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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine
pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Osteoporose.
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Japan bewegt sich auf eine überalterte Gesellschaft zu,
welche es in der Vergangenheit bisher nicht gegeben hat, und im
Zusammenhang damit wird der Anstieg der Zahl der
Osteoporosepatienten zu einem ernsten Problem. Die gestiegene Zahl der alten
Menschen, welche aufgrund eines Knochenbruchs bettlägerig ist,
erzwingt einen enormen Anstieg der Ausgaben für medizinische
Betreuung.
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Als therapeutisches Mittel für Osteoporose wurden in Japan
Vitamin-D-Präparate, Calcitoninpräparate, Ipriflavonpräparate
und dgl. verwendet. Es wurde jedoch kein Verfahren zur
radikalen Behandlung von Osteoporose gefunden, sondern es kommt in
diesem Stadium nur eine symptomatische Behandlung zur
Anwendung. Osteoporose entwickelt sich, wenn ein Gleichgewicht
zwischen Knochenbildung und Knochenresorption verloren geht, und
es wird daher für möglich gehalten, die Osteoporose durch
Förderung der Knochenbildung oder Inhibierung der
Knochenresorption zu verhindern.
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Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung
einer neuen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von
Osteoporose. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben als
Ergebnis verschiedener Studien die Tatsache gefunden, daß in
Fopfenextrakten enthaltenes Xanthohumol eine stark inhibierende
Wirkung gegenüber einer Knochenresorption aufweist, und diese
Erfindung wurde nun abgeschlossen.
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Hopfenpflanzen (Humulus lupulus L.) waren ursprünglich als
medizinisches Kraut bekannt und werden seit langer Zeit zum
Brauen von Bier verwendet. Man kann daher sagen, daß
Xanthohumol eine ausreichend niedrige Toxizität besitzt.
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Mizobuchi et al. (Rep. Pes. Lab. Kinn Brew. Co., Nr. 28,
1985, S.33-38) beschreiben die antimikrobielle Aktivität von
Xanthohumol gegenüber Trichophyton spp., einem pathogenen Pilz
im Menschen, und Bakterien, beispielsweise Staphylococcus
aureaus, in vitro.
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Die vorliegende Erfindung umfaßt eine pharmazeutische
Zusammensetzung zur Behandlung von Osteoporose, die als wirksamen
Bestandteil Xanthohumol mit der Formel (1) enthält.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben versucht,
ein therapeutisches Mittel gegen osteoporose zu entwickeln und
haben Screening-Tests nach Substanzen zur Inhibierung von
Knochenresorption durchgeführt
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Andererseits wurde bisher über ein weibliches
Sexualhormon, das Östrogen, als einen der
Knochenresorptions-Inhibierungsfaktoren berichtet [Igaku no Ayumi (Journal of Clinical
and Experimental Medicine), (1993), Bd. 165, S. 533] und es
wurde tatsächlich als ein therapeutisches Mittel gegen
Osteoporose in Europa und Nordamerika angewendet. Die Östrogentherapie
kann jedoch Nebenwirkungen einschließlich Hyperplasie der
Gebärmutterschleimhaut, Blutungen, Mastodynien, Fettleibigkeit,
Entstehen von Gebärmutterkrebs und dgl. verursachen und der
Wunsch nach Auffindung einer Verbindung mit einer östrogenen
Aktivität ohne Nebenwirkungen wurde laut. Die Erfinder der
vorliegenden Erfindung haben ihr Augenmerk auf den Bericht
gelenkt, daß die Hopfenextrakte eine östrogene Substanz enthalten
und daß der aktive Bestandteil der Substanz noch nicht
aufgeklärt worden war [Food Cosmet. Toxicol., (1973), Bd. 11, S.597-
603] und sie haben eine Reinigung einer derartigen
Östrogensubstanz und eine Bewertung ihrer
Knochenresorptionsinhibierungsaktivität mit Hilfe eines Lochbildungsassays durchgeführt. Als
Ergebnis wurde gefunden, daß Xanthohumol die Knochenresorption
in einer so niedrigen Konzentration wie bis zu 10&supmin;&sup6;M
inhibiert. Über die Tatsache, daß Xanthohumol eine
Lochbildungs-Inhibierungsaktivität besitzt, war bisher nicht berichtet worden,
sie wurde erstmals durch die vorliegende Erfindung aufgeklärt.
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Zur Identifizierung einer Östrogensubstanz aus den
Hopfenextrakten wurde Phosphormolybdänsäure, ein Farbreagens, das
spezifisch mit Östrogen reagiert [J. Chromatog., (1968), Bd.34,
S.269] als wirksam befunden und dieses Farbreagens wurde daher
als ein Identifizierungsreagens für die östrogene Substanz
verwendet, die grün gefärbt war.
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Xanthohumol kann durch Reinigung aus natürlichen
Hopfenpflanzen und auch durch chemische Synthese gemäß einer
herkömmlichen Methode hergestellt werden.
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Die Dosis bei klinischer Verwendung, obwohl sie in
Abhängigkeit von der Verabreichungsmethode variiert, liegt
üblicherweise im Bereich von 0,1 g - 2 g Xanthohumol für Erwachsene pro
Tag (etwa 1,5 mg-30 mg/kg/Tag). Es kann intravenös,
intramuskulär, oral und intrarektal verabreicht werden. Im Falle
einer intravenösen Verabreichung kann ein intravenöser
Tropfzusätzlich zu einer normalen intravenösen Injektion zur
Anwendung kommen.
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Die Xanthohumol enthaltenden Präparate werden nach einem
herkömmlichen Verfahren hergestellt, wobei übliche Exzipientien
und Additive verwendet werden.
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Injizierbare Präparate können beispielsweise in Form von
injizierbaren Pulvern formuliert werden. In diesem Fall können
die Pulver durch Zusetzen eines oder mehrerer geeigneter
wasserlöslicher Exzipientien wie Mannit, Saccharose, Lactose,
Maltose, Glucose, Fructose und dgl. zu einem aktiven Bestandteil,
Lösen des Gemisches in Wasser, Aufteilen auf Phiolen oder
Ampullen, gefolgt von einem Lyophilisieren und Verschließen,
hergestellt werden.
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Es kann als ein orales Präparat in Form von gewöhnlichen
Tabletten, Kapseln, Granulaten, Feingranulaten oder Pulvern
sowie darmlöslichen Präparaten formuliert werden.
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Darmlösliche Präparate können durch Zusetzen von
Exzipientien wie Mannit, Saccharose, Lactose, Maltose, Stärke,
Kieselsäureanhydrid, Calciumphosphat und dgl., von Gleitmitteln wie
Talk, Magnesiumstearat und dgl., von Bindemitteln wie
Carboxymethylzellulose, Methylzellulose, Gelatine, Gummi arabicum und
dgl. und von Sprengmitteln wie Calciumcarboxymethylzellulose
und dgl., soferne notwendig, zu einem wirksamen Bestandteilzur
Herstellung von Tabletten, Granulaten, Feingranulaten und dgl.,
hergestellt werden, zu welchen weiters eine oder mehrer
darmlösliche Grundstoffe wie Zelluloseacetatphthalat,
Hydroxypropylmethylzellulosephthalat,
Hydroxypropylmethylzelluloseacetylsuccinat,
Polyvinylalkoholphthalat,
Styrol-Maleinsäureanhydridcopolymer, Styrol -Maleinsäurecopolymer,
Methylmethacrylat-Methacrylsäurecopolymer,
Methylacrylat-Methacrylsäurecopolymer und wenn notwendig, ein Färbemittel wie Titanoxid zur
Herstellung von beschichteten Präparaten zugesetzt werden. Die
oben bereiteten darmlöslichen Granulate oder Feingranulate
können eingekapselt werden, um Kapseln herzustellen.
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Außerdem können gemäß einem üblichen Verfahren
hergestellte Kapseln mit den zuvor genannten darmlöslichen Basen
überzogen werden, um darmlösliche Kapseln herzustellen. In
alternativer Weise können darmlösliche Kapseln durch Verwendung
einer Kapsel hergestellt werden, die aus den zuvor genannten
darmlöslichen Basen allein oder im Gemisch mit Gelatine
hergestellt wurden.
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Zäpfchen können durch Zusetzen einer lipophilen Basis wie
einer halbsynthetischen Basis, in der Kakaobutter oder
Fettsäuretriglycerid mit Fettsäuremonoglycerid oder
Fettsäurediglycerid in verschiedenen Verhältnissen gemischt sind, oder einer
hydrophilen Basis wie Polyethylenglycol und Glycerogelatine und
dgl., gelöst durch Erhitzen, zu einem aktiven Bestandteil, um
ein homogenes Gemisch zu ergeben und dann Gießen des Gemisches
in eine Form zur Ausbildung eines Zäpfchens hergestellt werden.
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Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele näher
erläutert werden.
Beispiel 1
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(1) Reinigung von Xanthohumol aus Hopfenpflanzen
Zu 250 g im Handel erhältlichen Hopfenpflanzen (gekauft
von Rupofresh Co., Ixic.) wurden 500 ml Aceton zugesetzt und die
Perkolations- und Extraktionsverfahren während einer Stunde
wurden insgesamt dreimal wiederholt. Der gebildete
Acetonextrakt wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um 50 g
schwarzen Sirup zu ergeben. Ein Teil des gebildeten Sirups
(17,5 g) wurde in 500 ml 0,5 % Essigsäure/80 % Methanol gelöst
und auf einem Anionenaustauschharz Dowex-I(Vernetzungsgrad x 4,
Teilchendurchmesser 37-74 tjm (Teilchengröße 200-400 Maschen),
Essigsäuretyp, The Dow Chemical Co.) unter Verwendung einer
Säule (5 cm Durchmesser x 27,5 cm Länge) mit einer
Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Minute entwickelt.
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Der absorbierte Hopfenextrakt wurde schrittweise gemäß der
Literatur (Agric. Biol. Chem., (1985), Bd. 49, S. 399-403) mit
einem Gemisch aus Essigsäure und Methanol eluiert, und das
Eluat wurde in 10g-Portionen Flüssiggewicht mittels eines
Fraktionssammlers fraktioniert. Zuerst wurden 1 l 0,5 %
Essigsäure/80 % Methanol und anschließend 1 l 5 % Essigsäure/80 %
Methanol am Kopf der Säule zugesetzt, um die unlöslichen
Materialien zu eluieren, und dann wurde Xanthohumol mit 1 l 20 %
Essigsäure/80 % Methanol extrahiert.
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Proben zu je 10 ul wurden aus den Fraktionen Nm. 1-420
jener Fraktionen, die zu je 10 g fraktioniert worden waren,
gezogen und die Proben wurden auf eine Silicageldünnschicht
(Silicagelplatte Nr. 5715, verfügbar von Merck AG) aufgetragen,
welche dann mit einem gemischten organischen Lösungsmittel
(Ethylacetat:Methanol = 30:1) entwickelt wurde. Eine 4 %ige
Methanollösung von Phosphormolybdänsäure (gekauft von Merck AG)
wurde als Farbreaktionsflüssigkeit für die phenolische
Hydroxygruppe auf die Silicagelplatte gesprüht, welche dann mit
gasförmigem Ammoniak in Kontakt gebracht wurde, um die Färbung
durchzuführen. Xanthohumol wurde grün gefärbt und diese
Farbreaktion wurde angewendet, um Xanthohumol über der
Silicagelplatte zu identifizieren.
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Als Ergebnis wurde Xanthohumol in den Fraktionen mit den
Fraktionsnummern 320-400 eluiert, die aus der
Dowex-1-Säulenchromatographie eluiert wurden. Die Fraktionen wurden unter
verringertem Druck konzentriert, um 80 mg einer pulverförmigen
Substanz zu ergeben. Demnach wurden 90,7 mg Xanthohumol als
Ausbeute pro 100 g Hopfen errechnet.
(2) Strukturbestimmung von Xanthohumol
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Die Struktur des so fraktionierten und gereinigten
Xanthohumols wurde mittels Farbreaktion, Protonen- und
¹³C-Kernresonanzspektren, Massenspektrum und Infrarotabsorptionsspektrum
bestimmt.
(3) Farbreaktion von Xanthohumol unter Verwendung von
Eisen(III)chlorid (FeCl&sub3;)
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Ein 2 %iges FeCl&sub3; (gekauft von Wako Pure Chemicals Ltd.)
in Ethanol wurde auf Xanthohumol auf einer Silicagelplatte
aufgesprüht, um einen ähnlich gelben Farbton zu entwickeln, wie er
in der Literatur beschrieben ist (Bull. Soc. Chim. Belg.,
(1957), Bd. 66, 5. 452-457). Demnach stimmt die Färbung des
vorhandenen Xanthohumols mit der in der Literatur beschriebenen
überein.
(4) ¹H-NMR-Spektrum (innerer Standard: TMS)
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¹H-NMR δ (CD&sub3;OD):1,648 (3H,s), 1,755 (3H,s), 3,223 (2H,d),
3,896 (3H,s), 5,196 (1H,t), 6,004 (1H,s), 6,819 (2H,d), 7,493
(2H,d), 7,646(1H,d), 7,799(1H,d)
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Diese Werte stimmen mit den in der Literatur beschriebenen
überein (Arch. Pharm., Weinheim, 1988, Bd. 321, S.37-40).
(5) ¹³C-NMR-Spektrum
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¹³C-NMR δ (CD&sub3;OD): 18,018, 22,465, 26,078, 56,299, 92,289,
106,466, 109,730, 117,107, 124,560, 126,047, 128,582, 131,345,
132,529, 143,291, 161,399, 162,644, 164,981, 166,332, 193,928
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(6) Infrarot-Spektrum (KBr-Methode)
u:3280, 1705,1606, 1541, 1512, 1470, 1439, 1346, 1292, 1227,
1171, 1144, 1103 cm&supmin;¹
(7) Massespektrum
MS(EI)m/z: 354 (M&sbplus;), 339, 311, 299, 234, 219, 205, 191, 179,
177, 153, 147, 120
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Aus den Ergebnissen der Spektren in den obigen Punkten 4-7
wurde die Strukturformel von Xanthohumol als die Struktur der
oben genannten Formel (1) erkannt.
Beispiel 2 Bestimmung der
Knochenresorptionsinhibierungsaktivität von Xanthohumol
(1) Herstellung der Zellen
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Aus 10 bis 11 Tage alten ICR-Mäusen (gekauft von Charles
River Inc.) wurden Ober- und Unterschenkel entnommen, welche
dann unter Verwendung von Scheren in einem a-MEM-Medium
(gekauft von Flow Laboratories Inc.) mit einem Gehalt an 5 %
FBS (gekauft von Irving Scientific Inc.), 100 U/ml Penicillin
und 100 ug/ml Streptomycin zerkleinert wurden. Dann wurde der
entstandene überstand durch Pipettieren gewonnen, mit dem
Medium gewaschen und dann in einem 5 % FBS, a-MEM-Medium zur
Ausbildung von Knochenzellen mit einem Gehalt an Osteodasten
suspendiert. Es wurde dann auf eine Zellenkonzentration von
1x10&sup7;/ml unter Verwendung des Kulturmediums ohne Gehalt an
Rattennebenschilddrüsenhormonen eingestellt.
(2) Versuch uner Verwendung eines Lochbildungsassays
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Ein Elfenbeinstück wurde auf eine Dicke von 150 um unter
Verwendung eines Niedergeschwindigkeitsprazisionsschneiders
(gekauft von Buehler GmbH) geschnitten und anschließend wurden
runde Stücke mit einem Durchmesser von 6 mm unter Verwendung
einer Einlochstanze herausgeschnitten. Diese Elfenbeinstücke
wurden in 70 %iges Ethanol eingetaucht, zweimal einer
Beschallung von je 5 Minuten unterworfen und dann dreimal mit sterilem
PBS und zweimal mit dem Medium gewaschen. Diese Elfenbeinstücke
wurden in eine Kulturschale mit 96 Vertiefungen (gekauft von
Falcon Inc.) eingebracht und 100 ul Medium mit einem Gehalt an
Medikamenten mit verschiedenen Konzentrationen (mit einem
Gehalt an 2x10&supmin;&sup8;M Ratten-Parathyroidhormon) wurden zugesetzt.
Dann wurden 100 ul des die oben hergestellten Knochenzellen
enthaltenden Mediums 1x10&sup6; zu jeder Vertiefung zugegeben. Die
Inkubation wurde bei 37ºC in einem 10 % CO&sub2; Inkubator 3 Tage
lang durchgeführt. Nach Abschluß der Inkubation wurden die
Zellen über dem Elfenbeinstück entfernt, die Absorptionshohlräume
wurden mit Coomassie Brilliant Blau angefärbt und die Zahl der
so geformten Absorptionsvertiefungen wurde unter dem Mikroskop
ausgezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt:
Tabelle 1
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Wie in der obigen Tabelle dargestellt, zeigte Xanthohumol
Inhibierungswerte im Ausmaß von 100 % bei 1x10&supmin;&sup4;M, 93,6 % bei
1x10&supmin;&sup5; M und 34,5 % bei 1x10&supmin;&sup6;M.
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Folglich wurde bestätigt, daß Xanthohumol die
Knochenresorption bei einer so geringen Konzentration wie 10&supmin;&sup6;M
inhibiert.
Abkürzungen:
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ICR-Mäuse Gattungsname von Mäusen, welche durch das
Institute of Cancer Research in den USA
systematisiert worden waren.
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a-MEM alpha-Mindestessentialmedium
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100 U/ml 100 Einheiten/ml
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PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
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Mittel + SD Mittelwert plus Standardabweichung