DE69520098T2

DE69520098T2 - Methode zur kontrolle der metallophosphatpraezipitation in fermentationen mit hoher zelldichte

Info

Publication number: DE69520098T2
Application number: DE69520098T
Authority: DE
Inventors: Burke Baclaski; Eric Curless
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-27
Publication date: 2001-07-19
Anticipated expiration: 2015-04-28
Also published as: WO1995029986A1; DK0755438T3; FI120405B; GR3035808T3; EP0755438B1; FI20095510L; FI120977B; AU699554B2; NO964368L; FI964208A0; ATE199166T1; ZA953452B; FI964208L; US7381545B2; US20070026497A1; IL113497A; CA2188434A1; JPH09512439A; ES2153896T3; JP3592330B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen bakteriellen Fermentationsprozeß zum Herstellen eines rekombinanten Proteins, wobei bestimmte Feed-Medium-Nährstoffe überwacht und eingestellt werden, um das Ausfällen von Metallphosphat in den Medien zu kontrollieren. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte, der ein Verfahren umfaßt, beidem bestimmte Polyphosphate und/oder Metaphosphate in den Medien verwendet werden, um das Ausfällen von Nährstoffen zu eliminieren und die Zelldichte zu erhöhen.
Fortschritte in der Molekularbiologie und das Ausnutzen von rekombinanten DNA- Prozeduren hat die Produktion von signifikanten Mengen von Fremdproteinen in bestimmten Wirtszellsystemen möglich gemacht. Rekombinante Proteine werden in den Wirtszellsystemen durch Transfizieren der Wirtszellen mit einer DNA, die für das interessierende Protein kodiert, und dann durch Wachsenlassen der transfizierten Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des neuen rekombinanten Proteins ermöglichen, produziert. Bestimmte bakterielle Wirtszellsysteme können verwendet werden, um große Mengen rekombinanter Proteine zu produzieren, die normalerweise in beschränkten Mengen aus natürlichen Quellen verfügbar sind.
Der Prokaryot Escherichia coli ist ein Bakterium, das in umfangreichem Maße studiert worden ist. E. coli wird im allgemeinen zur Verwendung bei Hochexpressions-Wirtszellsystemen ausgewählt, zum Teil, weil E. coli Zellen dazu tendieren, der Produktion von extrem großen Mengen an rekombinanten Protein zugänglich zu sein. Wirtszellsysteme, die eukaryotische Wirtszellen verwenden, und Hefe-Wirtszellen vermögen es im allgemeinen nicht, rekombinantes Protein in den großen Mengen zu produzieren, die in den Hochexpressions- Wirtszellsystemen, wie E. coli erzeugt werden. Außerdem hat die Entwicklung von Fermentationsprozessen mit hoher Zelldichte zu einer erhöhten volumetrischen Produktivität von rekombinanten Produkten im E. coli geführt. Yee and Blanch, Biotechnology and Bioengineering, 41: 221-230 (1993).
Die Fermentationsprozesse, die verwendet worden sind, um rekombinante Proteine in Wirtszellsystemen, wie dem E. coli System, zu produzieren, werden in begrenzten physischen Behältern (d. h. Fermentoren, Reaktoren) durchgeführt. Tanks mit Rührung repräsentieren die beliebteste Fermentoren-Geometrie, obwohl eine wachsende Anzahl anderer physisch geformter Gefäße entwickelt werden. Die Arten des Fermentor-Betriebs können in eine der folgenden Kategorien fallen: (1) Diskontinuierlicher Betrieb (Batch-Prozeß), (2) kontinuierlicher Betrieb oder (3) verschiedene Typen semi-kontinuierlicher Betriebe, wie etwa der Fed-Batch- Prozeß.
Abhängig von dem Betriebsmodus und dem Wirtszellsystem, das verwendet wird, muß ein definiertes ausbalanciertes Batch- und/oder Feed-Medium bereitgestellt werden, das das Zellwachstum und die Expression des rekombinanten Proteins ermöglichen wird. Das definierte Medium wird als "minimal" bezeichnet, wenn es nur die für das Wachstum essentiellen Nährstoffe enthält. Für das E. coli System müssen die Minimalmedien eine Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Magnesium und Spuren von Eisen und Calcium enthalten. The Bacteria, Band 1, Kapitel 1 Academic Press Inc., N. Y. (1960). Die meisten Minimalmedien verwenden Glukose als eine Kohlenstoffquelle, Ammoniak als eine Stickstoffquelle und Orthophosphat (z. B. PO&sub4;) als die Phosphorquelle. Die idealen Nährstoffmedien für das Zellwachstum würden die genaue Menge jedes Nährstoffes einschließen, der während des Zellwachstums verbraucht wird, so daß keine Nährstoffe in inhibitorischen Konzentrationen ackumulieren können und die Zellen auch nicht an irgendeinem Nährstoffmangel leiden. Thompson et al., Biotechnology and Bioengineerin, 27: 818-824 (1985). Ein theoretisch ausbalanciertes Nährstoffminimalmedium für E. coli ist früher zur Verwendung bei Schüttelkolben mit geringer Zelldichte bereitgestellt worden (Zelldichten bis zu 1,5 g Zelltrockengewicht/Liter). Neidhardt et al., Journal of Bacteriology, 119: 736-747 (1974).
Zusätzlich zu der chemischen Zusammensetzung der Medien müssen die Wirkungen mehrerer anderer Umgebungsparameter, wie etwa pH, Zeit, Kultivierungstemperatur und Partialdruck des aufgelösten Sauerstoffes sorgfältig berücksichtigt werden. Z. B. ist der optimale pH für das Wachstum von E. coli pH = 7,0. Während des Fermentationsprozesses kann der pH der Medien verändert werden aufgrund des Verbrauches an Ammoniak oder der Synthese von bestimmten metabolischen Produkten, z. B. Essigsäure und Milchsäure, durch den Mikroorganismus. Da ein veränderter pH für ein optimales Zellwachstum unvorteilhaft sein kann, ist es wesentlich, das Medium auf einem bestimmten pH zu halten und dies kann durch Säure- und Base-Zugabe erreicht werden. Der pH und andere Prozeß-Parameter kann per Hand oder mittels automatischer Vorrichtungen überwacht werden.
Fermentationen mit hoher Zelldichte (d. h. diejenigen, die Zelldichten > 20 g Zelltrockengewicht/Liter erreichen) müssen ein konzentriertes Medium verwenden. Die Betreiber von Fermentationen mit hoher Zelldichte haben gefunden, daß sich bei der Arbeit mit konzentrierten Nährstoffmedien Niederschläge bilden, wenn die Lösung, die das Phosphat enthält, mit der Lösung, die die anderen Nährstoffbestandteile enthält, gemischt wird. Die Niederschläge, die sich in den Nährstoffmedien bilden, beinhalten das Ausfällen von Orthophosphaten und schließen NH&sub4;MgPO&sub4;, (Mg)&sub3;(PO&sub4;)&sub2;, und Metallphosphate der Form (Me)n(PO&sub4;)m ein (wobei Me = Fe, Ca, Zn, Cu, Co). Diese Verbindungen haben sehr geringe Löslichkeiten in Wasser. Dean, John A., Lange's Handbook of Chemistry, 12. Auflage, McGraw-Hill, New York, Seiten 7-12 (1979). Die Fällungsmenge kann abhängig vom pH, der Glukosekonzentration und der Konzentration der Medienbestandteile variieren.
Die Niederschlagbildung kann zu einer Anzahl von Problemen bei dem Feed-Medium und im Fermentor führen. Zum Beispiel können die Niederschläge in dem Feed-Medium zu einem nicht-homogenen Feed-Vorrat (aufgrund des Absetzens des Niederschlags in den Feed- Gefäßen oder Vorratsleitungen) und zu einem Hungern der Zellen nach wesentlichen Nährstoffen führen, die nicht länger löslich sind. Die Niederschläge können ebenso die Feed- Pumpen und Leitungen abschaben und möglicherweise die Feed-Leitungen insgesamt verstopfen.
Im Fermentor wird ein Ausfällen stattfinden, wenn das Medium nicht perfekt für das Zellwachstum ausbalanciert ist. Das Ausfällen im Fermentor kann eine Verstopfung des Luftverteilers im Fermentor verursachen, zu nicht-homogenem Mischen führen (d. h. ein Niederschlag setzt sich in den unteren Bereichen des Fermentors ab) und die Verfügbarkeit von löslichen Nährstoffen für die Zellen reduzieren. Die Konzentration von Nährstoffen, die für die Zellen verfügbar sind, wird von der Rate des Nährstoffverlusts aufgrund von Niederschlagsbildung im Vergleich mit der Rate der Nährstoffaufnahme durch die Zellen abhängig. Diese Wirkungen können durch die automatische Zugabe von Säure und Base für die pH-Kontrolle verstärkt werden. Alle diese Bedingungen reduzieren die Reproduzierbarkeit des Fermentationsprozesses. Darüber hinaus kann die Anwesenheit von Niederschlägen die Proteinaufreinigungsprozeduren beeinträchtigen und die Verwendung von zusätzlichen Aufreinigungsverfahrensschritten erzwingen, um den Niederschlag von dem Produkt zu trennen.
In einem kommerziellen Ansatz muß das Fällungsproblem verringert werden, damit der Fermentationsprozeß durchführbar ist. Ein vorgeschlagener Weg, um das Ausfällen von Nährstoffen im Minimalmedium zu verhindern, ist die Zugabe von EDTA und Citrat, um Metallionen in den Nährmedien zu chelieren. Pirt, S. J., Principles of Microbe and Cell Cultivation, Seite 134 (1975). Jedoch ist die Notwendigkeit, Cheliermittel zuzugeben, nicht wünschenswert, weil die Mittel nicht metabolisiert werden. In Folge davon akkumulieren sie und erhöhen die Osmolarität der Zellumgebung. Eine hohe Osmolarität hat einen nachteiligen Effekt auf den zellulären Metabolismus. Gouesbet et al., Journal of Bacteriology, 175: 214-221 (1993). Hohe Konzentrationen an Cheliermitteln können ebenso die Zellmembranen beschädigen. Ryan et al., Biotechnology and Bioengineering, 37: 430-444 (1991).
In der deutschen Patentanmeldung Nr. 290,212 AS (eingereicht am 28. Juli 1988) beschreiben Riesenberg et al. eine Prozedur für die Herstellung eines Glukose-Minimalmediums zur Verwendung bei einer Massenkultur-Fermentation von E. coli zum Erhalt von rekombinanten DNA-Produkten. Das von Riesenberg et al. beschriebenen Minimalmedium war darauf angelegt, die schweren Fällungsproblemen zu überwinden, auf die man normalerweise bei der Arbeit mit solchen Medien stößt. Das bei der Anwendung beschriebene Medium verwendet Orthophosphate als die Phosphorquelle und eliminiert das Ausfällen von Nährstoffen nicht vollständig; stattdessen wird gesagt, daß es nur geringe Turbulenzen aufweist aufgrund einer leichten Niederschlagsbildung.
Abgesehen von der obigen Diskussion kann nichts aus der Literatur entnommen werden, was die Herstellung von Medien für Fermentationen mit hoher Zelldichte betrifft, das effektiv das Nährstoffausfällungsproblem eliminiert. Es existiert immer noch ein Bedarf für ein Verfahren zum Verringern des Ausfällens in einem Batch- und/oder Feed-Medium, das keinen Niederschlag enthält, wenn alle Bestandteile gemischt werden (gemischt bei neutralem pH für E. coli), und das sicherstellt, daß sich kein Niederschlag im Fermentor während der Verarbeitung bilden wird. Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren bereit durch Verwendung eines Natriumphosphat-Glases als die Phosphorquelle in den konzentrierten Nährmedien. Anders als die in den zitierten Literaturangaben oben vorgeschlagenen Verfahren stellen die Verfahren der vorliegenden Erfindung den dreifachen Vorteil bereit von: (1) Ermöglichen des Designs eines konzentrierten, vollständig ausbalancierten Batch- und/oder Feed-Mediums, das keinen Niederschlag enthält; (2) die Fähigkeit, von E. coli metabolisiert zu werden; und (3) Ermöglichen einer erhöhten Zelldichte und Wachstumsraten. Die praktischen Verfahren der vorliegenden Erfindung sind bei einer Vielzahl von bakteriellen Fermentationen, insbesondere Fermentationsprozessen mit hoher Zelldichte nützlich.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen bakteriellen Fermentationsprozeß zum Herstellen eines rekombinanten Proteins, bei dem bestimmte Feed-Medien-Nährstoffe überwacht und so eingestellt werden, daß das Ausfällen von Metallphosphaten während des Prozesses kontrolliert wird. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte, umfassend ein Verfahren, bei dem die konzentrierte Nährlösung Natriumphosphat- Glas als die Phosphorquelle verwendet. Überraschenderweise eliminiert dieses Verfahren die Bildung von Niederschlag in den Medien und führt zu erhöhten Zelldichten bei Standardbedingungen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Verringern des Ausfällens in einem bakteriellen Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte zum Herstellen eines rekombinanten Proteins, wobei der Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte Zelldichten > 20 g Zell-Trockengewicht/Liter erreicht, wobei das Verfahren die Verwendung von Phosphat-Gläsern als eine Phosphorquelle in den Nährmedien während der Herstellung besagten Proteins umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erhöhen der Zelldichte in einem bakteriellen Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte zum Herstellen eines rekombinanten Proteins bereitgestellt, wobei der Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte Zelldichten > 20 g Zell-Trockengewicht/Liter erreicht, wobei das Verfahren die Verwendung von Phosphat-Gläsern als die Phosphorquelle in den Nährmedien während der Herstellung besagten Proteins umfaßt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenso ein Verfahren zum Verringern des Ausfällens in einem Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte zum Herstellen eines rekombinanten Proteins in E. coli bereitgestellt, wobei der Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte Zelldichten > 20 g Zell-Trockengewicht/Liter erreicht, wobei das Verfahren die Verwendung eines Phosphat-Glases mit einer Kettenlänge von ungefähr ñ = 4 bis ungefähr ñ = 20 als eine Phosphorquelle in den Nährmedien während der Herstellung besagten Proteins umfaßt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt Zelldichtenprofile aus Lauf C (· - ·) und Lauf D (o - o), die demonstrieren, daß die Verwendung eines Phosphat-Glases als die Phosphorquelle in den Medien zu einer Erhöhung der Zelldichte gegenüber derjenigen führt, die unter Verwendung von Orthophosphat als die Phosphorquelle erhalten wird. Die Zelldichte wurde unter Verwendung eines Perkin- Elmer M35 Spektrophotometers gemessen, und die OD&sub6;&sub0;&sub0; wurde gegen die Zeit aufgetragen.

Detaillierte Beschreibung

Die Verfahren, mit denen bestimmte Feed-Medien-Nährstoffe überwacht und so eingestellt werden, um das Ausfällen von Metallphosphaten während des Fermentationsprozesses zu kontrollieren, werden in größerem Detail in der Diskussion unten beschrieben und werden durch die unten bereitgestellten Beispiele erläutert. Die Beispiele demonstrieren, daß alternative Phosphorquellen in Fermentationen mit hoher Zelldichte verwendet werden können, um das Ausfällen von Nährstoffen zu eliminieren. Die Resultate waren dahingehend überraschend, daß Batch- und Fed-Batch-Fermentationen mit hoher Zelldichte unter Verwendung eines glasigen Natriumphosphats als die Phosphorquelle in dem konzentrierten Batch- und/oder Feed-Medium das Ausfällen von Metallphosphaten in den Medien eliminierte und zu erhöhten Zelldichten in den Fermentationen führte.
Die Fermentationsprozesse, die bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet werden, werden einen Betriebsmodus verwenden, der unter eine der folgenden Kategorien fällt: (1) Diskontinuierlicher (Batch-Prozeß) Betrieb, (2) kontinuierlicher Betrieb und (3) semi-kontinuierlicher (Fed-Batch) Betrieb. Ein Batch-Prozeß wird durch das Beimpfen des sterilen Kulturmediums (Batch-Medium) mit Mikroorganismen am Anfang des Prozesses, die für eine spezifische Reaktionsperiode kultiviert worden sind, charakterisiert. Während der Kultivierung verändern sich die Zellkonzentrationen, Substratkonzentrationen (C-Quelle, Nährstoffsalze, Vitamine, etc.) und Produktkonzentrationen. Eine gute Mischung stellt sicher, daß es keine signifikanten örtlichen Unterschiede hinsichtlich der Zusammensetzung oder der Temperatur der Reaktionsmischung gibt. Die Reaktion ist nicht-stationär, und die Zellen läßt man wachsen, bis das wachstumslimitierende Substrat (im allgemeinen die Kohlenstoffquelle) aufgebraucht ist.
Ein kontinuierlicher Betrieb ist dadurch charakterisiert, daß ein frisches Kulturmedium (Feed- Medium) kontinuierlich zum Fermentor zugegeben wird und aufgebrauchtes Medium und Zellen kontinuierlich von dem Fermentor in derselben Rate entzogen werden. Bei einem kontinuierlichen Betrieb wird die Wachstumsrate durch die Rate der Mediumszugabe bestimmt, und die Wachstumsausbeute wird durch die Konzentration des wachstums-limitierenden Substrats (d. h. der Kohlenstoffquelle) bestimmt. Alle Reaktionsvariablen und Kontroll-Parameter bleiben über die Zeit konstant, und deshalb wird ein zeitkonstanter Zustand in dem Fermentor erreicht, gefolgt von einer konstanten Produktivität und Leistung.
Ein semi-kontinuierlicher Betrieb kann als eine Kombination aus Batch- und kontinuierlichem Betrieb angesehen werden. Die Fermentation wird als ein Batch-Prozeß begonnen, und wenn das wachstumslimitierende Substrat aufgebraucht ist, wird ein kontinuierliches Feed-Medium, enthaltend Glukose und Mineralien, auf eine spezifizierte Weise (Fed-Batch) zugegeben. In anderen Worten, dieser Betrieb verwendet sowohl ein Batch-Medium als auch ein Feed- Medium, um Zellwachstum und effiziente Herstellung des erwünschten Proteins zu erreichen. Keine Zellen werden zugegeben oder während der Kultivierungsperiode entnommen, und deshalb läuft der Fermentor batch-Weise, soweit es die Mikroorganismen betrifft. Während die vorliegende Erfindung in einer Vielzahl von Prozessen verwendet werden kann, einschließlich der oben erwähnten, ist eine bevorzugte Verwendung im Zusammenhang mit einem Fed-Batch-Prozeß.
In jedem der obigen Prozesse können Zellwachstum und Produkt-Akkumulierung indirekt durch Ausnützen einer Korrelation zwischen Metabolitbildung und einer anderen Variablen, wie etwa Medium-pH, optischer Dichte, Farbe und titrierbarer Acidität überwacht werden. Zum Beispiel stellt die optische Dichte ein Anzeichen für die Akkumulierung unlöslicher Zellpartikel bereit und kann on-stream unter Verwendung einer Mikro-OD-Einheit, gekoppelt an eine Display-Einrichtung oder einen Rekorder, überwacht werden, oder off-line durch Probenziehen. Die Meßwerte der optischen Dichte bei 600 Nanometer (OD&sub6;&sub0;&sub0;) werden als ein Mittel zum Bestimmen des Trocken-Zellgewichts verwendet.
Fermentationen mit hoher Zelldichte werden im allgemeinen als diejenigen Prozesse beschrieben, die zu einer Ausbeute > 20 g Zell-Trockengewicht/Liter führen (OD&sub6;&sub0;&sub0; > 30). Alle Fermentationsprozesse mit hoher Zelldichte verwenden ein konzentriertes Nährmedium, das allmählich in den Fermentor in einem "Fed-Batch-Prozeß" abgemessen wird. Ein konzentriertes Feed-Nährmedium ist bei Prozessen mit hoher Zelldichte erforderlich, um die Verdünnung des Fermentorinhalts während des Zuführens zu minimieren. Ein Fed-Batch-Prozeß ist erforderlich, weil er es dem Betreiber ermöglicht, das Zuführen der Kohlenstoffquelle zu kontrollieren, was wichtig ist, weil, wenn die Zellen gegenüber Konzentrationen der Kohlenstoffquelle ausgesetzt sind, die hoch genug sind, um hohe Zelldichten zu erzeugen, die Zellen so viel des inhibitorischen Biprodukts, Acetat, produzieren werden, daß das Wachstum aufhören wird. Majewski and Domach, Biotechnology and Bioengineering, 35: 732-738 (1990).
Standardreaktionsbedingungen für die Fermentationsprozesse, die verwendet werden, um rekombinante Proteine zu erzeugen, beinhalten im allgemeinen das Aufrechterhalten eines pH bei ungefähr 5,0 bis 8,0 und Kultivierungstemperaturen im Bereich von 20º bis 50ºC für E. coli. Bei der vorliegenden Erfindung wird eine bevorzugte Ausführungsform, die E. coli als das Wirtssystem verwendet, einen optimalen pH von ungefähr 7,0 und eine optimale Kultivierungstemperatur von ungefähr 37ºC haben.
Die Standard-Nährmedien-Bestandteile bei diesen Fermentationsprozessen schließen im allgemeinen eine Quelle von Energie, Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Magnesium und Spurenmengen von Eisen und Calcium ein. Zusätzlich können die Medien Wachstumsfaktoren (wie Vitamine und Aminosäuren), anorganische Salze und alle anderen für die Produktbildung essentiellen Vorläufer enthalten. Die elementare Zusammensetzung des betrachteten Mikroorganismus kann verwendet werden, um den Anteil von jedem Bestandteil zu berechnen, der erforderlich ist, um das Zellwachstum zu unterstützen. Die Bestandteil- Konzentrationen werden variieren in Abhängigkeit davon, ob der Prozeß ein Prozeß mit geringer Zelldichte oder hoher Zelldichte ist. Zum Beispiel reichen die Glukosekonzentrationen in Batch-Fermentationsprozessen mit niedriger Zelldichte von 1-5 g/l, während Batch- Prozesse mit hoher Zelldichte Glukosekonzentrationen im Bereich von 45 g/l bis 75 g/l verwenden.
Es wird zur Verwendung bei der Ausübung dieser Erfindung als eine Phosphatquelle in den Medien eine große Vielfalt an Phosphat-Gläsern in Erwägung gezogen. Phosphat-Gläser sind lineare Polyphosphate mit relativ spezialisierten Anwendungen. Für eine allgemeine Diskussion linearer Polyphosphate, einschließlich Phosphat-Gläsern, siehe Corbridge, D. E. C., Phosphorus: An Outline of its Chemistry, Biochemistry and Technology, 4. Auflage, Kapitel 3, Seiten 210-302 (1990). Phosphat-Gläser können über einen großen Bereich von Zusammensetzungen hergestellt werden und bestehen hauptsächlich aus einer Mischung von Kationen und diskreten Polyphosphat-Ketten. Die mit Na&spplus;-Kationen gebildeten Gläser sind sehr sorgfältig untersucht worden und existieren in einer kontinuierlichen Reihe, stabil bei normalen Temperaturen, von der Zusammensetzung P&sub2;O&sub5; bis zu 5Na&sub2;O.100P&sub2;O&sub5;. Phosphat-Gläser werden durch die Kondensation von Orthophosphat-Anionen gebildet, d. h. durch Erhitzen von NaH&sub2;PO&sub4; auf ~ 650ºC und durch Löschen. Ein typisches Glas aus einer gelöschten Schmelze bei 650ºC und Wasserdampfdruck von 55 torr hat eine mittlere Kettenlänge von ñ = 60 PO&sub4;- Tetraedern.
Glasige Sorten von Natriumpolyphosphat sind kommerziell erhältlich. Diese werden mit verschiedenen durchschnittlichen Kettenlängen hergestellt (z. B. ñ = 5 bis ñ = 200).
Im allgemeinen sind die Polyphosphate, die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, Natriumphosphat-Gläser. Insbesondere werden Natriumphosphat-Gläser im Bereich von ungefähr ñ = 2 bis ungefähr ñ = 100 und bevorzugter ungefähr ñ = 4 bis ungefähr ñ = 20 zur Verwendung in Erwägung gezogen. Diese Phosphat-Gläser sind bei der vorliegenden Erfindung nützlich, weil: (1) ihre Löslichkeitseigenschaften derart sind, daß konzentrierte Nährmedien hergestellt werden können ohne resultierendes Ausfällen nach der Mischung; (2) Wirtszellsysteme, wie etwa das E. coli System, die notwendigen Stoffwechselwege haben, um die Phosphat-Gläser zu metabolisieren; und (3) weil es kein Ausfällen gibt, alle Nährstoffe zum Verbrauch voll verfügbar sind, was zu erhöhten Zelldichten und Wachstumsraten führt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein glasiges Natriumpolyphosphat mit einer Kettenlänge von ñ = 11 als die Phosphorquelle verwendet.
Die vorliegende Erfindung ist nützlich in einem Prozeß zur Herstellung einer Vielzahl rekombinanter Proteine. Beispielhafte Proteine, die in Erwägung gezogen werden, sind Cytokine, einschließlich verschiedener hämatopoetischer Faktoren, wie etwa G-CSF, SCF, EPO, GM- CSF, CSF-1, die Interleukine, wie etwa IL-1 bis IL-12, IGFs, M-CSF, TNF oder LIF. Andere therapeutische Proteine, wie etwa Interferone (alpha-, beta-, gamma- oder Consensus- Interferone) und Wachstumsfaktoren oder Hormone sind ebenso nützlich, wie etwa menschliche oder andere tierische Wachstumshormone (z. B. Schweine- oder Hühnchen- Wachstumshormon), FGF, KGF, EGF und PDGF. Protease-Inhibitoren, wie etwa Metalloproteinase-Inhibitoren werden in Erwägung gezogen (wie etwa TIMP-1, TIMP-2 oder andere Proteinase-Inhibitoren). Nervenwachstumsfaktoren werden ebenso in Erwägung gezogen, wie etwa BDNF und NT-3. Ebenso erwogen werden Peptidteile von Proteinen mit der gesamten oder einem Teil der Primärstruktur des Elternproteins und wenigstens einer der biologischen Eigenschaften des Elternproteins.
Im allgemeinen hat der bei der vorliegenden Erfindung nützliche KGF die Sequenz von menschlichem KGF oder naher verwandter Analoge davon. Die veröffentlichte PCT- Patentanmeldung WO 90/08771 beschreibt die Aufreinigung von KGF aus dem konditionierten Medium einer menschlichen Embryonen-Fibroblasten-Zellinie, das partielle Aminosäuresequenzieren des isolierten Polypeptids, das Klonieren des Gens und die Expression in bakteriellen Zellen (E. coli), um rekombinanten, biologisch aktiven KGF zu erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die rekombinante Wirtszelle, die in dem Prozeß verwendet wird, E. coli. E. coli ist ein bevorzugtes System, weil seine Genetik gut charakterisiert ist, es hohe Zelldichten ermöglicht und es effizient kultiviert werden kann unter normalen Bedingung (z. B. pH und Temperatur).
Zusätzliche Elemente, die bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung bereitstellen, schließen komplexe Stickstoffquellen, wie etwa Hefeextrakt und chemische Verdaue von Casein- Sojamehl, Fleisch, Blut oder Baumwollsamen ein. Wie von einer Person mit Kenntnis des Gebiets verstanden würde, umfaßt die Erfindung Verfahren zum Kontrollieren des Metallphosphat-Ausfällens mit verschiedenen Kombinationen dieser zusätzlichen Elemente.

Beispiel 1

Ausbalancierte minimale Feed-Nährmedien, die typisch für diejenigen waren, die verwendet würden, um rekombinante Proteine in Fermentationen mit hoher Zelldichte in E. coli herzustellen, wurden hergestellt unter Verwendung alternativer Phosphatquellen. Ein "Standard"- Batch-Minimalmedium (bezeichnet als Medium A), das Orthophosphat als die Phosphorquelle verwendete, wurde verglichen mit einem Medium (bezeichnet als Medium B), das HexaphosTM verwendete, ein glasiges Natrium-Polyphosphat mit einer Kettenlänge von ñ = 11 und geliefert von FMC Corp., als die Phosphorquelle.
Medium A enthielt 45 g/l Glukose, 3 g/l Hefeextrakt, 1 g/l (NH&sub4;) 2504, 4 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 4,56 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,71 g/l MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,74 g/l KCl, 4,0 ml/l einer Spurenmetalllösung A (27 g/l von FeCl&sub3; · 6H&sub2;O, 2,0 g/l von ZnCl&sub2; 4H&sub2;O, 2,0 g/l von CoCl&sub2; 6H&sub2;O, 2,0 g/l MnMoO&sub4; 2H&sub2;O, 1,0 g/l von CaCl&sub2; · 2H&sub2;O, 1,9 g/l von CuSO&sub4; · 5H&sub2;O, 0,5 g/l von H&sub3;BO&sub3;, 1,6 g/l MnCl&sub2; · 4H&sub2;O, 73,5 g/l Natriumcitrat 1120) und 4 ml/l einer Vitaminlösung A (0,06 g/l Biotin, 0,04 g/l Folsäure, 1,4 g/l Pyridoxin · HCl, 0,42 g/l Riboflavin, 5,4 g/l Pantothensäure, 6,1 g/l Niacin). Medium B war mit Medium A identisch, außer daß 3,33 g/l HexaphosTM als die Phosphatquelle verwendet wurde statt K&sub2;HPO&sub4; und KH&sub2;PO&sub4;.
Während der Sterilisierung jedes der Medien wird die Glukose und das Magnesiumsulfat zusammen sterilisiert, die Spurenmetaillösung A wird separat sterilisiert, und die anderen Medienbestandteile (einschließlich des Orthophosphats) werden separat sterilisiert. Dies wird gemacht, um unerwünschte Nebenreaktionen zu verhindern. Für Medium B wird das HexaphosTM ebenso separat sterilisiert. Bei Medium A wurde die resultierende Lösung trübe, wenn alle der sterilisierten Medienbestandteile zusammen gemischt werden. Die Trübung wurde dem Stattfinden von Fällungsreaktionen zugeschrieben. Jedoch blieb Medium B nach der Mischung transparent.
Das Gewicht des resultierenden Niederschlags wurde gemessen durch Entnehmen von 10 ml Proben der Medien und durch Filtern durch zwei Nylonfilter 0,2 um Porengröße (Nalgene, 215-4020) in einem Filterhalter (Nalgene, 300-4100). Der zweite Filter in der Linie wurde verwendet, um das Anwachsen der Masse aufgrund löslicher Feststoffe, die innerhalb der Membran eingefangen sind, einzuschätzen. Die Filter wurden für mehrere Stunden luftgetrocknet und dann vollständig in einem Labware 9000 Mikrowellen-Trockenofen mit Gewichtskala getrocknet. Der Labware 9000 wurde zum Bestimmen des Trockengewichts der Filter verwendet, vor und nachdem die Probe aufgebracht war. Die Resultate werden in Tabelle 1 unten zusammengefaßt.

TABELLE 1

Medium Gewicht des Niederschlags
A 0,20 Gramm/Liter
B nicht nachweisbar

Beispiel 2

Fed-Batch-Fermentationen mit hoher Zelldichte, die darauf angelegt waren, rekombinanten KGF in E. coli herzustellen, wurden durchgeführt, um die Verwendung eines Phosphat-Glases gegen Orthophosphat als die Phosphorquelle in dem Batch-Medium und dem konzentrierten - Feed-Nährmedium zu vergleichen. Die Effekte auf die Metallphosphat-Ausfällungsniveaus in den Medien sowie die Gesamtzelldichte wurden bestimmt. Ein Lauf mit einem "Standard"- Fed-Batch-Minimalmedium (bezeichnet als Lauf C) unter Verwendung von Orthophosphat als die Phosphorquelle wurde verglichen mit einem Lauf (bezeichnet als Lauf D), der HexaphosTM als die Phosphorquelle verwendete.
Für Lauf C enthielt das Batch-Medium 5 g/l Glukose, 1,68 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,05 g/l K&sub2;SO&sub4;, 0,36 g/l NaH&sub2;PO&sub4; 1120, 0,136 g/l MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 0,008 g/l KCl, 0,78 ml/l einer Spurenmetalllösung A (27 g/l FeCl&sub3; · 6H&sub2;O, 2,0 g/l ZnCl&sub2; 4H&sub2;O, 2,0 g/l CoCl&sub2; · 6H&sub2;O, 2,0 g/l MnMoO&sub4; · 2H&sub2;O, 1,0 g/l CaCl&sub2; · 2H&sub2;O, 1,9 g/l CuSO&sub4; · 5H&sub2;O, 0,5 g/l H&sub3;BO&sub3;, 1,6 g/l MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 73,5 g/l Natriumcitrat · H&sub2;O). Lauf D war identisch mit Lauf C, außer daß 0,28 g/l HexaphosTM anstelle von NaH&sub2;PO&sub4; · H&sub2;O verwendet wurde.
Im Lauf C enthielt das Feed-Medium 651,5 g/l Glukose, 6,52 g/l K&sub2;SO&sub4;, 46,91 g/l NaH&sub2;PO&sub4; H&sub2;O, 17,69 g/l MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 1,08 g/l KCl und 102 ml/l der Spurenmetalllösung A. Der Lauf D mit Feed-Medium war identisch mit demjenigen von Lauf C, außer daß 37,2 g/l HexaphosTM anstelle von NaH&sub2;PO&sub4; 1120 verwendet wurde. Für jeden Lauf wurde der pH des Feed-Mediums auf 7,0 durch Zugabe von 36 ml/140% v/v NaOH-Lösung eingestellt.
Ebenso wie bei den ausbalancierten minimalen Feed-Nährmedien aus Beispiel 1 führte die Verwendung von Orthophosphat als Phosphorquelle zur Bildung von Niederschlägen nach dem Mischen der sterilisierten Mediumbestandteilen. Die Verwendung von HexaphosTM andererseits führte zu keiner solchen Ausfällung. Das Gewicht des resultierenden Niederschlags wurde unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur gemessen, und die Resultate sind in Tabelle 2 unten zusammengefaßt.

TABELLE 2

Lauf Gewicht des Niederschlag
C 0,33 Gramm/Liter
D nicht nachweisbar
Die Zelldichten für die Läufe C und D wurden ebenso überwacht. Bei jedem Lauf werden die Zellen anfänglich batch-Weise in dem Batch-Medium wachsen gelassen. Nachdem die Glukose aufgebraucht ist, wird eine kontinuierliche Zuführung unter Verwendung des Feed- Mediums begonnen. Während dieses Fed-Batch-Teils der Fermentation wird die Zuführrate in zweistündigen Intervallen entsprechend der Zelldichte erhöht. Im Lauf C begann die Wachstumsrate bei 0,08 h&supmin;¹ und nahm auf 0,04 h&supmin;¹ ab 42 Stunden, nachdem das Zuführen begann, als die Zelldichte OD 65 erreicht wurde. Die OD nahm dann ab. Im Lauf D wuchs die Fermentation in einer stetigen Rate von 0,09 h&supmin;¹ für 43 Stunden, wenn eine Zelldichte von OD 92 erreicht wurde. Die OD nahm dann ab (siehe Fig. 1). Das Resultat war eine Endzelldichte von 61 g Zell-Trockengewicht/Liter für Lauf D, im Vergleich zu nur 43 g Zell- Trockengewicht/Liter für Lauf C. Als ein Resultat produzierte Lauf D 180 mg/Liter KGF während Lauf C 120 mg/Liter KGF produzierte.

Beispiel 3

Mehrere Polyphosphate (mit Kettenlängen im Bereich von ñ = 2 bis ñ = 19), die nicht HexaphosTM waren, wurden als Phosphorquelle in Mediumzubereitungen verwendet, die typisch für diejenigen waren, welche für Fermentationen mit hoher Zelldichte in E. coli verwendet werden. Mehrere Medien, enthaltend Glukose : Phosphor- und Glukose : Magnesium- Verhältnisse, typisch für diejenigen, die für Fermentationen mit hoher Zelldichte notwendig sind, wurden durch Mischen einer konzentrierten Stammlösung von Glukose/Magnesiumsulfat (enthaltend 888 g Glukose/l) mit konzentrierten Lösungen verschiedener Phosphor-enthaltender Verbindungen und Wasser formuliert. Der pH jeder resultierenden Lösung wurde auf pH = 7,0 unter Verwendung von entweder 40% NaOH oder 30% HCl eingestellt.
Visuelle Untersuchungen jeder Lösung wurden täglich für fünf Tage durchgeführt, um auf Niederschlagbildung zu kontrollieren. Die Resultate werden in Tabelle 3 unten zusammengefaßt. Die Resultate zeigen, daß die Verwendung von HexaphosTM als die Phosphorquelle in den Medien die Verwendung von Glukosekonzentrationen so hoch wie 800 g/l ohne das Auftreten von Ausfällen ermöglicht. Die Verwendung von Glass HTM, einem glasigen Natriumpolyphosphat mit einer Kettenlänge von ñ = 19, und SodaphosTM, einem glasigen Natriumpolyphosphat mit einer Kettenlänge von ñ = 4 ermöglicht die Verwendung von Glukosekonzentrationen so hoch wie 600 g/l. Die Verwendung von Orthophosphat andererseits erlaubt eine maximale Glukosekonzentration von nur 462 g/l. TABELLE 3
* Maximale Glukosekonzentration, die erhalten werden kann, ist 462 g/l.
Diese Resultate demonstrieren, daß eine Vielzahl glasiger Natriumpolyphosphate beim Eliminieren des Ausfällens von Nährstoffen effektiv sind in den konzentrierten Medien, die zur Herstellung von rekombinanten Proteinen bei den Fermentationen mit hoher Zelldichte verwendet werden.
Die hierin präsentierten Resultate zeigen ein praktisches Verfahren zum Kontrollieren von Metallphosphat-Fällungsreaktionen in den Medien, die bei bakteriellen Fermentationsprozessen mit hoher Zelldichte verwendet werden, und werden verbessertes Zellwachstum und Proteinherstellung in einer Vielzahl von bakteriellen Fermentationsprozessen mit hoher Zelldichte ermöglichen.

Claims

1. Verfahren zum Verringern des Ausfällens in einem bakteriellen Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte zum Herstellen eines rekombinanten Proteins, wobei der Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte Zelldichten > 20 g Zell-Trockengewicht/Liter erreicht, wobei das Verfahren die Verwendung von Phosphat-Gläsern als eine Phosphorquelle in den Nährmedien während der Herstellung besagten Proteins umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagte Phosphat-Gläser ausgewählt sind aus der Gruppe, die Natrium-Phosphat-Gläser mit Kettenlängen im Bereich von ungefähr ñ = 2 bis ungefähr ñ = 100 umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei besagtes Natrium-Phosphat-Glas eine Kettenlänge von ungefähr ñ = 4 bis ungefähr ñ = 20 hat.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei besagtes Natrium-Phosphat-Glas eine Kettenlänge von ñ = 11 hat.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei besagte Fermentation mit hoher Zelldichte ausgewählt ist aus der Gruppe, die eine Batch-Fermentation, eine kontinuierliche Fermentation und eine Fed-Batch-Fermentation umfaßt.

6. Verfahren zum Erhöhen der Zelldichte in einem bakteriellen Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte zum Herstellen eines rekombinanten Proteins, wobei der Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte Zelldichten > 20 g Zell-Trockengewicht/Liter erreicht, wobei das Verfahren die Verwendung von Phosphat-Gläsern als die Phosphor-Quelle in den Nährmedien während der Herstellung besagten Proteins umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei besagte Phosphat-Gläser ausgewählt sind aus der Gruppe, die Natrium-Phosphat-Gläser mit Kettenlängen im Bereich von ungefähr ñ = 2 bis ungefähr ñ = 100 umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei besagtes Natrium-Phosphat-Glas eine Kettenlänge von ungefähr ñ = 4 bis ungefähr ñ = 20 hat.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei besagtes Natrium-Phosphat-Glas eine Kettenlänge von ñ = 11 hat.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei besagte Fermentation mit hoher Zelldichte ausgewählt ist aus der Gruppe, die eine Batch-Fermentation, eine kontinuierliche Fermentation und eine Fed-Batch-Fermentation umfaßt.

11. Verfahren zum Verringern des Ausfällens in einem Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte zum Herstellen eines rekombinanten Proteins in E. coli, wobei der Fermentationsprozeß mit hoher Zelldichte Zelldichten > 20 g Zell-Trockengewicht/Liter erreicht, wobei das Verfahren die Verwendung eines Phosphat-Glases mit einer Kettenlänge von ungefähr ñ = 4 bis ungefähr ñ = 20 als eine Phosphorquelle in den Nährmedien während der Herstellung besagten Proteins umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei besagtes Phosphat-Glas eine Kettenlänge von ungefähr ñ = 11 hat.