DE69433301T2

DE69433301T2 - Methoden zur erhöhung der biologischen aktivität von chemokinen

Info

Publication number: DE69433301T2
Application number: DE69433301T
Authority: DE
Inventors: Louis M. Pelus; Pradip Kumar Bhatnagar; Andrew Garrison King; Joanna Maria Balcarek
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-06-08
Filing date: 1994-06-03
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2014-06-04
Also published as: EP1378522A2; JP4006021B2; US20040057925A1; PT713495E; DE69433301D1; EP0713495B1; WO1994029341A1; JPH08511167A; ATE253637T1; US6399053B1; EP1378522A3; DK0713495T3; ES2210255T3; US6080398A; EP0713495A4; EP0713495A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein bestimmte Proteine und Verfahren zur Verbesserung der biologischen Aktivität bestimmter Proteine und insbesondere von Chemokinen.
Hintergrund der Erfindung
Alle Mitglieder der Intercrin- oder Chemokin-Familie sind basische Heparin-bindende Polypeptide, die vier Cystein-Reste aufweisen, die zwei Disulfidbrücken bilden. Alle diese Proteine, die funktionell charakterisiert wurden, scheinen an entzündungsfördernden und/oder restorativen Funktionen beteiligt zu sein. Als solche wird von diesen Molekülen vorhergesehen, daß sie therapeutisches Potential in der Knochmarkstransplantation und in der Behandlung von Infektionen, Krebs, myelopoietischer Dysfunktion, Transplantat-Wirt-Erkrankung und Autoimmunkrankheiten haben.
Die Chemokin-Familie kann in zwei Unterfamilien unterteilt werden, abhängig von ihrer Aminosäuresequenz und ihrem chromosomalen Ort. Die Mitglieder als α-Unterfamilie werden als "C-X-C"-Unterfamilie bezeichnet, weil die ersten zwei Cysteine durch nur eine Aminosäure getrennt sind. Die menschlichen Gene in dieser Unterfamilie schließen IL-8, GRO/MGSA und IP-10 ein; murine Entsprechungen schließen KC und das Makrophagen-Entzündungsprotein 2 (MIP-2) ein. In der Chemokin-β-Unterfamilie sind die ersten zwei Cysteine in einer benachbarten Position (die "C-C"-Unterfamilie). Diese Unterfamilie schließt menschliches MCAF, LD-78, ACT-2 und RANTES ein. Die murinen Entsprechungen sind JE, TCA-3, MIP-1α und MIP-1β [J. J. Oppenheim et al., Annu. Rev. Immunol., 9: 617–648 (1991)].
Das murine KC-Genprodukt [Oquendo et al., J. Biol. Chem., 264: 4233 (1989)] wird durch aus Blutplättchen gewonnenem Wachstumsfaktor (PDGF) induziert, und es wird angenommen, daß dies das murine Homologe des menschlichen MGSA/gro-α-Gens ist (63,0% Aminosäureidentität mit mMIP-2). KC wurde in COS-1-Zellen exprimiert um zu zeigen, daß es ein sezerniertes Protein codiert [Oquendo, loc. cit.].
Zwei Formen von MIP wurden in Kulturen von Makrophagen-Tumorzellen aus der Maus gefunden: MIP-1 und MIP-2. Murines MIP-2 (mMIP-2) ist ein induzierbares Protein, dessen cDNA ebenfalls kloniert und sequenziert wurde [internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 90/02762 (22. März 1990)]. Es wurde gezeigt, daß murines MIP-2 hochwirksame chemotaktische Aktivität für menschliche polymorphonukleäre Leukozyten (PMN) hat und die PMN-Degranulation von Lysozym induziert, aber nicht von β-Glucuronidase [Wolpe et al., J. Exp. Med., 167: 570 (1987)]. Ferner wurde gezeigt, daß mMIP-2 myelopoietische verstärkende Aktivitäten für CFU-GM hat [Broxmeyer et al., J. Exp. Med., 170: 1583 (1989)]. Es wurde gefunden, daß die menschliche Entsprechung dieses Faktors aus zwei Typen besteht, MIP-2α und MIP-2β, die ebenfalls als gro-β bzw. gro-γ bezeichnet werden.
Die cDNA- und Aminosäuresequenzen von menschlichem gro-β werden in der internationalen Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 92/00327 (9. Jan. 1992) bereitgestellt; die cDNA- und Aminosäuresequenzen von menschlichen gro-γ werden in der internationalen Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 92/00326 (9. Jan. 1992) bereitgestellt. Für jede dieser Sequenzen wurde vorhergesagt, daß sie ein reifes Protein mit 73 Aminosäuren codiert.
MGSA oder gro-α [Richmond et al., EMBO J., 7: 2025 (1988)] ist ein autokriner Wachstumsfaktor mit hochwirksamer mitogener Aktivität, der durch menschliche Melanomzellen sezerniert wird und das Produkt des menschlichen gro-Gens ist [Anisowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 7188 (1987)].
Vergleiche in vitro und in vivo eines Granulozyten-chemotaktischen Proteins (GCP-2) aus menschlichen Tumorzellen mit GRO, IP-10 und IL-8 wurden berichtet (Proost et al., J. Immunol. 150 (3), S. 1000-10 (02/1993)). Es wurde gefunden, daß in seiner natürlichen Form isoliertes GCP-2 strukturell mit anderen Mitgliedern der IL-8-Familie verwandt ist. GROa, IP-10 und GCP-2 zeigten eine Heterogenität darin, daß verschiedene Formen jedes Proteins gewonnen wurden, die sich in der Kürzung des Amino-Terminus unterscheiden.
Analoga von IL-8, die NH₂- und COOH-terminale Varianten umfassen, werden berichtet und ihre Aktivitäten mit synthetischem IL-8 voller Länge mit 72 Resten verglichen (Clarke-Lewis et al., J. Biol. Chem., 266(34), 23128-34 (1991)). Es wird angedeutet, daß die COOH-terminale α-Helix wahrscheinlich wichtig zur Stabilisierung der dreidimensionalen Struktur ist, während die NH₂-terminalen Reste 4, 5 und 6 direkt an der Rezeptorbindung beteiligt sind.
Es wurde berichtet, daß Analoga von IL-8, die eine Modifikation der ELR-Sequenz am N-Terminus umfassen, die Wirkung von IL-8 und seinen verwandten chemotaktischen Cytokinen verhindern oder abschwächen (Moser et al., J. Biol. Chem., 268(10), 7125–7128 (1993)).
NH₂-terminale gekürzte Formen von natürlichem IL-8 und βTG wurden auf die Neutrophil-Aktivierung in vitro und in vivo verglichen (Van Damme et al., Eur. J. Immunol., 20, 2113–2118 (1990)). Es wurde gefolgert, daß βTG, das mit IL-8 strukturell verwandt ist, ebenfalls eine Rolle in der Neutrophilaktivierung während entzündlicher Reaktionen spielen kann.
EP 0 408 371 (SmithKline Beecham Corporation) offenbart Peptide zur Verwendung in der Stimulierung von Hämatopoiese und in der Behandlung bakterieller, viraler und pilzlicher Erkrankungen.
Es besteht ein Bedarf auf diesem Gebiet an Verfahren zur Steigerung der Bioaktivität dieser reifen Proteine, um ihre effiziente Verwendung als therapeutische oder pharmazeutische Produkte zu ermöglichen, und um die zur Erzeugung einer therapeutischen Wirkung erforderlichen Mengen der Proteine zu minimieren, um dadurch die Toxizität zu verringern.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein modifiziertes Chemokin bereit, das KC-Proteine, gro-β und gro-γ einschließt, wobei das modifizierte Protein durch eine Kürzung von zwischen ca. 2 bis ca. 8 Aminosäuren am Aminoterminus des reifen Proteins und durch eine um wenigstens eine Größenordnung höhere biologische Aktivität als das reife Protein gekennzeichnet ist.
In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein multimeres Protein bereit, das eine Assoziation aus zwei oder mehreren modifizierten Proteinen dieser Erfindung umfaßt. Diese Multimere enthalten bevorzugt mehrfache Kopien des gleichen modifizierten Proteins, z. B. ein Dimer aus gekürztem KC-Protein. Jedoch sind multimere Formen aus zwei oder mehreren unterschiedlichen modifizierten Proteinen dieser Erfindung ebenfalls in dieser Erfindung eingeschlossen. Multimere Formen aus einem modifizierten Protein dieser Erfindung und einem anderen bekannten reifen Protein sind ebenfalls von dieser Erfindung umfaßt.
In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die die modifizierten und multimeren Proteine der Erfindung enthalten, sowie Verfahren zur Verabreichung derselben in therapeutischen Behandlungen.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind ferner in der folgenden ausführlichen Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die veröffentlichte Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 1] des reifen, nativen murinen KC-Proteins bereit.
2 stellt die veröffentlichte Aminosäuresequenz [SEQ iD NO: 2] des reifen, humanen gro-alpha-Proteins bereit.
3 stellt die veröffentlichte Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 3] des reifen, humanen gro-β-Proteins bereit.
4 stellt die veröffentlichte Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 4] des reifen, humanen gro-γ-Proteins bereit.
5 ist eine DNA-Karte des Plasmids peal-mkc38(–4), das nachfolgend im Beispiel 2 beschrieben wird.
6 ist eine DNA-Karte des Plasmids peal-hgroß(–4), das nachfolgend im Beispiel 6 beschrieben wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt modifizierte Proteine, spezifisch Chemokine, die mit Entzündungsreaktionen, Hämatopoiese und Myelopoiese verbunden sind, bereit, wobei die modifizierten Proteine dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine erhöhte biologische Aktivität im Vergleich zu den entsprechenden unmodifizierten oder ungekürzten reifen nativen Proteinen haben.
Wie hier definiert bezeichnet "hämopoietischer synergistischer Faktor" oder "HSF" eine Klasse von Proteinen, einschließlich der natürlich vorkommenden Chemokine und der modifizierten Chemokine der Erfindung, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine synergistische Aktivität in der Stimulierung von Hämatopoiese haben, wenn sie in vivo und in vitro mit einem anderen hämopoietischen Faktor verabreicht werden, wie mit einem Kolonie-stimulierenden Faktor (siehe Beispiel 8), oder wenn sie mit natürlich im Kreislauf vorkommenden CSFs kombiniert werden. Der Begriff "Chemokine", ebenfalls bekannt als "Intercrine", schließt u. a. die Proteine ein, die auf diesem Gebiet herkömmlich als KC-Protein, gro-β, gro-α und gro-γ bezeichnet werden, alle mit Säugetierursprung. Die Aminosäuresequenzen von vier der oben identifizierten reifen Chemokine [SEQ ID NOS: 1–4] sind hier in den 1 bis 4 veranschaulicht. Ebenfalls eingeschlossen in dieser Definition sind Analoga oder Derivate dieser Proteine, die die biologische Aktivität des reifen Proteins teilen.
Wie hier definiert, schließen solche Analoga und Derivate modifizierte Proteine ein, die ebenfalls durch Veränderungen gekennzeichnet sind, die in der bekannten Aminosäuresequenz reifer Proteine vorgenommen werden, z. B. die in SEQ ID NOS: 1–4 bereitgestellten Proteine. Solche Analoga sind dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aminosäuresequenz haben, die sich von der des reifen Proteins um 8 oder weniger Aminosäure-Reste und bevorzugt um ca. 5 oder weniger Aminosäure-Reste unterscheidet. Es kann bevorzugt sein, daß etwaige Unterschiede in den Aminosäuresequenzen der Proteine nur konservative Aminosäuresubstitutionen beinhalten. Konservative Aminosäuresubstitutionen treten auf, wenn eine Aminosäure im wesentlichen die gleiche Ladung wie die Aminosäure hat, für die sie substituiert wird, und die Substitution keine signifikante Wirkung auf die lokale Konformation des Proteins oder seine biologische Aktivität hat. Alternativ können Veränderungen wie die Eliminierung oder Einführung einer bestimmten Aminosäure in die Sequenz bevorzugt sein, die die Stabilität des Proteins verändern können oder seine Expression in einer gewünschten Wirtszelle erlauben.
Hier verwendet bezeichnet "erhöhte biologische Aktivität" eine biologische Aktivität, die wenigstens um eine Größenordnung höher, d. h. 10-mal oder 10-fach, als diejeniger ist, die im reifen Protein voller Länge im HSF-Test aus Beispiel 8 beobachtet wird. Zusätzlich bezeichnet dieser Begriff biologische Aktivitäten, die nicht charakteristisch für das reife Protein sind, z. B. kann das reife Protein voller Länge wie bei KC inaktiv sein, während das modifizierte Protein eine signifikante Aktivität besitzt.
Die vorliegende Erfindung stellt modifizierte Desaminochemokine bereit. Der Begriff "Desamino" wird verwendet, um Chemokine oder Proteine der Erfindung anzuzeigen, die so modifiziert wurden, daß inzwischen ca. 2 bis ca. 8 und bevorzugt ca. 5 bis ca. 8 Aminosäuren vom Aminoterminus des reifen Proteins entfernt wurden. Optional können die Desaminochemokine der Erfindung, insbesondere bei rekombinanter Expression, eine inseriertes N-terminales Met enthalten. Während der Expression durch die Wirtszelle kann dieses optionale Met abgespalten werden. Alternativ kann diese Aminosäure, falls gewünscht, durch Enzymverdauung oder andere bekannte Mittel abgespalten werden.
In einer Ausführungsform dieses Aspekts stellt die vorliegende Erfindung ein Desamino-KC-Protein bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen gekürzten Amino- (oder N-) Terminus im Vergleich zum reifen KC-Protein hat. Das modifizierte Protein kann an einer Position zwischen den Aminosäure-Resten #2 bis #8 des reifen KC-Proteins aus 1 [SEQ ID NO: 1] gekürzt sein. Bevorzugt enthält dieses Desamino-KC Aminosäuren 5–72 des reifen KC-Proteins aus SEQ ID NO: 1; d. h. die ersten vier Aminosäure-Reste des Aminoterminus des dargestellten KC-Proteins fehlen in diesem Protein.
Überraschend haben die Erfinder gefunden, daß dieses Desamino-KC dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Bioaktivität im hämopoietischen synergistischen Faktor-Test (siehe Beispiel 8) von wenigstens 10¹⁴ Einheiten/mg im Gegensatz zum unmodifizierten, reifen KC voller Länge [SEQ ID NO: 1] hat, das inaktiv ist (^–0 Einheiten/mg). Es wird erwartet, daß dieses modifizierte Chemokin bei Reinigung durch eine noch höhere Bioaktivität charakterisiert sein wird. Die Konstruktion, Synthese und der Test des Desamino-KC werden im Detail in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Ein anderes modifiziertes Chemokin, das in der vorliegenden Erfindung enthalten ist, ist ein Desamino-gro-β-Protein (ebenfalls bekannt als MIP-2α). Dieses Protein umfaßt die Aminosäuresequenz von reifem gro-β-Protein, gekürzt an seinem N-Terminus zwischen den Aminosäurepositionen 2 und 8 aus 3 [SEQ ID NO: 3]. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Desaminoprotein der Erfindung eine Proteinsequenz, die die Aminosäuren 5 bis 73 des reifen gro-β aus SEQ ID NO: 3 umspannt.
Die Erfinder haben überraschend gefunden, daß dieses Desamino-gro-β dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine um wenigstens zwei Größenordnungen höhere biologische Aktivität als unmodifiziertes, humanes gro-β voller Länge hat.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Desamino-gro-γ-Protein (ebenfalls bekannt als MIP-2β). Dieses Protein umfaßt die Aminosäuresequenz von reifem gro-γ-Protein, gekürzt an seinem N-Terminus zwischen den Aminosäurepositionen 2 und 8 aus SEQ ID NO: 4. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das modifizierte Protein der Erfindung eine Proteinsequenz, die die Aminosäuren 5 bis 73 des reifen gro-γ [SEQ ID NO: 4] umspannt. Die Erfinder haben gefunden, daß dieses Desaminogro-γ eine um wenigstens zwei Größenordnungen größere Bioaktivität im Test aus Beispiel 8 als das reife gro-γ voller Länge hat. Es wird erwartet, daß bei weiterer Reinigung eine noch größere Bioaktivität beobachtet werden wird.
Es wird erwartet, daß andere Desamino- und Descarboxychemokine ebenfalls gesteigerte biologische Aktivität im Vergleich zu den entsprechenden unveränderten reifen Chemokinen aufweisen können. Beispiele für solche Chemokine schließen die α-Unterfamilie der Chemokine wie IL-8/NAP-1, PF-4 und IP-10, die β-Unterfamilie der Chemokine wie MCAF/MCP-1, LD-78, PAT464, GOS19-1, ACT-2, PAT744/G26, RANTES, I-309, und die oben beschriebenen Proteine ein. Diese Proteine werden alle in der Literatur beschrieben und sind den Fachleuten bekannt.
Wie nachfolgend im größeren Detail beschrieben wird, schließen außerdem modifizierte Proteine dieser Erfindung multimere Formen der modifizierten und/oder gekürzten Proteine ein, z. B. Dimere, Trimere, Tetramere und andere aggregierte Formen. Solche multimeren Formen können durch Synthese oder rekombinante Expression hergestellt werden und können Chemokine enthalten, die durch eine Kombination aus synthetischen und rekombinanten Techniken erzeugt werden, wie nachfolgend genau beschrieben wird. Multimere können sich bei Expression natürlich bilden oder können zu solchen multimeren Formen konstruiert werden.
Es wird erwartet, daß multimere Formen der modifizierten Chemokine dieser Erfindung Multimere der gleichen modifizierten Chemokine einschließen können. Ein anderes Multimer dieser Erfindung wird durch die Aggregation unterschiedlicher modifizierter Proteine gebildet. Noch ein anderes Multimer dieser Erfindung wird durch die Aggregation eines modifizierten Chemokins dieser Erfindung und eines bekannten, reifen Chemokins voller Länge gebildet.
Bevorzugt würde ein Dimer oder Multimer der Erfindung wenigstens eines der Descarboxy- oder Desaminochemokin-Proteine der Erfindung und wenigstens ein anderes Chemokin oder ein anderes Protein enthalten, das durch den gleichen Typ biologischer Aktivität gekennzeichnet ist. Dieses andere Protein kann ein zusätzliches Desamino- oder Descarobxychemokin oder ein anderes bekanntes Protein sein.
Z. B. umfaßt ein wünschenswertes Dimer der Erfindung zwei Desamino-KC-Proteine der Erfindung. Andere wünschenswerte Dimere der Erfindung sind zwei Descarboxy-KC-Proteine der Erfindung, ein Desamino-KC und ein Descarboxy-KC der Erfindung oder zwei Desamino-gro-R-Proteine der Erfindung. Alternativ kann ein anderes Dimer der Erfindung ein Desamino-KC-Protein der Erfindung oder ein Descarboxy-KC-Protein der Erfindung in Kombination mit einem unmodifizierten reifen KC-Protein sein. In ähnlicher Weise können solche Kombinationen von Dimeren mit dem Descarboxy-gro-α-, -gro-β, -gro-γ oder anderen Chemokinen dieser Erfindung gebildet werden. z. B. kann ein Desamino-gro-R-Protein der Erfindung ein Dimer mit einem unmodifizierten reifen gro-β-Protein der Erfindung bilden. Ein Fachmann kann andere wünschenswerte Multimere unter Verwendung der modifizierten Chemokine der Erfindung erhalten.
Die Multimere sowie die anderen modifizierten Proteine dieser Erfindung sind durch eine erhöhte biologische Aktivität im Gegensatz zu den bekannten reifen Proteinen gekennzeichnet. Eine erhöhte biologische Aktivität stellt einen klaren Vorteil für die therapeutische Verwendung bereit, d. h. daß weniger des Proteintherapeutikums verabreicht werden muß, um ein gewünschtes therapeutisches Ergebnis zu erhalten. Eine solche niedrigere Dosis kann in einer geringeren Toxizität und geringeren Kosten resultieren.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der biologischen Aktivität eines ausgewählten Chemokins bereit, z. B. KC, gro-β und gro-γ. Dieses Verfahren beinhaltet das Modifizieren von nativ oder rekombinant hergestellten reifen Chemokinen wie hier beschrieben. Dieses Verfahren kann ebenfalls das Herstellen multimerer Aggregtionen davon beinhalten. Gemäß einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens können die modifizierten Proteine oder Multimere wie nachfolgend beschrieben synthetisiert werden.
Vorteilhaft beinhaltet dieses Verfahren das Herstellen der Desamin- und Descarboxychemokine der Erfindung unter Befolgen bekannter Techniken. Z. B. werden diese Peptide durch die Festphasentechnik von Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1964), hergestellt, oder fachbekannte Lösungsverfahren können erfolgreich eingesetzt werden. Die Verfahren der Peptidsynthese, die allgemein dargestellt werden in J. M. Stewart und J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984) oder M. Bodansky, Y. A. Klauser und M. A. Ondetti, "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1976), können zur Herstellung der Peptide dieser Erfindung verwendet werden.
Jede Aminosäure oder jedes Peptid wird geeignet geschützt, wie es auf dem Peptidgebiet bekannt ist. Z. B. sind die α-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Gruppe (Fmoc) oder t-Butoxycarbonyl-Gruppe (t-Boc) bevorzugt zum Schutz der Amino-Gruppe, speziell in der α-Position. Eine geeignet substituierte Carbobenzoxy-Gruppe kann für die ε-Amino-Gruppe von Lysin verwendet werden und eine Benzyl-Gruppe für die β- und γ-Carboxy-Gruppen von Asp bzw. Glu. Eine geeignete Substitution der Carbobenzoxy-Schutzgruppe ist die ortho-und/oder para-Substitution mit Chlor, Brom, Nitro oder Methyl und wird zur Modifizierung der Reaktivität der Schutzgruppe verwendet. Außer der t-Boc-Gruppe sind die Schutzgruppen am zweckmäßigsten diejenigen, die nicht durch milde Säurebehandlung entfernt werden. Diese Schutzgruppen werden durch solche Verfahren wie die katalytische Hydrierung, Natrium in flüssigem Ammoniak oder HF-Behandlung entfernt, wie es fachbekannt ist.
Falls Festphasen-Syntheseverfahren verwendet werden, wird das Peptid sequenziell aufgebaut, ausgehend vom Carboxy-Terminus und unter Hinarbeitung auf den Amino-Terminus des Peptids. Die Festphasensynthese wird durch kovalentes Anbinden des C-Terminus einer geschützten Aminosäure an ein geeignetes Harz begonnen, wie Benzhydrylaminharz (BHA), Methylbenzhydrylaminharz (MBHA) oder Chlormethylharz (CMR), wie es allgemein in US-PS 4 244 964 angegeben wird, oder Phenylacetamidomethylharz (PAM). Ein BHAoder MBHA-Trägerharz wird verwendet, falls der Carboxy-Terminus des Produktpeptids ein Carboxamid sein soll. ACMR- oder PAM-Harz wird allgemein verwendet, falls der Carboxy-Terminus des Produktpeptids eine Carboxy-Gruppe sein soll, obwohl dies ebenfalls verwendet werden kann, um ein Carboxamid oder einen Ester herzustellen.
Die Schutzgruppe an der α-Aminogruppe wird durch milde Säurebehandlung (d. h. Trifluoressigsäure) entfernt. Geeignete Entschützungs-, Neutralisation- und Kupplungskreisläufe, die fachbekannt sind, werden verwendet, um sequenziell Aminosäuren ohne Isolierung der Zwischenstufe anzufügen, bis das gewünschte Peptid gebildet ist. Das fertige Peptid kann dann in beliebiger Reihenfolge entblockt und/oder vom Trägerharz abgespalten werden.
Die Behandlung eines harzgeträgerten Peptids mit HF oder HBr/Essigsäure spaltet das Peptid vom Harz und erzeugt die Carboxyterminale Aminosäure als Carbonsäure oder Carboxamid.
Falls ein Ester gewünscht wird, kann das CMR- oder PAM-Harz mit einem geeigneten Alkohol wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl- oder Benzylalkohol in Gegenwart von Triethylamin behandelt werden, um das Peptid vom Harz abzuspalten und den Ester direkt zu erzeugen.
Ester der Peptide dieser Erfindung können ebenfalls durch herkömmliche Verfahren aus der Carbonsäure-Vorstufe hergestellt werden. Typischerweise wird die Carbonsäure mit einem Alkohol in Gegenwart eines Säurekatalysators behandelt. Alternativ kann die Carbonsäure zu einer aktivierten Acyl-Zwischenstufe wie einem Säurehalogenid umgewandelt und mit einem Alkohol behandelt werden, bevorzugt in Gegenwart einer Base.
Das bevorzugte Verfahren zum Abspalten eines Peptids vom Trägerharz ist die Behandlung des harzgeträgerten Peptids mit wasserfreiem HF in Gegenwart eines geeigneten Kationenfängers wie Anisol oder Dimethoxybenzol.
Dieses Verfahren entfernt gleichzeitig alle Schutzgruppen, ausgenommen eine Schwefel schützende Thioalkyl-Gruppe, und spaltet das Peptid vom Harz. Auf diese Weise von den CMR- und Pam-Harzen hydrolysierte Peptide sind Carbonsäuren, die vom BHA-Harz abgespaltenen werden als Carboxamide erhalten.
Die Modifikation der terminalen Amino-Gruppe des Peptids wird durch Alkylierung oder Acylierung durch allgemein fachbekannte Verfahren erreicht. Diese Modifikationen können an der Aminosäure vor dem Einfügen in das Peptid oder am Peptid durchgeführt werden, nachdem es synthetisiert und die terminale Amino-Gruppe freigesetzt wurde, aber vor der Entfernung der Schutzgruppen.
Typischerweise wird die Acylierung an der freien Amino-Gruppe unter Verwendung des Acylhalogenids, Anhydrids oder aktivierten Esters der entsprechenden Alkyl- oder Arylsäure in Gegenwart eines tertiären Amins durchgeführt. Die Monoalkylierung wird am zweckmäßigsten durch reduktive Alkylierung der Amino-Gruppe mit einem geeigneten aliphatischen Aldehyd oder Keton in Gegenwart eines milden Reduktionsmittel wie Lithium- oder Natriumcyanoborhydrid durchgeführt. Die Dialkylierung kann durch Behandeln der Amino-Gruppe mit einem Überschuß eines Alkylhalogenids in Gegenwart einer Base durchgeführt werden.
Die Lösungssythese von Peptiden wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren erreicht, die für Amid-Bindungen verwendet werden. Typischerweise wird eine geschützte t-Boc-Aminosäure, die eine freie Carboxyl-Gruppe hat, mit einer geschützten Aminosäure, die eine freie Aminosäure-Gruppe hat, unter Verwendung eines geeigneten Kupplungsmittels wie N,N'-Dicyclohexylcarbodümid (DCC) gekuppelt, gegebenenfalls in Gegenwart von Katalysatoren wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) oder Dimethylaminopyridin (DMAP). Andere Verfahren wie die Bildung aktivierter Ester, Anhydride oder Säurehalogenide der freien Carboxyl-Gruppe einer geschützten t-Boc-Aminosäure und die anschließende Reaktion mit dem freien Amin einer geschützten Aminosäure, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, sind ebenfalls geeignet. z. B. wird eine geschützt Boc-Aminosäure oder ein solches Peptid in einem wasserfreien Lösungsmittel wie Methylenchlorid oder Tetrahydrofuran (THF) in Gegenwart einer Base wie N-Methylmorpholin, DMAP (Dimethylaminopyridin) oder eines Trialkylamins mit Isobutylchlorformiat behandelt, um das "aktivierte Anhydrid" zu bilden, das anschließend mit dem freien Amin einer anderen geschützten Aminosäure oder eines Peptids umgesetzt wird. Das durch diese Verfahren gebildete Peptid kann selektiv unter Verwendung herkömmlicher Techniken am Amino- oder Carboxyterminus entschützt und an andere Peptide oder Aminosäuren unter Verwendung ähnlicher Techniken gekuppelt werden. Nachdem das Peptid vervollständigt wurde, können die Schutzgruppen wie zuvor beschrieben entfernt werden, wie durch Hydrierung in Gegenwart eines Palladium- oder Platinkatalysators, Behandlung mit Natrium und flüssigem Ammoniak, Fluorwasserstoffsäure oder Alkali.
Falls das fertige Peptid nach dem Entschützen eine basische Gruppe enthält, kann ein Säureadditionssalz hergestellt werden. Säureadditionssalze der Peptide werden in einer standardmäßige Weise in einem geeigneten Lösungsmittel aus der Stammverbindung und einem schwachen Überschuß einer Säure wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure oder Methansulfonsäure hergestellt. Die Acetatsalzform ist besonders nützlich. Falls das fertige Peptid eine saure Gruppe enthält, können kationische Salze hergestellt werden. Typischerweise wird die Stammverbindung mit einem schwachen Überschuß eines alkalischen Reagens wie mit einem Hydroxid, Carbonat oder Alkoxid, das das geeignete Kation enthält, behandelt. Kationen wie Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺ und NH₄ ⁺ sind Beispiele für Kationen, die in pharmazeutisch akzeptablen Salzen vorhanden sind. Na⁺ und NH₄ ⁺ sind besonders bevorzugt.
Jedoch werden in einem bevorzugten Verfahren reife Chemokine voller Länge mit einem geeigneten Enzym verdaut, um die modifizierten Proteine der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Derzeit ist das bevorzugte Enzym DPP-IV, das kommerziell von Enzyme Products Systems, Inc. erhältlich ist.
Die Desamino- und Descarboxychemokine dieser Erfindung können ebenfalls durch andere, den Fachleuten bekannte Techniken hergestellt werden, z. B. durch Gentechnik. Siehe z. B. Sambrook et al. in "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). Systeme zum Klonieren und zur Expression eines ausgewählten Proteins in einem gewünschten Mikroorganismus oder einer gewünschten Zelle, einschließlich z. B. E. coli, Bacillus, Stroptomyces, Säugetier-, Insekten- und Hefezellen, sind bekannt und aus privaten und öffentlichen Laboratorien und Hinterlegungsstellen und von gewerblichen Anbietern erhältlich.
Derzeit ist das am meisten bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Descarboxy- und Desaminochemokine der Erfindung durch die direkte rekombinante Expression des modifizierten Chemokins. Z. B. kann das murine Descarboxy- oder Desamino-KC-Protein rekombinant durch Inserieren seiner codierenden DNA-Sequenz in einen herkömmlichen Plasmidexpressionsvektor unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen rekombinant exprimiert werden, die die Replikation und Expression des Proteins in einer ausgewählten Wirtszelle ausrichten können. Siehe z.B, die Beschreibung in den nachfolgenden Beispielen 2 und 3.
Die rekombinante Expression von Desamino- und/oder Descarboxy-gro-β und -gro-γ kann unter Verwendung analoger Techniken erhalten werden. Unter den bevorzugten Expressionssystemen für diese Chemokine sind ebenfalls eukaryotische Zellen eingeschlossen, einschließlich Insekten- und Hefezellen. Jedoch ist das am meisten bevorzugte Expressionssystem wie bei KC ein bakterielles System. Weil nicht angenommen wird, daß diese Proteine glycosyliert sind, scheint es keine Konformationsprobleme zu geben, die mit der Translation und Expression in Bakterien verbunden sind.
Die modifizierten Chemokine der Erfindung, die in der Zelle erzeugt oder in das Medium sezerniert werden, können dann daraus unter Verwendung herkömmlicher Techniken wie Zellyse und Zellchromatographie gereinigt werden.
Wünschenswert kombinieren diese Desamino- und Descarboxychemokine der Erfindung, einschließlich derjenigen, die in monomerer Form synthetisch erzeugt wurden, natürlich zu Dimeren, Trimeren und anderen Aggregaten. z. B. kann ein monomeres Descarboxy-KC-Protein der Erfindung in einer ausgewählten Wirtszelle coexprimiert werden, die mit einem oder mehreren Vektoren cotransfiziert wurde, die die codierenden Sequenzen des modifizierten Chemokins der Erfindung enthalten. Alternativ können zwei oder mehr Kopien des monomeren Descarboxy-KC-Proteins der Erfindung auf einem einzelnen Vektor sein oder in ein Cromosom einer Wirtszelle eingefügt werden. Bevorzugt ist diese Wirtszelle bakteriell oder aus einem Säugetier.
Somit kann als eine weitere Ausführungsform der Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die die modifizierten Chemokine der Erfindung codiert, herkömmlich erhalten oder durch einen Fachmann mit dem Wissen der Aminosäuresequenzen der Chemokine konstruiert werden. Solche Nukleinsäuresequenzen können mit bevorzugten Codonen für das ausgewählte Expressionssystem, z. B. bakteriell, Hefe, etc., konstruiert werden. In ähnlicher Weise können die Nukleotidsequenzen, die die Expressionsplasmide codieren, herkömmlich in Abhängigkeit von der Selektion des Plasmids und der Selektion des darin zu exprimierenden modifizierten Chemokin-Proteins erhalten werden. Die Nukleotidsequenzen, die diese Proteine codieren, können ebenfalls ein optionales Met-Startcodon enthalten.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die nützlich in der Behandlung von Entzündung, Fieber, viralen, pilzlichen und bakteriellen Infektionen, Krebs, myelopoietischer Dysfunktion, Hämatopoiese-Störungen und Autoimmunerkrankungen sind. Diese Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Menge eines modifizierten Chemokins dieser Erfindung und einen akzeptablen pharmazeutischen Träger. Wie hier verwendet schließt der Begriff "pharmazeutisch" Veterinäranwendungen der Erfindung ein.
Modifizierte Chemokine der Erfindung zur therapeutischen Verwendung schließen ohne Beschränkung ein Desamino-KC, ein Descarboxy-KC, ein Desamin-gro-β oder -gro-γ oder ein Descarboxy-gro-β oder -gro-γ, sie enthaltene Multimere und Kombinationen daraus ein.
Die modifizierten Chemokine der Erfindung können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert und in der gleichen Weise wie für die reifen Proteine beschrieben verabreicht werden [siehe z. B. internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 90/02762 (22. März 1990)]. Der Unterschied in der Zubereitung und Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung liegt in der Fähigkeit, geringere Mengen von Protein bereitzustellen, um die gleiche therapeutische Wirkung zu erreichen, für die das reife Protein verwendet wird. Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" bezeichnet die Menge eines modifizierten Chemokins, ob in monomerer oder bevorzugt multimerer Form, die nützlich zur Linderung eines ausgewählten Zustandes ist.
Allgemein wird ein Desamino- oder Descarboxychemokin der Erfindung in einer Menge von ca. 0,01 ng/kg Körpergewicht bis ca. 1 g/kg und bevorzugt ca. 0,01 ng/kg bis 100 μg/kg pro Dosis verabreicht. Bevorzugt werden diese pharmazeutischen Zusammensetzungen an menschliche oder andere Säugetier-Patienten durch Injektion verabreicht. Jedoch kann die Verabreichung auf jedem geeigneten internen Weg erfolgen und kann nach Bedarf wiederholt werden, z. B. ein- bis dreimal täglich für einen Tag bis ca. 3 Wochen.
Geeignete pharmazeutische Träger sind den Fachleuten allgemein bekannt und können leicht ausgewählt werden. Derzeit ist der bevorzugte Träger Kochsalzlösung. Gegebenenfalls können die pharmazeutischen Objekte der Erfindung andere aktive Bestandteile enthalten oder in Verbindung mit anderen Therapeutika verabreicht werden. Geeignete optionale Bestandteile oder andere Therapeutika schließen diejenigen ein, die herkömmlich zur Behandlung von Zuständen dieser Natur sind, z. B. andere entzündungshemmende Mittel, Diuretika und Immunsuppressiva neben anderen. Wünschenswert sind diese modifizierten Chemokine der Erfindung besonders gut geeignet zur Verabreichung in Verbindung mit Kolonie-stimulierendem Faktor.
Daher stellt die Erfindung ebenfalls verbesserte Verfahren der Behandlung von Entzündung, Autoimmunstörungen und Zuständen bereit, die durch eine geringe Produktion und/oder Differenzierung von hämatopoietischen und/oder Knochenmarkzellen gekennzeichnet sind. Dieses Verfahren beinhaltet das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung an ein ausgewähltes Säugetier. Bevorzugt wird diese Zusammensetzung zusammen mit einem Kolonie-stimulierenden Faktor verabreicht oder enthält diesen. Geeignete Quellen für Kolonie-stimulierenden Faktor sind allgemein bekannt und schließen z. B. natürlichen, synthetischen und rekombinanten GM-CSF, M-CSF, G-CSF und IL-3 ein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann ein Descarboxy- oder Desaminochemokin der Erfindung in vivo verabreicht und in Synergie mit den natürlichen Koloniestimulierenden Faktoren wirken gelassen werden, die in einem ausgewählten Patient gefunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Descarboxy- und Desaminochemokine der Erfindung besonders gut geeignet zur internen Verwendung in Verbindung mit GM-CSF, eine anerkannte Behandlung für solche Zustände, die unglücklicherweise äußerst toxisch ist. Die Verwendung eines modifizierten Chemokins der Erfindung wie Desamino-gro-β in Kombination mit CSF, wobei eine Synergie dieser Kombination beobachtet wurde, erlaubt die Verabreichung niedrigerer Dosen von CSF an einen Patienten, was zu einer geringeren Toxizität des GM-CSF führt.
Ebenfalls eingeschlossen in dieser Erfindung sind pharmazeutisch akzeptable Salzkomplexe der Verbindungen dieser Erfindung. Es sollte in Formel (I) bemerkt werden, daß A die terminale Amino-Gruppe des Aminosäure-Restes umfaßt, entsprechend Pyroglutaminsäure, Prolin, Glutamin, Tyrosin oder Glutaminsäure. In ähnlicher Weise umfaßt D die terminale Carboxyl-Gruppe der Aminosäure.
Die folgenden Beispiele erläutern die bevorzugten Verfahren zur Herstellung der modifizierten und gekürzten Chemokine der Erfindung. Ebenfalls bereitgestellt werden Vergleichsbeispiele, die die erhöhte Bioaktivität dieser Chemokine im Vergleich mit den Chemokinen zeigen, aus denen sie abgeleitet werden. Diese Beispiele sind nur zur Erläuterung und beschränken nicht den Umfang der Erfindung.
Beispiel 1 – Synthese von Desamino-KC
Es folgt das Verfahren, das zur Synthese von modifiziertem murinem KC-Protein, Aminosäuresequenz #5-72 des reifen KC-Proteins aus SEQ ID NO: 1, verwendet wurde.
Die KC-Proteinsequenz wurde unter Verwendung von Festphasenverfahren synthetisiert, die an einen vollautomatisierten Protein-Syntheseautomaten (Applied Biosystems Model 430 A) angepaßt waren. Boc-Lys(Cl-Z)-PAM-Harz (0,75 g, 0,5 mmol) wurde in ein Reaktionsgefäß gefüllt, und das Zielprotein wurde gemäß vom Hersteller vorgeschlagenen Protokollen unter Verwendung von 2 mmol jeder Na-t-Boc-Aminosäure synthetisiert. Jede Kupplungsreaktion wurde zweimal durchgeführt, gefolgt von N-Verkappen mit Essigsäureanhydrid. Sterisch gehinderte Reste wurden ein drittes Mal gekuppelt. Die folgenden Seitenketten-Schutzgruppen wurden verwendet: Benzyl (Thr, Ser); 4-Methylbenzyl (Cys); Toluolsulfonyl (Arg); 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (Lys); Dinitrophenyl (His); Cyclohexyl (Asp, Glu). Die Kupplungsausbeuten bestimmter schwieriger Sequenzen wurden durch den Kaiser-Test überwacht. Nach Beendigung der Synthese wurde der Proteinrest mit DCM gewaschen und getrocknet.
Ein Teil des Proteinharzes (0,2 g, 0,017 mmol) wurde mit DMF-BME-DIEA (75 : 20 : 5) für 4 × 30 min behandelt, um die His-Reste zu entschützen, und nach ausgiebigem Waschen mit DMF und DCM wurde die N^α-t-Boc-Gruppe durch Behandlung mit 50% TFA in DCM für 20 min entfernt. Das Protein wurde weiter entschützt und vom Harz abgespalten unter Verwendung von HF (5 ml) bei –5°C für eine Stunde in Gegenwart von Anisol (0,5 ml), Dimethylsulfid (0,5 ml) und p-Thiokresol (0,1 g). Das HF wurde verdampft und die Protein-Harz-Mischung mit Ether, der 5% β-Mercaptoethanol (BME) enthielt, gewaschen. Das Protein wurde aus dem Harz mit 6 M Guanidin-HCl/0,1 M HOAc (30 ml) extrahiert. Ein Teil des Rohproteins (1,75 ml, –6,6 mg) wurde zuerst an einer präparativen Größenausschlußsäule (Beckman TSK 3000SW) unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Puffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min und dann an einer präparativen Säule C-18 Vydac unter Verwendung von Acetonitril-Wasser (0,1% TFA) als Puffersystem mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min gereinigt. Mehr als 0,36 mg reines Protein wurde erhalten. Aminosäureanalyse und Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie (FAB-MS) bestätigten die Struktur.
FAB-MS: [MH⁺) bei m/z: 7457,4 a. m. u., wobei MH⁺ ein positiv geladenes Masseion darstellt, m/z Masse/Ladung ist und a. m. u. atomare Masseneinheiten sind.
Aminosäureanalyse:
Chemisch synthetisiertes und natives gereinigtes KC voller Länge sind beide inaktiv als synergistische Faktoren. Chemisch synthetisiertes Desamino-KC, hergestellt nach dieser Erfindung, ist ein hochwirksamer synergistischer Faktor.
Beispiel 2 – Plasmidkontruktion zur Expression von murinem Desamino-KC
Ein partieller cDNA-Klon, der murines KC voller Länge codiert, wurde von der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland (ATCC Nr. 37591) erhalten. Ein 422 by Tfi2-HincII-Fragment (bp 125–553) wurde aus diesem cDNA-Klon isoliert. (Alle Basenpaar- und Aminosäurenummern beziehen sich auf die in Genbank^® erhältliche Sequenz, Eingangsnummer J04596.)
Ein Linker, der by 74–124 umfaßt, wurde mit einem TfiI-Überhang am 3'-Ende und einem HindIII-Überhang am 5'-Ende unter Verwendung herkömmlicher Technik synthetisiert. Eine NdeI-Stelle wurde am 5'-Ende eingeführt, um ein Met-Codon im Raster mit dem KC-Produkt zu erzeugen.
Der Linker und das KC-Fragment wurden an pUC18 [ATCC 15752-B1] ligiert, das mit HindIII und HincI2 geschnitten worden war, um pMKC zu erzeugen. pMKC codiert das gesamte reife KC-Genprodukt (Aminosäuren 25–96) unter Addition eines N-terminalen Met.
Die gesamte E. coli-Expression von KC und seinen Derivaten wurde unter Verwendung von Plasmid pEA191kn [SmithKline Beecham] durchgeführt. pEA191kn ist ein Derivat von pSKF301 [Shatzman et al., "Expression Using Vectors with Phage λ Regulatory Sequences" in Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. F. A. Ausubel et al., S. 16.3.1–16.3.11 (1990)], geschaffen durch 1) Entfernen eines Teils des Amp-Resistenzgens und Ersetzen durch ein Kanamycin-Resistenzgen und 2) Inserieren des λrexB-Gens, das zur Entfernung endogener NdeI-Stellen konstruiert war, stromaufwärts des PL-Promotors.
Zur Expression des reifen KC voller Länge (mit der Addition eines N-terminalen Met) wurde ein NdeI-SspI-Fragment, das Aminosäuren 25-Stopp- Codon mit der Addition eines N-terminalen Met codiert, aus pMKC isoliert und in pEA181kn subkloniert, das mit NdeI und HpaI geschnitten worden war. Der resultierende Klon wurde als pEA1/mkc19(wt) bezeichnet.
Zur Erzeugung der Desamino-Form von KC wurde ein 322 by PstI-Ssp2-Fragment (bp 112–434) aus pMKC isoliert (oben beschrieben). Ein Linker, der by 86–111 umfaßte, wurde mit einem PstI-kompatiblen Überhang am 3'-Ende und einem NcoI-Überhang am 5'-Ende synthetisiert. Eine NdeI-Stelle wurde am 5'-Ende eingeführt, um ein N-terminales Met im Raster mit dem KC-Genprodukt bereitzustellen. Das Fragment und der Linker wurden an pEA181kn ligiert, geschnitten mit NcoI und HpaI. Der resultierende Klon, in dem das Desamino-KC-Gen an das NS1-Genprodukt fusioniert ist, wurde als pEA1-NS1/mkc21(–4) bezeichnet. Zur Deletion des NS1-Teils der Fusion wurde pEA1-NS1/mkc21(–4) mit NdeI geschnitten und religiert. Der resultierende Klon wurde als pEA/mkc38(–4) bezeichnet.
pEA/mkc18(wt) und pEA/mkc39(–4) wurden mit Nalidixinsäure induziert, um die volle Länge (Aminosäuren 25-Stopp mit der Addition eines N-terminalen Met) bzw. das Desamino (Aminosäuren 29-Stopp mit N-terminalem Met) zu exprimieren. Zur Induktion wurden E. coli-AR120-zellen [SmithKline Beecham], transformiert mit dem Plasmidkonstrukt, bei 37°C in einem Kreiselschüttler bei 250–300 U/min bis AD₆₅₀ = 0,4–0,6 gezüchtet. Ein 1/1000 des Volumens von 60 mg/ml Nalidixinsäure (angesetzt in 1 N NaOH) wurde auf eine Endkonzentration von 60 μg/ml hinzugegeben. Die Kulturen wurden für 4 bis 5 Stunden gezüchtet und dann geerntet. Die Zellen wurden lysiert und Rohlysate auf Aktivität als hämatopoietischer synergistischer Faktor (HSF) wie in Beispiel 8 nachfolgend beschrieben untersucht.
Beispiel 3 -Expression von murinem Desamino-KC in E. coli
Murines KC voller Länge und Desamino-KC wurden an pEA181kn wie in Beispiel 2 oben beschrieben subkloniert, wo sie unter der Kontrolle des induzierbaren PL-Promotors aus dem Bakteriophagen λ exprimiert wurden. Die Induktion des Desamino-Konstrukts, pEA1/mkc38(-4), mit Nalidixinsäure resultierte in der Erzeugung eines Proteins mit 69 Aminosäuren (Aminosäuren 29–96 des reifen KC mit der Addition eines Methionins am Amino-Terminus). Das Desamino-KC-Produkt ist löslich und zeigt synergistische Aktivität beim Test als bakterielles Rohlysat im nachfolgend in Beispiel 8 beschriebenen Test auf hämatopoietische synergistische Aktivität. Das Protein mit 73 Aminosäuren, das durch Nalidixinsäure-Induktion von pEA1/mkc18(wt) erzeugt wird, ist ebenfalls löslich, aber zeigte keine synergistische Aktivität, es sei denn, es wurde mit DPP Iv verdaut, um die gekürzte Form des Proteins zu erzeugen.
Das mit GM-CSF (20 E) kombinierte Desamino-KC führte zu ca. 40 bis 50 Kolonien von Zellen, die einer Aktivität von ca. 10¹⁴ E entsprachen.
Beispiel 4 – Synthese von Descarboxy-KC
Die nativen KC-Formen voller Länge und Desamino-KC-Formen wurden aus Überständen der murinen Fibroblasten-Zellinie C6 [SmithKline Beecham] durch Heparin-Agarose-Affinitätschromatographie mit anschließender Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gereinigt.
Zur Herstellung von Descaroboxy-KC wurde natives KC voller Länge, gereinigt wie oben beschrieben, mit Carboxypeptidase Y verdaut, um Descarboxy-KC zu bilden, das theoretisch die Aminosäuren 1 bis 68 des KC voller Länge [SEQ ID NO: 1] ist. Im Gegensatz zum nativen KC voller Länge ist dieses Descarboxy-KC aktiv als synergistischer Faktor.
Beispiel 5 – Herstellung von Desamino-gro-β
Rekombinantes gro-β voller Länge, das optional aus kommerziellen Quellen erhalten werden kann, wurde mit DPP IV-Enzym [Enzyme Product Systems, Inc.] verdaut, um Desamino-gro-β zu bilden, das die Aminosäuren 5 bis 68 des humanen gro-β voller Länge [SEQ ID NO: 3] umspannt.
gro-β voller Länge zeigt keine synergistische Aktivität im Test auf hämatopoietische synergistische Aktivität (0 Einheiten/mg). Verdauung des Lysats mit DPP IV zur Erzeugung der gekürzten Form des Proteins führt zum Auftreten signifikanter Stärken von synergistischer Aktivität im Lysat; spezifisch beträgt diese Aktivität ca. 10⁸ Einheiten im Test aus Beispiel 8, wenn nur kurze Zeit verdaut wurde. Noch höherer Aktivitäten werden bei erhöhter Dauer der Verdauung erwartet.
Beispiel 6 – Plasmid-Konstruktion zur Expression von humanem Desamino-gro-β
In der folgenden Beschreibung beziehen sich alle Aminosäure- und Basenpaarzahlen für humanes gro-β auf die Sequenz, wie sie in Genbank, Eingangsnummer M57731 erhalten wird. Ein Gen, das das reife humane gro-β-Protein voller Länge codiert (Aminosäuren 34–106, by 172–393, mit Addition eines N-terminalen Methionins, entsprechend SEQ ID NO: 3), wurde synthetisiert und an pCR2000 [SmithKline Beecham] subkloniert. Der resultierende Klon wurde als pHgroß bezeichnet. 5'-NdeI- und 3'-HpaI-Stellen wurdne im synthetisierten Gen eingeschlossen, um das anschließende Subklonieren zu vereinfachen.
Zur E. coli-Expression wurde das NdeI-Hpa2-Fragment, das das gesamte reife Protein codiert (mit Addition eines N-terminalen Met), in pEA181Kn subkloniert, das oben beschrieben wurde und mit NdeI und HpaI geschnitten worden war. Der resultierende Klon wurde als pEA1/hgroβ5(wt) bezeichnet. Dieser Klon kann mit Nalidixinsäure wie oben beschrieben induziert werden, um ein Produkt mit 74 Aminosäuren zu erzeugen, das dem reifen gro-β-Protein voller Länge (mit dem hinzugefügten N-terminalen Met) entspricht.
Die Desamino-Form von humanem gro-β wurde wie folgt konstruiert. Ein 176 by Pst2-HpaI-Fragment wurde aus pHgroß isoliert und mit einem NdeI-PstI-Linker (der die Aminosäuren 39–49 mit der Addition eines N-terminalen Methionins codiert) in NdeI/HpaI-geschnittenes pEA181kn ligiert. Der resultierende Klon wird als pEA-Hgroß(–4) bezeichnet. 6 ist eine DNA-Karte dieses Plasmids.
pEA1-hgroß(–4) wurde mit Nalidixinsäure wie oben beschrieben induziert, um ein gro-β-Protein mit 70 Aminosäuren zu erzeugen, das am Amino-Terminus des aktiven Proteins um 4 Aminosäuren gekürzt ist (Aminosäuren 39– 106 mit der Addition eines N-terminalen Met).
Beispiel 7 – Expression von humanem Desamino-gro-β in E. coli
Das humane gro-β-(MIP2α)-Gen wurde synthetisiert und in den E, coli-Expressionsvektor pEA181kn, der in Beispiel 6 oben beschrieben ist, subkloniert, wo es unter der Kontrolle des aus dem Bakteriophagen λ stammenden PL-Promotors exprimiert wird. Induktion mit Nalidixinsäure führte zur Erzeugung eines Proteins mit 74 Aminosäuren (Aminosäuren 35-Stoppcodon mit Addition eines N-terminalen Methionins).
Es wurde gefunden, daß dieses rekombinante gro–ß (Aminosäuren 5–73 aus SEQ ID NO: 3) eine Aktivität von ca. 1014 Einheiten im Test aus Beispiel 8 hat.
Beispiel 8 – Test auf Aktivität als hämatopoietischer synergistischer Faktor
Alle modifizierten Chemokine werden im folgenden herkömmlichen Test durchmustert, um zu bestimmen, ob das modifizierte Chemokin durch eine synergistische Aktivität mit Kolonie-stimulierendem Faktor (CSF) gekennzeichnet ist oder nicht, d. h. ob die Kombination aus dem Chemokin und dem Kolonie-stimulierenden Faktor die additive Wirkung der zwei Proteine übertrifft.
Murine Knochenmarkzellen werden geernetet und in RPMI 1649 mit 10% Rinderfötusserum (FBS) suspendiert. Die Knochenmarkzellen werden mit suboptimalen Konzentrationen von rekombinantem murinem Granulocyten- Makrophagen-(GM)-CSF (20 E/ml) und Verdünnungen von Testverbindungen in einem murinen CFU-GM-Standard-Weichagar-Test kultiviert. Optional können G-CSF, M-CSF und IL-3 (niedrige O₂-Bedingungen) als abwechselnde CSF-Quelle verwendet werden. Markzellen, die mit 20 Einheiten GM-CSF kultiviert werden, führen zum Wachstum von ca. 20–30 Kolonien von Zellen (Hintergrund). In üblicher Weise ist eine Einheit (E) äquivalent zu ca. 1 Kolonie über dem Hintergrund.
Z. B. führte mit GM-CSF (20 E/ml) kombiniertes Desamino-KC zu ca. 40– 50 Kolonien von Zellen, die einer spezifischen Aktivität von ca. 10¹⁴ E/mg entsprachen. Synthetisches gro-α (Aminosäuren 5–73) ist ebenfalls dadurch gekennzeichnet, daß es eine spezifische Aktivität von 10¹⁴ E/mg hat.
Selbst wenn kommerziell erhaltene Chemokine verwendet werden, die Verunreinigungen enthalten können, führt das Verfahren der Erfindung zu einer erhöhten Aktivität. Z. B. wurden die folgenden Ergebnisse unter Verwendung gekürzter Verdauungsperioden erhalten.

Kommerzielles gro-β 2 × 104 E

+ DPPIV-Verdauung 1 × 106 E

Kommerzielles gro-γ 2 × 103 E

+ DPPIV-Verdauung 5 × 105 E
Dramatischere Anstiege der Aktivität werden bei erhöhter Dauer der Verdauung und bei synthetisch erzeugten Cytokinen erwartet.
SEQUENZPRTOKOLL

Claims

Modifziertes Chemokin, das durch die Kürzung von 2 bis 8 Aminosäuren am Amino-Terminus eines reifen Chemokins, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus KC, gro-β und gro-γ besteht und Säugetierursprungs ist, und durch eine wenigstens 10 mal höhere biologische Aktivität als das reife Chemokin in einem hämopoietischen synergistischen Faktor-Test gekennzeichnet ist.
Modifiziertes Chemokin gemäss Anspruch 1, worin das reife Chemokin aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus KC und gro-β besteht.
Modifiziertes Chemokin gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz des reifen KC-Proteins mit seinem an einer Position zwischen den Aminosäureresten 2 bis 8 von SEQ ID NO: 1 gekürzten Amino-Terminus umfasst.
Modifiziertes Chemokin gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es aus den Aminosäuren 5 bis 72 von SEQ ID NO: 1 besteht.
Modifiziertes Chemokin gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz von reifem gro-β-Protein umfasst, das an seinem N-Terminus zwischen den Aminosäurepositionen 2 und 8 von SEQ ID NO: 3 gekürzt ist.
Modifiziertes Chemokin gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es aus den Aminosäuren 5 bis 73 von SEQ ID NO: 3 besteht.
Modifiziertes Chemokin gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz von reifem gro-γ-Protein umfasst, das an seinem N-Terminus zwischen den Aminosäurepositionen 2 und 8 von SEQ ID NO: 4 gekürzt ist.
Modifiziertes Chemokin gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es aus den Aminosäuren 5 bis 73 von SEQ ID NO: 4 besteht.
Multimeres Protein, das eine Assoziation eines modifizierten Chemokins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem anderen der Chemokine und/oder mit einem bekannten reifen Chemokin voller Länge umfasst.
Protein gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es mehrfache Kopien des gleichen modifizierten Chemokins umfasst.
Protein gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens zwei unterschiedliche modifizierte Chemokine umfasst.
Nukleinsäuresequenz, die die Sequenz umfasst, die ein modifiziertes Chemokin codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (a) einem modifizierten Chemokin gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 und (b) einem multimeren Protein gemäss einem der Ansprüche 9 bis 11 besteht.
Plasmid, das die Nukleinsäuresequenz gemäss Anspruch 12 unter der Kontrolle von ausgewählten regulatorischen Sequenzen umfasst, die zur Ausrichtung ihrer Replikation und Expression in einer Wirtszelle fähig sind.
Isolierte Wirtszelle, die mit einem Plasmid gemäss Anspruch 13 transfiziert ist.
Verfahren zur Erzeugung eines modifizierten Chemokins, welches das Kultivieren einer Wirtszelle gemäss Anspruch 14 und Isolieren des Chemokins aus der Zelle oder Zellkultur umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die (a) ein modifiziertes Chemokin gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder (b) ein multimeres Protein gemäss einem der Ansprüche 9 bis 11 in einem geeigneten pharmazeutischen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das modifizierte Chemokin gemäss Anspruch 6 und einen geeigneten pharmazeutischen Träger umfasst.
Verwendung eines modifizierten Chemokins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines multimeren Proteins gemäss einem der Ansprüche 9 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines entzündlichen Zustands in einem Säugetier.
Verwendung eines modifizierten Chemokins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung des Wachstums und/oder der Differenzierung von Knochenmarkszellen in einem Säugetier.
Verwendung eines modifizierten Chemokins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Reifung von hämatopoietischen Vorläuferzellen in einem Säugetier.
Verwendung einer Mischung aus G-CSF und einem modifizierten Chemokin gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einer synergistischen Wirkung in der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung des Wachstums und/oder der Differenzierung von Knochenmarkszellen in einem Säugetier.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 19 bis 21, worin das modifizierte Chemokin das Chemokin gemäss Anspruch 6 ist.
Verwendung eines modifizierten Chemokins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung von viralen, pilzlichen und bakteriellen Infektionen.
Verwendung gemäss Anspruch 23 eines modifizierten Chemokins gemäss Anspruch 6.
Verwendung eines modifizierten Chemokins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung einer myelopoietischen Dysfunktion.
Verwendung gemäss Anspruch 25 eines modifizierten Chemokins gemäss Anspruch 6.