DE69528888T3

DE69528888T3 - Regulation der NF-KB Aktivität durch Proteasomen

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Publication number: DE69528888T3
Application number: DE69528888T
Authority: DE
Inventors: Vito J. Palombella; Alfred L. Golberg; Thomas P. Maniatis; Oliver Rando
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1994-03-18
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2015-03-18
Also published as: DE69528888D1; DE69528888T2; SI0750507T1; WO1995025533A1; AU2121595A; EP0750507A4; US20040097420A1; CA2184727C; PT750507E; DK0750507T4; AU682264B2; EP0750507B1; EP0750507A1; US6660268B1; DK0750507T3; ES2182897T5; CA2184727A1; EP0750507B2; ATE228002T1; ES2182897T3

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verringerung des Gehalts und der Aktivität von NF-κB in der Zelle unter Verwendung von Hemmstoffen einer Proteasom-Funktion oder einer Ubiquitin-Konjugation.
2. Beschreibung des verwandten Fachgebiets
Der Transkriptionsfaktor NF-κB und andere Mitglieder der rel-Familie von Proteinkomplexen spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation eines Satzes von bemerkenswert verschiedenen Genen, die an Immun- und Entzündungsreaktionen beteiligt sind (Grilli et al., International Review of Cytology 143:1-62 (1993)). Zum Beispiel ist NF-κB für die Expression einer Reihe von Genen der Immunantwort erforderlich, einschließlich des Gens für die leichte Immunglobulinkette Ig-κ, des Gens für die α-Kette des IL-2-Rezeptors, des Gens für die β-Kette des T-Zell-Rezeptors und der Klasse-I- und Klasse-II-Haupthistokompatibilitätsgene. Außerdem wurde gezeigt, daß NF-κB für eine Reihe von Genen erforderlich ist, die an der Entzündungsreaktion beteiligt sind, wie das TNF-α-Gen und die Zelladhäsionsgene, E-Selektin, I-cam und V-cam. NF-κB wird außerdem für die Expression einer großen Anzahl von Cytokingenen, beispielsweise für IL-2, IL-6, G-CSF und IFN-β, benötigt. Schließlich ist NF-κB für die Expression des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) wesentlich.
Im Cytosol existiert ein löslicher proteolytischer Weg, der ATP benötigt und die kovalente Konjugation der zellulären Proteine mit dem kleinen Polypeptid Ubiquitin ("Ub") beinhaltet (Hershko et al., A. Rev. Biochem. 61:761-807 (1992); Rechsteiner et al., A. Rev. Cell. Biol. 3:1-30 (1987)). Danach werden die konjugierten Proteine durch einen 26S-Proteolysekomplex hydrolysiert, der ein abbauendes 20S-Partikel enthält, das man als Proteasom bezeichnet (Goldberg, Eur. J. Biochem. 203:9-23 (1992); Goldberg et al., Nature 357:375-379 (1992)). Dieses Multikomponentensystem katalysiert bekanntlich den selektiven Abbau von stark anomalen Proteinen und kurzlebigen regulatorischen Proteinen. Das System scheint aber auch verantwortlich zu sein für den Abbau der meisten Proteine in reifenden Reticulozyten (Boches et al., Science 215:978-980 (1982); Spenser et al., J. Biol. Chem. 257:14122-14127 (1985)), in wachsenden Fibroblasten (Ciechanover et al., Cell 37:57-66 (1984); Gronostajski et al., J. Biol. Chem. 260:3344-3349 (1985)), und in atrophierendem Skelettmuskel.
Der erste Schritt beim Abbau vieler Proteine beinhaltet deren Konjugation an Ub durch einen ATP-benötigenden Prozeß. Die ubiquitinierten Proteine werden dann durch einen vorstehend erwähnten ATP-abhängigen proteolytischen Komplex abgebaut, der als 26S-Proteasomkomplex bekannt ist.
Die genaue Natur des 26S-Proteasomkomplexes ist unklar, obwohl gezeigt wurde, daß der 1000-1500-kDa- (26S-) Komplex in Extrakten aus an Energie verarmten Reticulozyten durch ATP-abhängige Aneinanderlagerung dreier Komponenten gebildet werden kann, die man als CF-1, CF-2 und CF-3 bezeichnet (Ganoth, D. et al. J. Biol. Chem. 263:12412-12419 (1988)). Eine große (~ 700 kDa), multimere Protease, die man im Cytoplasma und im Kern eukaryotischer Zellen findet und als das Proteasom bezeichnet, ist eine Komponente (CF-3) (Driscoll et al., J. Biol. Chem. 265:4789-4792 (1992); Eytan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7751-7755 (1989); Orlowski, Biochemistry 29:10289-10297 (1990) und Rivett, Arch. Biochem. Biophys. 268:1-8 (1989)).
Es wird angenommen, daß das Proteasom das katalytische Zentrum des großen cytoplasmatischen 26S-Partikels mit mehreren Untereinheiten bildet, das für den Ubiquitinabhängigen Weg der intrazellulären Proteolyse notwendig ist (Driscoll et al., J. Biol. Chem. 265:4789-4792 (1990); Eytan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86:7751-7755 (1989); Hough et al., Biochemistry 262:8303-8313 (1987); McGuire et al., Biochim. Biophys. Acta 967:195-203 (1988); Rechsteiner et al., A. Rev. Cell. Biol. 3:1-30 (1987); Waxman et al., J. Biol. Chem. 262:2451-2457 (1987)). Das Proteasom allein kann keine ubiquitinierten Proteine abbauen, liefert aber den größten Teil der proteolytischen Aktivität des 26S-Proteasomkomplexes.
Es gibt eine weitere ATP-abhängige Protease, die am Abbau von ubiquitinierten Proteinen beteiligt ist, einen Komplex mit dem Proteasom bildet und anscheinend ein Teil des 26S-Proteasomkomplexes ist, der an Ubiquitin konjugierte Proteine schnell abbaut. Diese als Multipain bezeichnete Protease wurde in Muskulatur identifiziert und spielt eine wesentliche Rolle beim ATP-Ubiquitin-abhängigen Weg.
Der zwischen Multipain und Proteasom in vitro gebildete Komplex ist anscheinend sehr ähnlich oder identisch mit dem 1500-kDa-UB-Konjugat, abbauenden Enzym oder 26S- Proteasomkomplex, der aus Reticulozyten und Muskulatur isoliert wurde. Die Komplexe enthalten die charakteristischen 20-30-kDa-Proteasom-Untereinheiten und eine Reihe größerer Untereinheiten, einschließlich der sechs großen Polypeptide, die man in Multipain findet. Der gebildete Komplex enthält mindestens 10-12 Polypeptide von 40-150 kDa.
Ein 40-kDa-Polypeptidregulator des Proteasoms, der die proteolytischen Aktivitäten des Proteasoms hemmt, wurde aus Reticulozyten isoliert, und es wurde gezeigt, daß es sich um ein ATP-bindendes Protein handelt, dessen Freisetzung anscheinend die Proteolyse aktiviert. Der isolierte Regulator existiert als 250-kDa-Multimer und ist relativ labil (bei 42 °C). Er läßt sich durch Zugabe von ATP oder eines nicht hydrolysierbaren ATP-Analogons stabilisieren, obwohl der gereinigte Regulator kein ATP benötigt, um die Proteasomen-Funktion zu hemmen, und keine ATPase-Aktivität aufweist. Es wurde gezeigt, daß der Regulator einem essentiellen Bestandteil des 1500-kDa-Proteolysekomplexes entspricht. Der Regulator scheint nach vielen Kriterien mit CF-2 identisch zu sein. Diese Befunde legen nahe, daß der Regulator eine Rolle im ATP-abhängigen Mechanismus des 26S-Proteasomkomplexes spielt.
Es gibt außerdem ein System im Cytosol, das antigene Partikel aus endogen synthetisierten zellulären und viralen Proteinen erzeugt (Moore et al., Cell 54:777-785 (1988); Morrison et al., J. Exp. Med. 163:903-921 (1986); Powis et al., Nature 354:529-531 (1991); Spies et al., Nature 351:323-324 (1991); Townsend et al., Cell 42:457-467 (1985); Townsend et al., Nature 324:575-577 (1986); Monaco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:3001-3005 (1982); Monaco, Immun. Today 13:173-179 (1992); Yewdell et al., Adv. Immun. 52:1-123 (1992); Townsend et al., J. Exp. Med. 168:1211-1224 (1988)). Indirekte Befunde deuten auf eine Rolle von proteolytischen Partikeln hin, die stark dem Proteasom ähneln und möglicherweise mit diesem identisch sind (Goldberg et al., Nature 357:375-379 (1992); Monaco, Immun. Today 13:173-179 (1992); Parham, Nature 348:674-675 (1990); Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4928-4932 (1992); Brown et al., Nature 353:355-357 (1991)). Es wurde gezeigt, daß das Proteasom für die Prozessierung von MHC-Klasse-I-Antigenmolekülen im Cytoplasma verantwortlich ist.
Das 20S-Proteasom besteht aus etwa 15 verschiedenen 20-30-kDa-Untereinheiten. Es enthält mindestens drei verschiedene Peptidasen, die spezifisch auf der Carboxylseite der hydrophoben, basischen und sauren Aminosäuren spalten (Goldberg et al., Nature 357:375-379 (1992); Goldberg, Eur. J. Biochem. 203:9-23 (1992); Orlowski, Biochemistry 29:10289-10297 (1990); Rivett et al., Archs. Biochem. Biophys. 218:1 (1989); Rivett et al., J. Biol. Chem. 264:12215-12219 (1989); Tanaka et al., New Biol. 4:1-11 (1992)). Diese Peptidasen bezeichnet man als die chymotrypsinähnliche Peptidase, die trypsinähnliche Peptidase und die Peptidylglutamyl-Peptidase. Es ist unbekannt, welche Untereinheiten für diese Aktivitäten verantwortlich sind, obwohl die cDNAs, die verschiedene Untereinheiten codieren, kloniert wurden (Tanaka et al., New Biol. 4:1-11 (1992)).
Neuere Studien ergaben, daß das 20S-Proteasom in seiner Größe und Untereinheitenzusammensetzung den mit dem MHC verknüpften LMP-Partikeln ähneln (Driscoll et al., Cell 68:823 (1992); Goldberg et al., Nature 357:375-379 (1992); Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:2586 (1989); Monaco et al., Human Immunology 15:416 (1986); Parham, Nature 348:674-675 (1990); Martinez et al., Nature 353:664 (1991); Oritz-Navarette et al., Nature 353:662 (1991); Glynne et al., Nature 353:357 (1991); Kelly et al., Nature 353:667 (1991); Monaco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:3001 (1982); Brown et al., Nature 353:355 (1991); Goldberg, Eur. J. Biochem. 203:9-23 (1992); Tanaka et al., New Biol. 4:1-11 (1992)).
Es wurden verschiedene Hemmstoffe der Peptidasen des Proteasoms beschrieben (Dick et al., Biochemistry 30:2725-2734 (1991); Goldberg et al., Nature 357:375-379 (1992); Goldberg, Eur. J. Biochem. 203:9-23 (1992); Orlowski, Biochemistry 29:10289-10297 (1990); Rivett et al., Archs. Biochem. Biophys. 218:1 (1989); Rivett et al., J. Biol. Chem. 264:12215-12219 (1989); Tanaka et al., New Biol. 4:1-11 (1992)). Dazu gehören bekannte Hemmstoffe chymotrypsinähnlicher und trypsinähnlicher Proteasen sowie Hemmstoffe von Thiol- (oder Cystein-) und Serinproteasen. Zusätzlich sind einige endogene Hemmstoffe von Proteasom-Aktivitäten isoliert worden. Dazu gehören die 240-kDa- und 200-kDa-Hemmstoffe, die aus menschlichen Erythrozyten isoliert wurden (Murakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:7588-7592 (1986); Li et al., Biochemistry 30:9709-9715 (1991)), und gereinigter CF-2 (Goldberg, Eur. J. Biochem. 203:9-23 (1992)). Zusätzlich zu antibiotischen Hemmstoffen, die ursprünglich aus Actinomyceten isoliert wurden (Aoyagi et al., Proteases and Biological Control, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 429-454 (1975)), ist eine Vielzahl von Peptidaldehyden synthetisiert worden, wie die von Siman et al. (WO 91/13904) beschriebenen Hemmstoffe chymotrypsinähnlicher Proteasen.
Es können auch neue Moleküle gewonnen und bezüglich ihrer Hemmstoffaktivität getestet werden. Wie durch die vorstehend zitierten Bezugsstellen verdeutlicht wird, sind verschiedene Strategien zur Gewinnung der Hemmstoffe für eine gegebene Protease im Fachgebiet bekannt. Verbindungs- oder Extraktbanken können unter Verwendung von Pep tidase-Assays bezüglich Hemmstoffen durchmustert werden. Alternativ können auf der Basis des Wissens über die Substrate der Protease Peptide und peptidomimetische Moleküle entworfen bzw. gestaltet werden. Zum Beispiel können Substratanaloga synthetisiert werden, die eine reaktive Gruppe enthalten, die wahrscheinlich mit dem katalytischen Zentrum der Protease wechselwirkt (siehe z.B. Siman et al., WO 91/13904; Powers et al., in Proteinase Inhibitors, Barrett et al. (Hrsg.), Elsevier, S. 55-152 (1986)). Die Hemmstoffe können stabile Analoga katalytischer Übergangszustände (Übergangszustand-Analog-Hemmstoffe), wie Z-Gly-Gly-Leu-H, sein, das die chymotrypsinähnliche Aktivität des Proteasoms hemmt (Orlowski, Biochemistry 29:10289-10297 (1990); siehe auch Kennedy und Schultz, Biochemistry 18:349 (1979)).
Verschiedene, in der Literatur beschriebene natürliche und chemische Proteasehemmstoffe oder dazu ähnliche Moleküle umfassen Peptide, die ein α-Diketon oder einen α-Ketoester enthalten, Peptidchlormethylketone, Isocumarine, Peptidylsulfonylfluoride, Peptidylboronate, Peptidepoxide und Peptidyldiazomethane (Angelastro et al., J. Med. Chem. 33:11-13 (1990); Bey et al., EPO 363.284; Bey et al. EPO 364.344; Grubb et al., WO 88/10266; Higuchi et al., EPO 393.457; Ewoldt et al., Molecular Immunology 29(6):713-721 (1992); Hernandez et al., Journal of Medicinal Chemistry 35(6):1121-1129 (1992); Vlasak et al., Journal of Virology 63(5):2056-2062 (1989); Hudig et al., Journal of Immunology 147(4):1360-1368 (1991); Odakc et al., Biochemistry 30(8):2217-2227 (1991); Vijayalakshmi et al., Biochemistry 30(8):2175-2183 (1991); Kam et al., Thrombosis and Haemostasis 64(1):133-137 (1990); Powers et al., Journal of Cellular Biochemistry 39(1):33-46 (1989); Powers et al., Proteinase Inhibitors, Barrett et. al. (Hrsg.), Elsevier, S. 55-152 (1986); Powers et al., Biochemistry 29(12):3108-3118 (1990); Oweida et al., Thrombosis Research 58(2):391-397 (1990); Hudig et al., Molecular Immunology 26(8):793-798 (1989); Orlowski et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 269(1):125-136 (1989); Zunino et al., Biochimica et Biophysica Acta 967(3):331-340 (1988); Kam et al., Biochemistry 27(7):2547-2557 (1988); Parkes et al., Biochem. J. 230:509-516 (1985); Green et al., J. Biol. Chem. 256:1923-1928 (1981); Angliker et al., Biochem. J. 241:871-875 (1987); Puri et al., Arch. Biochem. Biophys. 27:346-358 (1989); Hanada et al., Proteinase Inhibitors: Medical and Biological Aspects, Katunuma et al., Hrsg., Springer-Verlag, S. 25-36 (1983); Kajiwara et al., Biochem. Int. 15:935-944 (1987); Rao et al., Thromb. Res. 47:635-637 (1987); Tsujinaka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1201-1208 (1988)).
Verschiedene Hemmstoffe der Konjugation von Ubiquitin an Proteine sind ebenfalls bekannt (Wilkinson et al., Biochemistry 29:7373-7380 (1990)).
Bestimmte Peptidaldehyde und Peptid-α-ketoester, die einen hydrophoben Rest in P₁-Position enthalten, wurden von Vinitsky et al. (Biochemistry 31:9421-9428 (1992), siehe auch Orlowski et al., Biochemistry 32:1563-1572 (1993)) als potentielle Hemmstoffe der chymotrypsinähnlichen Aktivität des Proteasoms getestet. Von drei Peptidaldehyden (Benzyloxycarbonyl)-Leu-Leu-Phenylalaninal(Z-LLF-H), N-Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal (Ac-LLnL-H) und N-Acetyl-Leu-Leu-Methioninal (Ac-LLM-H) wurde gefunden, daß sie langsam bindende Hemmstoffe mit K_i-Werten von 0, 46, 5, 7 bzw. 33 μM sind. Unter den verschiedenen getesteten Peptid-α-Ketoester-Hemmstoffen war Z-Leu-Leu-Phe-COOEt der stärkste Hemmstoff der chymotrypsinähnlichen Aktivität mit einem K_i-Wert von 53 μM. Es gibt viele dieser Verbindungen.
Andere Tripeptide, die in der Literatur beschrieben wurden, sind u.a. Ac-Leu-Leu-Leu-H, Ac-Leu-Leu-Met-OR, Ac-Leu-Leu-Nle-OR, Ac-Leu-Leu-Leu-OR, Ac-Leu-Leu-Arg-H, Z-Leu-Leu-Leu-H, Z-Arg-Leu-Phe-H und Z-Arg-Ile-Phe-H, wobei OR zusammen mit der Carbonylgruppe des vorausgehenden Aminosäurerests eine Estergruppe bildet.
Goldberg offenbart in der U.S.-Patentanmeldung mit der laufenden Nr. 07/699.184, eingereicht am 13. Mai 1991, daß gezeigt werden konnte, daß der ATP-Ubiquitinabhängige Prozeß für den übermäßigen Proteinabbau verantwortlich ist, der unter Bedingungen oder Erkrankungszuständen auftritt, bei denen ein schwerer Körpermasseverlust und ein negatives Stickstoffgleichgewicht vorliegen. Ein Verfahren zur Hemmung der beschleunigten oder verstärkten Proteolyse, ein Verfahren zum Identifizieren von Hemmstoffen des Prozesses, Multipain- und Proteasomenhemmstoffe sind ebenfalls offenbart.
Goldberg et al. offenbaren in der U.S.-Patentanmeldung mit der laufenden Nr. 08/016.066, eingereicht am 10. Februar 1993, Verfahren und Medikamente, welche die Prozessierung von Antigenen für eine Präsentation durch Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I-Moleküle hemmen. Insbesondere sind Hemmstoffe des ATP-Ubiquitinabhängigen Proteolysewegs beschrieben, die eine Antigenpräsentation durch MHC-I hemmen können. Diese Verfahren und Medikamente können sich zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten und zur Verringerung der Abstoßung von Organen und Transplantaten eignen. Siehe auch Michalek et al., Nature 363:552-554 (1993).
Tsubuki et al., Biochem. and Biophys. Res. Commun. 196(3):1195-1201 (1993) beschrieben, daß ein Tripeptidaldehyd-Proteasehemmstoff, Benzyloxycarbonyl(Z)-Leu-Leu- Leucinal, das Neuritenwachstum in PC12-Zellen bei einer optimalen Konzentration von 30 nM einleitet. Die folgenden synthetischen Peptide sind ebenfalls erwähnt: Z-Leu-Leu-Gly-H, Z-Leu-Leu-Ala-H, Z-Leu-Leu-Ile-H, Z-Leu-Leu-Val-H, Z-Leu-Leu-Nva-H, Z-Leu-Leu-Phe-H, Z-Leu-Leu-Leu-H, Bz-Leu-Leu-Leu-H, Ac-Leu-Leu-Leu-H, Z-Leu-Leu-Leu.sc, Z-Leu-Leu-Leu.ol, Z-Leu-Leu-Leu, Dns-Leu-Leu-Leu-H, Dns-Leu-Leu-Leu-CH₂Cl und Leupeptin.
Siman et al. (WO 91/13904) offenbaren chymotrypsinähnliche Proteasen und deren Hemmstoffe. Die Hemmstoffe haben die Formel R-A4-A3-A2-y, wobei
R Wasserstoff oder eine N-terminale Blockierungsgruppe ist;
A4 eine kovalente Bindung, eine Aminosäure oder ein Peptid ist;
A3 eine kovalente Bindung, eine D-Aminosäure, Phe, Tyr, Val oder ein konservativer Aminosäureaustausch von Val ist;
A2 eine hydrophobe Aminosäure oder Lysin oder ein konservativer Aminosäureaustausch davon ist, oder, wenn A4 mindestens zwei Aminosäuren umfaßt, A2 jede andere Aminosäure ist; und
Y eine Gruppe ist, die mit dem aktiven Zentrum der Protease reagiert.
Powers (WO 92/12140) offenbart Peptidketoamide, -ketosäuren und -ketoester und deren Verwendung zur Hemmung von Serinproteasen und Cysteinproteasen.
Bartus et al. (WO 92/1850) offenbaren Verwendungen für Calpain-Hemmstoffverbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten. Eine Verwendung dieser Verbindungen ist zur Behandlung einer neurodegenerativen Pathologie bei einem menschlichen Patienten. Die Offenbarung stellt außerdem weitere Verwendungen und pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die Calpain-Hemmstoffverbindungen, wie Peptidketoamide, Peptidketosäuren und Peptidketoester, enthalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verwendungen von Hemmstoffen einer Proteasom-Funktion oder einer Ubiquitin-Konjugation.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Hemmstoffs einer Ubiquitin-Konjugation zur Herstellung eines Medikaments für eine Verwendung zur Behandlung eines entzündlichen Leidens. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Hemmstoffs einer Peptidase oder einer proteolytischen Aktivität eines 20S-Proteasom- oder 26S-Proteasomkomplexes in der Herstellung eines Medikaments für eine Verwendung bei der Behandlung eines entzündlichen Zustands.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Hemmstoffs einer Proteasom-Funktion oder einer Ubiquitin-Konjugation für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer HIV-Infektion.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Hemmstoffs einer Proteasom-Funktion oder einer Ubiquitin-Konjugation zur Herstellung eines Medikaments zur Ver wendung bei einem Behandlungsverfahren zur Verringerung des zellulären Gehalts und der Aktivität von NF-κB.
Genauer gesagt, hat der erfindungsgemäße Hemmstoff einer Proteasom-Funktion oder einer Ubiquitin-Konjugation die Formel I:
wobei
P eine Aminogruppen schützende Komponente ist,
B¹, B², B³ und B⁹ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus
besteht,
X¹, X² und X³ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus
besteht,
R ein Wasserstoff, ein Alkyl-, Acyl- oder Carboxylrest ist,
R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, einem Alkyl-, Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Arylrest und -CH₂-R⁵ besteht,
wobei R⁵ ein Aryl-, Aralkyl-, Alkaryl-, Cycloalkylrest oder -Y-R⁶ i s t
wobei Y ein Chalkogen ist und R⁶ ein Alkylrest ist und A 0 oder 1 ist.
Die hier angesprochenen "Tiere" sind vorzugsweise Säuger. Beide Ausdrücke sollen Menschen umfassen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt, daß die proteolytische in-vitro-Prozessierung des p60Tth-Vorläufers zu p50 ATP erfordert.
2 ist ein Diagramm, das die Rolle von Ubiquitin und des Proteasoms bei der Bildung von aktivem NF-κB zeigt.
3 zeigt die Prozessierung von p105/p60Tth in an Proteasomen verarmten und mit Proteasomen angereicherten Extrakten.
4 zeigt, daß die immunologische Verarmung an Proteasomen die Prozessierung von NF-κB verhindert.
5 zeigt, daß gereinigte Proteasomen die Prozessierung von p60Tth stimulieren.
6 zeigt, daß das p60Tth-Vorläuferprotein ubiquitiniert ist.
7 zeigt, daß Ubiquitin für die Prozessierung von NF-κB benötigt wird.
8 zeigt, daß eine Prozessierung von p105 in Saccharomyces cerevisiae das Proteasom erfordert.
9 zeigt, daß spezifische Hemmstoffe des Proteasoms die in-vivo-Prozessierung von p105 blockieren.
10 zeigt, daß spezifische Hemmstoffe des Proteasoms eine Aktivierung von NF-κB blockieren.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
NF-κB liegt in einer inaktiven Form im Cytosol im Komplex mit einem Hemmstoffprotein, IκB, vor. Damit NF-κB aktiv wird und seine Funktion ausübt, muß es in den Zellkern eintreten. Dies erfolgt jedoch solange nicht, bis der IκB-Anteil aus dem Komplex entfernt worden ist, ein Prozeß, den der Fachmann als Aktivierung oder Prozessierung von NF-κB bezeichnet. Bei einigen Erkrankungen kann die normale Erfüllung seiner Funktion durch NF-κB für die Gesundheit des Patienten schädlich sein. Wie vorstehend erwähnt, ist NF-κB zum Beispiel für die Expression des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) wesentlich. Folglich kann ein Verfahren, das die Aktivierung von NF-κB bei Patienten verhindert, die an diesen Erkrankungen leiden, therapeutisch von Nutzen sein. Die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzten Hemmstoffe können diese Aktivierung verhindern. Somit kann eine Blockierung der NF-κB-Aktivität oder -Bildung eine wichtige Anwendung in verschiedenen Gebieten der Medizin haben, z.B. bei Entzündung, Sepsis, AIDS und dergleichen.
Genauer gesagt, wird die Aktivität von NF-κB streng reguliert (Grilli et al., International Review of Cytology 143:1-62 (1993); Beg et al., Genes and Development 7:2064-2070 (1993)). NF-κB umfaßt zwei Untereinheiten, p50 und ein weiteres Mitglied der rel-Genfamilie, z.B. p65 (auch als Rel A bekannt). In den meisten Zellen liegen p50 und p65 in einer inaktiven Vorläuferform im Cytoplasma, gebunden an IκB, vor. Zusätzlich wird die p50-Untereinheit von NF-κB durch proteolytische Prozessierung eines 105-kD-Vorläuferproteins NF-κB₁ (p105) erzeugt, und auch diese Prozessierung ist reguliert. Die Sequenz des N-terminalen 50-kD-Abschnitts von p105 ähnelt derjenigen von p65 und anderen Mitgliedern der rel-Genfamilie (die rel-Homologiedomäne). Dagegen besitzen die C-terminalen 55 kD von p105 eine auffallende Ähnlichkeit zu IκB-α (auch als MAD-3 bekannt). Es ist signifikant, daß sich unprozessiertes p105 mit p65 und anderen Mitgliedern der rel-Familie unter Bildung eines p65/p105-Heterodimers zusammenlagern kann. Die Prozessierung von p105 führt zur Bildung von p50, welches das transkriptionsaktive p50/p65-Heterodimer bilden kann. Die C-terminale, zu IκB-α homologe Sequenz von p105 wird nach der Prozessierung schnell abgebaut.
Es gibt ein weiteres rel-ähnliches Protein, NF-κB₂ (p100), das p105 ähnelt und ebenfalls zu einer DNA-bindenden Untereinheit, p52, prozessiert wird (Neri et al., Cell 67:1075 (1991); Schmid et al., Nature 352:733 (1991); Bours et al., Molecular and Cellular Biology 12:685 (1992); Mercurio et al., DNA Cell Biology 11:523 (1992)). Viele der strukturellen und regulatorischen Merkmale von p100 ähneln p105. Zusätzlich kann auch das p100-Protein mit p65 und anderen Mitgliedern der rel-Familie ein Heterodimer bilden.
Zusammengefaßt läßt sich sagen, daß die Transkriptionsaktivität von Heterodimeren, die aus p50 und einem der vielen Proteine der rel-Familie bestehen, wie p65, über mindestens zwei Mechanismen reguliert werden kann. Zuerst lagern sich die Heterodimere mit IκB-α unter Bildung eines inaktiven, ternären, cytoplasmatischen Kom plexes zusammen. Zweitens lagern sich die Mitglieder der rel-Familie mit p105 und p100 unter Bildung inaktiver Komplexe zusammen. Der ternäre Komplex kann durch Dissoziation und Zerstörung von IκB-α aktiviert werden, wohingegen das p65/p105- und das p65/p100-Heterodimer durch Prozessierung von p105 bzw. p100 aktiviert werden können.
Die Dissoziation von IκB-α kann durch eine bemerkenswert große Zahl extrazellulärer Signale eingeleitet werden, wie Lipopolysaccharide, Phorbolester, TNF-α und eine Vielzahl von Cytokinen. IκB-α wird dann schnell abgebaut. Neuere Untersuchungen legen nahe, daß die Prozessierung von p105 und p100 ebenfalls durch zumindest einige dieser extrazellulären Signale eingeleitet werden kann. Weder die zur NF-κB-Aktivierung führenden Signalübertragungswege noch die Mechanismen der IκB-α-Inaktivierung oder der p105/p100-Prozessierung sind aufgeklärt. Also möchten sich die Erfinder nicht auf irgendeine Theorie zu dem (den) Mechanismus (Mechanismen) festlegen lassen, durch welche(n) die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzten Hemmstoffe ihre nützlichen Wirkungen erzielen. Die Erfinder haben klare Befunde zu Wirkungen mit bestimmten Hemmstoffen, welche die hydrophobe Stelle am 20S- (Kern-) Proteasompartikel blockieren, aber es muß beachtet werden, daß es andere wesentliche Stellen an diesem Partikel gibt, das den katalytischen Kern des 26S-Proteasomkomplexes ausmacht. Folglich werden ähnliche Wirkungen mit Hemmstoffen anderer wesentlicher Aktivitäten des Proteasoms erwartet. Die Entfernung des Proteasompartikels durch Ultrazentrifugation oder Immunfällung verhindert die Aktivierung von NF-κB. Es gibt viele andere katalytische Funktionen an diesem Partikel, von denen der Fachmann erwartet, daß auch sie nach ihrer Blockierung dessen Fähigkeit zur Prozessierung von NF-κB und/oder zur Zerstörung von IκB verhindern. Es ist ebenfalls möglich, daß die Wirkungen, die durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Hemmstoffe erzielt werden, durch Hemmung der Ubiquitinierung von NF-κB und/oder IκB erreicht werden können. Tatsächlich haben die Erfinder entdeckt, daß eine Ubiquitin-Konjugation für deren Abbau notwendig ist. Also kann es spezifische E-2- oder E-3-Enzyme geben, die an der Prozessierung von NF-κB und/oder IκB beteiligt sind, wobei man voraussagen kann, daß jeder Hemmstoff der E-1-, E-2- oder E-3-abhängigen Ubiquitin-Konjugation die NF-κB-Aktivierung durch Blockierung des Ubiquitin-Proteasom-Wegs verhindert.
Studien haben gezeigt, daß p105 oder eine verkürzte Form von p105 (p60Tth) in vitro zu p50 prozessiert werden können (Fan et al., Nature 354:395-398 (1991)). Bestimmte Anforderungen und Merkmale dieser in-vitro-Prozessierungsreaktion (z.B. ATP/Mg⁺⁺-Abhängigkeit) deuteten für die Erfinder darauf hin, daß der ATP-abhängige Proteasekomplex des Ubiquitin-vermittelten Proteinabbauwegs beteiligt war (d.h. das Proteasom; Rechsteiner, 1991, Goldberg, Eur. J. Biochem. 203:9-23 (1992); Hershko et al., Annu. Rev. Biochem. 61:761-807 (1992)). Es war jedoch nur bekannt, daß diese Struktur den vollständigen Abbau von Proteinen in kleine, säurelösliche Peptide katalysiert, und es wurde nicht angenommen, daß sie Vorläufer unter Bildung aktiver Proteine, wie p50-NF-κB, prozessieren kann.
Unter Verwendung einer Vielzahl experimenteller Ansätze haben die Erfinder nachgewiesen, daß das Proteasom tatsächlich für die Prozessierung von p105 zu p50 erforderlich ist. Zuerst wurde gefunden, daß die p105/p6OTth-Proteine in cytoplasmatischen Säugerzellextrakten, die an Proteasom-Aktivität verarmt sind, nicht prozessiert werden. Die Zugabe von gereinigten 26S-Proteasomen zu diesen ver armten Extrakten stellt jedoch die Prozessierungsaktivität wieder her. Zweitens blockieren spezifische Hemmstoffe des Proteasoms die Bildung von p50 in Säugerzellextrakten sowie in vivo. Drittens wird Säuger-p105 in Saccharomyces cerevisiae in vivo zu p50 prozessiert, und eine Mutante in der chymotrypsinähnlichen Aktivität des Proteasoms führt zu einer signifikanten Abnahme der p105-Prozessierung. p60Tth wird in vitro ubiquitiniert, und diese Ubiquitinierung ist eine Voraussetzung für die p105-Prozessierung.
Wie vorstehend erwähnt, wird die C-terminale Hälfte von p105 (p105C') bei der Bildung von p50 schnell abgebaut, und die Sequenz von p105C' ist bemerkenswert ähnlich zu derjenigen von IκB. Aufgrund der Ähnlichkeit in den Strukturen und Aktivitäten von p105C' und IκB-α leiteten die Erfinder Studien ein, um zu bestimmen, ob auch das Proteasom an der Inaktivierung von IκB-α beteiligt ist. IκB-α wird als Reaktion auf NF-κB-Induktoren schnell abgebaut, und es wurde gezeigt, daß dieser Abbau für die Aktivierung nötig ist (Mellits et al., Nucleic Acids Research 21(22):5059-5066 (1993); Henkel et al., Nature 365:182-185 (1993); Beg et al., Molecular and Cellular Biology 13(6):3301-3310 (1993)). Die Erfinder haben jetzt gezeigt, daß der IκB-α-Abbau und die Aktivierung von NF-κB tatsächlich durch Hemmstoffe einer Proteasom-Funktion oder einer Ubiquitin-Konjugation blockiert werden.
Also spielt das Proteasom eine wesentliche Rolle bei der Regulation der NF-κB-Aktivität. Erstens ist das Proteasom für die Prozessierung von p105 und möglicherweise p100 erforderlich. Der Abbau des hemmenden C-Terminus kann ebenfalls das Proteasom erfordern. Zweitens scheint das Proteasom für den Abbau von IκB-α als Reaktion auf extrazelluläre Induktoren erforderlich zu sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft vorzugsweise die Verwendung von Hemmstoffen einer Proteasom-Funktion oder einer Ubiquitin-Konjugation der Struktur (1):
wobei
P eine Aminogruppen schützende Komponente ist,
B¹, B², B³ und B⁴ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus
besteht,
X¹, X² und X³ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus
besteht,
R ein Wasserstoff, ein Alkyl-, Acyl- oder Carboxylrest ist,
R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, einem Alkyl-, Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Arylrest und -CH₂-R² besteht,
wobei R⁵ ein Aryl-, Aralkyl-, Alkaryl-, Cycloalkylrest oder -Y-R⁶ ist,
wobei Y ein Chalkogen ist und R⁶ ein Alkylrest ist und A 0 oder 1 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die P-Komponente des Proteasomhemmstoffs (2)
und R⁷ ist ein Alkyl-, Aryl-, Alkaryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Alkaryloxy- oder Aralkoxyrest.
Wenn R⁷ ein Alkylrest ist, ist er vorzugsweise ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylrest oder Isomere davon. Wenn R⁷ ein Alkaryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Alkaryloxy- oder Aralkoxyrest ist, hat außerdem die Alkylkomponente von diesen vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome.
Wenn R⁷ ein Arylrest ist, ist dies vorzugsweise ein Arylrest mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, z.B. ein Phenyl- oder Naphthylrest, die, wenn gewünscht, ringsubstituiert sein können. Wenn R⁷ ein Alkaryl-, Aralkyl-, Aryloxy-, Alkaryloxy- oder Aralkoxyrest ist, hat außerdem die Arylkomponente von diesen vorzugsweise 6 bis 10 Kohlenstoffatome.
Es ist stärker bevorzugt, daß R⁷ ein Alkyl- oder Aralkoxyrest ist, am stärksten bevorzugt ein Methyl- oder Benzyloxyrest ist, d.h.
In der Struktur (1) steht X für eine Peptidbindung oder ein Isoster, das als Ersatz für eine Peptidbindung in den Proteasomhemmstoffen verwendet werden kann, um die biologische Verfügbarkeit zu steigern und den Hydrolysestoffwechsel zu senken. Wie oben erwähnt, kann X
oder -CH=CH- sein. Vorzugsweise ist X
Das Einbringen dieser Komponenten in die Proteasomhemmstoffe ergibt folgendes:
Wenn zum Beispiel gefunden wird, daß Z-Leu-Leu-Leu-H einem schnellen Hydrolysestoffwechsel unter Bildung von Z-Leu-OH und H₂N-Leu-Leu-H unterliegt, kann das Hydroxyethylen-Isoster hergestellt werden, um diese Reaktion zu beseitigen:
Ein weiteres Isoster im Umfang der vorliegenden Erfindung ist das Azapeptid-Isoster. Dies ist das Ergebnis des Austauschs des α-Kohlenstoffatoms einer Aminosäure durch ein Stickstoffatom, z.B.
Wie vorstehend erwähnt, kann A in der Struktur (1) entweder 0 oder 1 sein. Wenn A 0 ist, liegt somit der Aminosäurerest in Klammern nicht vor, und der Hemmstoff ist ein Tripeptid. Wenn A 1 ist, liegt der Aminosäurerest in Klammern vor, und der Hemmstoff ist ein Tetrapeptid. Vorzugsweise ist A 0.
Es ist bevorzugt, daß R¹ und R² in Struktur (1) unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem Alkylrest und -CH₂-R⁵ besteht. Stärker bevorzugt sind R¹ und R² unabhängig aus der Gruppe ausgewählt, die aus Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylgruppen oder Isomeren davon, z.B. Isopropyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl-, t.-Butylgruppen, oder -CH₂-R⁵ besteht, wobei R⁵ ein Cycloalkyl- oder Naphthylrest ist. Es ist stärker bevorzugt, daß mindestens einer der Reste R¹ und R² ein
Isobutylrest,
oder
ist, und am stärksten bevorzugt, daß sowohl R¹ als auch R² Isobutylreste sind.
Wenn R³ ein Alkylrest ist, ist dies vorzugsweise ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylgruppe oder Isomere davon, wobei die Gruppen substituiert oder unsubstituiert sein können.
Wenn R³ ein Arylrest ist, ist dies vorzugsweise ein Arylrest mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, z.B. eine Phenyl- oder Naphthylgruppe, wobei die Gruppen substituiert oder unsubstituiert sein können.
Wenn R³ ein substituierter Alkylrest ist, ist dies vorzugsweise ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, der mit mindestens einer Arylgruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder mindestens einer Cycloalkylgruppe, vorzugsweise einer Cycloalkylgruppe mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, substituiert ist, wobei die Gruppen substituiert oder unsubstituiert sein können.
Wenn R³ ein substituierter Arylrest ist, ist dieser vorzugsweise mit mindestens einer Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert, wobei die Gruppen substituiert oder unsubstituiert sein können.
Wenn R³ ein Cycloalkylrest ist, ist dies vorzugsweise ein Cycloalkylrest mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen, z.B. eine Cyclopentyl- oder Cyclohexylgruppe, wobei die Gruppen substituiert oder unsubstituiert sein können.
Wenn R³ ein substituierter Cycloalkylrest ist, ist dieser vorzugsweise mit mindestens einer Arylgruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder mindestens einer Alkylgruppe, vorzugsweise einer Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, substituiert, wobei die Gruppen substituiert oder unsubstituiert sein können.
Wenn R³ -Y-R⁶ ist, ist Y ein Chalkogen, vorzugsweise Sauerstoff oder Schwefel, stärker bevorzugt Schwefel, und R⁶ ist ein Alkylrest, vorzugsweise ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylrest oder Isomere davon.
R in der vorstehend gezeigten Struktur ist Wasserstoff, ein Alkyl-, Acyl- oder Carboxylrest.
Wenn R ein Alkylrest ist, ist dies vorzugsweise ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylrest oder Isomere davon.
Wenn R ein Acylrest ist, umfaßt dieser vorzugsweise eine Carbonylkomponente, die kovalent an eine Alkylkomponente mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. einen Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylrest oder Isomere davon, die substituiert oder unsubstituiert sein können, gebunden ist.
Wenn R eine Carboxylgruppe ist, ist diese vorzugsweise eine Carboxylgruppe der Struktur [R⁸]_n-COO-, wobei R⁸ ein Alkylenrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. ein Methylen-, Ethylen-, Propylen-, Butylenrest und Isomere davon, ist und n 0 oder 1 ist und wobei das letzte 0 gewöhnlich an eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, die substituiert oder unsubstituiert sein kann, gebunden ist, wodurch ein Ester gebildet wird.
R ist vorzugsweise Wasserstoff, ein Alkyl- oder Carboxylrest, stärker bevorzugt Wasserstoff.
Beispiele für geeignete Proteasomhemmstoffe sind u.a., ohne Beschränkung, die folgenden Verbindungen:
Stärker bevorzugt sind die Proteasomhemmstoffe:
Die vorliegende Erfindung betrifft Verwendungen von Hemmstoffen einer Proteasom-Funktion oder einer Ubiquitin-Konjugation. Bei der vorliegenden Erfindung wird die beschleunigte Proteolyse verhindert, indem der ATP-Ubabhängige Weg an einem oder mehreren möglichen Schritten gestört wird (z.B. indem die Aktivität des 26S-Proteasomkomplexes gestört wird oder die Aktivität einer seiner Komponenten gestört wird).
Ein besonders geeigneter Ansatz zur Untersuchung von Arzneistoffkandidaten bezüglich ihrer Fähigkeit, den ATP-Ubiquitin-abhängigen Abbauprozeß zu hemmen, ist die Durchführung in kultivierten Zellen, in denen ein kurzlebiges Protein gebildet wird, dessen Abbau Ubiquitin-abhängig ist. Die Hemmung dieses Prozesses führt zur Anhäufung des Proteins im Cytosol. Das Ausmaß, in dem sich das Protein im Cytosol anhäuft, kann unter Verwendung bekannter Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein möglicher Hemmstoff des Prozesses in kultivierte Zellen, die ein kurzlebiges Enzym produzieren, eingebracht werden, und das Ausmaß, in dem das Enzym im Cytosol in Anwesenheit des potentiellen Hemmstoffs vorliegt, kann mit dem Ausmaß verglichen werden, in dem es in dessen Abwesenheit vorliegt. Die Anhäufung des Enzyms in Anwesenheit des potentiellen Hemmstoffs zeigt eine Hemmung des ATP-Ubiquitin-abhängigen Prozesses durch den getesteten potentiellen Hemmstoff an. Kultivierte Zellen, wie COS-Zellen, die stabil mit einem Gen transformiert sind, das ein kurzlebiges Protein codiert, dessen Abbau Ubiquitin-abhängig ist (z.B. ein kurzlebiges Enzym, wie eine mutierte β-Galactosidase aus E. coli, deren Halbwertszeit etwa 15 Minuten beträgt und deren Abbau Ubiquitinabhängig ist), können verwendet werden (Bachmair, A. et al., Science 234:179-186 (1986); Gonda, D.K. et al., J. Biol. Chem. 264:16700-16712 (1989)). Andere mutierte Formen von Enzymen, die schnell abgebaut werden, können ebenfalls verwendet werden. Die Anhäufung der mutierten β-Galactosidase in COS-Cytosol in Anwesenheit einer Substanz, die auf ihre Fähigkeit zur Hemmung des Prozesses getestet wird (eines potentiellen Hemmstoffs), zeigt die Hemmung des Prozesses an. Eine geeignete Kontrolle sind COS-Zellen, die unter den gleichen Bedingungen, aber in Abwesenheit des potentiellen Hemmstoffs gehalten werden. Dieser Ansatz läßt sich für das Screening nach wirksamen Hemmstoffen aus Mikroben-Brühen oder chemischen Banken verwenden.
Die Tabellen I-III fassen die Ergebnisse von kinetischen Experimenten zusammen, welche die Hemmung der 20S- und 26S-Proteasomen sowie von Cathepsin B und Calpain maßen. In diesen Tabellen sind K_i-Werte genannt, welche die Dissoziationskonstanten für das Gleichgewicht sind, das sich einstellt, wenn Enzym und Hemmstoff miteinander unter Bildung des Enzym:Hemmstoff-Komplexes in Wechselwirkung treten.
Die Substanzen und Testbedingungen sind in den Fußnoten zu Tabelle I kurz zusammengefaßt. MG 101 und MG 102, auch als Calpain-Hemmstoff I und II bekannt, wurden als Katalogprodukte von Calbiochem bezogen.
Hauptpunkte der Tabellen I-III:

(1) Die Kettenlänge des Peptids ist für die Hemmstoffstärke gegenüber dem 20S-Proteasom von Bedeutung: vergleiche K_i von 47 nM für Z-Leu-Leu-Nle-H (MG 114) mit K_i von 15.000 nM für Z-Leu-Nle-H (MG 105; hergestellt von Calbiochem als Katalogprodukt, nicht in den Tabellen gezeigt).
(2) Die Stärke gegenüber dem 20S-Proteasom steigt außerdem mit steigender Hydrophobie der N-terminalen Blockierungsgruppe: vergleiche K_i von 47 nM für Z-Leu-Leu-Nle-H (MG 114) mit K_i von 140 nM für Ac-Leu-Leu-Nle-H (MG 101).
(3) In der Reihe der Verbindungen in Tabelle II, in der die Länge der unverzweigten Alkylkette an der P₁-Position monoton erhöht wird (MG 118 (Wasserstoff), MG 111 (Methyl), MG 119 (Ethyl), MG 115 (n-Propyl) und MG 114 (n-Butyl)) tritt maximale Stärke mit Z-Leu-Leu-Nva-H (MG 115) auf.
(4) Die Hemmstoffstärke gegenüber dem 26S-Proteasom ist immer kleiner als die Stärke gegenüber dem 20S-Proteasom. Der Unterschied ist am kleinsten für Z-Leu-Leu-Nva-H (MG 115; K_i,20S = 21 nM und K_i,23S = 78 nM), Z-Leu-Leu-Nal-H (MG 121; K_i,20S = 25 nM und K_i,26S = 70 nM) und Z-Leu-Leu-Phe-C(O)-OMe (MG 113; K_i,20S = 690 nM und K_i,26S = 1.300 nM).
(5) Die getesteten Peptidaldehyde hemmen Cathepsin B und Calpain stärker als das 20S- und das 26S-Proteasom, mit Ausnahme von zwei Hemmstoffen mit großen, hydrophoben P₁-Resten, Z-Leu-Leu-Phe-H und Z-Leu-Leu-Nal-H (MG 110 bzw. MG 121).

Die Daten zeigen auch, daß MG 101 ein Hemmstoff der ATP-abhängigen 26S-Protease und ein Hemmstoff des Proteasoms (Macropain, multikatalytische Protease) ist (Tabelle IV).
Die Hemmstoffe können in vitro oder in vivo verwendet werden. Sie können auf jede Anzahl bekannter Wege, einschließlich oral, intravenös, intramuskulär, topisch und durch Infusion, verabreicht werden (Platt et al., U.S.-Patent Nr. 4.510.130; Badalamente et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5983-5987 (1989); Staubli et al., Brain Research 444:153-158 (1988)) und werden gewöhnlich in Kombination mit einem physiologisch verträglichen Träger (z.B. physiologischer Kochsalzlösung) verabreicht. Die wirksame Menge Hemmstoff, die verabreicht wird, wird empirisch bestimmt und basiert auf Überlegungen, wie dem besonderen verwendeten Hemmstoff, dem Zustand des Individuums und der Größe und dem Gewicht des Individuums. Sie können allein oder in Kombination mit einem anderen Hemmstoff oder einem Hemmstoff für einen anderen Weg verabreicht werden.
Tabelle V faßt Daten zur Hemmung des 20S-Proteasoms durch verschiedene Tripeptidaldehyd-Hemmstoffe zusammen.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt durch die nachstehenden Beispiele veranschaulicht, die in keiner Weise beschränkend sein sollen.
Beispiele 1 bis 3
Herstellung von Peptidylaldehyden
Alle Peptidyl-N,O-dimethylhydroxylamide wurden unter Verwendung des Lösungsphase-Verfahrens mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid als Kupplungsreagens hergestellt (Sheehan et al., J. Am. Chem. Soc. 87:2492-2493 (1965)). Die Reduktion des Hydroxylamids mit Lithiumaluminiumhydrid lieferte das Peptidylaldehyd (Fehrentz et al., Synthesis:676-678 (1983); Fehrentz et al., Int. J. Peptide Protein Res. 26:236-241 (1985)). Alle Verbindungen werden mittels magnetischer Protonen-Kernresonanz- (NMR-) Spektroskopie charakterisiert. Die Reinheit der Produkte wurde durch Dünnschichtchromato graphie und in einigen Fällen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestätigt.
Beispiel 1
Herstellung von Z-L-Leucin-L-Leucin-L-Norvalinal
a) Boc-L-Norvalin-N,O-dimethylhydroxylamid
1-Ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (443 mg) wurde auf einmal zu einem Gemisch von N-Boc-L-Norvalin-dicyclohexylammoniumsalz (838 mg), N,O-Dimethylhydroxylaminhydrochlorid (215 mg), 1-Hydroxybenzotriazolmonohydrat (340 mg) und N-Methylmorpholin (0,28 ml) in Dimethylformamid (DM F, 20 ml) bei 0 °C gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0 °C, dann 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde mit Wasser (80 ml) gequencht, und das Gemisch wurde mit Ethylacetat (EtOAc, 3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 10%iger wäßriger Salzsäure (HCl), gesättigtem Natriumbicarbonat (NaHCO₃) und Salzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat (MgSO₄) getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt (546 mg) als Öl erhalten wurde.
b) Z-L-Leucin-L-Leucin-L-Norvalin-N,O-dimethylhydroxylamid
Eine Lösung von N-Boc-L-Norvalin-N,Odimethylhydroxylamid (546 mg) und Trifluoressigsäure (8 ml) in Methylenchlorid (20 ml) wurde 3 Stunden bei 0 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und der Rückstand unter Vakuum getrocknet. In dieses Gefäß wurden Z-L-Leucin-L-Leucin (794 mg), 1-Hydroxybenzotriazolmonohydrat (340 mg), N-Methylmorpholin (0,28 ml) und DMF (20 ml) gegeben. 1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (442 mg) wurde dann bei 0 °C hinzugefügt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0 °C, dann 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde mit Wasser (40 ml) gequencht, und das Gemisch wurde mit EtOAc (3 × 60 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 10%iger wäßriger HCl, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt (1,09 g) als weißer Feststoff erhalten wurde.
c) Z-L-Leucin-L-Leucin-L-Norvalinal
Eine Lösung von Z-L-Leucin-L-Leucin-L-Norvalin-N,O-dimethylhydroxylamid (1,09 g) wurde in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) gelöst und auf 0 °C abgekühlt. Lithiumaluminiumhydrid (1 M Lösung in THF, 3,05 ml) wurde hinzugefügt und das Gemisch 25 Minuten bei 0 °C gerührt. Kaliumbisulfat (465 mg) in 20 ml Wasser wurde hinzugefügt und das Gemisch mit EtOAc (3 × 80 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 5%iger wäßriger HCl, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt (430 mg) als weißer Feststoff erhalten wurde.
Beispiel 2
Herstellung von Z-L-Leucin-L-Leucin-L-Leucinal
a) Boc-L-Leucin-N,O-dimethylhydroxylamid
Ein Gemisch von N-Boc-L-Leucin-L-Leucin (1 g), N,O-Dimethylhydroxylaminhydrochlorid (423 mg), 1-Hydroxybenzo-triazolmonohydrat (509 mg) und N-Methylmorpholin (0,42 ml) wurde in DMF (20 ml) gelöst. 1- Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimidhydrochlorid (610 mg) wurde bei 0 °C für 2 Stunden, dann 40 Stunden bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die Umsetzung wurde mit Wasser (80 ml) gequencht, und das Gemisch wurde mit EtOAc (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 10%iger wäßriger HCl, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt (923 mg) als weißer Feststoff erhalten wurde.
b) Z-L-Leucin-L-Leucin-L-Leucin-N,O-dimethylhydroxylamid
Eine Lösung von N-Boc-L-Leucin-L-Leucin-N,O-dimethylhydroxylamid (923 mg) und Trifluoressigsäure (10 ml) in Methylenchlorid (20 ml) wurde 3 Stunden bei 0 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und der Rückstand unter Vakuum getrocknet. Ein Teil dieses Produkts (488 mg) wurde in ein anderes Gefäß überführt und mit Z-L-Leucin (451 mg), 1-Hydroxybenzotriazolmonohydrat (276 mg), N-Methylmorpholin (0,22 ml) und DMF (15 ml) vereinigt. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (357 mg) wurde dann bei 0 °C hinzugefügt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0 °C, dann 42 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde mit Wasser (50 ml) gequencht, und das Gemisch wurde mit EtOAc (3 × 60 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 10%iger wäßriger HCl, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt als weißer Feststoff erhalten wurde. Dieser wurde mittels Silicagelchromatographie (Hexan/Aceton 80:20, 70:30) weiter gereinigt, wobei die Titelverbindung (546 mg) als weißer Feststoff erhalten wurde.
c) Z-L-Leucin-L-Leucin-L-Leucinal
Eine Lösung von Z-L-Leucin-L-Leucin-L-Leucin-N,O-dimethylhydroxylamid (546 mg) wurde in 15 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) gelöst und auf 0 °C abgekühlt. Lithiumaluminiumhydrid (1 M Lösung in THF, 4,1 ml) wurde hinzugefügt und das Gemisch 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Kaliumbisulfat (1,39 g) in 30 ml Wasser wurde hinzufügt und das Gemisch mit EtOAc (3 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 5%iger wäßriger HCl, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt (446 mg) als weißer Feststoff erhalten wurde. Dieser wurde mittels Umkehrphasen-HPLC (Wasser/Acetonitril) weiter gereinigt.
Beispiel 3
Herstellung von Z-L-(2-Naphthyl)-Alanin-L-(1-Naphthyl)-Alanin-L-Leucinal
a) Boc-L-Leucin-N,O-dimethylhydroxylamid
Ein Gemisch von N-Boc-L-Leucin (2,47 g), N,O-Dimethylhydroxylaminhydrochlorid (1,09 g), 1-Hydroxybenzotriazolmonohydrat (1,51 g) und N-Methylmorpholin (1,21 ml) wurde in DMF (40 ml) gelöst, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (2,14 g) wurde bei 0 °C hinzugefügt und das Gemisch für 2 Stunden bei 0 °C, dann 22 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde mit Wasser (100 ml) gequencht, und das Gemisch wurde mit EtOAc (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 10%iger wäßriger HCl, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt (2,57 g) als Öl erhalten wurde.
b) Boc-L-(1-Naphthyl)-Alanin-L-Leucin-N,O-dimethylhydroxylamid
Eine Lösung von N-Boc-L-Leucin-N,O-dimethylhydroxylamid (983 mg) und Trifluoressigsäure (8 ml) in Methylenchlorid (20 ml) wurde 3 Stunden bei 0 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und der Rückstand unter Vakuum getrocknet. Ein Teil dieses Produktes (208 mg) wurde in ein anderes Gefäß überführt und mit Boc-L-(1-Naphthyl)-Alanin (378 mg), 1-Hydroxybenzotriazolmonohydrat (178 mg), N-Methylmorpholin (0,15 ml) und DMF (10 ml) vereinigt. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (241 mg) wurde dann bei 0 °C hinzugefügt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0 °C, dann 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde mit Wasser (20 ml) gequencht, und das Gemisch wurde mit EtOAc (3 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 10%iger wäßriger HCl, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO₉ getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt als weißer Feststoff (459 mg) erhalten wurde.
c) Z-L-(2-Naphthyl)-Alanin-L-(1-Naphthyl)-Alanin-L-Leucin-N,O-dimethylhydroxylamid
Eine Lösung von Boc-L-(1-Naphthyl)-Alanin-L-Leucin-N,O-dimethylhydroxylamid (459 mg), Trifluoressigsäure (5 ml) und Thioanisol (2 ml) wurde 2,5 Stunden bei 0 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand unter Vakuum getrocknet. Ein Teil dieses Produkts (182 mg) wurde in ein anderes Gefäß überführt und mit Z-L-(2-Naphthyl)-Alanin (171 mg), 1-Hydroxybenzotriazolmonohydrat (99 mg), N-Methylmorpholin (0,08 ml) und DMF (10 ml) vereinigt. 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (112 mg) wurde dann bei 0 °C hinzugefügt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0 °C, dann 41 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde mit Wasser (20 ml) gequencht, und das Gemisch wurde mit EtOAc (3 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit l0%iger wäßriger HCl, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt als weißer Feststoff erhalten wurde. Dieser wurde dann mittels Silicagelchromatographie (Hexan/Aceton 80:20, 70:30) gereinigt, wobei die Titelverbindung (321 mg) erhalten wurde.
d) Z-L-(2-Naphthyl)-Alanin-L-(1-Naphthyl)-Alanin-L-Leucinal
Z-L-(2-Naphthyl)-Alanin-L-(1-Naphthyl)-Alanin-L-Leucin-N,O-dimethylhydroxylamid (321 mg) wurde in 15 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) gelöst und auf 0 °C abgekühlt. Lithiumaluminiumhydrid (1 M Lösung in THF, 1,7 ml) wurde hinzugefügt und das Gemisch 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Kaliumbisulfat (0,59 g) in 30 ml Wasser wurde hinzufügt und das Gemisch mit EtOAc (3 × 40 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 5%iger wäßriger HCl, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt (274 mg) als weißer Feststoff erhalten wurde.
Beispiel 4
Proteolytische in-vitro-Prozessierung des p60Tth-Vorläufers zu p50 erfordert ATP
Der p60Tth-Vorläufer (oder p105) wurde in Weizenkeimextrakt translatiert. Das Substratprotein wurde mit Cy toplasmaextrakt (5100) aus HeLa-Zellen in einem Prozessierungspuffer gemischt, der 12 mM Tris, pH 7,5, 60 mM KCl, 20 mM Kreatinphosphat, 3,5 mM MgCl₂ und 1 mM ATP enthielt. Nach Inkubation bei 30 °C für eine Stunde wurden die Reaktionsgemische einer Immunfällung mit anti-p50-Ak unterworfen und die Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt. In der Apyrase-behandelten Probe wurde p60 mit 10 U Enzym 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, um restliches ATP im Weizenkeimextrakt vor der Zugabe von HeLa-Zell-S100 zu inaktivieren. Die Kontrollprobe erhielt weder Enzym noch ATP. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Beispiel 5
Prozessierung von p105/p60 Tth in an Proteasomen verarmten und mit Proteasomen angereicherten Extrakten
HeLa-Zell-S100 wurde sechs Stunden bei 100.000 × g zentrifugiert, um Proteasomen zu entfernen. Der Verlust der Proteasom-Aktivität wurde unter Verwendung eines für das Proteasom spezifischen Tests mit einem fluorogenen Peptid bestätigt. Die Ergebnisse von zwei verschiedenen verarmten Extrakten [Pr^–(I & II)] sind gezeigt. Das Sediment enthält den größten Teil der Proteasom-Aktivität. Die Prozessierungsreaktionen wurden wie im Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, und die Umsetzungen wurden entweder mit anti-p50-Ak oder anti-myc-Peptid-mAk immungefällt. Der anti-myc-mAk erkennt das N-terminale myc-Peptid an einem markierten p60-Vorläuferprotein. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
Beispiel 6
Immunologische Verarmung an Proteasom hemmt die Prozessierung von NF-κB₁
Monoklonale Antikörper gegen spezifische Bestandteile des Proteasoms (MCP20, 29K) und ein Kontroll-mkAk gegen Hämagglutinin (HA 12CA5) wurden mit Pr^–(II)-Extrakt inkubiert, der mit der Proteasom-Aktivität aus dem Sediment rekonstituiert worden war. Die Immunkomplexe wurden entfernt, und die verarmten Extrakte wurden wie in Beispiel 4 beschrieben bei p60-Prozessierungsreaktionen eingesetzt. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Beispiel 7
Gereinigte Proteasomen stimulieren die Prozessierung von p60Tth
Steigende Mengen gereinigte 20/26S-Proteasomen oder eine mit Proteasomen angereicherte Fraktion aus Reticulozytenlysat, Fraktion II, wurden in einer Prozessierungsreaktion allein zugegeben oder mit Pr^–(II)-Extrakt kombiniert (siehe Beispiel 4). Zusätzlich wurde die Prozessierung durch ATPγS gehemmt, ein nicht hydrolysierbares Analogon von ATP, welches die Ubiquitinierung ermöglicht, aber die Proteasom-Funktion hemmt (Spuren 3-5). Siehe 5.
Beispiel 8
Das p60Tth-Vorläuferprotein ist ubiquitiniert
In diesem Beispiel und in den vorstehend beschriebenen gibt es leiterähnliche Banden, die auftreten, wenn das Substrat mit Extrakten inkubiert wird, die keine Proteasom-Aktivität aufweisen (Pr^–). Die Ubiquitinierung von p60 ist ausgeprägter, wenn in einer Prozessierungsreaktion 7,5 μg gereinigtes Ubiquitin (ub) zum Pr^–(II)-Extrakt gegeben wird (Spur 5). Siehe 6.
Beispiel 9
Ubiquitin ist zur Prozessierung von NF-κB₁ erforderlich
A. Verschiedene Mengen Reticulozyten-Fraktion II (+/– 7,5 μg ub) wurden in einer Prozessierungsreaktion (siehe Beispiel 4) mit p60 als Substrat eingesetzt. Fraktion II hat Proteasom-Aktivität, aber sehr wenig Ubiquitin.
B. HeLa-Zell-S100 oder Fraktion II wurden mit einem rekombinanten Wildtyp-ub aus E. coli oder einem mutierten ub(L > R48)-Protein ergänzt, welches die Bildung der ub-Kette hemmt. Die Prozessierungsreaktionen erfolgten wie vorstehend.
Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
Beispiel 10
Prozessierung von p105 in Saccharomyces cerevisiae erfordert das Proteasom
Wildtyp- (PRE 1-) und im Proteasom mutierte (prel-1-) Hefe wurden mit menschlichem p105 transformiert. Die Transformanten erhielten für 20 Minuten einen Puls mit ³⁵S-Methionin/Cystein, und für verschiedene Zeiten wurde ein Chase mit kaltem Methionin/Cystein durchgeführt. Es wurden Extrakte hergestellt, die Lysate wurden mit anti-p50-Ak immungefällt, und die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.

Claims

Verwendung eines Hemmstoffs einer Ubiquitin-Konjugation für die Herstellung eines Medikaments für eine Verwendung bei der Behandlung eines entzündlichen Zustands.
Verwendung eines Hemmstoffs einer Peptidase oder einer proteolytischen Aktivität eines 20S-Proteasom- oder 26S-Proteasomkomplexes in der Herstellung eines Medikaments für eine Verwendung bei der Behandlung eines entzündlichen Zustands.
Verwendung eines Hemmstoffs einer Proteasom-Funktion oder einer Ubiquitin-Konjugation für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer HIV-Infektion.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 eines Hemmstoffs der Formel I
wobei P eine Aminogruppen schützende Komponente ist, B¹, B², B³ und B⁴ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus
und
besteht, X¹, X², X³ und X⁴ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus
-CH₂-NH-,

und -CH=CH- besteht, R ein Wasserstoff, ein Alkyl-, Acyl- oder Carboxylrest ist, R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, einem Alkyl-, Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Arylrest und -CH₂-R⁵ besteht; R⁵ ein Aryl-, Aralkyl-, Alkaryl- Cycloalkylrest oder -Y-R⁶ ist; Y ein Chalkogen ist, R⁶ ein Alkylrest ist und A 0 oder 1 ist.
Verwendung nach Anspruch 4 eines Hemmstoffs der Formel I, wobei P
ist und R⁷ ein Alkyl-, Aryl-, Alkaryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Alkaryoxy- oder Aralkoxyrest ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 und 5 eines Hemmstoffs der Formel I, wobei X¹, X² und X³
sind.
Verwendung nach Anspruch 6 eines Hemmstoffs der Formel I, wobei A 0 ist und B¹, B² und B³
sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7 eines Hemmstoffs der Formel I, wobei R¹ und R² unabhängig aus der aus einem Alkylrest und -CH₂-R⁵ bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei R⁵ ein Cyclohexyl- oder Naphthylrest ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8 eines Hemmstoffs der Formel I, wobei R¹ und R² Isobutylreste sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 eines Hemmstoffs, der aus den folgenden ausgewählt ist: Ac-Leu-Leu-Nle-H

wobei:
Nle = Norleucin Nva = Norvalin Nal = Naphthylalanin.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 eines Hemmstoffs, der aus den folgenden ausgewählt ist: Ac-Leu-Leu-Met-H Z-Leu-Leu-Phe-H (wobei Z und Ac wie in Anspruch 7 definiert sind).
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 eines Hemmstoffs, der aus den folgenden ausgewählt ist:
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 eines Hemmstoffs, der aus den folgenden ausgewählt ist:
Verwendung nach einem der voranstehenden Ansprüche eines spezifischen Hemmstoffs eines 20S-Proteasom- oder 26S-Proteasomkomplexes.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche eines Hemmstoffs einer Ubiquitin-Konjugation von NF-κB oder IκB.