DE69507185T2

DE69507185T2 - Arzneimittel zur Behandlung von Osteoporose

Info

Publication number: DE69507185T2
Application number: DE69507185T
Authority: DE
Inventors: Kazuyuki Kitamura; Hiroyasu Tobe
Original assignee: Hoechst Marion Roussel; Hoechst Marion Roussel Inc
Current assignee: Sanofi Aventis France; Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-04-12
Filing date: 1995-04-06
Publication date: 1999-09-09
Anticipated expiration: 2015-04-07
Also published as: FI951702L; FI951702A0; EP0677289B1; HU9501043D0; ATE175575T1; AU696334B2; NO951422L; CA2146820A1; HUT71604A; KR950031059A; DK0677289T3; DE69507185D1; EP0677289A3; US5604263A; AU1638495A; EP0677289A2; TW427901B; NO951422D0; ES2129691T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Osteoporose.
Japan bewegt sich nun verstärkt in Richtung einer überalterten Gesellschaft, die es in der Vergangenheit nicht gegeben hat, und gleichzeitig wird die steigende Zahl von Osteoporosepatienten nun zum ernsten Problem. Die steigende Zahl von alten Menschen, die aufgrund eines Knochenbruchs bettlägrig wird, erfordert eine enorme Ausweitung der medizinischen Ausgaben.
Als ein therapeutisches Mittel für Osteoporose wurden in Japan Vitamin D-Präparate, Calcitonin-Präparate, Ipriflavone-Präparate udgl. verwendet. Es wurde jedoch keine Methode zur radikalen Behandlung von Osteoporose festgelegt, sondern es wird in diesem Stadium nur eine symptomatische Behandlung angewendet. Osteoporose entsteht, wenn das Gleichgewicht zwischen Knochenbildung und Knochenresorption verlorengeht, und als Konsequenz davon wird die Verhinderung von Osteoporose durch Unterstützung der Knochenbildung oder durch Inhibierung der Knochenresorption als machbar betrachtet.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher, eine neue medizinische Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Osteoporose bereitzustellen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung sind infolge verschiedener Studien auf die Tatsache gestoßen, daß α-Säuren und Iso-α-säurederivate, die in Hopfenextrakten enthalten sind, eine starke inhibierende Wirkung gegen Knochenresorption aufweisen und diese Erfindung wurde nun ab geschlossen.
Hopfen (Humulus lupulus L.) war ursprünglich bekannt als medizinisches Kraut und wurde seit langem zum Brauen von Bier verwendet. Iso-α-säurederivate sind Verbindungen, die durch Isomerisation aus α-Säuren während des Brauens von Bier (während der Stufe des Kochens von Hopfen) gebildet werden und sie sind in Bier als aktive Substanz einer bitteren Komponente enthalten. Aus dem vorstehenden kann geschlossen werden, daß die α- Säuren und Iso-α-säurederivate eine ausreichend niedrige Toxizität besitzen. Es ist bekannt, daß α-Säuren vor allem Humulon (Formel I), Cohumulon (Formel II) und Adhumulon (Formel III) enthalten, während Iso-α-säurederivate hauptsächlich Isohumulon (Formel IV), Isocohumulon (Formel V) und Isoadhumulon (Formel VI) umfassen.
Folglich umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Osteoporose, welche als aktiven Bestandteil eine oder mehrere Verbindungen enthält, die aus der aus Humulon, Cohumulon, Adhumulon, Isohumulon, Isocohumulon und Isoadhumulon bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben versucht, ein therapeutisches Mittel für Osteoporose zu entwickeln und führten die Versuchstests für Substanzen zum Inhibieren der Knochenresorption durch.
Andererseits wurde Prostaglandin E&sub2; als einer der Knochenresorption fördernden Faktoren genannt [IGAKU NO AYUNI (Journal of Clinical and Experimental Medicine), (1993), Bd. 165, S. 568]. Es wird angenommen, daß Prostaglandin E&sub2; in Osteoblasten gebildet wird, welche eine wichtige Rolle bei der Knochenbildung spielen, und es kann auf Knochenresorptionszellen wirken, um die Knochenresorption zu fördern. Wenn eine Substanz gefunden werden kann, die befähigt ist, die Wirkung von Prostaglandin E&sub2; zu inhibieren oder zu antagonisieren, wäre diese Substanz ein Mittel zur Behandlung von Osteoporose. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daher - als Ergebnis verschiedener Studien - ihr Augenmerk auf die Tatsache gerichtet, daß α-Säuren und Iso-α-säurederivate, die in Hopfenextrakten enthalten sind, eine ähnliche Struktur aufweisen wie Prostaglandin E&sub2;; d. h. sie besitzen einen 6-gliedrigen oder 5- gliedrigen Ring mit einer ungesättigten Carbonylgruppe, und die Erfinder haben α-Säuren und Iso-α-säurederivate gereinigt und mittels eines Lochbildungsversuches auf ihre Wirkung zur Inhibierung der Knochenresorption geprüft. Als Ergebnis wurde gefunden, daß α-Säuren und Iso-α-säurederivate die Knochenresorption bei einer niedrigen Konzentration von 1 · 10&supmin;&sup9; M inhibieren. Über die Tatsache, daß α-Säuren und Iso-α-säurederivate die Fähigkeit zur Inhibierung der Lochbildung besitzen, wurde bisher noch nicht berichtet, sie wurde erstmals durch die vorliegende Erfindung beleuchtet.
Wie obenstehend beschrieben, werden Iso-α-säurederivate durch Isomerisation von α-Säuren gebildet, und die Isomerisation von α-Säuren zu Iso-α-säurederivaten läuft daher kontinuierlich während der Isolierung und Reinigung ab. Andererseits wurde die Phosphormolybdänsäure (vertrieben von der Merck AG) als Farbreagens, das sowohl für α-Säuren als auch für Iso-α-säurederivate eine gelblich-grüne Farbe entwickelt, für wirksam befunden, und dieses Farbreagens wurde als Identifizierungsreagens für α-Säuren und Iso-α-säurederivate angewendet.
α-Säuren und Iso-α-säurederivate können durch Reinigung aus natürlichem Hopfen und auch durch Organosynthese der bekannten chemischen Struktur gemäß einer herkömmlichen Methode hergestellt werden.
Die Dosierung von α-Säuren und Iso-α-säurederivaten in der klinischen Anwendung liegt üblicherweise im Bereich von 0,1 g - 2 g pro Erwachsenem pro Tag (etwa 1,5 mg - 30 mg/kg/Tag), obwohl diese Dosierung in Abhängigkeit von den Verabreichungsmethoden variiert. Sie kann intravenös, intramuskulär, oral und intrarektal verabreicht werden. Im Falle einer intravenösen Verabreichung kann ein intravenöser Tropf zusätzlich zu den üblichen intravenösen Injektionen zur Anwendung kommen.
Die α-Säuren und Iso-α-säurederivate enthaltenden Präparate werden durch eine herkömmliche Methode unter Anwendung herkömmlicher Exzipientien und Additive hergestellt.
Injizierbare Präparate können beispielsweise in Form von injizierbaren Pulvern formuliert werden. In diesem Fall können die Pulver durch Zusetzen von einem oder von mehreren geeigneten wasserlöslichen Exzipientien wie Mannit, Saccharose, Lactose, Maltose, Glucose, Fructose udgl. zu einem aktiven Bestandteil hergestellt werden, wobei das Gemisch in Wasser gelöst, in Phiolen oder Ampullen verteilt wird, gefolgt von einem Lyophilisieren und luftdichten Verschließen.
Als ein orales Präparat kann es in Form von gewöhnlichen Tabletten, Kapseln, Granulaten, feinen Granulaten oder Pulvern sowie als enterische Präparate formuliert werden.
Enterische Präparate können durch Zusetzen von Exzipientien wie Mannit, Saccharose, Lactose, Maltose, Stärke, Kieselsäureanhy drid, Calciumphosphat udgl., Gleitmitteln wie Talk, Magnesiumstearat udgl., Bindemitteln wie Carboxymethylzellulose, Methylzellulose, Gelatine, Gummi arabicum udgl. und Sprengmitteln wie Calciumcarboxymethylzellulose udgl., falls erforderlich, zu einem aktiven Bestandteil hergestellt werden, um Tabletten, Granulate, feine Granulate udgl. herzustellen, zu welchen weiters ein oder mehrere enterische Basismaterialien zugesetzt werden wie Zelluloseacetatphthalat, Hydroxypropylmethylzellulosephthalat, Hydroxypropylmethylzelluloseacetylsuccinat, Polyvinylalkoholphthalat, Styrol-Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Styrol-Maleinsäure-Copolymer, Methylmethacrylat-Methacrylsäure- Copolymer, Methylacrylat-Methacrylsäure-Copolymer und bei Bedarf ein Färbemittel wie Titanoxid, um beschichtete Präparate herzustellen. Die oben hergestellten enterischen Granulate oder feinen Granulate können eingekapselt werden, um Kapseln herzustellen.
Außerdem können die gemäß einer herkömmlichen Methode hergestellten Kapseln mit den oben erwähnten enterischen Basismaterialien beschichtet werden, um enterische Kapseln herzustellen. In alternativer Weise können enterische Kapseln unter Anwendung einer aus den oben erwähnten enterischen Basismaterialien allein oder im Gemisch mit Gelatine hergestellten Kapsel bereitet werden.
Zäpfchen können durch Zusetzen einer lipophilen Grundlage wie einer halbsynthetischen Grundlage, in der Kakaobutter oder Fettsäuretriglycerid mit Fettsäuremonoglycerid oder Fettsäurediglycerid in unterschiedlichen Verhältnissen vermischt werden, oder von hydrophilen Grundlagen wie Polyethylenglycol und Glycerogelatine udgl. zu einem aktiven Bestandteil, und Auflösen durch Erhitzen, um ein homogenes Gemisch zu ergeben, und anschließendes Gießen des Gemisches in eine Form, um ein Zäpfchen auszubilden, hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden.

BEISPIELE

Beispiel 1

(1) Reinigung von α-Säuren aus Hopfen

Zu 250 g im Handel erhältlichem Hopfen (vertrieben von Rupofresh Co., Inc.) wurden 500 ml Aceton zugesetzt und die Perkolatrier- und Extraktionsvorgänge wurden während einer Stunde insgesamt dreimal wiederholt. Der erhaltene Acetonextrakt wurde unter reduziertem Druck eingeengt, um 50 g schwarzen Sirup zu ergeben. Ein Teil des gebildeten Sirups (17,5 g) wurde in 500 ml 0,5% Essigsäure/80% Methanol gelöst und auf einem anionischen Austauscherharz Dowex-1 (Vernetzungsgrad X4, Teilchengröße 200-400 Mesh, Essigsäuretyp, The Dow Chemical Co.) unter Anwendung einer Kolonne (5 cm Durchmesser · 27,5 cm Länge) bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Minute entwickelt.
Die absorbierten Hopfenextrakte wurden graduell mit einem Gemisch aus Essigsäure und Methanol gemäß der Literatur eluiert (Agric. Biol. Chem., (1985), Bd. 49, S. 399-403) und das Eluat wurde auf Basis des Flüssiggewichts mittels eines Fraktionssammlers zu 10 g-Teilen fraktioniert. Zuerst wurde 1 l 0,5% Essigsäure/80% Methanol und anschließend 2 l 5% Essigsäure/80% Methanol verwendet, um die Eluierung durchzuführen.
Die Entnahme von Proben zu je 10 ul erfolgte aus den Fraktionen mit den Nummern 1-300 dieser zu je 10 g fraktionierten Fraktionen und die Proben wurden über einer dünnen Schicht aus Siliciumdioxidgel (Silicagelplatte Nr. 5715, erhältlich von der Merck AG) verteilt, welche dann mit einem gemischten organischen Lösungsmittel (Ethylacetat : Methanol = 30 : 1) entwickelt wurde. Eine 4%ige methanolische Lösung von Phosphormolybdänsäure (vertrieben von der Merck AG) als Farbreaktionsflüssigkeit für die phenolische Hydroxygruppe wurde über die Silicagelplatte gesprüht, welche dann mit gasförmigem Ammoniak in Kontakt gebracht wurde, um die Färbung zu ergeben. Die α-Säurefraktion wurde gelblich-grün gefärbt und diese Farbreaktion wurde auf die folgende Identifizierung der α-Säurefraktion angewandt.
Die Fraktionen (Fraktionsnummern 232-240) mit einem Gehalt an α-Säure-Fraktionen, welche durch Säulenchromatographie mit Dowex-1 eluiert worden waren, wurden unter Verwendung einer Gelfiltrationschromatographie mit Sephadex LH-20 (5 cm Durchmesser · 39 cm Länge, erhältlich von Pharmacia AB) weiter gereinigt. Jeder 5 g-Teil wurde unter Verwendung von Methanol als Eluierungsmittel durch einen Fraktionensammler fraktioniert. Als Ergebnis wurden α-Säuren aus den Fraktionen mit den Fraktionsnummern 39-60 eluiert, unter reduziertem Druck konzentriert und getrocknet, um 150 mg einer öligen Substanz zu ergeben. Demnach wurden 170 mg α-Säuren als Ausbeute pro 100 g Hopfen ermittelt.

(2) Strukturbestimmung der α-Säuren

Die Strukturuntersuchung der auf diese Weise fraktionierten und gereinigten α-Säuren erfolgte unter Anwendung der Farbreaktion, der Protonen- und ¹³C-Kernmagnetresonanzspektren, des Massenspektrums und des UV-Absorptionsspektrums. Als Ergebnis wurde beobachtet, daß die α-Säurefraktionen vor allem Humulon, weiters Cohumulon und Adhumulon enthalten.

(3) Farbreaktion der α-Säuren unter Verwendung von Eisen(III)chlorid (FeCl&sub3;)

Eine 2%ige FeCl&sub3;-Lösung (vertrieben von Wako Pure Chemicals Ltd.) in Ethanol wurde über die α-Säuren auf der Silicagelplatte aufgesprüht, um einen ähnlich blauschwarzen Ton wie den in der Literatur beschriebenen zu entwickeln (Agric. Biol. Chem., angegebene Stelle).
Demnach stimmte die Färbung der vorliegenden α-Säuren mit der in der Literatur beschriebenen überein.

(4) ¹H-NMR-Spektrum

In Deuteriomethanol wurden 20 mg α-Säuren gelöst und das ¹H- NMR-Spektrum wurde bei 400 MHz gemessen (JEOL Ltd., JNM-GSX400, erhältlich von JEOL Ltd.). Die Ergebnisse sind nachstehend angeführt. TMS wurde als interner Standard verwendet.
¹H-NMR δ (CD&sub3;OD): 0.928 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH&sub3;), 0.950 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH&sub3;), 1.508 (3H, s, CH&sub3;), 1.632 (3H, s, CH&sub3; · 2), 1.704 (3H, s, CH&sub3;), 2.048 (1H, m, J = 6.8 Hz, -CH < ), 2.415 (3H, d, J = 7.2 Hz, -CH&sub2;-), 2.632 (1H, d, J = 6.0 Hz, -CH < ), 2.737 (1H, d, J = 7.6 Hz, -CH < ), 2,924 (1H, d, J = 6.8 Hz, -CH < ), 2.991 (1H, d, J = 7.6 Hz, -CH < ), 5.095 (1H, t, J = 6,8 Hz, -CH =), 5.125 (1H, t, J = 7.2 Hz, -CH=)
Diese Werte stimmen mit jenen des in der Literatur beschriebenen Humulon überein (Wallestein Lab. Commun., (1964), Bd. 27, S.19-28).

(5) ¹³C-NMR-Spektrum

In Deuteriomethanol wurden 20 mg α-Säuren gelöst und das ¹³C- NMR-Spektrum wurde bei 100 MHz gemessen (JEOL Ltd., JNM-GSX400, erhältlich von JEOL Ltd.). Die Ergebnisse sind nachstehend angeführt. TMS wurde als interner Standard verwendet.
¹³C-NMR δ (CD&sub3;OD): 18.063, 18.154, 22.283, 23.315, 23.437, 26.275, 27.702, 36.111, 44.384, 83.819, 104.189, 119.566, 125.971, 130.267, 135.397, 182.574, 193.230, 198.937, 199.544

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum

Eine methanolische Lösung von α-Säuren (10 ul/ml) wurde für das Ultraviolettabsorptionsspektrum gemessen. Die maximale Absorption betrug E (1%, 1cm) 236, 283, 323, welche mit der in der Literatur beschriebenen übereinstimmte (Bull. Soc. Chim. Belg., (1963), Bd. 72, S. 60-68).

(7) Massenspektrum

EIMS m/z: 362 (M&spplus;), 344, 248, 234, 233, 215, 191, 149, 114, 69
Durch die Bestimmungsergebnisse der verschiedenen Spektren in den obenstehenden Punkten 4 - 7 wurde festgestellt, daß die α- Säurefraktion hauptsächlich Humulon, weiters Cohumulon und Adhumulon enthält, welche eine gemeinsame Matrix mit Humulon und niedrigere Alkylgruppen aufweisen, welche von jenen von Humulon verschieden sind.

Beispiel 2

Bestimmung der Wirksamkeit der α-Säuren zur Inhibierung der Knochenresorption

(1) Gewinnung der Zellen

Aus 10 bis 11 Tage alten ICR-Mäusen (erhältlich bei Charles River Inc.) wurden Ober- und Unterschenkel extrahiert, welche dann unter Verwendung von Scheren in ein α-MEM-Medium (vertrieben von Flow Laboratories Inc.) mit einem Gehalt an 5% FBS (vertrieben von Irving Scientific Inc.), 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin zerstückelt wurden. Ferner wurde der gebildete Überstand durch Pipettieren aufgefangen, mit dem Medium gewaschen und dann in 5% FBS, α-MEM-Medium suspendiert, um Osteoblasten enthaltende Knochenzellen zu erhalten. Die auf diese Weise bereitete Knochenzellensuspension wurde in dem Rattennebenschilddrüsenhormon enthaltenden Medium eine Woche lang inkubiert. Nach Abschluß der Inkubation wurden die Zellen unter Verwendung von 0,05% Trypsin EDTA-PBS gewonnen und für den Lochbildungsversuch verwendet.

(2) Assay unter Anwendung des Lochbildungsversuchs

Ein Elfenbeinstück wurde zu einer Dicke von 150 um unter Verwendung eines Präzisionsschneiders mit niedriger Geschwindigkeit (vertrieben von der Buehler GmbH) geschnitten, und anschließend wurden runde Stücke mit einem Durchmesser von 6 mm unter Verwendung einer Einlochzange ausgestanzt. Diese Elfenbeinstücke wurden in 70%igem Ethanol eingetaucht, zweimal je 5 Minuten lang einer Beschallung unterzogen und anschließend dreimal mit sterilem PBS und zweimal mit dem Medium gewaschen. Diese Elfenbeinstücke wurden in eine Kulturplatte mit 96 Vertiefungen (vertrieben von Falcon Inc.) gestellt und 100 l des Arzneimittels in verschiedenen Konzentrationen enthaltenden Mediums wurden zugesetzt. Dann wurden 100 ul der 1 · 10&sup5; der oben hergestellten Knochenzellen enthaltenden Medien in jede Vertiefung zugegeben. Die Inkubation wurde unter 10% CO&sub2; in einem Inkubator bei 37ºC während 2 Tagen durchgeführt. Nach Abschluß der Inkubation wurden die Zellen über dem Elfenbeinstück entfernt, die Absorptionslöcher wurden mit Coomassie Brilliantblau gefärbt und die Zahl der so gebildeten Absorptionslöcher wurde unter dem Mikroskop gezählt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. α-Säuren inhibierten die Knochenresorption in einer von der Dosis abhängigen Weise, wobei die Höchstdosis, bei der eine 50%ige Inhibierung erreicht wurde, (ID&sub5;&sub0;), 1,2 · 10&supmin;&sup9; M betrug. Tabelle 1

Beispiel 3

Assay unter Verwendung des Lochbildungsversuchs durch organosynthetische α-Säure

Organosynthetisches Humulon wurde gemäß Obara, H. et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., Bd.62, S. 3034-3035 (1989), hergestellt. Die Wirksamkeiten des so erhaltenen organosynthetischen Humulons und der in Beispiel 1 erhaltenen α-Säuren zur Inhibierung der Knochenresorption wurden durch den in (2) des Beispiels 2 beschriebenen Versuch ermittelt.
In der Folge wurden die Werte für eine 50 %ige Inhibierung (ID&sub5;&sub0;) bestimmt, wobei beobachtet wurde, daß das organosynthetische Humulon und die α-Säuren aus Beispiel 1 die Knochenresorption in einer niedrigen Konzentration von 1,3 · 10&supmin;&sup7;M bzw. 3,5 · 10&supmin;&sup7;M inhibierten. Andererseits waren die ID&sub5;&sub0;-Werte der in Beispiel 2 hergestellten und während 10 Monaten aufbewahrten α-Säuren 3,5 · 10&supmin;&sup7;M, etwa 300-fach niedriger als der in Beispiel 2 erhaltene Wert. Der Grund für die niedrigere Aktivität des organosynthetischen Humulons kann der niedrigen Stabilität zugeordnet werden.

Claims

1. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche als aktiven Bestandteil eine wirksame Menge einer oder mehrerer Verbindungen, die von der aus Humulon, Cohumulon, Adhumulon, Isohumulon, Isocohumulon und Isoadhumulon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienz umfaßt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Osteoporose.

2. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche Humulon als aktiven Bestandteil umfaßt.

3. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche Cohumulon als aktiven Bestandteil umfaßt.

4. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche Adhumulon als aktiven Bestandteil umfaßt.

5. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche Isohumulon als aktiven Bestandteil umfaßt.

6. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche Isocohumulon als aktiven Bestandteil umfaßt.

7. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche Isoadhumulon als aktiven Bestandteil umfaßt.

8. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche als aktiven Bestandteil ein Gemisch aus Humulon, Cohumulon, Adhumulon, Isohumulon, Isocohumulon und Isoadhumulon umfaßt.

9. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche als aktiven Bestandteil ein Gemisch aus Humulon, Cohumulon, Adhumulon, Isohumulon, Isocohumulon und Isoadhumulon umfaßt, die durch Extraktion aus Hopfen erhältlich sind.

10. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche als aktive Bestandteile Humulon, Cohumulon und Adhumulon umfaßt, die durch Extraktion aus Hopfen erhältlich sind.

11. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche als aktive Bestandteile Isohumulon, Isocohumulon und Isoadhumulon umfaßt, die durch Extraktion aus Hopfen erhältlich sind.