DE69531682T2

DE69531682T2 - Sterolderivate für die regulierung der meiose

Info

Publication number: DE69531682T2
Application number: DE69531682T
Authority: DE
Inventors: Grete Anne BYSKOV; Yding Claus ANDERSEN; Lars Nordholm; Henning Th Gersen; Ole Wassmann; Verner Ivan DIERS; Erling Guddal
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1994-06-23
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 2004-07-15
Anticipated expiration: 2015-06-24
Also published as: CZ289407B6; BR9508074A; ATE248852T1; JP3987105B2; PL186688B1; NO965516D0; ES2204955T3; WO1996000235A1; CN1068333C; HUT76343A; IL114294A0; AU694240B2; FI965144A0; EP0767798B1; DK0767798T3; CA2192941C; NO965516L; US5716777A; EP0767798A1; KR100408369B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte Sterolderivate und ihre Verwendung als Medikamente. Ganz besonders wurde gefunden, dass bestimmte Sterolderivate zur Regulierung der Meiose verwendet werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Meiose ist das einzigartige und grundlegende Ereignis der Keimzellen, auf denen die geschlechtliche Fortpflanzung basiert. Die Meiose umfasst zwei meiotische Teilungen. Während der ersten Teilung findet ein Austausch zwischen mütterlichen und väterlichen Genen statt, bevor die Chromosomenpaare in die zwei Tochterzellen aufgeteilt werden. Diese enthalten lediglich die halbe Anzahl (1n) der Chromosomen und 2c DNA. Die zweite meiotische Teilung erfolgt ohne eine DNA-Synthese. Diese Teilung resultiert daher in der Bildung der haploiden Keimzellen mit lediglich 1c DNA.
Die meiotischen Ereignisse sind in den männlichen und weiblichen Keimzellen ähnlich, jedoch unterscheiden sich der Zeitplan und die Differenzierungsprozesse, welche zu Ova und zu Spermatozoen führen, erheblich. Alle weiblichen Keimzellen erreichen die Prophase der ersten meiotischen Teilung früh im Leben, häufig vor der Geburt, an, jedoch werden alle später in der Prophase (dictyate-Stadium) als oozyten angehalten, bis zu ihrer ovulation nach der Pubertät. So haben Frauen vom frühen Leben an einen oozytenvorrat, aus welchem bezogen wird, bis der Vorrat aufgebraucht ist. Die Meiose bei Frauen ist erst nach der Befruchtung abgeschlossen und resultiert in lediglich einem ovum und zwei abortiven Polarkörpern pro Keimzelle. Im Gegensatz dazu erreichen nur einige der männlichen Keimzellen die Meiose aus der Pubertät und hinterlassen eine Stammpopulation von Keimzellen das ganze Leben lang. Einmal initiiert, findet die Meiose in den männlichen Zellen ohne signifikante Verzögerung statt und stellt 4 Spermatozoen her.
Es ist nur wenig über den Mechanismus bekannt, der die Initiation der Meiose in dem Mann und in der Frau steuert. Neue Studien deuten darauf hin, dass in der oozyte follikulare Purine, Hypoxanthin oder Adenosin, verantwortlich für das meiotische Anhalten sein könnten (Downs, S. M. et al. Dev. Biol. 82 (1985) 454– 458; Eppig, J. J. et al. Dev. Biol. 119 (1986) 313–321; und Downs, S. M. Mol. Reprod. Dev. 35 (1993) 82–94). Die Gegenwart einer diffusionsfähigen Meioseregulierenden Substanz wurde erstmals von Byskov et al. in einem Kultursystem von fetalen Mausgonaden beschrieben (Byskov, A. G. et al. Dev. Biol. 52 (1976) 193–200). Eine Meiose-induzierende Substanz (MIS) wurde von dem fetalen Mauseierstock, in welchem die Meiose am Laufen war, abgesondert und eine Meiose-verhindernde Substanz (MPS) wurde von den morphologisch differenzierten Hoden mit ruhenden, nicht-meiotischen Keimzellen freigesetzt. Es wurde angedeutet, dass die relativen Konzentrationen von MIS und MPS den Beginn, das Anhalten und die Wiederaufnahme der Meiose in den männlichen und den weiblichen Keimzellen reguliert (Byskov, A. G. et al. in The Physiology of Reproduction (Hsg. Knobil, E. und Neill, J. D., Raven Press, New York (1994)). Deutlich ist, dass, wenn die Meiose reguliert werden kann, die Fortpflanzung gesteuert werden kann. Unglücklicherweise war es bis heute nicht möglich, eine Meioseinduzierende Substanz zu identifizieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Überraschenderweise wurde gefunden, dass bestimmte Sterole, die als Intermediate in der Biosynthese von Cholesterol und einigen neuen, strukturell verwandten synthetischen Sterolen bekannt waren, zur Regulierung der Meiose verwendet werden können.
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)
wobei R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, unverzweigtes oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl, welches durch Halogen oder Hydroxy substituiert sein kann oder wobei R¹ und R² zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Cyclopentanring oder einen Cyclohexanring bilden;
R³ und R⁴ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen, in welchem Fall R⁵ Wasserstoff ist und R⁶ und R⁷ entweder Wasserstoff sind oder sie zusammen eine zusätzliche Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen; oder
R⁵ und R⁴ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen, in welchem Fall R³ Wasserstoff ist und R⁶ und R⁷ entweder Wasserstoff sind oder sie zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen; oder
R⁶ und R⁴ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen, in welchem Fall R³, R⁵ und R⁷ alle Wasserstoff sind;
R⁸ und R⁹ Wasserstoff sind oder sie zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen; und
R¹⁰ entweder Wasserstoff oder eine Acylgruppe, einschließlich einer Phosphonogruppe oder einer Sulfogruppe, ist, oder R¹⁰ eine Gruppe ist, welche zusammenmit dem verbleibenden Teil der Moleküle einen Ether bildet, zur Verwendung als ein Medikament.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung neue Verbindungen der allgemeinen Formel (I).
In dem vorliegenden Zusammenhang wird der Ausdruck „Regulierung der Meiose" verstanden, um anzuzeigen, dass die Verbindungen zur Stimulierung der Meiose in vitro, in vivo und ex vivo verwendet werden können.
Demnach trifft die vorliegende Erfindung in einem spezifischeren Aspekt die Verwendung einer Verbindung der obigen allgemeinen Formel (I) in der Regulierung der Meiose.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Regulierung der Meiose in einer Säugetierkeimzelle, welches Verfahren die Verabreichung einer effektiven Menge einer Verbindung der obigen allgemeinen Formel (I) an eine Keimzelle, die eine solche Behandlung benötigt, umfasst.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wurde gefunden, dass die Meiose-induzierenden Substanzen, die von Bullenhoden und aus humaner Follikelflüssigkeit extrahiert wurden, beide fähig sind, die Wiederaufnahme der Meiose in kultivierten Mausoozyten (der oozytentest) zu induzieren und ebenso die Meiose in männlichen Keimzellen aus kultivierten fetalen Maushoden (der Gonadentest) zu stimulieren. Eine Meiose-induzierende Substanz wird von adulten Hoden verschiedener Säugetiere, einschließlich des Mannes, hergestellt und wird ebenso in reifen ovarialfollikeln einiger Säugetierarten, einschließlich Frauen, gefunden. Wie sich aus den Beispielen 1 und 2 zeigt, ist die Meiose-induzierende Substanz, die in Bullenhoden gefunden wurde, 4,4-Dimethylzymosterol, während die Meiose-induzierende Substanz, die in humaner Follikelflüssigkeit gefunden wurde, 4,4-Dimethyl-5α-cholesta-8,14,24-trien-3β-ol ist.
Die Existenz Meiose-induzierender Substanzen ist seit einiger Zeit bekannt. Die Identität der Meiose-induzierenden Substanz oder Substanzen war jedoch bis heute unbekannt. Nach bestem Wissen der vorliegenden Erfinder hat bisher keine praktische Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in der Medizin stattgefunden. Insbesondere wurden bisher keine Verbindungen der allgemeinen Formel (I) als Medikamente zur Regulierung der Meiose verwendet.
Es gibt einige Möglichkeiten, in der Lage zu sein, die Meiose zu beeinflussen. Nach einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verwendet, um die Meiose zu stimulieren. Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verwendet, um die Meiose in Menschen zu stimulieren. So versprechen die Verbindungen der Formel (I), neue Befruchtungs-regulierende Wirkstoffe zu sein, ohne die übliche Nebenwirkung auf somatische Zellen, wie sie von den bisher verwendeten hormonellen Empfängnisverhütungsmitteln, die auf Östrogenen und/oder Gestagenen basieren, bekannt sind. Zur Verwendung als empfängnisverhütender Wirkstoff bei Frauen kann eine Meiose-induzierende Substanz verabreicht werden, um vorzeitig die Wiederaufnahme der Meiose in oozyten zu induzieren, während sie noch in dem wachsenden Follikel sind, bevor das ovulatorische Maximum des Gonadotropins stattfindet. Bei Frauen kann die Wiederaufnahme der Meiose beispielsweise eine Woche, nachdem die vorangegangene Menstruation aufgehört hat, induziert werden. Wenn ovuliert wird, werden die resultierenden überreifen oozyten höchstwahrscheinlich nicht befruchtet. Der normale Menstruationszyklus wird wahrscheinlich nicht beeinträchtigt. In diesem Zusammenhang ist es wichtig anzumerken, dass die Biosynthese von Progesteron in kultivierten humanen Granulosazellen (somatische Zellen des Follikels) durch die Gegenwart einer Meioseinduzierenden Substanz nicht beeinträchtigt wird, während die Östrogene und Gestagene, die in den bisher verwendeten hormonellen Empfängnisverhütungsmitteln verwendet wurden, sehr wohl einen nachteiligen Effekt auf die Biosynthese von Progesteron haben.
Nach einem anderen Aspekt dieser Erfindung kann eine Meiose-induzierende Substanz der allgemeinen Formel (I) in der Behandlung bestimmter Fälle von Unfruchtbarkeit bei Weibchen, einschließlich Frauen, verwendet werden durch die Verabreichung dieser an Weibchen, die aufgrund einer unzureichenden Eigenproduktion von MIS nicht in der Lage sind, reife oozyten zu produzieren. Ebenso werden bei der Ausführung einer In-vitro-Befruchtung bessere Ergebnisse erzielt, wenn eine Meiose-induzierende Substanz der allgemeinen Formel (I) dem Medium hinzugefügt wird, in welchem die oozyten aufbewahrt werden.
Ebenso kann die Verabreichung einer Meiose-induzierenden Substanz der allgemeinen Formel (I) dem Problem abhelfen, wenn die Unfruchtbarkeit bei Männchen, einschließlich Männern, durch eine unzureichende Eigenprodukte der Meiose-induzierenden Substanz verursacht wird.
Der Verabreichungsweg der Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Formel (I) enthalten, kann irgendein Weg sein, der die aktive Verbindung effektiv an ihren Wirkungsort transportiert.
So können die erfindungsgemäßen Verbindungen, wenn sie einem Säugetier verabreicht werden sollen, vorteilhaft in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt werden, welche mindestens eine Verbindung der Formel (I) in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst. Zur oralen Verwendung haben solche Zusammensetzungen vorzugsweise die Form von Kapseln oder Tabletten.
Aus dem oben Genannten soll verstanden werden, dass eine notwendige Verabreichungskur von den zu behandelnden Bedingungen abhängig ist. So kann, wenn die Verwendung zur Behandlung von Unfruchtbarkeit erfolgt, die Verabreichung lediglich einmalig, oder für eine begrenzte Dauer, sein, z. B., bis eine Schwangerschaft erreicht wird. Wenn eine Verwendung als Empfängnisverhütungsmittel erfolgt, wird die Meiose-induzierende Substanz der allgemeinen Formel (I) entweder kontinuierlich oder zyklisch genommen werden müssen. Wenn die Verwendung als Empfängnisverhütungsmittel durch Frauen erfolgt und nicht kontinuierlich genommen wird, ist die zeitliche Koordinierung bezogen auf den Menstruationszyklus wichtig.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können Träger, Verdünnungsmittel, Absorptionsverstärker, Konservierungsmittel, Puffer, Wirkstoffe zur Einstellung des osmotischen Drucks, Tabletten-auflösende Wirkstoffe und andere Bestandteile, welche herkömmlich im Stand der Technik verwendet werden, umfassen. Beispiele von festen Trägern sind Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Dextrin, Lactose, Zucker, Talk, Gelatine, Pektin, Tragant, Methylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose, niedrig schmelzende Wachse und Kakaobutter.
Flüssige Zusammensetzungen schließen sterile Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Solche flüssigen Zusammensetzungen können zur Injektion oder zur Verwendung in Verbindung mit Ex-vivo- und In-vitro-Befruchtung geeignet sein. Die flüssigen Zusammensetzungen können andere Bestandteile enthalten, welche herkömmlich im Stand der Technik verwendet werden, einige von ihnen sind in der obigen Liste genannt.
Weiterhin kann eine Zusammensetzung zur transdermalen Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung in Form eines Pflasters (patch) bereitgestellt werden und eine Zusammensetzung zur nasalen Verabreichung kann in Form eines Nasensprays in flüssiger oder Puderform bereitgestellt werden.
Die Dosis einer zu verwendenden erfindungsgemäßen Verbindung wird durch einen Mediziner bestimmt und wird unter anderem von der besonderen eingesetzten Verbindung, dem Verabreichungsweg und dem Verwendungszweck abhängig sein.
Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind die folgenden:
Cholest-7-en-3β-ol;
4-Methylcholest-7-en-3β-ol;
4-Ethylcholest-7-en-3β-ol;
4,4-Dimethylcholest-7-en-3β-ol;
4α-Methyl-4β-ethylcholest-7-en-3β-ol;
4α-Ethyl-4β-methylcholest-7-en-3β-ol;
4,4-Diethylcholest-7-en-3β-ol;
4-Propylcholest-7-en-3β-ol;
4-Butylcholest-7-en-3β-ol;
4-Isobutylcholest-7-en-3β-ol;
4,4-Tetramethylencholest-7-en-3β-ol;
4,4-Pentamethylencholest-7-en-3β-ol;
Cholest-8-en-3β-ol;
4-Methylcholest-8-en-3β-ol;
4-Ethylcholest-8-en-3β-ol;
4,4-Dimethylcholest-8-en-3β-ol;
4α-Methyl-4β-ethylcholest-8-en-3β-ol;
4α-Ethyl-4β-methylcholest-8-en-3β-ol;
4,4-Diethylcholest-8-en-3β-ol;
4-Propylcholest-8-en-3β-ol;
4-Butylcholest-8-en-3β-ol;
4-Isobutylcholest-8-en-3β-ol;
4,4-Tetramethylencholest-8-en-3β-ol;
4,4-Pentamethylencholest-8-en-3β-ol;
Cholest-8(14)-en-3β-ol;
4-Methylcholest-8(14)-en-3β-ol;
4-Ethylcholest-8(14)-en-3β-ol;
4,4-Dimethylcholest-8(14)-en-3β-ol;
4α-Methyl-4β-ethylcholest-8(14)-en-3β-ol;
4α-Ethyl-4β-methylcholest-8(14)-en-3β-ol;
4,4-Diethylcholest-8(14)-en-3β-ol;
4-Propylcholest-8(14)-en-3β-ol;
4-Butylcholest-8(14)-en-3β-ol;
4-Isobutylcholest-8(14)-en-3β-ol;
4,4-Tetramethylencholest-8(14)-en-3β-ol;
4,4-Pentamethylencholest-8(14)-en-3β-ol;
Cholesta-8,14-dien-3β-ol;
4-Methylcholesta-8,14-dien-3β-ol;
4-Ethylcholesta-8,14-dien-3β-ol;
4,4-Dimethylcholesta-8,14-dien-3β-ol;
4α-Methyl-4β-ethylcholesta-8,14-dien-3β-ol;
4α-Ethyl-4β-methylcholesta-8,14-dien-3β-ol;
4,4-Diethylcholesta-8,14-dien-3β-ol;
4-Propylcholesta-8,14-dien-3β-ol;
4-Butylcholesta-8,14-dien-3β-ol;
4-Isobutylcholesta-8,14-dien-3β-ol;
4,4-Tetramethylencholesta-8,14-dien-3β-ol;
4,4-Pentamethylencholesta-8,14-dien-3β-ol;
Cholesta-8,24-dien-3β-ol;
4-Methylcholesta-8,24-dien-3β-ol;
4-Ethylcholesta-8,24-dien-3β-ol;
4,4-Dimethylcholesta-8,24-dien-3β-ol;
4α-Methyl-4β-ethylcholesta-8,24-dien-3β-ol;
4α-Ethyl-4β-methylcholesta-8,24-dien-3β-ol;
4,4-Diethylcholesta-8,24-dien-3β-ol;
4-Propylcholesta-8,24-dien-3β-ol;
4-Butylcholesta-8,24-dien-3β-ol;
4-Isobutylcholesta-8,24-dien-3β-ol;
4,4-Tetramethylencholesta-8,24-dien-3β-ol;
4,4-Pentamethylencholesta-8,24-dien-3β-ol;
Cholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
4-Methylcholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
4-Ethylcholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
4,4-Dimethylcholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
4α-Methyl-4β-ethylcholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
4α-Ethyl-4β-methylcholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
4,4-Diethylcholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
4-Propylcholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
4-Butylcholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
4-Isobutylcholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
4,4-Tetramethylencholesta-8,14,24-trien-3β-ol; und
4,4-Pentamethylencholesta-8,14,24-trien-3β-ol;
und Ester und Ether hiervon.
Bevorzugte Ester der Formel (I) sind solche, in welchen R¹⁰ die Acylgruppe einer Carbonsäure ist, welche verzweigt oder unverzweigt oder zyklisch sein kann und eine optional substituierte Aminogruppe und/oder 1 oder 2 Sauerstoffatome zusätzlich zu dem Carbonylsauerstoff der Estergruppe, welche R¹⁰ mit dem Sterolgerüst verbindet, umfassen kann. Wenn R¹⁰ eine Acylgruppe bestimmt, umfasst diese bevorzugt 1 bis 20 Kohlenstoffatome, bevorzugter von 1 bis 12 Kohlenstoffatome, noch mehr bevorzugt von 1 bis 10 Kohlenstoffatome, noch weiter mehr bevorzugt von 1 bis 7 Kohlenstoffatome. Die Säure, von welcher R¹⁰ abgeleitet wird, kann eine Dicarbonsäure sein. Beispiele von R¹⁰ sind: Acetyl, Benzoyl, Pivaloyl, Butyryl, Nicotinoyl, Isonicotinoyl, Hemisuccinoyl, Hemiglutaroyl, Hemimaloyl, Hemiphthaloyl, Butylcarbamoyl, Phenylcarbamoyl, Butoxycarbonyl, tert-Butoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, 4-Dimethylaminomethylbenzoyl, 4-Diethylaminomethylbenzoyl, 4-Dipropylaminomethylbenzoyl, 4-(Morpholinomethyl)-benzoyl, 4-(4-Methyl-1-piperazinylmethyl)-benzoyl, 3-Dimethylaminomethylbenzoyl, 3-Diethylamino-methylbenzoyl, 3-Dipropylaminomethylbenzoyl, 3-(Morpholinomethyl)benzoyl, 3-(4-Methyl-1-piperazinylmethyl)benzoyl, Sulfo (in welchem Fall (I) einen Sulfatester oder ein Salz hiervon bestimmt) oder Phosphono (in welchem Fall (I) einen Phosphatester oder ein Salz hiervon bestimmt).
Bevorzugte Ether der Formel (I) sind solche, bei denen R¹⁰ eine Methylgruppe, eine Methoxymethylgruppe, eine Benzylgruppe oder eine Pivaloyloxymethylgruppe ist.
Die natürlich auftretenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung können aus natürlichen Quellen durch per se bekannte Verfahren erhalten werden. Alternativ können sie – wie die strukturell verwandten synthetischen Sterole der vorliegenden Erfindung – durch Synthese durch per se bekannte Verfahren erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin anhand der folgenden Beispiele illustriert, die jedoch nicht als Begrenzung des Schutzbereiches konstruiert sind. Die in der vorangegangenen Beschreibung und in den folgenden Beispielen offenbarten Merkmale können sowohl separatals auch in beliebiger Kombination hiervon Material zur Realisierung der Erfindung in diversen Formen hiervon sein.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Isolierung, Reinigung und Identifizierung einer Meiose-induzierenden Substanz (MIS) von Bullenhoden
Hoden von einem sechs Jahre alten Bullen (Dänische Landrasse) wurden unmittelbar nach der Schlachtung entfernt. Die Tunica albuginea wurde entfernt und das Hodengewebe auf Trockeneis platziert und bei –80°C aufbewahrt. Gefrorenes Hodengewebe (92 g) wurde in kleine Stücke, kleiner 1 mm³ zerkleinert und im Dunkeln gefriergetrocknet bis zur vollständigen Trockenheit, ungefähr 90 h. Das gefriergetrocknete Gewebe wurde mit 400 ml n-Heptan (LiChrosolv, Merck 4390, Deutschland) unter Stickstoff unter Rühren für 24 h bei 20°C extrahiert. Die Suspension wurde filtriert und das feste Material wurde noch einmal extrahiert, derselben Vorgehensweise folgend. Die vereinten („pooled") organischen Phasen wurden in einem Rotationsevaporator bei Raumtemperatur bis zur Trockenheit evaporiert, wodurch 981 mg des extrahierten Materials erzielt wurden. Dieses Material wurde aufgelöst in n-Heptan und in 15 Fläschchen portioniert, von denen das n-Heptan evaporiert wurde. Die Fläschchen wurden unter Stickstoff bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt.
Für die Extrakte wurde eine Drei-Schritt-HPLC-Reinigung eingesetzt:
In dem ersten Schritt wurde der Inhalt eines Fläschchen in 50 μl 50%-igem (Volumen-%, „v/v") Tetrahydrofuran (THF) in Wasser aufgelöst und auf die Umkehrphasen-HPLC-Säule (LiChoSpher 100 RP-8 endverschlossen („endcapped") 5 μm, 250 × 4 mm Innendurchmesser („i. d."), Merck). Die Elution wurde bei 40 °C unter Verwendung eines linearen Gradienten an THF von 50% bis 100% gehend in 15 Min (Durchfluss: 1 ml/Min) durchgeführt. 18 Fraktionen von je 1 ml wurden gesammelt und auf die MIS-Aktivität hin überprüft.
In dem zweiten Schritt wurden die Fraktionen aus dem ersten Schritt, für welche eine Aktivität in dem oozyten-Assay gefunden wurde, in 50–100 μl 70%-igem THF aufgelöst und auf eine Säule, die gleich der in dem ersten Schritt verwendeten war, aufgetragen. Die Elution wurde bei 40°C unter Verwendung eines linearen Gradienten an THF von 60% bis 78% in 16 Min (Durchfluss: 1 ml/Min) durchgeführt. 8 Fraktionen von je 1 ml wurden gesammelt und auf die MIS-Aktivität hin überprüft.
In dem dritten Schritt wurden die Fraktionen aus dem zweiten Schritt, für welche eine Aktivität in dem oozyten-Assay gefunden wurde, in 100 μl n-Heptan : 2-Propanol (98 : 2) (Volumen-%) aufgelöst und auf eine halbpräparative HPLC-Säule (ChromsPher Si 5 μm, 250 × 10 mm Innendurchmesser (i. d.), Chrompack) aufgetragen. Die Elution wurde bei Raumtemperatur unter Verwendung einer mobilen Phase bestehend aus n-Heptan : 2-Propanol, 98 : 2 (Volumen-%) (Durchfluss: 5 ml/Min) durchgeführt. Fünf Fraktionen von je 2,5 ml wurden gesammelt und auf die MIS-Aktivität hin überprüft.
In allen drei Schritten wurde die Elution durch UV-Detektion bei 220 nm überwacht.
Das Material, welches die Drei-Schritt-Reinigungsvorgehensweise, wie oben beschrieben, durchlaufen hat, wurde verwendet, um die molekulare Struktur der aktiven Verbindung durch Spektrometrie für kernmagnetische Resonanz („nuclear magnetic resonance spectrometry") (NMR) und durch Massenspektrometrie untersucht.
Für die NMR-Spektren wurde ungefähr 1 mg des gereinigten Materials in 0,6 ml Deuterochloroform aufgelöst. Ein ¹³C-Proton-entkoppeltes NMR-Spektrum, ein ¹H-NMR-Spektrum (mit und ohne Auflösungsverstärkung) und ein 2D ToCSY Spektrum wurden auf einem Bruker AMX2 400 NMR-Spektrometer, ausgestattet mit einem inversen Breitband-5 mm-Sonden-Boden („broad band 5 mm probe head") mit einer gradienten Spirale aufgezeichnet. Die ¹³C-NMR chemischen Verlagerungen in ppm (6) für die isolierten MIS sind in Tabelle 1 angegeben, im Vergleich mit den entsprechenden Daten für Zymosterol (Taylor, U. F. et al. J. Lipid Res. 22 (1981) 171) und Lanosterol (Emmons, G. T. et al. Magn. Res. Chem. 27 (1989) 1012).
Tabelle 1
Es wurde eine Massenspektrometrie unter Verwendung eines VG Trio 1000 LC/MS-Gerätes mit LINC-Partikelstrahl-Interphase („particle beam interphase") und LAB-BASE 2,1 Software (Fisons Instruments) mit einem HPLC-System, eine ChromSpher Si, 3 μm, 100 × 4,6 mm Säule (Chrompack) umfassend. Die HPLC wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und n-Heptan : 2-Propanol, 98 : 2 (Volumen-%) wurde als mobile Phase (Durchfluss: 0,6 ml/Min) verwendet. Die zu injizierende MIS-Probe wurde in n-Heptan aufgelöst. Das Massenspektrometer wurde im Elektronenstoßmodus betrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben, in welcher die relativen Maximumhöhen für das isolierte Produkte verglichen werden mit Daten für 4,4-Dimethylzymosterol aus der Ref. 1. Unter Ref. 2 a bestimmt „+", dass das entsprechende Maximum in dieser Untersuchung ebensfalls berichtet wird. Ein „-" unter Ref. 1 oder 2 zeigt an, dass das entsprechende Maximum nicht in dieser Untersuchung berichtet wurde. Tabelle 2

SC: Seitenkette,
C₂H₃: Position 16 und 17,
C₃H₆: Position 15, 16 und 17.
Ref.: 1: Baloch et al. Phytochemistry 23 (1984) 2219.
Ref.: 2: Morimoto et al. Liebigs Ann. Chem. 708 (1967) 230.

Basierend auf dem ¹³C-NMR-Spektrum und seines Molekulargewichts von 412, wie durch Massenspektroskopie (MS) bestimmt, wurde die Struktur des von den Bullenhoden isolierten MIS als 4,4-Dimethyl-5α-cholest-8,24-dien-3β-ol vorgeschlagen, ebenso als 4,4-Dimethylzymosterol (DMZ) bestimmt. Die chemischen Verschiebungen der einzelnen Kohlenstoffatome des MIS-aktiven Materials aus dem dritten HPLC-Reinigungsschritt wurden mit den chemischen Verschiebungen der strukturell sehr eng verwandten Verbindungen Lanosterol und Zymosterol verglichen. Die beobachteten Protonen-chemischen Verschiebungen („proton chemical shifts"), Kopplungskonstanten und ToCSY-Korrelationen unterstützen vollständig, dass die isolierte Verbindung 4,4-Dimethylzymosterol ist.
BEISPIEL 2
Isolierung, Reinigung und Identifizierung einer Meiose-induzierenden Substanz (MIS) aus humaner Follikelflüssigkeit.
Humane Follikelflüssigkeit (FF) wurde aus Follikeln erhalten, die zur oozytensammlung bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit durch in-vitro-Befruchtung angesaugt wurden. Die Flüssigkeit wurde gefriergetrocknet und mit n-Heptan extrahiert, und das Extrakt wurde nach denselben Vorgehensweisen, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt. Die Verbindung des Aktivitätsmaximums hatte ein Molekülion von M/Z = 410 und das Massenspektrum sagte aus, dass die chemische Struktur des FF-MIS-Moleküls 4,4-Dimethyl-5α-cholesta-8,14,24-trien-3β-ol ist.
Verfahren: Die Massenspektrometrie wurde unter Verwendung eines VG Trio 1000 LC/MS mit LINC-Partikelstrahl-Interphase und LAB-BASE 2,1 Software (Fison Instruments) durchgeführt, verbunden mit einem HPLC-System mit geradliniger Phase („straight phase"), bestehend aus einer ChromSpher Si, 3 μm, 100 × 4 mm Innendurchmesser Säule (Chrompack) und n-Heptan : 2-Propanol : Methanol : Ammoniak (68 : 30 : 2 : 0,2) als mobile Phase (Durchfluss: 0,5 ml/Min) bei Raumtemperatur, durchgeführt. Die Probe des zu injizierenden MIS wurde in n-Heptan aufgelöst. Das Massenspektrometer wurde im Elektronenstoßmodus betrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

SC: Seitenkette

BEISPIEL 3
Zubereitung von 4β-Methylzymosterol durch Fermentation.
Schritt A
Der Hefestamm Kluyveromyces bulgaricus A3410 wurde auf einem YPG-Schrägagar inokuliert und für 3 Tage bei 30°C in einem Thermostatinkubator wachsen gelassen. 5 ml steriles YE-Medium wurde zu dem Schrägröhrchen hinzugefügt und die Hefekolonien wurden in dem Flüssigmedium suspendiert durch Schütteln des Röhrchens auf einem Wirbelmixer (whirlimixer). Diese Suspension der Zellen wurde dann in eine 5 ml-Sterilspritze aufgezogen und einer 500 ml-Schüttelflasche mit zwei Intrusionsbafflen im Boden hinzugefügt. Die Flasche enthielt 200 ml ZYM-Medium. Die Flasche wurde auf einem Rotationstisch befestigt und für 24 Stunden bei 250 rpm, 30°C, propagiert. 0,4 ml einer steril gefilterten Amphotericin B-Lösung wurden der Flasche nun hinzugefügt und die Propagation wurde für weitere 25 Stunden fortgesetzt. Die Hefezellen wurden durch Zentrifugation geerntet (Beckman Modell J6, 5°C, 10 Min, 4.000 rpm) und einmal in Wasser gewaschen. Der Zellschlamm wurde in einen kleinen Plastikcontainer isoliert und vor der Endextraktion der Sterole bei –18°C aufbewahrt.

Die oben genannten Nährmedien und die Amphotericin B-Lösung hatten die folgende Zusammensetzung: YPG-Agar

Hefeextrakt, Difco	4 g
KH₂Po₄	1 g
MgSO₄·7H₂O	0,5 g
Glucose	15 g
Agar	20 g
Deionisiertes Wasser	1.000 ml

pH bei 5,8 eingestellt, vor dem Autoklavieren bei 121°C, 20 Min. YE-Medium

Hefeextrakt, Difco 10 g	Deionisiertes Wasser 1.000 ml
Autoklavierung 121°C, 20 Min.

ZYM-Medium

Hefeextrakt, Difco	20 g
Pepton, Bacto	10 g
Leitungswasser	1.000 ml
pH bei 6,5–6,6 eingestellt, vor dem Autoklavieren bei 12	1°C, 20 Min.
Glucose (separat nach dem Autoklavieren hinzugefügt)	60 g

Amphotericin-B-Lösung
1 mg Fungizone^® (gefriergetrockneter Filterkuchen („cake") 50 mg Amphotericin B, 41 mg Natriumdesoxycholat und 20,2 mg Natriumphosphat von Squibb) aufgelöst in 1 ml deionisiertem Wasser.
Schritt B
Die kultivierten Zellen aus Schritt A wurden in 10 ml Wasser suspendiert und 10 ml 40%-ige KoHL in Methanol wurden hinzugefügt.
Die Mischung wurde Rückflusserhitzt für 4 Stunden, über Nacht bei Raumtemperatur belassen und dann zwei mal mit 20 ml n-Heptan extrahiert. Die gemischten Extrakte wurden mit 10%iger Natriumchloridlösung und dann mit Wasser bis zur Neutralität (fünfmal) gewaschen und getrocknet. Die Evaporation des Lösungsmittels hinterließ 40 mg Rohsterole.
Schritt C
Die Rohsterole aus Schritt B wurden in 1 ml n-Heptan/2-Propanol (98 : 2) aufgelöst und auf einem Vortexmixer geschüttelt, bei 5.000 rpm für 10 Min zentrifugiert und dann der HPLC unterzogen.

Säule: LiChroSorb DIoL 10 μm, 250 × 4 mm Innendurchmesser (Merck)

Eluent: n-Heptan/2-Propanol (98 : 2)

Rückfluss: 1,1 ml/Min, 20°C

Detektion: UV bei 220 nm
Das nach 6,8 Min eluierte Maximum wurde von verschiedenen Durchläufen gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden zusammengeführt und das Lösungsmittel wurde evaporiert und hinterließ einen Rest, welcher der Massenspektrometrie unterworfen wurde und in dem oozyten-Test überprüft wurde.
Die Daten des Massenspektrums, die in Tabelle 4 berichtet werden, sind mit denen des in der Bibliothek des Nationalen Büros für Normen (National Bureau of Standards library) verzeichneten 4β-Methylzymosterols identisch. Tabelle 4

SC: Seitenkette

BEISPIEL 4
Zubereitung von 4,4-Dimethylcholesta-8,14-dien-3β-ol.
Diese Verbindung wurde, wie in Schroepfer et al.: Chemistry and Physics of Li pids 47 (1988) 187 beschrieben, zubereitet, und zeigte physikalische Konstanten, wie in der Literatur beschrieben.
BEISPIEL 5
Zubereitung von 4,4-Dimethylcholest-8-en-3β-ol.
Schritt A
2,48 g 4,4-Dimethylcholesta-8,14-dien-3-ol (Beispiel 4) wurden in 20 ml Pyridin bei 0°C aufgelöst. 1,7 g Benzoylchlorid wurden hinzugefügt und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Evaporation bis zur Trockenheit, wurden 25 ml Toluen hinzugefügt und nach wässriger Standardverarbeitung, Evaporation und Zerreibung mit Aceton, wurden 2,3 g (74%) kristallines Benzoat erhalten.
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, δ) zeigte charakteristische Signale bei 8,1 (d, 2H); 7,55 (t, 1H); 7,4 (t, 2H); 5,4 (s, breit („broad"), 1H); 4,2 (dd, 1H).
Schritt B
2,04 g 3-Benzoyloxy-4,4-dimethylcholesta-8,14-dien (Schritt A) wurden in 50 ml THF aufgelöst und 360 ml 1 M Boran in THF wurde tropfenweise bei 0°C hinzugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, auf 0°C abgekühlt und 140 ml Wasser wurden tropfenweise hinzugefügt, gefolgt von 360 ml 10%igem Natriumhydroxid und 378 ml 30%igem Hydrogenperoxid. Nach dem Rühren für 90 Min wurden 100 ml Diethylether zu der Mischung hinzugefügt und die wässrige Phase wurde zweimal mit Diethylether extrahiert. Die gemischten organischen Phasen wurden zweimal mit Natriumbisulfidlösung und dann mit Wasser gewaschen. Nach der Evaporation wurde das Produkt durch Chromatographie auf SiO₂ (2% Diethylether in Toluen) gereinigt, wodurch 0,62 g 3-Benzoyloxy-4,4-dimethylcholest-8-en-15-ol erzielt wurden.
MS (Molekularion): 534,4.
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, δ) zeigte charakteristische Signale bei: 8,0 (d, 2H); 7,5 (t, 1H); 7,4 (t, 2H); 4,75 (m, 1H); 4,1 (m, 1H).
Schritt C
0,54 g 3-Benzoyloxy-4,4-Dimethylcholest-8-en-15-ol wurden in 2,7 ml Pyridin bei 0°C aufgelöst und 33 mg Dimethylaminopyridin und 287 mg Phenylchlorothioformat wurde vorsichtig hinzugefügt. Die Mischung wurde für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Zugabe von 25 ml Diethylether wurde die Mischung sechsmal mit einer gesättigten Lösung aus Kupfersulfat, Wasser, zweimal mit 10%igem Natriumhydroxyd, Wasser und Lauge gewaschen, und evaporiert, wodurch 0,68 g rohes 3-Benzoyl-4,4-dimethylcholest-8-en-15-phenylthiocarbonat erzielt wurden, welches durch Auflösen in 20 ml Toluen weiterverarbeitet wurde und mit 370 mg Tributyltinhydrid und 20 mg Azoisobutyronitrill behandelt wurde. Die Mischung wurde bei 90°C für 20 Min erhitzt und dieselbe Behandlung wurde wiederholt. Nach der Evaporation wurde die Mischung grob durch Chromatographie auf Sio₂ (Heptan/Methylenchlorid: 70/30) gereinigt, wodurch 150 mg rohes 3-Benzoyloxy-4,4-dimethylcholest-8-en erzielt wurden, kontaminiert mit dem entsprechenden 8,14-Dien (Schritt A).
Schritt D
105 ml von der in Schritt C zubereiteten Mischung wurden in 2 ml Methylenchlorid aufgelöst und auf 0°C abgekühlt. 0,7 ml Diisobutylaluminiumhydrid wurden tropfenweise hinzugefügt und nach 15 Min wurden 0,15 ml Wasser vorsichtig hinzugefügt. Dann wurden 25 ml Diethylether hinzugefügt und die organische Phase wurde zweimal mit einer gesättigten Lösung Natriumtartrat, mit Wasser und mit Lauge gewaschen und evaporiert, wodurch 130 mg einer Mischung erzielt wurden, die auf AgNO₃/SiO₂ (zubereitet wie in: Chem. & Phys. of Lipids 63 (1992) 115 beschrieben) chromatographiert und mit Toluen eluiert wurden. Durch Kristallisation aus Ether/Methanol wurden 49 mg der Titelverbindung erzielt.
Schmelzpunkt: 154–155°C.
MS (Molekularion): 414,4.
Das ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃, 100,6 MHz) zeigte charakteristische Signale bei 78,49 (C₃); 127,49 (C₈); 135,35 (C₉).
BEISPIEL 6
Zubereitung von 3-Acetoxy-4,4-dimethylcholesta-8,14-dien.
1,3 g 4,4-Dimethylcholesta-8,14-dien-3-ol (Schroepfer et al.: Chemistry and Physics of Lipids 47 (1988) 187) wurden in 7,4 ml Pyridin und 7,5 ml Essigsäureanhydrid aufgelöst und über Nacht bei 22°C gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum evaporiert, zwei mal mit Toluen abgestreift und durch Blitzchromatographie (flash chromatography) auf Sio₂ (Toluen) gereinigt. Die ersten 300 ml des Eluats wurden evaporiert und das Produkt wurde aus Diethylether kristallisiert, wodurch 140 mg 3-Acetoxy-8,14-dimethylcholestadien erzielt wurden. Schmelzpunkt: 12–125°C (mit Zerstörung).
MS (Molekularion): 454,4.
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, δ) zeigte charakteristische Signale bei: 5,4 (s, breit, 1H); 4,5 (dd, 1H); 2,0 (s, 3H):
BEISPIEL 7
Zubereitung von cholesta-8,14-dien-3β-ol.
770 mg Dehydrocholesterol wurden in einer Mischung aus 2,7 ml Benzen, 19 ml Ethanol und 2,7 ml konzentrierte Salzsäure aufgelöst und bei Rückflusstemperatur für 3 Stunden erhitzt. Die Mischung wurde in einem Eisbad abgekühlt, wodurch eine erste Ernte von 110 mg Kristalle erhalten wurden. Die Evaporation des Filtrats bis zur Trockenheit und die Kristallisation aus Ether/-Methanol ergab eine zweite Ernte von 220 mg Kristalle, welche mit der ersten Ernte verbunden wurden und auf AgNO₃/SiO₂ (zubereitet wie in Beispiel 5, Schritt D beschrieben) chromatographiert und mit 2,5%igem Aceton in Toluen eluiert, wodurch 94 mg reines Cholesta-8,14-dien-3β-ol erzielt wurden.
Schmelzpunkt: 113–114,5°C.
MS (Molekularion): 384,4.
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, δ) des Produkts zeigte charakteristische Signale bei: 5,35 (s, breit, 1H); 3,6 (m, 1H).
Das ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃, 50,3 MHz) zeigte charakteristische Signale bei: 70,99(C₃); 117,42(C₁₅); 123,1(C₈); 140,8(C₉); 151,1(C₁₄)
BEISPIEL 8
Zubereitung von 4,4-tetramethylencholesta-8,14-dien-3-ol.
Schritt A
1,15 g Dehydrocholesterol wurden in 15 ml 2-Butanon aufgelöst, 0,34 g Aluminiumisopropoxid wurden hinzugefügt und die Mischung wurde bei Rückflusstemperatur für 75 Min erhitzt. Nach Abkühlung in einem Eisbad wurden 15 ml 2N Salzsäure hinzugefügt, die Phasen wurden separiert und die organische Phase wurde zweimal mit 7,5 ml 2N Salzsäure gewaschen. Die wässrige Phase wurden mit Toluen extrahiert und die gemischten organischen Phasen wurde mit Wasser und Lauge gewaschen, getrocknet und evaporiert, wodurch 1,18 g reines Cholesta-5,7-dien-3-on als viskoses Öl erzielt wurden.
Das ¹H-NMR-Spektrum zeigte charakteristische Signale bei: 5,8 (s, 1H); 5,2 (m, 1H); 3,2 (d, 1H); 2,7 (dd, 1H).
Schritt B
0,67 g Kaliumtert-butoxid wurden in 16 ml tert-Butanol bei 45°C aufgelöst, 0,57 g Cholesta-5,7-dien-3-on wurden hinzugefügt und die Mischung wurde für 10 Min gerührt. 0,47 g 1,4-Diiodobutan wurde hinzugefügt und die Mischung wurde für 30 Min gerührt. Das Lösungsmittel wurde evaporiert, der Rest in Toluen und Wasser neu aufgelöst und ein wenig Lauge wurde hinzugefügt um die Separierung der Phasen zu induzieren. Die organische Phase wurde viermal mit Wasser gewaschen und die gemischten wässrigen Phasen wurden einmal mit Toluen extrahiert. Die gemischten Toluenextrakte wurden getrocknet und evaporiert, wodurch 0,45 g eines Schaumes erzielt wurden, aus dem nach Kristallisation aus Diethylether/Methanol 0,35 g kristallines 4,4-Tetramethylencholesta-5,7-dien-3-on erzielt wurden.
MS (Molekularion): 436,4.
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, 6) zeigte charakteristische Signale bei 5,75 (d, 1H); 5,5 (m, 1H).
Schritt C
130 mg LiAlH₄ wurde in 6 ml THF suspendiert und 1,97 g 4,4-Tetramethylencholesta-5,7-dien-3-on, aufgelöst in 40 ml THF, wurden tropfenweise über 30 Min hinzugefügt. 15 Min nachdem die Zugabe abgeschlossen war, verblieb dennoch einiges Ausgangsmaterial (TLC) das nicht reagiert hatte, und zusätzliche 65 mg LiAlH₄ wurden hinzugefügt. Nach dem Rühren für 30 Min war die Reaktion abgeschlossen, und 0,9 ml Wasser, aufgelöst in 5 ml THF, wurden tropfenweise hinzugegeben. Nach 30 Min Rühren wurde Magnesiumsulfat im Überschuss hinzugefügt und die Mischung wurde für weitere 30 Min gerührt, gefiltert und bis zur Trockenheit evaporiert. Der Rest wurde in 25 ml Diethylether und 25 ml Methanol aufgelöst und der Ether wurde vorsichtig im Vakuum entfernt. Nach dem Rühren über Nacht, wurden 1,75 g kristallines 4,4-tetra-Methylen-cholesta-5,7-dien-3-ol durch Filtration isoliert.
MS (Molekularion): 438,4.
Das ¹H-NMR-Spektrum zeigte charakteristische Signale bei: 5,8 (d, 1H); 5,5 (m, 1H); 3,5 (m, 1H).
Schritt D
770 mg von der in Schritt C zubereiteten Verbindung wurden in einer Mischung aus 2,38 ml Benzen, 17,5 ml Ethanol und 2,38 ml konzentrierter Salzsäure aufgelöst und für 16 Stunden rückflusserhitzt und im Vakuum evaporiert. Der Rest wurde in 5 ml Toluen aufgelöst, filtriert und auf einer Mediumdrucksäule aus AgNO₃/SiO₃ (Heptan : Toluen, 10 : 90) chromatographiert, wodurch 35 mg 4,4-Tetramethylen-cholesta-8,14-dien-3-ol erzielt wurden.
MS (Molekularion): 438,4.
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, δ) zeigte charakteristische Signale bei 5,35 (s, breit, 1H); 3,3 (d, d, 1H).
Das ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃, 100,6 MHz) zeigte charakteristische Signale bei: 79,0(C₃); 117,4(C₁₅); 122,9(C₈); 141,3(C₉); 151,1(C₁₄)
BEISPIEL 9
Zubereitung von 4,4-Dimethylcholest-8(14)-en-3β-ol.
580 mg 4,4-Dimethylcholest-8-en-3β-ol wurden in 20 ml Diethylether und 20 ml Essigsäure aufgelöst. 60 mg 10%-iger Pd/C-Katalysator wurden hinzugefügt und die Mischung wurde unter Rühren über Nacht unter Wasserstoff bei 3,5 Atm gelassen. Der Katalysator wurde entfernt und das Filtrat auf 10 ml konzentriert, wodurch die Kristallisation gestartet wurde. 10 ml Methanol wurden hinzugefügt und die Kristalle wurden nach 16 Stunden gesammelt. Durch Rekristallisation aus Methanol wurde 230 mg Material erzielt, welches durch ¹H- und ¹³C-NMR als Mischung aus dem 8(9) und 8(14)-Isomeren gezeigt wurde.
Die Mischung wurde in 10 ml Diethylether und 10 ml Essigsäure neu aufgelöst. 75 mg 5%-iger Pt/C-Katalysator wurde hinzugefügt und die Mischung wurde über Nacht mit Wasserstoff bei atmosphärischem Druck behandelt. Der Katalysator wurde entfernt, das Lösungsmittel evaporiert und der kristalline Rest mit 5 ml Methanol zerrieben, wodurch 190 mg reines 4,4-Dimethylcholest-8(14)-en-3β-ol erzielt wurden.
MS (Molekularion): 414,4
¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃, 100,6 MHz) zeigte charakteristische Signale bei: 79,24(C₃); 126,11(C₈); 142,20(C₁₄)
BEISPIEL 10
Überprüfung von Meiose-induzierenden Substanzen im oozyten-Test.
Tiere
Unreife weibliche Mäuse (B6D2-F1, Stamm C57B1/2J) wurden unter regulierter Beleuchtung (14 Std. Licht, 10 Std Dunkelheit) und Temperatur, mit Futter und Wasser nach Belieben (ad libitum) gehalten. Als die Tiere ein Gewicht von 13–16 Gramm (welches dem Alter von 20 bis 22 Tagen nach der Geburt entsprach) erreicht hatten, wurde ihnen eine einzelne Injektion (i. p.) humanes menopausales Gonadotropin (Humegon, organon, Niederlande) gegeben, welches ungefähr 20 N FSH und 20 N LH (Ziebe, S. et al. Hum. Reprod. 8 (1993) 385–88) enthielt. 48 Stunden später wurden die Tiere durch zervikale Dislokation getötet.
Sammlung und Kultivierung der oozyten
Die ovarien wurden entfernt, in HX-Medium (siehe unten) platziert und von Fremdgewebe befreit. Das Sammlungs- und Kulturmedium bestand aus Eagles essenziellem Minimalmedium (Flow, USA), enthaltend 4 mM Hypoxanthin, 3 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,23 mM Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (alles Sigma, USA). Dieses Medium wird als HX-Medium bezeichnet. Dasselbe Medium, jedoch ohne HX, wurde als Kontrollmedium verwendet.
Die antrafen Follikel der ovarien wurden unter einem Seziermikroskop unter Verwendung einer 27-Eichnadel punktiert. Kumulus-eingeschlossene oozyten („cumulus-enclosed oocytes", CEo) einheitlicher Größe wurden selektiert und dreimal in frischem HX-Medium gespült.
Von Kumuluszellen befreite oozyten, d.h. entblößte oozyten („denuded oocytes") DO, wurden durch vorsichtiges Spülen der CEo durch eine mundgesteuerte Pipette mit Feinbohrung erhalten. CEo und DO wurden in 4-Well-Multischalen (Nunclon, Dänemark) kultiviert, die 0,5 ml HX-Medium enthielten, mit Ausnahme der Kontrollen, welche in Kontrollmedium kultiviert wurden. Jedes Well enthielt 35 bis 50 oozyten. Die Testkulturen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der zu testenden Verbindungen, hergestellt wie in Tabelle 5 gezeigt.
Die Kulturen wurden bei 37°C und 100% Luftfeuchtigkeit mit 5% Co₂ in der Luft durchgeführt. Die Kulturzeit betrug 24 Stunden.
Auswertung der oozyten
Am Ende der Kulturperiode wurde die Anzahl der oozyten mit Keimbläschen („germinal vesicle", GV) oder aufgerissenen Keimbläschen („germinal vesicle breakdown", GVBD) und solchen mit Polarkörper („polar Body", PB) unter einem umgekehrten Mikroskop mit verschiedener Interferenzkontrastausstattung gezählt. Der prozentuale Anteil der oozyten mit GVBD pro Gesamtanzahl an oozyten und der prozentuale Anteil der oozyten mit PB pro GVBD wurde errechnet. Die Ergebnisse für DO und CEo, berechnet als Einheiten der MIS-Aktivität, sind in Tabelle 5 gegeben. Eine Einheit der MIS-Aktivität wurde definiert als:
und die Anzahl der MIS-Aktivitätseinheiten wurde berechnet als:
Tabelle 5
BEISPIEL 11
Überprüfung von Meiose-induzierenden Substanzen im Gonaden-Test.
Der Gonaden-Test wurde im wesentlichen wie bei Byskov, A. G. et al. Mol. Reprod. Dev. 34 (1993) 47–52 beschrieben durchgeführt. Die in Tabelle 6 gegebenen Ergebnisse wurden semiquantitativ evaluiert, wie von Westergaard, L. et al. Fertil. Steril. 41 (1984) 377–84 beschrieben.
Tabelle 6
BEISPIEL 12
Zubereitung von Mono(5α-cholesta-8,14-dien)-3β-succinat.
0,50 g 5α-cholesta-8,14-dien-3β-ol wurden in 10 ml THF aufgelöst, gefolgt von 0,39 g Bernsteinsäureanhydrid und 16 mg 4-Dimethylaminopyridin. Die Lösung wurde über Nacht rückflusserhitzt und dann bis zur Trockenheit evaporiert. Der Rest wurde in 10 ml Wasser suspendiert und das Präzipitat wurde ausgefiltert und mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch sich 0,48 g der Titelverbindung ergaben, welche weiter gereinigt werden konnte durch das Auflösen in einer Mischung aus wässrigem Natriumhydrogencarbonat und Ethanol, Hinzufügung von Salzsäure bis zum pH 2, gefolgt von einer Konzentrierung der Lösung, wodurch sich eine Präzipitation ergab.
Schmelzpunkt: 128–131°C
MS (Molekularion): 484,4
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, δ) des Produktes zeigte charakteristische Signale bei: 5,36 (s, 1H); 4,75 (m, 1H); 2,67 (m, 2H); 2,6 (m, 2H).
Das ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃, 100,6 MHz) zeigte charakteristische Signale bei: 73,4; 117,1; 122,7; 140,0; 150,5; 171,2; 177,2.
BEISPIEL 13
Zubereitung von 3β-Ethoxycarbonyloxy-5α-cholesta-8,14-dien.
0,50 g 5α-cholesta-8,14-dien-3β-ol wurde in einer Mischung von 5 ml Toluen und 5 ml Pyridin während Abkühlung in einem Eisbad aufgelöst. 2,3 ml Ethylchloroformiat, aufgelöst in 5 ml Toluen wurde über 5 Min. hinweg hinzugefügt. Nach 30 Min. wurde das Eisbad entfernt und das Rühren wurde für 20 Stunden bei Raumatemperatur und dann 2 Stunden bei 60°C fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum bis zur Trockenheit evaporiert und mit 10 ml Ethanol zerrieben, wodurch sich 0,505 g der Titelverbindung ergaben, welche durch Rekristallisierung aus Ethanol weiter gereinigt werden konnte.
Schmelzpunkt: 101–106°C
MS (Molekularion): 456,3
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, δ) des Produktes zeigte charakteristische Signale bei: 5,30 (s, 1H); 4,50 (m, 1H); 4,12 (q, 2H); 1,24 (t, 3H).
Das ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃, 100,6 MHz) zeigte charakteristische Signale bei: 62,6; 116,6; 122,2; 139,4; 150,0; 153,6.
BEISPIEL 14
Zubereitung von 3β-Phosphonooxo-4,4-dimethyl-5α-cholesta-8,14-dien.
2,00 g 4,4-Dimethyl-5α-cholesta-8,14-dien-3β-ol wurden in 10 ml wasserfreiem Pyridin aufgelöst und über 5 Min. hinweg zu einer Lösung aus 1,66 ml Phosphoroxychlorid in 10 ml wasserfreiem Aceton während Abkühlung in einem Eisbad hinzugefügt. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für 30 Min. wurde das Präzipitat ausgefiltert und mit wasserfreiem Aceton gewaschen. Der Rest wurde in 70 ml Wasser suspendiert und für 1¼ Stunden rückflusserhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde das Präzipitat ausgefiltert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch sich 0,93 g Rohprodukt ergaben. 0,70 g des Rohproduktes wurden in 75 ml 0,1 M wässrigem Kaliumhydroxid aufgelöst und die Lösung wurde durch 10 g Amberlite-Granulat IR-120(H) gefiltert und im Vakuum bis zur Trockenheit evaporiert. Der Rest wurde mit 10 ml Wasser zerrieben und das Präzipitat wurde ausgefiltert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch sich 0,48 g der Titelverbindung ergaben.
Schmelzpunkt: 183–185°C
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃ + 2 Tropfen CD₃OD) des Produktes zeigte charakteristische Signale bei: 5,36 (s, 1H); 3,89 (m, 1H).
Das ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃ + 2 Tropfen CD₃OD, 100,6 MHz) des Produktes zeigte charakteristische Signale bei: 85,1; 116,9; 122,3; 140,9; 150,5.
BEISPIEL 15
Zubereitung von 3β-Isonicotinoyl-5α-cholesta-8,14-dien.
0,50 g 5α-Cholesta-8,14-dien-3β-ol wurden in 5 ml Pyridin aufgelöst, gefolgt von 1,16 g Isonicotinoylchloridhydrochlorid. Die Lösung wurde über Nacht rückflusserhitzt und dann bis zur Trockenheit evaporiert. Der Rest wurde in 100 ml Wasser während Abkühlung in einem Eisbad suspendiert. Das Präzipitat wurde ausgefiltert und mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch sich 0,97 g des Rohproduktes ergaben, welches aus Aceton/Wasser rekristallisiert wurde, wodurch sich 0,40 g der Titelverbindung ergaben.
Schmelzpunkt: 129–131°C
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, δ) des Produktes zeigte charakteristische Signale bei: 8,77 (d, 2H), 7,84 (d, 2H); 5,39 (s, 1H); 4,49 (m, 1H). Das ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃, 50,3 MHz) zeigte charakteristische Signale bei: 75.0; 117,7; 122,8; 123,3; 138,0; 140,3; 150,5; 150,9; 164,6.

Claims

Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)
wobei R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, unverzweigtes oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl, welches durch Halogen oder Hydroxy substituiert sein kann oder wobei R¹ und R² zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Cyclopentanring oder einen Cyclohexanring bilden; R³ und R⁴ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen, in welchem Fall R⁵ Wasserstoff ist und R⁶ und R⁷ entweder Wasserstoff sind oder sie zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen; oder R⁵ und R⁴ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, bestimmen, in welchem Fall R³ Wasserstoff ist und R⁶ und R⁷ entweder Wasserstoff sind oder sie zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen; oder R⁶ und R⁴ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen, in welchem Fall R³, R⁵ und R⁷ alle Wasserstoff sind; R⁸ und R⁹ Wasserstoff sind oder sie zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen; und R¹⁰ entweder Wasserstoff, eine Acylgruppe, eine Sulfogruppe oder eine Phosphonogruppe ist, in der Zubereitung von einem Medikament zur Verwendung in der Regulation der Meiose.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ Wasserstoff oder Methyl ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Ethyl und unverzweigtes und verzweigtes C₃-C₆-Alkyl.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ eine unverzweigte oder eine verzweigte Hydroxyalkylgruppe mit bis zu sechs Kohlenstoffatomen ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ eine unverzweigte oder eine verzweigte α-Hydroxyalkylgruppe mit bis zu sechs Kohlenstoffatomen ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ eine unverzweigte oder eine verzweigte Alkylgruppe, substituiert mit Halogen, ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ ein Trifluormethyl ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R² Wasserstoff oder Methyl ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R² ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Ethyl und unverzweigtes und verzweigtes C₃-C₆-Alkyl.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R² eine unverzweigte oder verzweigte Hydroxyalkylgruppe mit bis zu sechs Kohlenstoffatomen ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R² eine unverzweigte oder verzweigte α-Hydroxyalkylgruppe mit bis zu sechs Kohlenstoffatomen ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R² eine unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe, substituiert mit Halogen, ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R² ein Trifluormethyl ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ und R² zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Cyclopentanring bilden.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ und R² zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Cyclohexanring bilden.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R³ und R⁴ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen und R⁵ Wasserstoff ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R⁵ und R⁴ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen und R³ Wasserstoff ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R⁶ und R⁴ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen und R³, R⁵ und R⁷ Wasserstoff sind.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R⁶ und R⁷ Wasserstoff sind.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R⁶ und R⁷ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R⁸ und R⁹ Wasserstoff sind.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R⁸ und R⁹ zusammen eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, bestimmen.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹⁰ Wasserstoff ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹⁰ eine Acylgruppe, abgeleitet von einer Säure mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 24, wobei R¹⁰ eine Acylgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Acetyl, Benzoyl, Pivaloyl, Butyryl, Nicotinoyl, Isonicotinoyl, Hemisuccinoyl, Hemiglutaroyl, Butylcarbamoyl, Phenylcarbamoyl, Butoxycarbonyl, tert-Butoxycarbonyl und Ethoxycarbonyl.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹⁰ Sulfo ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹⁰ Phosphono ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 4,4-Dimethyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 4,4-Dimethyl-5α-cholesta-8,14,24-trien-3β-ol ist.
Verfahren zur Regulierung der Meiose in einer Säugetierkeimzelle außerhalb des humanen Körpers, dieses Verfahren umfasst die Verabreichung einer effektiven Menge einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 29 an eine Keimzelle, die eine solche Behandlung benötigt.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Keimzelle, deren Meiose reguliert wird, eine oozyte ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 29 an eine oozyte ex vivo verabreicht wird.