DE69525340T2

DE69525340T2 - Verbesserungen in zusammensetzungen von kopolymeren enthaltend kopolymer-1

Info

Publication number: DE69525340T2
Application number: DE69525340T
Authority: DE
Inventors: Ruth Arnon; Eliezer Konfino; Michael Sela; Dvora Teitelbaum
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1995-05-23
Publication date: 2002-09-19
Anticipated expiration: 2015-05-24
Also published as: CN1626238A; NO964976L; HUT75672A; UA62908C2; TJ392B; SK149396A3; CA2191088A1; EP0762888B1; US20050171286A1; AU2602195A; FI964600L; KR970703154A; US20040106554A1; DE10299030I1; US6342476B1; IL113812A0; KR100403750B1; WO1995031990A1; NZ287335A; FI964600A0

Description

Hintergrund der Erfindung

Das Copolymer-1 ist ein synthetisches Polypeptidanalogon des basischen Myelinproteins (myelin basic protein = MBP), einer natürlichen Komponente der Myelinscheide. Es ist als mögliches therapeutisches Mittel für Multiple Sklerose vorgeschlagen worden [Eur. J. Immunol. (1971) 1: 242 und J. Neurol. Sci (1977) 31: 433]. Das Interesse an Copolymer-1 als Immuntherapie für Multiple Sklerose stammt aus erstmals in den fünfziger Jahren gemachten Beobachtungen, dass Myelinkomponenten wie MBP experimentelle Autoimmunencephalomyelitis (EAE) verhindern oder anhalten. EAE ist eine der Multiplen Sklerose ähnliche Krankheit, die bei dafür anfälligen Tieren künstlich ausgelöst werden kann.
Copolymer-1 wurde von Dr. Sela, Dr. Arnon und deren Mitarbeitern am Weizmann-Institut (Rehovot, Israel) entwickelt. Wie sich zeigt, unterdrückte es EAE [Eur. J. Immunol. (1971) 1: 242; US-A-3,849,550]. In jüngerer Zeit hat sich erwiesen, dass Copolymer-1 vorteilhaft für Patienten ist, die unter einer sich verschlimmernden remittierenden Form von Multipler Sklerose leiden [N. Engl. J. Med. (1987) 317: 408]. Bei Patienten, die mit täglichen Injektionen von Copolymer-1 behandelt wurden, traten weniger Verschlimmerungen und geringere Zunahmen der Behinderung auf als bei einer Kontrollgruppe.
Copolymer-1 ist ein Gemisch von Polypeptiden, das aus Alanin, Glutaminsäure, Lysin und Tyrosin in einem Molverhältnis von etwa 6 : 2 : 5 : 1 zusammengesetzt ist. Es wird durch die chemische Polymerisation der vier Aminosäuren bildenden Produkte mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 23,000 Dalton synthetisiert (US-A-3,849,550).
Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine verbesserte Zusammensetzung von Copolymer-1 zur Verfügung zu stellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Folglich stellt die Erfindung eine Copolymer-1-Fraktion zur Verfügung, die weniger als 5% einer Spezies des Copolymers-1 mit einem Molekulargewicht über 40 Kilodalton enthält und in der über 75% der Fraktion innerhalb eines Molekulargewichtsbereiches von 2 Kilodalton bis 20 Kilodalton liegen.
Eine spezielle Fraktion hat ein durchschnittliches Molekulargewicht von 4 bis 8 Kilodalton.
Eine weitere Fraktion hat ein durchschnittliches Molekulargewicht von 6,25 bis 8,4 Kilodalton.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zubereitung, die das vorstehend erörterte Copolymer-1 umfasst. Außerdem wird die Verwendung dieses Copolymers-1 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Multipler Sklerose beansprucht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Molekulargewichtsverteilung von drei Chargen von Copolymer-1, in denen die Anteile der Spezies mit einem Molekulargewicht über 40 kDa zu sehen sind. Fig. 2 zeigt ähnliche Daten für die molare Fraktion.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Zubereitung von Copolymer-1, die im Wesentlichen frei von Copolymer-1-Spezies mit einem Molekulargewicht über 40 Kilodalton (kDa) ist. Die Zusammensetzung enthält weniger als 5% Copolymer-1-Spezies mit einem Molekulargewicht von 40 kDa oder mehr. Bevorzugt enthält die Zusammensetzung weniger als 2,5% Copolymer-1-Spezies mit einem Molekulargewicht von 40 kDa oder mehr.
Die Erfindung betrifft ein Copolymer-1, in dem über 75% der Molfraktion im Molekulargewichtsbereich von 2 bis 20 kDa liegen.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Copolymer-1 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 4 bis 8,6 kDa. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Copolymer-1 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 4 bis 8 kDa und ein Copolymer-1 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6,25 bis 8,4 kDa.
Erfindungsgemäß kann das Copolymer-1 nach in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, z. B. dem in US-A-3,849,550 offenbarten Verfahren, bei dem das N-Carboxyanhydrid von Tyrosin, Alanin, γ-Benzylglutamat und E-N- Trifluoracetyllysin bei Umgebungstemperatur in wasserfreiem Dioxan mit Diethylamin als Initiator polymerisiert werden. Das Entblockieren der γ-Carboxylgruppe der Glutaminsäure wird durch Bromwasserstoff in Eisessig bewirkt. Anschließend werden die Trifluoracetylgruppen durch 1 M Piperidin aus den Lysinrückständen entfernt. Für die Zwecke dieser Anmeldung sollten die Begriffe "Umgebungstemperatur" und "Raumtemperatur" so verstanden werden, dass sie eine Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 26ºC bedeuten.
Das Copolymer-1 mit dem erforderlichen Molekulargewichtsprofil ist entweder durch an sich bekannte Verfahren erhältlich. Solche Verfahren umfassen die Chromatographie von Copolymer-1, das Spezies mit hohem Molekulargewicht enthält, und das Sammeln der Fraktionen ohne die unerwünschte Spezies oder die Teilhydrolyse durch Säure oder Enzyme, um diese Spezies mit hohem Molekulargewicht zu entfernen, gefolgt von einer Reinigung durch Dialyse oder Ultrafiltration, Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Copolymer-1 mit dem erwünschten Molekulargewichtsprofil besteht darin, die erwünschte Spezies herzustellen, während die Aminosäuren noch geschützt sind, und dann durch Entschützen die richtige Spezies direkt zu erhalten. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können durch herkömmliche in der Technik bekannte Verfahren formuliert werden. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung lyophilisiert und zu einer wässrigen Lösung geformt, die sich für die subkutane Injektion eignet. Alternativ kann das Copolymer-1 auf alle in der Technik bekannten Arten zur Herstellung von oralen, nasalen, bukkalen oder rektalen Formulierungen von Peptidmedikamenten formuliert werden.
Typischerweise wird Copolymer-1 Patienten, die unter Multipler Sklerose leiden, täglich in einer Dosis von 20 mg verabreicht.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, jedoch nicht unbedingt eingeschränkt.

Beispiel 1

Chromatographisches Verfahren zur Herstellung von Copolymer-1 mit geringer Toxizität

Zwei Chargen von Copolymer-1 wurden nach in der Technik bekannten Verfahren hergestellt, z. B. US-A-3,849,550.
Eine Charge wurde dann, wie nachstehend beschrieben, einer chromatographischen Trennung unterzogen.
Eine Säule für die Gelfiltration, FRACTOGEL® TSK HW55 (600 · 26 mm) wurde nach Angaben des Herstellers in einer Superperformance® 26 Merck- Kassette hergestellt. Die Säule wurde mit Wasser equilibriert und Acetonlösung zur Bestimmung des Gesamtvolumens eingespritzt. Die Säule wurde mit 0,2 M Ammoniumacetatpuffer mit einem pH von 5,0 equilibriert. 30 ml Copolymer-1- Proben (20 mg/ml in 0,2 M Ammoniumacetat, pH 5,0) wurden in die Säule eingebracht und Fraktionen alle zehn Minuten gesammelt. Eine Fraktion mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 7 bis 8 kDa wurde zwischen 120 und 130 Minuten isoliert (Charge A).

Analyse des Molekulargewichts

Die UV-Absorption bei 275 nm wurde in einem UVIKON® 810 Spektrophotometer bestimmt. Die Proben wurden verdünnt, um eine UV-Absorption von weniger als einer Absorptionseinheit zu erhalten. Die Molekulargewichtsverteilung der beiden Chargen wurde auf einer kalibrierten Gelfiltrationssäule (Superose® 12) bestimmt.
Für die Copolymer-1-Charge A wurde ein durchschnittliches Molekulargewicht von 7 bis 8 kDa ermittelt. 2,5% dieser Charge hatten ein Molekulargewicht von mehr als 32 kDa, aber keine in dieser Charge vorhandene Copolymer-1-Spezies hatte ein Molekulargewicht von mehr als 40 kDa.
Die andere Charge von Copolymer-1, die nicht chromatographiert worden war, hatte ein durchschnittliches Molekulargewicht von 12 kDa. 2,5% der Charge hatten ein Molekulargewicht von mehr als 42 kDa, und 5% der gesamten Copolymer-1-Spezies in dieser Charge hatten ein Molekulargewicht von mehr als 40 kDa.

Beispiel 2

Toxizitätsanalyse

A: In vivo

Drei Chargen von Copolymer-1 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 7,3 und 8,4 kDa (weniger als 2,5% Copolymer-1-Spezies über 40 kDa) und 22 kDa (mehr als 5% Copolymer-1-Spezies über 40 kDa) wurden dem nachstehend beschriebenen Toxizitätstest unterzogen. In jedem Fall verwendete man 5 Mäuse pro Experimentalgruppe.

Verfahren

Copolymer-1 wurde in destilliertem Wasser gelöst, um eine Lösung von 2 mg/ml des Wirkstoffs zu erhalten. Jeder Maus wurden 0,5 ml der Testlösung in die laterale Schwanzvene injiziert. Die Mäuse wurden über einen Zeitraum von 48 Stunden auf Mortalität und die relevanten klinischen Anzeichen beobachtet. Diese Beobachtungen wurden 10 Minuten, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Injektion aufgezeichnet. Wenn am Ende der 48 Stunden noch alle Tiere am Leben waren und man keine negativen Signale beobachtet hatte, wurde die Charge als "nichttoxisch" bezeichnet. Wenn jedoch eine oder mehrere Mäuse gestorben oder negative Anzeichen gezeigt hatte, wurde die Charge als "toxisch" bezeichnet.
Die Chargen mit dem durchschnittlichen Molekulargewicht von 7,3 und 8,4 kDa wurden beide als "nichttoxisch" bezeichnet, während in der Charge mit dem durchschnittlichen Molekulargewicht von 22 kDa drei von fünf Mäusen am Ende der 48 Stunden gestorben waren. Folglich wurde diese Charge als "toxisch" bezeichnet.

B: In vitro

RBL - Degranulationstest

I. Einführung

Die Freisetzung von Histamin (oder Serotonin) aus basophilen Granulocyten ist ein in vitro Modell für eine sofortige Überempfindlichkeit. Die basophile Leukämie-Zelllinie bei Ratten (RBL-2H&sub3;) wurde entwickelt und als hochsensibles, gleichmäßiges, leicht in einer Kultur aufrechtzuerhaltendes und reproduzierbares System gekennzeichnet [E. L. Basumian, C. Isersky, M. G. Petrino und R. P. Siraganian, Eur. J. Immunol. 11, 317 (1981)]. Der physiologische Anreiz für die Histaminfreisetzung beinhaltet das Binden des Antigens an membrangebundene IgE- Moleküle, was zum Vernetzen der letzteren und der darauffolgenden Auslösung einer komplizierten biochemischen Kaskade führt. Neben diesen physiologischen, durch Immunoglobulin vermittelten Auslösern kann durch verschiedene, nicht durch IgE vermittelte Anreize auch eine Degranulation in Gang gesetzt werden. Unter diesen sind verschiedene Peptide und synthetische Polymere, z. B. Polylysin ([R. P. Siraganian; "Trends in Pharmacological Sciences", 432 (Oktober 1983)]. Der RBL-Degranulationstest wird daher verwendet, um diejenigen Chargen von Polymer-1 auszusondern, die eine erhebliche Degranulation bewirken und daher unerwünschte lokale und/oder systemische Nebenwirkungen hervorrufen könnten.

II. Prinzip des Testverfahrens

Basophile Leukämiezellen von Ratten (RBL-2H&sub3;) werden mit [³H]-Serotonin beschickt und anschließend mit 100 ug des Copolymers-1, das getestet werden soll, inkubiert. Chargen von Copolymer-1, die eine unspezifische Degranulation auslösen, setzen [³H]-Serotonin in das Medium frei. Die Radioaktivität im Medium wird durch einen Szintillationszähler gezählt und das gesamte in die Zellen inkorporierte radiomarkierte Serotonin in den pelletisierten Zellen bestimmt. Der Prozentsatz der Degranulation wird als Prozentsatz des Serotonins berechnet, das aus dem gesamten inkorporierten Serotonin freigesetzt wird.

III. Ergebnisse

Vier Chargen von Copolymer-1 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 6.250 und 14.500 wurden sowohl auf den Prozentsatz der Spezies mit einem Molekulargewicht über 40 kDa als auch auf Degranulation der RBLs analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Wie man sieht, ist dann, wenn der Prozentsatz der Spezies mit dem hohem Molekulargewicht, gering ist (< 2,5), die prozentuale Freisetzung von Serotonin, der Indikator für die Toxizität, ebenfalls gering, und umgekehrt.

Beispiel 3

Herstellung von Trifluoracetyl-Copolymer-1

Geschütztes Copolymer-1 wird wie von Teitelbaum et al., Eur. J. Immun., Band 1, S. 242 (1971) beschrieben aus den N-Carboxyanhydriden von Tyrosin (18 g), Alanin (50 g), γ-Benzylglutamat (35 g) und Trifluoracetyllysin (83 g), die in 3,5 l Dioxan gelöst waren, hergestellt.
Das Polymerisationsverfahren wird durch die Zugabe von 0,01 bis 0,02% Diethylamin in Gang gesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt und dann in 101 Wasser gegossen. Das Produkt (geschütztes Copolymer-1) wird filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Entfernung der γ-Benzylblockierungsgruppen aus dem Glutamatrückstand erfolgt durch Behandlung des geschützten Copolymers-1 mit 33% Bromwasserstoffsäure in Eisessig bei Raumtemperatur über 6 bis 12 Stunden unter Rühren. Das Produkt wird in überschüssiges Wasser gegossen, filtriert, gewaschen und getrocknet, wodurch man das Trifluoracetyl-Copolymer-1 enthält.

Beispiel 4

Herstellung von Trifluoracetyl-Copolymer-1

Geschütztes Copolymer-1 wird wie von Teitelbaum et al., Eur. J. Immun., Band 1, S. 242 (1971) beschrieben aus den N-Carboxyanhydriden von Tyrosin (18 g), Alanin (50 g), γ-Benzylglutamat (35 g) und Trifluoracetyllysin (83 g), die in 3,5 l Dioxan gelöst waren, hergestellt.
Das Polymerisationsverfahren wird durch die Zugabe von 0,01 bis 0,02% Diethylamin in Gang gesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt und dann in 10 l Wasser gegossen. Das Produkt (geschütztes Copolymer-1) wird filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Das geschützte Copolymer-1 wird mit 33%iger Bromwasserstoffsäure in Essigsäure behandelt, wodurch die Ω-Benzylschutzgruppe vom 5-Carboxylat des Glutamatrückstandes entfernt und das Polymer in kleinere Polypeptide gespalten wird. Die Zeit, die erforderlich ist, um ein Copolymer-1 mit einem Molekulargewicht von 7.000 ± 2.000 Da zu erhalten, hängt von der Reaktionstemperatur und der Größe des geschützten Copolymers-1 ab. Bei Temperaturen zwischen 20 und 28ºC wird bei jeder Charge eine Testreaktion über unterschiedliche Zeiträume durchgeführt, z. B. von 10 bis 50 Stunden.
Die Ergebnisse bezüglich der Molekulargewichte dieser Reaktionen im kleinen Maßstab werden berechnet und die Kurve des Molekulargewichts im Vergleich zur Zeit erstellt. Die Zeit, die erforderlich ist, um ein Molekulargewicht von 7.000 ± 2.000 zu erhalten, wird aus der Kurve berechnet und auf eine Reaktion im größeren Maßstab skaliert. Im Durchschnitt beträgt der Zeitraum 17 Stunden, wenn man bei 26ºC arbeitet. Das Produkt wird in überschüssiges Wasser gegossen, filtriert, gewaschen und getrocknet, wodurch man das Trifluoracetyl-Copolymer-1 erhält.

Herstellung von Copolymer-1 mit geringer Toxizität

20 g Trifluoracetyl-Copolymer-1 werden in 1 l Wasser dispergiert und mit 100 g Piperidin versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und filtriert. Die Lösung von rohem Copolymer-1 wird in Dialysebeutel verteilt und bei 10 bis 20ºC gegen Wasser dialysiert, bis man einen pH von 8 erhält. Dann wird sie gegen etwa 0,3%ige Essigsäure und erneut gegen Wasser dialysiert, bis man einen pH von 5,5 bis 6,0 erhält. Diese Lösung wird dann konzentriert und bis zur Trockenheit lyophilisiert.

Claims

1. Copolymer-1-Fraktion, worin die Fraktion weniger als 5% einer Species des Copolymer-1 mit einem Molekulargewicht über 40 Kilodalton enthält und worin über 75% der Fraktion innerhalb eines Molekulargewichtsbereiches von 2 Kilodalton bis 20 Kilodalton liegt.

2. Die Copolymer-1-Fraktion gemäß Anspruch 1, worin das Copolymer-1 ein mittleres Molekulargewicht von 4 bis 8 Kilodalton aufweist.

3. Die Copolymer-1-Fraktion gemäß Anspruch 1, worin das Copolymer-1 ein mittleres Molekulargewicht von 6,25 bis 8,4 Kilodalton aufweist.

4. Zubereitung für die Verwendung bei der Behandlung der Multiplen Sklerose, worin die Fraktion weniger als 5% einer Species an Copolymer-1 mit einem Molekulargewicht von über 40 Kilodalton enthält und 75% des Copolymer-1 in der Fraktion innerhalb eines Molekulargewichtsbereichs von 2 Kilodalton bis 20 Kilodalton liegt.

5. Die Zubereitung für die Verwendung in der Behandlung von Multipler Sklerose gemäß Anspruch 4, umfassend

eine pharmazeutisch wirksame Menge einer Copolymer-1-Fraktion, worin das Copolymer-1 in der Fraktion ein mittleres Molekulargewicht von 4 bis 8 Kilodalton aufweist, und

einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

6. Die Zubereitung für die Verwendung in der Behandlung von Multipler Sklerose gemäß Anspruch 4, umfassend

eine pharmazeutisch wirksame Menge einer Copolymer-1-Fraktion, worin das Copolymer-1 in der Fraktion ein mittleres Molekulargewicht von 6,25 bis 8,4 Kilodalton aufweist, und

einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

7. Verfahren zur Herstellung eines Copolymer-1 mit über 75% seiner molaren Fraktion im Molekulargewichtsbereich von 2 bis 20 Kilodalton, umfassend das Umsetzen von geschütztem Copolymer-1 mit Bromwasserstoffsäure zur Bildung von Trifluoracetyl-Copolymer-1, worin die Reaktion für eine Zeit und eine Temperatur stattfindet, die zuvor über Re-aktionen im kleinen Ansatz ermittelt wurden,

Behandeln des Trifluoracetyl-Copolymer-1 mit einer wässrigen Piperidin-Lösung zur Bildung von rohem Copolymer-1, und

Reinigen des rohen Copolymer-1, um zu rohem Copolymer-1 mit über 75% seiner molaren Fraktion innerhalb des Molekulargewichtsbereichs von 2 bis 20 Kilodalton zu führen.

8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das geschützte Copolymer-1 für 10 bis 50 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 28ºC mit Bromwasserstoffsäure umgesetzt wird.

9. Das Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das geschützte Copolymer-1 für etwa 17 Stunden bei einer Temperatur von etwa 26ºC mit Bromwasserstoffsäure umgesetzt wird.

10. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das rohe Copolymer-1 ein Molekulargewicht von 5 bis 9 Kilodalton aufweist.

11. Verwendung einer Copolymer-1-Fraktion, worin das Copolymer-1 ein mittleres Molekulargewicht von 4 bis 8 Kilodalton aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Multiplen Sklerose.

12. Verwendung einer Copolymer-1-Fraktion, worin das Copolymer-1 ein mittleres Molekulargewicht von 6,25 bis 8,4 Kilodalton aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Multiplen Sklerose.