Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Abgabe eines
therapeutischen, z. B. antimikrobiellen, oder kosmetischen, z. B.
fleckentfernenden Mittels, auf die Zahnoberfläche durch
Verwendung von Antikörpern, die Proteinstrukturen (Cryptitope)
auf einem Belag spezifisch erkennen und
Mundpflegezusammensetzungen, die diese Antikörpersysteme, wie im Folgenden
genauer beschrieben, enthalten.
Hintergrund der Erfindung
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Der erworbene Zahnbelag oder Zahnschmelzbelag wird durch
selektive Adsorption von Speichelproteinen auf der sauberen
Zahnoberfläche gebildet (Bennick et al. (1979) Biochem. J.
183, 115-126; Bennick et al. (1983) Arch. Oral Biol. 28, 19-
27; Rolla et al. (1983) Scand. J. Dent. Res. 91, 186-190; Al-
Hashimi et al. (1989) Arch. Oral Biol. 34, 289-295).
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Es wird angenommen, dass Speichelproteine bei der Adsorption
einer Konformationsänderung unterliegen, die zur Freilegung
verborgener Strukturen führen, die als "Cryptitope"
bezeichnet werden (Moreno et al. (1991) Biofouling 4, 3-24).
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In-vitro-Untersuchungen deuten darauf hin, dass verschiedene
orale Mikroorganismen, einschließlich Actinomyces viscosus
(ein Organismus, der bevorzugt die Zähne besiedelt und mit
Gingivitis in Verbindung gebracht wird) die Fähigkeit haben,
solche Cryptitope zu erkennen und dabei effizient an
Zahnschmelz zu binden, was zu mikrobieller Adhäsion führt
(Gibbons et al. (1990) Arch. Oral Biol. 35 (Ergänzung) 1075-
1145). Die Entwicklung von Plaque folgt häufig einer
mikrobiellen Adhäsion, die ohne eine gute Mundhygiene häufig zu
einem Krankheitszustand führt, z. B. Karies, Gingivitis.
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Es wurde gezeigt, dass bestimmte orale Organismen, z. B. A.
viscosus, S. gordonii stark an prolinreiche Proteine (PRPs)
auf Hydroxyapatit-Oberflächen binden, nicht aber an PRPs in
Lösung (Gibbons et al. (1988) Infect. Immun. 56, 439-445;
R.J. Gibbons (1989) J. Dent. Res. 68, 750-760).
Untersuchungen mit FTIR-Spektren von PRPs in Lösung und in adsorbiertem
Zustand haben auch bemerkenswerte Veränderungen der FTIR-
Spektren gezeigt, die mit signifikanten Veränderungen bei dem
Anteil an β-Faltblatt und β-Schleifen von adsorbierten
Proteinen übereinstimmen (Moreno et al. (1991) Biofouling 4, 3-
24). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen deuten auf die
Cryptitoptheorie hin, bestätigen sie aber nicht, wonach
Proteine einer Konformationsänderung unterliegen und neue
Stellen bei einer Adsorption an einer Oberfläche freigelegt
werden. Weiterhin ist es nicht bekannt, ob Veränderungen der
Konformation oder Cryptitopexpression auf oralen Oberflächen
neue immunologische Ziele oder Epitope liefern.
Gegenstand der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von
monoklonalen Antikörpern (murin), die die an der Oberfläche
gebundene Form eines gegebenen Belagsbestandteils (Cryptitop)
auf dem erworbenen Schmelzbelag exklusiv erkennt. Solche
Antikörper, die gegen einen Speichelbelag gezüchtet wurden,
können verwendet werden, um "aktive Bestandteile" zu dem
Belag hinzuführen.
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Die einzigen anderen Antikörper, von denen gezeigt wurde,
dass sie Protein auf einem Speichelbelag erkennen, sind
monoklonale Antiidiotyp-Antikörper, die gegen angenommene
Adhäsine von S. sanguis gezüchtet wurden. Die Ergebnisse haben hier
die Fähigkeit der Antikörper gezeigt, S. sanguis-Adhäsin mit
hoher Spezifizität nachzuahmen und an ein Epitop zu binden,
das ein Rezeptor für das S. sanguis-Adhäsin auf einem
Speichelbelag ist (Gong et al. (1993) J. Dent. Res. 72, Abstract
1766). Diese Antikörper unterscheiden sich jedoch von denen
der vorliegenden Erfindung darin, dass sie nicht gegen
Cryptitope gezüchtet wurden und es ist nicht bekannt, ob sie
tatsächlich Cryptitope auf einem Speichelbelag erkennen.
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Weitere Forschungen auf diesem Gebiet schließen die
Verwendung eines neuen gentechnisch hergestellten Bindungsproteins
ein, das mit einem bakteriellen Adhäsin um eine
Belagsbindungsstelle konkurriert. Hier wird sich ein Belag bilden
gelassen und dann werden Stellen erkannt durch bestimmte orale
Bakterien, die mit dem Bindungsprotein bedeckt sind (WO-A-
92/06192). Dieses Bindungsprotein wurde jedoch auf Basis
eines speziellen Aminosäuresequenzbereichs eines
Speichelproteins (PRP) in Lösung und nicht auf einer Oberfläche
hergestellt und würde daher nicht mit der Konformation der
Struktur übereinstimmen.
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Daten, die die Bindung von humanen Speichelkomponenten an
orale Stämme von Streptokokkenbakterien zeigen (z. B. Douglas
et al., Archs. Oral Biol. 29, 751-757 (1984); Newman et al.
(1993) Electrophoresis 14, 1322-1327; Newman et al. (1994) J.
Dent. Res. 73, Abstract Nr. 396) deuten auf die Gegenwart
eines Speichel-"Belags" über den Bakterienoberflächen innerhalb
eines Biofilms.
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Überraschenderweise wurde gefunden, dass die
erfindungsgemäßen Antikörper zusätzlich dazu, dass sie Cryptitope auf
Modellzahnoberflächen erkennen, auch die gleichen Cryptitope
auf Bakterienbelägen erkennen. Diese Antikörper sind daher
ideale Ziele, um aktive Bestandteile nicht nur zu dem
erworbenen Schmelzbelag zu führen, sondern auch zu einer
Speichelbeschichtung auf einem sich entwickelnden Biofilm.
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Eines der größeren technischen Probleme, die mit der
Entwicklung effektiver aktiver Systeme für die Mundpflege verbunden
sind, besteht darin, die Mittel in erheblichem Ausmaß an die
gewünschte Stelle, z. B. den Zahn, wo die Plaquebildung
stattfindet, zu bringen. Antiplaque-Mittel, die derzeit verwendet
werden, sind substantiv, wenn sie an orale Oberflächen binden
über (i) elektrostatische oder (ii) hydrophobe
Wechselwirkungen. Die Bindung, die reversibel ist, ist jedoch nicht
spezifisch, d. h. die Mittel binden an alle Mundgewebe.
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Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können verwendet
werden, um Mittel (z. B. therapeutische, kosmetische) zu einer
Stelle zu bringen, die als Ankerpunkt innerhalb des Mundes
dienen kann und dadurch die notwendige Substantivität für
eine maximale Wirkung liefern.
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Obwohl Antikörper, die gegen verschiedene orale Bakterien
gezüchtet wurden, z. B. S. mutans, S. sanguis, verwendet werden
können, um antimikrobielle Mittel zu der bakteriellen
Oberfläche zu führen, in einem Versuch, das Plaque abzubauen,
unterscheiden sich die Belagantikörper der vorliegenden
Erfindung von diesen Antikörpern darin, dass sie zusätzlich zu
ihrer Reaktivität gegen eine Speichelbeschichtung auf einem
sich entwickelnden Biofilm, wo sie aktive Bestandteile für
den Abbau des Plaques hinführen können, auch aktive
Bestandteile zu einer sauberen Zahnoberfläche bringen können, wo sie
den Aufbau von Plaques verhindern können. Diese Antikörper
können auch einen Weißmacher für den Zahn (oder ein Mittel,
das Flecken abbaut) zu der Stelle der extrinsischen
Fleckbildung, d. h. dem erworbenen Schmelzbelag, führen.
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Konjugate können zwischen den monoklonalen Antikörpern dieser
Erfindung und verschiedenen aktiven Verbindungen gebildet
werden, einschließlich Enzymen, Peptiden, Antikörpern,
teilchenförmigen Systemen, Liganden etc. Diese Verbindungen
können so zu Speichelbelag auf der Zahnoberfläche geführt
werden, dass z. B. die Plaqueentwicklung, Fleckenbildung etc.
kontrolliert wird. Die Zielführung und damit Substantivität
kann zu einer verminderten Menge an "aktivem Mittel", das
erforderlich
ist, führen. Die Konjugate können chemisch oder
über Werkzeuge der Molekularbiologie gebildet werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Der Zweck der vorliegenden Erfindung besteht darin, die
monoklonalen Antikörper der Erfindung als Zielgruppen für die
substantive Abgabe von aktiven Mundpflegemitteln,
insbesondere antimikrobiellen und Antifleckenmitteln, zu dem
Speichelbelag auf dem Zahn und der Speichelbeschichtung auf
bakteriellen Oberflächen zu bringen.
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Ein erster Antikörper oder ein Antikörperfragment bindet, an
eine Zielstelle und ein oder mehrere weitere Antikörper oder
Fragmente binden kollektiv ein Mittel an der Zielstelle.
Konjugate werden gebildet entweder durch (i) chemische
Konjugation zwischen Belagantikörpern (Fragmenten) und einem Mittel
oder (ii) rekombinante DNA-Technik. Alternativ kann eine
Fusion gemacht werden, die aus der bindenden Region des
Antikörperfragments und dem "aktiven Mittel" besteht.
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Schließlich können Konjugate gebildet werden durch nicht
kovalente selbst zusammenführende Systeme, wobei (i) ein
Antibelag-Antikörper oder Fragment davon zu der gewünschten
Stelle führt und ein anderes Antikörper-(oder Fragment)-System zu
dem Antibelag-Antikörper führt oder (ii) Hybridantikörper
oder Fragmente zum Belag führen und ein antimikrobielles
Enzym oder eine andere aktive Verbindung (z. B. bispezifische
Fragmente mit Antibelag- und Antiglucoseoxidase-Spezifität)
"hinzuziehen".
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Die monoklonalen Antikörper können gegen Speichelbeläge
erzeugt werden, die aus Parotis-, submandibularem/sublingualem
und dem gesamten Speichel gebildet werden:
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Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, dass
Belagantikörper, die gegen einen Parotisspeichelbelag gezüchtet wurden,
ihr Ziel sowohl auf aus Parotisbelägen als auch aus gesamtem
Speichel in vitro gebildeten Belägen erkennen. Ein weiterer
Vorteil besteht darin, dass solche Antikörper substantiv sind
(d. h. dem Speichelfluss widerstehen), aber nicht durch
lösliche Speichelkomponenten gehemmt werden und gegenüber ihrem
Ziel in Gegenwart eines sich entwickelnden Biofilms reaktiv
bleiben. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass diese
Antikörper reaktiv sind gegenüber einem in vivo geformten Belag.
Solche Antikörper sind ideale Werkzeuge, um "aktive Mittel"
zu der Zahnoberfläche hinzuführen. Solche aktiven Mittel
können sowohl zu einer sauberen Zahnoberfläche geführt werden,
d. h. dem erworbenen Schmelzbelag, um Plaque- oder
Fleckenbildung zu vermeiden, als auch zu einer Speichelbeschichtung auf
einem sich entwickelnden bakteriellen Biofilm, um die Plaque-
oder Fleckenbildung abzubauen.
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Aktive Mittel, die verwendet werden können, schließen ein:
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(i) Antimikrobielle Mittel:
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(a) antimikrobielle Enzyme, z. B. Oxidasen,
einschließlich Glucoseoxidase, Lactatoxidase,
Galactoseoxidase, Harnsäureoxidase; Peroxidasen,
einschließlich Meerrettichperoxidase,
Myeloperoxidase, Lactoperoxidase, Chlorperoxidase; Proteasen
einschließlich Papain, Pepsin, Trypsin, Ficin,
Bromelin; die Zellwand lysierende Enzyme,
einschließlich Lysozym; spezifische
Enzyminhibitoren, wie solche, die die Neuraminidaseaktivität
oder -Produktion hemmen; Plaquematrixinhibitoren,
einschließlich Dextranasen, Mutanasen.
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(b) antimikrobielle Peptide, z. B. Peptide
einschließlich Bakteriocine, Histatine, Defensine,
Cecropine.
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(c) Komplex bildende Mittel, z. B. Eisen
komplexierendes Lactoferrin.
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(ii) Kosmetische Vorteile erzeugende aktive Mittel:
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(a) Zahn weißmachende Mittel, z. B. bleichende Enzyme,
einschließlich Glucoseoxidase, Myeloperoxidase;
Enzyme, die Flecken abbauen, einschließlich
Proteasen.
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(b) Antigeruchsverbindungen, einschließlich Zink- und
Metallionenkomplexe.
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(iii) Alkali erzeugende Systeme, einschließlich Urease,
Arginin, Desaminase, Asparaginase etc.
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(iv) Teilchenförmige Systeme, einschließlich Zinkoxid,
Latex, Kapseln, Liposomen, Emulsionen.
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(v) Redoxpuffer.
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Bevorzugte Systeme schließen zielgerichtete Enzyme
(Enzymsubstrate in Gelen) zielgerichtete Systeme in Spüllösungen
(Substrate in Gelen); zielgerichtete Enzyme und Substrate in
Spülungen zielgerichtete Enzyme und Substrate in Pasten;
zielgerichtete Enzyme und Substrate in Pastillen ein.
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Die empfohlene Konzentration des zielgerichteten aktiven
Mittels/Antikörpers in einem Produkt ist etwa 0,01 ug/g bis 50
mg/ml.
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Die oralen Zusammensetzungen können in irgendeiner geeigneten
Applikationsform formuliert werden, z. B. als Emulsionen,
Gele, Mundspülungen, Zahnpulver und Zahnpasten. Sie können als
einzelnes Präparat formuliert werden oder sie können als
unterschiedliche Präparate für Mehrkammerbehälter formuliert
werden.
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Die Mundpflegezusammensetzungen können weiterhin fakultative
übliche Inhaltsstoffe enthalten, z. B. pharmazeutisch
annehmbare Träger, wie Stärke, Saccharose, Wasser oder
Wasser/Alkohol-Systeme etc. Geringe Mengen von Tensiden können auch
enthalten sein, z. B. anionische, nichtionische und amphotere
Tenside. Wenn Präparate zu einer Zahnpasta formuliert werden,
können sie die gewöhnlichen Zahnpastainhaltsstoffe enthalten.
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So können sie teilchenförmige abrasive Materialien enthalten,
einschließlich agglomerierter teilchenförmiger abrasiver
Materialien, wie Siliciumdioxide, Aluminiumoxide,
Calciumcarbonate, Dicalciumphosphate, Calciumpyrophosphate,
Hydroxyapatite, Trimetaphosphate, unlösliche Hexametaphosphate usw.,
gewöhnlich in Mengen zwischen 5 und 60 Gew.-%.
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Weiterhin können die Zahnpastapräparate Feuchthaltemittel,
wie Glycerin, Sorbit, Propylenglycol, Polyethylenglycol,
Xylit, Lactit usw. enthalten.
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Bindemittel und Verdickungsmittel, wie
Natriumcarboxymethylcellulose, Xanthangummi, Gummi arabicum etc., können auch
enthalten sein, ebenso wie synthetische Polymere, z. B.
Polyacrylate und Carboxyvinylpolymere, wie Carbopol®.
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Aromastoffe, wie Pefferminz- und Spearmintöle können auch
enthalten sein, ebenso wie Konservierungsmittel,
Trübungsmittel, Farbstoffe, den pH einstellende Mittel, Süßstoffe usw.
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Antibakterielle Mittel können auch enthalten sein, z. B.
Triclosan, Chlorhexidin, Kupfer-, Zink- und Zinnsalze, wie
Zinkcitrat, Natriumzinkcitrat und Zinnpyrophosphat,
Sanguinarinextrakt, Metronidazol. Weitere Beispiele für zusätzliche
antibakterielle Mittel sind quaternäre Ammoniumverbindungen,
wie Cetylpyridiniumchlorid; Bis-guanidide wie
Chlorhexidindigluconat, Hexetidin, Octenidin, Alexidin; halogenierte
bisphenolische Verbindungen, wie 2,2'-Methylenbis (4-chlor-6-
bromphenol).
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Polymere Verbindungen, die die Abgabe aktiver Inhaltsstoffe,
wie antibakterieller Mittel, verbessern können, können auch
enthalten sein. Beispiele für solche Polymere sind Copolymere
von Polyvinylmethylether
mit Maleinsäureanhydrid und andere
ähnliche die Abgabe verbessernde Polymere, z. B. solche, die
in DE-A-39 42 643 (Colgate) beschrieben werden.
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Weiterhin können entzündungshemmende Mittel wie Ibuprofen,
Flurbiprofen, Aspirin, Indomethacin etc. enthalten sein.
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Antikariesmittel wie Natrium- und Zinnfluorid, Aminfluoride,
Mononatriumfluorphosphat, Casein, Plaguepuffer, wie
Harnstoff, Calciumlactat, Calciumglycerophosphat,
Strontiumpolyacrylate können auch enthalten sein. Andere fakultative
Inhaltsstoffe schließen Vitamine, wie Vitamin C, und
Pflanzenextrakte ein. Desensibilisierende Mittel, wie
Kaliumcitrat, Kaliumchlorid, Kaliumtartrat, Kaliumbicarbonat,
Kaliumoxalat, Kaliumnitrat ebenso wie Strontiumsalze können auch
enthalten sein.
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Puffer und Salze, um den pH und die Ionenstärke der
Zusammensetzungen zu puffern, können auch enthalten sein. Liposomen
und andere eingekapselte Mittel können auch verwendet werden,
um die Abgabe oder Stabilität aktiver Inhaltsstoffe zu
verbessern.
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Weiterhin können die oralen Zusammensetzungen
steinbildungsverhindernde Mittel enthalten, wie Alkalipyrophosphate,
hypophosphithaltige Polymere, organische Phosphonate,
Phosphocitrate etc.
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Außerdem können die Zusammensetzungen weitere funktionelle
Biomoleküle enthalten, wie Bakteriozine, Antikörper, Enzyme
usw.
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Andere fakultative Inhaltsstoffe, die enthalten sein können,
sind z. B. Bleichmittel, z. B. solche wie in EP-A 0 545 594
beschrieben, organische Peroxysäuren, schäumende Systeme wie
Natriumbicarbonat-/Citronensäuresysteme,
Farbveränderungssysteme usw..
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Die Mundpflegezusammensetzung enthält, wenn sie als
Mundspülung formuliert ist, gewöhnlich eine Wasser-/Alkohollösung,
Aromastoff, Feuchthaltemittel, Süßstoff und Farbstoff.
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Die vorliegende Erfindung wird durch Beispiele weiter
erläutert.
Beispiel 1
Erzeugung von Cryptitop-spezifischen monoklonalen Antikörpern
Methode
1) Immunisierung
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Immunogen - 1 ml frisch gesammelter Parotisspeichel wurde zu
35 mg vorgewaschenem (gewaschen mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung: PBS pH 7,4) Hydroxyapatit (HA) 2 Stunden bei 4ºC
gegeben, wobei in einem aufrecht stehenden Mischer gemischt
wurde. Mit Parotisspeichel beschichteter HA wurde dann
gewaschen (PBS) und zentrifugiert X2 (2000 g). Das entstehende
Pellet wurde vor der Verabreichung des Impfstoffs an Mäuse
(Tag 1) entweder mit Freunds Adjuvans oder Titres-Adjuvans
vermischt, um die Immunantwort zu verstärken. Die Mäuse
erhielten das obige Immunogen am Tag 8 erneut. Die Immunantwort
der Mäuse wurde an den Tagen 15, 22, 30 durch Injektion von
mit Parotisspeichel beschichtetem HA geboostert. Eine Fusion
wurde am Tag 35 durchgeführt.
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Zellfusion - Die Milz einer immunisierten Maus wurde
entnommen und in 30 ml serumfreies RPMI-1640-Medium gebracht, um
eine Einzellsuspension zu bilden. Die Milzzellen wurden dann
mit einer Myelomzelllinie unter Verwendung von
Polyethylenglycol fusioniert. Die Zellen wurden dann in HAT-(Hypoxanthin,
Aminopterin, Thymidin)-Medium (einem Medium, das
verwendet wird, um die Bedingungen zu fördern, die nur das
Wachstum von Hybridzellen zulassen) dispergiert und in 96-
Napf-Gewebekulturplatten aufgeteilt.
2) Screening-Assay - Nachweis von Antikörpern mit einer
Spezifität für oberflächengebundene Determinanten auf mit
Parotisspeichel beschichtetem HA.
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Mit PBS gewaschener HA wurde zu frisch gesammeltem
Parotisspeichel in einer Konzentration von 35 mg HA/ml
Parotisspeichel zugegeben. Die Probe wurde dann über Nacht in
einem aufrecht stehenden Mischer bei 4ºC gemischt. Danach wurde
die Probe gewaschen (PBS) und zentrifugiert (2000 g) X2 vor
der Zugabe von 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (PBSA). Mit
Speichel beschichteter HA wurde dann in einem aufrecht
stehenden Mischer 1 Stunde bei 4ºC gemischt. Die Probe wurde
dann wie vorher gewaschen, bevor PBSA zu dem HA-Pellet auf
eine Konzentration von 5 mg HA/100 ul PBSA zugegeben wurde.
Danach wurden 100-ul-Aliquots der HA-Probe in Eppendorf®-
Röhrchen gegeben. PBSA (150 ul) oder frischer Parotisspeichel
(150 ul) wurden dann zu HA vor der Zugabe von Antikörper (100
ug/ml) zugegeben.
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Die Proben wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang
inkubiert und zweimal (Zeit 0,15 Minuten) während dieser Zeit
gevortexed. Die Proben wurden gewaschen und X3 mit 500 ul 0,05%
Tween® 20 in PBS (PBST) zentrifugiert. Ein mit
Meerrettichperoxidase (HRP) markierter sekundärer Antikörper wurde dann
30 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben (250 ul 1/1000
Verdünnung) (die Probe wurde zum Zeitpunkt 0 und 15 Minuten
gevortexed, wie oben). Danach wurden die Proben wiederum
gewaschen und X3 zentrifugiert mit 500 ul PBST vor der Zugabe von
250 ul des Substrats TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) (4
Minuten, RT). Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 2
M H&sub2;SO&sub4; (250 ul). Schließlich wurden 400 ul jeder
Reaktionsmischung filtriert und das Filtrat auf eine ELISA-Platte
überführt, wo auf einem Spektrophotometer bei einer
Absorption von 450 nm abgelesen wurde.
Ergebnisse
Erzeugung von Cryptitop-spezifischen monoklonalen Antikörpern
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Zahlreiche Zelllinien wurden auf die Antikörperproduktion
gescreent in dem oben modifizierten ELISA-Screen. Zelllinien,
die positiv waren, wurden kloniert und dann auf mg-Mengen in
Hohlzellfaserreaktoren "aufgezogen".
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Tabelle 1 zeigt ELISA-Ergebnisse von klonierten und
aufgezogenen monoklonalen Antikörpern, bei denen Antikörper gegen
mit Speichel beschichteten HA in Gegenwart sowohl von Puffer
als auch Speichel reagiert hatten. Die Tatsache, dass
Speichel die Aktivität der Antikörper nicht hemmte oder
verminderte, deutet darauf hin, dass die Antikörper bevorzugt
adsorbiertes Speichelprotein, d. h. Cryptitope, erkennen. Diese
Antikörper sind somit die ersten Antikörper, die Cryptitope
erkennen.
Tabelle 1
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Negative Kontrolle = 0,11
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(Bemerkung: Die monoklonalen Antikörper waren alle von der
Isotypklasse IgG).
Beispiel 2
Bindung von monoklonalen Antikörpern an Belag und
sich entwickelnde Plaques in vitro
Methode
1) Immunospezifität von monoklonalen Antikörpern sowohl gegen
Parotisspeichelbelag als auch Gesamtspeichelbelag
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Die Immunospezifität von Antikörpern sowohl gegen
Parotisbeläge als auch Gesamtbeläge wurde bestimmt unter Verwendung
einer konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM). Diese
Methode wurde ausgewählt, da sie (i) eine von dem obigen ELISA
unterschiedliche Nachweisstufe hat und somit ein anderes
Mittel darstellt, um die Spezifität gegenüber
Parotisspeichelbelag zu bestätigen zusätzlich zu dem Reaktivitätstest von
Antikörpern gegen Gesamtspeichelbeläge und (ii) die direkte
insitu-Betrachtung der Reaktion auf Speichel-HA-Scheiben
zuließ. Dies war besonders vorteilhaft bei Zeitverlaufsstudien
(siehe 3 unten).
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Versuch - Der Belag wurde gebildet, indem HA-Scheiben bei 4ºC
über Nacht in 2,5 ml Speichel mit Parotisspeichel oder 2,
Stunden mit Gesamtspeichel (um Proteinabbau zu verhindern)
auf einer schwingenden Plattform STR6 (Stuart) mit maximaler
Geschwindigkeit beschichtet wurden.
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Die Scheiben wurden dann gewaschen (PBS), bevor ein
Blockierungsmittel zugegeben wurde (1 Stunde bei RT), um
nichtspezifische Reaktionen zu vermindern. Das in all diesen
Untersuchungen verwendete Blockierungsmittel war 5% BSA, da sich
zeigte, dass dieses effektiv blockierte und sich
natürlicherweise in Speichel findet. Nach der Blockierungsstufe wurden
die Scheiben wiederum gewaschen vor Zugabe des für den Belag
spezifischen monoklonalen Antikörpers (30 Minuten).
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Nach weiterem Waschen wurde ein zweiter fluoreszierend
markierter (FITC) Antikörper (Vektor) zugegeben (1/20
Verdünnung, 30 Minuten). Schließlich wurden die Scheiben gewaschen
und unter dem CLSM betrachtet.
2) Reaktivität von monoklonalen Antikörpern gegen
Proteinbestandteile von Parotisspeichel und Gesamtspeichel in einem
Western Blot
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Die Spezifität der monoklonalen Antikörper wurde auch mit
einem Western Blot von Speichelprotein untersucht.
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Versuch - Aliquots von Parotisspeichel und Gesamtspeichel
wurden einer SDS-PAGE (Laemmli UK (1970) Nature 227, 680) 1,8
Stunden lang bei 80 Volt unterzogen, bevor die getrennten
Proteine auf Nitrocellulosemembranen (Porengröße 0,45 um,
Sigma) in einer Semi-Trockentransfereinheit (Biorad) 5
Stunden lang (5 Volt) übertragen wurden. Die Membranen wurden mit
Ponceau S. (Sigma) gefärbt, um den erfolgreichen Transfer zu
bestätigen. Die Membranen wurden dann mit 5% BSA (4ºC) 2
Stunden lang blockiert, bevor weitere 2 Stunden lang
Antibelag-Antikörper zugegeben wurden (RT). Die Reaktivität wurde
durch Zugabe eines sekundären mit HRP konjugierten
Antikörpers (RT; 2 Stunden) gefolgt von dem Substrat (4-Chlor-1-
naphthol, Sigma), das die Visualisierung der
Antikörperproteinbanden zuließ, nachgewiesen.
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(Bemerkung: die Antikörper wurden getestet gegenüber
reduzierten und nicht reduzierten Speichelproteinen auf
Acrylamidgelen mit 5 bis 15%. SDS-PAGE-Standards mit niedrigem
Molekulargewicht (Biorad) wurden in allen
Western-Blot-Verfahren verwendet, um eine Größeneinschätzung der
Proteinantikörperbanden zuzulassen).
3) Zeitverlaufsstudien
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Es wurde ein in-vitro-Modell verwendet, um die Mundhöhle
nachzuahmen, um (i) die Substantität der Antikörper und (ii)
die Antibelagsbindung eines reiferen Belags in
Abwesenheit/Gegenwart von Bakterien zu simulieren. Die Beläge wurden
auf HA-Scheiben, wie vorher beschrieben, gebildet. Die
Modelle wurden aus 50-ml-Vorratskolben beschickt, die mit Speichel
gefüllt waren und mit 6 ml/h durchgepumpt wurden. Alle
Modellversuche wurden bei 37ºC durchgeführt. Vorbereitete HA-
Scheiben wurden in modifizierte 1-ml-Pipettenspitzen
eingesetzt, bevor sie auf das Modell übertragen wurden. Nach der
erforderlichen Inkubationszeit wurden die Scheiben entnommen
und mit Antikörper markiert. Die FITC-Bindung wurde mit CLSM
quantitativ ausgewertet.
Versuch (i) - Wirkung von Speichelfluss auf
Antibelag-Antikörperbindung (Substantivitätsbestimmung)
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Die Beläge wurden gebildet unter Verwendung von
Parotisspeichel. Antibelag-Antikörper wurden zu den HA-Scheiben 30
Minuten vor Inkubation in dem Modell zugegeben. Die Scheiben
wurden in dem Modell unter konstantem Speichelfluss gehalten und
in stündlichen Intervallen bis zu 4 Stunden entnommen.
Fluoreszierend markierter Antikörper wurde zugegeben und die
FICT-Bindung mit CLSM wie vorher quantitativ ausgewertet.
Versuch (ii) - Antibelag-Antikörperbindung an reiferen Belag
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Beläge wurden gebildet unter Verwendung von Gesamtspeichel
und Parotisspeichel. Die Wirkungen auf die Bindung von
Antikörpern gegen mit Speichel beschichtete HA-Scheiben, die in
dem Modell bis zu 6 Stunden inkubiert worden waren, wurde
untersucht. Die Modelle wurden mit (siehe * für die
Vorbereitung der Bakterien) und ohne Bakterien inkubiert. Es wurden
auch Modelle durchgeführt, bei denen
Hirn-Herz-Infusionsmedien den Speichel ersetzten. Die Scheiben wurden aus dem
Modell (Zeitpunkt 0, 2, 4 und 6 Stunden) entnommen vor der
Zugabe von Antibelag-Antikörper und anschließend
fluoreszierend markiertem Antikörper. Die FITC-Bindung wurde mit CLSM
quantitativ ausgewertet. Das vollständige Protokoll für
diesen Versuch ist in Fig. 1 aufgeführt.
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- Vorbereitung der Mikroorganismen - Die zur Erzeugung eines
Biofilms mit 3 Bakterien verwendeten Organismen waren
Actinomyces viscosus, Streptococcus mutans SM211 und
Streptococcus oralis: ein Streptomycin-resistenter Stamm. Die
Organismen wurden auf Hirn-Herz-Infusions-(BHI)-Medium, das
mit Agar ergänzt war, gezüchtet (BHI: Oxoid 47 g/l,
Hefeextrakt: Oxoid 5 g/l, Cystein HCL: Sigma 0,1 g/l, Haemin: Sigma
500 mg/l, Vitamin K: Sigma 5 mg/l und steriles
Pferdeblut: Oxoid 50 ml/l), bevor Kolonien aseptisch entnommen
wurden, um sterile BHI-Brühe zu impfen. Nach über-Nacht-
Inkubation wurden die Brühen zentrifugiert (2000 g: 10
Minuten) und dreimal mit PBS gewaschen, bevor die
Bakteriensuspensionen auf OD600nm von 1,0 korrigiert wurden.
Ergebnisse
Bindung von monoklonalen Antikörpern an Belag und
sich entwickelnde Plaques in vitro
1) Immunospezifität von Antikörpern gegenüber Parotis- und
Gesamtspeichelbelägen
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Es wurde gefunden, dass alle Antikörper immunospezifisch
waren für Parotisspeichelbeläge und in einem geringeren Ausmaß
für Gesamtspeichelbeläge. Die Verminderung der Aktivität
beruht wahrscheinlich entweder darauf: (i) dass das Epitop,
gegen das der Antikörper gerichtet ist, nicht so häufig in
Gesamtspeichelbelägen wie in Parotisspeichelbelägen vorkommt
oder (ii) dass die Komponenten in Gesamtspeichel das Epitop
maskieren können.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt:
Tabelle 2 Spezifität von Belag-McAbs gegenüber
Parotis- und Gesamtspeichelbelägen
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* Messung der Fluoreszenz = Pixelintensität
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(Andere getestete IgG-Antikörper = vergleichbar der negativen
Kontrolle)
2) Reaktivität von Antikörpern gegenüber immobilisierten
Proteinen: Western Blot
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Alle Antikörper reagierten mit Proteinbanden von 50, 100 und
200 kDa sowohl in Parotis- als auch Gesamtspeichel. Es ist
ziemlich wahrscheinlich, dass sich die Speichelproteine auf
Nitrocellulosemembranen genauso wie auf Hydroxyapatit
verhalten, wo die Cryptitope freigelegt sind. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 3 gezeigt:
Tabelle 3
Western Blot von Antikörpern gegen Speichelproteine
MeAb McAb-Reaktivität gegen
Proteinbanden (kDa)
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3D5 50, 100, 200
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1A1 50, 100, 200
-
1C6 50, 100, 200
-
1D3 50, 100, 200
-
Neg. Kontrollen negativ
3) Zeitverlaufsstudien
(i) Substantivitätsbestimmung
-
Es wurde keine bemerkenswerte Reduktion der Aktivität der
Antikörper beobachtet, wenn Speichel bis zu 4 Stunden über die
mit Belag beschichteten HA-Scheiben strömen gelassen wurde.
Dieses Ergebnis deutet auf die Substantivität der Antikörper.
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt:
Tabelle 4 Substantivität von Belag-McAbs (ein typisches Ergebnis)
Antikörperbindung
(ii) Antibelagbindung an reifere Beläge in
Abwesenheit/Gegenwart von Bakterien
-
Ein Anstieg der Fluoreszenz, d. h. der Antibelagbindung mit
der Zeit (bis zu 6 Stunden) wurde beobachtet, wenn Antikörper
getestet wurden gegen einen sich entwickelnden Biofilm sowohl
auf Parotis- als auch Gesamtspeichelbelägen, wie in den
beigefügten Fotografien Nr. 1 und 2 gezeigt. Der Anstieg der
Antikörperbindung beruhte nicht nur auf (i) einer Vergrößerung
des Bereichs, der durch die Entwicklung eines intensiveren
Belags verursacht wird, da ein Anstieg der Fluoreszenz nicht
beobachtet wurde bei einer sterilen Kontrolle, d. h.
Parotisspeichel, keine Bakterien (Fotografie Nr. 3) oder (ii) auf
metabolisierenden Organismen, da kein Anstieg der Fluoreszenz
beobachtet wurde, wenn BHI den Speichel in dem Modell
ersetzte (Fotografie Nr. 4). Es scheint daher so zu sein, dass
diese Antwort auf einer Kombination von Speichelprotein und
Bakterien beruht, wobei die Antikörper mit adsorbierten
Speichelproteinen (d. h. potenziellen Cryptitopen) auf einem sich
entwickelnden Biofilm reagiert haben. Dieses Ergebnis war
sehr überraschend, da nicht erwartet wurde, dass die
Antikörper Cryptitope aus bakteriellen Oberflächen oder Cryptitope
auf einer HA-Oberfläche erkennen würden.
-
(Bemerkung: Es ist anzumerken, dass negative Kontrollen zu
einem vollständig schwarzen Bild bei der CLSM führten).
-
Alle vier Antikörper erwiesen sich als immunospezifisch
gegenüber Parotisspeichelbelag und in einem geringeren Ausmaß
gegenüber Gesamtspeichelbelägen. Die Ähnlichkeit dieser
Antikörper im Bindungsverhalten und der Reaktivität bei Western
Blots deuten daruf hin, dass sie die gleiche antigene Stelle
erkennen. Diese Antikörper haben ein großes Potenzial, da sie
sich als substantiv erwiesen haben und zunehmend mit der
Speichelbeschichtung auf einem sich entwickelnden Biofilm
reagieren. Letzteres Ergebnis war sehr wichtig, da ein sich
entwickelnder Biofilm die Zielsuche des Antikörpers verbessert.
Die Implikationen daraus sind groß im Hinblick auf die
Zuführung einer Funktionalität, d. h. Antikörper können
"aktive Mittel" zu (i) Proteinen auf dem erworbenen Schmelzbelag
führen und dort abgeben, um den Aufbau von z. B. Plaques und
Flecken zu verhindern, und (ii) zu Proteinen auf einer
Speichelbeschichtung auf einem mikrobiellen Biofilm führen und
dort abgeben, um z. B. Plaques und Flecken abzubauen.
Beispiel 3
Bindung von monoklonalen Antikörpern an in situ
gebildetem Belag
Methode
-
Die Reaktivität von Antikörper gegenüber Proteinstrukturen
auf einem in situ gebildeten Belag wurde untersucht. Eine
Vorrichtung, ähnlich einem Gaumen, die 8 bis 10
Schmelzplatten aufwies, wurde verwendet, um in-situ-Beläge zu bilden.
Die Schmelzplatten wurden von einem weichen Harz auf der
Vorrichtung gehalten, um ein leichtes Entnehmen der Platten
zuzulassen (ohne den Belag zu stören) nach dem erforderlichen
Zeitraum für die Belagsbildung.
-
Versuch - Die Vorrichtung wurde 5 Stunden lang in den Mund
gebracht, um die Entwicklung eines Schmelzbelags zuzulassen.
Es wurde erwartet, dass während dieses Zeitraums eine
mikrobielle Besiedelung (und Speichelbeschichtung auf bakteriellen
Oberflächen) beginnen würde. Nach diesem Inkubationszeitraum
wurde die Vorrichtung aus dem Mund entnommen. Die
Schmelzplatten wurden vorsichtig aus dem weichen Harz entfernt vor
dem Waschen (PBS) und der Zugabe von monoklonalen Antikörpern
(30 Minuten). Nach weiterem Waschen wurde der fluoreszierend
markierte (FITC) Antikörper zugegeben (30 Minuten), bevor die
Schmelzplatten gewaschen wurden und unter dem CLSM betrachtet
wurden.
Ergebnisse
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt:
Tabelle 5
Reaktivität von Belag-McAbs gegenüber in situ
gebildeten Belägen
Belag-McAb Antikörperbindung
Pixelintensität
-
1D3 105,24 (+/- 10,14)
-
1C6 98,46 (+/- 8,10)
-
1A1 110,08 (+/- 15,10)
-
3D5 103,29 (+/- 11,29)
-
Neg. Kontrolle 14,25 (+/- 2,11)
-
Alle vier Antikörper waren reaktiv gegenüber in situ
gebildetem Belag (Tabelle 5). Dieses Ergebnis ist sehr viel
versprechend, wobei während des Zeitraums der Belagsbildung die
Antikörper wahrscheinlich mit Cryptitopen auf dem erworbenen
Schmelzbelag und zusätzlich mit adsorbiertem Protein
(potenzielle Cryptitope) auf bakteriellen Oberflächen reagieren.
Die Ergebnisse deuten auf den Nutzen der Antibelag-Antikörper
als Mittel, um "aktive Mittel" einer Oberfläche zuzuführen.
Beispiel 4
Gezieltes Hinführen von oxidativen Enzymen durch monoklonale
Antikörper in vitro
Methode
-
Die Fähigkeit von Antikörpern, ein oxidatives Enzym
(Glucoseoxidase: GOX) gezielt zu einem in vitro gebildeten Belag zu
bringen, wurde untersucht. Die Abgabe von Glucoseoxidase
wurde untersucht, indem Wasserstoffperoxid, das von GOX in
Gegenwart von 5% Glucose erzeugt wurde, gemessen wurde. Ein
Parotisspeichelbelag wurde gebildet, indem Parotisspeichel über
Nacht über Hydroxyapatitscheiben bei 4ºC geschüttelt wurde.
Die Scheiben wurden gewaschen (PBS), mit 5% BSA blockiert und
wiederum gewaschen vor Zugabe eines monoklonalen Antikörpers
(30 Minuten). Danach wurde ein mit GOX markierter sekundärer
Antikörper (Organon Teknika Corporation) zugegeben (30
Minuten). Die Scheiben wurden dann vor der Zugabe von TMB-
(Sigma)-Substrat* (2 ml/Scheibe) gewaschen, das dann bei
Raumtemperatur auf einer schwingenden Plattform von Stuart
STR6 (maximale Geschwindigkeit) geschüttelt wurde.
Schließlich wurde das Gesamtvolumen der Lösung auf eine ELISA-Platte
aufgeteilt und die Absorptionen auf einem Spektrophotometer
bei 450 nm abgelesen.
-
(* Substratlösung: 5% Glucose, 10 ml Phosphatcitratpuffer
(0,075 M Citronensäure 0,316 M Natriumhydrogenphosphat), 100
ul TMB/Dimethylsulfoxid: 0,1 g TMB, 10 ml Dimethylsulfoxid,
10 ul HRP (0,5 mg/ml), Bemerkung: kein Wasserstoffperoxid).
Ergebnisse
Zielgerichtete Hinführung von oxidativen Enzymen durch
monoklonale Antikörper in vitro
-
Die Ergebnisse sind in der beigefügten Fig. 2 gezeigt.
-
Die Fähigkeit von Antibelag-Antikörpern, gezielt GOX auf
einer Oberfläche anzusteuern, wurde bestätigt (Tabelle 6). Die
Fähigkeit von Antibelag-Antikörpern, etwas abzugeben, wurde
bestätigt durch den Mangel der GOX-Abgabe bei der Kontrolle,
die keine Antibelag-Antikörper aufwies (d. h. nur
GOX-markierter Antikörper und Substrat). Dieses Ergebnis war extrem viel
versprechend, da der Antibelag-Antikörper den mit GOX markierten
Antikörper band und auf diese Weise das GOX einer
Oberfläche zuführte. GOX ist ein nützliches "aktives Mittel",
da Wasserstoffperoxid, das von GOX erzeugt wird, verwendet
werden kann, um (i) die Zähne zu bleichen oder weiß zu machen
oder (ii) als antimikrobielles Mittel (plus einem Substrat
für ein weiteres antimikrobielles Mittel), um die Entwicklung
von Plaques zu kontrollieren.
Beispiel 5
Abgabe von antibakterieller Aktivität durch monoklonale
Antikörper in situ
Methode
-
Bei diesem Versuch wurden Antibelag-Antikörper untersucht auf
ihre Fähigkeit, mit GOX und HRP markierte Antikörper (Organon
Teknika Corporation) einer Oberfläche zuzuführen, in diesem
Fall einem in situ gebildeten Belag. GOX erzeugt in Gegenwart
von Glucose Wasserstoffperoxid, das von HRP verwendet wird,
um Thiocyanat oder Kaliumiodid (KI) zu oxidieren, um
antibakterielle Ionen zu erzeugen. Die Substantitivät der
antimikrobiellen Mittel wird verbessert, indem Antibelag-Antikörper
verwendet werden, um mit GOX und HRP markierte Antikörper an
eine Oberfläche zu binden.
-
Versuch - Es wurde in situ ein Belag gebildet über einen
Zeitraum (5 Stunden), der die mikrobielle Besiedelung zuließ.
Der Belag wurde gebildet unter Verwendung der vorher
beschriebenen Vorrichtung (siehe Beispiel 3). Nach 5 Stunden
Inkubation wurde die Vorrichtung aus dem Mund entnommen und
die Schmelzplatten vorsichtig aus dem weichen Harz genommen.
Die Platten wurden dann gewaschen (PBS) und blockiert (5%
BSA) vor Zugabe der Antibelag-Antikörper (30 Minuten) gefolgt
von mit GOX (1/500) und HRP (1/500) markierten Antikörpern
(30 Minuten). Die Schmelzplatten wurden dann dem Substrat (5%
Glucose, 1 mM KI) 1 Stunde lang bei 37ºCO&sub2;-Inkubator)
ausgesetzt. Schließlich wurden die Proben ausplattiert und die
Kolonie bildenden Einheiten/ml (CFU/ml) berechnet.
Ergebnisse
Abgabe von antibakterieller Aktivität durch
monoklonale Antikörper in situ
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt:
Tabelle 7
Abgabe von antimikrobiellen Mitteln durch Belag-McAbs
Behandlung (gegen Bakterien auf Schmelzplatten) / Zahl der lebensfähigen
Organismen
Log cfu/ml
-
Test
Belag-McAb + GOX/HRP Abs + Substrate 1,30 (+/- 0, 02)
-
Kontrolle 1
GOX/HRP Abs + Substrate
(kein Belag-Ab) 3,30 (+/- 0,30)
-
Kontrolle 2
Belag-McAb + Substrate 3,37 (+/- 0,90)
-
Kontrolle 3
Nur Substrate 3,24 (+/- 0,15)
-
Der Test, d. h. Antibelag-Antikörper, GOX- und HRP-Antikörper
+ Substrat, führte zu der zielgerichteten Abgabe von
antimikrobiellen Mitteln, wobei eine Reduktion der bakteriellen
CFU/ml um 1 bis 2 10 g im Vergleich zu negativen Kontrollen
beobachtet wurde (Tabelle 7). Die Abgabe dieser
antimikrobiellen Mittel hat offensichtlich die Fähigkeit der
Antikörper, zwei Stellen zu erkennen, d. h. den erworbenen
Schmelzbelag und die Speichelbeschichtung auf einem sich entwickelnden
Biofilm, verbessert. Antibelag-Antikörper scheinen daher
ausgezeichnete Mittel zu sein, um therapeutisch oder kosmetisch
aktive Mittel der Zahnoberfläche zuzuführen und dort
abzugeben.