzen und zu der äußeren,
dialysierenden Lösung ein Salz hinzuzugeben, um eine Abnahme der Ausbeute an erwünschtem Polypeptid
zu unterdrücken. Es ist nicht bevorzugt, eine semipermeable Membran mit einem fraktionellen
Molekulargewicht von mehr als 1.000 zu benutzen, da die Membran ein Hindurchdringen des
erwünschten Polypeptids gestattet, was die Ausbeute verringert.
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Mit den vorgenannten Oprationen kann ein Rohprodukt des erwünschten Polypeptids
(Motilin-analoges) erhalten werden. Das Rohprodukt kann dann unter Erhalt eines hochreinen
Motilin-Analogen gereinigt werden, indem man es direkt einer Hochleistungs-Flüssigkeits-
Chromatographie (HPLC) oder einem ähnlichen Trennverfahren mit einer hohen, theoretischen
Bodenzahl unterwirft, doch ist ein solches Trennverfahren für eine wirksame Produktion des
erwünschten Polypeptids nicht bevorzugt. Gemäß der Erfindung wird daher mindestens eine
Ionenaustausch-Chromatographie vor der HPLC ausgeführt. Das entsalzene Eluat wurde durch
Zugabe einer Säure, wie Essigsäure, oder eines sauren Puffers auf einen pH von 2 - 5 eingestellt
und dann einer Kationenaustausch-Chromatographie unterworfen.
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Es können verschiedene Harze, die zum Reinigen von Proteinen vermarktet werden, für
die Kationenaustausch-Chromatographie eingesetzt werden. Es ist bevorzugt, den Träger
auszuwählen, der reich an Carboxymethyl- oder Sulfonsäure-Austauschresten ist und einen Träger
aus Dextran, Agarose, Cellulose oder ähnlichem Polysaccharid, Polyacrylat, hydrophilem
Polyvinyl oder ähnlicher, synthetischer Substanz hohen Molekulargewichtes auszuwählen. Das
bevorzugteste Kationenaustauschharz ist S-Sepharose FF mit funktionellen Sulfonsäuregruppen.
Wurde das hinsichtlich des pH eingestellte Eluat auf eine mit dem Kationenaustauscherharz mit
Sulfonsäuregruppen gepackte Säule gegeben, dann wird das erwünschte Polypeptid bei einem
pH-Wert von mehr als 6 eluiert. Eine wässerige Salzlösung, wie Salzlösung mit einem
Konzentrationsgradienten von 0,01- 0,5M, deren Konzentration oder pH stufenweise zunimmt,
verursacht eine Elution des erwünschten Polypeptids.
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Eine Analyse des resultierenden Eluats unter Anwendung einer Umkehrphasen-HPLC
mit einem Octadecyl (C-18)-ODS-Träger (pH: etwa 2, Gradientenelution von Acetonitril) zeigt,
daß die zuerst eluierten Fraktioen Hauptfraktionen des erwünschten Polypeptids sind und
unerwünschte, andere Polypeptide in einer geringen Menge enthalten, was zu einer merklichen
Reinigung vor der Ionenaustausch-Chromatographie führt.
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Das Eluat kann direkt der HPLC unterworfen werden, doch ist es bevorzugt, vor der
HPLC eine Operation zum Öffnen des Lactonringes des Homoserinrestes am C-Ende des
erwünschten Polypeptids auszuführen, um diesen in den Homoserinrest umzuwandeln. Zu diesem
Zweck wird das Eluat basisch gemacht. Es ist bevorzugt, den pH des Eluats auf 9 - 11 und mehr,
vorzugsweise weniger als 10, einzustellen, um eine mögliche Zersetzung des erwünschten
Polypeptids zu vermeiden.
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Das hinsichtlich des pH eingestellte Eluat wird einer Umkehrphasen-HPLC unterworfen.
Das Eluat wird auf eine mit ODS-Träger für HPLG zur Adsorption des erwünschten Polypetids
gegeben. Eine Elution des Polypeptids wird mit einem Zweistufenverfahren ausgeführt. Bei der
ersten Stufe wird eine wässerige Lösung von Acetonitril in einer geringeren Konzentration
(18 -20 Gew.-%) benutzt, zuerst Fraktionen unerwünschter(n) Substanz(en) zu entfernen und die
erwünschte Fraktion zu erhalten. Bei der zweiten Stufe wird eine wässerige Lösung von
Acetonitril in höherer Konzentration (höher als die erste Lösung, aber geringer als 30% und in einem
bevorzugten Bereich von 20-24%) benutzt, um eine Elution des verbliebenen, erwünschten
Polypeptids zu verursachen. Wird die Konzentration der zweiten Lösung erhöht, dann nimmt eine
für die Elution erforderliche Menge ab, doch nimmt die Menge anderer Substanz(en) als das
erwünschte Polypeptid im resultierenden Eluat zu. Es ist bevorzugt, den pH der ersten und
zweiten Lösung auf 2,0 - 9,0 einzustellen, doch ist der Bereich von 2 bis etwa 6 bevorzugt, wenn ein
Siliciumoxid-ODS-Träger benutzt wird. Dieses zweistufige Verfahren ist gegenüber einem
Verfahren bevorzugt, das ein Elutionsmittel mit konstanter Konzentration benutzt, da die
erforderliche Zeit verkürzt und die benötigte Menge des Elutionsmittels verringert wird.
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Das resultierende, saure Eluat wird auf einmal neutralisiert, um eine mögliche
Zersetzung des erwünschten Polypeptids zu vermeiden. Das neutralisierte Eluat wird konzentriert und
mit an sich bekannten Verfahren entsalzen, um das erwünschte Polypeptid mit hoher Reinheit
(Reinheit: 99% oder mehr) zu erhalten.
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Das motilin-artige, biologische Wirkung zeigende Polypeptid liegt in Form einer Lösung
vor, die zur Lagerung und anderen Zwecke lyophilisiert werden kann.
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Die durch das Verfahren gemäß der Erfindung hergestellten Polypeptide können als ein
wirksamer Bestandteil für verschiedene Arzneimittel zum Heilen von Gastroenteropathien,
Verbessern der abnormalen Sekretion von Tränen und anderem benutzt werden. Es gibt keine
spezifische Einschränkung, wann das Polypeptid zum Arzneimittel verarbeitet wird. Das
Arzneimittel kann daher von fester Form, wie Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Granulat und
Suppositorien, sein oder von einer flüssigen Form der Lösung, Suspension oder Emulsion, zusammen
mit konventionellen Zusätzen und/oder Trägern. Falls erforderlich, kann auch ein Stabilisator,
wie Albumin oder ähnliches, hinzugefügt werden.
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Die Erfindung wird nun weiter unter Bezugnahme auf ein Beispiel erläutert.
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Im folgenden wird die Erläuterung hinsichtlich eines Motilin-Analogen gegeben, bei dem
der Methioninrest in Position 13 des natürlichen Motilins zu dem Leucinrest modifiziert ist, und
das in Position 23 einen Hse-Rest aufweist {[L-Leu¹³]-Motilin-Hse}, doch ist darauf hinzuweisen,
daß andere und verschiedene Motilin-Analoge, die einen anderen Aminosäurerest als den
Methioninrest in Position 13 aufweisen, in einer ähnlichen Weise hergestellt werden können.
Beisdiel
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Es wurden etwa 350 g Acetonpulver der rekombinanten Mikroorganismen (Escherichia
coli), die ein Fusionsprotein tandemartig angeordneter Motilin-Analoger enthielten, in 80 Liter
Salzlösung suspendiert und mit einem Hochdruck-Homogenisator bei mehr als 400 kg/cm²
behandelt, um die Mikroorganismenkörper zu zerkleinern oder zu zerbrechen. Die resultierende
Lösung wurde mit einer Drabal-Zentrifuge kontinuierlich zentrifugiert, um die Lösung auf 10
Liter zu konzentrieren. Zu der konzentrierten Lösung wurden Saccharose und gereinigtes
Wasser hinzugegeben, um eine 0,5M Saccharoselösung herzustellen, die zur Gewinnung unlöslicher
Ausfällung als Pellets zentrifugiert wurde. Die Pellets enthalten das Fusionsprotein.
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Die Pellets wurden in gereinigtem Wasser suspendiert, um ein Volumen von 8,6 Litern
zu erhalten. Zu der Suspension wurde Ameisensäure (20 l) hinzugegeben, um die Feststoffe
darin zu lösen, und dann wurde Bromcyan (75 g) hinzugegeben, um über Nacht bei etwa 30ºC
eine Reaktion zu verursachen. Nach der Zugabe gereinigten Wassers (3 l) zu der
Reaktionslösung und unter Abkühlen derselben mit gekühltem Wasser, wurde eine 5N-Lösung (40 l) von
Natriumhydroxid graduell hinzugegeben und für etwa 1 Stunde stehengelassen. Eine
Ausfällung wurde durch Zentrifugieren, unter Benutzung eines Filters mit einer Porengröße von 0,3
µm, entfernt, um eine Lösung zu erhalten.
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Nach dem Puffern mit 50%-iger, gesättigter Lösung von Ammonlumsuffat wurde die
Lösung auf eine Säule (9 cm x 80 cm), gepackt mit einem Träger aus Butyl Toyo Pearl 650M
(Handelsname) zur hydrophoben Chromatographie gegeben, um eine Adsorption von [L-Leu¹³]-
Motilin-Hse am Träger zu verursachen, und dann wurde eine 0,5%-ige, wässerige Lösung von
Essigsäure zur Elution des Polypeptids auf die Säule gegeben, wobei Fraktionen erhalten
wurden, deren Hauptpeak durch Messen einer Extinktion bei 280 nm nachgewiesen wurde.
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Die Fraktionen wurden kombiniert und mittels eines Elektrodialysators (vertrieben
durch Asahi Chemical Industry Co. Ltd., Japan "Microasylizer G3"), unter Einsatz einer
Styrolmembran mit einem fraktionellen Molekulargewicht von 300 und einer wirksamen
Membranlläche von 400 cm² sowie einer wässerigen Lösung, die etwa 1 Gew.-% Ammoniumsulfat enthielt,
als einer äußeren Lösung für die Dialyse, entsalzen, bis die dialysierte Lösung einen Stromwert
von 0,1 A bei einer Spannung von 7,5 V zeigte. Die entsalzene Lösung wurde auf eine Säule (14
cm x 20 cm), gepackt mit einem Träger für die Kationenaustauscher-Chromatographie von
S-Sepharose FF gegeben, wobei diese Säule vorher mit einer 0,5%-igen, wässerigen
Essigsäure-Lösung gepuffert worden war. Die Säule wurde mit 100 mM Natrium-Essigsäure-Puffer (pH 5,0,
enthaltend 50 mM NaCl) gewaschen und dann mit der gleichen Art Puffer eluiert, der aber 350
mM NaCl enthielt, um Fraktionen zu erhalten, die das erwünschte [L-Leu¹³]-Motilin-Hse ent
hielten, deren Hauptpeak durch Messen einer Extinktion bei 280 nm nachgewiesen werden
konnte.
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Zu dem resultierenden Eluat wurde 5N Natriumhydroxid graduell hinzugegeben, um den
pH auf etwa 10 einzustehen, und es wurde 1 Stunde lang auf einem bei etwa 37ºC gehaltenen
Wasserbad behandelt.
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Aus der neutralisierten Lösung wurden 100 ml abgenommen. Die Lösung wurde auf eine
Säule, gepackt mit ODS-Siliciumoxid-Träger (5 cm x 25 cm, Porengröße 120 Å, Teilchengröße 10
µm), gegeben, die vorher mit 19%-iger, wässeriger Acetonitril-Lösung, enthaltend 0,012N HCl,
gepuffert worden war, und dann wurde die Pufferlösung mit einer Strömungsrate von 60 me/min
auf die Säule gegeben, um die Elution von am Träger adsorbierten Materialien zu verursachen.
In diesem Falle wurde eine Elution des angestrebten [L-Leu¹³]-Motilin-Hse durch
kontinuierliches Messen einer Extinktion, unter Verwendung eines UV-Detektors (Strahllänge: 3 mm) und
bei 220 nm überpraft. Erreichte die durch den Detektor angezeigte Extinktion 0,1, dann wurde
das Elutions-Lösungsmittel zu einer 22%-igen, wasserigen Acetonitril-Lösung geändert, die
0,012N HCl enthielt, um eine Fraktion zu erhalten, die eine Extinktion von 0,5 oder mehr zeigte
und das [L-Leu¹³]-Motilin-Hse enthielt, und dann wurde zu der Fraktion zur Neutralisation ein
Phosphatpulfer (pH 7,5) auf einmal hinzugegeben.
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Die erhaltenen, neutralisierten Eluate wurden kombiniert, mit gereinigtem Wasser auf
das Doppelte verdünnt und auf eine Säule von Prepack Cartridge Delta Pack ("Handelsname",
vertrieben durch Waters Co., 4,7 cm x 30 cm, Teilchengröße 15 µm, funktionelle Gruppe: C18,
Porengröße: 100 Å), die vorher mit 0,003N HCl gepuffert worden war, gegeben. Die Säule wurde
mit der Pufferlösung gewaschen und dann wurde unter Einsatz von 30%-iger, wässeriger
Acetonitril-Lösung, die 0,002N HCl enthielt, eine Elution ausgeführt, um eine Fraktion zu erhalten,
die in einem Hauptpeak das [L-Leu¹³]-Motilin-Hse enthielt, die durch Zugabe eines
Phosphatpuffers (pH 7,5) neutralisiert wurde, so daß die Endkonzentration des Puffers 10 mM betrug.
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Alle neutralisierten Fraktionen wurden kombiniert, unter Einsatz eines Verdampfers
konzentriert und lyophilisiert, um fast die gesamten Lösungsmittel zu entfernen. Das
resultierende Polypeptidpulver wurde in gereinigtem Wasser gelöst, um eine etwa 2%-ige, wässerige
Lösung zu ergeben. Die Lösung wurde mittels Elektrodialyse, unter Anwendung einer Membran
mit einem fraktionellen Molekulargewicht von 300 und einer wirksamen Fläche von 400 cm²,
unter Einsatz einer Lösung, enthaltend etwa 1% Ammoniumsulfat als äußere Lösung, entsalzen,
bis die dialysierte Lösung einen Stromwert von weniger als 0,01 Å bei einer Spannung von 7,5 V
aufwies.
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Die resultierende, dialysierte Lösung enthielt 20 g oder mehr des erwünschten [L-Leu¹³]-
Motilin-Hse mit einer Reinheit von 99% oder mehr. Die quantitative Analyse nach dem Limulus-
Test zeigte, daß Endotoxin des Motilin-Analogen bei einem unter der Identifikationsgrenze
befindlichen Niveau lag.