DE69527194T2

DE69527194T2 - Liposomen enthaltend ein röntgen- oder ultraschallkontrastmittel

Info

Publication number: DE69527194T2
Application number: DE69527194T
Authority: DE
Inventors: Arne Berg; Thorfinn Ege; Trond Vegard Jacobsen; Hiroshi Kikuchi; Klaveness; Pal Rongved; Kiyoto Yachi
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd; Nycomed Imaging AS
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd; GE Healthcare AS
Priority date: 1994-03-28
Filing date: 1995-03-27
Publication date: 2003-02-06
Anticipated expiration: 2015-03-28
Also published as: AU2076895A; US5676928A; WO1995026205A1; EP0752889B1; CN1148812A; EP0752889A1; DE69527194D1; CA2185810A1; IL113139A0; ATE219688T1; ZA952485B

Description

Diese Erfindung betrifft diagnostische Zusammensetzungen zur Injektion, enthaltend Liposome, welche ein oder mehrere Abbildungsmittel einkapseln.
Kontrastmittel werden verwendet, um eine Abbildungsverstärkung auf einer Vielzahl von Gebieten der diagnostischen Abbildung zu bewirken, wobei die wichtigsten hiervon die Röntgenabbildung, Magnetresonanzabbildung (MRI), Ultraschallabbildung und Nuklearmedizinabbildung sind.
Bei der Röntgenabbildung, einschließlich Anwendungen wie Computertomographie (CT) und digitale Subtraktionsangiographie (DSA), basiert der Kontrast auf Unterschieden in der Elektronendichte. Gegenwärtig verwendete Röntgenkontrastmittel basieren im allgemeinen auf schweren Elementen und schließen Bariumsalze wie Bariumsulfat, welche verwendet werden können, um die Sichtbarmachung des Magen-Darm-Systems zu verbessern, und iodierte Kontrastmittel, welche bei der Sichtbarmachung des Magen- Darm-Systems und in parenteralen Studien verwendet werden können, ein.
Iodierte Röntgenkontrastmittel enthalten sehr häufig iodierte Phenylgruppen, welche typischerweise mindestens eine 2,4,6-Triiodophenylgruppe besitzen, die in der 3- und/oder 5-Position Gruppen aufweist, gewählt aus Carboxyl, Carbamoyl, N-Alkylcarbamoyl, N-Hydroxyalkylcarbamoyl, Acylamino, N-Alkylacylamino und Acylaminomethyl. Ionische Röntgenkontrastmittel dieses Typs schließen Metrizoesäure, Diatriazoesäure, Iothalaminsäure, Ioxaglinsäure und Salze dieser Säuren ein.
Nichtionische iodierte Röntgenkontrastmittel, welche aufgrund ihrer geringeren Osmolalität und den sich daraus ergebenden reduzierten hämodynamischen Wirkungen im allgemeinen im wesentlichen weniger toxisch als die ionischen Mittel sind, schließen Iohexol, Iopentol, Iopamidol, Iodixanol, Iopromid, Iotrolan und Metrizamid ein. Darin eingeschlossen sind auch die sogenannten Dimere, wie zum Beispiel Iodixanol und Iotrolan, welche aufgrund ihrer Osmolalität formuliert werden können, so daß sie mit Blut in Konzentrationen von 300 mg I/ml oder darüber isotonisch sind.
In letzter Zeit richtete sich das Interesse auf parenterale Röntgenkontrastmittel auf der Basis von Schwermetallclustern/Chelaten - vgl. zum Beispiel WO-A-9114460 und WO-A-9217215.
Im Hinblick auf ihre hydrophile Natur weisen sämtliche der vorstehend erwähnten Röntgenkontrastmittel ungefähr die gleiche extrazelluläre Bioverteilung auf und zeigen deshalb ähnliche klinische Indikationen und werden über die Niere ausgeschieden. Daher wurden Versuche durchgeführt, organspezifischere Kontrastmittel zu finden. So wurden zum Beispiel iodierte Phenylgruppen an makromolekulare Substrate wie Stärke in der Hoffnung gebunden, die vaskuläre Halbwertszeit von iodierten Kontrastmitteln zu verbessern.
Mögliche Leberkontrastmittel basierend auf bioabbaubaren Teilchen sind angeregt worden (vgl. zum Beispiel WO-A-8900988 und WO-A-9007491), und Liposomen, enthaltend entweder ionische oder nichtionische Röntgenkontrastmittel, sind vorgeschlagen worden. Kein solches Mittel ist bisher infolge von Stabilitäts- oder Toxizitätsproblemen auf den Markt gebracht worden oder hat das Stadium der späten klinischen Entwicklung erreicht, und so gibt es einen nicht erfüllten Bedarf an stabileren, nichttoxischen und organspezifischen Röntgenkontrastmitteln.
Liposomale Kontrastmedien zur Verwendung bei der Ultraschallabbildung sind in WO 90/04943 und WO 91/09629 beschrieben, welche beide Gas einkapselnde Liposomen offenbaren, und WO 91/09629 offenbart eine Reihe von Materialien, aus denen die Gas- Lipid-Membran in solchen Liposomen gebildet werden kann.
Die Ultraschallabbildung basiert auf dem Eindringen von Ultraschallwellen, z. B. im Frequenzbereich von 1-10 MHz, in einen Menschen oder ein Tier mit Hilfe eines Meßwandlers, wobei die Ultraschallwellen mit den Grenzflächen von Körpergeweben und -flüssigkeiten interagieren. Der Kontrast in einer Ultraschallabbildung resultiert aus einer unterschiedlichen Reflektion/Absorption der Schallwellen an solchen Grenzflächen; die Ergebnisse können durch die Anwendung von Dopplertechniken, einschließlich der Anwendung eines Farb-Dopplerverfahrens zur Beurteilung des Blutflusses, verbessert werden.
Es ist lange bekannt gewesen, daß es vorteilhaft sein kann, den Unterschied der akustischen Eigenschaften verschiedener Gewebe/Flüssigkeiten unter Verwendung von Kontrastmitteln zu verstärken, und seit der Verwendung von Indocyaningrün im Jahr 1968 als das erste Ultraschallkontrastmittel sind viele andere mögliche, einen Kontrast hervorrufende Mittel untersucht worden. Diese schließen Emulsionen, feste Teilchen, wasserlösliche Verbindungen, frei Gasblasen und verschiedene Arten von Systemen, enthaltend eingekapseltes Gas, ein. Es ist allgemein anerkannt, daß Kontrastmittel mit niedriger Dichte, welche ohne weiteres komprimierbar sind, im Hinblick auf die akustische Rückstreuung, die sie erzeugen, besonders wirksam sind; gashaltige und gaserzeugende Systeme pflegen folglich eine deutlich größere Wirksamkeit als andere Arten von Kontrastmitteln zu zeigen.
Drei Ultraschallkontrastmittel sind nun im Handel erhältlich oder in der späten klinischen Entwicklung, diese sind Echovist®, welches auf Gas enthaltenden Galactosemikrokristallen basiert; Levovist®, umfassend Gas enthaltende Galactosemikrokristalle, überzogen mit einer Fettsäure; und Infoson®, welches Gasblasen umfaßt, welche durch teilweise denaturiertes menschliches Serumalbumin eingekapselt sind. Die klinische Anwendung dieser Mittel ist jedoch durch ihre kurzen Kontrast-Halbwertszeiten (d. h. durch ihre relative mangelnde Stabilität in vivo) und/oder ihre begrenzte Haltbarkeit begrenzt.
Demgemäß besteht weiterhin ein Bedarf an Ultraschallkontrastmitteln, besonders für kardiale und nichtkardiale Perfusionsstudien, welche eine gute Lagerstabilität mit einer Stabilität in vivo, vorzugsweise während mindestens mehreren Blutkreislaufdurchgängen im Fall einer kardialen und nichtkardialen Perfusionsanalyse, kombinieren.
Trotz der zahlreichen Veröffentlichungen, welche die Verwendung von Liposomenformulierungen und andere Techniken zur Erhöhung der Gewebe- und Organspezifität verschiedener Arten von Kontrastmitteln vorschlagen, weisen diese alle Nachteile auf, und es sind gegenwärtig keine Produkte dieses Typs auf dem Markt oder in der späten klinischen Entwicklung. Dies könnte das Ergebnis von Problemen sein, einschließlich einer geringen Einkapselungseffizienz, Toxizität, unzureichenden Haltbarkeit und/oder Instabilität in vivo oder einer kurzen Kontrast-Halbwertszeit; zusätzlich weisen einige der gegenwärtigen Produkte sehr komplexe Zusammensetzungen auf. Somit besteht weiterhin ein Bedarf an Kontrastmitteln, welche diese Probleme lösen. Auf dem Gebiet der Ultraschallabbildung besteht ein besonderer Bedarf an Kontrastmitteln, welche eine ausreichend hohe in vivo-Stabilität zur Verwendung bei der kardialen und nichtkardialen Perfusion zeigen, sowie an Mitteln, welche ausreichend stabil sind, um eine wirksame Leberabbildungsdiagnose zu ermöglichen.
Im allgemeinen werden lipidlösliche Arzneistoffe leicht in Liposome aufgenommen. Andererseits können von den wasserlöslichen Arzneistoffen wasserlösliche Elektrolyte in die innere wäßrige Phase in Liposomen durch die elektrostatische Wechselwirkung zwischen der Ladung des Arzneistoffes und dem geladenen Lipid (Japanische Patentanmeldung Nr. 2-187370) oder durch einen pH-Gradienten zwischen der Außenseite und der Innenseite eines Liposoms (WPI 88-271022/38) eingekapselt werden.
Unter Anwendung der obigen Verfahren ist die Menge des eingekapselten Arzneistoffes jedoch gering. Außerdem, wenn der Arzneistoff ein wasserlöslicher nichtelektrolytischer Stoff ist, kann das oben erwähnte Verfahren nicht angewendet werden, und daher ist es nicht ohne weiteres effizient, einen wasserlöslichen Nichtelektrolyt in Liposomen einzukapseln. Als ein Mittel zur wirksamen Einkapselung eines wasserlöslichen Nichtelektrolyts in die innere wäßrige Phase von Liposomen sind Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75(9) (1978), S. 4194), Ether-Injektionsverfahren (ibid, Bd. 443 (1975), S. 629) und ähnliche vorgeschlagen worden.
Da solche Verfahren jedoch einen Ether mit einem niedrigen Entzündungspunkt verwenden, können diese Verfahren nicht zur industriellen Herstellung von großen Mengen an Liposomen angewendet werden.
Die Internationale Patentanmeldung WO 88/09165 beschreibt Liposomenzubereitungen zur Injektion, enthaltend eine Röntgenkontrastmittellösung innerhalb der Liposomen und eine gepufferte, physiologische, kontinuierliche Salzlösungsphase, worin die Liposomen suspendiert sind. Obwohl die Liposomen in einem wäßrigen Medium, enthaltend das Röntgenkontrastmittel zur Injektion, gebildet werden, werden sie durch Zentrifugation isoliert und in dem Puffer resuspendiert. Es wäre sehr vorteilhaft, wenn die Liposomenzubereitung autoklaviert werden könnte, um sterile Zusammensetzungen zur Injektion vorzusehen, da die Herstellung der Formulierung aus den separaten Komponenten der Mischung unter aseptischen Bedingungen teuer und unzuverlässig ist; obwohl die Liposomensuspension im Prinzip sterilfiltriert werden kann, ist dies in der Praxis nur anwendbar, wenn die gesamte Teilchengrößenverteilung unter 0,22 um liegt. Mit wenigen Ausnahmen jedoch war das Autoklavieren von Liposomensuspensionen bisher nicht erfolgreich, das es eine Phasenübergangstemperatur (Tc) gibt, welche deutlich unter den Autoklaventemperaturen (etwa 121ºC) liegt; solche Ausnahmen treten auf, wenn der eingekapselte gelöste Stoff und die Lipiddoppelschichten entgegengesetzte Ladungen aufweisen, wie durch Kikuchi et al. in Chem. Pharm. Bull. 39(4) (1991), S. 1018-1022, berichtet wird. So haben die Anmelder festgestellt, daß beim Autoklavieren von Liposomenzubereitungen, wie solche von WO 88/09165, worin das Röntgenkontrastmittel nur innerhalb der Liposomen vorliegt, das Röntgenkontrastmittel aus dem Inneren der Liposomen entweicht. Sie stellten weiterhin fest, daß dieses Problem durch das Autoklavieren der Liposomen in einer kontinuierlichen Phase, worin die Konzentration des gelösten Röntgenkontrastmittels außerhalb der Liposomen im wesentlichen gleich der innerhalb der flüssigen Phase ist, vermieden werden kann. Eine solche Autoklavierung wird normalerweise in einem hermetisch abgeschlossenen Gefäß durchgeführt, welches nach dem Abkühlen und während der Lagerung verschlossen bleibt, bis es unmittelbar vor der Injektion geöffnet wird.
Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf der Feststellung, daß liposomale Kontrastmittel zur Verwendung bei der Abbildung im Hinblick auf Einkapselungseffizienz, Toxizität, Herstellungsverfahren und/oder Halbwertszeit dadurch verbessert werden können, daß ein neutrales Lipid und ein geladenes Lipid verwendet werden, um die Liposomenmembran zu bilden, und der durchschnittliche Teilchendurchmesser der Liposomen relativ klein, z. B. im Größenbereich von 50 bis 3.000 nm, gehalten wird. Die Liposomen tragen eine negative Nettoladung, welche eine elektrostatische Abstoßung zwischen den Liposomenmembran vorsieht, wodurch eine hohe Einkapselungskapazität, z. B. mindestens 5 ml/g, erhalten wird.
Gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung stellen die Anmelder eine diagnostische Zusammensetzung zur Verabreichung an Menschen oder Tiere bereit, wobei die Zusammensetzung multilamellare Liposomen, wahlweise zusammen mit unilamellaren Liposomen, enthält, wobei die Liposomen mindestens ein Abbildungsmittel enthalten und in einem das Abbildungsmittel enthaltenden, wäßrigen Medium suspendiert sind, wobei das Abbildungsmittel aus Röntgenkontrastmitteln, enthaltend eine oder mehrere iodierte Phenylgruppen oder Schwermetallcluster oder Chelate, und Ultraschallkontrastmitteln, welche flüssige, feste oder semifeste Verbindungen sind, die in vivo ein Gas bilden, gewählt ist, und wobei die Liposomen ein neutrales Phospholipid und ein geladenes Phospholipid umfassen, der durchschnittliche Teilchendurchmesser der Liposomen 50-3.000 nm beträgt und die Konzentration des Abbildungsmittels in irgendeiner wäßrigen Phase, welche das Innere der Liposomen ausfüllt, im wesentlichen die gleiche ist, wie die in dem wäßrigen Medium, in welchem die Liposomen suspendiert sind.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, umfassend flüssig ausgefüllte Liposomen, umfassen folglich eine äußere kontinuierliche Phase aus einem herkömmlichen Kontrastmittel, welches die herkömmlichen Abbildungsanforderungen für Blutansammlungen erfüllt, als ein allgemeines Kontrastmittel, zusammen mit Liposomen, enthaltend ein Kontrastmittel, welches sich in der Leber und der Milz konzentriert und die Abbildung dieser Organe unterstützt.
Erfindungsgemäße Liposomensuspensionen weisen eine hohe Einkapselungskapazität in der inneren wäßrigen Phase (z. B. mindestens 5 ml/g Lipid, vorzugsweise mindestens 6 ml/g) auf und können daher eine große Menge eines wasserlöslichen Arzneistoffes festhalten und sind im Blut und bei der Lagerung sowie gegenüber einer Autoklavierung stabil.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Röntgenabbildung können zum Beispiel irgendeines der auf dem Fachgebiet bekannten iodierten Röntgenkontrastmittel und Schwermetallcluster/Chelat-Röntgenkontrastmittel, z. B. wie vorstehend beschrieben, einschließen.
Iodierte Röntgenkontrastmittel in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise drei oder mehrere Iodatome pro Molekül und im allgemeinen eine oder mehrere iodierte Phenylgruppen. Nichtionische Abbildungsmittel werden bevorzugt, besonders die sogenannten nichtionischen Dimere wie Iodixanol und Iotrolan, welche sehr hydrophil sind und nur einen niedrigen osmotischen Druck in hohen Konzentrationen erzeugen. Die Konzentration des Kontrastmittels in der Zusammensetzung kann sehr variieren und wird durch Faktoren wie die Art des Kontrastmittels, die beabsichtige Verabreichungsweise der fertigen Zusammensetzung und die klinische Indikation beeinflußt.
Eine typische Konzentration kann zum Beispiel im Bereich von 10-300 mg (vorzugsweise 60-180 mg, stärker bevorzugt 70-110 mg) eingekapseltem Iod pro ml der Zusammensetzung liegen. Die Konzentration des gesamten Iods pro ml der Zusammensetzung liegt vorzugsweise im Bereich von 40-450 mg, stärker bevorzugt 160 bis 320 mg. Die vorliegenden Zusammensetzungen werden üblicherweise intravenös verabreicht, und die verabreichte Dosis der Zusammensetzung kann in ähnlicher Weise sehr variieren, z. B. abhängig von der klinischen Indikation; im allgemeinen kann eine typische Dosis zur Gefäß- oder Leberabbildung zum Beispiel im Bereich von 5-300 mg Iod pro kg Körpergewicht liegen.
Schwermetallcluster/Chelate in den erfindungsgemäßen Liposomenzubereitungen enthalten vorzugsweise mindestens zwei Metallatome mit Ordnungszahlen, welche höher als die von Iod sind; repräsentative Kontrastmittel dieses Typs schließen zum Beispiel die in WO-A-9114460 und WO-A-9217215 beschriebenen Wolframcluster/Chelate ein. Nichtionische Cluster/Chelate können bevorzugt werden.
Liposomenzusammensetzungen zur Verwendung bei der Ultraschallabbildung können bei sämtlichen Arten der Ultraschalltechnik einschließlich der Dopplertechnologie verwendet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise Liposomen mit einem darin eingekapselten, physiologisch verträglichen Gas oder einem darin eingekapselten oder kovalent daran gebundenen Gasvorläufer.
Im allgemeinen kann irgendein biokompatibles Gas in den erfindungsgemäßen Ultraschallzusammensetzungen, zum Beispiel Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Wasserstoff, Dinitrogenoxid, Kohlendioxid, oder mehr bevorzugt ein wasserunlösliches Gas, zum Beispiel Helium, Argon, Schwefelhexafluorid, ein niedermolekulargewichtiger, wahlweise fluorierter Kohlenwasserstoff wie Methan, Acetylen, Tetrafluorkohlenstoff, oder ein C&sub2;&submin;&sub7;- Perfluoralkan wie Perfluorpropan, Perfluorbutan oder Perfluorpentan, oder eine Mischung aus irgendwelchen der vorhergehenden Gase vorliegen. Der Begriff "Gas", so wie hier verwendet, schließt irgendeinen Stoff in gasförmiger Form bei der normalen Körpertemperatur von 37ºC und daher bei niedriger Temperatur siedende Flüssigkeiten wie Diethylether oder bestimmte Perfluoralkane ein.
Gasvorläufer schließen Aminomalonat; Carbonate und Bicarbonate wie Lithiumcarbonat, Lithiumbicarbonat, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Ammoniumcarbonat, Calciumcarbonat und Magnesiumbicarbonat; physiologisch verträgliche Diazoniumverbindungen; Carbonatester enthaltend Gruppierungen des Typs -CO.O.CR¹R².O.CO.OR³; und β-Ketosäuren ein.
Diese können in vielfältiger Weise reagieren, um Gas enthaltende Liposomen zu bilden. So können zum Beispiel Carbonate und Bicarbonate im Hinblick auf die im Körper vorherrschenden sauren pH-Werte nach der Verabreichung Kohlendioxid in vivo bilden; Diazoniumverbindungen können z. B. mit UV-Licht bestrahlt werden, um Stickstoff zu erzeugen; Carbonatester interagieren mit unspezifischen Esterasen in vivo, wobei Kohlendioxid freigesetzt wird; β-Ketosäuren werden spontan decarboxyliert.
Erfindungsgemäße Ultraschallzusammensetzungen können zum Beispiel intestinal oder parenteral verabreicht werden, obwohl es bei bestimmten Anwendungen vorteilhaft sein kann, sie direkt in Körperhöhlen wie die Eileiter zu verabreichen. Im allgemeinen jedoch wird höchstwahrscheinlich die intravaskuläre Verabreichung, besonders häufig durch intravenöse Injektion, verwendet, um die Gefäßabbildung, einschließlich kardiale und extrakardiale Perfusion, zu verstärken. Infolge ihrer Stabilität wird eine große Menge einer derart verabreichten Zusammensetzung letztendlich durch das reticuloendotheliale System, hauptsächlich in der Leber, aufgenommen, wodurch eine gute Ultraschallkontrastverstärkung in der Leber vorgesehen wird.
Die einfache Komprimierbarkeit ist eine wünschenswerte Eigenschaft von Ultraschallkontrastmitteln mit niedriger Dichte. Da die Liposomen in den erfindungsgemäßen Zusammensetzung im wesentlichen nichtfeste Matrizen enthalten, zeigen sie einen wesentlichen Grad an Flexibilität. Dies erhöht demgemäß die Komprimierbarkeit und auf diese Weise die Echogenität von erfindungsgemäßen gasgefüllten Ultraschallzusammensetzungen.
Eine der wesentlichen Komponenten zur Bildung der Membranen der vorliegenden Liposomen ist ein neutrales Phospholipid, umfassend mindestens einen im wesentlichen gesättigten Fettsäurerest. Die Anzahl der Kohlenstoffatome in solchen Fettsäureresten beträgt vorzugsweise mindestens 15 oder mehr, vorzugsweise mindestens 16. Wenn die Anzahl der Kohlenstoffatome in einem Fettsäurerest weniger als 14 beträgt, ist die Fähigkeit der Liposomen gering, die innere wäßrige Phase festzuhalten, und die Stabilität der Liposomen im Blut nach der Verabreichung ist gering. Wenn andererseits die Anzahl der Kohlenstoffatome in einem Fettsäurerest 28 oder mehr beträgt, wird die Biokompatibilität gering und während der Herstellung der Liposomen ist eine sehr hohe Temperatur erforderlich.
Eine andere der wesentlichen Komponenten zur Bildung der Membranen der vorliegenden Liposomen ist ein geladenes Phospholipid, umfassend mindestens einen im wesentlichen gesättigten Fettsäurerest. Die Anzahl der Kohlenstoffatome in einem solchen Fettsäurerest beträgt üblicherweise mindestens 14, vorzugsweise mindestens 15 und stärker bevorzugt mindestens 16. Wenn die Anzahl der Kohlenstoffatome in einem Fettsäurerest weniger als 14 beträgt, ist die Fähigkeit der Liposomen gering, die innere wäßrige Phase festzuhalten, und die Stabilität der Liposomen im Blut nach der Verabreichung ist gering. Wenn andererseits die Anzahl der Kohlenstoffatome in einem Fettsäurerest 28 oder mehr beträgt, wird die Biokompatibilität gering und während der Herstellung der Liposomen ist eine sehr hohe Temperatur erforderlich.
Der Begriff "im wesentlichen gesättigt", so wie oben verwendet, bedeutet, daß die Fettsäurereste der neutralen und der geladenen Phospholipide vollständig gesättigt sind (d. h. keine C-C-Doppelbindungen enthalten) oder daß der Anteil ihrer Ungesättigtheit sehr gering ist, z. B. wie durch eine Iodzahl von nicht mehr als 20, vorzugsweise nicht mehr als 10, gezeigt. Wenn der Anteil der Ungesättigtheit zu hoch ist, werden die Liposomen leicht oxidiert und sind schwer hitzesterilisierbar.
Erfindungsgemäß nützliche neutrale Phospholipide schließen zum Beispiel neutrale Glycerophospholipide, zum Beispiel ein teilweise oder vollständig hydriertes, natürlich vorkommendes (z. B. abgeleitet aus Sojabohnen oder Eidotter) oder synthetisches Phosphatidylcholin, besonders ein halbsynthetisches oder synthetisches Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) oder Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), ein.
Erfindungsgemäß nützliche geladene Phospholipide schließen zum Beispiel positiv oder negativ geladene Glycerophospholipide ein. Negativ geladene Phospholipide schließen zum Beispiel Phosphatidylserin, zum Beispiel ein teilweise oder vollständig hydriertes, natürlich vorkommendes (z. B. abgeleitet aus Sojabohnen oder Eidotter) oder halbsynthetisches Phosphatidylserin, besonders ein halbsynthetisches oder synthetisches Dipalmitoylphosphatidylserin (DPPS) oder Distearoylphosphatidylserin (DSPS); Phosphatidylglycerol, zum Beispiel ein teilweise oder vollständig hydriertes, natürlich vorkommendes (z. B. abgeleitet aus Sojabohnen oder Eidotter) oder halbsynthetisches Phosphatidylglycerin, besonders ein halbsynthetisches oder synthetisches Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) oder Distearoylphosphatidylglycerol (DSPG); Phosphatidylinositol, zum Beispiel ein teilweise oder vollständig hydriertes, natürlich vorkommendes (z. B. abgeleitet aus Sojabohnen oder Eidotter) oder halbsynthetisches Phosphatidylinositol, besonders ein halbsynthetisches oder synthetisches Dipalmitoylphosphatidylinositol (DPPI) oder Distearoylphosphatidylinositol (DSPI); Phosphatidinsäure, zum Beispiel eine teilweise oder vollständig hydrierte, natürlich vorkommende (z. B. abgeleitet aus Sojabohnen oder Eidotter) oder halbsynthetische Phosphatidinsäure, besonders eine halbsynthetische oder synthetische Dipalmitoylphosphatidinsäure (DPPA) oder Distearoylphosphatidinsäure (DSPA), ein. Obwohl ein solches geladenes Phospholipid gewöhnlich allein verwendet wird, kann mehr als ein geladenes Phospholipid verwendet werden. Falls mehr als ein geladenes Phospholipid verwendet wird, sind vorzugsweise beide der geladenen Phospholipide positiv geladen oder beide der geladenen Phospholipide sind negativ geladen, um eine Aggregation zu verhindern.
Positiv geladene Lipide schließen zum Beispiel einen Ester von Phosphatidinsäure mit einem Aminoalkohol ein, wie ein Ester von Dipalmitoylphosphatidinsäure oder Distearoylphosphatidinsäure mit Hydroxyethylendiamin.
Erfindungsgemäß beträgt das Verhältnis des neutralen Phospholipids zu dem geladenen Phospholipid üblicherweise 200 : 1 bis 3 : 1, vorzugsweise 60 : 1 bis 4 : 1 und stärker bevorzugt 40 : 1 bis 5 : 1, bezogen auf das Gewicht, z. B. etwa 10 : 1.
Die vorliegenden Liposomen können verschiedene wahlweise Komponenten zusätzlich zu den oben erwähnten zwei wesentlichen Komponenten enthalten. Zum Beispiel kann Vitamin E (α-Tocopherol) und/oder ein Vitamin E-Acetatester als ein Antioxidationsmittel in einer Menge von 0,01 bis 2 Mol-%, vorzugsweise 0,1 bis 1 Mol-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Lipide, zugesetzt werden.
Für diagnostische Zusammensetzungen, umfassend Liposome, welche die oben erwähnten Phospholipide enthalten, beträgt die Konzentration an Gesamtlipid im allgemeinen 20 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 40 mg/ml bis 90 mg/ml und stärker bevorzugt 50 mg/ml bis 80 mg/ml, um die Einkapselung des Kontrastmittels in die Liposomen zu erhöhen.
Solche Kontrastmittel sind vorzugsweise in den Liposomen in Form einer isotonischen Lösung oder Suspension (im Verhältnis zu dem physiologischen, osmotischen Druck im Körper) in einem geeigneten Medium eingekapselt, so daß die Liposomen nach der Verabreichung im Körper stabil aufrechterhalten werden. Als Medium können Wasser, eine Pufferlösung wie Tris-HCl-Puffer, Phosphatpuffer, Citratpuffer oder ähnliches verwendet werden.
Ein bevorzugter pH-Bereich bei Raumtemperatur ist 6,5-8,5, stärker bevorzugt 6,8-7,8. Wenn das Kontrastmittel ein nichtionisches Röntgenkontrastmittel ist, welches mehrere Hydroxylgruppen trägt, z. B. Iohexol, Iodixanol oder Iopamidol, ist der Puffer vorzugsweise einer mit einem negativen Temperaturkoeffizient, wie in USP 4278654 beschrieben ist. Aminpuffer besitzen die erforderlichen Eigenschaften, besonders TRIS. Dieser Puffertyp weist einen niedrigeren pH bei Autoklaventemperaturen auf, was die Stabilität des Röntgenkontrastmittels während des Autoklavierens erhöht, während sich bei Raumtemperatur wieder ein physiologisch verträglicherer pH einstellt. TRIS sieht überraschenderweise auch eine verbesserte Halbwertszeit vor.
Um eine isotonische Lösung oder Suspension zu erhalten, wird das Kontrastmittel in einem Medium in einer Konzentration, welche eine isotonische Lösung vorsieht, gelöst oder suspendiert. In dem Fall, wo ein Kontrastmittel allein keine isotonische Lösung vorsehen kann, weil zum Beispiel die Löslichkeit des Kontrastmittels gering ist, können andere nichttoxische wasserlösliche Stoffe, zum Beispiel Salze wie Natriumchlorid oder Zucker wie Mannitol, Glucose, Saccharose, Sorbitol oder ähnliches, zu dem Medium zugegeben werden, so daß eine isotonische Lösung gebildet wird.
Wie oben angegeben, ist ein Vorteil der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ihre Fähigkeit, das Autoklavieren zu überstehen. Sie weisen auch eine hohe Einkapselungskapazität und ein hohes Einkapselungsverhältnis aufgrund ihrer Lipidzusammensetzung auf.
Außerdem, wie nachstehend beschrieben, weisen die erfindungsgemäßen diagnostischen Zusammensetzungen gute Abbildungseigenschaften und geringe Nebenwirkungen auf.
Die vorliegenden Liposomen können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden, welche zur Bildung von multilamellaren Liposomen angewendet werden. Diese Verfahren schließen die Bangham-Methode (J. Mol. Dial. 13 (1965), 238-252), das mehrwertige Alkohol-Verfahren (geprüfte Japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 4- 36734), das Lipidlösungsverfahren (geprüfte Japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 4-36735) und das mechanochemische Verfahren (geprüfte Japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 4-28412) ein.
Im allgemeinen können die erwünschten multilamellaren Vesikel durch Lösen der oben erwähnten Phospholipide in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Methanol, Dichlormethan, Ethanol oder ähnliche, oder einem Lösungsmittelgemisch aus dem organischen Lösungsmittel und Wasser, Entfernen des Lösungsmittels, Mischen des resultierenden Rückstands mit einer ein Kontrastmittel enthaltenden, wäßrigen Phase und Schütteln oder Rühren der Mischung hergestellt werden.
Als Schritt zur Entfernung des Lösungsmittels in den oben erwähnten Verfahren wendet die Bangham-Methode das Verdampfen an, jedoch können auch Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung verwendet werden.
Bei den oben erwähnten Liposomenherstellungsverfahren ist die im Verhältnis zu dem Lipid verwendete Menge des Lösungsmittels nicht entscheidend, und irgendeine Menge, welche die Lösung des Lipids ermöglicht, ist annehmbar. Die Entfernung des Lösungsmittels aus der resultierenden Mischung von Lipid und Lösungsmittel durch Verdampfen kann gemäß herkömmlichen Verfahren, wie Verdampfen unter vermindertem Druck, oder gegebenenfalls in Gegenwart eines inerten Gases durchgeführt werden. In der Praxis können die oben erwähnten, flüchtigen organischen Lösungsmittel gegebenenfalls in Lösungsmittelgemischen, umfassend 10 Volumenteile des organischen Lösungsmittels und bis zu 1 Volumenteil Wasser, verwendet werden.
Um die Lösungsmittelentfernung durch Gefriertrocknung zu bewirken, wird ein Lösungsmittel ausgewählt, welches bei einem verminderten Druck von etwa 0,005 bis 0,1 Torr bei einer Temperatur, welche niedriger ist als der Gefrierpunkt des Lösungsmittels, typischerweise -30ºC bis -50ºC, entfernt werden kann. Wenn die Lösungsmittelentfernung durch Sprühtrocknung bewirkt wird, werden der Luftdruck typischerweise auf 1,0 kg/cm² und die Luftdurchströmmenge bei 0,35 cm²/Minute eingeregelt, wobei die Einlaßtemperatur auf eine Temperatur eingestellt wird, welche höher als der Siedepunkt des verwendeten Lösungsmittels ist. Zum Beispiel kann das Lösungsmittel Chloroform sein, die Temperatur kann auf 60 bis 90ºC eingestellt werden, und die Sprühtrocknung kann gemäß herkömmlichen Verfahren bewirkt werden.
Der auf diese Weise erhaltene Lipidrückstand wird mit einer ein Kontrastmittel enthaltenden, wäßrigen Lösung bei einer Temperatur gemischt, welche gleich oder höher als die Phasenübergangstemperatur (Tc) des verwendeten Lipids ist, und im Anschluß daran wird die Mischung bei einer Temperatur, welche gleich oder höher als diese Tc ist, kräftig oder vorsichtiger geschüttelt oder gerührt, um die erwünschten Liposomen suspendiert in der das Kontrastmittel enthaltenden, wäßrigen Lösung herzustellen. Die Elektrolytionenkonzentration in der das Kontrastmittel enthaltenden, wäßrigen Lösung sollte wünschenswerterweise so gering wie möglich sein, um eine ungünstige Beeinflussung der Einkapselungseffizienz etc. zu vermeiden; im allgemeinen beträgt die Gesamtkonzentration der positiven und negativen Ionen abgesehen von dem Kontrastmittel wünschenswerterweise nicht mehr als 40 mM, vorzugsweise nicht mehr als 20 mM.
Obwohl die Teilchengröße der Liposomen durch die zahlenmittlere Teilchengröße ausgedrückt werden kann, wird vorzugsweise die gewichtsmittlere Teilchengröße bei der Definition der Einkapselungskapazität verwendet.
Die durchschnittliche Teilchengröße der vorliegenden Liposomen beträgt üblicherweise 50 nm bis 3.000 nm, vorzugsweise 150 nm bis 1.000 um und stärker bevorzugt 200 nm bis 500 nm. Um die oben erwähnte, erwünschte Teilchengröße zu erhalten, können Liposomen mit einer größeren Teilchengröße durch einen oder mehrere Filter mit einer vorherbestimmten Porengröße (z. B. etwa 1 um) durch ein Extrusionsverfahren (Biochem. Biophys. Acta, Bd. 557 (1979), S. 9) hindurch geleitet werden.
Die erfindungsgemäßen Liposomen enthalten mindestens einen Anteil, welcher eine multilamellare Membran aufweist. Wenn die Liposomen zuerst durch die hierin beschriebenen Techniken hergestellt werden, sind die Liposomen im allgemeinen multilamellar, wenn jedoch die Liposomensuspension gemäß der oben beschriebenen, bevorzugten Technik durch einen oder mehrere Filter, zum Beispiel Membranfilter, z. B. mit einer Porengröße von etwa 1 um, hindurch geleitet werden, werden die äußeren Lipidschichten abgelöst, wobei eine Mischung von multilamellaren und unilamellaren Liposomen zurückbleibt. Die multilamellaren Liposomen weisen im Hinblick auf die Stabilität einige Vorteile auf, jedoch ist ein relativ großer Anteil an unilamellaren Liposomen annehmbar, besonders da sie eine höhere Einkapselungskapazität als multilamellare Liposomen vorsehen können.
Die auf diese Weise hergestellten Liposomen liegen als eine Suspension in einem wäßrigen Medium (äußere Flüssigkeit) vor und werden im allgemeinen als solche als eine diagnostische Zusammensetzung verwendet. Die Lösung des Kontrastmittels, welches während der Bildung der Liposomen nicht eingekapselt worden ist, liegt als die äußere Flüssigkeit vor. Alternativ kann die äußere Flüssigkeit durch eine andere Flüssigkeit ersetzt werden, obgleich die Konzentration des Abbildungsmittels in der äußeren Flüssigkeit die gleiche wie in irgendeiner inneren Flüssigkeit sein sollte. In jedem Fall ist die äußere Flüssigkeit (Dispersionsmedium) im Verhältnis zu der inneren wäßrigen Phase der Liposomen vorzugsweise isotonisch. Die Elektrolytionenkonzentration in der auf diese Weise hergestellten Liposomensuspension sollte wünschenswerterweise so gering wie möglich sein; im allgemeinen beträgt die Gesamtkonzentration der positiven und der negativen Ionen abgesehen von dem Kontrastmittel wünschenswerterweise nicht mehr als etwa 40 mM, vorzugsweise nicht mehr als 20 mM, um die Stabilität der Liposomen bei der Hitzesterilisation und der Langzeitlagerung zu erhöhen.
Wie oben angemerkt, beträgt die Einkapselungskapazität der vorliegenden Liposomen im allgemeinen mindestens 5 ml/g Lipid, vorzugsweise mindestens 6 ml/g.
Wenn ein iodiertes Röntgenkontrastmittel durch das erfindungsgemäße Verfahren eingekapselt wird, sollte die Konzentration des Kontrastmittels in der anfänglichen wäßrigen Lösung wünschenswerterweise hoch sein, um ein Produkt mit einem relativ hohen Iod/Lipid-Verhältnis zu erhalten, wodurch die Kosten und mögliche Toxizitätsprobleme verringert werden. Erfindungsgemäß jedoch ist ein bevorzugter Bereich für das Gewichtsverhältnis von Iod zu dem Lipid 1,3-1,45. Dieses ist geringer als einige Verhältnisse gemäß dem Stand der Technik; WO 88/09165 gibt eine untere Grenze von 1,5 an.
Die am meisten bevorzugten Röntgenkontrastmittelzusammensetzungen der Erfindung umfassen hydriertes Phosphatidylcholin als das neutrale Phospholipid und hydriertes Phosphatidylserin als das geladene Phospholipid, vorzugsweise in dem Verhältnis von 10 : 1. Eine solche Zusammensetzung kann eine Einkapselungskapazität von über 7 ml/g aufweisen. Das am meisten bevorzugte Röntgenkontrastmittel zur Verwendung in solchen Zusammensetzungen ist Iodixanol. Das wäßrige Medium innerhalb und außerhalb der Liposomen enthält vorzugsweise etwa 400 mg Iodixanol/ml sowie ein Mittel zur Einstellung der Isotonie wie Sorbitol, ein Stabilisierungsmittel wie EDTANa&sub2;Ca und TRIS- Puffer (pH etwa 7,4).
Liposomenzusammensetzungen, worin ein Kontrastmittel kovalent an die Liposomenmembran gebunden ist, können zum Beispiel unter Anwendung von Verfahren hergestellt werden, welche zu den in US-A-51357737 beschriebenen analog sind.
Gas enthaltende Zusammensetzungen zur Ultraschallabbildung können auf vielfältige Weise hergestellt werden, z. B. unter Anwendung von Techniken, welche den auf dem Fachgebiet zur Herstellung von Gas enthaltenden, unilamellaren und multilamellaren Vesikeln beschriebenen ähnlich sind. Solche Techniken sind zum Beispiel in US-A- 4544545, US-A-4900540, WO-A-9109629 und WO-A-9115244 beschrieben. So kann zum Beispiel eine Lösung eines pH-empfindlichen Gasvorläufers eingekapselt und der pH des Systems anschließend verändert werden, um die Gasproduktion innerhalb des Liposoms zu begünstigen.
In solchen Fällen kann es vorteilhaft sein, ein oder mehrere Ionophoren in die Membranen der Liposomen einzuschließen, um den Transport von Wasserstoffionen oder Hydroxidionen über die Membran zu unterstützen und auf diese Weise die pH-Änderung zu erleichtern - vgl. zum Beispiel die oben erwähnte WO-A-9109629.
Alternativ kann eine Carbonatesterlösung zusammen mit einer unspezifischen menschlichen Esterase eingekapselt werden, und die resultierenden Liposomen können z. B. bei 37ºC während 5 Tagen inkubiert werden. Die schwimmenden, Kohlendioxid enthaltenden Liposomen können danach abgetrennt und wie geeignet formuliert werden.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Gas enthaltenden Liposomen schließt die Applikation eines äußeren Gasdrucks auf eine Suspension von vorgebildeten Liposomen, welche ein wäßriges Medium einkapseln, ein. Im allgemeinen sollte das Gas in einem sehr hohen Druck, z. B. mindestens etwa 5 Atmosphären, appliziert werden.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung schließt das Dispergieren der ausgewählten Phospholipide in einem wäßrigen Medium oder einer Mischung von Wasser und wasserlöslichen, biologisch verträglichen, organischen Lösungsmitteln, von denen bekannt ist, daß sie Phospholipidlösungen stabilisieren, wie Glycerin und Propylenglykol, und das kräftige Schütteln dieser Lösung in Gegenwart eines ausgewählten Gases oder Gasgemisches ein. Alternativ können die Liposomen durch Beschallen der Phospholipidlösung in Gegenwart des ausgewählten Gases oder Gasgemisches gebildet werden.
Jedes biologisch verträgliche Gas, z. B. wie vorstehend beschrieben, kann bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Ultraschallkontrastmittel verwendet werden.
Im allgemeinen können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur Verwendung bei irgendeiner Art der Abbildung gegebenenfalls mit Materialien wie Polyethylenglykol modifiziert werden, um die Halbwertszeit der Liposomen im Blutkreislauf zu erhöhen. Dies kann bei Anwendungen in Verbindung mit einer kardiovaskulären Abbildung besonders vorteilhaft sein.
Die folgenden nichtbegrenzenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen.

Meßverfahren

(1) Messung der Teilchengröße

Die gewichtsmittlere Teilchengröße der erhaltenen Liposomen wurde durch ein quasi-elastisches Lichtstreuungsverfahren unter Verwendung eines Dynamic-Lichtstreuungsmeßgeräts DLS (Otsuka Electronics Co., Ltd.) gemessen.

(2) Messung der Einkapselungskapazität

Das Volumen der inneren wäßrigen Phase der Liposomen wurde durch den in den Liposomen festgehaltenen Anteil an Iodixanol berechnet; d. h. ein Einkapselungsverhältnis von Iodixanol beträgt 40%, wenn das Volumen der inneren wäßrigen Phase in einer 1 ml- Liposomenzubereitung 0,4 ml beträgt.
Die Einkapselungskapazität ist definiert als das Volumen der inneren wäßrigen Phase pro Gramm Lipideinheit. Wenn zum Beispiel die Konzentration des Lipids einer Liposomenzubereitung 0,056 g/ml beträgt und der Prozentsatz an Iodixanol in den Liposomen 40% beträgt, dann beträgt die Einkapselungskapazität 7,1 ml/g Lipid, da 0,056 g Lipid 0,4 ml der inneren wäßrigen Phase in 1 ml der Liposomen tragen.
Das Einkapselungsverhältnis von Saccharose in einer Liposomenzubereitung wurde durch das Gelfiltrationsverfahren gemessen. So wurden Liposomenzubereitungen über eine Gelfiltrationssäule (Träger Sephadex G50, Pharmacia; Säulendurchmesser = 16 mm; Säulenhöhe = 300 mm) unter Verwendung von physiologischer Salzlösung als mobile Phase geleitet, und das Eluat wurde fraktioniert (2,5 ml/Fraktion). Ein Aliquot von 0,8 ml wurde aus einer jeden Fraktion entnommen, dazu wurden 2 ml Methanol zugegeben, gefolgt von 1 ml Chloroform. Die Mischung wurde einmal umgerührt, um das Ganze durchsichtig zu machen.
Dazu wurde 1 ml Chloroform zugegeben, und nach dem Umrühren wurden 1,2 ml destilliertes Wasser zu der Mischung zugegeben, welche dann gerührt und in einer gekühlten Zentrifuge (Kuboka Shoji K. K., Typ KR-702) zentrifugiert (3.500 UpM, 10 Minuten, Raumtemperatur) wurde; und die Konzentration des wiedergewonnenen Iodixanols in der oberen Phase (Wasser-Methanol-Phase) der getrennten zwei Phasen wurde durch die Absorption bei 246 nm gemessen. Falls die Konzentration des Iodixanols in dem Extrakt hoch war, wurde das Eluat geeigneterweise mit destilliertem Wasser verdünnt, ein 0,8 ml- Aliquot wurde entnommen und mit Methanol, Chloroform und destilliertem Wasser extrahiert.
Die Menge an Iodixanol in der Liposomenfraktion, welche in das Hohlraumvolumen eluierte, wurde durch die Gesamtmenge des in dem Eluat wiedergewonnenen Iodixanols (die in 25 Fraktionen wiedergewonnene Menge an Iodixanol) dividiert, um ein Einkapselungsverhältnis zu erhalten. Es ist anzumerken, daß der Endpunkt der Liposomenfraktionierung die Fraktion war, deren Iodixanolkonzentration minimal war.

Beispiel 1

Einkapselung eines Röntgenabbildungsmittels, Iodixanol

0,640 g hydriertes Phosphatidylcholin aus Eidotter (HEPC), 0,064 g hydriertes Phosphatidylserin (HEPS), synthetisiert aus HEPC, und 60 ml einer Mischung von Chloroform, Methanol und Wasser (Volumenverhältnis 100 : 20 : 0,1) wurden in einem Kolben gemischt. Die Mischung wurde in einem Wasserbad (65ºC) erhitzt, um die Phospholipide zu lösen, und die resultierende Lösung wurde in einem Rotationsverdampfer bei 60ºC erhitzt, um das Lösungsmittel zu verdampfen.
Der Rückstand wurde unter vermindertem Druck während 2 Stunden weiter getrocknet, um einen Lipidfilm zu bilden. Eine wäßrige Lösung, enthaltend Iodixanol (1,3-Bis(acetylamino)-N,N'-bis[3,5-bis(2,3-dihydroxypropylaminocarbonyl)-2,4,6-triiodophenyl]-2-hydroxypropan) (0,4 g/ml) und Saccharose (0,05 g/ml) wurden auf 65ºC erhitzt, und 10 ml der erhitzten Lösung wurden mit dem Lipidfilm kombiniert, und die Mischung wurde mit einem Mischgerät unter Erhitzen bei 65ºC während 10 Minuten gerührt. Diese Mischung wurde unter Druck durch einen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 1,0 um einmal filtriert, um multilamellare Vesikel mit der erforderlichen Größe zu erhalten (MLVs).
Die auf diese Weise erhaltenen MLVs wurden in Glasfläschchen gefüllt und zur Sterilisation bei 121ºC während 20 Minuten autoklaviert, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die Einkapselungskapazität wurde gemäß dem obigen Verfahren unter (2) gemessen. Die gewichtsmittlere Teilchengröße wurde gemäß dem obigen Verfahren unter (1) bestimmt. Tabelle 1

Beispiel 2

Einkapselung von Iodixanol

Eine Iodixanol enthaltende Liposomenformulierung wurde gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2

Beispiel 3

Die in Beispiel 1 erhaltene Liposomensuspension wurde mit isotonischer Glucose auf eine Konzentration von 50 mg eingekapseltem Iod/ml verdünnt. Beim Verdünnen wurde die Suspension milchig weiß. Bei der mikroskopischen Untersuchung der Emulsion konnten keine Liposomenaggregate beobachtet werden. Nach der Lagerung der Emulsion während einem Jahr wurde keine Auswirkung auf die Menge an eingekapseltem Iodixanol und die Größenverteilung beobachtet.

Beispiel 4

Die Zusammensetzung aus Beispiel 3 wurde intravenös in Ratten injiziert. Es wurde bestätigt daß der größte Teil des eingekapselten Iodixanols nach der Injektion in der Leber verteilt ist, jedoch wurde auch eine hohe Iodixanolkonzentration in der Milz nachgewiesen. Nach der Injektion nahm die Menge des gewebeassoziierten Iodixanols mit der Zeit kontinuierlich ab, bis schließlich kein Iodixanol in diesen zwei Organen nachgewiesen werden konnte. Alle anderen Organe zeigten Iodixanolspiegel, welche parallel zu dem Iodixanolspiegel im Blut abnahmen. Der größte Teil des injizierten Iodixanols konnte im Urin wiedergewonnen werden.

Beispiel 5

Die Zusammensetzung aus Beispiel 3 wurde intravenös in Ratten injiziert, welche vielfache Leberkrebsmetastasen trugen. Bei Dosen von 50 und 100 mg eingekapseltem Iod/kg wurden Röntgenstrahlschwächungen von 42 bzw. 62 HU in den normalen Bereichen der Leber beobachtet, während die Schwächung in Tumormetastasen minimal beeinflußt wurde. Die makroskopische Untersuchung zeigte, daß die nachgewiesenen Tumore kleiner als 5 mm im Durchmesser waren.

Beispiel 6

Die Zusammensetzung aus Beispiel 3 wurde intravenös in Gruppen von Mäusen in Dosen von 200-7.500 mg eingekapseltem Iod/kg Körpergewicht injiziert. Über einen Zeitraum von 14 Tagen wurden Gewichtszunahme und Sterblichkeit beobachtet.
Die Ergebnisse der Untersuchung zeigten, daß alle Tiere Injektionen von bis zu 3 g in Liposomen eingekapseltes Iodixanol/kg überlebten. Diese Tiere zeigten keine verminderte Gewichtszunahme während des Beobachtungszeitraums, verglichen mit Tieren, welche keine Injektion erhielten. Bei Dosen von 4 g und 5 g in Liposomen eingekapseltem Iodixanol/kg gab es eine leichte, dosisabhängige Verminderung der Körpergewichtszunahme und es wurden Todesfälle beobachtet. Für den LD&sub5;&sub0; wurde ein Wert von 5 g in Liposomen eingekapseltem Iodixanol/kg bestimmt.

Beispiel 7

Nach Einzel- und wiederholten (3 Injektionen/Woche, 3 Wochen) intravenösen Injektionen der Zusammensetzung aus Beispiel 1 in Dosen von 100-1.000 mg eingekapseltem Iod/kg in Ratten, wurde der Blutspiegel einer Vielzahl von gewebegebundenen Enzymen gemessen, und die Histologie aller wichtigen Organe wurde zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Im Hinblick auf Serumenzyme wurden nur kleine Effekte beobachtet, verglichen mit Kontrolltieren, denen Salzlösung injiziert worden war. Neben einer dosisabhängigen Zunahme der Vakuolisierung phagocytischer Zellen in der Leber und der Milz, wurden keine liposomeninduzierte histologische Veränderungen nachgewiesen. Der Grad der Vakuolisierung der phagocytischen Zellen nahm mit der Zeit parallel zu der Abnahme des gewebeassoziierten Iodixanols in der Leber und der Milz ab.

Beispiel 8

Iodixanol enthaltende Liposomen

Eine diagnostische Zusammensetzung, umfassend:
Iodixanol (Gesamtmenge) 400 m ml
Eingekapseltes Iod 80 m ml
Sorbitol 20 m ml
Trometamol (TRIS) 0,097 m /ml
EDTANa&sub2;Ca 0,1 m /ml
Hydriertes Phosphatidylcholin 51,2 m ml
Hydriertes Phosphatidylserin 5,1 m /ml
Wasser zur Injektion auf 1 ml (etwa 0,9 ml)
wurde durch Lösen des Phospholipids in Chloroform/Methanol/Wasser (4 : 1 : 0,025, Volumen) und Verdampfen des Lösungsmittels (Rotationsverdampfen) hergestellt. Eine isotonische von Iodixanol und Sorbitol wurde hergestellt und auf 60-70ºC erhitzt, und diese Temperatur wurde während des restlichen Verfahrens aufrechterhalten. Die Phospholipidmischung wurde unter Rühren zugegeben, und die Liposomen wurden gebildet. Um die Größe der Liposomen zu kontrollieren, wurde die Zubereitung homogenisiert (Rotor/Stator-Homogenisator). Die Liposomen wurden dann durch sieben hintereinander angeordnete Polycarbonatfilter (Porendurchmesser 1 um) extrudiert.
Das Produkt wurde mit der isotonischen Lösung von Iodixanol und Sorbitol verdünnt, und Trometamol und EDTA wurden zugegeben. Das Produkt wurde in Glasfläschchen gefüllt und autoklaviert (121ºC, 15 Minuten).

Beispiel 9

Iotrolan enthaltende Liposomen

Die Liposomen wurden hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben, jedoch wurde Iotrolan anstelle von Iodixanol verwendet.

Beispiel 10

Iodixanol enthaltende Liposomen mit hydriertem Phosphatidylglycerol

Die Liposomen wurden hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben, jedoch wurde hydriertes Phosphatidylglycerol anstelle von hydriertem Phosphatidylserin verwendet.

Beispiel 11

Schwermetallchelat-Kontrastmittel (Gadolinium)

Ein Lipidfilm von hydriertem Phosphatidylcholin und hydriertem Phosphatidylserin wird hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
10 ml einer 0,5 M Lösung von GdHPDO3A wird auf 65ºC erhitzt. Die Mischung wird mit einem Mischgerät während 15 Minuten unter Erhitzen bei 65ºC gerührt. Diese Mischung wird einmal unter Druck durch einen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 1,0 um filtriert, um multilamellare Vesikel (MLVs) herzustellen.
Die MLVs werden in Glasfläschchen gefüllt und zur Sterilisation bei 121ºC während 20 Minuten autoklaviert.
Die MLVs enthalten GdHPDO3A.

Beispiel 12

Schwermetallchelat-Kontrastmittel (Dysprosium)

Die Liposomen werden gemäß Beispiel 11 unter Verwendung einer Lösung von DyDTPA-BMA (0,5 M) anstelle von GdHPDO3A hergestellt.
Die MSVs enthalten DyDTPA-BMA.

Beispiel 13

Liposomales GdHPD03A (HEPC-HEPS)

Eine vorher hergestellte Mischung aus 640 mg hydriertem Phosphatidylcholin aus Eidotter (HEPC) und 64 mg hydriertem Phosphatidylserin (HEPS), synthetisiert aus HEPC, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde zu einem Fläschchen zugegeben, welches 10 ml einer 5%igen wäßrigen Lösung von Glucose (isotonische Lösung), enthaltend 250 mM GdHPD03A (Gadoteriol), enthielt. Die Mischung wurde während 30 Minuten bei 65ºC gerührt und eine weitere Stunde bei dieser Temperatur gehalten. Die Liposomenlösung wurden fünf Frost/Tau-Wechseln unterzogen und fünfmal bei 65ºC durch zwei aufeinandergesetzte 400 nm-Polycarbonatfilter extrudiert, um das Zielprodukt zu erhalten.

Beispiel 14

Liposomales GdHPD03A (DPPC-DPPG)

Eine Lipidmischung von 640 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und 64 mg Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde zu einem Fläschchen zugegeben, welches 10 ml einer 5%igen wäßrigen Lösung von Glucose (isotonische Lösung), enthaltend 250 mM GdHPD03A, enthielt. Die Mischung wurde während 30 Minuten bei 50ºC gerührt und eine weitere Stunde bei dieser Temperatur gehalten. Die Liposomenlösung wurden fünf Frost/Tau-Wechseln unterzogen und fünfmal bei 50ºC durch zwei aufeinandergesetzte 400 nm-Polycarbonatfilter extrudiert.

Beispiel 15

Liposomales GdDTPA-BMA

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 13 wurde angewendet, außer daß die wäßrige Lösung 250 mM GdDTPA-BMA (Gadodiamid) anstelle von GdHPDO3A enthielt.

Beispiel 16

Liposomales DyTTHA

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 13 wurde angewendet, außer daß die wäßrige Lösung 250 mM DyTTHA (Dysprosiumkomplex von Triethylentetraminhexaessigsäure) anstelle von GdHPDO3A enthielt.

Beispiel 17

Die Zusammensetzung aus Beispiel 8 wurde intravenös in Ratten injiziert. Bei Dosen von 75 mg und 100 mg eingekapseltem Iod/kg wurden Röntgenstrahlschwächungen von 47 bzw. 70 HU in der Leber beobachtet.

Beispiel 18

Die Zusammensetzung aus Beispiel 8 wurde intravenös in Ratten injiziert. Für den ungefähren LD&sub5;&sub0; wurde ein Wert von 2.000 mg eingekapseltem Iod/kg bestimmt.

Claims

1. Diagnostische Zusammensetzung zur Verabreichung an Menschen oder Tiere, wobei die Zusammensetzung multilamellare Liposome, wahlweise zusammen mit unilamellaren Liposomen, enthält, wobei die Liposome mindestens ein Abbildungsmittel enthalten und in einem das Abbildungsmittel enthaltenden, wäßrigen Medium suspendiert sind, wobei das Abbildungsmittel aus Röntgen-Kontrastmitteln, enthaltend eine oder mehrere iodierten Phenylgruppen, oder Schwermetallcluster oder Chelate, und Ultraschall-Kontrastmitteln, welche flüssige, feste oder semifeste Verbindungen sind, welche in vivo ein Gas bilden, gewählt ist, und wobei die Liposome ein neutrales Phospholipid und ein geladenes Phospholipid umfassen, der durchschnittliche Teilchendurchmesser der Liposome 50-3.000 nm beträgt und die Konzentration des Abbildungsmittels in irgendeiner wäßrigen Phase, welche das innere der Liposome ausfüllt, im wesentlichen die gleiche ist, wie die in dem wäßrigen Medium, in welchem die Liposome suspendiert sind.

2. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das wäßrige Medium, in welchem die Liposome suspendiert sind, isotonisch ist.

3. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das neutrale Phospholipid und/oder das geladene Phospholipid mindestens einen im wesentlichen gesättigten Fettsäurerest mit mindestens 14 Kohlenstoffatomen umfaßt.

4. Diagnostische Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das neutrale Phospholipid und/oder das geladene Phospholipid mindestens einen im wesentlichen gesättigten Fettsäurerest mit bis zu 28 Kohlenstoffatomen enthält.

5. Diagnostische Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das neutrale Phospholipid ein Phosphatidylcholin ist.

6. Diagnostische Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das geladene Phospholipid ein Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol, Phosphatidinsäure oder ein Ester von Phosphatidinsäure und einem Aminoalkohol ist.

7. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei die Phosphatidylgruppe eine synthetische oder semisynthetische Dipalmitoylphosphatidyl- oder Distearoylphosphatidylgruppe ist.

8. Diagnostische Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der durchschnittliche Teilchendurchmesser der Liposome 150 nm bis 1.000 nm beträgt.

9. Diagnostische Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Einkapselungskapazität des Liposoms mindestens 5 ml/g beträgt.

10. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Einkapselungskapazität der Liposome mindestens 6 ml/g beträgt.

11. Diagnostische Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gewichtsverhältnis des neutralen Phospholipids zu dem geladenen Phospholipid 60 : 1 bis 4 : 1 beträgt.

12. Diagnostische Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konzentration an Gesamtlipid 20 mg/ml bis 100 mg/ml beträgt.

13. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Konzentration an Gesamtlipid 50 mg/ml bis 80 mg/ml beträgt.

14. Diagnostische Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Abbildungsmittel ein Röntgen-Kontrastmittel ist, enthaltend eine oder mehrere iodierten Phenylgruppen oder Schwermettallcluster oder Chelate.

15. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das Abbildungsmittel Iodixanol ist.

16. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Abbildungsmittel ein Ultraschall-Kontrastmittel ist, das eine flüssige, feste oder semifeste Verbindung ist, die in vivo Gas bildet.

17. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 16, umfassend Liposome, wobei die Gesamtlipidkonzentration mindestens 20 mg/ml beträgt.

18. Verfahren zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein neutrales Phospholipid und ein geladenes Phospholipid in einem Lösungsmittel löst, das Lösungsmittel entfernt, um einen Rest zu erhalten, und den Rest mit einer wäßrigen Lösung, enthaltend das Abbildungsmittel, vermischt, wodurch Liposome gebildet werden, welche das Abbildungsmittel einkapseln.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die so gebildeten Liposome durch ein Membranfilter extrudiert werden, um deren Größe zu reduzieren.

20. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 bei einem Verfahren zur Erzeugung eines Bildes zur Verwendung in der Diagnose.

21. Verfahren zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß eine gemäß mindestens einem der Ansprüche 1- 17 definierte Zusammensetzung im Autoklaven behandelt wird, um hierdurch eine sterile diagnostische Zusammensetzung zu erzeugen.