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Fachgebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein für
Kreislauferkrankungen vorbeugendes Mittel, das die Wirkung zur Vorbeugung
von Kreislauferkrankungen, insbesondere Gehirnschlag, besitzt.
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Hintergrund der Erfindung
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Durch die jüngsten Änderungen der Essgewohnheiten
und Fortschritte in der Medizintechnik steigt die Häufigkeit
von Alterserkrankungen, darunter Bluthochdruck und Hyperlipämie, stetig
an. Es besteht heute angesichts von Veränderungen im sozialen Umfeld
ein wachsendes Interesse an vorbeugender Medizin, und funktionelle
Stoffe, die sowohl Sicherheit als auch vorbeugende Wirkung versprechen,
gewinnen Beachtung oder werden gesucht. Die Weltbevölkerung
tendiert heute mehr und mehr zum hohen Ende der Altersskala, und
es besteht die äußerst wichtige
Aufgabe für
die in medizinischer Versorgung und medizinischer Wissenschaft Beschäftigten
eine Perspektive für "gesunde Langlebigkeit" zu schaffen.
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Tiermodelle für Erkrankungen der Blutgefäße, die
entscheidende Faktoren im menschlichen Altern darstellen, namentlich
für solche
Erkrankungen wie Kreislauferkrankungen, repräsentiert durch Gehirnschlag (Yamori
Y, et al., Jpn. Circ. J. 38 (1974), 1095), Herzinfarkt (Yamori Y.
et al., Atherosclerosis 42 (1982), 15), Arteriosklerose, Multi-Infarkt-Demenz,
usw. sind entwickelt worden, und es ist unter Verwendung solcher
Modelle gezeigt worden, daß Kreislauferkrankungen
selbst in Anwesenheit erblicher Veranlagungen durch geeignete Ernährung vorgebeugt
werden kann. Nach Experimenten unter Verwendung von Tiermodellen,
namentlich SHR (Spontan Hypertensive Ratten) (Okamoto K. et al.,
Jpn. Circ. J. 27 (1963), 282) und SHRSP (Schlaganfall-gefährdete SHR),
begünstigt
die übermäßige Aufnahme
von Natriumchlorid diese Erkrankungen, wohingegen bestimmte Nährstoffe
in Nahrungsmitteln sie verhindern. Es ist zum Beispiel gezeigt worden,
daß Sojabohnenprotein,
Lysin, Taurin, Kalium, Calcium, Magnesium, Palmitoleinsäure, usw.
vorbeugende Wirkungen gegen diese Erkrankung zeigen (Yamori Y. et
al., New horizon in preventing cardiovascular diseases, Yamori Y.
and Strasser T. (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1989), 1), wenn sie
vor dem Beginn von Bluthochdruck oder in einem frühen Stadium
nach dem Beginn und darüber
hinaus verabreicht werden.
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Die in Nahrungsmitteln enthaltenen
Faktoren sind ebenfalls erforscht und untersucht worden, und es wurde
zunehmend deutlich, daß aus
Nahrungsmitteln gewonnene Proteine verschiedene physiologische Rollen
spielen können.
Die Entwicklung von Nahrungsbestandteilen, die entsprechende Wirkungen
auf Alterskrankheiten, also Blutcholesterin erniedrigende Wirkung
und blutdrucksenkende Wirkung haben (Karaki H. et al., Comp. Biochem.
Physiol. 96C (1990), 367), ist mit großem Engagement angegangen worden,
und viele Substanzen sind als Bestandteile für performance food (Nutraceuticals
oder funktionelle Nahrungsmittel) und Nahrungsmittel mit ernährungsphysiologischem
Zusatznutzen kommerziell erhältlich
gemacht worden.
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Vor kurzem ist berichtet worden,
daß der
ACE Inhibitor, oder Captopril in einer niedrigen Dosis, die gerade
noch keine Blutdrucksenkung verursacht, die Entstehung eines Gehirnschlags
in SHRSP verhindert (Ohta Y. et al., Genetic. Hypertens. 218 (1992),
393). Captopril hat jedoch ungünstige
Nebenwirkungen wie Hautrötungen,
und andere Verbindungen, die bekanntermaßen gegen Kreislauferkrankungen,
besonders Gehirnschlag, wirksam sind, sind Gegenstand für die symptomatische
Behandlung mit ungünstigen
Nebenwirkungen wie Blutdruckschwankungen und so weiter.
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Die blutdrucksenkenden Wirkungen
von Trypsin-verdautem Casein sind ebenfalls an Ratten mit Bluthochdruck
bewertet worden (Suzuki et al., Acta medica Kinki Univ. 3(1) (1978),
11–18).
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Ein Verfahren zur Gewinnung biologisch
aktiver immunologischer Verbindungen, die die Bildung von Antikörpern stimulieren,
das die Behandlung von entfettetem löslichen menschlichen Casein
mit einem Enzym wie Trypsin enthält,
ist in US Patent 4,462,990 offenbart.
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Vom Standpunkt der vorbeugenden Medizin
aus hat es daher einen großen
festen Bedarf an Verbindungen gegeben, die sehr sicher, frei von
Nebenwirkungen wie Blutdruckschwankungen, vorbeugend wirksam für die Entstehung
von Kreislauferkrankungen, insbesondere Gehirnschlag, und preiswert
genug für
den täglichen
Konsum sind.
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Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung hat die
Bereitstellung eines für
Kreislauferkrankungen vorbeugenden Mittels zum Gegenstand, das frei
von ungünstigen
Nebenwirkungen wie Blutdruckschwankungen und vorbeugend wirksam
gegen Kreislauferkrankungen, insbesondere Gehirnschlag, ist.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung
haben verschiedene Nahrungsmittelbestandteile auf der Suche nach
Verbindungen untersucht, die vorbeugend für Kreislauferkrankungen, insbesondere
Gehirnschlag, wirksam sein sollten, und haben entdeckt, daß eine niedermolekulare
Peptidfraktion, die durch Hydrolyse von Casein aus Milch mit Trypsin
und partielle Aufreinigung des entstandenen Verdaus erhältlich ist,
ein vorbeugend wirksames Mittel für Kreislauferkrankungen ist.
Die vorliegende Erfindung ist auf der Basis der oben genannten Entdeckung
entwickelt worden.
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Die vorliegende Erfindung wird nun
im Detail beschrieben.
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Das Casein, das als Substrat für den tryptischen
Verdau verwendet werden kann, der Bestandteil des vorbeugenden Mittels
der vorliegenden Erfindung sein soll, schließt eine Auswahl von Caseinarten,
die als Nahrungsmittelzusätze
weit verbreitet sind, und saures Casein, Caseinsalze, Rennet-Casein
und so weiter ein.
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Das in der vorliegenden Erfindung
als Hydrolase verwendete Trypsin schließt verschiedene Arten von Trypsin
ein, die üblicherweise
als Einsatzstoff für
pharmazeutische Anwendungen, oder als Nahrungsmittelzusatz verwendet
werden, und ist vorzugsweise eines, das so weit als möglich frei
von anderen Enzymen (insbesondere Chymotrypsin) ist.
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Der Trypsin-Hydrolyseschritt im erfindungsgemäßen Verfahren
schließt
die neutrale oder alkalische Einstellung von Casein, eines Caseinsalzes
oder ähnlichem
und dessen Umsetzung mit Trypsin in wäßriger Lösung ein. Bevorzugt wird diese
Reaktion in der Nähe
von pH 7.5 bei einer Proteinkonzentration von ungefähr 10 Gew.-%
für 2 bis
5 Stunden durchgeführt.
Die Hydrolysereaktion kann durch ein übliches Verfahren beendet werden,
z. B. durch Erhitzen vorzugsweise auf 121°C für 10 Minuten, Bedingungen,
die der vollständigen
Inaktivierung des Enzyms und der Sterilisierung dienen.
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Die niedermolekulare Peptidfraktion
zur erfindungsgemäßen Verwendung
kann gemäß der folgenden Verfahren
abgetrennt (und gereinigt) werden. Demzufolge wird die unlösliche Fraktion
im Anschluß an
die Beendigung der Hydrolysereaktion durch Zentrifugation oder Filtration
abgetrennt. Der Überstand
oder das Filtrat wird unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran
oder eines Gelpermeations-Chromatographie (GPC) Liganden mit einem
Peptid-Ausschlußmolekulargewicht
von ungefähr
3000 Da fraktioniert. Die Ultrafiltrationsmembran schließt SEP1013
(Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), Amicon H10 P3-20 (Grace Japan), UFP-3-E-9A
(A/G Technology) ein, und ähnliche
können
genannt werden. Der GPC Ligand schließt Sephadex G-25 (Pharmacia),
Sephacryl S-100HR (Pharmacia), Bio-Gel P-6 (Bio-Rad Laboratories), Toyopearl
HW-40 (Tosoh Corporation), usw ein. Auf diese Weise kann eine niedermolekulare
Peptidfraktion mit einem Molekulargewicht von nicht größer als
3000 Da zur erfindungsgemäßen Verwendung
erhalten werden.
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Die Darreichungsform des für Kreislauferkrankungen
vorbeugenden Mittels gemäß der vorliegenden Erfindung
kann jede Form sein, die für
pharmazeutische Zwecke oder in Nahrungsmitteln akzeptabel ist. Insbesondere
können
orale Nahrungsaufnahme, enterale Nahrungsaufnahme, Getränke, Tabletten,
Eiszubereitungen, Würzmittel
und andere Formen genannt werden. Das bevorzugt verwendete Verhältnis beträgt 0.1 bis 50
Gew.-% und für
noch bessere Ergebnisse 0.5 bis 10 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge
der genannten Form.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
in einem Diagramm den Zeitverlauf des (a) systolischen Blutdrucks
und (b) des Körpergewichtes
in Schlaganfall-gefährdeten
Spontan Hypertensiven Ratten (bezeichnet als SHRSPs), denen Trypsin-verdautes
Casein verabreicht wurde. ⎕ bezeichnet die Kontrolldiät Gruppe
und O bezeichnet die Peptiddiät Gruppe.
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2 ist
die Darstellung eines Diagramms des (a) Gehirngewichtes und (b)
des Herzgewichtes in SHRRPs, die für 30 Wochen eine Diät erhielten,
die Trypsin-verdautes Casein beinhaltete, das die Peptiddiät Gruppe
mit der Kontrolldiät
Gruppe vergleicht.
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3 zeigt
in einem Diagramm den Zeitverlauf der Überlebensrate in SHRSPs, die
für 30
Wochen eine Diät
erhielten, die Trypsin-verdautes Casein beinhaltete. • bezeichnet
die Peptiddiät
Gruppe, Δ bezeichnet die
Aminosäurendiät Gruppe
und ⎕ bezeichnet die Kontrolldiät Gruppe.
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Beste Art
der Erfindungsausführung
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Das folgende Beispiel, das Testbeispiel,
und Anwendungsbeispiele sind weitere Veranschaulichungen der vorliegenden
Erfindung. Das Beispiel ist ein Beispiel für die Produktion einer niedermolekularen
Fraktion von Trypsin-verdautem Casein und das Testbeispiel zeigt
die Ergebnisse eines Experimentes zur Vorbeugung einer Kreislauferkrankung
in SHRSPs mit der niedermolekularen Fraktion.
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Beispiel 1
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In einem 50-L Fermenterkessel (hergestellt
von Mitsuwa) wurden 3 kg Casein aus Kuhmilch (hergestellt von Benie,
saures Casein zur Verwendung in Nahrungsmitteln) in 30 L Wasser
suspendiert und die Suspension mit 10 N-KOH auf pH 7.5 eingestellt.
Die Temperatur wurde bei 37°C
gehalten, 7.5 g Trypsin (hergestellt von Sigma, Typ III, EC 3.4.21.4)
zugegeben, und der Verdau wurde 4 Stunden unter Rühren durchgeführt.
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Der Verdau wurde im Fermenterkessel
bei hoher Temperatur und Druck (121°C, 10 Minuten) hitzebehandelt
und der entstandene Niederschlag wurde durch wiederholte Zentrifugation
bei 4°C
mit 10000 U/min entfernt, um Trypsin-verdautes Casein als Überstand
zu erhalten.
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Ein 5-L Anteil des oben genannten
Trypsin-verdauten Caseins wurde über
eine Ultrafiltrationsmembran filtriert, um eine hochmolekulare Peptidfraktion
zu entfernen. Die verwendete Ultrafiltrationsmembran war SEP1013
(Ausschlußmolekulargewicht
= 3000 Da), erhältlich
von Asahi Chemical Industry Co., Ltd. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet
und ergab 35 g einer niedermolekularen Fraktion des Trypsin-verdauten
Caseins.
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Testbeispiel 1
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Die vorbeugende Wirksamkeit gegen
Kreislauferkrankungen wurde in Schlaganfall-gefährdeten
Tiermodellen (SHRSPs) geprüft.
Drei Arten von Rattenfutter wurden bereitgestellt. (1) eine Peptiddiät, die durch Zugabe
des Peptids aus Beispiel 1 in einer Konzentration von 10 Gew.-%
zu einer 3%igen NaCl Ration basierend auf Funabashi Farm SP Diät bereitet
wurde, (2) eine Aminosäurendiät, die durch
Zugabe einer Aminosäurenmischung
der gleichen Zusammensetzung wie die Peptidfraktion zu der 3 %igen
NaCl Ration in einer Konzentration von 10 Gew.-% bereitet wurde,
und (3) die 3%ige NaCl Ration als Kontrolldiät.
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Zehnergruppen männlicher SHRSPs wurden, beginnend
an Tag 77 nach Geburt, auf die Peptiddiät, die Aminosäurendiät und die
Kontrolldiät
gesetzt, und Blutdruck und Körpergewicht
wurden in Woche 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 und 24 der Fütterung
bestimmt. Alle Ratten, die nach Woche 30 der Fütterung noch lebten, wurden
auf beginnenden Schlaganfall im Hinblick auf allgemeine Befunde,
Gehirngewicht, Herzgewicht und andere Parameter untersucht. Die
Tiere, die im Untersuchungszeitraum starben, wurden aus Anlaß autopsiert und
auf ähnliche
Weise untersucht. Die Anzahl von Tieren, die nach 30 Wochen Fütterung
Symptome eines Schlaganfalls zeigten, betrug 1 in der Peptiddiät Gruppe,
5 in der Aminosäurendiät Gruppe
und 5 in der Kontrolldiät
Gruppe, was darauf hinweist, daß die
Peptiddiät
der Entstehung eines Schlaganfalles vorbeugt. Bezüglich Blutdruck
und Körpergewicht
gab es keinen Unterschied zwischen den Gruppen (1).
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Die pathologischen Beurteilungen
(einschließlich
der Bestimmung von Gehirngewicht und Herzgewicht) wurden an toten
Tieren zum Zeitpunkt des Todes und an Überlebenden in Woche 30 der
Fütterung durchgeführt. Die
Gehirngewicht- und Herzgewicht-Daten sind in 2 gezeigt. Beim Gehirngewicht wurde eine
signifikante Abschwächung
des Gewichtszuwachses festgestellt. Beim Herzgewicht wurde eine
Tendenz zur Abschwächung
des Gewichtszuwachses festgestellt. Demzufolge wurde gezeigt, daß die Peptiddiät Gehirnödemen und
cardialer Hypertrophie vorbeugt.
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Der Zeitverlauf der Überlebensrate
in jeder Gruppe während
des Fütterungszeitraumes
wurde in 3 gezeigt.
Während
es in der Peptiddiät
Gruppe keinen Todesfall gab, wurden 5 Todesfälle jeweils in der Aminosäurengruppe
und der Kontrollgruppe gezählt.
Demzufolge wurde eine lebensverlängernde
Wirkung der Peptiddiät
bestätigt.
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Anwendungsbeispiel 1
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Ein Getränk (100 ml/Flasche) wurde gemäß dem in
Tabelle 1 folgenden Rezept auf übliche
Weise zubereitet.
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Anwendungsbeispiel 2
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Tabletten (500 mg/Tablette) wurden
gemäß dem in
Tabelle 2 folgenden Rezept auf übliche
Weise hergestellt.
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Anwendungsbeispiel 3
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Eine Eiscreme (100 g/Becher) wurde
gemäß dem in
Tabelle 3 folgenden Rezept auf übliche
Weise hergestellt.
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Anwendungsbeispiel 4
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Ein Joghurt (100 g/Becher) wurde
gemäß dem in
Tabelle 4 folgenden Rezept auf übliche
Weise hergestellt.
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Industrielle Anwendbarkeit
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Es ist offenkundig, daß die vorliegende
Erfindung ein Mittel zur Vorbeugung von Kreislauferkrankungen liefern
kann, das in der Lage ist, der Entstehung von Kreislauferkrankungen
vorzubeugen ohne nachteilige Wirkungen wie Blutdruckschwankungen
zu verursachen.
