DE69427850T2

DE69427850T2 - Monoklonaler antikörper gegen mucoglykoprotein

Info

Publication number: DE69427850T2
Application number: DE69427850T
Authority: DE
Inventors: Kyoko Hotta; Kazuhiko Ishihara; Makoto Kurihara; Shiro Shimauchi; Hiromi Tanaka
Original assignee: Kanto Chemical Co Inc
Current assignee: Kanto Chemical Co Inc
Priority date: 1993-05-26
Filing date: 1994-05-26
Publication date: 2001-12-06
Anticipated expiration: 2014-05-27
Also published as: CA2141025A1; US5576182A; WO1994028158A1; JP3581160B2; EP0654532A1; EP0654532A4; JPH06335396A; CA2141025C; DE69427850D1; EP0654532B1

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen monoklonalen Antikörper, der in Tests für Schleim, der für menschliche Magendrüsen typisch ist, verwendet werden kann. Somit wird erfindungsgemäß ein neuer Antikörper bereitgestellt, der eine starke Affinität für muköse Zellen der menschlichen Magendrüsen und den davon sekretierten Schleim besitzt, jedoch nicht mit mukösen Zellen der menschlichen Magenoberfläche oder dem davon sekretierten Schleim kreuzreagiert.
Die Schleim-sekretierenden Zellen im Epithel von Schleimhäuten des Nahrungstrakts, einschließlich der Magenschleimhaut, sind vermutlich an der Aufrechterhaltung gastrointestinaler Funktionen durch die Synthese von Schleim, gefolgt von einer Sekretion beteiligt. Der Magenschleim wird insbesondere als eines der wichtigsten Verteidigungsmittel für den Schutz der Magenschleimhaut vor einem Angriff durch z. B. Magensäure und Pepsin betrachtet.
Die Schleimproduktion im menschlichen Magen erfolgt durch muköse Zellen der Oberfläche (sie bedecken die Epithelzellen), die im Oberflächen-Epithel der Magenschleimhaut auftreten, und durch muköse Zellen der Magendrüsen, die im verborgenen Teil der Magendrüsen auftreten. In den vergangenen Jahren wurde versucht, die einzelnen Schleimarten, die von diesen mukösen Zellen produziert werden, zu unterscheiden. Ein histochemisches Färbeverfahren wurde entwickelt, das spezifisch für die Zuckerkomponenten ist, die charakteristisch für die jeweiligen Schleimarten der mukösen Zellen der Oberfläche und der mukösen Zellen von Drüsen sind. Das Färbeverfahren kann somit zwischen ihnen unterscheiden. So kann der Schleim in den mukösen Zellen der Oberfläche spezifisch durch die Galaktoseoxidase-kaltes Thionin-Schiff (GOCTS)-Reaktion angefärbt werden, während man herausfand, dass der als Klasse III durch das Concanavalin A paradoxe Färbeverfahren klassifizierte Schleim (Katsuyama, T. und Spicer, S. S. (1978), J. Histochem. Cytochem. 26, 233-250) spezifisch in den mukösen Zellen der Drüsen lokalisiert ist (Ota, H. et al. (1991), Histochemical J. 23, 22-28). Die Schleimschicht, die das Oberflächenepithel der Magenschleimhaut bedeckt, stellte sich als laminare Struktur alternierender Schichten aus GOCTS-reaktivem Schleim und Schleim der Klasse III heraus und die Schleimschicht enthielt Schleim aus mukösen Zellen der Oberfläche und mukösen Zellen der Drüsen (Ota, H. et al. (1991), Histochemical J. 23, 22-28).
Katsuyama et al. haben herausgefunden, dass bei normalen Geweben der Schleim der Klasse III nur in den begrenzten Drüsenepithelien des Nahrungstrakts vorkommt, von den kardialen Drüsen des Ösophagus über die kardialen Drüsen, mukösen Nackenzellen und pylorischen Drüsen des Magens, die Brunner-Drüsen des Duodenums, die mukösen Drüsen der Papilla-Vateri und die mukösen Drüsen des Bauchspeicheldrüsengangs im Kopf der Bauchspeicheldrüse. Er kann hingegen mit hoher Wahrscheinlichkeit in Tumorgeweben wie einem cholezystischem Adenom, Krebs der Gallenblase und Krebs des Pankreasgangs nachgewiesen werden (Katsuyama et al. (1989), Byori to Rinsho 7, 1217-1224). Ferner fanden Matsuzawa et al. unter Bezug auf das Verhältnis zwischen Metaplasie und Krebs, dass Gewebeformen wie die in der Magenschleimhaut, wo ein stark GOCTS-positiver Schleim im Oberflächenepithel der Mukosa vorkommt und sich Schleim der Klasse III im tieferen Teil davon befindet, nicht in Geweben des normalen Pankreasgangs, jedoch häufig in Geweben des Pankreasgangs mit Metaplasie oder Karzinom aufgefunden werden können (Matsuzawa, K. et al. (1992), Human Pathology 23, 925-933). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen legen nahe, dass Daten für die Diagnose von Krebserkrankungen oder für die mögliche Charakterisierung durch die Bestimmung des in die Körperflüssigkeit sekretierten magentypischen Schleims, insbesondere des für die Magendrüsen typischen Schleims, bereitgestellt werden können.
Für den spezifischen Nachweis des für menschliche Magendrüsen typischen Schleims waren bisher die Concanavalin A paradoxe Färbung und die Verwendung monoklonaler Antikörper, die gegen Differenzierungs-Antigene der Magenschleimhaut gerichtet sind, bekannt. Die von Ghanei et al., Verb. Dtsch. Ges. Path., 1989, Bd. 73, Seite 665, beschriebenen monoklonalen Antikörper sind gegen muköse Drüsenzellen und akzessorische Zellen des Magens, muköse Antrumzellen, Brunner-Drüsen, gastrische Metaplasie der Gallenblase und des Dünndarms und gegen die schleimartige Metaplasie des Pankreas gerichtet. Mit der Concanavalin A paradoxen Färbung kann der Magendrüsen-typische Schleim aufgrund seiner schlechten Reproduzierbarkeit einer Färbung und aufgrund des Nachteils des Verfahren, dass es nur bei fixierten Proben und somit nicht für die Bestimmung von sekretierten oder gelöstem Schleim angewendet werden kann, nicht quantitativ bestimmt werden.
Als Ergebnis ihrer intensiven Untersuchung von monoklonalen Antikörpern, die den für menschliche Magendrüsen typischen Schleim erkennen können, konnten die Erfinder durch Verwendung von Mukus-Glykoproteinen (Mucinen) als Antigen für eine Immunisierung, die die Hauptbestandteile des Mukus darstellen, ein Hybridom erhalten, das einen neuen monoklonalen Antikörper mit einer hohen Spezifität für menschliche Magendrüsen-typische muköse Zeilen und den davon sekretierten Schleim produziert, sowie den monoklonalen Antikörper.
Somit wird erfindungsgemäß, wie in den Punkten 1-5 nachstehend beschrieben, ein neuer monoklonaler Antikörper und ein Hybridom bereitgestellt, sowie die Verwendung des monoklonalen Antikörpers für die Analyse in Körperflüssigkeiten enthaltenen Mukus-Glykoproteinen, die von Magendrüsen typischen mukösen Zellen abstammen.
1. Ein monoklonaler Antikörper der IgM-Klasse, der Zuckerketten, umfassend α-gebundene N-Acetylglucosaminreste erkennt und spezifisch mit Mukus-Glykoproteinen reagiert, die von menschlichen Magendrüsen typischen mukösen Zellen produziert werden.
2. Der monoklonale Antikörper gemäß 1, wobei der monoklonale Antikörper der IgM- Klasse von einem Hybridom produziert wird, das beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer P-13622 hinterlegt ist.
3. Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper der IgM-Klasse gemäß 1. produziert.
4: Ein Hybridom, hinterlegt beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer P-13622.
5. Verwendung des monokonalen Antikörpers gemäß 1. oder 2. für die Analyse von in menschlichen Körperflüssigkeiten enthaltenen Mukus-Glykoproteinen, die von Magendrüsen-typischen mukösen Zellen abstammen.
Die Erfindung betrifft somit einen monoklonalen Antikörper, der für die Färbung von Drüsentypischen mukösen Zellen (d. h. kardiale Drüsenzeilen, muköse Nackenzellen und pylorische Drüsenzellen) der menschlichen Magenschleimhaut und von mukösen Zellen, die für menschliche Magendrüsen typischen Schleim produzieren (z. B. Brunner-Drüsen des Duodenums, Magendrüsen-typische metaplastische Zellen und Magendrüsen-typische Tumorzellen), verwendet werden kann. Ferner betrifft die Erfindung einen monoklonalen Antikörper, der für die Bestimmung von Mukus-Glykoproteinen verwendet werden kann, die von den vorstehend genannten Magendrüsen typischen mukösen Zellen sekretiert werden. Insbesondere erlaubt die immunhistochemische Färbung mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder einem markierten Derivat davon die spezifische Färbung von für menschliche Magendrüsen typischen mukösen Zellen und den davon sekretrierten Schleim. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) erlaubt die Analyse, sowohl qualitativ als auch quantitativ, von Mukus-Glykoproteinen in menschlichen Körperflüssigkeiten, z. B. Magensaft, Pankreassaft, Blut und Sputum, die von Magendrüsen typischen mukösen Zellen abstammen. Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann auch für die Untersuchung und Diagnose von Krebs verwendet werden.
Das den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzierende Hybridom kann durch ein jegliches konventionelles Verfahren, z. B. das Verfahren von Köhler und Milstein (Köhler, G. und Milstein, C. (1975), Nature 256, 495-497) unter Verwendung von durch irgendein geeignetes Verfahren hergestelltem Muküs-Glykoprotein erhalten werden. Somit wird das vorstehend genannte Mukus-Glykoprotein für die Immunisierung einer Maus verwendet und Milzzellen der Maus werden mit Myelomzellen aus Mäusen fusioniert. Aus den resultierenden Hybridomen kann ein Hybridom, das den gewünschten Antikörper produziert und sekretiert, ausgewählt und isoliert werden. Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen, vorstehend genannten Hybridoms und monoklonalen Antikörpers und die charakteristischen Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers werden nachstehend beschrieben.
A. Isolierung und Reinigung von Antigen:
Als Antigen für die Immunisierung können Extrakte der Magenschleimhaut oder von Brunner-Drüsen des Menschen oder eines nicht-menschlichen Säugers verwendet werden. Vorzugsweise werden Mukus-Glykoproteine, die aus diesen Extrakten erhalten werden, vor der Verwendung gereinigt. So wird z. B. das aus der Magenschleimhaut von Ratten gemäß dem Verfahren von Ohara et al. (Ohara, S. et al. (1986), Comp. Biochem. Physiol. 83B, 273-275) extrahierte und gereinigte Mukus-Glykoprotein verwendet. In den nachstehend aufgeführten Beispielen wurden die Extrakte aus der Magenschleimhaut von Ratten durch Gelfiltration fraktioniert und Fraktionen, deren entsprechendes Molekulargewicht nicht niedriger als 1 500 000 war, gesammelt und einer CsCI-Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation unterzogen, um Glykoproteinfraktionen bereitzustellen (Mukus-Glykoprotein-enthaltende Fraktionen). Das so erhaltene Mukus-Glykoprotein wurde als Antigen für eine Immunisierung verwendet.

B. Immunisierung von Mäusen

Als zu immunisierende Tiere können bevorzugt 4-8 Wochen alte BALB/c-Mäuse verwendet werden, obwohl andere Mäusestämme auch verwendet werden können. Das Immunisierungsdiagramm und die Antigen-Konzentration werden derart ausgewählt, dass eine geeignete Menge Antigen-stimulierter Lymphozyten gebildet werden. So wird den Mäusen z. B. intraperitoneal 100 ug/Tier des vorstehend beschriebenen Mukus-Glykoproteins in Verbindung mit einem geeigneten Adjuvans verabreicht. Darauf wird den Tieren mehrfach bei Intervallen von mehreren Tagen oder Wochen das gleiche Antigen, das für die erste Immunisierung verwendet wurde, verabreicht. Nach der zweiten Immunisierung werden Blutproben aus der Augenhintergrundvene entnommen, um sie auf den Antikörpertiter zu untersuchen. Der Antikörpertiter kann vorzugsweise durch ELISA gemessen werden.

C. Zellfusion

Die Milz wird den immunisierten Mäusen entnommen und eine wässrige Suspension von einzelnen Milzzellen wird daraus hergestellt. Die Suspension wird einer Zellfusion mit Mäuse-Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels unterzogen. Ein bevorzugtes Beispiel derartiger Fusionierungsmittel ist Polyethylenglykol eines mittleren Molekulargewichts 400-6 000, es kann jedoch auch jedes andere bekannte Fusionierungsmittel verwendet werden (Klebe, R. J. und Mancuso, M. G. (1981), Somat. Cell. Genet. 7, 473-488). In den nachstehend beschriebenen Beispielen wurde Polyethylenglykol 4 000 (E. Merck; Katalog Nr. 9727) verwendet. Vorzugsweise werden Myelomzellen vervuendet, die aus der gleichen Tierspezies wie das für die Herstellung von Milzzellen verwendete Tier stammen und die keinen Antikörper produzieren. In den nachstehend beschriebenen Beispielen wurden 8-Azaguanin-resistente Maus-Myelomzellen Sp2/0-Ag14 verwendet (Shulman, M. et al. (1978), Nature 276, 269-270). Vorzugsweise werden Milzzellen und Myelomzellen bei einem Zellzahlverhältnis von etwa 20 : 1 bis etwa 5 : 1 verwendet.

D. Auswahl fusionierter Zellen

In einem getrennten Behälter wird das in dem vorstehenden Schritt C. erhaltene Gemisch, d. h. das Gemisch aus nicht-fusionierten Milzzellen, nicht-fusionierten Myelomzellen und fusionierten Zellen, für einen geeigneten Zeitraum in Selektionsmedium kultiviert, das nicht das Wachstum von nicht-fusionierten Zellen unterstützt und dadurch die nicht-fusionierten Zellen abtötet. Als derartiges Medium kann ein Medium verwendet werden, das das Wachstum nicht-fusionierter Myelomzellen, die gegenüber einem Gift resistentsind (z. B. 8-Azaguaninresistent), nicht unterstützt. Ein Beispiel ist HAT-Medium. Da nicht-fusionierte Milzzellen keine Tumorzellen sind, sterben nicht-fusionierte Milzzellen und nicht-fusionierte Myelomzellen in einem derartigen Selektionsmedium nach einem bestimmen Zeitraum ab. Fusionierte Zellen sind in einem derartigen Selektionsmedium lebensfähig, da sie Tumoreigenschaften ihrer parentalen Myelomzellen und Eigenschaften von Milzzellen besitzen.

E. Identifizierung von einem durch ein Hybridom produzierten Antikörper in jedem Behälter (Screening)

Der Kulturüberstand wird aus einem jeden der Löcher entfernt, in denen sich Hybridome gebildet hatten, wie bestätigt durch die Kultivierung in dem vorstehenden Schritt D. Der Kulturüberstand wird auf Immunoreaktivität mit Glykoprotein des Magenschleims getestet. Ein derartiges Screening kann vorzugsweise durch ELISA erfolgen. Immunoreaktive Proben werden weiter für eine spezifische Erkennung von mukösen Zellen der Magendrüsen und des davon sekretierten Schleims gescreent. Ein derartiges Screening kann vorzugsweise durch immunohistochemische Färbung erfolgen, wobei Schnitte von fixierten Magenschleimhautproben verwendet werden.

F. Klonierung von Hybridomen, die den gewünschten Antikörper produzieren und Produktion des Antikörpers

Die in dem vorstehenden Schritt E. erhaltene immunoreaktive Zellsuspension wird durch irgendein geeignetes Verfahren kloniert, z. B. durch das Verfahren der begrenzten Verdünnung, und der gewünschte Antikörper kann sodann durch eine von zwei Möglichkeiten erhalten werden. Eine Möglichkeit umfasst die Kultivierung eines Hybridoms in irgendeinem geeigneten Medium für einen gewissen Zeitraum, gefolgt von der Isolierung des durch das Hybridom produzierten monoklonalen Antikörpers aus dem Kulturüberstand. Die andere Möglichkeit umfasst die intraperitoneale Beimpfung einer syngenen oder semi-syngenen Maus mit dem Hybridom. Im letzteren Fall kann der von dem Hybridom produzierte gewünschte monoklonale Antikörper nach einem gewissen Zeitraum aus dem Blut oder der Aszitenflüssigkeit der beimpften Maus isoliert werden.

G. Reinigung des monoklonalen Antikörpers

Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann aus dem Hybridom-Kulturüberstand oder aus dem Blut oder der Aszitenflüssigkeit der Maus, wie in dem vorstehenden Schritt F. erhalten, durch jedes biochemische Reinigungsverfahren, das allgemein verwendet wird, gereinigt werden. Eine derartige Reinigung kann z. B. vorzugsweise durch Kombination verschiedener Reinigungsverfahren erfolgen, wie Ammoniumsulfat-Aussalzung, Ionenaustausch-Säulenchromatographie, Molekularsieb-Säulenchromatographie oder Affinitäts- Säulenchromatographie.

H. Markierung des monoklonalen Antikörpers und Verwendung des markierten monoklonalen Antikörpers

Der so gereinigte monoklonale Antikörper kann durch irgendein biochemisches Mittel markiert werden, das allgemein zusammen mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase, Biotin, usw. verwendet wird. Eine Markierung kann durch Verknüpfung des Produkts einer Periodatoxidation des Enzyms mit dem Antikörper oder durch Verbinden des Enzyms mit dem Antikörper mit Hilfe von Glutaraldehyd als Quervernetzer erfolgen. Der so erhaltene markierte monoklonale Antikörper kann einfach in einer immunohistochemischen Färbung oder in einem auf einem ELISA basierenden Sandwich-Test eingesetzt werden. In einem ELISA- Verfahren kann das in einer Probe enthaltene Mukus-Glykoprotein, das von Magendrüsentypischen mukösen Zellen abstammt, quantitativ bestimmt werden, z. B. durch Adsorption des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers als Primär-Antikörper an jedes Loch einer ELISA-Platte, gefolgt von einer weiteren Adsorption eines Materials, das nicht an der Reaktion beteiligt ist, z. B. Magermilch, auf die adsorbierten Stellen eines jeden Lochs. Die Probenlösung wird sodann zu jedem Loch hinzugegeben und die Löcher gewaschen. Kleine Mengen einer Lösung des markierten monoklonalen Antikörpers einer geeigneten Verdünnung werden zu den Löchern hinzugegeben, gewaschen und eine Substratlösung für das in dem ELISA verwendete Enzym hinzugefügt.

I. Reaktivität des monoklonalen Antikörpers mit Antigen

Die das Antigen erkennende Stelle des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers kann durch Untersuchung der Reaktivität des monoklonalen Antikörpers mit Verbindungen einer bekannten Struktur untersucht werden. Die Erfinder unterzogen kreuzreagierendes Glykoprotein aus Magenschleim von Schweinen (Sigma) einem Abbau durch gewöhnliche biochemische Methoden und Bestandteile mit einer antigenen Aktivität wurden aufgetrennt, aus den Abbauprodukten isoliert und durch herkömmliche physikochemische Verfahren analysiert. Die antigene Aktivität kann einfach durch einen kompetitiven ELISA gemessen werden, der den Hemmungstest auf den ELISA anwendet.
Die Erfindung wird nun weiter durch Beispiele veranschaulicht, die nicht begrenzend zu verstehen sind.

Beispiel 1

(1) Herstellung von Antigen für eine Immunisierung

Mägen wurden weiblichen SD-Ratten mit einem Gewicht von 250-300 g (Japan SLC, Inc.) entnommen und die Magenschleimhäute durch Abkratzen gesammelt und sodann einer Extraktion mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,2, mit 2% Triton X-100 unterzogen. Die Extrakte wurden einer Gelfiltration mit einer Bio-Gel A 1,5 m-Säule (Bio-Rad Laboratories) unterzogen, um die eluierten Fraktionen mit einem Molekulargewicht von mehr als 1 500 000 zu sammeln. Die Fraktionen wurden ferner einer CsCI-Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation (N. B.) unterzogen, um gereinigtes Glykoprotein-Antigen (Mukus-Glykoprotein-Fraktion) mit einer Dichte von 1,4 ± 0,4 g/ml zu erhalten, wobei ein Fraktionssammler verwendet wurde.
N. B. "CsCI-Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation" erfolgte unter den nachstehenden Bedingungen:
Zentrifugation: 1,5 · 10&sup5; g
Temperatur: 10ºC
Zeit: 85 Stunden
Vorrichtung: Modell 72P;
Rotor: RPS-40T
(Hitachi, Ltd.)

(2) Herstellung von Milzzellen aus immunisierten Mäusen

4 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden intraperitoneal mit 50 ul Freundschem vollständigen Adjuvans (Difco, Laboratories) und 100 ug/Tier des gereinigten Mukus-Glykoprotein-Antigens, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten wurde (hier als gereinigtes Mukus-Glykoprotein-Antigen bezeichnet) immunisiert. Den Tieren wurde sodann in 3-Wochen-Intervallen für eine Verstärkung intraperitoneal 50 ul Freundsches unvollständiges Adjuvans (Difco, Laboratories) und 100 ug/Tier des gleichen, wie für die erste Immunisierung verwendeten gereinigten Mukus-Glykoprotein-Antigens verabreicht. Am dritten oder vierten Tag nach jeder Verstärkungsinjektion wurden Blutproben aus der Augenhintergrundvene entnommen und auf anti-Mukus-Glykoprotein-Antikörper in den Seren durch das nachstehend beschriebene ELISA-Verfahren getestet.
ELISA: Das gereinigte Mukus-Glykoprotein-Antigen wurde in 0,05 M Natriumcarbonat-Natrium-Hydrogencarbonat-Puffer, pH 9,6, bei einer Konzentration von 2 ug/ml gelöst und der gleiche Puffer für die Herstellung zweifacher serieller Verdünnungen verwendet. 100 ul-Mengen einer jeden Verdünnung wurden zu den Löchern einer für die Verwendung in einem ELISA angepassten Mikroplatte (Corning) gegeben und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Jedes Loch wurde dreimal mit 0,05% Tween 20 in PBS (PBS-Tween) gewaschen, mit 2% Magermilch in PBS aufgefüllt und sodann 1 Stunde stehen gelassen. Die Löcher wurden dreimal mit PBS-Tween gewaschen und eine 1000-fache Verdünnung der Maus- Serumprobe wurde in Mengen von 100 ul in die Löcher verteilt. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Löcher dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 100 ul einer 10 000-fachen Verdünnung eines Peroxidase-markierten anti-Maus-lmmunoglobuline-Antikörpers aus Ziege (Tago, Inc.) in PBS als Sekundär-Antikörper zu jedem Loch hinzugegeben und 1 Stunde stehen gelassen. Die Löcher wurden dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 100 ul einer ABTS-H&sub2;O&sub2;-Peroxidase-Substratlösung (Kirkegaard & Perry Laboratories) zu jedem Loch hinzugegeben. Nach 30-minütiger Reaktion bei Raumtemperatur wurde die optische Dichte bei 415 nm für jedes Loch mit Hilfe eines Mikroplatten-Lesegeräts gemessen. Die Mausseren, die eine Farbentwicklung in Abhängigkeit von der Dosis des Mukus-Glykoproteins aufwiesen, wurden als Antikörperpositiv bewertet.
Die Milz wurde den Mäusen entnommen, die positiv in Bezug auf einen Antikörper gegen gereinigtes Mukus-Glykoprotein-Antigen bewertet wurden, und eine wässrige Suspension von einzelnen Milzzellen wurde daraus für eine Zellfusion hergestellt.

(3) Herstellung von Maus-Myelomzellen

8-Azaguanin-resistente Maus-Myelomzellen Sp2/0-Ag14 wurden mit Hilfe eines Kohlensäuregasinkubators bei 37ºC in normalem Medium kultiviert [RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (10,2 g/l)-Medium, supplementiert mit Natriumhydrogencarbonat (2,2 g/l), L-Glutamin (0,3 g/l), Gentamycin (40 mg/l) und fötalem Kälberserum (10% v/v)].

(4) Zellfusion und Kultivierung von Hybridomen

Die Milzzellen und Maus-Myelomzellen Sp2/0-Ag14, die vorstehend erhalten wurden, wurden bei einem Zellzahlverhältnis von 10 : 1 gemischt und sodann einer Zellfusion unter Zugabe einer Fusionslösung [Polyethylenglykol 4000 (0,5 g) in Dimethylsulfoxid (0,05 ml) und PBS (0,5 ml)] zu dem Gemisch unter gelindem Rühren unterzogen. Nach 90-sekündiger Inkubation bei 37ºC wurde ein Medium [RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (10,2 g/l)- Medium, supplementiert mit Natriumhydrogencarbonat (2,2 g/l), L-Glutamin (0,3 g/l) und Gentamycin (40 mg/l)] langsam hinzugegeben, um ein Gesamt-Flüssigkeitsvolumen von 40 ml zu ergeben. Nach Zentrifugation bei 1100 Upm für 10 Minuten wurde der Überstand entfernt und HAT-Medium [RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (10,2 g/l)-Medium, supplementiert mit Natriumhydrogencarbonat (2,2 g/l), L-Glutamin (0,3 g/l), Gentamycin (40 mg/l), fötalem Kälberserum (20% v/v), Hypoxanthin (100 umol/l), Aminopterin (0,4 umol/l) und Thymidin (16 umol/l)] wurde hinzugegeben, um die Zellen vorsichtig darin zu suspendieren. Die Suspension wurde zu jedem Loch einer 96 Loch-Kulturplatte hinzugegeben und die Suspension in einem Inkubator mit 5% Kohlensäuregas kultiviert.

(5) Screening und Klonierung

Aus den Löchern der vorstehend beschriebenen 96 Loch-Kulturplatte, in denen ein Wachstum von fusionierten Zellen in Form von Kolonien beobachtet wurde, wurden Proben des Kulturüberstands entnommen. Ein Screening auf Hybridome, die einen Antikörper produzierten, der fähig zur Reaktion mit dem gereinigten Mukus-Glykoprotein-Antigen ist, erfolgte durch den nachstehend beschriebenen ELISA. In dieser Weise wurden HIK-22 und HIK-108 ausgewählt. Ein weiteres Screening erfolgte in Bezug auf die von HIK-22 und HIK-108 produzierten Antikörper, wobei das nachstehend beschriebene immunohistochemische Färbeverfahren eingesetzt wurde. Somit wurde HIK-108 als ein Hybridom ausgewählt, das einen Antikörper mit einer Reaktivität gegen muköse Zellen der Magendrüsen und den davon sekretierten Schleim produziert. HIK-108 wurde 1 Woche in HT-Medium [RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (10,2 g/l)-Medium, supplementiert mit Natriumhydrogencarbonat (2,2 g/l), L-Glutamin (0,3 g/l), Gentamycin (40 mg/l), fötalem Kälberserum (15% v/v), Hypoxantin (100 umol/l) und Thymidin (16 umol/l)] und eine weitere Woche in normalem Medium [RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (10,2 g/l)-Medium, supplementiert mit Natriumhydrogencarbonat (2,2 g/l), L-Glutamin (0,3 g/l), Gentamycin (40 mg/l) und fötalem Kälberserum (10% v/v)] subkultiviert und zweimal unter begrenzter Verdünnung subkloniert, was zu drei Hybridomen, HIK-1081, HIK-1082 und HIK-1083, führte. Diese Hybridome wurden jeweils 4 Wochen in normalem Medium subkultiviert und jeder Hybridom-Kulturüberstand durch ELISA wie nachstehend beschrieben untersucht. Daraus wurde HIK-1083 ausgewählt (hinterlegt beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, unter der Zugangsnummer P-13622). Dieses Hybridom erzeugte einen Kulturüberstand, das die stärkste Farbentwicklung aufwies.
ELISA: Das gereinigte Mukus-Glykoprotein-Antigen wurde in 0,05 M Natriumcarbonat-Natrium-Hydrogencarbonat-Puffer, pH 9,6, bei einer Konzentration von 1 ug/ml gelöst. 100 ul der Lösung wurden zu jedem Loch einer an die Verwendung in einem ELISA angepassten Mikroplatte (Corning) hinzugegeben und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Jedes Loch wurde dreimal mit 0,05% Tween 20 in PBS (PBS-Tween) gewaschen, mit 2% Magermilch in PBS aufgefüllt und sodann 1 Stunde stehen gelassen. Die Löcher wurden dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 100 pl/Loch des in (5) erhaltenen Hybridom-Kulturüberstands zu jedem Loch hinzugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Löcher dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 100 pl/Loch einer 10 000-fachen Verdünnung eines Peroxidase-gekoppelten anti-Maus-lmmunoglobuline-Antikörpers aus Ziege (Tago, Inc.) in PBS als Sekundär-Antikörper zu jedem Loch hinzugegeben und 1 Stunde stehen gelassen. Die Löcher wurden dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 100 ul einer ABTS-H&sub2;O&sub2;-Peroxidase-Substratlösung (Kirkegaard & Perry Laboratories) zu jedem Loch hinzugegeben. Nach 30-minütiger Reaktion bei Raumtemperatur wurde die optische Dichte bei 415 nm für jedes Loch mit Hilfe eines Mikroplatten-Lesegeräts gemessen. Es wurden die Löcher ausgewählt, die eine intensivere Farbentwicklung zeigten als die Löcher, die in der gleichen Weise wie vorstehend behandelt wurden, mit der Ausnahme, dass der in (3) erhaltene Myelomzellen- Kulturüberstand anstelle des Hybridom-Kulturüberstands hinzugegeben wurde. Die Proben, die den derart ausgewählten Farbstoff-entwickelnden Löchern entsprachen, wurden als positiv bewertet.
Immunohistochemische Färbung: Menschliche Magenschleimhaut wurde mit Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hilfe eines Mikrotoms in 4 um dicke Scheiben geschnitten. Jeder der so hergestellten Schnitte wurde auf einem Glas-Objektträger fixiert. Jeder Glas-Objektträger wurde in Xylol für eine Endparaffinisierung eingetaucht und sodann in Methanol mit 0,3% Wasserstoffperoxid 30 Minuten gegeben und sodann durch Eintauchen in PBS für 30 Minuten gewaschen. Sodann wurde 10%iges normales Kaninchenserum (Nichirei Corporation) zu den gewaschenen Schnitten auf jedem Glas-Objektträger gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Schnitte in PBS gewaschen. Proben des Hybridom- Kulturüberstands wurden auf die gewaschenen Schnitte gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Schnitte mit PBS gewaschen. Biotin-markierter anti-Maus-IgG + lgA + IgM (H + L)-Antikörper aus Kaninchen (Nichirei Corporation) wurde auf jeden gewaschenen Schnitt gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Schnitte in PBS gewaschen. Peroxidase-gekoppeltes Streptavidin (Nichirei Corporation) wurde sodann auf jeden gewaschenen Schnitt gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Schnitte in PBS gewaschen. Sodann wurde jeder gewaschene Schnitt etwa 4 Minuten in 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, mit 0,02% Diaminobenzidin (Dojindo Laboratories) und 0,005% wässrigem Wasserstoffperoxid für eine Farbentwicklung eingetaucht.

(6) Identifizierung des Isotyps

Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper wurde in Bezug auf die Globulinklasse durch einen ELISA mit Hilfe eines Isotypisierungskits (PharMingen) untersucht. Monoklonaler anti- Maus-IgG1-Antikörper aus Ratte, monoklonaler anti-Maus-IgG2a-Antikörper aus Ratte, monoklonaler anti-Maus-IgG2b-Antikörper aus Ratte, monoklonaler anti-Maus-lgG3-Antikörper aus Ratte, monoklonaler anti-Maus-IgM-Antikörper aus Ratte, monoklonaler anti-Maus- IgA-Antikörper aus Ratte, monoklonaler anti-Maus-IgL(K)-Antikörper aus Ratte und monoklonaler anti-Maus-IgL(λ)-Antikörper aus Ratte wurden verwendet und jedes Reagenz 1 : 5 mit Beschichtungspuffer verdünnt. Jeweils 50 ul/Loch der Verdünnungen wurden in die Löcher einer für die Verwendung in einem ELISA angepassten Mikroplatte (Corning) gegeben und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Jedes Loch wurde dreimal mit 0,05% Tween 20 in PBS (PBS-Tween) gewaschen, mit 2% Magermilch in PBS aufgefüllt und sodann 1 Stunde stehen gelassen. Die Löcher wurden dreimal mit PBS-Tween gewaschen und ein Kulturüberstand aus einer 3 Tage-Kultur von HIK-1083 (Zugangsnummer P-13622) in normalem Medium [RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (10,2 g/l)-Medium, supplementiert mit Natriumhydrogencarbonat (2,2 g/l), L-Glutamin (0,3 g/l), Gentamycin (40 mg/l) und fötalem Kälberserum (10% v/v)] in 50 ul-Mengen auf die Löcher verteilt. Nach 1-stündiger inkubation wurden die Löcher dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 50 ul eines mit alkalischer Phosphatase markierten polyklonalen anti-Maus-Igs-Reagenzes aus Ratte zu jedem Loch hinzugegeben. Die Reaktionen wurden 1 Stunde stehen gelassen und sodann dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Zu jedem Loch wurden 50 ul einer Substratlösung gegeben, die durch Lösen einer pNPP-Tablette in 5 ml eines Lösungsmittels für das Substrat hergestellt worden war. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Mikroplatte optisch ausgewertet. Man fand heraus, dass nur die zwei Löcher, die mit dem monoklonalen anti-Maus-IgM-Reagenz aus Ratte und dem monoklonalen anti-Maus-IgL(λ)- Reagenz aus Ratte vorbehandelt worden waren, eine intensive Gelbfärbung aufwiesen, während die anderen Löcher farblos und transparent waren. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper als IgM-Antikörper identifiziert, wobei die leichte Kette eine κ-Kette ist.

(7) Herstellung von monoklonalem Antikörper

6 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen mit einem Gewicht von 19-21 g wurde intraperitoneal 0,5 ml/Tier 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan (Pristan) verabreicht und die Tiere sodann 10-14 Tage gehalten. Diesen Tieren wurden sodann 5 · 10&sup6; Zellen/Tier des vorstehend beschriebenen Hybridom-Stamms HIK-1083 (Zugangsnummer P-13622) verabreicht.
Nach 10-21 Tagen wurde die angesammelte Aszitenflüssigkeit gesammelt und zentrifugiert (12 000 Upm/20 Minuten/4ºC).
Der Überstand wurde sodann getrennt und Ammoniumsulfat für eine Aussalzung bis 40% Sättigung hinzugegeben. Das Gemisch wurde zentrifugiert (12 000 Upm/20 Minuten/4ºC). Der Niederschlag wurde in PBS gelöst und sodann gegen PBS 2 Tage bei 4ºC dialysiert und das Dialysat auf eine Affinitätssäule geladen. Dazu wurde Mukus-Glykoprotein aus Schweinemagen (Sigma) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8, mit 0,5 M NaCl gelöst und die Lösung mit in dem gleichen Puffer gequollener CNBr-aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia) gemischt. Eine Säule wurde mit dem Gemisch gepackt und sodann mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Bestandteile des vorstehend genannte Dialysats wurden auf der Säule adsorbiert und die so adsorbierten Komponenten des Dialysats mit 0,2 M Glycin-HCl-Puffer, pH 2,0, mit 0,5 M NaCl eluiert. 3 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,5, wurden zu dem Eluat hinzugegeben und das Gemisch für die nachstehende Markierungsreaktion mit Meerrettichperoxidase eingesetzt.

(8) Markierung des monoklonalen Antikörpers

Meerrettichperoxidase (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) wurde in destilliertem Wasser gelöst und eine 0,1 M wässrige Lösung von Natriummetaperiodat hinzugegeben und das Gemisch 10 Minuten inkubiert. Ethylenglykol wurde zu der Reaktionslösung hinzugegeben und das Gemisch mit Hilfe einer Sephadex G-25-Säule (Pharmacia) für die Herstellung einer Periodat-behandelten Peroxidaselösung entsalzt. Die Periodat-behandelte Peroxidaselösung wurde mit dem vorstehend beschriebenen monoklonalen Antikörper, der aus der Aszitenflüssigkeit von Mäusen mit Hilfe der Affinitätssäule gereinigt worden war, gemischt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert und nach Zugabe einer 0,1 M wässrigen Lösung von Natriumborhydrid das Gemisch weitere 2 Stunden inkubiert. Die resultierende Reaktionslösung wurde mit Hilfe einer Sephacryl S-200 HR (Pharmacia)-Säule in 35 Fraktionen fraktioniert und jede Fraktion wie nachstehend beschrieben durch einen ELISA untersucht. Vier Fraktionen, die eine Farbentwicklung zeigten, wurden kombiniert und vor der Lagerung eingefroren.
ELISA: Das gereinigte Mukus-Glykoprotein-Antigen wurde in 0,05 M Natriumcarbonat-Natriumhydrogencarbonat-Puffer, pH 9,6, bei einer Konzentration von 1 ug/ml gelöst. 100 uI der Lösung wurden zu jedem Loch einer für die Verwendung in einem ELISA angepassten Mikroplatte (Corning) hinzugegeben und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Jedes Loch wurde dreimal mit 0,05% Tween 20 in PBS (PBS-Tween) gewaschen, mit 2% Magermilch in PBS aufgefüllt und sodann 1 Stunde stehengelassen. Die Löcher wurden dreimal mit PBS-Tween gewaschen und das Säuleneluat (jede Fraktion) in Mengen von 100 ul in die Löcher verteilt, gefolgt von der Inkubation für 1 Stunde. Die Löcher wurden dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 100 pl einer ABTS-H&sub2;O&sub2;-Peroxidase-Substratlösung (Kirkegaard & Perry Laboratories) zu jedem Loch hinzugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die optische Dichte bei 415 nm für jedes Loch mit Hilfe eines Mikroplatten-Lesegeräts gemessen.

Beispiel 2

Antigene Spezifität des monoklonalen Antikörpers

(1) Bestätigung der antigenen Spezifität durch immunohistochemische Färbung

Die Reaktivität des in Beispiel 1 erhaltenen monoklonalen Antikörpers mit menschlicher Magenschleimhaut wurde mit Hilfe von immunohistochemischer Färbung untersucht. Menschliche Magen- und Duodenumschleimhäute wurden mit Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hilfe eines Mikrotoms in 4 um dicke Scheiben geschnitten. Jeder der so hergestellten Schnitte wurde auf einem Glas-Objektträger fixiert. Jeder Glas-Objektträger wurde in Xylol für eine Endparaffinisierung eingetaucht, sodann 30 Minuten in Methanol mit 0,3% Wasserstoffperoxid gegeben und sodann durch Eintauchen in PBS für 30 Minuten gewaschen. Unmittelbar darauf wurde 10%iges normales Kaninchenserum (Nichirei Corporation) auf den gewaschenen Schnitt auf jedem Glas-Objektträger gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Schnitte in PBS gewaschen. Ein Kulturüberstand einer 3 Tage- Kultur des Hybridoms HIK-1083 (Zugangsnummer P-13622) in normalem Medium [RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (10,2 g/l)-Medium, supplementiert mit Natriumhydrogencarbonat (2,2 g/l), L-Glutamin (0,3 g/l), Gentamycin (40 mg/l) und fötalem Kälberserum (10% v/v)] wurde sodann auf den gewaschenen Schnitt auf jedem Glas-Objektträger gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Schnitte in PBS gewaschen. Biotin-markierter anti-Maus-IgG + IgA + IgM (H + L)-Antikörper aus Kaninchen (Nichirei Corporation) wurde auf jeden Schnitt gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Schnitte in PBS gewaschen. Peroxidase-gekoppeltes Streptavidin (Nichirei Corporation) wurde sodann auf jeden Schnitt gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Schnitte in PBS gewaschen. Unmittelbar darauf wurde jeder gewaschene Schnitt etwa 4 Minuten in 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, mit 0,02% Diaminobenzidin (Dojindo Laboratories) und 0,005% wässrigem Wasserstoffperoxid für eine Farbentwicklung eingetaucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der menschliche Magendrüsen-typische Schleim (Klasse III Mukus) spezifisch durch Verwendung des in Beispiel 1 erhaltenen monoklonalen Antikörpers nachgewiesen werden kann. Tabelle 1
N. B. +: positiv in Bezug auf eine Färbung;
-: negativ in Bezug auf eine Färbung.

(2) Analyse der Bestandteile

Das Mukus-Glykoprotein-Antigen, mit dem der in Beispiel 1 erhaltene monoklonale Antikörper spezifisch reagiert, wurde untersucht.

(a) Herstellung von Abbauprodukten des Mukus-Glykoproteins

Mukus-Glykoprotein aus Schweinemagen (Sigma) wurde gemäß Carlson, Don M. (1968), J. Biol. Chem. 243, 616-626, einer 24-stündigen Hitzebehandlung bei 50ºC in 0,05 M wässriger Natriumhydroxidlösung mit 1 M Natriumborhydrid unterzogen.

(b) Trennung und Reinigung der vorstehend erwähnten Abbauprodukte

Die vorstehend in (a) erhaltene Reaktionslösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und auf eine Toyopearl HW-50S-Säule (Tosoh Corporation) gegeben, die mit 0,1 N Essigsäure vorequilibriert war. Die Säule wurde mit 0,5 N Essigsäure eluiert und das Eluat in 40 Fraktionen fraktioniert. Die Fraktionen wurden auf antigene Aktivität durch kompetitiven ELISA wie nachstehend beschrieben getestet und die Fraktionen mit antigener Aktivität, die zuletzt eluiert wurden, ausgewählt. Die ausgewählten Fraktionen wurden weiter in 70 Fraktionen durch HPLC unter Verwendung einer TSK-Gel NH&sub2;-60-Säule (Tosoh Corporation) fraktioniert und jede Fraktion auf antigene Aktivität durch kompetitiven ELISA wie nachstehend beschrieben getestet. Unter den resultierenden 70 Fraktionen wurden drei Fraktionen ausgewählt, die eine stärkere antigene Aktivität besaßen, und diese drei Fraktionen wurden kombiniert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Kompetitiver ELISA: Das gereinigte Mukus-Glykoprotein-Antigen wurde in 0,05 M Natriumcarbonat-Natriumhydrogencarbonat-Puffer, pH 9,6, bei einer Konzentration von 2 ug/ml gelöst. 100 ul der Lösung wurden zu jedem Loch einer für die Verwendung in einem ELISA angepassten Mikroplatte (Corning) hinzugegeben und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Jedes Loch wurde dreimal mit 0,05% Tween 20 in PBS (PBS-Tween) gewaschen, mit 2% Magermilch in PBS befüllt und sodann für 1 Stunde stehen gelassen. Die Löcher wurden dreimal mit PBS-Tween gewaschen. In einem getrennten Behälter wurden 50 ul der Probe, d. h. des vorstehend beschriebenen Säuleneluats der Abbauprodukte des Mukus-Glykoprotein-Antigens, 25 ul eines Kulturüberstands einer 3 Tage-Kultur des Hybridoms HIK-1083 (Zugangsnummer P-13622) in normalem Medium [RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (10,2 g/l)-Medium, supplementiert mit Natriumhydrogencarbonat (2,2 g/l), L-Glutamin (0,3 g/l), Gentamycin (40 mg/l) und fötalem Kälberserum (10% v/v)] und 25 ul eines vierfachen Konzentrats von PBS gemischt und das Gemisch 2 Stunden stehen gelassen. Dieses Gemisch wurde zu den gewaschenen Löchern hinzugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Löcher dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 100 ul einer 1 : 10 000-Verdünnung in PBS eines Peroxidase-gekoppelten anti-Maus-Immunoglobuline-Antikörpers aus Ziege (Tago, Inc.) als Sekundär-Antikörper zu jedem Loch hinzugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Löcher dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 100 ul einer ABTS- H&sub2;O&sub2;-Peroxidase-Substratlösung (Kirkegaard & Perry Laboratories) zu jedem Loch hinzugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die optische Dichte bei 415 nm für jedes Loch mit Hilfe eines Mikroplatten-Lesegeräts gemessen. Die Proben, die den Löchern entsprachen, die eine niedrigere optische Dichte als die Reaktionslösung in dem Loch aufwiesen, in dem das vorstehend beschriebene Verfahren unter Verwendung von destilliertem Wasser anstelle der Proben durchgeführt wurde, besaßen antigene Aktivität.

(c) Analyse des durch Eindampfen zur Trockne bei vermindertem Druck erhaltenen Produkts

Das vorstehend in (b) durch Eindampfen zur Trockne unter vermindertem Druck erhaltene Produkt wurde gemäß Sweeley et al. (Sweeley, C. C. (1963), J. Am. Chem. Soc. 85, 2497- 2507) trimethylsilyliert und sodann durch Gaschromatographie untersucht. Dabei wurde das vorstehend beschriebene Produkt einer Hitzebehandlung in Methanol mit 3% HCl unterzogen und Silbercarbonat wurde zu der Reaktionslösung für die Einstellung des pH auf 5 hinzugegeben. Unmittelbar darauf wurde Essigsäureanhydrid zu der Reaktionslösung hinzugegeben und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Gemisch wurde sodann bei 2000 Upm 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand entfernt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Ein Tri-Sil-Reagenz (Pierce) wurde hinzugegeben, um es in dem resultierenden einkonzentrierten Rest zu lösen. Nach Inkubation wurden kleine Mengen der Reaktionslösung in einen Modell GC7A-Gaschromatograph (Shimazu Corporation), der mit einer OV-1-Kapillarsäule (GL Science Inc.) mit einer Länge von 2,5 m und einem inneren Durchmesser von 0,25 mm ausgestattet war, injiziert, gefolgt von einem Nachweis mit Hilfe eines FID (Flammenionisationsdetektor). Die nachgewiesenen Signale wurden durch Vergleich mit Chromatogrammen identifiziert, die mit Standardsubstanzen unter den gleichen analytischen Bedingungen erhalten worden waren. Die Standardsubstanzen wurden durch Reaktion eines Tri-Sil-Reagenzes (Pierce) mit Fucose, Galactose, Glucose, Mannose, N-Acetylgalactosamin oder N-Acetylglucosamin hergestellt. Ferner wurde eine N-Acetylgalactosaminitol-Standardsubstanz durch Reduktion von N-Acetylgalactosamin in 0,2 M Borsäure-Puffer, pH 9, mit Natriumborhydrid hergestellt, gefolgt von der Reaktion mit einem Tri-Sil-Reagenz (Pierce). So wurde in dem konzentrierten Rest der vorstehend beschriebenen Fraktionen mit einer antigenen Aktivität N-Acetylgalactosaminitol, N-Acetylglucosamin, Fucose und Galactose nachgewiesen.

Beispiel 3

Reaktivität mit Zuckern

Für Methyl-2-acetamido-2-desoxy-α-D-glucopyranosid (Sigma) und Methyl-2-acetamido-2- desoxy-β-D-glucopyranosid (Sigma) wurde eine 1 mg/ml-Lösung in destilliertem Wasser hergestellt und zweifache serielle Verdünnungen davon unter Verwendung von destilliertem Wasser hergestellt. Die Reaktivität des in Beispiel 1 erhaltenen monoklonalen Antikörpers mit diesen wässrigen Lösungen wurde durch einen kompetitiven ELISA wie nachstehend beschrieben untersucht. Im Ergebnis verringerte das Methyl-2-acetamido-2-desoxy-α-D-glucopyranosid die optische Dichte in Abhängigkeit seiner Konzentration und somit wurde eine Reaktivität damit beobachtet, während keine derartige konzentrationsabhängige Veränderung der optischen Dichte bei Methyl-2-acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosid nachgewiesen wurde.
Kompetitiver ELISA: Das gereinigte Mukus-Glykoprotein-Antigen wurde in einem 0,05 M Natriumcarbonat-Natriumhydrogencarbonat-Puffer, pH 9,6, bei einer Konzentration von 2 ug/ml gelöst. 100 ul der Lösung wurden zu jedem Loch einer für die Verwendung in einem ELISA angepassten Mikroplatte (Corning) hinzugegeben und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Jedes Loch wurde dreimal mit 0,05% Tween 20 in PBS (PBS-Tween) gewaschen, mit 2% Magermilch in PBS aufgefüllt und sodann für 1 Stunde stehen gelassen. Die Löcher wurden dreimal mit PBS-Tween gewaschen. In einem getrennten Behälter wurden 50 ul der Probe, d. h. der vorstehend beschriebenen wässrigen Lösung, 25 ul eines Kulturüberstands einer 3 Tage-Kultur des Hybridoms HIK-1083 (Zugangsnummer P-13622) in normalem Medium [RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (10,2 g/l)-Medium, supplementiert mit Natriumhydrogencarbonat (2,2 g/l,), L-Glutamin (0,3 g/l), Gentamycin (40 mg/l) und fötalem Kälberserum (10% v/v)] und 25 u1 eines vierfachen Konzentrats von PBS gemischt und das Gemisch 2 Stunden stehen gelassen. Dieses Gemisch wurde zu den gewaschenen Löchern hinzugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Löcher dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 100 ul einer 1 : 10 000-Verdünnung in PBS eines Peroxidase-gekoppelten anti-Maus-lmmunoglobuline-Antikörpers aus Ziege (Tago, Inc.) als Sekundär-Antikörper zu jedem Loch hinzugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation Wurden die Löcher dreimal mit PBS- Tween gewaschen und 100 ul einer ABTS-H&sub2;O&sub2;-Peroxidase-Substratlösung (Kirkegaard & Perry Laboratories) zu jedem Loch hinzugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die optische Dichte bei 415 nm für jedes Loch mit Hilfe eines Mikroplatten- Lesegeräts gemessen.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper der IgM-Klasse, der Zuckerketten, umfassend α-gebundene N-Acetylglucosaminreste erkennt und spezifisch mit Mukus-Glykoproteinen reagiert, die von menschlichen Magendrüsen typischen mukösen Zellen produziert werden.

2. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei der monoklonale Antikörper der IgM-Klasse durch ein Hybridom erhältlich ist, das beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer P-13622 hinterlegt ist.

3. Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper der IgM-Klasse gemäß Anspruch 1 produziert.

4. Hybridom, hinterlegt beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer P-13622.

5. Verwendung des monokonalen Antikörpers gemäß Anspruch 1 oder 2 für die Analyse von in menschlichen Körperflüssigkeiten enthaltenen Mukus-Glykoproteinen, die von Magendrüsen typischen mukösen Zellen abstammen.