DE69522965T2

DE69522965T2 - Verbindungen und methoden für die stimulierungen und die erhöhung von schutzimmunantworten und il-12 herstellung

Info

Publication number: DE69522965T2
Application number: DE69522965T
Authority: DE
Inventors: G. Reed
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1995-04-24
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2015-04-25
Also published as: NO964468D0; MX9604993A; JP3350551B2; PT804581E; EP0804581B1; ES2161883T3; CN1149887A; EP0804581A1; AU2427695A; DE69522965D1; KR100358271B1; NZ285238A; JPH09512172A; AU695273B2; US5876966A; ATE206163T1; KR970702367A; BR9507505A; CA2188543A1; NO964468L

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf Verbindungen und Verfahren zur Stimmulierung von Immunantworten in Patienten, ebenso wie in isolierten Zellen und Zellkulturen und auf Evaluierung Leishmania-infizierter Patienten. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Verbindungen, umfassend das vollständige oder einen Teil eines Leishmania brasiliensis-Antigens (LbelF4A), das ein Homologon eines eukaryotischen Initiationsfaktors 4A (eIF4A) ist und auf die Verwendung von solchen Verbindungen zur Stimmulierung einer TH1-Immunantwort.

Hinterrund der Erfindung

Leishmania sind obligate, intrazelluläre protozoische Parasiten von Makrophagen, die eine Reihe von Humankrankheiten verursachen, beinhaltend selbstheilende Hautläsionen, diffundierende kutane und mucosale Manifestationen und verschiedene viszerale Krankheiten. Die Anzahl von Leishmaniase-Fällen hat in den letzten 20 Jahren dramatisch zugenommen, wobei ungefähr 2 Millionen neue Fälle jedes Jahr diagnostiziert werden. Millionen Fälle dieser Krankheit existieren jetzt weltweit, insbesondere in Brasilien, China, Ostafrika, Indien und Gebieten des Mittleren Osten. Die Krankheit ist auch in der mediterranen Region endemisch, einschließlich Südfrankreich, Italien, Griechenland, Spanien, Portugal und Nordafrika.
Es gibt 20 Spezies von Leishmania, die Menschen infizieren. Eine dieser Spezies, Leishmania brasiliensis, verursacht üblicherweise örtlich begrenzte, kutane Leishmaniase (CL). Patienten mit CL haben einen stark verzögerten Typ von Hypersensitivität (DTH) und in vitro proliferative Reaktionen auf Leishmania-Antigene, sowohl während der aktiven als auch der geheilten Krankheit. Die meisten Patienten mit CL heilen spontan. Jedoch entsteht in einigen infizierten Individuen eine aktive kutane Krankheit oder mucolsale Leishmaniase (ML), die durch ernste und fortschreitende Zerstörung der nasalen, oralen und/oder pharyngealen Schleimhäute gekennzeichnet ist. Neuere Hinweise lassen vermuten, daß IL-12, das die Entwicklung von TH1-Effektorzellen induzieren kann, bei der Heilung von L. major - Infektion helfen kann (siehe Trinchieri, Immunol. Today 14: 335-337, 1993). Promastigote Formen scheinen die am meisten empfindlichen für Makrophagen-vermittelte Immunantwort zu sein und es ist gefunden worden, daß promastigote Formen die Produktion von IL-12 nicht induzieren (siehe Reiner et al. J. Exp. Med. 179: 447-456, 1994).
Eine frühe Diagnose von Leishmaniase kann entscheidend für die erfolgreiche Behandlung sein, aber ist schwierig zu erreichen, da es keine ausgeprägten Zeichen oder Symptome der Krankheit gibt. Verfahren zur Detektion der Parasiten wurden eingesetzt, aber solche Verfahren sind nicht sensitiv oder praktikabel. Laufende serologische Tests (verwenden zum Beispiel ELISA oder Immunfluoreszenztechnik) benutzen typischerweise ganze oder lysierte Parasiten und sind im allgemeinen insensitiv und anfällig für Kreuzreaktionen mit einer Reihe von anderen Krankheiten. Darüber hinaus scheitern solche Verfahren häufig daran, die möglicherweise unheilvolle Krankheit früh genug zu detektieren, um eine wirksame Behandlung zu ermöglichen, da sie auf der Detektion von Antikörpern beruhen, die während der akuten Phase der Krankheit vorhanden sind.
Im Fall aktiver mucosaler Krankheit reagieren der intradermale Hauttest und die Lymphozytenproliferation außergewöhnlich stark auf Leishmania-Antigene. Tatsächlich ist es möglich, daß Gewebezerstörung im Zusammenhang mit mucosalen Läsionen zum Teil von einer hypersensitiven Antwort auf Leishmania-Antigene herrühren. Jedoch sind die spezifischen Antigene, die bei einer zellvermittelten Immunantwort auf Leishmania beteiligt sind, nicht charakterisiert worden.
Demzufolge gibt es einen Bedarf im Stand der Technik zur Charakterisierung von Leishmania-Antigenen, die bei Immunantworten beteiligt sind und eine Bestimmung ihrer Rolle in der Manifestation der Erkrankung. Es gibt auch ein Bedürfnis, verbesserte Verfahren zur Evaluierung von Patienten in frühen Stadien der Krankheit zu identifizieren und Leishmaniase zu behandeln. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse und bietet weiterhin andere damit in Beziehung stehende Vorteile.

Zusammenfassung der Erfindung

Kurz dargelegt, stellt die vorhandene Erfindung Verbindungen und Verfahren in Bezug auf das Leishmania-Antigen LbelF4A zur Verfügung, welches homolog zu dem eukaryotischen ribosomalen Protein eIF4A ist. In einem Aspekt der Erfindung werden DNA-Moleküle, umfassend DNA-Sequenzen, die LbelIF4A kodieren oder Teile oder andere Varianten desselben, zur Verfügung gestellt. Solche DNA-Sequenzen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nukleotide 115-1323 SEQ ID NO: 1; (b) DNA-Sequenzen, die zu einer Nukleotidsequenz komplementär zu den Nukleotiden 115-1323 der SIEQ ID NO: 1, unter stringenten Bedingungen hybridisieren, wobei die DNA-Sequenz ein Polypeptid kodiert, das eine TH1- Immunantwort in peripheren mononukleären Blutzellen stimuliert, erhalten aus einem Leishmania-infizierten Individuum; und (c) DNA, die ein Polypeptid kodiert, kodiert durch eine der vorangegangenen Sequenzen.
In verwandten Aspekten stellt die vorliegende Erfindung rekombinante Expressionsvektoren, umfassend DNA-Moleküle wie oben beschrieben, mit solchen Expressionsvektoren transformierte oder transfizierte Wirtszellen und ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, kodiert durch ein oben beschriebenes DNA-Molekül, zur Verfügung, umfassend das Kultivieren einer transformierten oder transfizierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression und Gewinnung des Polypeptids fördern. Gereinigte Polypeptide, umfassend eine Sequenz von Aminosäuren, kodiert durch ein DNA-Molekül wie oben beschrieben oder Aminosäuren 49-403 der SEQ ID NO: 2 (oder eine Variante derselben, die nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen differiert) werden auch zur Verfügung gestellt. Zusätzlich sind monoklonale Antikörper, die spezifisch solche Polypeptide binden, enthüllt.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Evaluierung der Fähigkeit eines Patienten zum Generieren einer Immunantwort zur Verfügung, umfassend die Kontaktierung einer biologischen Probe, erhalten aus einem Patienten mit einem Polypeptid wie hierin beschrieben und Messung einer Antwort der Zellen. Die biologische Probe kann periphere mononukleäre Blutzellen, Monozyten, B-Zellen, dendritische Zellen, Makrophagen oder Kombination derselben umfassen. Die gemessene Antwort kann sein (1) eine proliferative Antwort; (2) die Sekretion von einem oder mehreren Zytokinen wie γ-Interferon, Interleukin-2, Interleukin-12 p70, Interleukin-12-Untereinheit p40, Interleukin-1 oder Tumornekrosefaktor-α; oder (3) Expression von mRNA, kodierend für ein oder mehrere Zytokine wie γ- Interferon, Interleukin-2, Interleukin-12-Untereinheit p40, Interleukin-1 oder Tumornekrosefaktor-α.
In noch einem anderen Aspekt werden Verfahren zur Verstärkung einer zellulären und/oder humoral Immunantwort auf ein Antigen in einem Patienten zur Verfügung gestellt, umfassend die Verabreichung eines Polypeptids wie hierin beschrieben und eines Antigens an einen Patienten. Das Polypeptid kann in Verbindung mit einer heterologen Antigenpräparation verabreicht werden oder in Verbindung mit anderen Leishmania-Antigenen. In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung Verfahren zur Stimulierung der Produktion von Antikörpern in einem Patienten zur Verfügung, die an Leishmania-Parasiten binden, umfassend die Verabreichung eines Polypeptids wie hierin beschrieben an einen Patienten.
In anderen Aspekten werden Verfahren zur Stimulierung einer TH1-Immunantwort, IL-12- Produktion und/oder die Herunterregulierung der Interleukin-10-Expression in einem Patienten zur Verfügung gestellt, umfassend die Verabreichung eines Polypeptids wie hierin beschrieben an einen Patienten. In einem verwandten Aspekt werden Verfahren zur Stimulierung einer TH1-Immunantwort, IL-12-Produktion und/oder der Herunterregulierung der Interleukin-10-Expression in einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, umfassend die Kontaktierung der biologischen Proben mit einem Polypeptid wie hierin beschrieben. Die biologische Probe kann periphere mononukleäre Blutzellen, Monozyten, B-Zellen, dendritische Zellen, Makrophagen oder Kombinationen derselben umfassen.
In einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung Verfahren zur Bestimmung der Eignung von einem Antigen zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zur Verfügung, umfassend die Bestimmung, ob das Antigen zur Stimulierung der Produktion von Interleukin-12 durch Zellen wie periphere mononukleäre Blutzellen oder Makrophagen, erhalten von einem Individuum, das nicht mit Leishmania infiziert ist, in der Lage ist.
In anderen Aspekten werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend ein Polypeptid wie hierin beschrieben und ein physiologischer akzeptabler Träger und Impfstoffe, umfassend ein Polypeptid wie hierin beschrieben und ein Antigen zur Verfügung gestellt.
In noch einem anderen Aspekt werden Verfahren zur Behandlung eines Patienten zur Verfügung gestellt, leidend an einer Krankheit, hervorgerufen durch die Stimulierung von IL-12, umfassend die Verabreichung eines Polypeptids wie hierin beschrieben an einen Patienten.
Diese und anderen Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Berücksichtigung der folgenden detaillierten Beschreibung und anhängenden Zeichnungen offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 präsentiert die Ergebnisse einer Southern-Blot-Analyse von Leishmania spp.-DNA, zu erkennend gebend, daß das Leishmania eF4A-Homologon konserviert ist und daß L. braziliensis genomische DNA mindestens zwei Kopien von LbeIF4A enthält.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer Immunoblotanalyse, die zeigt, daß LbeIF4A-immunisiertes Kaninchenserum mit einer dominanten Proteinform der Größe ~45 kDa in verschiedenen Leishmania-Spezies reagiert.
Fig. 3 illustriert die Fähigkeit des gereinigten rekombinanten LbeIF4A zur Stimulierung der Proliferation von PBMCs von L. braziliensis-infizierten Individuen.
Fig. 4A und 4B präsentieren die Ergebnisse, gewonnen durch Analysen von ZytokinmRNA-Expressionsmustern von PBMCs von Patienten mit nachgewiesenen Fällen von L. braziliensis-Infektion.
Fig. 5 illustriert die Überstandslevels von sekretiertem IFN-γ von PBMCs von L. braziliensis-infizierten Individuen nach Stimulation mit LbeIF4A oder Parasitenlysat.
Fig. 6 zeigt die Levels von TNF-α, detektiert in den Überständen von PBMCs von L. braziliensis-infizierten Individuen nach Stimulation mit LbeIF4A oder Parasitenlysat.
Fig. 7A-7D zeigen, daß LbeIF4A auch Patienten-PBMCs zum Sekretieren von IL-12 in den Kulturüberstand mit einer signifikant höheren Stärke stimuliert, als das IL-12-Level durch Parasitenlysat stimuliert wird und daß IL-10 diese IL-12-Produktion inhibiert.
Fig. 8A und 8B demonstrieren, daß in allen getesteten Patienten-PBMCs die IFN-γ- Produktion IL-12-abhängig war und durch IL-10 inhibiert wurde.
Fig. 9A und 9B zeigen, daß LbeIF4A IL-12-Produktion in kultivierten Humanmakrophagen und adhärenten PBMCs stimuliert.
Fig. 10 zeigt, daß LbeIF4A IL-12-Produktion in der humanen Myeloidleukämie-Zelllinie THP-1 stimuliert und mit IFN-γ zusammenwirkt, um THP-1-Zellen zum Sekretieren von IL- 12 zu stimulieren.
Fig. 11 präsentiert die Ergebnisse, die zeigen, daß Lymphknotenzellen von Mäusen, vorbehandelt mit LbeIF4A, proliferieren und ein beinah ausschließliches TH1-Zytokinprofil sekretieren, wohingegen Lymphknotenzellen von Mäusen, vorbehandelt mit einem anderen rekombinanten L. braziliensis-Antigen (8E), ein TH0- oder TH1/TH2-Typ-Zytokinprofil produzieren, abhängig von dem verwendeten Adjuvans, während Mäuse, vorbehandelt mit Parasitenlysat, eine gemischtes Zytokinprofil produzieren.
Fig. 12 demonstriert, daß LbeIF4A einen signifikanten Schutz gegen L. major-Infektion in einem Tiermodell zur Verfügung stellt, was erkennbar Relevanz für humane Krankheiten hat.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Wie oben erwähnt, ist die vorliegende Erfindung auf Verbindungen und Verfahren, verwendbar zur Evaluierung von Patienten und zur Stimulierung und Verstärkung der Immunantworten in Patienten, ebenso wie in isolierten Zellen und Zellkulturen, gerichtet. Die Verbindungen dieser Erfindung umfassen hauptsächlich ein Polypeptid, das eine TH1-Immunantwort in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) stimuliert oder eine DNA-Sequenz, die für ein solches Polypeptid kodiert. Insbesondere sind Polypeptide, umfassend alle oder einen stimulatorischen Teil von einem Leishmania braziliensis-Homologon des eukaryotischen ribosomalen Proteins eIF4A (hier als LbeIF4A benannt) enthüllt. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "PBMCs" auf Kernzellen, die im peripheren Blut vorhanden sind. Der Begriff "Polypeptid" im Zusammenhang mit dieser Erfindung umfaßt Aminosäureketten jeglicher Länge, einschließlich Vollängenproteinen und Teile derselben, wobei Aminosäurereste durch kovalente Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Des weiteren umfaßt ein "LbeIF4A-Polypeptid" LbeIF4A oder einen Teil oder eine andere Variante desselben, das stimulatorische Aktivität bewahrt hat. Bevorzugt sind die Polypeptide im wesentlichen frei von kontaminierenden endogenen Materialien. Die Verwendung von solchen Polypeptiden zur Evaluierung von Immunantworten von Patienten urLd zur Stimulation und Verstärkung einer Reihe von Immunantworten ist auch enthüllt.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung beinhalten Varianten des LbeIF4A, die die Fähigkeit zum Stimulieren einer TH1-Immunantwort in PBMCs bewahrt haben. Solche Varianten beinhalten verschiedene strukturelle Formen des ursprünglichen Proteins. In Folge des Vorhandenseins von ionisierbaren Amino- und Carboxylgruppen, kann ein LbeIF4A- Polypeptid zum Beispiel in der Form eines sauren oder basischen Salzes oder in neutraler Form vorliegen. Einzelne Aminosäurereste können auch durch Oxidation oder Reduktion modifiziert sein.
Varianten innerhalb des Umfangs dieser Erfindung beinhalten auch Polypeptide, in denen die ursprüngliche Aminosäurestruktur von LbeIF4A oder ein Fragment desselben durch Bildung kovalenter oder aggregativer Konjugate mit anderen Polypeptiden oder chemischen Bestandteilen wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetylgruppen und ähnlichem modifiziert ist. Kovalente Derivate können zum Beispiel durch Verbünden einzelner funktionaler Gruppen an Aminosäureseitenketten oder an den N- oder C-Tenninus hergestellt werden. Alternativ kann für Derivate, in denen ein Polypeptid mit einem LbeIF4A-Polypeptid verbunden ist, ein Fusionsprotein unter Verwenden rekombinanter DNA wie oben beschrieben, hergestellt werden. In einer solchen Ausführungsform kann das LbeIF4A-Polypeptid an eine Signal- (oder Leader-) Polypeptidsequenz an die N-terminale Region des Proteins konjugiert werden, welches co-translational oder post-translational den Transfer des Proteins von seinem Syntheseort zu seinem Funktionsort innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder -wand leitet (z. B. das Hefe α-Faktor-Signal).
Proteinfusionen innerhalb der vorliegenden Erfindung können auch Peptide umfassen, die zur leichteren Reinigung oder Identifikation der LbeFI4A-Polypeptide zugesetzt wurden (z. B. poly-His). Zum Beispiel ist das bei Hopp et al., Bio/Technology 6: 12040 (1988) beschriebene Peptid ein hochantigenes Peptid, das verwendet werden kann, um die Identifikation zu erleichtern. Solch ein Peptid stellt ein Epitop zur Verfügung, das reversibel durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden werden kann und einen schnellen Test und schnelle Reinigung des exprimierten, rekombinanten Proteins ermöglicht. Die Sequenz von Hopp et al. wird auch spezifisch durch mukosale Rinder enterokinase geschnitten, was die Entfernung des Peptids von dem gereinigten Protein ermöglicht. Fusionsproteine, geschützt mit solchen Peptiden, können auch gegenüber intrazellulärer Degradation in E. coli resistent sein.
Weitere durch diese Erfindung umfaßte Proteinfusionen beinhalten zum Beispiel, LbeIF4A- Polypeptide, gebunden an eine Iummunglobulin-Fc-Region. Wenn LbeIF4A-Fusionsproteine mit beiden schweren und leichten Ketten eines Antikörpers gemacht werden, ist es möglich, ein Proteinoligomer herzustellen, das bis zu vier LbeIF4A-Proteinbereiche hat. Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung finden sich auch LbeIF4A-Polypeptide, gebunden an eine Leucin-Zipper-Domaine. Leucin-Zipper-Domainen sind zum Beispiel in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 94/10308 beschrieben. LbeIF4A-Polypeptide, umfassend Leucin-Zipper, können zum Beispiel oligomer, dimer oder trimer sein. Alle der obigen Proteinfusionen können durch chemische Verbindung oder als Fusionsproteine, wie unten beschrieben, hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch LbeIF4A-Polypeptide mit oder ohne assoziierter Glycosylierung des nativen Musters. In Hefe oder tierischen Expressionssystemen exprimierte Polypeptide können im Molekulargewicht und Glycosylierungsmuster den nativen Molekülen ähnlich oder leicht von ihnen unterschiedlich sein, in Abhängigkeit von dem Expressionssystem. So stellt zum Beispiel die Expression von DNA, kodierend für LbeIF4A-Polypeptide, in Bakterien wie E. coli nicht-glycosylierte Moleküle zur Verfügung. N-glycosylierte Stellen von eukaryotischen Proteinen sind durch das Aminosäuretriplet Asn-A&sub1;-Z charakterisiert, wobei A&sub1; jede Aminosäure mit Ausnahme von Pro ist und Z Ser oder Thr ist. Varianten von LbeIF4A-Polypeptiden mit inaktivierten N-Glycosylierungsstellen können durch Fachleuten bekannten Techniken hergestellt werden, wie Oligonukleotidsynthese und Ligation oder ortsspezifische Mutagenesetechniken und befinden sich innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Alternativ können N-verbundene Glycosylierungsstellen an ein LbeIF4A-Polypeptid angehängt werden.
Die Polypeptide dieser Erfindung beinhalten auch Varianten von LbeIF4A-Polypeptiden, die eine Aminosäuresequenz haben, die sich von dem nativen LbeIF4A-Protein aufgrund einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen, Substitutionen oder anderen Modifikationen unterscheidet. Solche Varianten sollten im wesentlichen homolog zu dem nativen LbeIF4A sein und sollten die Fähigkeit behalten, eine TH1-Immunantwort in PBMCs zu stimulieren. Eine "wesentliche Homologie" wie hierin verwendet, bezieht sich auf Aminosäuresequenzen, die durch DNA-Sequenzen kodiert sein können, die in der Lage sind, unter moderaten stringenten Bedingungen an eine natürlich auftauchende DNA-Sequenz, kodierend LbeIF4A, zu hybridisieren. Geeignete moderate stringente Bedingungen beinhalten das Vorwaschen in einer Lösung von 5 · SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); Hybridisierung bei 50ºC-65ºC, 5X SSC, über Nacht; gefolgt durch zweimaliges Waschen bei 65ºC für 20 Minuten mit jeweils 2X, 0,5X and 0,2X SSC (enthaltend 0,1% SDS). Solche hybridisierenden DNA-Sequenzen befinden sich auch im Umfang dieser Erfindung, ebenso wie Nukleotidsequenzen, die aufgrund der Code-Degeneration ein stimulierendes Polypehtid kodieren, das durch eine hybridisierende DNA-Sequenz kodiert ist. Der Effekt jeder solcher Modifikationen auf die Aktivität von einem LbeIF4A-Polypeptid kann leicht durch Analysieren der Fähigkeit des mutierten LbeIF4A-Peptids bestimmt werden, eine TH1-Antwort durch zum Beispiel eine der hierin beschriebenen Methoden zu induzieren.
Im allgemeinen sollten Aminosäurensubstitutionen konservativ durchgeführt werden; d. h., eine substituierte Aminosäure sollte eine Aminosäure ersetzen, die ähnliche Eigenschaften aufweist, so daß ein Fachmann der Peptidchemie erwarten würde, daß die Sekundärstruktur und hydropathische Natur des Polypeptids im wesentlichen unverändert bleiben. Hauptsächlich repräsentieren die folgen Gruppen von Aminosäuren konservative Veränderung: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his, und (5) phe, tyr, trp, his. Varianten innerhalb des Umfangs dieser Erfindung können auch oder alternativ, andere Modifikationen enthalten, einschließend die Deletion oder Addition von Aminosäuren, die einen minimalen Einfluß auf die stimulatorischen Eigenschaften, Sekundärstruktur und hydropathischer Natur des Polypeptids haben. Im allgemeinen können Fragmente von LbeIF4A durch Deletieren terminaler oder interner Reste oder Sequenzen hergestellt werden. Zusätzliche Anleitung zur geeigneten Modifikationen können durch einen Vergleich der Sequenz des LbeIF4A mit den Sequenzen und Strukturen von anderen eIF4A- Familienmitgliedern erhalten werden. So können zum Beispiel terminale oder interne Reste oder Sequenzen von LbeIF4A, die nicht für die biologische Aktivität notwendig sind, entfernt werden. Cysteinreste können entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die Bildung von falschen intramolekularen Disulfidbrücken bei der Renaturierung zu vermeiden. Andere Mutageneseansätze beinhalten die Modifikation benachbarter dibasischer Aminosäurereste, um die Expression in Hefesystämmen zu erhöhen, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist.
Ein LbeIF4A-Vollängenprotein kann im allgemeinen unter Verwendung eines genomischen oder cDNA-Klons, kodierend für das Protein, erhalten werden. Eine genomische Sequenz, die ein Vollängen-LbeIF4A kodiert, ist in der SEQ ID NO: 1 dargestellt und die abgeleitete Aminosäuresequenz wird in der Sequenz SEQ ID NO: 2 präsentiert. Solche Klone können durch durchmustern einer geeigneten Leishmania braziliensis-Expressionsbibliothek von Klonen, die Antigene exprimieren, die mit Serum von einem Patienten, leidend unter mukosaler Leishmaniase, reagieren, isoliert werden und dann das reaktive Agens auf die Fähigkeit zum Stimulieren proliferativer Antworten und bevorzugt TH1-Zytokinproduktion in Patienten T- Zell-Tests analysiert werden. Die Herstellung und das Durchmustern der Bibliothek können im allgemeinen unter Verwendung von Verfahren durchgeführt werden, wie sie bei Fachleuten bekannt sind, wie Verfahren, die bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 beschrieben sind. Zusammengefaßt kann eine Bakteriophagenexpressionsbibliothek plattiert und auf Filter übertragen werden. Die Filter können dann mit Serum und einem Detektionsreagenz inkubiert werden. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung ist ein "Detektionsreagenz" jede Verbindung, die in der Lage ist, an den Antikörper Antigenkomplex zu binden, welche dann durch jedes einer Reihe von Mitteln, die den Fachleuten bekannt sind, detektiert werden kann. Typische Detektionsreagenzien enthalten ein "Bindungsagens" wie Protein A, Protein G, IgG oder ein Lectin, gebunden an eine Reportergruppe. Bevorzugte Reportergruppen beinhalten Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, Farbstoffe, Radienuklide, Lumineszenzgruppen, Fluoreszenzgruppen und Biotin. Besonders bevorzugt ist die Reportergruppe Meerrettichperoxidase, die durch Inkubation mit einem Substrat wie Tetramethylbenzidin oder 2,2'-Azino-di-3- ethylbenzthiazolisulfonsäure detektiert werden kann. Plaques, enthaltend genomische oder cDNA-Sequenzen die ein Protein exprimieren, das an einen Antikörper in dem Serum bindet, werden isoliert und gereinigt mit Techniken, die Fachleuten bekannt sind. Geeignete Verfahren können zum Beispiel bei Sambrock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, gefunden werden.
Patienten-T-Zelltests können im allgemeinen durch Behandlung von Patienten-PBMCs mit den reaktiven Antigenen durchgeführt und die Zellen auf eine geeignete Antwort hin analysiert werden. Zum Beispiel kann der PBMC-Überstand auf das Level von sekretierten Zytokinen hin getestet werden. Die bevorzugt getesteten Zytokine sind γ-Interferon, Interleukin-2, Interleukin-12 (entweder die p40-Untereinheit oder die biologisch aktive p70), Interleukin-1 oder Tumornekrosefaktor-α. Zytokine können zum Beispiel unter Verwendung kommerziell zur Verfügung stehender Antikörper, spezifisch für die Zytokine des Interesses, in einem ELISA-Format getestet werden, wobei positive Ergebnisse entsprechend den Angaben des Herstellers bestimmt werden. Geeignete Antikörper könne zum Beispiel von Chemicon, Temucula, CA und PharMingen, San Diego, CA erhalten werden. Alternativ können die behandelten PBMCs auf mRNA hin getestet werden, die für eines oder mehrere der Zytokine γ- Interferon, Interleukin-2, Interleukin-12-Untereinheit p40, Interleukin-1 oder Tumornekrosefaktor-α kodiert oder die PBMCs können auf eine proliferative Antwort wie hierin beschrieben getestet werden.
Varianten von LbeIF4A, die die Fähigkeit zum Stimulieren einer TH1 Immunantwort in PBMCs behalten haben, können durch Modifizieren der Sequenz in einer oder mehrerer der oben beschriebenen Aspekte identifiziert und die sich ergebenen Polypeptide auf ihre Fähigkeit zur Stimulierung einer TH1-Antwort hin getestet werden. Solche Tests können im allgemeinen durch Behandlung von Patienten-PBMCs mit dem modifizierten Polypeptid und Testen der wie oben beschriebenen Antwort durchgeführt werden.
Die oben beschriebenen Sequenzmodifikationen können unter Verwendung von rekombinanten Standardtechniken oder durch automatisierte Synthese der modifizierten Polypeptide eingefügt werden. Mutationen können zum Beispiel an speziellen Orten durch synthetisierte Oligonukleotide, enthaltend eine Mutationssequenz, flankiert durch Restriktionsstellen, die die Ligation der Fragmente in die native Sequenz ermöglichen, eingefügt werden. Nach der Ligation kodiert die so entstandene rekonstruierte Sequenz ein Analogon, das die erwünschte Aminosäureinsertion, -Substitution oder -Deletion trägt.
Alternativ können Oligonukleotid-gerichtete, seitenspezifische Mutageneseverfahren verwendet werden, um ein Gen zur Verfügung zu stellen, in dem spezielle Kodons entsprechend der notwendigen Substitution, Deletion oder Insertion verändert sind. Beispielhafte Verfahren zur Herstellung der oben dargelegten Veränderung sind bei Walder et al., Gene 42: 133, 1986; Bauer et al., Gene 37: 73, 1985; Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981; and U. S. Patent Nrn. 4,518,584 und 4,737,462 enthüllt.
Mutationen bei Nukleotidsequenzen, hergestellt zur Expression von solchen LbeIF4A- Polypeptiden, müssen natürlich den Leserahmen der kodierenden Sequenzen erhalten und bilden bevorzugt keine komplementären Regionen, die hybridisieren könnten, um sekundäre mRNA-Strukturen zu erzeugen, wie Schleifen oder Haarnadelstrukturen, welche nachteilig die Translation der Rezeptor-mRNA beeinflussen würden. Obwohl eine Mutationsstelle vorherbestimmt sein kann, ist es nicht notwendigerweise so, daß die Natur der Mutation per se vorherbestimmt ist. So können zum Beispiel zum Selektieren im Zusammenhang für optimale Charakteristika von Mutationen an einer gegebenen Stelle Zufallsmutagenesen an dem Startkodon durchgeführt werden und die exprimierten LbeIF4A-Proteinmutanten auf die gewünschte Aktivität hin durchgemustert werden.
Nicht alle Mutationen in einer Nukleotidsequenz, die ein LbeIF4A-Protein kodiert, werden im Endprodukt ausgedrückt. So können zum Beispiel Nukleotidsubstitutionen zur Expressionsverstärkung gemacht werden, vor allem, um sekundäre Schleifenstrukturen in der transkribierten mRNA zu vermeiden (siehe z. B. europäische Patentanmeldung 75,444 A) oder um Kodons zur Verfügung zu stellen, die häufiger durch den ausgewählten Wirt translatiert werden, wie die gut bekannten E. coli-bevorzugten Kodons für E. coli-Expression.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, sowohl die natürlich vorkommenden als auch die modifizierten, werden bevorzugt durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt. Solche Verfahren beinhalten das Einführen einer DNA-Sequenz, kodierend für ein LbeIF4A- Polypeptid, in einen rekombinanten Expressionsvektor und Exprimieren der DNA-Sequenz in einem rekombinanten mikrobiellen Expressionssystem unter Bedingungen, die die Expression fördern. DNA-Sequenzen, die für die Polypeptide kodieren, die durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt werden, können aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotidlinkern zusammengesetzt werden oder aus einer Serie von Oligonukleotiden bestehen, um ein synthetisches Gen zur Verfügung zu stellen, das in der Lage ist, in einen rekombinanten Expressionsvektor eingeführt zu werden und in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert zu werden.
Rekombinante Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz, kodierend ein LbeIF4A- Polypeptid, kodieren, sind mit geeigneten regulatorischen Transkriptions- oder Translationselementen verbunden, stammend von Genen aus Säugetieren, Mikroben, Viren oder Insekten. Solche regulatorischen Elemente beinhalten einen transkriptionalen Promotor, eine optionale Operatorsequenz zur Transkriptionskontrolle, eine Sequenz, kodierend für geeignete mRNA-ribosomale Bindungsstellen und Sequenzen, die die Termination der Transkription und Translation kontrollieren, wie im Detail unten beschrieben ist. Ein Replikationsstartpunkt und ein selektierbarer Marker, um die Wiedererkennung von Transformaten zu erleichtern, können zusätzlich eingebaut sein.
DNA-Regionen sind durchführbar verbunden, wenn sie funktionsmäßig miteinander in Beziehung stehen. Zum Beispiel ist DNA für ein Signalpeptid (Sekretionssignal) durchführbar mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn es als ein Vorläufermolekül exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids Teil hat; ein Promotor ist durchführbar mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist durchführbar mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation ermöglicht. Im allgemeinen bedeutet durchführbar verbunden, zusammenhängend und im Fall von Sekretionssignalen, im Leserahmen.
DNA-Sequenzen, die für LbeIF4A-Polypeptide kodieren, die in einem Mikroorganismus exprimiert werden sollen, enthalten bevorzugt keine Introns, welche zu einer frühzeitigen Beendigung der Transkription der DNA in die mRNA führen könnten.
Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung können einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsstart umfassen, abgeleitet von kommerziell zur Verfügung stehenden Plasmiden, umfassend genetische Elemente des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017). Solche kommerziellen Vektoren beinhalten zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEMI (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322-"Rückrat"-Abteilungen werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden strukturellen Sequenz kombiniert. E. coli wird typischerweise unter Verwendung von pBR322-Derivaten transformiert, einem Plasmid, erlangt von einer E. coli-Spezies (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). pBR322 enthält Gene zur Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen zur Verfügung.
In rekombinanten mikrobiellen Expressionsvektoren herkömmlich verwendete Promotoren beinhalten das β-Lactamase- (Penizillinase) und Lactosepromotorsystem (Chang et al., Nature 275: 615, 1978 and Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), das Tryptophan (trp)- Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und europäische Patentanmeldung 36,776) und den tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 5.412, 1982). Ein besonders nützliches bakterielles Expressionssystem verwendet den Phagen 1 PL-Promotor und cI857ts-thermostabilen Repressor. Plasmidvektoren, verfügbar von der American Type Culture Collection, die Derivate von dem 1 PL-Promotor umfasst, beinhaltet Plasmid pHUB2, resident im E. coli-Stamm JMB9 (ATCC 37092) und pPLc28, resident in E. coli RR1 (ATCC 53082).
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren beinhalten die Promotoren von Metallothionein, 3-Phosphoglycerinkinase (Hitzeman et al., J: Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder anderen glycolytischen Enzymen (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), wie Enolase, Gylcerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3- Phosphoglycerinmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression sind weiterhin beschrieben bei R. Hitzeman et al., europäische Patentanmeldung 73,657.
Bevorzugte Hefevektoren können unter Verwendung von DNA-Sequenzen von pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Ampr-Gen und Replikationsstartpunkt) und Hefe-DNA- Sequenzen, beinhaltend einen Glucose-reprimierbaren ADH&sub2;-Promotor und α-Faktor- Sekretionssignal, zusammengesetzt werden. Der ADH&sub2;-Promotor wurde bei Russell et al., J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982, und Beier et al., Nature 300 : 724, 1982 beschrieben. Das Hefe α- Faktor-Signal, das zur Sekretion von heterologen Proteinen führt, kann zwischen dem Promotor und dem zu exprimierenden Strukturgen eingefügt werden. Siehe z. B. Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; und Bitter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 5330, 1984. Die Signalsequenz kann modifiziert sein, um in der Nähe des 3'-Endes ein oder mehrere nützliche Restriktionsschnittstellen zu enthalten, die die Fusion der Signalsequenz an die Fremdgene erleichtert. Die transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen in Expressionsvektoren, zu verwenden beim Transformieren von Vertebratenzellen, können durch virale Quellen zur Verfügung gestellt werden. Häufig verwendete Promotoren und Verstärker stammen zum Beispiel von Polyoma, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und dem humanen Cytomegalovirus. Abgeleitete DNA-Sequenzen vom SV40 viralen Genom, zum Beispiel SV40-Start, früher und später Promotor, Verstärker, Splice- und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die anderen für die Expression von einer heterologen DNA-Sequenz notwendigen genetischen Elemente zur Verfügung zu stellen. Die frühen und späten Promotoren sind besonders nützlich, da beide leicht von dem Virus als ein Fragment erhalten werden, das auch den viralen SV40-Replikationsstartpunkt enthält (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Es können auch kleinere oder größere SV40-Fragmente verwendet werden, vorausgesetzt, daß die ungefähr 250 bp-Sequenz, sich erstreckend von der Hind III-Stelle bis zur Bgl II-Stelle, lokalisiert im viralen Replikationsstartpunkt, eingeschlossen ist. Weiterhin können virale genomische Promotoren, Kontroll- und/oder Signalsequenzen verwendet werden, vorausgesetzt, solche Kontrollsequenzen sind mit der gewählten Wirtszelle kompatibel. Exemplarische Vektoren können konstruiert werden, wie bei Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983 enthüllt.
Ein nützliches System zur stabilen Expression auf hohem Level von tierischen RezeptorcDNAs in C127 epithelialen Brustdrüsenzellen aus Maus kann im wesentlich wie bei Cosman et al., Mol. Immunol. 23: 935, 1986, beschrieben, konstruiert werden. Ein bevorzugter eukaryotischer Vektor zur Expression von LbeIF4A-Protein-DNA ist pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991) und beinhaltet regulatorische Sequenzen, abgeleitet von SV40, vom humanen Immundeffizienzvirus (HIV) und Epstein-Barr-Virus (EBV). Andere bevorzugte Vektoren schließen pDC409 und pDC410 ein, die von pDC406 abgeleitet sind. pDC410 wurde von pDC406 durch Substituieren des EBV-Replikationsstartpunkts durch Sequenzen, kodierend für das SV40 große T-Antigen, abgeleitet. pDC409 unterscheidet sich von pDC406 darin, daß eine Bgl II-Restriktionsschnittstelle außerhalb der multiplen Klonierungsstelle deletiert wurde, was die Bgl II-Stelle innerhalb der multiplen Klonierungsstelle einzigartig macht.
Eine geeignete Zellinie, die episomale Replikation von Expressionsvektoren ermöglicht, wie pDC406 und pDC409, die den EBV-Replikationsstartpunkt enthalten, ist CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). Die CV-L/EBNA-Zellinie wurde abgeleitet durch Transfektion der CV- 1-Zellinie mit einem Gen, kodierend für das Epstein-Barr-Virus-Kernantigen-I (EBNA-1) und exprimiert EBNA-1, angetrieben vom humanen CMV unmittelbar-frühzeitigen Verstärker/Promotor.
Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die transformiert oder mit Expressionsvektoren transfiziert worden sind, konstruiert unter Verwenden rekombinanter DNA-Techniken und die Sequenzen enthalten, kodierend ein LbeIF4A-Polypeptid der vorliegenden Erfindung. Transformierte Wirtszellen können das erwünschte LbeIF4A-Polypeptid exprimieren, aber Wirtszellen, transformiert zum Zweck des Klonierens oder Amplifizierens der LbeIF4A-DNA müssen nicht das LbeIF4A-Protein exprimieren. Exprimierte LbeIF4A-Proteine werden bevorzugt in den Kulturüberstand sekretiert, in Abhängigkeit von der ausgewählten DNA, können aber auch in der Zellmembran abgelagert werden.
Geeignete Wirtszellen zur Expression von rekombinanten Proteinen beinhalten Prokaryoten, Hefen oder höhere eukaryotische Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren. Prokaryoten beinhalten Gram-negative oder -positive Organismen, zum Beispiel E. coli oder bacilli. Höhere eukaryotische Zelle beinhalten etablierte Zellinien, die ihren Ursprung bei Insekten oder Säugetieren haben, wie unten beschrieben. Zellfreie Translationssyteme können auch zur Herstellung von LbeIF4A-Proteinen eingesetzt werden, unter Verwendung von RNAs, abgeleitet von den DNA-Konstrukten wie hierin offenbart. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit bakteriellen, pilzlichen, hefebezogenen und säugetierbezogenen zellulären Wirten sind beschrieben, zum Beispiel bei Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985.
Prokaryotische Expressionswirte können zur Expression von LbeIF4A-Polypeptiden verwendet werden, die keine umfassende proteolytische- und Disulfid-Prozessierung benötigen. Prokaryotische Expressionsvektoren umfassen im allgemeine ein oder mehrere phänotypisch auswählbare Marker, zum Beispiel ein Gen, kodierend für Proteine im Zusammenhang mit Antibiotikaresistenz oder zur Verfügung stellen einer autotrophen Anforderung und einen Replikationsstartpunkt, erkannt durch den Wirt, um die Amplifikation innerhalb des Wirtes sicherzustellen. Geeignete prokaryotische Wirte zur Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies innerhalb der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl auch andere Wirte eingesetzt werden können.
Rekombinante LbeIF4A-Polypeptide können auch in Hefewirten exprimiert werden, bevorzugt von Saceharomyces-Spezies wie S. cerevisiae. Hefen aus anderen Gattungen wie Pichia oder Kluyveromyces können auch eingesetzt werden. Hefevektoren werden im allgemeinen einen Replikationsstartpunkt von dem 2u-Hefeplasmid oder eine autonome Replikationssequenz (AR), einen Promotor, DNA, kodierend für das LbeIF4A-Polypeptid, Sequenzen zur Polyadenylierung und Transkriptionstermination und ein Selektionsgen enthalten. Bevorzugt werden Hefevektoren einen Replikationsstartpunkt und einen selektierbaren Marker enthaltend, der sowohl die Transformation von Hefe als auch E. coli erlaubt, zum Beispiel das Ampicillinresistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae tpl-Gen, was einen Selektionsmarker für einen Hefemutantenstamm zur Verfügung stellt, der nicht die Fähigkeit zum Wachsen in Tryptophan besitzt und einen Promotor, abgeleitet von einem hochexprimierten Hefegen, um die Transkription von einer strukturellen Sequenz stromabwärts zu induzieren. Das Vorhandensein der trp1-Läsion im Hefewirtszellgenom stellt somit eine wirksame Umgebung zum Detektieren der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan dar.
Geeignete Hefetransformationsprotokolle sind für Fachleute bekannt. Eine beispielhafte Technik, beschrieben bei Hind et al., Proc. Natl. Acad Sci, USA 75: 1929, 1978, beinhaltet das Selektieren von Trp+-Transformanten in einem selektiven Medium, bestehend aus 0,67% Hefestickstoffgrundlage, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glucose, 10 mg/ml Adenin und 20 mg/ml Uracil. Wirtsstämme, transformiert mit Vektoren, umfassend den ADH2-Promotor, können zur Expression in einem reichen Medium wachsen, bestehend aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glucose, angereichert mit 80 mg/ml Adenin und 80 mg/ml Uracil. Derepression des ADH2-Promotors geschieht nach Aufbrauchen der Glucose im Medium. Rohüberstände von Hefe werden durch Filtration geerntet und bei 4ºC bis zur weiteren Reinigung aufbewahrt.
Verschiedene Säugetier- oder Insektenzellkultursysteme (z. B. Spodoptera oder Trichoplusia) können auch zur Expression rekombinanten Proteins eingesetzt werden. Baculovirussysteme zur Produktion heterologer Proteine in Insektenzellen wurden zum Beispiel von Luckow and Summers, Bio/Technology 6: 47, 1988 zusammengefaßt. Beispiele für geeignete Säugetierwirtszellinien schließen die COS-7-Linien von Affennierenzellen, beschrieben bei Gluzman, Cell 23: 175, 1981 ein und andere Zellinien, in der Lage einen geeigneten Vektor zu exprimieren, beinhalten zum Beispiel, CV-1/EBNA-(ATCC CRL 10478), L-Zellen, C127-, 3T3-, chinesische Hamsterovar-(CHO), COS-, NS-1-, HeLa- und BHK-Zellinien. Säugetierexressionsvektoren können nicht transkribierte Elemente wie einen Replikationsstartpunkt, einen geeigneten Promotor und Verstärker, gebunden an das Gen das exprimiert werden soll und andere 5'-oder 3'-flankierende, nicht transkribierte Sequenzen und 5'- oder 3'-nicht-translatierte Sequenzen wie die notwendigen ribosomalen Bindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleißdonor und Akzeptorstellen und transkriptionale Terminationssequenzen umfassen.
Gereinigte LbeIF4A-Polypeptide können durch kultivieren geeigneter Wirts-/Vektorsysteme zum Exprimieren der rekombinanten Translationsprodukte der DNAs nach der Erfindung bereitet werden, welche dann vom Kulturmedium oder von Zellextrakten gereinigt werden. Zum Beispiel können Überstände von Systemen, die rekombinantes Protein in Kulturmedium sekretieren, zuerst unter Verwenden eines kommerziell erwerbbaren Proteinkonzentrationsfilters, wie eine Amicon- oder Millipore Pellicon-Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix aufgebracht werden. Zum Beispiel kann eine geeignete Affinitätsmatrix ein Gegenstrukturprotein (d. h. ein Protein, an das LbeIF4A in einer spezifischen Interaktion, basierend auf der Struktur, bindet) oder Lectin oder Antikörpermolekül, gebunden an einen geeigneten Träger, umfassen. Alternativ kann ein Anionaustauschharz eingesetzt werden, zum Beispiel eine Matrix oder Substrat, dem Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen anhängen. Die Matrizes, können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere Arten sein, die herkömmlicherweise in der Proteinreinigung verwendet werden. Alternativ kann ein Kationaustauschschritt verwendet werden. Geeignete Kationaustauscher beinhalten verschiedene unlösliche Matrizes, umfassend Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen. Sulfopropylgruppen sind bevorzugt. Gelfiltrationschromatographie stellt auch ein Mittel zum Reinigen von LbeIF4A zur Verfügung.
Affinitätschromatographie ist ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Reinigung der LbeIF4A-Polypeptide. Wird zum Beispiel ein LbeIF4A-Polypeptid als ein Fusionsprotein, umfassend eine Immunglobulin-Fc-Region, exprimiert, kann es mit Protein A- oder Protein G-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Umfaßt darüber hinaus das LbeIF4A-Protein eine Leucin-Zipper-Domäne, kann es auf einem Harz, umfassend einen Antikörper, spezifisch für die Leucin-Zipper-Domäne, gereinigt werden. Monoklonale Antikörper gegen das LbeIF4A-Protein können in der Affinitätschromatographie-Reinigung auch nützlich sein, bei Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik wohl bekannt sind.
Schließlich kann ein oder können mehrere Umkehrphasen-Hochleistungs- Flüssigchromatographie (RP-HPLC)-Schritte unter Verwenden hydrophober RP-HPLC- Medien (d. h. Silikagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen) verwendet werden, um eine LbeIF4A-Proteinzusammensetzung weiter zu reinigen. Eine oder alle der vorangegangenen Reinigungsschritte können auch in verschiedenen Kombinationen verwendet werden, um ein homogenes rekombinantes Protein zur Verfügung zu stellen.
Rekombinant hergestelltes LbeIF4A-Polypeptid in Bakterienkultur wird bevorzugt durch anfängliche Extraktion von Zellpellets isoliert, gefolgt durch eine oder mehrere Konzentrations-, Aussalz-, wässrige Jonenaustausch- oder Größenausschluß-Chromatographieschritte. Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) kann für letzte Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobenzellen, verwendet bei der Expresslon von rekombinantem LbeIF4A- Protein, können durch zahlreiche geeignete Verfahren aufgeschlossen werden, einschließlich zyklisches Einfrieren und Auftauen, Sonifizieren, mechanischer Aufschluß oder Verwenden von zellysierenden Agenzien.
Die Fermentation von Hefe, die LbeIF4A-Polypeptid als ein sekretiertes Protein exprimiert, erleichtert die Reinigung wesentlich. Sekretiertes rekombinantes Protein, erhalten aus einer Großfermentation, kann durch Verfahren gereinigt werden, analog zu denen bei Urdal et al., J. Chromatog. 296: 171, 1984 enthüllten. Diese Referenz beschreibt zwei aufeinanderfolgende Umkehrphasen-HPLC-Schritte zur Reinigung von rekombinantem humanen GM-CSF auf einer präparativen HPLC-Säule.
Präparationen von LbeIF4A-Polypeptiden, synthetisiert in rekombinanten Kulturen, können nicht-LbeIF4A-Zellkomponenten enthalten, einschließlich Proteinen, in Mengen und von einer Beschaffenheit, von denen die einzusetzenden Reinigungsschritte zum Erhalt des LbeIF4A-Proteins aus der Kultur abhängt. Diese Komponenten werden gewöhnlich Hefe, prokaryotischen oder nicht-humanen eukaryotischen Ursprungs sein und sind bevorzugt in ungefährlichen Kontaminationsmengen in der Größenordnung von weniger als ungefähr 1 Gewichtsprozent vorhanden. Solche Präparationen sind typischerweise frei von anderen Proteinen, die normalerweise mit dem LbeIF4A-Protein assoziiert sein können, wie sie in der Natur in seiner Ursprungsspezies gefunden werden.
Automatisierte Synthese bietet ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden in dieser Erfindung, die weniger als ungefähr 100 Aminosäuren und typischerweise weniger als ungefähr 50 Aminosäuren haben. Zum Beispiel kann das Merrifield- Festphasensyntheseverfahren verwendet werden, in dem Aminosäuren nacheinander an die wachsende Aminosäurekette angefügt werden. Siehe Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149- 2146, 1963. Ausrüstung für automatische Synthesen von Polypeptiden ist kommerziell von Anbietern wie Applied Biosystems, Inc. of Foster City, CA erwerbbar.
Zusätzlich zu den oben erwähnten Polypeptiden und DNA-Sequenzen stellt das Ziel der Erfindung weiterhin Verfahren zur Verwendung der oben enthüllten Polypeptide zur Evaluierung von Immunantworten und zur Stimulierung protektiver Immunantworten und IL-12 Produktion zur Verfügung. Es wurde in der vorliegenden Erfindung herausgefunden, daß LbeIF4A T-Zellepitop(e) enthält, die PBMCs von Leishmania-infizierte Individuen zum Proliferieren stimulieren. LbeIF4A stimuliert auch PBMCS von infizierten Individuen, um ein TH1-Zytokinprofil zu erhalten, siehe Skeiky et al., J. immunol. 150: 93a, 1993. Eine TH1- Antwort ist durch die Produktion von den Zytokinen Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL- 2), Interleukin-12 (IL-12) oder γ-Interferon (IFN-γ) ebenso wie durch den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) charakterisiert. IL-12 ist ein heterodimeres Molekül, umfassend die p-40 und p35 Untereinheiten, die für die Produktion von biologisch aktivem IL-12 p70 koexprimiert werden müssen. Die p40-Untereinheit wird nur von IL-12-produzierende Zellen hergestellt und ist in vitro und in vivo nach bakterieller Stimulation und Stimulation durch Parasiten induziert, wobei die p35-Untereinheit sowohl ubiquitär als auch konstitutiv exprimiert wird. Deshalb haben IL-12-produzierende Zellen auch einen großen Überschuß (10-100 fach) an biologisch inaktiven freien p40-Ketten.
LbeIF4A stimuliert auch ein TH1-Zytokinprofil von mRNAs, wie diese, die für IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-12 p40-Untereinheit und TNF-α in PBMCs von Leishmania-infizierten Patienten kodieren. Detektierbare IL-4- oder IL-10-mRNA, hinweisend auf eine TH&sub2;-Antwort, ist in solchen stimulierten PBMCs nicht vorhanden. In der Tat regelt LbeIF4A hauptsächlich die Expression von IL-10 und mRNA, vorhanden in den "ruhenden" PBMCs von einigen Leishmaniase-Patienten, ebenso wie die LPS-induzierte IL-10-Produktion von Patienten und normalen PBMCs, herunter. Diese Eigenschaften von LbeIF4A lassen eine Rolle für LbeIF4A in einer protektiven Immunantwort nach einer L. brazilliensis-Infektion vermuten.
Zusätzlich stimuliert LbeIF4A die Produktion von IL-12 und IL-2 in PBMCs, gewonnen aus nicht-infizierten Kontrollindividuen, ebenso, wie in kultivierten humanen Makrophagen, in der humanen Myeloidleukämiezellinie THP-1 und in Mäusen. LbeIF4A wirkt auch mit IFN-γ zusammen, um THP-1-Zellen zum Sekretieren von IL-12 zu stimulieren und die Induktion der IFN-γ-Produktion durch Patienten-PBMCs ist durch das Vorhandensein von anti-IL-12- Antikörpern aufgehoben. Die Fähigkeit, IL-12- und IL-2-Produktion zu stimulieren, zeigt, daß LbeIF4A die Fähigkeit besitzt, eine protektive Immunantwort zu induzieren und daß die hierin beschriebenen Polypeptide eine breite Anwendbarkeit in der Prävention und Behandlung von Krankheiten wie Krebs ebenso wie bei Infektionskrankheiten haben.
Dementsprechend sind in einem Aspekt dieser Erfindung Verfahren zur Evaluierung einer Gesamtfähigkeit von Patienten zur Entwicklung einer Immunantwort enthüllt. Der hierin verwendete Begriff "Patient" bezieht sich auf jedes warmblütige Tier, bevorzugt ein Mensch. Ein Patient kann von einer Krankheit befallen sein wie Leishamaniase (oder anderen infektiösen Krankheiten) oder Krebs oder kann normal (d. h. frei von detektierbaren Krankheiten und Infektionen) sein. Im allgemeinen gibt das Level von einer proliferativen oder TH1- assoziierten Antwort, ausgelöst durch Aussetzen der PBMCs eines Patienten gegenüber eines LbeIF4A-Polypeptids, einen Hinweis auf die Kapazität < ies Patienten zum Entwickeln einer Immunantwort.
Zusammengefaßt kann eine Evaluierung der Fähigkeit eines Patienten, eine Immunantwort zu entwickeln, durch kontaktieren von PBMCs, gewonnen von dem Patienten der infiziert oder uninfiziert sein kann, mit einem Polypeptid dieser Erfindung und Messung einer geeigneten Antwort der Zellen durchgeführt werden. PBMCs für diesen Zweck können durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, isoliert werden, einschließlich durch Dichtezentrifugation mit zum Beispiel FicollTM (Winthrop Laboratories, New York). Im allgemeinen bewegt sich die Menge des Polypeptids, das ausreichend zur Evaluierung von ungefähr 104-106 Zellen ist, von ungefähr 1 ug/ml bis ungefähr 50 ug/ml und bevorzugt ist sie ungefähr 10 ug/ml. Die Inkubation von einem Polypeptid mit PBMCs wird typischenweise bei 37ºC für ungefähr 5 Tage durchgeführt. Nach der Inkubation mit dem Polypeptid werden PBMCs auf eine geeignete Antwort hin getestet. Zum Beispiel kann die gemessene Antwort eine proliferative Antwort sein, welche durch Verfahren evaluiert werden kann, die den Fachleuten bekannt sind wie Exponieren der Zellen gegenüber einem Puls von radioaktiv makiertem Thymidin und Messung des Einbaus des markierten Stoffs in die zelluläre DNA. Im allgemeinen ist eine proliferative Antwort, bei der die Stimulationsanzeige (d. h. die durchschnittlichen cpm von Zellen, stimuliert durch Antigen geteilt durch die durchschnittlichen cpm von Zellen ohne Antigen) größer als oder gleich 5 ist, indikativ für ein Individuum mit einer reduzierten Kapazität zum Entwickeln einer Immunantwort. Alternativ kann die gemessene Antwort die Sekretion von einem oder mehreren spezifischen Zytokinen (wie IFN-γ, IL-2, IL-12 p70, IL-12- Untereinheit-p40, IL-1 und TNF-α) wie oben beschrieben sein oder der Level von mRNA, kodierend für ein oder mehrere spezifische Zytokine (wie IFN-γ, IL-2, IL-12 Untereinheit p40, IL-1 und TNF-α), bestimmt durch Techniken, die den Fachleuten bekannt sind (welche die Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (PCR) beinhaltet). Hohe Levels solcher Zytokinsekretion oder mRNA-Expression entsprechen einer überdurchschnittlichen Kapazität zur Erzeugung einer Immunantwort. Im allgemeinen hat ein Patient eine erniedrigte Fähigkeit eine Immunantwort zu erbringen, wenn IL-12 oder mRNA, kodierend IL-12, nicht in PBMCs, behandelt mit einem LbeIF4A-Polypeptid, detektiert werden können (durch die hierin offenbarten Verfahren).
Im weiteren Aspekten stellt die vorliegenden Erfindung Verfahren zum Stimulieren von Immunantworten in PBMCs und isolierten Einzelzellen (einschließlich, aber nicht limitierend auf, Makrophagen, Monozyten, B-Zellen und dendritischen Zellen) zur Verfügung. Zur Stimulation von solchen Zellen können die Zellen durch irgendeine von einer Reihe von Techniken isoliert werden, die Fachleuten wohl bekannt sind (wie Ficoll-Hypaque- Dichtezentrifugation) und in Kontakt bringen mit einem LbeIF4A-Polypeptid in ausreichenden Mengen und für eine ausreichende Zeit, um eine Immunantwort, wie oben beschrieben, auszulösen. Die nach dieser Erfindung behandelten Zellen können (aber müssen nicht) von Patienten isoliert worden sein, die unter Leishmaniase oder einer anderen Krankheit leiden und können nach Behandlung dem Patienten wieder zugeführt werden. Bei Zellen, gewonnen von Leishmania-infizierten Individuen, kann die erhaltene Immunantwort eine bevorzugte TH1-Immunantwort (was die Stimulation der IL-12-Produktion beinhaltet) und die Herunterregulierung der IL-10-Expression beinhalten. Bei Zellen von nicht-infizierten Individuen kann die Immunantwort die Produktion von IL-12 sein.
In verwandten Aspekten stellt die vorliegenden Erfindung Verfahren zum Stimulieren oder Verstärken von Immunantworten in Patienten, einschließlich Menschen, zur Verfügung. In einer Ausführungsform kann ein LbeIF4A-Polypeptid als ein immunmodulierendes Agens zum Verstärken einer zellulären und/oder humoralen Immunantwort auf ein anderes Antigen verwendet werden. Durch Verabreichung eines LbeIF4A-Polypeptids an einen Patienten in Verbindung mit einem anderen spezifischen Antigen kann die Immunantwort des Patienten auf das Antigen verstärkt werden. Unter diesem Aspekt kann das LbeIF4A-Polypeptid mit derselben Zusammensetzung (z. B. Impfstoff) wie das Antigen verabreicht werden oder es kann separat verabreicht werden. Im allgemeinen jedoch werden das Antigen und das LbeIF4A-Polypeptid zur selben Zeit und an der selben Stelle verabreicht. In dieser Art und Weise können zum Beispiel LbeIF4A-Polypeptide als Adjuvans bei Impfstoffzusammensetzungen für heterologe Agenzien verwendet werden. Geeignete Dosen in Verfahren zur Verabreichung sind unten im Detail dargestellt.
LbeIF4A-Polypeptide können auch Leishmania-ifizierten Individuen verabreicht werden, entweder alleine oder zusammen mit anderen Leishmania-Antigenen zum Stimulieren der Produktion von Antikörpern, die an Leishmania-Parasiten binden. Die Immunisierung von Mäusen mit LbeIF4A in einem Modell, allgemein anerkannt als einigermaßen vorhersehbar als eine Antwort auf Leishmania-Spezies in Menschen und anderen Säugetieren, hat zu einer protektiven Immunantwort gegen L. braziliensis geführt, was die Eignung von LbeIF4A als Impfstoff bestätigt. Die Polypeptide dieser Erfindung können zum Beispiel an Patienten, leidend an chronischer Hautleishmaniase, zum Stimulieren einer heilenden Immunantwort verabreicht werden.
In weiteren Ausführungsformen können die hier enthüllten Polypeptide an einen Patienten verabreicht werden, um eine Immunantwort zu erzeugen. Bei Leishmania-infizierten Individuen beinhalten die Immunantworten, die erzeugt werden können, eine bevorzugte TH1- Immunantwort (die die Stimulation der IL-12-Produktion einschließt) und die Herunterregulierung der IL-10-Expression. Bei nicht-infizierten Individuen kann die Immunantwort die Produktion von IL-12 und/oder IL-2 oder die Stimulation von Gamma-T-Zellen sein. Geeignete Dosen und Verfahren zur Verabreichung sind unten beschrieben.
In noch einem anderen Aspekt dieser Erfindung können eines oder mehrere LbeIF4A- Polypeptide an einen Patienten verabreicht werden, leidend an einer Krankheit, reagierend auf Interleukin-12-Stimulation. Solche Krankheiten beinhalten Infektionen (welche zum Beispiel bakteriell, viral oder protozoal sein können) oder Krankheiten wie Krebs. Im allgemeinen kann die Empfänglichkeit einer speziellen Krankheit auf IL-12-Stimulation durch Evaluierung der Wirkung der Behandlung mit einem LbeIF4A-Polypeptid auf klinischem Wege in Verbindung mit der Immunität bestimmt werden. Wenn zum Beispiel die Behandlung zu einer erhöhten TH1-Antwort oder zur Umwandlung eines TH2-Level in ein TH1-Profil führt, mit begleitender klinischer Verbesserung bei dem behandelten Patienten, reagiert die Krankheit auf IL-12-Stimulation. Die Polypeptidverabreichung kann wie unten beschrieben sein oder kann auf eine längere Zeitperiode, in Abhängigkeit von der Indikation, ausgedehnt werden.
In den oberen Aspekten, in denen ein LbeIF4A-Polypeptid zum Stimulieren oder Verstärken einer Immunantwort in einem Patienten verwendet wird, ist das Polypeptid bevorzugt als eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Impfstoff formuliert. Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen im allgemeinen ein oder mehrere LbeIF4A-Polypeptide in Kombination mit einem physiologisch akzeptablen Träger, Bindemittel oder Verdünnungsmittel. Solche Träger werden bei Empfängern bei den eingesetzten Dosen und Konzentrationen nicht toxsisch sein. Die Impfstoffe umfassen ein oder mehrere LbeIF4A-Polypeptide und ein oder mehrere zusätzliche geeignete Antigene für die Indikation. Die Verwendung von LbeIF4A- Proteinen in Verbindung mit löslichen Zytokinrezeptoren oder Zytokinen ist daher in Erwägung gezogen.
Arten und Häufigkeit der Verabreichung und Polypeptiddosen werden von Individuum zu Individuum variieren und können momentan denen bei Immunisierung oder Behandlung von anderen Infektionen verwendeten entsprechen. Im allgemeinen werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe durch Injektion (z. B. intramuskulär, intravenös oder subkutan), intranasal (z. B. durch Aspiration) oder oral verabreicht. Die Menge und Häufigkeit der Verabreichung wird natürlich von solchen Faktoren wie der Art und Schwere der zu behandelnden Indikation, der erwünschten Reaktion, dem Zustand des Patienten und so weiter abhängen. Typischerweise können zwischen 1 und 4 Dosen für alle 2-6-Wochenperiode verabreicht werden. Bevorzugt werden zwei Dosen verabreicht, wobei die zweite Dose 2-4 Wochen nach der ersten liegt. Eine geeignete Dose ist eine Menge von LbeIF4A-Polypeptid, die die Produktion von IL-12 im Patienten stimuliert, so daß die Menge von IL-12 in den Überständen von PBMCs, isoliert von dem Patienten, zwischen ungefähr 10 ng und 10 ug pro ml liegt. Im allgemeinen kann die Menge von IL-12 unter verwenden jeglichen geeigneten Tests, die den Fachleuten bekannt sind, bestimmt werden, beinhaltend die hierin beschriebenen Tests. Die Menge des in einer Dosis vorhandenen LbeIF4A-Polypeptids schwankt typischerweise zwischen ungefähr 1 pg bis ungefähr 100 mg pro kg Gewicht, typischerweise von ungefähr 10 pg bis ungefähr 1 mg und bevorzugt von ungefhhr 100 pg bis ungefähr 1 ug. Geeignete Dosisgrößen werden mit der Größe des Tieres variieren, aber werden typischerweise im Bereich von ungefähr 0,01 ml bis ungefähr 5 ml für 10-60 kg Tier liegen. Besonders geeignete Dosen für eine spezielle Indikation können schnell ermittelt werden.
Während jeder geeignete Träger, für Fachleute bekannt, in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden kann, wird die Art des Trägers in Abhängigkeit von der Art der Verabreichung und ob eine fortwährende Verabreichungsgabe gewünscht ist, variieren. Für parenterale Verabreichung wie subkutane Injektionen, umfaßt der Träger bevorzugt Wasser, Salzlösung, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer. Zur oralen Verabreichung kann jeder der oben genannten Träger oder ein fester Träger wie Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Glukose, Sukrose und Magnesiumkarbonat eingesetzt werden. Biodegradierbare Mikrosphären (z. B. polylaktische Galaktide) können auch als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden. Geeignete biodegradierbare Mikrosphären sind zum Beispiel in den U. S. Patenten Nrn. 4,897,268 und 5,075,109 enthüllt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Impfstoffe können auch Verdünnungsmittel wie Puffer, Antioxidantien wie Ascorbinsäure, Polypeptide niederen Molekulargewichts (weniger als ungefähr 10 Reste), Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate einschließlich Glukose, Sukrose oder Dextrine, chelatierende Agenzien wie EDTA, Glutathion oder andere Stabilisatoren und Bindemittel enthalten. Neutral-gepufferte Salzlösung oder Salzlösung gemischt mit nicht-spezifischem Serumalbumin sind beispielsweise geeignete Verdünnungsmittel. Bevorzugt wird das Produkt als ein Lyophilisat unter Verwendung geeigneter Bindemittellösungen (z. B. Sukrose) als Verdünnungsmittel formuliert.
Jedes einer Reihe von Adjuvanzien kann in den Impfstoffen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung zusätzlich zu dem LbeIF4A-Polypeptid verwendet werden, um die Immunantwort unspezifisch zu verstärken. Die meisten Adjuvanzien enthalten eine Substanz, entworfen zum Schutz des Antigens gegenüber eines schnellen Katabolismus wie Aluminiumhydroxid oder Mineralöl und einen unspezifische Stimulator der Immunantworten wie Lipid A, Bordella pertussis oder Mycobacterium tuberculosis. Solche Adjuvanzien sind kommerziell zu erwerben als zum Beispiel Freundsches Inkomplettes Adjuvans und komplettes Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI) und Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ).
In einem anderen Aspekt dieser Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit eines gegebenen Antigens zum Stimulieren einer protektiven Immunantwort zur Verfügung gestellt. Die Fähigkeit von LbeIF4A, die Interleukin-12-Produktion zu stimulieren, korreliert mit der Entwicklung einer protektiven TH1-Antwort bei infizierten Patienten und PBMCs, isoliert von infizierten Patienten. Deswegen stellt das Bestimmen, ob ein ausgwähltes Antigen in der Lage ist, die IL-12-, IFN-γ- und/oder IL-2-Produktion zu stimulieren, ein schnelles, reproduzierbares Durchmusterungsverfahren zur Verwendung in der Impfstoffentwicklung zur Verfügung. Antigene, die in der Lage sind, eine TH1-Antwort hervorzurufen, wie gezeigt durch die Stimulation der in Gamma-T-Zellen, IL-12- und/oder IL-2-Produktion in normalen peripheren mononukleären Blutzellen bei Verwenden der oben beschriebenen Verfahren, sind im allgemeinen zur Herstellung von Impfstoffen geeignet.
LbeIF4A-Proteinderivate können auch als Immunogene, Reagenzien in Immungssays oder als bindende Agenzien für Affinitätsreinigungsverfahren verwendet werden. LbeIF4A- Polypeptide für Test- oder Reinigungszwecke können an ein Festträgermaterial gebunden werden. Die Polypeptide können an das Trägermaterial unter Verwendung einer Reihe von Techniken, für Fachleute bekannt, gebunden werden, welche reichlich in der Patentliteratur und wissenschaftlichen Literatur beschrieben sind. Im Zusammenhang mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "binden" sowohl auf nichtkovalente Assoziation wie Adsorption und kovalente Anlagerung (welche eine direkte Verbindung zwischen dem Antigen und den funktionalen Gruppen auf dem Trägermaterial sein kann oder eine direkte Verbindung im Zusammenhang mit einem kreuzvernetzenden Agens). Die Bindung durch Adsorption an ein Well in einer Mikrotiterplatte oder an eine Membrane ist bevorzugt. In solchen Fällen kann die Adsorption durch kontaktieren des Polypeptides, in einem geeigneten Puffer, mit dem festen Trägermaterial für eine geeignete Zeitdauer erreicht werden. Die Kontaktzeit variiert mit der Temperatur, liegt aber typischerweise zwischen 1 Stunde und 1 Tag. Im allgemeinen ist das Kontaktieren eines Wells einer Plastikmikrotiterplatte (wie Polystyren oder Polyvinylchlorid) mit einer Menge von Polypeptid, im Bereich von ungefähr 10 mg bis ungefähr 1 ug und bevorzugt ungefähr 250 ng, ausreichend, um eine adäquate Menge an Antigen zu binden.
Die Polypeptide könne kovalent unter Verwenden einer Reihe von Techniken an ein festes Trägermaterial gebunden sein. Zum Beispiel kann die Bindung durch Verwenden kreuzvernetzender Agenzien wie M-Maleimidobenzoylsuccinimidester und N-Hydroxysuccinimid erreicht werden, die das Polypeptid an Cystein- und Lysinreste binden. LbeIF4A-Polypeptide können auch kovalent durch reaktive Seitengruppen an verschiedene unlösliche Trägermaterialien gebunden werden wie Cyanogen-bromid-aktivierte, Bisoxiran-aktivierte, Carbonyldiimidazol-aktivierte oder Tosyl-aktivierte Agarosestrukturen oder durch Adsorbieren an Polyolefinoberflächen (mit oder ohne Glutaraldehyd-Kreuzvernetzung).
Einmal an ein Trägermaterial gebunden, können LbeIF4A-Polypeptide in Tests für Antikörper verwendet werden, die das LbeIF4A-Protein binden. Geeignete Tests beinhalten Enzymgekoppelte Immuntests (ELISAs). Solche Tests können durchgeführt werden, indem erst ein Polypeptid-Antigen, das an ein festes Trägermaterial gebunden ist, herkömmlicherweise das Well einer Mikrotiterplatte, mit einer Antikörper-enthaltenden Probe kontaktiert wird, so daß es den Antikörpern innerhalb der Probe ermöglicht wird, an das immobilisierte Polypeptid zu binden. Ungebundene Probe wird dann von dem immobilisierten Polypeptid entfernt und ein Detektionsreagenz, fähig, den immobilisierten Antikörper-Polypeptidkomplex zu binden, wird zugefügt. Die Menge des Detektionsreagenzes, das an dem festen Trägermaterial gebunden bleibt, wird dann unter Verwendung eines Verfahrens, geeignet zur spezifischen Reagenzdetektion, bestimmt.
Immobilisierte Polypeptide können auch zur Reinigung von Antikörpern verwendet werden, die an das LbeIF4A-Polypeptid binden. Solche Antikörper können durch verschiedene Techniken hergestellt werden, die den Fachleuten bekannt sind. Siehe z. B. Harlow Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In einer solchen Technik wird ein Immunogen, umfassend das Polypeptid, in irgendeins von einer großen Reihe von Säugetieren (z. B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe und Ziegen) injiziert. In diesem Schritt kann das Polypeptid dieser Erfindung als das Immunogen ohne Modifikation dienen. Alternativ, insbesondere für relativ kurze Polypeptide, kann eine stärkere Immunantwort erreicht werden, wenn das Polypeptid an ein Trägerprotein gebunden wird, wie Rinderserumalbumin oder Keyhole-Napfschneckenhämocyanin. Das Immunogen wird in das Wirtstier, bevorzugt entsprechend eines vorher festgelegten Plans, der eine oder mehrere Wiederholungs- Immunisierungen umfaßt, injiziert und die Tiere regelmäßigen Blutungen unterzogen, vorsieht. Für das Polypeptid spezifische polyklonale Antikörper können dann von solchem Antiserum durch zum Beispiel Affinitätschromatographie, verwendend das an ein geeignetes festes Trägermaterial gebundene Polypeptid, gereinigt werden.
Monoklonale Antikörper, spezifisch gegen das Polypeptid des Interesses, können zum Beispiel unter Verwenden der Technik von Kohler und Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976, und Verbesserungen derselben, hergestellt werden Zusammengefaßt beinhalten diese Verfahren die Herstellung von immortalen Zellinien, fähig zur Produktion von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität (d. h. Reaktivität mit dem Polypeptid des Interesses). Solche Zellinien können zum Beispiel von Milzzellen, erhalten aus einem immunisierten Tier wie oben beschrieben, erzeugt werden. Die Milzzellen werden dann durch zum Beispiel Fusion mit einem Myelomazellfusionspartner immortalisiert, bevorzugt mit einem, der gen-identisch mit dem immunisierten Tier ist. Ein Reihe von Fusionstechniken können verwendet werden. Zum Beispiel können die Milzzellen und Myelomazellen mit einem nicht-ionischen Detergenz für einige wenige Minuten gemischt werden und dann in niedriger Dichte in einem Selektionsmedium ausplattiert werden, das das Wachstum von Hybridzellen, aber nicht Myelomazellen, unterstützt. Eine bevorzugte Selektionstechnik verwendet HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin)-Selektion. Nach einer ausreichenden Zeit, üblicherweise ungefähr 1 bis 2 Wochen, werden Hybridkolonien beobachtet. Einzelne Kolonien werden ausgewählt und auf Bindungsaktivität gegen das Polypeptid getestet. Hypridomas, die eine hohe Reaktivität und Spezifität zeigen, werden bevorzugt.
Monoklonale Antikörper können von den Überständen der wachsenden Hypridomakolonien isoliert werden. Zusätzlich können verschiedene Techniken eingesetzt werden, um die Ausbeute zu erhöhen, wie Injektion der Hyridomazellinie in die Peritonealhöhle eines geeigneten Vertebratenwirts wie einer Maus. Monoklonale Antikörper können dann von der Aszitesflüssigkeit oder dem Blut geerntet werden. Verunreinigungen können von den Antikörpern durch herkömmliche Techniken wie Chromatographie, Gelitration, Präzipitation und Extraktion entfernt werden. Die Polypeptide dieser Erfindung können in dem Reinigungsprozeß in zum Beispiel einem Affinitätschromatographieschritt verwendet werden.
Monospezifische Antikörper, die an die Polypeptide dieser Erfindung binden, können zum Beispiel verwendet werden, um Leishmania-Infektion in einer biologischen Probe unter Verwendung einer oder einer Reihe von Immuntests zu detektieren, die direkt oder kompetitiv sein können. Zusammengefaßt kann in einer direkten Testart ein monospezifischer Antikörper auf einem festen Trägermaterial immobilisiert werden (wie oben beschrieben) und mit der zu untersuchenden Probe kontaktiert werden. Nach Entfernen der ungebundenen Probe kann ein zweiter monospezifischer Antikörper, der mit einer Reportergruppe markiert ist, zugefügt werden und zum Detektieren des gebundenen Antigens verwendet werden. In einem beispielhaften kompetitiven Test kann die Probe mit dem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, der mit einer geeigneten Reportergruppe markiert worden war, vereinigt werden. Das Gemisch aus Probe und Rest des Antikörpers kann dann mit auf einem geeigneten festen Trägermaterial immobilisierten Polypeptid-Antigen vereinigt werden. Antikörper, der nicht an ein Antigen in der Probe gebunden hat, besitzt die Möglichkeit, an das immobilisierte Antigen zu binden und der Rest der Probe und Antikörper wird entfernt. Der Level des an die feste Trägersubstanz gebundenen Antikörpers ist umgekehrt proportional zum Antigenlevel in der Probe. Somit gibt ein niedriger Level von gebundenem Antikörper das Vorhandensein von Leishmania in der Probe an. Andere Arten zum Verwenden monospezifischer Antikörper, um Leishmania in einer Probe zu detektieren, werden für den Fachmann offensichtlich sein und die oben genannten Arten werden allein zu exemplarischen Zwecken zur Verfügung gestellt.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sollen nicht limitierend wirken. Fachleute werden erkennen, daß Variationen der Erfindung, ausgeführt in den Beispielen, gemacht werden können, insbesondere im Zusammenhang mit der Lehren von verschiedenen zitierten Referenzen.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Präparation von DNA, kodierend für LbeIF4A

Dieses Beispiel veranschaulicht das molekulare Klonieren von einer DNA Sequenz, kodierend für das L. braziliensis ribosomale Antigen LbeIF4A.
Eine genomische Expressionsbibliothek wurde mit gescherter DNA von L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) im Bakteriophagen λZAPII (Stratagene, La Jolla, CA) konstruiert. Die Expressionsbibiothek wurde mit E. co/i-präadsorbiertem Patientserum von einem L. braziliensis-infizierten Individuum mit mukosaler Leishmaniase durchgemustert. Plaques, enthaltend die immunreaktiven rekombinanten Antigene, wurden gereinigt und das pBSK(-)- Phagemid nach dem Protokoll des Herstellers ausgeschnitten. Verschachtelte Deletionen wurden mit Exonuklease III durchgeführt, um überlappende Deletionen für einzelsträngige Matritzenpräparationen und Sequenzierung zu erhalten. Einzelsträngige Matritzen wurden nach Infektion mit VCSM13-Helferphagen, wie durch den Hersteller (Stratagene, La Jolla, CA) empfohlen, isoliert und durch das Dideoxy-Kettenterminationsverfahren oder durch das Taq- Farbstoffterminationssystem, verwendend den Applied Biosystems Automated Sequencer Modell 373 A, sequenziert.
Die immunreaktiven rekombinanten Antigene wurden dann in Patienten-T-Zelltests auf ihre Fähigkeit hin untersucht, eine proliferative Antwort, wie unten in Beispiel 5 beschrieben und ein dominantes TH1-Zytokinprofil, wie unten in Beispiel 7 beschrieben, zu stimulieren.
Ein rekombinanter Klon wurde in den oben beschriebenen Tests identifiziert, der, nach folgenden Sequenzvergleich seiner vorhergesagten Aminosäuresequenz mit Sequenzen von anderen Proteinen, als ein Leishmania braziliensis-Homologon des eukaryotischen Initiationsfaktors 4A (eIF4A) identifiziert wurde. Dem isolierten Klon (pLeIF.1) fehlten die ersten 48 Aminosäurereste (144 Nukleotide) der Vollängenproteinsequenz. Das pLeIF.4-Insert wurde anschließend verwendet, um die genomische Sequenz voller Länge zu isolieren.
SEQ ID NO: 1 zeigt die gesamte Nukleotidsequenz des Vollängen-LbeIF4A-Polypeptids. Der offene Leserahmen (Nukleotide 115 bis 1323) kodiert ein 403 Aminosäuren-großes Protein mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 45,3 kD. Ein Vergleich zu der vorhergesagten Proteinsequenz von LbeIF4A mit den homologen Proteinen von Tabak (TeIF4A), Maus (MeIF4A) und Hefe (YeIF4A) zeigt eine umfangreiche Sequenzhomologie, wobei die ersten 20-30 Aminosäuren besonders variabel sind. Die Längen (403, 413, 407 und 395 Aminosäuren), Molekulargewichte (45,3, 46,8, 46,4 und 44.7 kDa) und isoelektrischen Punkte (5,9, 5,4, 5,5 und 4,9) von LbeIF4A, TeIF4A, MeIF4A und YeIF4A sind jeweils ähnlich. LbeIF4A zeigt eine gesamte Homologie von 75,5% (57% Identität, 18,5% konservative Substitution) mit TeIF4A, 68,6% (50% Identität, 18,6% konservative Substitution) mit MeIF4A und 67,2% (47,6% Identität, 19,6% konservative Substitution) mit YeIF4A.

BEISPIEL 2

Charakterisierung des LbeIF4A-Gens

Dieses Beispiel beschreibt eine Southern-blot-Analyse von LbeIF4A-DNA in Leishmania- Spezies. Leishmania braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), L. guyanensis (MHOM/BR/75/M4147) L. amazonensis (IFLAJBR/67/PH8), L. chagasi (MHOM/BR/82/BA-2,C1 und MHOM/BR/84/Jonas), L. donovani (MHOM/Et/67/HU3), L. infantum (IPT-1), L. major (LTM p-2, L. tropica (1063C), Trypanosoma cruzi (MHOM/CH/00/Tulahuen C2) und T. brucei (TREU 667) wurden verwendet und sind vorher beschrieben worden (siehe Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U. S. A. 90: 775-779, 1993).
Promastigote und Epimastigote wurden in keimfreiem Medium kultiviert. L. chagasi- und L. amazonensis-Amastigote wurden entsprechend von Milzen syrischer Hamster und Fußpolstern von BALB/c ByJ-Mäusen gewonnen und wie bei Burns et al., J. Immunol. 146: 742-748, 1991 beschrieben gereinigt.
Genomische DNA wurde präpariert, mit Enzymen verdaut, die sowohl innerhalb (PstI und NotI) und außerhalb von LbeIF4A (BamHI, EcoRI, EcoRV, HindIII, PvuII, und SstI) schneiden, auf einem 0,7% Agarosegel getrennt und auf Nytranmembran übertragen, wie bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 beschrieben. Ein Restriktionsfragment, umfassend ein 0,94 kb-Fragment (Nukleotide 143 bis 1083) der kodierenden Region von LbeIF4A, wurde durch das Zufalls- Priming-Verfahren radioaktiv markiert (siehe Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 137: 266-268, 1984) und Blots wurden über Nacht bei 65ºC hybridisiert. Die Blots wurden zweimal bei 65ºC für 20 Minuten mit jeweils 2X, 0,5X und 0,2X SSC, enthaltend 0,1% SDS, gewaschen. L. braziliensis genomische DNA enthielt mindestens zwei Kopien von LbeIF4A, wie beispielhaft durch das Vorhandensein von zwei Hybridisierungsbanden in den BamHI- und PvuII-Spuren (Fig. 1) zu sehen war.
Dieselbe Abbildung veranschaulicht auch die Kreuz-Spezies-Konservierung zwischen dem eIF4A-Homologon von L. braziliensis und anderen Leishmania-Spezies. Zwei-Haupt-PstI- Jrlybridisierungsfragmente wurden in allen anderen getesteten Leishmania-Spezies detektiert, wobei Mitglieder des L. donovani-Komplexes (L. chagasi, L. donovani und L. infantum), identische Hybridisierungsmuster zeigen. LbeIF4A kreuzhybridisiert auch mit den weiter entfernten Parasiten T. cruzi, aber nicht 71 brucei, unter stringenten- Hybridisierungsbedingungen. Diese Daten zeigen umfangreiche Kreuz-Spezies- Konservierung von dem Leishmania eIF4A-Homologon.

BEISPIEL 3

Präparation von LbeIF4A

Das Beispiel veranschaulicht die Expression und Reinigung von dem -45 kDa-LbeIF4A- Antigen-Genprodukt. Das 45 kDa rekombinante Antigen des genomischen Klons pLeIF.1 (d. h. das Antigen, das die N-terminalen 48 Reste nicht besitzt) wurde aus 500 ml IPTGinduzierter Kulturen gereinigt. Die Proteineinschlußkörper wurden isoliert und nacheinander in 10 ml TNE (50 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl und 10 mM EDTA), enthaltend 2, 4 und 8 M Harnstoff, gewaschen. Fraktionen, enthaltend gelöstes rekombinantes Antigen (gewöhnlich die 4 und 8 M Harnstoffüberstände), wurden vereinigt, gegen Tris-gepufferte Salzlösung (TBS) dialysiert und durch Präzipitation mit 30% Ammoniumsulfat konzentriert. Die Reinigung zur Homogenität wurde durch präparative SDS-PAGE-Elektrophorese vollendet, gefolgt von Ausschneiden und Elektroelution des rekombinanten Antigens. Alle Antigene, verwendet in unseren Studien, hatten weniger als 10 pg/ml Endotoxin in einem durchgeführte Limulus- Amöbozytentest, durchgeführt von Immunex Corp., Seattle, WA.
Das rekombinante Antigen wurde verwendet, um ein Kaninchen für die Produktion eines polyklonalen Antiserums zu immunisieren. Ein erwachsenes Kaninchen (New Zealand White; R & R Rabbitry, Stanwood, WA) wurde durch subkutane Immunisierung mit 100 ug des gereinigten -LbeIF4A in Freudschem Inkompletten Adjuvans (IFA, GIBCO, Grand Island, NY), zusammen mit 100 ug eines Muramyldipeptids (Adjuvanspeptid, Calbiochem-Novabiochem Corp. La Jolla, CA), immunisiert, gefolgt von einer Wiederholungsimpfung vier Wochen später mit 100 ug des rekombinanten Antigens in IFA allein. Drei Wochen später wurde das Kaninchen intravenös mit 25 ug LbeIF4A in Salzlösung erneut geimpft und das Serum eine Woche später gesammelt.
Immunblots von L. braziliensis-Lysaten von Promasigoten, geerntet während der frühen-, mittleren- oder späten Log-Phase oder nach einem Temperatursprung der Kultur von 22- 35ºC, wurden nacheinander mit dem polyklonalen Kaninchen-Antiserum als eine Sonde untersucht (Fig. 2). Bereich A der Fig. 2 zeigt die Immunblotanalysen von Molekulargewichtsmarkern (Spur M), E. coli-Lysaten von uninduzierten (Spur 1) und induzierten (Spur 2) Kulturen und dem gereinigten rekombinanten Antigen (Spur 3). Bereich B der Fig. 2 zeigt die Immunblotanalysen von L. braziliensis-Promastigoten-Lysat (Spur 1), L. chagasi- Promastigoten-Lysat (Spur 2) und L. amazonensis-Promastigot-(Spur 3) oder Amastigoten- (Spur 4) Lysat.
Parasiten und Säugetierzellysate wurden durch Einfrier-/Auftau-Lyse von Pellets in SDS- Probenpuffer ohne Glycerin und β-Mercaptoethanol hergestellt. Unlösliches Material wurde von dem Überstand durch Zentrifugation bei 10K rpm in einer Mikrozentrifuge getrennt. Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Pierce BCA-Proteintestkits bestimmt. Fünf bis 10 ug Parasiten oder Zellextrakte oder 0,5 bis 1,0 ug rekombinanten Anitgens wurden auf einem 12,5% SDS-PAGE getrennt und elektrophoretisch auf Nitrozellulosemembran transferiert. Reaktivitäten des Antiserums wurden wie vorher beschrieben bestimmt (Skeiky et al., J. Exp. Med. 176: 201-211, 1992) unter Verwendung von [¹²&sup5;I]-Protein A, gefolgt von Autoradiographie.
Das Kaninchen-Antiserum detektierte eine dominante Proteinspezies der Größe ~45 kD. Die relativen Intensitäten des 45 kD eIF4A-Homologs waren für alle analysierten Lysate ähnlich, was somit vermuten ließ, daß dies Antigen während der frühen oder mittleren Log- Wachstumsphase des Parasiten oder als Folge einer Temperaturveränderung, die das intrazelluläre amastigote Stadium nachahmt, konstitutiv exprimiert wird. Das sind verschiedene Mitglieder der Leishmania-Hitzeschockproteinfamilie, deren Produkte als Folge einer Temperaturänderung von 22-35ºC hochreguliert werden. Das prä-immunisierte Kaninchen reagierte nicht mit den Parasitenlysaten.

BEISPIEL 4

Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die an LbeIF4A binden

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen LbeIF4A. Präparationen von gereinigten rekombinanten LbeIF4A oder transfizierten Zellen, die hohe Levels an LbeIF4A exprimieren, können zur Gewinnung monoklonaler Antikörper gegen LbeIF4A unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie diese im U. S. Patent Nr. 4,411,993 enthüllt wurden, verwendet werden. Solche Antikörper können verwendet werden, um in die LbeIF4A-Aktivierung von PBMCs einzugreifen, als Komponenten von diagnostischen Tests oder Forschungstest für LbeIF4A oder zur Afinitätsreinigung von LbeIF4A.
Zur Immunisieren von Nagetieren ist das LbeIF4A-Immunogen in einem Adjuvans (wie Komplettes oder Inkomplettes Freudsches Adjuvans, Alum oder ein anderes Adjuvans wie Ribi-Adjuvans R700 (Ribi, Hamilton, MT) emulgiert worden und in Mengen in einem Bereich von 10-100 ug subkutan in ein ausgewähltes Nagetier, zum Beispiel BALB/c-Mäuse oder Lewis-Ratten, injiziert worden. Zehn Tage bis drei Wochen später sind die immunisierten Tiere mit zusätzlichem Immunogen erneut geimpft worden und wurden danach periodisch nach einem wöchentlichen-, zweiwöchentlichen- oder dreiwöchentlichen Immunisierungsplan erneut geimpft. Serumproben wurden periodisch durch retro-orbitale Blutung oder Entfernung der Schwanzspitze zum Testen durch Dot-Blot-Tests (Antikörpersandwich) oder ELISA (Enzymgekoppelter Immuntest) genommen. Andere Testverfahren wie Inhibition des Hervorrufens einer TH1-Antwort, sind auch geeignet.
Gefolgt von der Detektion eines angemessenen Antikörpertiters bekamen die positiven Tiere eine intravenöse Injektion des Antigens in Salzlösung. Drei bis vier Tage später wurden die Tiere getötet, die Milzzellen geerntet und mit einer Mausmyelomazellinie (z. B. NS1 oder bevorzugt Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]) fusioniert. Durch dieses Verfahren erzeugte Hybridomazellinien wurden in zahlreichen Mikrotiterplatten in einem Selektionsmedium ausplattiert (zum Beispiel eines, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin oder HAT enthält) um die Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myeloma-Myeloma-Hybriden und Milzzelle- Milzzelle-Hybriden zu inhibieren.
So erzeugte Hybridomalinien können mit Hilfe eines ELISA auf Reaktivität mit LbeIF4A durchgemustert werden, zum Beispiel durch Anpassung der bei Engvall et al., Immunochem. 8: 871 (1971) und in U. S. Patent Nr. 4,703,004 enthüllten Techniken. Eine bevorzugte Durchmustertechnik ist die Antikörperfangtechnik, beschrieben bei Beckman et al., J. Immunol. 144: 4212 (1990). Die Hybridomalinien werden zum Beispiel durch limitierende Verdünnung oder durch Klonierung in Soft-Agar geklont, um eine monoklonale Zellinie zu erhalten. Positive Klone wurden dann in die peritonealen Höhlen von genetisch ähnlichen Nagetieren injiziert, um Aszites, enthaltend hohe Konzentrationen (> 1 mg/ml) des monoklonalen Antikörpers anti-LbeIF4A, zu produzieren. Die erhaltenen monoklonalen Antikörper können über Ammoniumsulfatpräzipitation gereinigt werden, gefolgt von einer Gelausschlußchromatographie. Alternativ kann eine Affinitätschromatographie, basierend auf der Bindung von Antikörpern an Protein A oder Protein G verwendet werden, ebenso wie eine Affinitätschromatographie, basierend auf die Bindung an LbeIF4A.

BEISPIEL 5

LbeIF4A-Stimulation von PMBC-Proliferation

Dieses Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit von gereinigtem rekombinanten LbeIF4A zur Stimulierung der Proliferation von PBMCs von L. braziliensis-infizierten Individuen. Peripheres Blut wurde von Individuen erhalten, lebend in einem Gebiet (Corte de Pedra, Bahia, Brasilien), das endemisch für L. braziliensis-Übertragung ist, wo epidemologische, klinische und immunologische Studien für über ein Jahrzehnt durchgeführt worden sind. Eine Diagnose der Patienten wurde durch klinische Befunde in Verbindung mit mindestens einem der folgenden Tests durchgeführt: Isolierung von Parasiten aus Wunden, ein positiver Hauttest mit Leishmania-Lysat oder ein positiver serologischer Test.
Peripheres Blut wurde gesammelt und PBMCs durch Dichtezentrifugation über FicollTM (Winthrop Laboratories, New York) isoliert. Für in vitro-Proliferationstests wurden 2-4 · 10&sup5; Zellen/Well in Vollmedium (RPMI 1640, versetzt mit Gentamycin, 2-ME, L-Glutamin und 10% durchgemustertes vereintes A+ Humanserum; Trimar, Hollywood, CA) in 96-Well Flachbodenplatten mit oder ohne 10 ug/ml des gekennzeichneten Antigens oder 5 ug/ml PHA (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO) für fünf Tage kultiviert. Die Zellen wurden dann mit 1 uCi [³H] Thymidin für die letzten 18 Stunden der Kultur pulsiert.
Die Ergebnisse sind als Mittel-cpm von drei Kulturen dargestellt und der Stimulationsindex (SI) als Mittel-cpm von Kulturen mit Antigen/Mittel-cpm von Kulturen ohne Antigen definiert. Wie in Tabelle 1 und Fig. 3 gezeigt, reagierten PBMCs der meisten (> 70%) mukosalen oder aktiven oder geheilten kutanen Patienten auf LbeIF4A mit einem heterogenen Proliferationsmuster mit Stimulationsindices im Bereich von 12 bis 233 und entsprechend 2 bis 64. TABELLE 1 In Vitro-Proliferation von PBMCs von L. braziliensis-infizierten Induviduen als Antwort auf Parasitenlysat und LbeIF4A-Antigene
Im allgemeinen waren die Stimulationsindices mit PBMCs von mukosalen Individuen höher. PBMCs von einigen mukosalen Patienten reagierten auf LbeIF4A mit Stimulationsindices, vergleichbar zu solchen, beobachtet mit Parasitenlysat. Interessanterweise waren in einigen Patienten mit kutaner Leishmaniase die proliferativen Antworten auf LbeIF4A höher, als solche durch Parasitenlysat angeregte. Im Gegensatz zu mukosalen und kutanen Patienten proliferierten PBMCs von allen sechs Individuen mit selbstheilender kutaner Leishmaniase in Reaktion auf LbeIF4A mit Stimulationsindices (16-198) vergleichbar zu solchen von mukosalen Individuen. PBMCs von zwei der selbstheilenden Individuen (MS und DJ) zeigten Reaktionen, die signifikant höher waren, als solche, erhalten mit Parasitenlysat. Zellen von normalen, uninfizierten Individuen wurden nur marginal durch LbeIF4A stimuliert.

BEISPIEL 6

LbeIF4A-Stimulation von Zytokin-mRNA-Expression in PBMCs

Dieses Beispiel präsentiert eine Analyse von Zytokin-mRNA-Expressionsmustern von PBMCs aus Patienten mit bestätigten Fällen von L. Sraziliensis-Infektion. Zur ZytokinmRNA-Analyse wurden 0,5 bis 1 ml PBMCs mit 1-2 · 106 Zellen/ml mit oder ohne 10 ug/ml des LbeIF4A-Antigens ohne die N-terminalen 48 Reste der SEQ ID NO: 2 (wie in Beispiel 3 beschrieben) für 48 bis 72 Stunden kultiviert. Die Überstände und Zellen wurden geerntet und auf Zytokin-mRNAs hin durch Polymerasekettenreaktion (PCR) analysiert. Zur ZytokinmRNA-PCR-Analyse wurde Gesamt-RNA von den PBMCs unter Verwendung der sauren Guanidium-thiocyanat-Phenol-Chloroformextraktionsmethode isoliert, wie bei Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987 beschrieben. Komplementäre DNA (cDNA) wurde unter Verwendung von poly(dT) (Pharmacia) und AMV-Reverser-Transkriptase (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) in einem Endvolumen von 20 ul synthetisiert. cDNA-Proben wurden auf 200 ul mit Wasser gebracht.
Nach Normalisierung zu β-Actin wurden 12 bis 20 ul der verdünnten cDNA mit PCR unter Verwendung von Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) mit 0,2 uM der entsprechenden 5' und 3' externen Primer in einem Reaktionsvolumen von 50 ul amplifiziert. Die verwendeten Bedingungen waren: Denaturierung bei 94ºC (1 Minute für β-Actin, IL-2 und IL-4; 45 Sekunden für IFN-γ und 30 Sekunden für IL-10), Annealing bei 55ºC (1 Minute für β-Actin, IL-2 und IL-4; 30 Sekunden für IL-10) oder 60ºC für 45 Sekunden für IFN-γ und Elongation bei 72ºC. Wir stellten sicher, daß unsere PCR-Bedingungen innerhalb des semiquantitativen Bereichs durch anfängliche Durchführung serieller Verdünnungen der cDNAs und Veränderung der Anzahl der Zyklen, verwendet für die PCR, waren. In allen nachfolgenden Experimenten wurden 30 Zyklen bei Amplifikationsreaktionen von β-Actin, IL-2, IL-4 und IFN-γ verwendet. Im Fall der IL-10-PCR wurden 25 Zyklen verwendet.
Die verwendeten Primerpaare und die PCR-Bedingungen wurden von veröffentlichten Informationen; β-Actin, IL-2, IL-4 und IFN-γ (Ehlers et al., J. Exp. Med. 173: 23-26, 1991) und IL- 10 (Viera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 1172-1176, 1991) verwendet. Die Nukleotidsequenzen für die entsprechenden 5'- und 3'- Oligonukleotidprimer waren wie folgt: (1) β- Actin,
Sonden wurden unter Verwendung von Plasmiden, enthaltend die humanen Sequenzen von IL-2, IFN-γ und IL-4 (Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Bei U. S. A. 85: 9743-9747, 1988) und β- Actin (Nr. 65128; American Type Culture Collection, Rockville, MD) erhalten, welche mit HindIII/EcoRI, EcoRI, SacI/HindII und EcoRI entsprechend verdaut wurden. Humane IL-10- DNA wurde durch PCR von mitogen-stimulierten PBMCs von normalen Spendern unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, entworfen zur Amplikation eines 535- Basenpaarfragmentes, umfassend die gesamte kodierende Region des humanen IL-10 (Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 9743-9747, 1988), kloniert. Die cDNA wurde in pßluesskript subkloniert und mit BamHI/EcoRI verdaut. Nach Trennung auf einem 1% Agarosegelen wurden die inserierten DNA-Fragmente ausgeschnitten, elektroeluiert und gereinigt. Radioaktiv-markierte ³²P-Sonden wurden mit Hilfe des Zufalls-Priming-Verfahrens hergestellt.
PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf 1,5%,Agarosegelen analysiert, auf Nylonmembranen transferiert und mit dem entsprechenden ³²P-markierten DNA-Insert zusammengebracht. Hybridisierungen wurden bei 55ºC über Nacht durchgeführt. Waschen nach der Hybridisierung wurde bei 55ºC für 20 Minuten zweimal jeweils mit 2x und 1x SSC, enthaltend 0,2% SDS, durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Analysen sind in den Fig. 4A und 4B dargestellt. PCR- Zytokinanalysen wurden mit Zellen vor der Kultivierung (Bahn 0), gefolgt von Kultivierung in Abwesenheit des Antigens (Bahnen -) oder gefolgt von Kultivierung in Anwesenheit von 10 ug/ml L. braziliensis-Lysat (Bahnen Lb) oder in der Anwesenheit von 10 ug/ml LbeIF4A (Bahnen IF) durchgeführt. Fig. 4A zeigt die PCR-Ergebnisse von Zytokin-mRNA für analysierte PBMCs von drei der sechs mukosalen Patienten (JV, SZ und TE) und einem Patienten (VA) mit L. amazonensis-Infektion, manifestiert als diffuse kutane Leishmaniase (DCL). In drei der sechs mukosalen Patienten (TE, Fig. 4A; NO und EO, nicht gezeigt) hatten die nichtin vitro-kultivierten PBMCs detektierbare Levels von mIRNA für IFN-γ und IL-4 ebenso wie IL-2 (Patienten TE und EO). IL-10-mRNA wurde in den "ruhenden" PBMCs von einem der mukosalen Patienten nicht detektiert. Jedoch wurde in Folge von in vitro-Kultivierung in Abwesenheit von Antigenstimulation die Synthese von IL-10-mRNA in den meisten der analysierten mukosalen PBMCs hochreguliert. Zusätzlich sanken die Levels von Zytokin-mRNAs, detektiert in den "ruhenden" PBMCs von den Patienten TE, NO und EO, auf das Hintergrundlevel ab.
Parasitenlysat stimulierte die Expression von mRNAs der TH1-Zytokine IFN-γ und IL-2 ebenso wie die von dem TH2-Zytokin IL-4 (in drei von den sechs Patienten). Ansteigende IL- 10 mRNA wurde in einem von den Patienten-PBMCs (SZ) in Folge der Kultur mit dem Parasitenlysat detektiert. Sowohl LbeIF4A-Antigen als auch Parasitenlysat regten die Produktion von mRNA von IFN-γ und IL-2 von allen mukosalen Patienten-PBMCs an, wobei LbeIF4A ein ausschließliches TH1-Zytokinprofil anregt. Tatsächlich reguliert LbeIF4A die Synthese von IL-10 mRNA, detektiert in den kultivierten PBMCs der meisten mukosalen Patienten vor der Antigenstimulation, herunter. Interessanterweise, wie im Fall des Verwendens von PBMCs von mukosalen Patienten, reguliert auch LbeTF4A die Synthese von IL-10-mRNA in dem DCL Patienten VA herunter.
Im allgemeinen steigen die Levels von mRNAs für IFN-γ und IL-2 von undetektierbaren Mengen vor der Antigenstimulation auf leicht sichtbare Levels in Folge der Antigenstimulation in Ethidiumbromid-gefärbten Gelen an. Jedoch wurde mRNA für die Zytokine IL-4 und IL-10 nur in Folge radioaktiver Markierung von den aufgelösten PCR-Produkten detektiert.
Ähnliche PCR-Analysen wurden bei PBMCs, stammend von kutanen Patienten (Fig. 4B), durchgeführt. Die ruhenden PBMCs von drei (VS, JP und CA (nicht gezeigt)) der vier analysierten Patienten enthüllten hohe Levels an mRNAs sowohl der TH1-(IFN-γ und IL-2) und TH2-(IL-4 und IL-10) untersuchten Zytokinen. mRNAs von IFN-γ und IL-2, aber nicht von IL-10 und IL-4, wurden in den ruhenden PBMCs des vierten (AS) kutanen Patienten detektiert. Somit haben, im Gegensatz zu mukosalen Patienten, Patienten mit kutaner Leishmaniase IL-10-mRNA, zusätzlich zu IL-4, IL-2 und IFN-y, in ihren ruhenden PBMCs. Interessanterweise, während die mRNAs für IL-2 und IFN-γ auf kaum detektierbare Levels in Folge der in vitro-Kultivierung von PBMCs in Abwesenheit von Antigen reduziert worden waren, blieben diese für IL-10 entweder unverändert oder stiegen an. Dafür sind in kutanen Patienten die ruhenden Levels von IL-10-mRNA entweder stabil oder ihre PBMCs führen die Synthese von IL-10-mRNA in Abwesenheit der Antigenstimulation fort. Die Beobachtung von solch einer Antwort für kutane Leishmaniase-Patienten kann ausgenutzt werden, um Individuen zu unterscheiden, die zur Entwicklung chronischer kutaner Leishmaniase prädisponiert sind und solchen, die selbstheilende Läsionen erfahren werden.
Alle untersuchten kutanen Patienten reagierten auf LbeIF4A-Antigen ebenso wie auf das Parasitenlysat mit Hochregulierung der Synthese von mRNAs für IL-2 und IFN-y und in zwei der vier Patienten (VS und AS) stieg auch das Level von IL-4-mRNA in Folge der Stimulation mit Parasitenlysat an. In den drei Patienten (VS, JP und CA) mit detektierbaren "ruhenden" Levels von IL-10-mRNA, regulierte LbeIF4A ebenso wie das Parasitenlysat die Expression von IL-10-mRNA herunter.
Die Zytokin-mRNA-Profile von PBMCs von Patienten mit selbstheilender CL waren insofern denen von ML-Patienten ähnlich (a), ausgenommen für ein Individuum mit detektierbarem Level von IL-10-mRNA, als daß ruhenden PBMCs von drei der vier analysierten Patienten detektierbare Levels von IL-2, IFN-γ und IL-4, aber geringe oder keine IL-10-mRNA hatten; (b) IL-10-mRNA nach Kultur von PBMCs ohne Antigen hochreguliert wurde, wobei solche von IL-2, IFN-γ, IL-4 auf das Hintergrundlevel absanken; und (c) Leishmanialysat die Expression von einem gemischten TH1/TH2-Zytokinprofil stimulierte, wobei LbeIF4A nur eine ansteigende mRNA-Expression von den TH1-Typ-Zytokinen auslöste und die Expression von IL-10-mRNA in den kultivierten PBMCs der meisten selbstheilenden Individuen (nicht gezeigt) herunterreguliert wurde.

BEISPIEL 7

LbeIF4A-Stimulation von Zytokinseiretion in PBMCs

Dieses Beispiel zeigt die Überstandslevels von sekretierten Zytokinen von PBMCs von L. braziliensis-infizierten Individuen in Folge der Stimulation mit LbeIF4A-Antigen ohne die Nterminalen 48 Reste der SEQ ID NO: 2 (in Beispiel 3 beschrieben) oder Parasitenlysat. Aliquots von den PBMC-Überständen wurden auf IFN-γ, TNF-α, IL-4 und IL-10 getestet. IFN-γ wurde durch einen Doppelsandwich-ELISA unter Verwendung von anti-human IFN-γ mAb aus Maus (Chemicon, Temucula, CA) und polyklonalen, anti-human IFN-γ Serums aus Kaninchen quantifiziert. Humanes rIFN-γ (Genentech Inc. San Franciso, CA) wurde zur Erzeugung einer Standardkurve verwendet. IL-4 wurde in Überständen durch einen Doppelsandwich-ELISA unter Verwendung eines anti-human IL-4 mAb aus Maus (M1) und eines polyklonalen anti-human IL-4 Serums aus Kaninchen (P3) quantifiziert. Humanes IL-4 (Immunex Corp., Seattle, WA) wurde zur Erzeugung einer Standardkurve im Bereich von 50 pg/ml bis 1 ng/ml verwendet. IL-10 wurde unter Verwendung eines anti-human IL-10 mAb aus Ratte (PharMingen, San Diego, CA, Cat. #18551D) zum "Fangen" sektretierten IL-10 und eines biotinylierten anti-human IL-10 mAb aus Ratte (PharMingen, San Diego, CA, Cat. # 18562D) zur Detektion eines gebundenen IL-10 mit Streptavidin-konjugierter Meerrettichperoxidase und ABTS als Substrat gemessen. Eine Standardkurve wurde durch Verwenden humanen rIL- 10 (freundlicherweise durch DNAX Research Institute, Palo Alto, CA zur Verfügung gestellt) im Bereich von 30 pg bis 2 ng/ml erhalten.
Zellen von allen drei Patientengruppen (d. h. mukosale, kutane und selbstheilende-kutane) sekretierten IFN-γ und TNF-α in Folge der Stimulation mit entweder 10 ug/ml LbeIF4- Antigen oder 10 ug/ml Parasitenlysat (Fig. 5 und 6). Ähnlich stimulierte LbeIF4A Patienten mit L. tropica-Infektion (Desert Storm-Patienten) zum Proliferieren und Sekretieren von IFN- γ (nicht gezeigt). Die Levels von sowohl IFN-γ als auch TNF-α, detektiert in den Überständen von Patienten-PBMCs, waren signifikant höher als solche von uninfizierten Kontrollen. In Abwesenheit von Antigenstimulation produzierten nur PBMCs von mukosalen Patienten (fünf von sechs) detektierbare Levels von TNF-a im Überstand (60 bis 190 pg/ml). Wenig oder kein IL-4 oder IL-10 wurde in einem der analysierten Überstände (nicht gezeigt) detektiert, was Levels unterhalb der Detektionsgrenze des verwendeten ELISA-Tests nahelegt. Im Vergleich stimuliert auch Leishmanialysat PBMCs zum Sekretieren von IFN-γ und TNF-α und in einigen Patienten wurde auch IL-10 detektiert (nicht gezeigt). Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, daß LbeIF4A ein prädominantes TH1-Zytokinprofil in PBMCs von L. braziliensis-infizierten Individuen stimuliert, wobei Parasitenlysat ein gemischtes TH1/TH2- Zytokinprofil stimuliert.
Die Levels von TNF-α, detektiert in den Überständen von Patienten-PBMCs mukosaler und selbstheilender Individuen in Folge von Antigenstimulation, war höher als solche von kutanen Patienten (Fig. 6). PBMCs von vier oder fünf mukosalen Patienten (JV, SZ, AB und MB) hatten höhere Überstandslevels von TNF-α (0,80 bis 2,20 ng/ml) als solche, wie sie in Kulturen von PBMCs von uninfizierten Kontrollen in Folge der Stimulation mit Parasitenlysat detektiert wurden. Ähnlich wurden dieselben PBMCs durch LbeIF4A stimuliert, um Überstandslevel von TNF-a mit Werten im Bereich von 0,66 bis 3,14 ng/ml zu produzieren. Verglichen mit uninfizierten Kontrollen produzierten PBMCs von drei (GS, HS und MCT) aus sechs analysierten, selbstheilenden Individuen höhere Levels an TNF-α als Antwort auf Parasitenlysat und alle sechs (GS, MS, AH, DJ, HS und MCT) von sechs analysierten, selbstheilenden Individuen produzierten höhere Levels an TNF-α als Antwort auf LbeIF4A. Die Levels von TNF-α, produziert durch PBMCs von kutanen Leishmaniase-Patienten als Antwort auf Parasitenlysat, waren mit uninfizierten Kontrollen vergleichbar. Jedoch stimulierte LbeIF4A PBMCs in drei von diesen Patienten (RJ, AD und JS), um TNF-α zu produzieren. Solche Patienten können im Prozeß der Entwicklung akuter kutaner Leishmaniose sein.

BEISPIEL 8

Stimulation von IL-12-Produktion durch LbeIF4A

Das Beispiel zeigt, daß LbeIF4A PBMCs von L. braziliensis-infizierten Individuen, kultivierten humanen Makrophagen, adhärenten PBMCs aus dem Blut normaler Spender und der humanen Myeloidleukämiezellinie THP-1 stimuliert, um IL-12 zu sekretieren. Es wurde gezeigt, daß IL-12 eine zentrale immunregulatorische Rolle in der Entwicklung von zellvermittelter Immunität, Erzeugen von TH1-Antworten und IFN-γ-Produktion bei intrazellulären bakteriellen oder parasitischen Infektionen spielt. Das verwendete LbeIF4A-Polypeptid war das LbeIF4A-Antigen ohne die N-terminalen 48 Reste der SEQ ID NO: 2 (wie in Beispiel 3 beschrieben).
IL-12 p40 wurde in zellfreien Überständen durch RIA (Detektionsgrenze von 10 pg/ml) unter Verwendung des mAb-Paares C11.79/C8.6, wie bei D'Andrea et al., J. Exp. Med. 179: 1387- 1398, 1992 beschrieben, gemessen. Biologisch aktives IL-12 p70-Heterodimere (Detektionsgrenze 1 pg/ml) wurde, wie bei Kubin et al., Blood 83: 11347-1855, 1994 beschrieben, gemessen.
Fig. 7A zeigt, dass 10 ug/ml LbeIF4A (LeIF) PBMCs von mukosalen Patienten stimuliert, um IL-12 p40 in den Kulturüberstand in einem erheblich größeren Ausmaß als das IL-12 p40- Level, beobachtet mit 10 ug/ml Parasitenlysat als Antigen (Lb), zu sekretieren. Die Menge des IL-12 p40, sekretiert in Abwesenheit von Lysat oder Antigen, ist auch dargestellt (Med). Dieselbe Figur zeigt auch, daß 10 ug/ml IL-10 die Produktion von IL-12 p40 bei Patienten- PBMCs in Folge der Stimulation mit LbeIF4A (LeIF + IL-10) oder Lysat (Lb + IL-10) herunterreguliert.
PBMCs von uninfizierten Individuen produzieren auch IL-12 p40, wenn sie mit LbeIF4A (LeIF, Fig. 7B) kultiviert werden, obwohl kein p40 als Antwort auf Parasitenlysat (Lb) detektiert wurde. Das kann eine Rolle von IFN-γ im Lysat induzierten p40, beobachtet in Patienten- PBMCs, vorschlagen, die eine 5-100 höhere IFN-γ-Menge als normale PBMCs nach Antigenstimulation (siehe Fig. 5) produzierten.
Um zu bestimmen, ob das beobachtete IL-12 p40 in Antigen-stimulierten PBMCs-Kulturen biologisch aktives Zytokin zeigt, wurde auch IL-12 p70 in diesen Kulturen getestet (Fig. 7C und 7D). Im allgemeinen läuft die p70-Produktion mit der von p40 parallel, was zeigt, daß biologisch aktives IL-12 in Antwort auf LbeIF4A in beiden Patienten und normalen PBMCs produziert worden war.
LbeIF4A stimuliert auch die IL-12-Produktion in kultivierten humanen Makrophagen (Fig. 9A) und in adhärenten PBMCs (Fig. 9B). Adhärente Zellen wurden aus PBMCs präpariert, getrennt durch eine Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation von dem Blut normaler Spender. 2 · 106 PBMCs wurden für 2 Stunden in 500 ul RPMI mit 2% humanen AB-Serums kultiviert. Adhärente Zellen wurden durch dreimaliges Waschen der Platten mit PBS gereinigt. Dann wurden 500 ul des Testmediums (RPMI, 2% humanes AB-Serum) mit dem entsprechenden Stimulus zugefügt (INF-1000U/ml, LbeIF4A (Lf) 10 ug/ml). Überstände wurden nach 18 Stunden genommen.
IL-12 Produktion von adhärenten PBMCs wurde durch einen Fang-Biotest mit 5 Tage alten PHA-Blasten gemessen. Zusammengefaßt wurde der IL-12-fangende Antikörper C11.5.14 (freundliche Gabe von dem Wistar Institute) an 96-Wellplatten gebunden. Überstände von den Induktionsexperiment und rekombinantes IL-12, als ein Standard, wurden für 4 Stunden inkubiert. Nach mehreren Waschschritten wurden 5 Tage alte PHA-Blasten zugefügt und die Proliferation von diesen Blasten wurde zur Bestimmung der IL-12-Konzentrationen in den Überständen der adhärenten Zellen verwendet.
Makrophagen wurden durch Kultivieren adhärenter Zellen (2 · 10&sup6; PBMCs) für 5 Tage in Testmedium erzeugt. Dann wurden die Makrophagen in PBS gewaschen und 500 ul RPMI, 2% humanes AB-Serum und 1000 U/ml IFN-γ wurden zugefügt. Makrophagen wurden mit LbeIF4A (10 ug/ml) stimuliert oder in Medium (M) alleine kultiviert. In einem Set wurden die LbeIF4A-Kontrollmakrophagen mit LbeIF4A in 500 ul RPMI, 2% humanes AB-Serum ohne IFN-γ inkubiert. Überstände wurden nach 18 Stunden entnommen und zur Induktion von IL-12-abhängiger Proliferation verwendet. Zusammengefaßt wurden 5 Tage alte Blasten mit Makrophagenüberständen für 2 Tage inkubiert. Für die verbleibenden 18 Stunden wurde ³H-Thymidin zugefügt. Wie angegeben, wurde neutralisierendes anti-IL-12 polyklonales Ziegenserum (5 ug/ml) zugegeben.
Zusätzlich stimuliert LbeIF4A IL-12-Produktion in der humanen Myeloidleukämiezellinien THP-1 (Fig. 10). Die Zellen wurden bei 106 Zellen/m1L für 24-48 Stunden in Endotoxinfreiem RPMI-Medium, erhaltend 5% fötales Rinderserum, kultiviert. 10 ug/ml LbeIF4A wirkten mit IFN-γ zusammen, um THP-1-Zellen zum Sekretieren von IL-12 zu stimulieren. Diese Ergebnisse legen die Verwendung von LbeIF4A als Impfstoff nahe.

BEISPIEL 9

Einfluß von IL-12 und IL-10 auf LbeIF4A-Induktion von IFN-γ-Produktion

Dieses Beispiel untersucht die Interaktion zwischen IL-12, IL-10 und IFN-γ in Antwort auf das LbeIF4A-Polypeptid ohne die N-terminalen 48 Reste der SEQ ID NO: 2 (wie in Beispiel 3 beschrieben). Wie in Fig. 8A gezeigt, werden PBMCs von Patienten mit mukosaler Leishmaniase mit 10 ug/ml LbeIF4A in Abwesenheit (LeIF) oder Anwesenheit von 10 ug/ml anti-IL-12 (LeIF + Anti-IL-12) oder IL-10 (LeIF + IL-10) stimuliert und die kultivierten Überstände wurden auf IFN-γ-Sekretion hin getestet. Sowohl anti-IL-12 mAb und IL-10 hoben die Produktion von LbeIF4A-induzierter IFN-γ-Sekretion auf. Anti-IL-12-mAb jedoch senkte nur teilweise die Produktion von IFN-γ nach Stimulation mit Leishmanialysat (Fig. 8B). Diese Ergebnisse zeigen, daß IFN-γ-Produktion IL-12 abhängig ist und durch IL-10 inhibiert wird, wohingegen die Produktion von IL-12 sowohl durch IFN-γ-abhängig als auch unabhängige Wege reguliert wird.

BEISPIEL 10

LbeIF4A-Stimulation von einem TH1-Profil in Mäusen

Dieses Beispiel zeigt, daß das LbeIF4A-Polypeptid ohne die N-terminalen Reste der SEQ ID NO: 2 (wie in Beispiel 3 beschrieben) ein dominantes TH1-Zytokinprofil in BALB/c Mäusen stimuliert. Die Tiere wurden entweder mit LbeIF4A oder 8E (der C-terminale Teil von dem L. braziliensis-mitochondrialen hsp70, der Patienten-PBMCs stimuliert, um hohe Level an IL-10 zu produzieren) unter Verwendung von quilA oder CFA als Adjuvans vorbehandelt. Zehn Tage nach Vorbehandlung wurden Lymphknoten (LN)-Zellen in vitro mit den rekombinanten Antigenen re-stimuliert und die Kulturüberstände wurden auf sekretierte Zytokine hin analysiert. Die Ergebnisse (Fig. 11) zeigen, daß LN-Zellen von Mäusen, vorbehandelt mit LbeIF4A, proliferierten und ein beinah ausschließliches TH1-Zytokin (IFN-γ) in Folge der Behandlung mit LbeIF4A, verwendend beider Arten von Adjuvanzien, sekretierte. Im Gegensatz produzierten LN-Zellen von Mäusen, vorbehandelt mit 8E, eine TH0-Antwort mit CFA als Adjuvans oder TH1/TH2-Typ Zytokine (mit quilA als Adjuvans) mit einer starken Tendenz in Richtung der TH2-Zytokine, IL-4 und IL-10 in spezifischer Antwort auf Behandlung mit 8E. Ähnlich produzierten Mäuse, vorbehandelt mit Parasitenlysat, ein gemischtes Zytokinprofil, ein Ergebnis, daß gegen die Verwendung von Parasitenlysat alleine als Impfstoffkandidat (Fig. 11) sprechen kann.
Diese Ergebnisse geben Hinweise, daß LbeIF4A als ein Adjuvants verwendet werden kann. Weil LbeIF4A eine starke TH1 Antwort induziert, beinhaltend die zwei Zytokine, die am deutlichsten mit dem Schutz bei experimenteller Leishmaniase assoziiert sind, IFN-γ und IL- 12, haben wir die Fähigkeit dieses Antigens zum Schulz von Mäusen gegen Leishmaniase untersucht. BALB/c-Mäuse wurden einmal mit LbeIF4A ohne Adjuvants immunisiert, gefolgt von subkutaner Infektion mit L. major sieben Tage später. Verglichen mit den Kontrollgruppen, bot LbeIF4A einen signifikanten Schutz gegen L. major-Infektion (Fig. 12). Somit kann ein heterologes Antigen, abgeleitet von L. braziliensis, einen gewissen Schutz gegen L. major-Infektion verleihen, was vermuten läßt, daß mindestens einige der "schützenden" Epitope zwischen den beiden Parasiten konserviert sind.
Von dem Vorangegangenen wird angenommen, obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung hierin zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben wurden, daß unterschiedliche Modifikationen gemacht werden können.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: Corixa, Corporation
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verbindungen und Verfahren zur Stimulierung und Verstärkung von schützenden Immunantworten und IL-12-Herstellung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: SEED and BERRY
(B) STRASSE: 6300 Columbia Center, 701 Fifih Avenue
(C) ORT: Seattle
(D) STAAT Washington
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 87104-7092
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release 1.0, Version 1.30
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US
(B) ANMELDETAG: 24. April 1995
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATION ZUM ANWALT:
(A) NAME: Kadlecek, Ann T.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: P-39, 244
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 210121.404PC
(ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (206) 622-4900
(B) TELEFAX: (206)682-6031
(C) TELEX: 3723836 SEEDANDBERRY
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1618 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 115..1326 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 403 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Claims

1. Ein isoliertes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) Nukleotide 115 bis 1323 der SEQ ID NO: 1;

(b) DNA-Sequenzen, die mit einer Nukleotidsequenz, komplementär zu den Nukleotiden 115 bis 1323 der SEQ ID NO: 1, unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisieren, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das eine TH1-Immunantwort in peripheren mononuklären Blutzellen, erhalten von einer Leishmania-infizierten Person, stimuliert; und

(c) DNA, die für ein Polypeptid kodiert, was durch eine der vorangegangen DNA- Sequenzen kodiert wird.

2. Ein rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 1.

3. Eine mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 2 transformierte oder transfizierte Wirtszelle.

4. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das eine TH1-Immunantwort in peripheren mononuklären Blutzellen, gewonnen von einer Leishmania-infizierten Person, stimuliert, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 3 unter Bedingungen, die die Expression der DNA-Sequenz fördern und die Gewinnung des Polypeptides.

5. Ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, kodiert durch eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1.

6. Ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuren 49-403 der SEQ ID NO: 2 oder eine Variante desselben, die nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen abweicht.

7. Ein Verfahren zur Evaluierung der Fähigkeit eines Patienten zur Erzeugung einer Immunantwort, umfassend:

(a) Kontaktierung einer biologischen Probe, erhalten von einem Patienten, mit dem Polypeptid nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe Zellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus peripheren mononuklären Blutzellen, Monozyten, B-Zellen, dendritischen Zellen, Makrophagen und Kombinationen derselben, umfaßt; und

(b) Messen einer Antwort der Zellen.

8. Das Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Antwort eine proliferative Antwort ist.

9. Das Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Antwort eine Sekretion von Zytokin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus γ-Interferon, Interleukin-2, Interleukin-12 p70, Interleukin-12-Untereinheit p40, Interleukin-1 und dem Tumornekrosefaktor-α, umfaßt.

10. Das Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Antwort die Expression einer mRNA umfaßt, die für ein Zytokin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus y- Interferon, Interleukin-2, Interleukin-12-Untereinheit p40, Interleukin-1 und dem Tumornekrosefaktor-α, kodiert.

11. Ein Verfahren zur Stimmulierung einer TH1-Artwort in einer biologischen Probe, umfassend die Kontaktierung einer biologischen Probe, erhalten von einer Leishmaniainfizierten Person, mit dem Polypeptid nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe Zellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus peripheren mononuklären Zellen, Monozyten, B-Zellen, dendritischen Zellen, Makrophagen und Kombinationen derselben, umfaßt.

12. Ein Verfahren zur Runterregulierung der Expression von Interleukin-10 in einer biologischen Probe, umfassend die Kontaktierung einer biologischen Probe, erhalten von einer Leishmania-infizierten Person, mit dem Polypeptid nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe Zellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus peripheren mononuklären Zellen, Monozyten, B-Zellen, dendritischen Zellen, Makrophagen und Kombinationen derselben, umfaßt.

13. Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach einem der Ansprüche 5 oder 6 bindet.

14. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 5 oder 6 und ein physiologisch akzeptabler Träger.

15. Ein Impfstoff zur Stimulierung einer schützenden Immunantwort gegen ein Antigen, umfassend die Polypeptide nach einem der Ansprüche 5 oder 6 und ein Antigen.

16. Ein Verfahren zur Stimulierung der IL-12-Produktion in einer biologischen Probe, umfassend die Kontaktierung der biologischen Probe mit dem Polypeptid nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe Zellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus peripheren mononuklären Blutzellen, Monozyten, B-Zellen, dendritischen Zellen und Kombinationen derselben, umfaßt.

17. Ein Polypeptid nach Anspruch 5 oder 6 zur Stimulierung der Produktion von Antikörpern nach einem Patent, die Leishmaniaparasiten binden.

18. Ein Polypeptid nach Anspruch 5 oder 6 zur Stimulierung einer TH1-Immunantwort im Patienten.

19. Ein Polypeptid nach Anspruch 5 oder 6 zur Runterregulierung der Expression von Interleukin-10 im Patienten.

20. Ein Polypeptid nach Anspruch 5 oder 6 zur Stimulierung von Interleukin-12 im Patienten.

21. Ein Polypeptid nach Anspruch 5 oder 6 zur Behandlung eines Patienten, leidend durch eine Krankheit, die auf Interleukin-12-Stimulation reagiert.

22. Das Polypeptid nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit eine Infektionskrankheit ist.

23. Das Polypeptid nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit Krebs ist.

24. Ein Polypeptid nach Anspruch 5 oder 6 zur Verstärkung einer zellulären und/oder humoralen Immunantwort im Patienten.