DE69033143T2

DE69033143T2 - Cytokinsynthesehemmender faktor (csif) und verfahren zur anwendung

Info

Publication number: DE69033143T2
Application number: DE69033143T
Authority: DE
Inventors: Martha Bond; Kevin Moore; Timothy Mosmann; Paulo Vieira
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1989-06-28
Filing date: 1990-06-28
Publication date: 1999-10-21
Anticipated expiration: 2010-06-29
Also published as: EP0567450A1; CN1198642C; CA2062763C; CN1318589C; NO915115D0; CN1317569A; NZ234291A; DE69033143D1; CS414591A3; JP2813063B2; TW218383B; EP0405980A1; IL94878A; EP0567450B1; HU216310B; CA2062763A1; WO1991000349A1; AU6077090A; CN1317343A; NO301718B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Krankheiten, die mit einem gestörten Gleichgewicht im Immunsystem verbunden sind, insbesondere mit einem gestörten Gleichgewicht, an dem humorale und zellvermittelte Immunreaktionen beteiligt sind. Die Erfindung umfaßt auch Proteine und deren Antagonisten, die in der Lage sind, die Synthese bestimmter am Immunsystem beteiligter Cytokine zu modulieren, um therapeutische Wirkungen zu erzielen.

Hintergrund

Immunreaktionen auf Antigene werden in solche eingeteilt, die vorwiegend entweder zellvermittelt sind, zum Beispiel die Phänomene der Hypersensitivität des verzögerten Typs (DTH), oder humoral, zum Beispiel die Erzeugung von Antikörpern. Die zellvermittelte Immunität ist von höchster Bedeutung für die Abstoßung von Tumoren und für die Erholung von vielen Virus-, Bakterien-, Protozoen- und Pilzinfektionen. Dagegen ist eine humorale Immunreaktion die effektivste Form der Immunität zur Eliminierung von Toxinen und eindringenden Organismen aus dem Kreislauf. Es wurde beobachtet, daß für verschiedene Antigene häufig die eine oder die andere dieser beiden Reaktionen in einer sich gegenseitig ausschließenden Weise vorherrscht und daß die Heftigkeit mancher Krankheiten, z. B. Lepra, Leishmaniasis und mancher Typen von Autoimmunität, auf die unangemessene Dominanz einer Klasse von Reaktionen über die andere zurückzuführen sein kann, Mosmann et al., Immunol. Today, Vol.
8, S. 223-227 (1987); Mosmann et al., Ann. Rev. Immunol., Vol. 7, S. 145-173 (1989); Parish, Transplant. Rev., Vol. 13, S. 35-66 (1972); und Liew, Immunol. Today, Vol. 10, S. 40-45 (1989). Es wurde weiterhin beobachtet, daß Gruppen von Cytokinen getrennt mit DTH-Reaktionen und humoralen Immunreaktionen assoziiert sind, Cher et al., J. Immunol., Vol. 138, S. 3688- 3694 (1987); und Mosmann et al. (1987 und 1989, loc. cit.), und man glaubt, daß mit diesen Klassen von Reaktionen assoziierte Krankheiten durch die unangemessene Produktion der damit verbundenen Gruppen von Cytokinen verursacht werden.
Zum Beispiel gibt es eine große Menge Beweismaterial für die Vermutung, daß eine übermäßige Produktion von γ-Interferon (IFN-γ) für Autoimmunkrankheiten verantwortlich ist, die mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) zusammenhängen: Hooks et al., New England J. Med., Vol. 301, S. 5-8 (1979) (erhöhte Serumspiegel von IFN-γ, die mit der Autoimmunität korrelieren); Basham et al., J. Immunol., Vol. 130, S. 1492- 1494 (1983) (IFN-γ kann die Expression von MHC-Genprodukten verstärken); Battazzo et al., Lancet, S. 1115-1119 (11/12/83) (anomale Expression von MHC-Genprodukten, die mit einigen Formen der Autoimmunität korreliert ist); Hooks et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., Vol. 301, S. 21-32 (1980) (höhere IFN-Y- Spiegel, die mit einer größeren Heftigkeit von Krankheiten bei SLE-Patienten korreliert sind, und eine die Freisetzung von Histamin verstärkende Wirkung von Interferon können durch Anti-Interferon-Seren gehemmt werden); und Iwatani et al., J. Clin. Endocrin. and Metabol., Vol. 63, S. 695-708 (1986) (monoklonaler Anti-IFN-γ-Antikörper zerstörte die Fähigkeit von Leucoagglutinin-stimulierten T-Zellen zum Induzieren der HLA- DR-Expression). Es gibt die Hypothese, daß ein Überschuß an IFN-γ die unangemessene Expression von MHC-Genprodukten bewirkt, die wiederum Autoimmunreaktionen gegen die Gewebe verursacht, deren Zellen die MHC-Produkte in unangemessener Weise exprimieren und im Zusammenhang mit den Produkten Autoantigene darbieten.
Auf dem Gebiet der klinischen Parasitologie wurde vor kurzem beobachtet, daß die Spiegel von IFN-γ und IL-2 wichtige Faktoren beim Fortschreiten und/oder der Lösung der Protozoeninfektion Leishmaniasis sind. Insbesondere scheint die Anwesenheit ausreichender IFN-γ-Spiegel für die Aktivierung infizierter Makrophagen zur Eliminierung intrazellulärer Amastigoten wesentlich zu sein, Mauel und Behin, in Cohen et al. (Hrsg.), Immunology of Parasitic Infections (Blackwell, London, 1982). Und in Mäusemodellen der Krankheit wurde gezeigt, daß hohe IFN-γ-Spiegel und niedrige IL-4-Spiegel mit der Lösung assoziiert sind, während niedrige IFN-γ-Spiegel und hohe IL-4-Spiegel mit dem Fortschreiten der Leishmaniasis assoziiert sind, Heinzel et al., J. Exp. Med., Vol. 169, S. 59-72 (1989).
Im Hinblick darauf wäre es vorteilhaft, über Mittel zu verfügen, die die Dominanz einer Klasse von Immunreaktionen zu der anderen verschieben könnten und die insbesondere die Synthese von IFN-γ und/oder anderer Cytokine unterdrücken bzw. verstärken könnten, je nachdem, wie es für die Therapie erforderlich ist. Solche Mittel wären von großem Vorteil für die Behandlung von Krankheiten, die mit unangemessenen oder unzureichenden Immunreaktionen assoziiert sind, wie Gewebeabstoßung, Leishmaniasis und andere Parasitenkrankheiten, sowie von Immunstörungen, die mit dem MHC assoziiert sind, einschließlich rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematosus (SLE), Myasthenia gravis, insulinabhängigem Diabetes mellitus, Thyroiditis und dergleichen.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft den Säuger-Cytokin-Synthese-Inhibitionsfaktor (CSIF), CSIF-Analoga, CSIF-Peptide und CSIF-Antagonisten. Sie umfaßt Nucleinsäuren, die für Polypeptide codieren, die CSIF-Aktivität besitzen, sowie die Polypeptide selbst, ihre agonistischen und/oder antagonistischen Analoga, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Verfahren zu ihrer Verwendung zur Behandlung von Störungen, die mit Cytokin- Ungleichgewichten verbunden sind, insbesondere solcher, die zu einer unangemessenen Klasse von Immunreaktionen führen. Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung von CSIF oder seiner Antagonisten, allein oder als Impfstoff-Adjuvantien, zum gezielten Induzieren einer vorwiegend zellvermittelten Immunreaktion bzw. einer vorwiegend humoralen Immunreaktion. Vorzugsweise sind Antagonisten von CSIF von monoklonalen Antikörpern abgeleitet, die in der Lage sind, die biologische Aktivität von CSIF zu blockieren. Die Nucleinsäuren der Erfindung sind definiert (1) durch ihre Homologie zu den hier offenbarten Sequenzen von klonierter komplementärer DNA (cDNA) oder ihre Fähigkeit, nachweisbare Hybride mit diesen zu bilden, und (2) durch funktionelle Assays auf CSIF-Aktivität, die auf die von den Nucleinsäuren codierten Polypeptide angewendet werden. Der hier verwendete Ausdruck "CSIF-Aktivität" bedeutet in bezug auf ein Protein oder ein Polypeptid, daß das Protein oder Polypeptid in der Lage ist, die Produktion wenigstens eines der folgenden Cytokine in den unten beschriebenen Assays zu hemmen oder ihr Ausmaß wesentlich zu reduzieren: IFN-γ, Interleukin-2 (IL-2), Lymphotoxin, Interleukin-3 (IL-3) oder Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF).
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein reifes Human-CSIF des offenen Leserasters, das durch die folgende Aminosäuresequenz definiert ist:
wobei die Standard-Einbuchstaben-Symbole (siehe unten) für L- Aminosäuren von links nach rechts aufgeführt sind, beginnend mit dem N-terminalen Methionin. Insbesondere ist das reife Human-CSIF durch die folgende Aminosäuresequenz definiert:
In diesen Sequenzen dienen die Zwischenräume nur der Bequemlichkeit des Lesers. Für die Aminosäuren wird hier der Standard-Einbuchstaben-Code verwendet:
A Ala Alanin
C Cys Cystein
D Asp Asparaginsäure
E Glu Glutaminsäure
F Phe Phenylalanin
G Gly Glycin
H His Histidin
I Ilc Isolcecin
K Lys Lysin
L Leu Leucin
M Met Methionin
N Asn Asparagin
P Pro Prolin
Q Gln Glutamin
R Arg Arginin
S Ser Serin
T Thr Threonin
V Val Valin
W Trp Tryptophan
Y Tyr Tyrosin
Die Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung und Klonierung von eDNAs, die in der Lage sind, Proteine mit CSIF- Aktivität zu exprimieren. Entsprechend wurden mehrere solcher Klone, die als pcD(SRα)-F115 (trägt ein Maus-CSIF-Gen) sowie pH5C und pH15C (tragen jeweils ein Human-CSIF-Gen) bezeichnet werden, bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, unter den Zugriffsnummern 68027, 68191 bzw. 68192 hinterlegt.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für den Grad der Hemmung der IFN-γ-Synthese bei mehreren Maus-T-Zell-Klonen, die mit unterschiedlichen Mengen CSIF behandelt wurden.
Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Hauptmerkmale der Säuger- Expressionsvektoren pH5C und pH15C zeigt.
Fig. 3 zeigt den RBS-ATG-Polylinker-Bereich des Plasmids TAC- RBS-hCSIF.
Fig. 4 zeigt die Nucleotidsequenz des cDNA-Einschubs von pH15C.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung umfaßt reife Polypeptide oder Proteine der größten offenen Leseraster der cDNA-Einschübe von pH5C, pH15C, pcD(SRα)-F115, sowie effektiv homologe cDNAs sowie Antagonisten davon. Bei sezernierten Proteinen codiert ein offenes Leseraster gewöhnlich ein Polypeptid, das aus einem reifen oder sezernierten Produkt besteht, das an seinem N-Terminus kovalent an ein Signalpeptid gebunden ist. Das Signalpeptid wird vor der Sekretion des reifen oder aktiven Polypeptids abgespalten. Die Spaltstelle kann mit hoher Genauigkeit anhand von empirischen Regeln vorausgesagt werden, z. B. von Heijne, Nucleic Acids Research, Vol. 14, S. 4683-4690 (1986), und die genaue Aminosäurezusammensetzung des Signalpeptids scheint für seine Funktion nicht entscheidend zu sein, z. B. Randall et al., Science, Vol. 243, S. 1156-1159 (1989); Kaiser et al., Science, Vol. 235, S. 312-317 (1987). Folglich werden reife Proteine leicht durch Vektoren exprimiert, die ganz andere Signalpeptide codieren als die, die das offene Leseraster codiert, das durch die cDNA-Einschübe von pH5C, pH15C und pcD(SRα)-F115 definiert ist.

I. Gewinnung und Expression von CSIF-cDNAs

Der hier verwendete Ausdruck "effektiv homolog" bedeutet, daß die Nucleotidsequenz mit einer Hybridisierungssonde, die von einem cDNA-Klon der Erfindung abgeleitet ist, nachgewiesen werden kann. Das genaue numerische Maß der Homologie, die zum Nachweis von für CSIF-Aktivität codierenden Nucleinsäuren notwendig ist, hängt von mehreren Faktoren ab; dazu gehören (1) die Homologie der Sonde zu nicht-CSIF-codierenden Sequenzen, die mit den Zielnucleinsäuren assoziiert sind, (2) die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen, (3) ob einzelsträngige oder doppelsträngige Sonden eingesetzt werden, (4) ob RNA- oder DNA-Sonden eingesetzt werden, (5) die zum Reduzieren der nichtspezifischen Bindung der Sonde ergriffenen Maßnahmen, (6) die Art des zum Markieren der Sonde verwendeten Verfahrens, (7) der Anteil von Guanidin- und Cytosin-Basen in der Sonde, (8) die Verteilung von Fehlpaarungen zwischen Sonde und Zielmolekül, (9) die Größe der Sonde, und dergleichen. Vorzugsweise ist eine effektiv homologe Nucleinsäuresequenz zu wenigstens 90% zu der cDNA der Erfindung homolog. Insbesondere ist eine effektiv homologe Nucleinsäuresequenz eine, deren cDNA durch eine Sonde, die aus einem cDNA-Einschub von pcD(SRα)-F115, pH5C, pH15C oder einem Äquivalent davon aufgebaut ist, unter Verwendung der in den Beispielen beschriebenen Hybridisierungsvorschrift mit nicht mehr als einigen falschen positiven Signalen, z. B. weniger als hundert, isoliert werden kann. Es gibt eine ausgedehnte Literatur, die Ratschläge für die Auswahl der Bedingungen für solche Hybridisierungen gibt, z. B. Hames et al., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (IRL Press, Washington, DC, 1985); Gray et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 80, S. 5842-5846 (1983); Kafatos et al., Nucleic Acids Research, Vol. 7, S. 1541-1552 (1979); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); und Beltz et al., Meth. in Enzymol., Vol. 100, S. 266-285 (1983), um nur einige zu nennen.
Homologie, wie der Ausdruck hier verwendet wird, ist ein Maß für die Ähnlichkeit zwischen zwei Nucleotidsequenzen (oder Aminosäuresequenzen). Homologie wird als der Anteil oder Prozentsatz übereinstimmender Basen (oder Aminosäuren) ausgedrückt, nachdem zwei Sequenzen (möglicherweise verschiedener Länge) aneinander ausgerichtet wurden. Der Ausdruck "Ausrichtung" wird in dem Sinne verwendet, wie er von Sankoff und Kruskal in Kapitel 1 von Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison (Addison-Wesley, Reading, MA, 1983), definiert wurde. Demnach werden zwei Sequenzen, grob gesagt, ausgerichtet, indem man die Anzahl der übereinstimmenden Basen (oder Aminosäuren) zwischen den beiden Sequenzen maximiert, wobei eine minimale Zahl von "Blind-" oder "Nullbasen" in jede Sequenz insertiert werden kann, um eine maximale Überlappung zu erreichen. Wenn zwei Sequenzen gegeben sind, stehen Algorithmen zur Verfügung, um ihre Homologie zu berechnen, z. B. Needleham und Wunsch, J. Mol. Biol., Vol. 48, S. 443-453 (1970); sowie Sankoff und Kruskal (loc. cit.), S. 23-29. Außerdem stehen kommerzieller Service und Softwarepakete zur Verfügung, um solche Vergleiche durchzuführen, z. B. Intelligenetics, Inc. (Palo Alto, CA), und University of Wisconsin Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin).
Restriktions-Endonuclease-Fragmente der Vektoren, die die cDNAs der Erfindung tragen, werden zum Aufbau von Sonden verwendet (unter Verwendung von Standardtechniken, wie Nick- Translation, siehe z. B. Sambrook et al., loc. cit.), um genomische oder cDNA-Bibliotheken (wiederum mit Standardtechniken aufgebaut) eines Zelltyps, von dem man annimmt, daß er CSIF erzeugen könnte, mit geringen Hybridisierungsstringenzen zu durchmustern. Standard-Durchmusterungsverfahren werden eingesetzt, z. B. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 72, S. 3961-3965 (1975); oder Benton et al., Science, Vol. 196, S. 180-183 (1977); oder Woo, Methods in Enzymology, Vol. 68, S. 389-396 (1979). Alternativ dazu können Bibliotheken auch mit markierten Oligonucleotidsonden durchmustert werden, deren Sequenzen aus den Nucleotidsequenzen der cDNA-Einschübe von pcD(SRα)-F115, pH5C und pH15C bestimmt werden. Solche Sonden können auf kommerziell erhältlichen DNA-Synthesizern synthetisiert werden, z. B. Applied Biosystems Modell 381A, wobei man Standardtechniken verwendet, z. B. Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Washington DC, 1984). In beiden Fällen hat die Sonde vorzugsweise eine Länge von wenigstens 18-30 Basen. Noch mehr bevorzugt hat die Sonde eine Länge von wenigstens 50-200 Basen. Hybridisierungssonden können auch verwendet werden, um mögliche Quellen für CSIF- mRNA zu durchmustern, bevor eine Bibliothek aufgebaut wird.
Eine große Vielfalt an einzelligen und mehrzelligen Expressionssystemen (d. h. Kombinationen von Wirt und Expressionsvektor) kann verwendet werden, um die Proteine der Erfindung herzustellen. Zu den möglichen Typen von Wirtszellen gehören unter anderem Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Säugerzellen und dergleichen. Viele Übersichtsartikel sind verfügbar, die einem dabei helfen, spezielle Expressionssysteme zu wählen und/oder zu modifizieren, z. B., um nur einige zu nennen, de Boer und Shepard, "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", S. 205-247, in Kroon (Hrsg.), Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), geben eine Übersicht über mehrere E.-coli-Expressionssysteme; Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry, Vol. 16, Heft 4, S. 349-379 (1984), und Banerji et al., Genetic Engineering, Vol. 5, S. 19-31 (1983), geben eine Übersicht über Verfahren zum Transfizieren und Transformieren von Säugerzellen; Reznikoff und Gold (Hrsg.), Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986), geben eine Übersicht über ausgewählte Themen der Genexpression in E. coli, Hefe und Säugerzellen; und Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworths, Boston, 1986), gibt eine Übersicht über Säuger- Expressionssysteme. Ähnlich stehen auch viele Übersichtsartikel zur Verfügung, die Techniken und Bedingungen für die Verknüpfung und/oder Manipulation spezieller cDNAs und Expressions-Steuersequenzen beschreiben, um Expressionsvektoren zu schaffen und/oder zu modifizieren, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, z. B. Sambrook et al. (loc. cit.).
Ein E.-coli-Expressionssystem wird von Riggs im US-Patent 4,431,739 offenbart. Ein besonders gut geeigneter prokaryontischer Promotor für die starke Expression in E. coli ist der tac-Promotor, der von de Boer im US-Patent 4,551,433 offenbart wird. Sekretions-Expressionsvektoren stehen auch für E.-coli- Wirte zur Verfügung. Besonders gut geeignet sind die pIN-III- ompA-Vektoren, die von Ghrayeb et al. in EMBO J., Vol. 3, S. 2437-2442 (1984), offenbart werden, wobei die zu transcribierende cDNA mit dem Teil des E.-coli-OmpA-Gens fusioniert wird, das das Signalpeptid des ompA-Proteins codiert, welches wiederum bewirkt, daß das reife Protein in den periplasmatischen Raum des Bakteriums sezerniert wird. Die US-Patente 4,336,336 und 4,338,397 offenbaren ebenfalls Sekretions-Expressionsvektoren für Prokaryonten.
Zahlreiche Bakterienstämme sind geeignete Wirte für prokaryontische Expressionsvektoren; dazu gehören Stämme von E. coli, wie W3110 (ATCC Nr. 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776 (ATCC-Nr. 31244), X2282, RR1 (ATCC-Nr. 31343), MRCI; Stämme von Bacillus subtilis; und andere Enterobacteriaceen, wie Salmonella typhimurlum oder Serratia marcescens, sowie verschiedene Pseudomonas-Arten. Allgemeine Verfahren zur Ableitung von Bakterienstämmen, wie E. coli K12 X1776, die für die Expression eukaryontischer Proteine geeignet sind, werden von Curtis III im US-Patent 4,190,495 offenbart.
Außer prokaryontischen und eukaryontischen Mikroorganismen können auch Expressionssysteme, die von mehrzelligen Organismen abgeleitete Zellen umfassen, verwendet werden, um Proteine der Erfindung zu erzeugen. Von besonderem Interesse sind Säuger-Expressionssysteme, da ihre Maschinerie der posttranslationalen Prozessierung mit größerer Wahrscheinlichkeit biologisch aktive Säugerproteine erzeugt. Mehrere DNA-Tumorviren wurden als Vektoren für Säugerwirte verwendet. Besonders wichtig sind die zahlreichen Vektoren, die Replikations-, Transcriptions- und/oder Translations-Steuersequenzen von SV40 umfassen, die an bakterielle Replikations-Steuersequenzen gekoppelt sind, z. B. die pcD-Vektoren, die von Okayama und Berg entwickelt wurden und in Mol. Cell. Biol., Vol. 2, S. 161-170 (1982), und Mol. Cell. Biol., Vol. 3, S. 280-289 (1983), offenbart sind und von Takebe et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 8, S. 466-472 (1988), verbessert wurden. Zu den weiteren auf SV40 beruhenden Säuger-Expressionsvektoren gehören die von Kaufman und Sharp in Mol. Cell. Biol., Vol. 2, S. 1304-1319 (1982), und von Clark et al. im US-Patent 4,675,285 offenbarten, worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Affenzellen sind gewöhnlich die bevorzugten Wirte für die obigen Vektoren. Solche Vektoren, die die SV40-ori-Sequenzen und ein intaktes A- Gen enthalten, können sich in Affenzellen autonom replizieren (was höhere Kopienzahlen und/oder stabilere Kopienzahlen ergibt als bei nichtautonom replizierenden Plasmiden). Überdies können sich Vektoren, die die SV40-ori-Sequenzen ohne ein intaktes A- Gen enthalten, in COS7-Affenzellen autonom zu hohen Kopienzahlen (aber nicht stabil) replizieren; sie werden von Gluzman, Cell, Vol. 23, S. 175-182 (1981), beschrieben und sind vom ATCC (Zugriffs-Nr. CRL 1651) erhältlich. Die obigen Vektoren auf SV40-Basis sind auch in der Lage, andere Säugerzellen, wie Maus-L-Zellen, durch Integration in die DNA der Wirtszelle zu transformieren.
Mehrzellige Organismen können ebenfalls als Wirte für die Erzeugung von CSIF dienen, z. B. Insektenlarven, Maeda et al., Nature, Vol. 315, S. 592-594 (1985), und Ann. Rev. Entomol., S. 351-372 (1989); und transgene Tiere, Jaenisch, Science, Vol. 240, S. 1468-1474 (1988).

II. In-vitro-Assays für CSIF

CSIF-Aktivität ist die Eigenschaft, die Synthese wenigstens eines Cytokins in der Gruppe, die aus IFN-γ, Lymphotoxin, IL-2, IL-3 und GM-CSF besteht, in einer Population von T-Helferzellen, die durch Einwirkung syngener antigenpräsentierender Zellen (APCs) und von Antigen zum Synthetisieren eines oder mehrerer dieser Cytokine induziert wurden, zu hemmen. Die APCs werden vorzugsweise so behandelt, daß sie replikationsunfähig werden, ihre antigenverarbeitende Maschinerie jedoch funktionsfähig bleibt. Dies wird zweckmäßigerweise erreicht, indem man die APCs z. B. mit etwa 1500-3000 R (Gamma- oder Röntgenstrahlung) bestrahlt, bevor man sie mit den T-Zellen mischt.
Alternativ dazu kann auf Cytokin-Inhibition in primären oder vorzugsweise sekundären Mischlymphocyten-Reaktionen (MLR) getestet werden; in diesem Fall brauchen keine syngenen APCs verwendet zu werden. MLRs sind in der Technik wohlbekannt, z. B. Bradley, S. 162-166, in Mishell et al. (Hrsg.), Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, San Francisco, 1980); und Battisto et al., Meth. in Enzymol., Vol. 150, S. 83-91 (1987). In Kürze: Zwei Populationen allogener lymphoider Zellen werden miteinander gemischt, wobei eine der Populationen vor dem Mischen so behandelt wurde, daß ihre Vermehrung verhindert wird, z. B. durch Bestrahlung. Vorzugsweise werden die Zellpopulationen mit einer Konzentration von etwa 2 · 10&sup6; Zellen/ml in ergänztem Medium, z. B. RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum, hergestellt. Sowohl für Kontrollen als auch für Testkulturen werden für den Assay 0,5 ml jeder Population vermischt. Für eine sekundäre MLR werden die nach 7 Tagen in der primären MLR verbleibenden Zellen durch frisch hergestellte bestrahlte Stimulatorzellen wieder stimuliert. Die Probe, von der man annimmt, daß sie CSIF enthalten könnte, kann zum Zeitpunkt des Mischens zu den Testkulturen gegeben werden, und sowohl Kontrollen als auch Testkulturen können 1 bis 3 Tage nach dem Mischen auf Cytokinproduktion getestet werden.
Zum Erhalten von T-Zellpopulationen und/oder APC-Populationen für CSIF-Assays werden Techniken verwendet, die in der Technik wohlbekannt sind und in DiSabato et al. (Hrsg.), Meth. in Enzymol., Vol. 108 (1984), vollständig beschrieben sind. APCs für den bevorzugten CSIF-Assay sind Monocyten des peripheren Blutkreislaufs. Diese werden mit Standardtechniken erhalten, wie z. B. beschrieben von Boyum, Meth. in Enzymol., Vol. 108, S. 88-102 (1984); Mage, Meth. in Enzymol., Vol. 108, S. 118-132 (1984); Litvin et al., Meth. in Enzymol., Vol. 108, S. 298-302 (1984); Stevenson, Meth. in Enzymol., Vol. 108, S. 242-249 (1989); und Romain et al., Meth. in Enzymol., Vol. 108, S. 148- 153 (1984). Vorzugsweise werden in den CSIF-Assays Helfer-T- Zellen verwendet, die erhalten werden, indem man zuerst Lymphocyten aus dem peripheren Blutkreislauf abtrennt und dann, z. B. durch Panning oder Durchflußcytometrie, Helferzellen ausselektiert, indem man einen kommerziell erhältlichen Anti- CD4-Antikörper verwendet, z. B. OKT4, der im US-Patent 4,381,295 beschrieben und von der Ortho Pharmaceutical Corp. erhältlich ist. Die erforderlichen Techniken sind von Boyum in Scand. J. Clin. Lab. Invest., Vol. 21 (Suppl. 97), S. 77 (1968), und in Meth. in Enzymol., Vol. 108 (loc. cit.), sowie von Bram et al., Meth. in Enzymol., Vol. 121, S. 737-748 (1986), vollständig offenbart. Im allgemeinen werden PBLs durch Ficoll-Hypaque- Dichtegradientzentrifugation aus Frischblut erhalten.
In dem Assay kann eine Vielzahl von Antigenen eingesetzt werden, z. B. KLH (keyhole limpet hemocyanin, Hämocyanin aus der Schlitzschnecke), Hühner-γ-Globulin oder dergleichen. Noch mehr bevorzugt werden Helfer-T-Zellen in dem Assay anstatt mit Antigen mit monoklonalem Anti-CD3-Antikörper stimuliert, z. B. OKT3, der im US-Patent 4,361,549 offenbart ist.
Cytokinkonzentrationen in Kontroll- und Testproben werden durch biologische und/oder immunchemische Standardassays gemessen. Der Aufbau immunchemischer Assays für spezielle Cytokine ist in der Technik wohlbekannt, wenn das gereinigte Cytokin zur Verfü gung steht, z. B. Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); und US-Patent 4,486,530 sind Beispiele für die ausgedehnte Literatur zu diesem Thema. ELISA-Kits für Human-IL-2, Human-IL-3 und Human- GM-CSF sind von der Genzyme Corp. (Boston, MA) kommerziell erhältlich, und ein ELISA-Kit für Human-IFN-γ ist von der Endogen, Inc. (Boston, MA) kommerziell erhältlich. Polyklonale Antikörper, die spezifisch für Human-Lymphotoxin sind, sind von der Genzyme Corp. erhältlich und können in einem Radioimmunoassay für Human-Lymphotoxin verwendet werden, z. B. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982).
Biologische Assays für die oben aufgeführten Cytokine können ebenfalls verwendet werden, um die CSIF-Aktivität zu bestimmen. Ein biologisches Assay für Human-Lymphotoxin ist offenbart in Aggarwal, Meth. in Enzymol., Vol. 116, S. 441-447 (1985), und von Matthews et al., S. 221-225, in Clemens et al. (Hrsg.), Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, DC, 1987). Human-IL-2 und GM-CSF können mit den faktorabhängigen Zellinien CTLL-2 und KG-1, die von der ATCC unter den Zugriffs-Nummern TIB 214 bzw. CCL 246 erhältlich sind, getestet werden. Human-IL-3 kann anhand seiner Fähigkeit, die Bildung eines großen Bereichs hämatopoietischer Zellkolonien in Weichagarkulturen zu stimulieren, getestet werden, wie z. B. von Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterdam, 1984), beschrieben. INF-γ kann mit Antivirenassays quantifiziert werden, z. B. Meager, S. 129-147, in Clemens et al. (Hrsg.; loc. cit.).
Die Cytokinproduktion kann auch durch mRNA-Analyse bestimmt werden. Cytokin-mRNAs können durch cytoplasmatische Punkthybridisierung gemessen werden, wie es von White et al., J. Biol. Chem., Vol. 257, S. 8569-8572 (1982), und Gillespie et al., US- Patent 4,483,920, beschrieben wird. Weitere Ansätze umfassen das Dot-Blotting unter Verwendung gereinigter RNA, z. B. Kapitel 6 in Hames et al. (Hrsg.), Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (IRL Press, Washington, DC, 1985). Im allgemeinen beinhaltet die cytoplasmatische Punkthybridisierung das Verankern von mRNA aus einer Zell- oder Gewebeprobe auf einem Festphasenträger, z. B. Nitrocellulose, das Hybridisieren einer DNA-Sonde mit der verankerten mRNA und das Entfernen von Sondensequenzen, die nichtspezifisch an den Festphasenträger gebunden sind oder fehlgepaarte Hybride mit der mRNA bilden, so daß nur Sondensequenzen übrigbleiben, die im wesentlichen perfekte Hybride mit Ziel-mRNAs bilden. Die Menge der verbleibenden DNA-Sonde ist ein Maß für die Zahl der am Festphasenträger verankerten Ziel-mRNAs. Die Menge der verbleibenden DNA- Sonde wird anhand des durch ihre Markierung erzeugten Signals bestimmt. Mehrere Standardtechniken stehen zur Verfügung, um einzel- und doppelsträngige Nucleinsäurefragmente zu markieren. Dazu gehören der Einbau von radioaktiven Markern, z. B. Harper et al., Chromosoma, Vol. 83, S. 431-439 (1984); direkte Bindung von Fluoreszenzmarkern, z. B. Smith et al., Nucleic Acids Research, Vol. 13, SS. 2399-2412 (1985), und Connolly et al., Nucleic Acids Research, Vol. 13, S. 4485-4502 (1985); und verschiedene chemische Modifikationen der Nucleinsäurefragmente, durch die sie immunchemisch oder durch andere Affinitätsreaktionen nachweisbar werden, z. B. Tchen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 81, S. 3466-3470 (1984); Richardson et al., Nucleic Acids Research, Vol. 11, S. 6167-6184 (1983); Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 78, S. 6633-6637 (1981); Brigati et al., Virology, Vol. 126, S. 32-50 (1983); Broker et al., Nucleic Acids Research, Vol. 5, S. 363-384 (1978); und Bayer et al., Methods of Biochemical Analysis, Vol. 26, S. 1-45 (1980).
Vorzugsweise wird mRNA aus T-Zellen nach der folgenden Vorschrift für die Hybridisierung mit der Sonde verankert. Isolierte T-Zellen werden lysiert, indem man sie bei 4ºC mit einer Endkonzentration von 1 · 10&sup8; Zellen/ml in einem Lysepuffer (0,14 M NaCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl, pH 8,6, 0,5% Nonidet P-40 (ein nichtionisches Detergens, z. B. von Sigma)) suspendiert. Die Suspension wird 10 s lang verwirbelt, und die Zellkerne werden sedimentiert (13000 · g, 2,5 min). Dann werden die resultierenden cytoplasmatischen Lysate in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen übertragen, das 0,3 Volumina 20x SSC (1x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Trinatriumcitrat (standard sahne citrate)) und 0,2 Volumina 37%igen (w/w) Formaldehyd enthielt. Dann wird das Gemisch 15 min bei 60ºC inkubiert und in Aliquoten bei -70ºC aufbewahrt. Zur Analyse werden 15 ml jeder Probe durch eine Verdünnungsreihe mit jeweils dreifacher Verdünnung in 15x SSC in Mengen von jeweils 0,1 ml in eine 96-Napf-Flachboden- Mikrotiterplatte (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA) titriert. Jede Verdünnung wird unter Verwendung eines 96- Haltepunkt-Minifold-Apparats (Schleicher und Schuell) durch Sog auf eine Nytranfolie (einen modifizierten Nylonträger, der von Schleicher und Schuell, Keene, NH, erhältlich ist; 0,45 mm Porengröße) auf einem Filterpapier als Träger (Whatman 3 mmChr, Whatman Inc., Clifton, NJ) aufgetragen. Dann wird das Nytran- Papier gebrannt (80ºC, 2 h) und mit einer Vorhybridisierungslösung behandelt, die aus 50% Formamid (BRL, Gaithersburg, MD), 6x SSC, 50 mg/ml E.-coli-tRNA (Sigma), jeweils 0,2% (w/v) Ficoll (MW = 400000), Polyvinylpyrrolidon und Rinderserumalbumin (BSA) besteht. Die Sonde wird in einer Konzentration von etwa 50 ng Sonde pro ml Hybridisierungslösung auf den Nytran- Träger aufgetragen. Nach der Hybridisierung wird der Träger zweimal jeweils 15 min bei Raumtemperatur in 2x SSC, dann zweimal jeweils 30 min bei 60ºC in 2x SSC/0,5% SDS gewaschen. Dann wird der Träger unter Verwendung eines Verstärkerschirms auf Film umkopiert und durch Abtasten mit einem Laser- Densitometer (z. B. Ultroscan XL, LKB Instruments Inc., Gaitehrsburg, MD) quantifiziert. Wenn es der cytoplasmatischen Punkthybridisierung an ausreichender Empfindlichkeit fehlt, wird die RNA vorzugsweise zuerst aus den PBLs extrahiert, bevor man blottet. Zum Beispiel kann RNA nach dem Guanidiniumthiocya nat-Verfahren extrahiert werden, das von Chirgwin et al. in Biochemistry, Vol. 18, S. 5294-5299 (1979), offenbart ist.
In manchen Fällen müssen auf CSIF-Aktivität zu testende Proben vorbehandelt werden, um vorbestimmte Cytokine zu entfernen, die den Assay stören könnten. Zum Beispiel erhöht IL-2 in einigen Zellen die Produktion von IFN-γ. Je nach den bei dem Assay verwendeten Helfer-T-Zellen muß IL-2 also gegebenenfalls aus der getesteten Probe entfernt werden. Solche Entfernungen werden zweckmäßigerweise durchgeführt, indem man die Probe durch eine Standard-Anti-Cytokin-Affinitätssäule laufen läßt.

III. Für CSIF spezifische monoklonale Antikörper und Antagonisten

Vorzugsweise sind die Antagonisten der Erfindung von Antikörpern abgeleitet, die spezifisch für Human-CSIF sind. Insbesondere umfassen die Antagonisten der Erfindung Fragmente oder Bindungszusammensetzungen, die spezifisch für Human-CSIF sind. Antikörper umfassen ein Gefüge von Polypeptidketten, die über Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Zwei Hauptpolypeptidketten, die als leichte Kette und schwere Kette bezeichnet werden, bilden alle größeren Strukturklassen (Isotypen) von Antikörpern. Sowohl schwere Ketten als auch leichte Ketten werden weiter in Teilbereiche unterteilt, die als variable Bereiche und konstante Bereiche bezeichnet werden. Schwere Ketten umfassen einen einzigen variablen Bereich und drei verschiedene konstante Bereiche, und leichte Ketten umfassen einen einzigen (von dem der schweren Kette verschiedenen) variablen Bereich und einen einzigen (von denen der schweren Kette verschiedenen) konstanten Bereich. Die variablen Bereiche der schweren Kette und der leichten Kette sind für die Bindungsspezifität des Antikörpers verantwortlich.
Der hier verwendete Ausdruck "variabler Bereich der schweren Kette" bedeutet ein Polypeptid, das (1) typischerweise eine Länge von 110 bis 125 Aminosäuren aufweist und (2) dessen Aminosäuresequenz der einer schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung entspricht, beginnend mit der N- terminalen Aminosäure der schweren Kette. Ähnlich bedeutet der Ausdruck "variabler Bereich der leichten Kette" ein Polypeptid, das (1) eine Länge von 95 bis 115 Aminosäuren aufweist und (2) dessen Aminosäuresequenz der einer leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung entspricht, beginnend mit der N-terminalen Aminosäure der leichten Kette.
Der hier verwendete Ausdruck "monoklonaler Antikörper" bezieht sich auf eine homogene Population von Immunglobulinen, die spezifisch an Human-CSIF binden können.
Der hier verwendete Ausdruck "Bindungszusammensetzung" bedeutet eine Zusammensetzung, die zwei Polypeptidketten umfaßt, die (1), wenn sie operationell miteinander verbunden sind, eine Konformation annehmen, die eine hohe Bindungsaffinität zu Human-CSIF hat, und die (2) von einem Hybridom abgeleitet sind, das für Human-CSIF spezifische monoklonale Antikörper erzeugt. Der Ausdruck "operationell miteinander verbunden" soll darauf hinweisen, daß die zwei Polypeptidketten mit einer Vielzahl von Mitteln zur Bindung relativ zueinander positioniert werden können, einschließlich der Assoziation in einem nativen Antikörperfragment, wie einem Fab- oder Fv-Fragment, oder mit Hilfe gentechnisch erzeugter cysteinhaltiger Peptidlinker an den Carboxytermini. Normalerweise entsprechen die beiden Polypeptidketten dem variablen Bereich der leichten Kette und dem variablen Bereich der schweren Kette eines für Human-CSIF spezifischen monoklonalen Antikörpers. Vorzugsweise sind Antagonisten der Erfindung von für Human-CSIF spezifischen monoklonalen Antikörpern abgeleitet. Monoklonale Antikörper, die CSIF blockieren oder neutralisieren können, werden anhand ihrer Fähigkeit ausgewählt, in Standard-CSIF-Bioassays CSIF-induzierte Wirkungen zu hemmen, z. B. die Hemmung der IFN- γ-Synthese.
Hybridome der Erfindung werden durch wohlbekannte Techniken erzeugt. Gewöhnlich beinhaltet das Verfahren die Fusion einer immortalisierenden Zellinie mit einem B-Lymphocyten, der den gewünschten Antikörper erzeugt. Alternativ dazu sind auch fusionsfreie Techniken zur Erzeugung unsterblicher antikörpererzeugender Zellinien möglich, die ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen, z. B. eine viral induzierte Transformation: Casali et al., "Human Monoclonals from Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes and Transformation by EBV", Science, Vol. 234, S. 476-479 (1986). Immortalisierende Zellinien sind gewöhnlich transformierte Säugerzellen, insbesondere Myelomzellen, die von Nagern, Rind und Mensch abgeleitet sind. Zweckmäßigerweise und wegen der Verfügbarkeit werden am häufigsten Ratten- oder Maus-Myelomzellinien eingesetzt. Techniken zur Gewinnung der geeigneten Lymphocyten aus Säugern, denen das Zielantigen injiziert wurde, sind wohlbekannt. Im allgemeinen werden entweder Lymphocyten des peripheren Blutes (PBLs) verwendet, wenn Zellen menschlicher Herkunft gewünscht werden, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen werden verwendet, wenn nichtmenschliche Säugerquellen gewünscht werden. Einem Wirtssäuger werden wiederholte Dosen des gereinigten Antigens injiziert, und man läßt den Säuger die gewünschten antikörperbildenden Zellen erzeugen, bevor diese für die Fusion mit der immortalisierenden Zellinie entnommen werden. Techniken für die Fusion sind in der Technik ebenfalls wohlbekannt; sie beinhalten im allgemeinen das Mischen der Zellen mit einem Fusionsmittel, wie Polyethylenglycol. Hybridome werden nach Standardverfahren selektiert, wie durch HAT- Selektion. Von diesen Hybridomen werden solche, die den gewünschten, d. h. für Human-CSIF spezifischen, Antikörper sezernieren, ausgewählt, indem man ihr Kulturmedium durch Standard- Immunoassays testet, wie Western-Blotting, ELISA, RIA, CSIF- Neutralisationsfähigkeit oder dergleichen. Antikörper werden mit Hilfe von Standard-Proteinreinigungstechniken aus dem Medium gewonnen, z. B. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985). Viele Literaturstel len mit einer Anleitung zur Anwendung einer der obigen Techniken stehen zur Verfügung, z. B. Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982), und dergleichen. Hybridome, die für Human- CSIF spezifische monoklonale Antikörper erzeugen, werden dann einer zweiten Durchmusterung unter Verwendung der oben beschriebenen CSIF-Assays unterzogen, um solche auszuwählen, die die biologische Aktivität von CSIF blockieren oder neutralisieren können.
Die Verwendung und Erzeugung von Antikörperfragmenten ist ebenfalls wohlbekannt, z. B. Fab-Fragmente: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985), Fv-Fragmente: Hochman et al., Biochemistry, Vol. 12, S. 1130- 1135 (1973); Sharon et al., Biochemistry, Vol. 15, S. 1591- 1594 (1976); und Ehrlich et al., US-Patent Nr. 4,355,023; und Antikörper-Halbmoleküle: Auditore-Hargreaves, US-Patent Nr. 4,470,925.
Antikörper und Antikörperfragmente, die für Hybridome der Erfindung charakteristisch sind, können auch mit rekombinanten Methoden erzeugt werden, indem man Messenger-RNA extrahiert, eine cDNA-Bibliothek aufbaut und Klone selektiert, die Segmente des Antikörpermoleküls codieren, z. B. Wall et al., Nucleic Acids Research, Vol. 5, S. 3113-3128 (1978); Zakut et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8, S. 3591-3601 (1980); Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 81, S. 3273-3277 (1984); Boss et al., Nucleic Acids Research, Vol. 12, S. 3791-3806 (1984); Amster et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8, S. 2055-2065 (1980); Moore et al., US-Patent 4,642,334; Skerra et al., Science, Vol. 240, S. 1038-1041 (1988); und Huse et al., Science, Vol. 246, S. 1275-1281 (1989). Insbesondere können solche Techniken verwendet werden, um interspezifische monoklonale Antikörper zu erzeugen, wobei der Bindungsbereich einer Spezies mit einem nichtbindenden Bereich des Antikörpers einer anderen Spezies kombiniert wird, um die Immunogenität zu reduzieren, z. B. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 84, S. 3439-3443 (1987).

IV. Reinigung und pharmazeutische Zusammensetzungen

Wenn Polypeptide der vorliegenden Erfindung in löslicher Form exprimiert werden, zum Beispiel als sezerniertes Produkt transformierter Hefe- oder Säugerzellen, können sie nach Standardverfahren der Technik gereinigt werden, die Schritten der Fällung mit Ammoniumsulfat, Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltration, Elektrophorese, Affinitätschromatographie und/oder dergleichen beinhalten; z. B. geben "Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology, 22: 233-577 (1977), und Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982), Anleitungen für solche Reinigungen. Ähnlich können Polypeptide der Erfindung, wenn sie in unlöslicher Form, zum Beispiel als Aggregate, Inklusionskörper oder ähnliches, exprimiert werden, nach Standardverfahren der Technik gereinigt werden, einschließlich des Abtrennens der Inklusionskörper von zerkleinerten Wirtszellen durch Zentrifugation, des Löslichmachens der Inklusionskörper mit chaotropen Mitteln und Reduktionsmitteln, des Verdünnens des in Lösung gebrachten Gemischs und des Senkens der Konzentration des chaotropen Mittels und des Reduktionsmittels, so daß das Polypeptid eine biologisch aktive Konformation annimmt. Letztere Verfahren sind in den folgenden Literaturstellen offenbart, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird: Winkler et al., Biochemistry, 25: 4041-4045 (1986); Winkler et al., Biotechnology, 3: 992-998 (1985); Koths et al., US-Patent 4,569,790; und Europäische Patentanmeldungen 86 306 917.5 und 86 306 353.3.
Der hier verwendete Ausdruck "effektive Menge" bedeutet eine ausreichende Menge, um ein Symptom einer Autoimmunkrankheit zu verbessern. Die ausreichende Menge kann für einen bestimmten Patienten in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Zustand der behandelten Autoimmunkrankheit, dem Allgemeinbefinden des Patienten, dem Darreichungsverfahren, der Stärke von Nebenwirkungen und dergleichen variieren. Im allgemeinen wird CSIF als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die eine wirksame Menge CSIF und einen pharmazeutischen Träger umfaßt. Bei dem pharmazeutischen Träger kann es sich um jede verträgliche nichttoxische Substanz handeln, die zur Verabreichung der Zusammensetzungen der Erfindung an einen Patienten geeignet ist. Im allgemeinen sind für die parenterale Verabreichung solcher Medikamente geeignete Zusammensetzungen wohlbekannt, z. B. Remington's Pharmaceutical Science, 15. Aufl. (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Alternativ dazu können Zusammensetzungen der Erfindung auch durch implantierbare oder injizierbare Wirkstoffabgabesysteme in den Körper eines Patienten eingeführt werden, z. B. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, S. 199-236 (1984); Lewis (Hrsg.), Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); US-Patent 3,773,919; US-Patent 3,270,960; und dergleichen.
Bei parenteraler Verabreichung wird das CSIF in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger in einer injizierbaren Einheitsdarreichungsform (Lösung, Suspension, Emulsion) zubereitet. Beispiele für solche Träger sind normale Kochsalzlösung, Ringers Lösung, Dextroselösung und Hanks's Lösung. Nichtwäßrige Träger, wie fette Öle und Ethyloleat, können ebenfalls verwendet werden. Ein bevorzugter Träger ist 5% Dextrose/Kochsalzlösung. Der Träger kann kleinere Mengen von Additiven enthalten, wie Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität erhöhen, z. B. Puffer und Konservierungsmittel. Das CSIF wird vorzugsweise in gereinigter Form und im wesentlichen frei von Aggregaten und anderen Proteinen in einer Konzentration im Bereich von etwa 5 bis 20 ug/ml zubereitet. Vorzugsweise wird CSIF durch kontinuierliche Infusion verabreicht, so daß eine Menge im Bereich von etwa 50-800 ug pro Tag (d. h. etwa 1-16 ug/kg/Tag) zugeführt wird. Die tägliche Infusionsrate kann auf der Grundlage einer Überwachung von Nebenwirkungen und Blutzellzahlen variiert werden.
CSIF kann aus Kulturüberständen von Säugerzellen gereinigt werden, die mit einem Expressionsvektor, der ein CSIF-Gen trägt, vorübergehend transfiziert oder stabil transformiert wurden. Vorzugsweise wird CSIF aus Kulturüberständen von COS-7- Zellen gereinigt, die mit dem pcD-Expressionsvektor vorübergehend transfiziert wurden. Die Transfektion von COS-7-Zellen mit pcD verläuft wie folgt: Einen Tag vor der Transfektion wurde eine Kultur mit ungefähr 10&sup6; COS7-Affenzellen auf einzelnen 100-mm-Platten in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DME), das 10% fetales Kälberserum und 2 mM. Glutamin enthielt, angesetzt. Zur Durchführung der Transfektion wird das Medium von jeder Platte abgesaugt und durch 4 ml DME ersetzt, das 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mg/ml DEAE-Dextran und 50 ug Plasmid-DNA enthält. Die Platten werden vier Stunden bei 37ºC inkubiert, dann wird das DNA-haltige Medium entfernt, und die Platten werden zweimal mit 5 ml serumfreiem DME gewaschen. DME wird zu den Platten zurückgegeben, die dann weitere 3 h bei 37ºC inkubiert werden. Die Platten werden einmal mit DME gewaschen, und danach wird DME hinzugefügt, das 4% fetales Kälberserum, 2 mM Glutamin, Penicillin (100 E/l) und Streptomycin (100 ug/l) in Standardkonzentrationen enthält. Dann werden die Zellen 72 h bei 37ºC inkubiert, und danach wird das Wachstumsmedium entnommen, um CSIF zu reinigen. Alternativ dazu kann die Transfektion auch durch Elektroporation erfolgen, wie es in den Beispielen beschrieben ist. Plasmid-DNA für die Transfektionen wird erhalten, indem man pcD(SRα), das den CSIF-cDNA-Einschub enthält, in E. coli MC1061, das von Casadaban und Cohen, J. Mol. Biol., Vol. 138, S. 179-207 (1980), beschrieben ist, oder einem ähnlichen Organismus züchtet. Die Plasmid-DNA wird mit Standardtech niken aus den Kulturen isoliert, z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).
Wenn die Antagonisten der Erfindung von Antikörpern abgeleitet sind, werden sie normalerweise parenteral, vorzugsweise intravenös, verabreicht. Da solche Protein- oder Peptidantagonisten immunogen sein können, werden sie vorzugsweise langsam verabreicht, entweder mit einem herkömmlichen IV-Verabreichungsset oder aus einem subkutanen Depot, wie es z. B. von Tomasi et al., US-Patent 4,732,863, gelehrt wird. Wenn sie parenteral verabreicht werden, werden die Antikörper und/oder Fragmente in einer injizierbaren Einheitsdarreichungsform in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger, wie er oben beschrieben ist, zubereitet. Der Antikörper wird vorzugsweise in gereinigter Form und im wesentlichen frei von Aggregaten, anderen Proteinen, Endotoxinen und dergleichen in Konzentrationen von etwa 5 bis 30 mg/ml, vorzugsweise 10 bis 20 mg/ml, zubereitet. Vorzugsweise sind die Endotoxinmengen kleiner als 2,5 IE/ml.
Die Wahl eines Verabreichungsschemas für einen Antagonisten hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Serumumsatzrate des Antagonisten, des mit der behandelten Störung verbundenen Serumspiegels von CSIF, der Immunogenität des Antagonisten, der Zugänglichkeit des Ziel-CSIF (z. B. wenn Nicht-Serum- CSIF blockiert werden soll), der relativen Affinität von CSIF zu seinen Rezeptoren im Vergleich zu der von CSIF zu dem Antagonisten und dergleichen. Vorzugsweise maximiert ein Verabreichungsschema die Menge des an den Patienten abgegebenen Antagonisten, die mit einem annehmbaren Ausmaß an Nebenwirkungen vereinbar ist. Entsprechend hängt die Menge des abgegebenen Antagonisten teilweise von dem besonderen Antagonisten und dem Schweregrad des behandelten Zustands ab. Anleitungen zur Wahl geeigneter Dosen findet man in der Literatur über therapeutische Verwendungen von Antikörpern, z. B. Bach et al., Kapitel 22, in Ferrone et al. (Hrsg.), Handbook of Monoclonal Antibo dies (Noges Publications, Park Ridge, NJ, 1985); und Russell, S. 303-357, sowie Smith et al., S. 365-389, in Haber et al. (Hrsg.), Antibodies in Human Diagnosis and Therapy (Raven Press, New York, 1977). Wann immer der Antagonist monoklonale Antikörper oder Fragmente davon in Fab-Größe umfaßt (einschließlich Bindungszusammensetzungen), liegt die Dosis vorzugsweise im Bereich von etwa 1-20 mg/kg pro Tag. Noch mehr bevorzugt liegt die Dosis im Bereich von etwa 1-10 mg/kg pro Tag.

V. Gentechnisch hergestellte mutante CSIFs

Sobald für ein natives Protein die Nucleinsäuresequenz und/oder Aminosäuresequenz zur Verfügung steht, wird eine Vielzahl von Techniken zugänglich, um praktisch jede Mutation in der nativen Sequenz zu erzeugen, z. B. Shortle, in Science, Vol. 229, S. 1193-1201 (1985); Zoller und Smith, Methods in Enzymology, Vol. 100, S. 468-500 (1983); Mark et al., US-Patent 4,518,584; Wells et al., in Gene, Vol. 34, S. 315-323 (1985); Estell et al., Science, Vol. 233, S. 659-663 (1986); Mullenbach et al., J. Biol. Chem., Vol. 261, S. 719-722 (1986); und Feretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 83, S. 597-603 (1986). Entsprechend wird auf diese Literaturstellen ausdrücklich Bezug genommen.
Muteine des natürlichen Polypeptids können unter vielfältigen Umständen wünschenswert sein. Zum Beispiel könnten unerwünschte Nebenwirkungen durch bestimmte Muteine reduziert werden, insbesondere wenn die Nebenwirkung mit einem anderen Teil des Polypeptids verbunden ist als die gewünschte Wirkung. Bei einigen Expressionssystemen kann das native Polypeptid anfällig für einen Abbau durch Proteasen sein. In solchen Fällen können ausgewählte Substitutionen und/oder Deletionen von Aminosäuren, die die anfälligen Sequenzen verändern, die Ausbeuten erheblich erhöhen, z. B. Britische Patentanmeldung 2173-804-A, wobei Arg in Position 275 des Human-Gewebeplasminogenaktivators durch Gly oder Glu ersetzt ist. Muteine können auch Ausbeuten bei Reinigungsverfahren erhöhen und/oder die Lagerbeständigkeiten von Proteinen erhöhen, indem Aminosäuren eliminiert werden, die anfällig für Oxidation, Acylierung, Alkylierung oder andere chemische Modifikationen sind. Zum Beispiel unterliegen Methionine leicht einer Oxidation unter Bildung von Sulfoxiden, was bei vielen Proteinen mit einem Verlust der biologischen Aktivität verbunden ist, z. B. Brot und Weissbach, Arch. Biochem. Biophys., Vol. 223, S. 271 (1983). Häufig können Methionine mit wenig oder keinem Verlust der biologischen Aktivität durch inertere Aminosäuren ersetzt werden, z. B. Australische Patentanmeldung AU-A-52451/86. Bei bakteriellen Expressionssystemen können Ausbeuten zuweilen erhöht werden, indem man für die Konformation unwesentliche Cysteinreste eliminiert oder ersetzt, z. B. Mark et al., US-Patent 4,518,584.
Vorzugsweise wird Cassettenmutagenese eingesetzt, um mutante Proteine zu erzeugen. Ein synthetisches Gen wird mit einer Sequenz von Restriktionsendonuclease-Spaltstellen aufgebaut, die sich in ungefähr gleichen Abständen entlang des Gens befinden; diese Restriktionsendonuclease-Spaltstellen werden so gewählt, daß sie auch dann einzigartig bleiben, wenn das Gen in einen geeigneten Vektor eingesetzt wird. Die einzigartigen Restriktionsstellen erlauben es, Segmente des Gens bequem herauszuschneiden und durch synthetische Oligonucleotide (d. h. "Cassetten") zu ersetzen, die gewünschte Mutationen codieren. Die Bestimmung der Anzahl und Verteilung der einzigartigen Restriktionsstellen beinhaltet die Berücksichtigung mehrerer Faktoren; dazu gehören (1) in dem bei der Expression einzusetzenden Vektor bereits vorhandene Restriktionsstellen, (2) ob eine artspezifische oder gattungsspezifische Codonverwendung gewünscht wird, (3) die Zahl der verfügbaren verschiedenen, den Vektor nicht spaltenden Restriktionsendonucleasen (und ihre Multiplizitäten innerhalb des synthetischen Gens), sowie (4) die Bequemlichkeit und Zuverlässigkeit des Synthetisierens und/oder Sequenzierens der Segmente zwischen den einzigartigen Restriktionsstellen.
Die obige Technik ist ein bequemer Weg, um in der nativen Proteinsequenz konservative Aminosäuresubstitutionen und dergleichen zu bewirken. "Konservativ" bedeutet hier, (i) daß die Änderungen so konformationsneutral wie möglich sind, d. h. so beschaffen, daß minimale Änderungen in der Tertiärstruktur der mutanten Polypeptide gegenüber der des nativen Proteins entstehen, und (ii) daß die Änderungen so antigenneutral wie möglich sind, d. h. so beschaffen, daß minimale Änderungen in den antigenen Determinanten der mutanten Polypeptide gegenüber denen des nativen Proteins entstehen. Konformationsneutralität ist wünschenswert, um die biologische Aktivität zu erhalten, und Antigenneutralität ist wünschenswert, um das Auslösen von immunogenen Reaktionen bei Patienten oder Tieren, die mit den Verbindungen der Erfindung behandelt werden, auszulösen. Obwohl es schwierig ist, mit absoluter Gewißheit Alternativen auszuwählen, die konformations- und antigenneutral sind, gibt es Regeln, die dem Fachmann helfen können, Änderungen vorzunehmen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit konformations- und antigenneutral sind, z. B. Anfisen (loc. cit.); Berzofsky, Science, Vol. 229, S. 932-940 (1985); und Bowie et al., Science, Vol. 247, S. 1306-1310 (1990). Einige der wichtigeren Regeln sind: (1) Der Ersatz von hydrophoben Resten erzeugt mit geringerer Wahrscheinlichkeit Änderungen der Antigenität, da sie sich wahrscheinlich im Innern des Proteins befinden, z. B. Berzofsky (loc. cit.) und Bowie et al. (loc. cit.); (2) der Ersatz von physiochemisch ähnlichen, d. h. synonymen, Resten erzeugt mit geringerer Wahrscheinlichkeit Konformationsänderungen, da die ersetzende Aminosäure dieselbe strukturelle Rolle spielen kann wie die ersetzte Aminosäure; und (3) eine Änderung der in der Evolution konservierten Sequenzen hat wahrscheinlich schädliche Wirkungen auf die Konformation, da eine Konservierung in der Evolution vermuten läßt, daß die Sequenzen funktionell wichtig sind. Neben solchen Grundregeln für die Auswahl von Muteinse quenzen stehen auch Tests zur Verfügung, um die biologische Aktivität und Konformation der gentechnisch veränderten Moleküle zu bestätigen. Biologische Assays für die Polypeptide der Erfindung sind oben ausführlicher beschrieben. Änderungen der Konformation können durch wenigstens zwei wohlbekannte Assays getestet werden: das Mikrokomplement-Fixierungsverfahren, z. B. Wasserman et al., J. Immunol., Vol. 87, S. 290-295 (1961), oder Levine et al., Methods in Enzymology, Vol. 11, S. 928-936 (1967), dessen Verwendung bei Untersuchungen der Tertiärstrukturen von Proteinen in der Evolution weit verbreitet ist; sowie Affinitäten zu Gruppen von konformationsspezifischen monoklonalen Antikörpern, z. B. Lewis et al., Biochemistry, Vol. 22, S. 948-954 (1983).

VI. Human-CSIF-Peptid-Antikörper

Die Erfindung umfaßt Peptide, die von Human-CSIF abgeleitet sind, und Immunogene, die Konjugate zwischen Trägern und Peptiden der Erfindung umfassen. Der hier verwendete Ausdruck "Immunogen" bezieht sich auf eine Substanz, die in der Lage ist, eine Immunreaktion zu bewirken. Der hier verwendete Ausdruck "Träger" bezieht sich auf jede Substanz, die es ermöglicht, wenn sie chemisch an ein Peptid der Erfindung konjugiert ist, daß ein mit dem resultierenden Konjugat immunisierter Wirtsorganismus Antikörper erzeugt, die für das konjugierte Peptid spezifisch sind. Zu den Trägern gehören Rote Blutkörperchen, Bakteriophagen, Proteine und synthetische Teilchen, wie Agarose-Kügelchen. Vorzugsweise sind die Träger Proteine, wie Serumalbumin, γ-Globulin, Schlitzschnecken-Hämocyanin, Thyroglobulin, Ovalbumin, Fibrinogen oder dergleichen.
Peptide der Erfindung werden durch Standardtechniken synthetisiert, z. B. Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl. (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984). Vorzugsweise wird ein kommerzieller Peptid-Synthesizer verwendet, z. B. das Modell 430A von Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA). Peptide der Erfindung werden durch Festphasensynthese auf einem Träger aus vernetztem Polystyrol aufgebaut, wobei man vom carboxyterminalen Rest ausgeht und Aminosäuren schrittweise anfügt, bis das gesamte Peptid gebildet worden ist. Die folgenden Literaturstellen sind Anleitungen zu der während der Synthese eingesetzten Chemie: Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., Vol. 85, S. 2149 (1963); Kent et al., S. 185, in Peptides 1984, Ragnarsson (Hrsg.; Almqvist und Weksell, Stockholm, 1984); Kent et al., S. 217, in Peptide Chemistry 84, Izumiya (Hrsg.; Protein Research Foundation, B. H. Osaka, 1985); Merrifield, Science, Vol. 232, S. 341-347 (1986); Kent, Ann. Rev. Biochem., Vol. 57, S. 957-989 (1988); sowie in diesen letzten beiden Literaturstellen zitierte Literatur.
Bei der Festphasensynthese ist es am wichtigsten, Nebenprodukte der Synthese, bei denen es sich in erster Linie um Terminations-, Deletions- oder Modifikationspeptide handelt, zu entfernen. Die meisten Nebenreaktionen können durch die Verwendung sauberer, wohlcharakterisierter Harze, sauberer Aminosäurederivate, sauberer Lösungsmittel und durch die Auswahl geeigneter Kupplungs- und Abspaltungsverfahren und Reaktionsbedingungen vermieden oder minimiert werden, z. B. Barany und Merrifield, The Peptides, Cross and Meienhofer (Hrsg.), Vol. 2, S. 1-284 (Academic Press, New York, 1979). Es ist wichtig, zu überwachen, daß Kupplungsreaktionen bis zu Ende verlaufen, so daß Deletionspeptide, denen ein oder mehrere Reste fehlen, vermieden werden. Die quantitative Ninhydrinreaktion ist für diesen Zweck geeignet: Sarin et al., Anal. Biochem., Vol. 117, S. 147 (1981). Man verwendet mit Na-t-butyloxycarbonyl (t-Boc) geschützte Aminosäuren mit geeigneten Schutzgruppen für die Seitenketten, die stabil gegenüber den Bedingungen des Kettenaufbaus, aber labil gegenüber starken Säuren sind. Nach dem Aufbau der geschützten Peptidkette werden die Schutzgruppen entfernt, und die Peptidverankerungsbindung wird durch die Verwendung von niedrigen und dann hohen Konzentrationen von wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart eines Thioester- Fängers gespalten: Tam et al., J. Amer. Chem. Soc., Vol. 105, S. 6442 (1983). Geeignete Schutzgruppen für die Seitenketten, die verwendet werden können, werden durch die Dreibuchstabenabkürzung für die fragliche Aminosäure, gefolgt von der Schutzgruppe in Klammern, angegeben: Asp(OBzl), Glu(OBzl), Ser(Bzl), Thr(Bzl), Lys(Cl-Z), Tyr(Br-Z), Arg(NGTos), Cys(4-MeBzl) und His(ImDNP). (Bzl = Benzyl; Tos = Toluolsulfoxyl; DNP = Dinitrophenyl; Im = Imidazol; Z = Benzyloxycarbonyl.) Die übrigen Aminosäuren haben keine Schutzgruppen für die Seitenketten. Bei jedem Cyclus wird das harzgebundene (t-Boc-Na)-geschützte Peptid 65%iger Trifluoressigsäure (von Eastman Kodak; vor der Verwendung destilliert) in Dichlormethan (DCM; Mallenckrodt) ausgesetzt: zuerst 1 Minute lang, dann 13 Minuten lang, um die Na-Schutzgruppe zu entfernen. Das harzgebundene Peptid wird in DCM gewaschen und zweimal jeweils 1 Minute lang mit 10%igem Diisopropylethylamin (DIEA; Aldrich) in Dimethylformamid (DMF; Applied Biosystems) neutralisiert. Nach der Neutralisation wird mit DMF gewaschen. Die Kupplung erfolgt mit dem symmetrischen Anhydrid der Aminosäure in DMF während 16 Minuten. Das symmetrische Anhydrid wird mit dem Synthesizer hergestellt, indem man 2 mmol Aminosäure in 6 ml DCM löst und 1 mmol Dicyclohexylcarbodiimid (Aldrich) in 2 ml DCM hinzufügt. Nach 5 Minuten wird die aktivierte Aminosäure in ein getrenntes Gefäß übergeführt, und das DCM wird durch Spülen mit einem kontinuierlichen Stickstoffstrom verdampft. Das DCM wird in verschiedenen Stadien während des Spülens durch DMF (insgesamt 6 ml) ersetzt. Nach der ersten Kupplung wird das harzgebundene Peptid with DCM, 10% DIEA in DCM und dann mit DCM gewaschen. Für die erneute Kupplung werden die gleiche Aminosäure und das Aktivierungsmittel Dicyclohexylcarbodiimid nacheinander in das Reaktionsgefäß übergeführt. Nach der Aktivierung in situ und 10 Minuten Kupplung wird genügend DMF hinzugefügt, so daß man ein 50%iges DMF- DCM-Gemisch erhält, und die Kupplung wird noch 15 Minuten lang fortgesetzt. Arginin wird als Ester mit Hydroxybenzotriazol (Aldrich) 60 Minuten in DMF gekuppelt und dann in derselben Weise wie die anderen Aminosäuren erneut gekuppelt. Asparagin und Glutamin werden als Hydroxybenzotriazolester in DMF zweimal gekuppelt, für jede Kupplung 40 Minuten. Bei allen Resten wird das Harz nach der zweiten Kupplung gewaschen, und eine Probe wird automatisch genommen, um verbliebenes ungekuppeltes α-Amin durch eine quantitative Ninhydrinreaktion zu überwachen, Sarin et al. (loc. cit.).
Die allgemeine Technik des Verknüpfens synthetischer Peptide mit einem Träger ist in mehreren Literaturstellen beschrieben, z. B. Walter und Doolittle, "Antibodies Against Synthetic Peptides", in Setlow et al. (Hrsg.), Genetic Engineering, Vol. 5, S. 61-91 (Plenum Press, NY, 1983); Green et al., Cell, Vol. 28, S. 477-487 (1982); Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 78, S. 3403-3407 (1981); Shimizu et al., US-Patent 4,474,754; und Ganfield et al., US-Patent 4,311,639. Außerdem sind die zur Bindung von Haptenen an Träger eingesetzten Techniken im wesentlichen dieselben wie die oben belegten Techniken, z. B. Kapitel 20 in Tijssens Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, New York, 1985). Die vier am häufigsten verwendeten Schemata für die Bindung eines Peptids an einen Träger sind (1) Glutaraldehyd für Aminokupplung, wie es z. B. von Kagan und Glick offenbart ist in Jaffe and Behrman (Hrsg.), Methods of Hormone Radioimmunoassay, S. 328-329 (Academic Press, NY, 1979); und Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 77, S. 5197-5200 (1980); (2) wasserlösliche Carbodiimide für Carboxy- Amino-Kupplung, wie es z. B. von Hoare et al., J. Biol. Chem., Vol. 242, S. 2447-2453 (1967), offenbart ist; (3) Bis(diazobenzidin) (DBD) für Tyrosin-Tyrosin-Seitenkettenkupplung, wie es z. B. von Bassin et al., S. 46-47, in Jaffe and Behrman (Hrsg.; loc. cit.), und Walter et al. (loc. cit.) offenbart ist; und (4) Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) für die Kupplung von Cystein (oder anderer Sulfhydryle) an Aminogruppen, wie es z. B. von Kitagawa et al., J. Biochem. (Tokyo), Vol. 79, S. 233-239 (1976), und Lerner et al. (loc. cit.) offenbart ist. Eine allgemeine Regel für die Auswahl eines geeigneten Verfahrens für die Kupplung eines gegebenen Peptids an einen Proteinträger kann wie folgt angegeben werden: Die an der Bindung beteiligte Gruppe sollte nur einmal in der Sequenz vorkommen, vorzugsweise am richtigen Ende des Segments. Zum Beispiel sollte BDB nicht verwendet werden, wenn ein Tyrosinrest im Hauptteil einer wegen ihres potentiell antigenen Charakters gewählten Sequenz vorkommt. In ähnlicher Weise schließen zentral gelegene Lysinreste das Glutaraldehydverfahren aus, und das Vorkommen von Asparagin- und Glutaminsäure schließt häufig den Carbodiimid-Ansatz aus. Andererseits können sich geeignete Reste als Befestigungsstellen an jedem der beiden Enden eines gewählten Sequenzabschnitts befinden, ob sie nun in der "nativen" Proteinsequenz vorkommen oder nicht. Innere Segmente werden sich im Unterschied zum Amino- und zum Carboxyterminus am "nicht gebundenen Ende" erheblich von derselben Sequenz unterscheiden, wie man sie im nativen Protein findet, wo das Polypeptidgerüst durchgehend ist. Das Problem kann bis zu einem gewissen Grade beseitigt werden, indem man die α-Aminogruppe acetyliert und dann das Peptid über seinen Carboxyterminus bindet. Die Effizienz der Kupplung an das Trägerprotein wird zweckmäßigerweise unter Verwendung eines radioaktiv markierten Peptids gemessen, das hergestellt wird, indem man entweder für einen Schritt der Synthese eine radioaktive Aminosäure verwendet oder indem man das fertige Peptid durch Iodierung eines Tyrosinrestes markiert. Die Anwesenheit von Tyrosin im Peptid ermöglicht auch die Durchführung eines empfindlichen Radioimmunoassays, falls dies wünschenswert ist. Daher kann Tyrosin als terminaler Rest eingeführt werden, wenn es kein Teil der durch das native Polypeptid definierten Peptidsequenz ist.
Bevorzugte Träger sind Proteine, und zu den bevorzugten Proteinträgern gehören Rinderserumalbumin, Myoglobulin, Ovalbumin (OVA), Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH) und dergleichen. Peptide können über Cysteine durch MBS an KLH gebunden werden, wie es von Liu et al., Biochemistry, Vol. 18, S. 690-697 (1979), offenbart ist. Die Peptide werden in phosphatgepufferter Koch salzlösung (pH 7,5), 0,1 M Natriumboratpuffer (pH 9,0) oder 1,0 M Natriumacetatpuffer (pH 4,0) gelöst. Der pH-Wert für die Auflösung des Peptids wird so gewählt, daß die Löslichkeit des Peptids optimiert wird. Der Gehalt an freiem Cystein wird für lösliche Peptide nach Ellmans Verfahren bestimmt, Ellman, Arch. Biochem. Biophys., Vol. 82, S. 7077 (1959). Für jedes Peptid werden 4 mg KLH in 0,25 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) mit 0,7 mg MBS (in Dimethylformamid gelöst) umgesetzt und 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das MBS wird tropfenweise hinzugefügt, um zu gewährleisten, daß die lokale Konzentration an Formamid nicht zu groß ist, da KLH in > 30%igem Formamid unlöslich ist. Das Reaktionsprodukt KLH-MBS wird dann zum Entfernen von freiem MBS durch Sephadex G-25 geleitet, das mit 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) äquilibriert wurde. Die KLH-Ausbeute aus den Peakfraktionen des Säuleneluats (anhand von OD280 überwacht) wird auf ungefähr 80% geschätzt. Dann wird KLH-MBS mit 5 mg Peptid umgesetzt, das in 1 ml des gewählten Puffers gelöst ist. Der pH-Wert wird auf 7-7,5 eingestellt, und das Reaktionsgemisch wird 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Kupplungseffizienz wird mit radioaktivem Peptid durch Dialyse einer Probe des Konjugats gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung überwacht und lag in einem Bereich von 8% bis 60%. Sobald das Peptid-Träger-Konjugat verfügbar ist, werden polyklonale oder monoklonale Antikörper durch Standardtechniken erzeugt, wie sie z. B. offenbart sind von Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, New York, 1984); Hurrell (Hrsg.), Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); Schreier et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); US- Patent 4,562,003; oder dergleichen.
Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper können durch ELISA durchmustert werden. Wie bei anderen Festphasenimmunoassays beruht der Test auf der Neigung von Makromolekülen, unspezifisch an Kunststoff zu adsorbieren. Die Irreversibilität dieser Reaktion ohne Verlust der immunologischen Aktivität erlaubt die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen mit einer einfachen Trennung solcher Komplexe von ungebundenem Material. Um Antipeptidserum zu titrieren, wird Peptid, das an einen anderen Träger als den bei der Immunisierung verwendeten konjugiert ist, an die Näpfe einer 96-Napf-Mikrotiterplatte adsorbiert. Dann läßt man das adsorbierte Antigen in den Näpfen mit Verdünnungen von Anti-Peptid-Serum reagieren. Ungebundener Antikörper wird ausgewaschen, und die übrigen Antigen-Antikörper-Komplexe läßt man mit Antikörper reagieren, der spezifisch für das IgG des immunisierten Tieres ist. Dieser zweite Antikörper ist an ein Enzym, wie Alkalische Phosphatase, konjugiert. Ein sichtbares farbiges Reaktionsprodukt, das entsteht, wenn das Enzymsubstrat hinzugefügt wird, zeigt an, welche Näpfe gebundene Anti-Peptid-Antikörper aufweisen. Die Verwendung von Spektrophotometer-Ablesungen erlaubt eine bessere Quantifizierung der Menge des gebundenen peptidspezifischen Antikörpers. Antiseren mit hohem Titer ergeben bei Verdünnungen zwischen 103 und 105 eine lineare Titrationskurve.

Beispiele

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Die ausgewählten Vektoren und Wirte sowie die Konzentration der Reagentien, die Temperaturen und die Werte anderer Variablen sollen nur Beispiele für die Anwendung der vorliegenden Erfindung sein und nicht als Einschränkungen betrachtet werden.

Beispiel I. Biologische Wirkungen von Maus-CSIF

Maus-CSIF-haltige Überstände von den mehreren T-Zell-Klonen wurden erhalten, indem man die T-Zell-Klone (5 · 10&sup6; Zellen/ml) 24 Stunden in serumfreiem Medium (RPMI 1640 ohne Phenolrot, das 0,05 mM 2-Mercaptoethanol und 20 mM HEPES enthält) und Concanavalin A (5 ug/ml) inkubierte. Die Klone beinhalteten die Zelllinien D9, die im US-Patent 4,613,459 beschrieben ist, D10 (unten beschrieben), MB2-1, die in Mosmann et al., J. Immunol., Vol. 136, S. 2348-2357 (1986), beschrieben ist, CDC25 und CDC35, die in Tony et al., J. Exp. Med., Vol. 161, S. 223 (1985), beschrieben sind, sowie M411-2 und M411-6. Die T-Zell- Überstände wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die IFN-γ- Synthese bei der Zellinie HDK-1 zu unterdrücken, die in Cherwinski et al., J. Exp. Med., Vol. 166, S. 1229-1244 (1987), beschrieben ist. Eine Verdünnungsreihe mit jeweils zweifacher Verdünnung von Proben aus jedem T-Zell-Klon wurde in 96-Napf- Flachboden-Mikrotiterplatten in einem Volumen von 0,05 ml hergestellt. HDK-1-Zellen (5 · 10&sup9; Zellen pro Napf) wurden zusammen mit bestrahlten (2500 R) syngenen APCs (Milzzellen mit 5 · 10&sup5; Zellen pro Napf) und Antigen (Schlitzschnecken-Hämocyanin in einer Menge von 150 ug/ml) in einem Volumen von 0,15 ml hinzugefügt. 11B11-Anti-IL-4-Antikörper (10 ug/ml), der in Ohara et al., Nature, Vol. 315, S. 333-336 (1985), beschrieben ist, wurde zu Proben gegeben, von denen angenommen wurde, daß sie IL-4 enthalten könnten. Nach 24 h Inkubation bei 37ºC wurden. Überstände entnommen und weniger als eine Woche bei 4ºC oder länger bei -80ºC aufbewahrt. Die Mengen an IFN-γ wurden durch Zwei-Stellen-Sandwich-ELISA unter Verwendung eines monoklonalen Ratten-Anti-Maus-IFN-γ-Antikörpers, XMG1.2, und von affinitätsgereinigtem Kaninchen-Anti-Maus-IFN-γ-Antikörper getestet. Fig. 1 zeigt das Ausmaß der Hemmung der IFN-γ-Synthese als Prozentsatz der Kontrollmengen.
Von D10-Zellen erzeugtes CSIF wurde partiell gereinigt und auf zwei verschiedene T-Zell-Klone aufgetragen, um den Grad der Cytokin-Synthesehemmung als Funktion der CSIF-Konzentration zu untersuchen. Das partiell gereinigte CSIF wurde wie folgt hergestellt: 1-2,5-Liter-Chargen mit Überstand von Concanavalin-A-induziertem D10 wurden unter Verwendung von Amicon-YM-5- Membranen (Amicon Corp., Danvers, MA) ungefähr 10fach konzentriert, durch eine Säule mit 5 ml Mannose-konjugierter Agarose (E-Y Laboratories, San Mateo, CA) geleitet, dann noch 3- bis 5fach weiter konzentriert, so daß man eine Gesamtkonzentrierung von 30-50fach erhielt. Das Material wurde dann durch zwei Schritte HPLC (high performance liquid chromatography) weiter gereinigt: zuerst über eine Säule auf Hydroxyapatit-Basis (Bio- Gel HPHT, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) und dann über eine Gelfiltrationssäule (TSK-G 3000 SW, 60 cm Länge, LKB Instruments, Gaithersburg, MD). Eine solche Charge mit partiell gereinigtem CSIF wurde in Aliquoten bei -80ºC aufbewahrt und als Standard der CSIF-Aktivität verwendet. Als es am Anfang getestet wurde, bewirkte dieses Präparat eine Hemmung der IFN-γ- Produktion von ungefähr 50% bei einer Verdünnung von 1/200 in einem Assayvolumen von 0,2 ml, und so wurde eine Standardeinheit definiert, indem man dem Standard-CSIF-Präparat einen Wert von 1000 E/ml zuordnete. Bei jedem Assay unten wurde die CSIF- Aktivität in unbekannten Proben quantifiziert, indem man das Ausmaß der Hemmung der IFN-γ-Synthese durch die unbekannte Probe mit dem des Standards verglich. Die T-Zell-Klone, die auf Hemmung der Cytokinsynthese getestet wurden, waren HDK-1 (oben beschrieben) und MD13-10, beschrieben in Cell. Immunol., Vol. 97, S. 357 (1986). Zum Bestimmen von IL-3- und GM-CSF-Mengen wurde das partiell gereinigte CSIF weiterbehandelt, indem man es über Anti-IL-3- und Anti-GM-CSF-Affinitätssäulen leitete. Antikörper in 0,1 M NaCl, 0,1 M HEPES und 0,08 M CaCl&sub2; wurden bei 4ºC 4 Stunden lang unter vorsichtigem Mischen an Affi-Gel 10 (Bio-Rad) gekuppelt. Jede 1-2-ml-Säule enthielt ungefähr 10 bis 20 mg gekuppelten Antikörper.
Wie in der Tabelle unten gezeigt ist, wurde die IFN-γ-Produktion in beiden Klonen gehemmt. Die Synthese der anderen Cytokine, IL-2, Lymphotoxin, IL-3 und GM-CSF, wurde in MD13-10-Zellen in geringerem Maße oder überhaupt nicht gehemmt. Tabelle

Beispiel II. Aufbau einer cDNA-Bibliothek aus D10-Zellen und Isolierung des Klons pcD(SRα)-F115

Aus mRNA, die aus D10-Zellen, wie sie in Kaye et al., J. Exp. Med., Vol. 158, S. 836 (1983), beschrieben sind, extrahiert wurde, wurde eine cDNA-Bibliothek im pcD(SRα)-Vektor im Einklang mit dem Verfahren von Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol. 2: 161-170 (1982), und 3: 280-289 (1983), das auch im US-Patent 4,695,542 offenbart ist, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird, aufgebaut. Die pcD(SRα)-Vektoren, die cDNA-Einschübe trugen, wurden in E. coli amplifiziert. Plasmid-DNA wurde aus Pools dieser zufällig herausgegriffenen Klone extrahiert und verwendet, um COS-7-Affenzellen zu transfizieren, wie es unten beschrieben ist. Dann wurden die Überstände der COS-7-Kulturen aus CSIF-Aktivität getestet. COS-Zellen wurden wie folgt transfiziert: Einen Tag vor der Transfektion wurde eine Kultur mit ungefähr 1,5 · 10&sup6; COS7-Affenzellen auf einzelnen 100-mm-Platten in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DME), das 5% fetales Kälberserum (FCS) und 2 mM Glutamin enthielt, angesetzt. Zur Durchführung der Transfektion wurden COS-7-Zellen durch Inkubation mit Trypsin aus den Schalen entfernt, zweimal in serumfreiem DME gewaschen und in einer Menge von 10&sup7; Zellen/ml in serumfreiem DME suspendiert. Ein 0,75-ml-Aliquot wurde mit 20 ug DNA gemischt und in eine sterile 0,4-cm-Elektroporationsküvette übertragen. Nach 10 Minuten wurden die Zellen in einer BioRad-Gene-Pulser-Einheit Pulsen von 200 Volt, 960 uF, ausgesetzt. Nach weiteren 10 Minuten wurden die Zellen aus der Küvette entnommen und zu 20 ml DME gegeben, das 5% FCS, 2 mM Glutamin, Penicillin, Streptomycin und Gentamycin enthielt. Das Gemisch wurde in Aliquoten auf vier 100-mm- Gewebekulturschalen aufgeteilt. Nach 12-24 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, wurde das Medium durch ein ähnliches Medium ersetzt, das nur 1% FCS enthielt, und die Inkubation wurde weitere 72 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, fortgesetzt, und danach wurde das Medium entnommen und auf CSIF-Aktivität getestet. Anschließend wurde die Sequenz des größten offenen Leserasters des cDNA-Einschubs von pcD(SRα)-F115 wie folgt bestimmt:
und die durch den Heijne-Algorithmus bestimmte Aminosäuresequenz des reifen Maus-CSIF-Proteins ist wie folgt:

Beispiel III. Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken auf Human- CSIF unter Verwendung von Sonden, die von cpD(SRα)-F115 abgeleitet sind; Isolierung von pH5C und pH15C

Eine cDNA-Bibliothek, die in pcD(SRα) aus mRNA aufgebaut wurde, die aus einem Human-T-Zell-Klon extrahiert wurde, wurde mit einer Sammlung von 70-mer-Oligonucleotiden durchmustert, deren Sequenzen zum codierenden und zum nichtcodierenden Strang des Fragments des Maus-CSIF-Gens, das reifes CSIF codiert, komplementär waren. Standard-Hybridisierungsvorschriften wurden verwendet; z. B. wurden auf 150-mm-Petri-Schalen gezüchtete Bakterienkolonien auf GeneScreen-Membranen übertragen, mit den radioaktiv markierten Oligonucleotidsonden behandelt, gewaschen und dann auf Röntgenfilm umkopiert. Die Sonden wurden unter Bedingungen geringer Stringenz in bezug auf die Länge der Sonden hybridisiert: Die Vorhybridisierung bestand aus einer Inkubation der Ziel-Nucleinsäuren in 5x SET (20x SET ist 3 M NaCl + 0,4 M Tris-HCl (pH 7,8) + 20 mM EDTA) bei 60ºC, und darauf folgte die Hybridisierung unter denselben Bedingungen sowie Waschen in 5x SET bei 50ºC. Zwei Klone, die die Plasmide pH5C und pH15C trugen, wurden identifiziert. Beide Plasmide exprimierten in COS-7-Zellen Proteine, die in der Lage waren, die IFN-γ-Synthese in PHA-stimulierten Human-PBLs zu hemmen. Der cDNA-Einschub von pH15C ist in Fig. 4 gezeigt, und die Nucleotidsequenz seines größten offenen Leserasters ist unten angegeben:

Beispiel IV. Für CSIF spezifische monoklonale Antikörper

Eine männliche Lewis-Ratte wird mit halbgereinigten Präparaten von Human-CSIF, das in COS-7-Zellen exprimiert wurde, immunisiert. Die Ratte wird zuerst mit ungefähr 50 ug Human-CSIF in Freunds vollständigem Adjuvans immunisiert und erhält dann zwei Auffrischimpfungen mit derselben Menge Material in Freunds unvollständigem Adjuvans. Blutproben werden entnommen. Das Tier erhält eine letzte Auffrischimpfung von 25 ug in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, und vier Tage später wird die Milz für eine Fusion entnommen.
Ungefähr 3 · 10&sup8; Ratten-Splenocyten werden mit der gleichen Zahl P3X63-AG8.653-Maus-Myelomzellen (erhältlich von der ATCC unter der Zugriffsnummer CRL 1580) fusioniert. 3840 Näpfe von Mikrotiterplatten werden mit 5,7 · 10&sup4; elterlichen Myelomzellen pro Napf angesetzt. Standardvorschriften für die Fusion und die anschließende Kultur der Hybride werden befolgt, wie es z. B. von Chretien et al., J. Immunol. Meth., Vol. 117, S. 67-81 (1989), beschrieben ist. 12 Tage nach der Fusion werden Überstände entnommen und auf PVC-Platten, die mit in COS-7-Zellen erzeugtem Human-CSIF beschichtet waren, durch indirektes ELISA durchmustert. Auf diese Weise wurde das Hybridom JES3-19F1 identifiziert und bei der American Type Culture Collection hinterlegt.
Hybridome, die blockierende Antikörper erzeugen, werden aus den ursprünglich durchmusterten Hybridomen anhand ihrer Fähigkeit ausgewählt, Antikörper zu erzeugen, die der CSIF-induzierten Hemmung der IFN-γ-Synthese in PHA-stimulierten Human-PBLs entgegenwirken.

Beispiel V. Expression von Human-CSIF in einem bakteriellen Wirt

Ein synthetisches Human-CSIF-Gen wird aus mehreren chemisch synthetisierten doppelsträngigen DNA-Fragmenten unter Bildung eines als TAC-RBS-hCSIF bezeichneten Expressionsvektors zusammengesetzt. Das Klonieren und die Expression werden in einem bakteriellen Standardsystem durchgeführt, zum Beispiel im E.- coli-K-12-Stamm JM101, JM103 oder dergleichen, wie es von Viera und Messing in Gene, Vol. 19, S. 259-268 (1982), beschrieben ist. Der Abbau mit Restriktions-Endonucleasen und Reaktionen mit Ligasen werden nach Standardvorschriften durchgeführt, z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).
Das alkalische Verfahren (Maniatis et al., loc. cit.) wird für Plasmidpräparationen in kleinem Maßstab verwendet. Für Präparationen in großem Maßstab wird eine Abwandlung des alkalischen Verfahrens verwendet, bei der ein gleiches Volumen Isopropanol verwendet wird, um Nucleinsäuren aus dem geklärten Lysat auszufällen. Eine Fällung mit kaltem 2,5 M Ammoniumacetat wird verwendet, um RNA vor der Gleichgewichts-Dichtezentrifugation mit Cäsiumchlorid und Nachweis mit Ethidiumbromid zu entfernen.
Für Filterhybridisierungen werden Whatman-540-Filterscheiben verwendet, um Kolonien auszuheben, die dann durch Behandlung (jeweils 2 Minuten) mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl und dann mit 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl und dann durch Erhitzen auf 80ºC (30 min) lysiert und fixiert werden. Hybridisierungen erfolgen 6 h lang in 6x SSPE, 20% Formamid, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mg/ml E.-coli-tRNA, 100 mg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) bei 42ºC unter Verwendung ³²P-markierter (mit Kinase behandelter) synthetischer DNAs. (20x SSPE wird hergestellt, indem man 174 g NaCl, 7,4 g EDTA und 27,6 g NaH&sub2;POq·9H&sub2;O in 800 ml Wasser löst; der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,4 eingestellt, das Volumen wird auf 1 Liter aufgefüllt, und die Lösung wird im Autoklaven sterilisiert.) Die Filter werden zweimal (15 min. Raumtemperatur) mit 1x SSPE, 0,1% SDS gewaschen. Nach Autoradiographie (Fuji RX Film) werden positive Kolonien lokalisiert, indem man die wiedergezüchteten Kolonien mit den blaugefärbten Kolonien auf den Filtern in Übereinstimmung bringt. Die DNA wird nach dem Didesoxy-Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 74, S. 5463 (1977), sequenziert. Matrizen für die Didesoxy-Reaktionen sind entweder einzelsträngige DNAs relevanter Bereiche, die in M13mp-Vektoren rekloniert wurden, z. B. Messing et al., Nucleic Acids Res., Vol. 9, S. 309 (1981), oder doppelsträngige DNA, die nach dem alkalischen Miniverfahren hergestellt und mit 0,2 M NaOH denaturiert (5 min, Raumtemperatur) und durch Zugabe von 2 Volumina Ethanol aus 0,2 M NaOH, 1,43 M Ammoniumacetat ausgefällt wurde. DNA wird durch Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung von 380A- Synthesizern von Applied Biosystems synthetisiert. Synthese, Entfernung der Schutzgruppen, Spaltung und Reinigung (PAGE mit 7 M Harnstoff, Elution, DEAE-Cellulose-Chromatographie) erfolgen wie im Handbuch des 380A-Synthesizers beschrieben.
Komplementäre Stränge synthetischer DNAs, die kloniert werden sollen (jeweils 400 ng), werden in einem Reaktionsvolumen von 50 ml gemischt und mit Polynucleotid-Kinase phosphoryliert. Diese DNA wird in einem Volumen von 50 ml bei Raumtemperatur 4 bis 12 Stunden lang mit 1 mg Vektor-DNA, die mit geeigneten Restriktionsenzymen abgebaut wurde, ligasiert. Die Bedingungen für die Phosphorylierung, Abbau mit Restriktionsenzymen, Poly merasereaktionen und Ligasierung sind beschrieben (Maniatis et al., loc. cit.). Die Kolonien werden auf lacZ+ durchmustert (falls gewünscht), indem man sie auf L-Agarplatten ausbreitet, die mit Ampicillin, Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid (IPTG) (0,4 mM) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (x- gal) (40 mg/ml) versetzt wurden.
Der TAC-RBS-Vektor wird aufgebaut, indem man mit DNA-Polymerase die einzelne Bam-HI-Stelle des tacP-tragenden Plasmids pDR540 (Pharmacia) auffüllt. Dieser wird dann mit uriphosphorylierten synthetischen Oligonucleotiden (Pharmacia) ligasiert, die ein doppelsträngiges Fragment bilden, das für einen Consensus- Ribosombindungsbereich codiert (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC). Nach der Ligasierung wird das Gemisch phosphoryliert und wieder mit dem SstI-Linker ATGAGCTCAT ligasiert. Dieser Komplex wird dann mit SstI und EcoRI gespalten, und das Fragment mit 173 bp wird durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) isoliert und in EcoRI-SstI-gespaltenes pUC19 (Pharmacia) einkloniert (wie unten beschrieben). Die Sequenz der RBS-ATG-Polylinker-Bereiche der endgültigen Konstruktion (TAC-RBS genannt) ist in Fig. 3 gezeigt.
Das synthetische CSIF-Gen wird in acht Schritten in ein pUC19- Plasmid eingebaut. Nach jedem Schritt können Einschübe, die frei von Deletionen und/oder Insertionen sind, nach dem Klonieren nachgewiesen werden, indem man das lacZ(α)-Gen von pUC19 im selben Raster wie das in Schritt 1 eingefügte Startcodon ATG hält. Klone, die Deletions- und/oder Insertionsveränderungen enthalten, können ausgefiltert werden, indem man auf L-Ampicillin-Platten, die x-gal und IPTG enthalten, auf blaue Kolonien hin durchmustert. Alternativ dazu lassen sich Einschubsequenzen bei jedem Schritt leicht bestätigen, indem man einen Universal-Sequenzierungs-Primer für Plasmid-DUA-Präparationen in kleinem Maßstab verwendet, wie er z. B. von Boehringer Mannheim erhältlich ist.
In Schritt 1 wird der TAC-RBS-Vektor mit SstI abgebaut, mit T4- DNA-Polymerase (deren 3'-Exonuclease-Aktivität die auf der 3'- Seite hervorstehenden Stränge der SstI-Schnittstellen unter Bildung von Fragmenten mit glatten Enden abbaut) behandelt und nach der Desaktivierung der T4-DNA-Polymerase mit EcoRI behandelt, wobei sich ein 173-bp-Fragment bildet, das den TAC-RBS- Bereich enthält und ein glattes Ende am Startcodon ATG sowie die EcoRI-Schnittstelle am anderen Ende aufweist. Schließlich wird das 173-bp-TAC-RBS-Fragment isoliert.
In Schritt 2 wird das isolierte TAC-RBS-Fragment aus Schritt 1 gemischt mit einem EcoRI/KpnI-abgebauten Plasmid pUC19 und dem synthetischen Fragment 1A/B, das, wie unten gezeigt, an seinem Upstream-Terminus ein glattes Ende und an seinem Downstream- Terminus ein versetztes Ende, das einer KpnI-Schnittstelle entspricht, aufweist. Dieses KpnI-Ende liegt stromabwärts in der Nähe einer BstEII-Stelle. Die Fragmente werden unter Bildung des pUC19 von Schritt 2 ligasiert.
In Schritt 3 werden die synthetischen Fragmente 2A/B und 3A/B (unten gezeigt) mit dem BstEII/SmaI-abgebauten pUC19 von Schritt 2 (nach Amplifikation und Reinigung) gemischt und unter Bildung von pUC19 von Schritt 3 ligasiert. Man beachte, daß der Downstream-Terminus des Fragments 3A/B zusätzliche Basen enthält, die das glatte Ende an der SmaI-Stelle bilden. Diese zusätzlichen Basen werden in Schritt 4 abgespalten. Außerdem weisen die Fragmente 2A/B und 3A/B komplementäre einzelsträngige Enden mit 9 Resten auf, die sich beim Zusammenmischen aneinanderlegen, so daß zur Ligasierung an das pUC19 stromaufwärts die BstEII-Schnittstelle von 2A/B und stromabwärts das glatte Ende von 3A/B zurückbleiben.
In Schritt 4 wird das mit AflII/XbaI abgebaute pUC19 von Schritt 3 (nach Amplifikation und Reinigung) erneut gereinigt, mit dem synthetischen Fragment 4A/B (unten gezeigt) gemischt und unter Bildung von pUC19 von Schritt 4 ligasiert.
In Schritt S wird das mit XbaI/SalI abgebaute pUC19 von Schritt 4 (nach Amplifikation und Reinigung) mit dem synthetischen Fragment 5A/B (unten gezeigt) gemischt und unter Bildung von pUC19 von Schritt S ligasiert. Man beachte, daß das versetzte SalI-Ende von Fragment 5A/B durch Abbau mit HpaI in Schritt 6 eliminiert wird.
In Schritt 6 wird das mit HpaI/PstI abgebaute pUC19 von Schritt 5 (nach Amplifikation und Reinigung) mit dem synthetischen Fragment 6A/B (unten gezeigt) gemischt und unter Bildung von pUC19 von Schritt 6 ligasiert.
In Schritt 7 wird das mit ClaI/SphI abgebaute pUC19 von Schritt 6 (nach Amplifikation und Reinigung) mit dem synthetischen Fragment 7A/B (unten gezeigt) gemischt und unter Bildung von pUC19 von Schritt 7 ligasiert.
In Schritt 8 wird das mit MluI/HindIII abgebaute pUC19 von Schritt 7 (nach Amplifikation und Reinigung) unter Bildung der endgültigen Konstruktion mit den synthetischen Fragmenten 8A/B und 9A/B gemischt. Die endgültige Konstruktion wird durch Standardtechniken in den E.-coli-K-12-Stamm JM101 eingeschleust, der z. B. von der ATCC unter der Zugriffsnummer 33876 erhältlich ist. Nach der Kultivierung wird Protein aus den JM101-Zellen extrahiert, und Verdünnungen der Extrakte werden auf biologische Aktivität getestet. Fragment 1A/B Fragment 2A/B Fragment 3A/B Fragment 4A/B Fragment 5A/B Fragment 6A/B Fragment 7A/B Fragment 8A/B Fragment 9A/B
(Kleinbuchstaben zeigen an, daß sich eine Base von derjenigen der nativen Sequenz an derselben Stelle unterscheidet.)

Beispiel VI. Für das CENKSKAVE-Peptid spezifische Antikörper

50 mg Ovalbumin (OVA) und 50 mg Myoglobulin (MYO) (z. B. von Sigma erhältlich) werden jeweils in 10 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonat gelöst und in einem 15-ml-Falcon-Röhrchen (Falcon Plastics, Oxnard, CA) oder dergleichen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 1 ml 0,12 M Iodacetamidlösung (88 mg Iodacetamid, gelöst in 4 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonat) umgesetzt. Jedes Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 4ºC gegen 41 0,1 M Natriumhydrogencarbonat dialysiert. Getrennt davon werden 10 mg CENKSKAVE in einem 4-ml-Röhrchen in 2 ml 0,1 M DTT-Lösung (Dithiothreit; enthält 50 mM Tris und 2,5 mM EDTA bei pH 8) gelöst und über Nacht bei 37ºC inkubiert; dann wird die Lösung auf eine GF05-Gelfiltrationssäule (1,5 · 26,5 cm) (LKB, Bromma, Schweden) aufgetragen und mit einem Peptid-Elutionspuffer eluiert, der aus 0,015 M Essigsäure und 0,005 M β-Mercapto ethanol besteht. Drei Fraktionen von jeweils etwa 3,5 ml, die das reduzierte Peptid enthalten, werden anhand der optischen Dichte bei 206 nm identifiziert, aufgefangen, vereinigt, in Trockeneis eingefroren und über Nacht lyophilisiert. Inzwischen werden OVA und MYO von der Dialyse zurückgewonnen und durch Filtration durch 0,45-um-Filter geklärt. OVA und MYO werden aktiviert, indem man jedes mit 380 ul N-Hydroxysuccinimidester von Iodessigsäure (NHIA) (offenbart von Rector et al. in J. Immunol. Meth., Vol. 24, S. 321 (1978)) mischt, der in Tetrahydrofuran (THF) gelöst ist (5 mg/ml), 30 Minuten bei Raumtemperatur rührt und über Nacht gegen 41 PBS (1,8 g NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O, 7,2 g Na&sub2;HPO&sub4;·H&sub2;O und 34 g NaCl in 41 H&sub2;O) dialysiert. Getrennt davon wird das lyophilisierte Peptid in 5 ml Borat-Reduktionspuffer (2 g Na&sub2;B&sub4;O&sub7;·&sub1;&sub0;H&sub2;O, 17,4 g NaCl und 336 mg EDTANa&sub2; in 11 H&sub2;O, wobei der pH-Wert mit konzentrierter HCl auf 8,5 eingestellt ist, 15 min unter Stickstoff desoxygeniert, danach werden 178 mg Ascorbat hinzugefügt) resuspendiert. Die dialysierten iodacetylierten OVA und MYO werden zurückgewonnen, getrennt mit gleichen Volumina (vorzugsweise 2 ml) Borat-Reduktionspuffer, der das Peptid enthält, gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierenden Konjugate werden durch SDS-PAGE (12,5% Gel) analysiert. Die konjugathaltige Lösung wird mit PBS auf 1 mg/ml verdünnt, sterilfiltriert und für die Immunisierungen in Aliquote mit zweckmäßigem Volumen (z. B. 500 ul) aufgeteilt und/oder bei 4ºC aufbewahrt. Polyklonale Antiseren gegen das MYO-Konjugat werden sowohl in Ratten als auch in Kaninchen (New Zealand White) erzeugt. Das Immunisierungsschema für Kaninchen ist wie folgt: Am Anfang (0. Woche) wird eine 10-ml-Serumprobe als Kontrolle entnommen. Eine Woche später (1. Woche) werden 0,5 ml Peptid-Träger-Konjugat mit 0,5 ml Freunds vollständigem Adjuvans gemischt und i. p. injiziert. Drei Wochen später (4. Woche) wird eine Auffrischimpfung verabreicht, die aus 0,5 ml Peptid-Träger-Konjugat besteht, das mit 0,5 ml Freunds unvollständigem Adjuvans gemischt ist. In der folgenden Woche (5. Woche) wird eine zusätzliche Auffrischimpfung verabreicht, die wiederum aus 0,5 ml Peptid-Träger-Konjugat besteht, das mit 0,5 ml Freunds unvollständigem Adjuvans gemischt ist, und noch eine weitere identische Auffrischimpfung folgt in der Woche danach (6. Woche). In der 7. Woche werden dem Tier 20 ml Serum entnommen. Nach dem Abtrennen der Zellfraktion wird das Serum durch ELISA auf positiven Anti-CENKSKAVE-Titer getestet. Die Immunisierung von Ratten verlief ähnlich, außer daß die Anfangsinjektion aus 0,15 ml PBS und 0,1 ml Peptid-Träger-Konjugat bestand, die mit 0,75 ml Freunds vollständigem Adjuvans gemischt waren, und daß die Auffrischimpfungen aus 0,15 ml PBS und 0,1 ml Peptid-Träger-Konjugat bestanden, die mit 0,75 ml Freunds unvollständigem Adjuvans gemischt waren, und daß der Ratte nur 2-3 ml Serum entnommen werden. Wiederum wird eine positive Anti-CENKSKAVE- Reaktion durch ELISA nachgewiesen.
Die Beschreibungen der obigen Ausführungsformen der Erfindung wurden zum Zwecke der Erläuterung und Beschreibung angegeben. Sie sollen nicht erschöpfend sein oder die Erfindung auf die genauen offenbarten Formen einschränken, und offensichtlich sind im Lichte der obigen Lehre viele Abwandlungen und Variationen möglich. Die Ausführungsformen wurden ausgewählt und beschrieben, um die Prinzipien der Erfindung optimal zu erklären und dadurch andere Fachleute in die Lage zu versetzen, die Erfindung in verschiedenen Ausführungsformen und mit verschiedenen Abwandlungen, die für die besondere betrachtete Verwendung geeignet sind, optimal zu nutzen. Der Umfang der Erfindung soll durch die beigefügten Ansprüche definiert werden.
Die Anmelder haben getrennte Kulturen von E, coli MC1061, die pcD(SRα)-F115, pH5C und pH15C trugen, bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), unter den Zugriffsnummern 68027, 68191 bzw. 68192 hinterlegt. Diese Hinterlegungen erfolgten unter den Bedingungen der Zustimmung der ATCC zum Culture Deposit for Patent Purposes, das gewährleistet, daß die Hinterlegung gemäß 35 USC 122 und 37 CFR 1.14 dem US Commissioner of Patents and Trademarks zugänglich gemacht wird und bei Erteilung eines US-Patents der Öffentlichkeit zugänglich gemacht werden wird, was erfordert, daß die Hinterlegungen aufrechterhalten werden. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stammes soll nicht als eine Lizenz zur Durchführung der Erfindung entgegen den unter der Autorität irgendeiner Regierung im Einklang mit ihren Patentgesetzen erteilten Rechten angesehen werden.
Die Hinterlegungen wurden so abgeändert, daß sie die Forderungen des Budapester Abkommens über die Hinterlegung von Mikroorganismen erfüllen.

Claims

1. Isolierte Säuger-Nucleinsäure, die (a) ein Polypeptid codiert, das die Aktivität eines Cytokin-Synthese-Inhibitionsfaktors besitzt, und (b) in der Lage ist, in Gegenwart von 5X SET bei 60ºC oder unter äquivalenten Bedingungen ein nachweisbares Hybrid mit einer oder mehreren Sonden zu bilden, die von den cDNA-Einschüben von pcD(SRα)-F115, pH5C oder pH15C abgeleitet sind, welche bei der American Type Culture Collection unter den Zugriffsnummern 68027, 68191 bzw. 68192 hinterlegt sind.

2. Isolierte Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei der Faktor in der Lage ist, die Produktion von wenigstens einem Cytokin, das aus IFN-γ, IL-2, IL-3, Lymphotoxin und GM-CSF ausgewählt ist, in einer Population von Zellen, bei denen die Synthese von einem oder mehreren dieser Cytokine induziert wurde, zu hemmen oder ihr Ausmaß wesentlich zu reduzieren.

3. Isolierte Nucleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellen T-Helfer-Zellen sind.

4. Isolierte Nucleinsäure, die zu wenigstens 90% homolog ist zum codierenden Bereich für ein reifes Polypeptid des größten offenen Leserasters eines cDNA-Einschubs eines Vektors, der aus pcD(SRα)-F115, pH5C und pH15C ausgewählt ist, welche bei der American Type Culture Collection unter den Zugriffsnummern 68027, 68191 bzw. 68192 hinterlegt sind.

5. Isolierte Nucleinsäure gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, die von Säugerzellen abgeleitet ist.

6. Isolierte Nucleinsäure gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Faktor um Human-Cytokin- Synthese-Inhibitionsfraktor handelt.

7. Isolierte Nucleinsäure gemäß Anspruch 6, wobei der Faktor aus reifen Polypeptiden des offenen Leserasters ausgewählt ist, das durch die folgende Aminosäuresequenz definiert ist:

8. Isolierte Nucleinsäure gemäß Anspruch 7, wobei der Faktor die folgende Aminosäuresequenz hat:

9. Isolierte Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei dem Faktor um Maus-Cytokin-Synthese- Inhibitionsfaktor handelt.

10. Isolierte Nucleinsäure gemäß Anspruch 9, wobei der Faktor die folgende Aminosäuresequenz hat:

11. Isolierte Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, die die codierende Sequenz

umfaßt.

12. Expressionsvektor, der eine Nucleinsäure gemäß einem der vorstehenden Ansprüche umfaßt.

13. Wirtszelle, die einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 12 umfaßt.

14. Wirtszelle gemäß Anspruch 13, bei der es sich um eine Bakterienzelle oder eine Säugerzelle handelt.

15. Verfahren zur Herstellung eines Säuger-Cytokin-Synthese- Inhibitionsfaktors, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 13 oder 14 unter Bedingungen, bei denen die Nucleinsäure exprimiert wird, umfaßt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, das weiterhin das Abtrennen des Cytokin-Synthese-Inhibitionsfaktors aus dem Wirt umfaßt.

17. Polypeptid, das die Aktivität eines Cytokin-Synthese- Inhibitionsfaktors besitzt und nach dem Verfahren gemäß Anspruch 15 oder 16 erhältlich ist.

18. Polypeptid, das die Aktivität eines Cytokin-Synthese- Inhibitionsfaktors besitzt und aus reifen Polypeptiden des offenen Leserasters ausgewählt ist, das durch die folgende Aminosäuresequenz definiert ist:

oder ein Mutein davon, das noch die biologische Aktivität besitzt.

19. Polypeptid, das die Aktivität eines Cytokin-Synthese- Inhibitionsfaktors besitzt und das die folgende Aminosäuresequenz hat:

oder ein Mutein davon, das noch die biologische Aktivität besitzt.

20. Polypeptid, das die Aktivität eines Cytokin-Synthese- Inhibitionsfaktors besitzt und das die folgende Aminosäurüesequenz hat:

oder ein Mutein davon, das noch die biologische Aktivität besitzt.

21. Antikörper, der spezifisch an einen Säuger-Cytokin-Synthese-Inhibitionsfaktor gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20 bindet.

22. Antikörper gemäß Anspruch 21, der in der Lage ist, die biologische Aktivität des Säuger-Cytokin-Synthese-Inhibitionsfaktors zu hemmen.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Säuger-Cytokin-Synthese-Inhibitionsfaktors gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20 umfaßt.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers gemäß Anspruch 21 oder 22 umfaßt.

25. Polypeptid, das 6 bis 30 Aminosäurereste umfaßt, die eine Sequenz haben, die mit einer Teilsequenz eines reifen Human-Cytokin-Synthese-Inhibitionsfaktors identisch ist, der die folgende Aminosäuresequenz umfaßt:

26. Polypeptid gemäß Anspruch 25, das 6 bis 12 Aminosäurereste umfaßt, die eine Sequenz haben, die mit einer Teilsequenz der folgenden Aminosäuresequenz identisch ist:

27. Polypeptid gemäß Anspruch 26, das die Sequenz RDLRDA umfaßt.

28. Polypeptid gemäß Anspruch 25, das 6 bis 12 Aminosäurereste umfaßt, die eine Sequenz haben, die mit einer Teilsequenz der folgenden Aminosäuresequenz identisch ist:

29. Polypeptid gemäß Anspruch 25, das die Sequenz ENQDPD umfaßt.

30. Polypeptid gemäß Anspruch 25, das 6 bis 12 Aminosäurereste umfaßt, die eine Sequenz haben, die mit einer Teilsequenz der folgenden Aminosäuresequenz identisch ist:

31. Polypeptid gemäß Anspruch 25, das die Sequenz ENKSKA umfaßt.

32. Polypeptid gemäß Anspruch 25, das die Sequenz CENKSKAVE umfaßt.