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DE69427799T2 - Anthracycline konjugate, deren herstellung und deren verwendung als antitumorwirkstoffe - Google Patents

Anthracycline konjugate, deren herstellung und deren verwendung als antitumorwirkstoffe

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DE69427799T2
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DE
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anthracycline
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polymer
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Francesco Angelucci
Maria Grandi
Antonino Suarato
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Pfizer Italia SRL
Original Assignee
Pharmacia and Upjohn SpA
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft lösliche synthetische Polymergebundene Anthracycline, ihre Herstellung und sie enthaltene pharmazeutische Zusammensetzungen.
  • Doxorubicin, 4'-Epidoxorubicin und 4-Demethoxydaunorubicin sind Beispiele von Anthracyclinen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind und die derzeit in der klinischen Behandlung von neoplastischen Malignomen verwendet werden; siehe z. B. F. Arcamon: "Doxorubicin" Medicinal Chemistry monograph, Band 17, Academic Press 1981.
  • Viele polymerische Derivate von Doxorubicin, die Antitumoraktivität besitzen, sind hergestellt worden. Unter diesen ist ein besonders vielversprechender Kandidat für die klinische Entwicklung lösliches Polymergebundenen-Toxorubicin, welches aus hydrophilen Anteilen und Peptid-Ketten, an welche Doxorubicin und 2-Hydroxypropylamin gebunden sind, bestehen. Dieses Polymer-gebundene Doxorubicin-Derivat wird hergestellt durch Kondensieren von Doxorubicinhydrochlorid mit einer methacrylischen polymerischen Vorstufe, enthaltend Peptidyl-Ketten, aktiviert als p-Nitrophenylester, in Dimethylsulfoxid in der Gegenwart von Triethylamin, gefolgt durch Aminolyse der zurückbleibenden Ester-Gruppen mit 1-Amino-2- hydroxypropan. Inkubation dieses Material mit lysosomalen Enzymen aus Ratten (Tritosomen) führt zur Spaltung der amidischen Bindung zwischen der terminalen Aminosäure und Doxorubicin [J. Kopecek et al., Biomaterials 10, 335 (1989); R. Duncan et al., Biochem. Pharmacol. 39, 1125 (1990); R. Duncan et al., J. Controlled Release 10, 51 (1989); 18, 123 (1992) und 19, 331 (1992)].
  • Duncan R. et al.: MAKROMOLECULARE CHEMIE, MACROMOLECULAR SYMPOSIA, Band 70/71, 1993, Seiten 157-162 beschreibt den Mechanismus der Wirkung von (2-Hydroxypropyl)methacrylamid-Copolymerkonjugaten auf die Abgabe von Doxorubicin.
  • Ein Problem mit konventionellen Verfahren, wie z. B. oben beschrieben, ist, daß es schwierig sein kann, das Doxorubicin aus dem Doxorubicin- Polymer-Konjugat zu entfernen. Dies liegt an der Bildung von π-Komplexen zwischen gebundenem und freiem Doxorubicin; es zeigte sich, daß sich das Material in Dialyse, molekularer Filtration und Gel-Chromatographie als eine Einheit verhält [J Feijen et al., J. Controlled Release, S. 301 (1985)].
  • Die Polymer-gebundenen Anthracyclin-Systeme der vorliegenden Erfindung basieren auf methacrylischen Polymeren, die hydrophilische Anteile tragen, Peptidyl-hängige Ketten gebunden nur an die Amino-Gruppe von Anthracyclin und Glycin-Reste, entweder in der Form der freien Säure oder in der Form eines Amid-Derivats. Diese Systeme haben den Vorteil über dem Stand der Technik, daß das Anthracyclin einfach aus dem Polymer, an das es gebunden ist, freigesetzt werden kann. Außerdem besitzen die erfindungsgemäßen Polymer-gebundenen Anthracycline eine breitere Antitumoraktivität und niedrigere allgemeine Toxizität als die entsprechenden freien Anthracycline.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Polymergebundenes Anthracyclin der Formel A bereit, welches im wesentlichen aus drei Einheiten besteht, dargestellt durch die Formeln (1), (2) und (3):
  • worin:
  • Gly Glycin darstellt;
  • n 0 oder 1 bedeutet;
  • x 70 bis 98 Mol-% bedeutet;
  • y 1 bis 29 Mol-% bedeutet;
  • z 1 bis 29 Mol-% bedeutet;
  • R&sub1; eine durch eine oder mehrere Hydroxy-Gruppen substituierte C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Gruppe bedeutet;
  • Y einen Aminosäure-Rest oder ein Peptid-Zwischenstück bedeutet;
  • [NH-D] der Rest eines Anthracyclinaminoglycosids [NH&sub2;-D] ist; und
  • Z eine Hydroxy-Gruppe oder einen Rest der Formel -NHR&sub1; bedeutet, worin R&sub1; wie oben definiert ist; und
  • Z eine Hydroxy-Gruppe oder einen wie oben definierten Rest der Formel -NHR&sub1; bedeutet.
  • Das Aminglycosidanthracyclin, von dem [NH-D] ein Rest ist, wird hier als [NH&sub2;-D] dargestellt, worin D die Struktur eines Anthracyclinaminoglycosids abzüglich der Amino-Gruppe des Zuckeranteils bedeutet.
  • Das Polymer-gebundene Anthracyclin enthält bevorzugt die Einheiten (1) in einem Bereich von 90 bis 98 Mol-%, die Einheiten der Formel (2) von 1 bis 10 Mol-% und die Einheiten der Formel (3) von 1 bis 10 Mol-%.
  • Die enzymatische in vivo-Hydrolyse der Peptidyl-Ketten führt zur Freisetzung lediglich des aktiven Arzneimittels D-NH&sub2;, während die Einheit 3 intakt bleibt.
  • Geeignete Alkyl-Gruppen, die R&sub1; darstellen kann, sind C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl- Gruppen, substituiert durch ein oder mehrere Hydroxy-Gruppen; Beispiele schließen Hydroxyethyl-, 2-Hydroxypropyl- und 3-Hydroxypropyl-Gruppen ein.
  • Der Peptid-Abstandshalter Y sollte für intrazelluläre Hydrolyse empfänglich sein. Der Abstandshalter kann gegenüber extrazellulärer Hydrolyse resistent sein. Der Peptid-Abstandshalter kann 1 bis 10, z. B. 2 bis 4 Aminosäure-Reste lang sein. Typischerweise ist der Peptid- Abstandshalter ein Tripeptid oder ein Tetrapeptid.
  • Jeder der Aminosäure-Reste des Peptid-Abstandshalters Y, der chiral ist, kann entweder als D- oder L-optisches Isomer, oder als eine D/L- Mischung vorhanden sein. Das übliche Dreibuchstaben-System zum Beschreiben von Aminosäuren wird hier angewendet, wobei die Symbole die L-Konfiguration der chiralen Aminosäure bedeuten, wenn nicht anders angegeben. Der Peptid- Abstandshalter Y kann als eine racemische Mischung oder als ein optisch reines Isomer vorhanden sein.
  • Bevorzugt wird Y ausgewählt aus Gly-Phe-Gly, Gly-Leu-Gly, Phe-Leu- Gly, Gly-Phe-Leu-Gly oder Leu-Leu-Gly, wobei der Glycyl-Rest in jedem Fall an das Aminoglycosidanthracyclin gebunden ist.
  • Der Aminoglycosidanthracyclin-Rest [NH-D] ist geeigneterweise der Rest eines Anthracyclinaminoglycosids [NH&sub2;-D] der folgenden Formel Q:
  • worin eines von RI und RII Wasserstoff und das andere eine Hydroxy- Gruppe oder Jod bedeutet; RIII Wasserstoff oder OCH&sub3; und RIV Wasserstoff oder eine Hydroxy-Gruppe bedeutet.
  • Bevorzugte Beispiele des Anthracyclinaminoglycosids [NH&sub2;-D] sind: Doxorubicin, 4'-Epidoxorubicin, 4-Demethoxydaunorubicin, Idarubicin und 4'-Jod-4'-desoxydoxorubicin.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung eines Polymer-gebundenen Anthracyclins A bereit, das im wesentlichen aus den Einheiten 1, 2 und 3 wie oben definiert besteht. Das Verfahren umfaßt:
  • (i) Umsetzen eines polymeren Zwischenprodukts (B), worin (B) im wesentlichen aus Einheiten der folgenden Formeln (1) und (4) besteht:
  • worin x, n und R&sub1; in Formel (1) wie oben definiert sind, w 30 bis 2 Mol-% bedeutet und R&sub2; eine Hydroxy-Gruppe oder eine Abgangsgruppe bedeutet; mit einem Anthracyclin-Derivat der allgemeinen Formel (5):
  • HY-[NH-D] (5)
  • worin [ND-D] und Y wie in Anspruch 1 definiert sind; und
  • (ii) wenn gewünscht ist, ein Polymer-gebundenes Anthracyclin, worin z in der Einheit der Formel (3) NHR&sub1; bedeutet, herzustellen: Umsetzen des Produkts aus Schritt (i), worin R&sub2; eine Abgangsgruppe bedeutet, mit einer Verbindung der Formel NH&sub2;R&sub1;, worin R&sub1; wie oben definiert ist.
  • Die Abgangsgruppe, die R&sub2; darstellen kann, ist geeigneterweise eine Phenyloxy-Gruppe, die im Phenyl-Ring durch ein oder mehrere elektronenziehende Gruppen substituiert ist. Beispiele von geeigneten elektronenziehenden Gruppe schließen Nitro (-NO&sub2;) und Halogen ein. R&sub2; ist bevorzugt die Abgangsgruppe
  • worin L eine elektronenziehende Gruppe, z. B. -NO&sub2; oder ein Halogen wie Fluor oder Chlor ist, und m ist eine ganze Zahl von 1 bis 5, typischerweise von 1 bis 3, bevorzugt 1 oder 2. Bevorzugt ist R&sub2; eine p-Nitrophenoxy- Gruppe oder eine 2,4-Dichlorphenoxy-Gruppe.
  • Verbindungen der Formel (5) werden einfach von dem polymerischen Konjugat der Formel (A) abgetrennt aufgrund ihrer hohen Lipophilie. Deshalb überwindet wie oben diskutiert der vorliegende Versuch zur Herstellung von Polymer-gebundenen Anthracyclinen einen Hauptnachteil der üblichen Kondensation von Anthracyclinen mit Polymeren, nämlich die Schwierigkeit des Trennens freien Anthracyclins vom Polymer-Konjugat.
  • Die polymerischen Zwischenprodukte (B), die wie oben definiert im wesentlichen aus Einheiten (1) und (4) bestehen, werden durch radikalische Copolymerisation von Methacryloyl-Verbindungen der folgenden Formeln (6) und (7):
  • gebildet, worin n, R&sub1; und R&sub2; wie oben definiert sind.
  • Einige Polymere, die im wesentlichen aus Einheiten (1) und (4) bestehen, sind aus der Literatur bekannt; z. B. wird ein Polymer (B1), das aus Einheit (1), worin R&sub1; -CH&sub2;CH(OH)CH&sub3; darstellt, n = 0; und Einheit (4), worin R&sub2; einen p-Nitrophenol-Rest darstellt, besteht, durch radikalische Präzipitationscopolymerisation von N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid [6a: R&sub1; = CH&sub2;CH(OH)CH&sub3;, n = 0] mit N-Methacryloylglycydyl-p-nitrophenylester [7a: R&sub2; = O-C&sub6;H&sub4;pNO&sub2;] hergestellt, wie in J. Kopecek, Makromol. Chem. 178, 2159 (1977) beschrieben. Polymerische Zwischenprodukte, die aus Einheiten (1) und (4) bestehen, worin R&sub2; Hydroxy darstellt, können durch radikalische homogene Polymerisation hergestellt werden.
  • Manche Monomer der Formeln (6) und (7) sind bekannt. Verbindungen der Formel (6), worin n = 0 und R&sub1; eine Alkyl-tragende sekundäre Hydroxy-Gruppe ist, werden üblicherweise durch Umsetzen von Methacryloylchlorid mit aliphatischem Amin, das sekundäre Hydroxy-Gruppen trägt hergestellt. Andererseits können Verbindungen der Formel (6), worin n = 0 und R&sub1; der Rest einer Alkyl-tragenden primären Hydroxy-Gruppe ist, aus Methacrylsäure und Amino-Verbindungen in der Gegenwart eines Kondensationsmittels wie 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin hergestellt werden.
  • Die Peptidyl-anthracyclin-Derivate der Formel (5) sind ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung. Verfahren für ihre Herstellung sind bekannt. Z. B., da es wichtig ist, ein geeignetes n-geschütztes Peptid mit Anthracyclin umzusetzen, muß die N-schützende Peptidyl-Gruppe aus denen ausgewählt werden, die unter Bedingungen entfernt werden, bei dem das Anthracyclin stabil ist. Ein Beispiel ist die Triphenylmethyl-Gruppe.
  • Die Peptidylanthracyclin-Derivate der Formel (5) können durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend:
  • (i) Umsetzen eines N-geschützten Peptids der Formel (8) oder (9):
  • R&sub3;-Y-OH (8) R&sub3;-Y-P (9)
  • worin R&sub3; eine säureempfindliche Amino-Schutzgruppe bedeutet, P eine Abgangsgruppe bedeutet und Y ein wie oben definierter Aminosäurerest oder Peptid-Abstandshalter ist, mit einem wie oben definierten Anthracyclinaminoglycosid [NH&sub2;-D] zur Herstellung eines Zwischenprodukts der allgemeinen Formel (10):
  • R&sub3;-Y-[NH-D] (10)
  • worin [NH-D], Y und R&sub3; wie oben definiert sind; und
  • (ii) Entfernen der Schutzgruppe R&sub3; zum Erhalt des Peptidylanthracyclins (5) in Form einer freien Base.
  • P kann eine Abgangsgruppe wie oben für R&sub2; definiert und veranschaulicht sein. Außerdem kann P eine Pentafluorphenyloxy- oder N-Hydroxysuccinimido-Gruppe sein. Beispiele der säureempfindlichen Schutzgruppe R&sub3; schließen Trityl- und Diphenylamino-Gruppen ein.
  • Peptidyl-Derivate der Formel (8) und 9 werden gemäß synthetischen Standardverfahren, die aus der Peptid-Literatur bekannt sind, hergestellt. Schutz der Amino-Funktion mit einer säureempfindlichen Gruppe wie Triphenylmethyl wird typischerweise gemäß Theodoropoulos et al. [J. Org. Chem. 47, 1324 (1982)] durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen, die für die Herstellung von Verbindungen (8), (9) und (10) angewendet werden, sind so entworfen, um Racemisierung zu vermeiden; die resultierenden Peptidyl- Derivate besitzen deshalb die gleiche Konfiguration wie die Ausgangsaminosäuren.
  • Um Anthracyclin-Derivate der Formel (5) herzustellen, kann Verbindung (9) mit einem Anthracyclinhydrochloridsalz in einem wasserfreien polaren Lösungsmittel, wie Dimethylformamid in der Gegenwart äquivalenter Mengen einer organischen Base wie Triethylamin, z. B. bei Raumtemperatur 15 h umgesetzt werden, zum Erhalt eines Zwischenproduktes der Formel (10), das durch Säulenchromatographie gereinigt wird und dann zum Derivat der Formel (5) entblockiert wird, z. B. in wäßriger 75%iger Essigsäure bei Raumtemperatur.
  • Es sollte beachtet werden, daß die Reaktion von Anthracyclinen, die eine Hydroxy-Gruppe in Position C-14 tragen, wie Doxorubicin und 4'-Epidoxorubicin in der Form von Hydrochloridsalz, mit aktivierten Peptidyl-Derivaten von Formel (9), in der Gegenwart der organischen Base, die zum Entblockieren der 3'-Amino-Gruppe der Anthracycline benötigt wird, in einem polaren Lösungsmittel, eine Mischung des Derivats (10) und Anthracyclinen, die sowohl in der Amino-Gruppe des Zuckeranteils und der C-14- Position substituiert sind benötigt. Die Bis(3'-N,14-O-peptidyl)-Derivate werden aus der Mischung durch Chromatographie entfernt.
  • Verbindungen der Formel (10) können auch durch Kondensieren eines N-geschützten Peptids der Formel (8) mit einem Anthracyclin als Hydrochloridsalzes in einem trockenen polaren Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid in der Gegenwart einer äquivalenten Menge Kondensationsmittel wie 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin hergestellt werden. Dieses Verfahren benötigt keine Bispeptidyl-Derivate von Anthracyclinen, die C-14 Hydroxy-Gruppen tragen.
  • Die Kondensation von Zwischenprodukt (B) mit Peptidylanthracyclin- Derivaten der Formel (5), wahlweise gefolgt durch Ersetzen der zurückbleibenden Abgangsgruppen, benötigt Polymer-gebundene Anthracycline, die im wesentlichen aus Einheiten (1), (2) und (3) bestehen. Es sollte herausgestellt werden, daß dieses Verfahren die Bildung von Ester-Bindungen zwischen primären Hydroxy-Gruppen und anhängenden Glycyl-aktivierten Estern vermeidet.
  • Polymer-gebundene Arzneimittel der Formel (A), worin Rest Z der Einheit (3) eine Gruppe der Formel NHR&sub1; darstellt, wie oben definiert, werden bevorzugt durch Umsetzen von Zwischenprodukt (B), worin R&sub2; eine Abgangsgruppe wie oben definiert ist, mit einem Anthracyclin-Derivat der Formel (5) in einem wasserfreiem polaren organischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid hergestellt. Die Reaktion kann üblicherweise in 8 bis 24 Stunden durchgeführt werden. Die Reaktion wird üblicherweise bei einer Temperatur bei 15 bis 30ºC, bevorzugt bei Raumtemperatur für 15 Stunden durchgeführt, dann werden die zurückbleibenden Abgangsgruppen durch Umsetzen des Konjugats mit einer Verbindung der Formel NH&sub2;R&sub1;, wie oben definiert, für 0,5 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur ersetzt.
  • Polymer-gebundene Arzneimittel der Formel A, worin Rest Z der Einheit (2) eine Hydroxy-Gruppe darstellt, werden bevorzugt durch Umsetzen von Zwischenprodukt (B), worin R&sub2; Hydroxy ist, mit einem Anthracyclin-Derivat der Formel (5) in einem wasserfreien polaren organischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid hergestellt. Die Reaktion kann typischerweise in 8 bis 24 Stunden durchgeführt werden. Die Reaktion wird üblicherweise bei einer Temperatur von 15 bis 30ºC, bevorzugt bei Raumtemperatur für 15 Stunden durchgeführt.
  • Z. B. um ein Polymer-gebundenes Anthracyclin, worin Z ein Rest NHR&sub1;, wie oben definiert ist, herzustellen, wird ein Zwischenprodukt (B), worin R&sub2; eine Abgangsgruppe wie p-Nitrophenoxy ist, mit einem Peptidylanthracyclin (5) bei Raumtemperatur 15 Stunden behandelt. (B) wird vorteilhafterweise zu 14% G/V und (5) zu 2,3% G/V angewendet. Eine Verbindung der Formel NH&sub2;R&sub1;, wie oben definiert, wird dann dazugegeben, typischerweise zu 0,1% G/V und die Reaktionsmischung wird 3 Stunden auf Raumtemperatur gehalten. Das Konjugat wird mit Aceton ausgefällt, in absolutem Ethanol gelöst, typischerweise in einer Konzentration von 8% (G/G) und wieder mit Aceton ausgefällt zum Erhalt des gewünschten Polymergebundenen Anthracyclins.
  • In dem oben beschriebenen Verfahren wird die Bildung von Ester- Bindungen zwischen dem C-14-hydroxylierten Anthracyclin und hängigem Glycyl-aktivierten Ester aufgrund der Abwesenheit irgendeiner organischen Base in dem Kondensationsprozeß vermieden.
  • In einem anderen Beispiel zum Herstellen eines Polymer-gebundenen Anthracyclins (A), worin Z Hydroxy ist, wird Zwischenprodukt (B), wie oben definiert, worin R&sub2; Hydroxy ist, in wasserfreiem Dimethylsulfoxid mit einem Peptidylanthracyclin (5) bei Raumtemperatur 15 h behandelt. (B) wird geeigneterweise zu 14% G/V und (5) zu 2,3% G/V verwendet. Das Konjugat wird dann mit Aceton ausgefällt, in absolutem Ethanol gelöst, typischerweise in einer Konzentration von 8% (G/G) und wieder mit Aceton ausgefällt, zum Erhalt eines Polymer-gebundenen Anthracyclins der Formel (A), wie oben definiert.
  • Der Anthracyclin-Gehalt des Konjugats (A) wird durch Analyse des aus gebundenem Anthracyclin durch Säurehydrolyse freigesetzten Aglycons bestimmt; so ist Adriamycinon der Aglycon-Anteil von Doxorubicin und 4'-Epirubicin, und 4-Demethoxydaunomycinon der von 4-Demethoxydaunorubicin.
  • Erfindungsgemäße Polymer-gebundene Anthracycline zeigen gute Wasserlöslichkeit, Biokompatibilität, Stabilität bei physiologischem pH und Freisetzen des freien aktiven Arzneimittels, D-NH&sub2;, nach Inkubation mit lysosomalen Enzymen.
  • Verbindungen der Formel (A) zeigen erhöhte Antitumoraktivität in experimentellen Modellen und reduzierte allgemeine Toxizität, wenn mit freiem Anthracyclin verglichen.
  • Die Polymer-gebundenen Anthracycline der Formel (A) besitzen Antitumoraktivität. Ein Mensch oder Tier kann deshalb durch ein Verfahren umfassend Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polymergebundenen Anthracyclins der Formel (A) behandelt werden. Der Zustand des menschlichen oder tierischen Patienten kann so verbessert werden.
  • Der verwendete Dosierungsbereich wird vom Verabreichungsweg und dem Alter, Gewicht und Zustand des behandelten Patienten abhängen. Die Polymergebundenen Anthracycline der Formel (A) werden üblicherweise parenteral, z. B. intramuskulär, intravenös oder durch Bolusinfusion verabreicht. Ein geeigneter Dosisbereich ist von 5 bis 800 mg/m² Anthracyclin-Äquivalent, z. B. von 20 bis 500 mg/m². Ein geeigneter Bereich bringt Verabreichen einer Lösung von 25 mg Anthracyclin-Äquivalent/m² intravenös in einem Volumen von 10 ml/kg Körpergewicht über 2 Wochen Dauer an Tagen 5, 9 und 15 mit sich.
  • Die Polymer-gebundenen Anthracycline der Formel (A) können in eine pharmazeutische Zusammensetzung zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Diluens formuliert werden. Typischerweise werden die Polymer-gebundenen Anthracycline zur parenteralen Verabreichung z. B. durch Lösen in sterilem Wasser oder Wasser zur Injektion formuliert. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter.
  • Beispiele 1 bis 6 betreffen synthetische Verfahren für die Herstellung von Monomeren der Formel (6) und (7) und polymerische Zwischenprodukte der Formel (B). Beispiel 1 [N-(Methacryloylglycyl)-12-hydroxypropylamid (6b)
  • Methacryloylglycyl-p-nitrophenylester ((7a): 5,28 g, 20 mmol), hergestellt wie in Makromol. Chem. 178, 2159 (1977) beschrieben, wurden in wasserfreiem Tetrahydrofuran (20 ml) gelöst und mit 1-Amino-2-hydroxypropan (3,2 ml, 40 mmol) behandelt. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und die Titelverbindung (6b) (3,3 g, Ausbeute 82,5%) wurde nach Kristallisation mit Aceton/Ethylether gewonnen.
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem Methylenchlorid/Aceton (90 : 10 pro Volumen), Rf = 0,47. Beispiel 2 [N-(Methacryloylglycyl)]-hydroxyethylamid (6c)
  • Zu einer gerührten Mischung von 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2- dihydrochinolin (37 g, 0,15 mol) und Aminoethanol (9,75 g, 0,15 mol) in wasserfreiem Toluol (150 ml), wurde in wasserfreiem Toluol (300 ml) gelöste Methacrylsäure (14 ml, 0,165 mol) in 15 Minuten zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 24 h gerührt. Die Titelverbindung (6c) wurde nach Ausfällen mit n-Hexan gewonnen.
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem Methylenchlorid/Aceton (90 : 10 pro Volumen), Rf = 0,35. Beispiel 3 [N-(Methacryloylglycyl)]-2,3-dichlorphenylester (7b)
  • Die Titelverbindung (7b) wurde aus Methacryloylglycin (2,66 g, 20 mmol) wie in Makromol. Chem. 178, 2159 (1977) beschrieben hergestellt, und 2,4-Dichlorphenol (3,26 g, 20 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (50 ml) und in Gegenwart von DCC (4,2 g, 21 mmol) hergestellt. Verbindung (7b) (4,7 g, Ausbeute 82%) wurde aus Ethylacetat und n-Hexan kristallisiert.
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem Ethylether, Rf = 0,47. Beispiel 4 Copolymer von N-Methacryloylamid-2-hydroxypropan und N-Methacryloylglycin (B2)
  • N-Methacryloylamid-2-hydroxypropan (25,2 g, 0,18 mol), Methacryloylglycin (2,86 g, 20 mmol) und α,α'-Azoisobutyronitril (5,9 g) wurden in wasserfreiem Methanol (164 ml) gelöst. Die Mischung wurde 20 Stunden bei 60ºC unter Stickstoff bewahrt, dann wurde die Reaktionsmischung zu Aceton (2000 ml) unter Rühren gegeben. Das Präzipitat wurde gesammelt, mit Aceton gewaschen und bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, zum Erhalt des Titel-Polymers (B2) (26 g). Gehalt an Carboxy- Gruppen (Gew.): 10 Mol-%. Beispiel 5 Copolymer von [N-(Methacryloylglycyl)-12-hydroxypropanolamid und N-(Methacryloylglycyl)-2,4-dichlorphenylester (B3)
  • Verbindung (6b) (14,4 g, 72 mmol) und Verbindung (7b) (5,19 g, 18 mmol) wurden in wasserfreiem Aceton (300 ml) und in der Gegenwart von α,α'-Azoisobutyronitril (1 g, 6 mmol) wie in Makromol. Chem. 178 2159 (1977) beschrieben zur Titelverbindung (B3) polymerisiert. Das polymerische Material wurde durch Filtration aus der Reaktionsmischung gewonnen, in absolutem Ethanol gelöst und mit Aceton wieder ausgefällt. Chlor-Gehalt: berechnet 6,89 Mol-%, gefunden 2,84 Mol-% (Gew.). Beispiel 6 Copolymer von [N-(methacryloylglycyl)]hydroxyethylamid und N-Methacryloylglycin (B4)
  • Das titelpolymerische Zwischenprodukt (B4) wurde aus N-Methacryloylamid-2-hydroxyethan ((6c): 23,2 g, 0,18 mol), Methacryloylglycin (2,86 g, 20 mmol) und α,α'-Azobisisobutyronitril (5,9 g) in wasserfreiem Methanol (164 ml) wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Gehalt an Carboxy-Gruppen (Gew.): 10%.
  • Beispiele 7 bis 12 betreffen Verfahren zur Herstellung von Peptidylanthracyclinen der Formel (5)
    • Beispiel 7 N-Trityl-L-phenylalanyl-L-leucylglycyl-4-nitrophenylester (C&sub6;H&sub5;)&sub3;C-L-Phe-L-Leu-Gly-OC&sub6;H&sub4;pNO&sub2; (9a)
  • N-Trityl-L-phenylalanin (20,3 g, 80 mmol), hergestellt wie beschrieben in J. Org. Chem. 47, 1324 (1982) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (150 ml) gelöst und mit wasserfreiem N-Hydroxybenzotriazol (8 g) zusammengegeben. Die Mischung wurde auf 0ºC gekühlt und mit 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (11,7 g, 50 mmol) behandelt und nach 10 min zu einer Lösung von L-Leucylglycinethylester-p-toluolsulfonatsalz (20 g, 50 mmol) in einer Mischung von wasserfreiem Tetrahydrofuran (100 ml) und N-Methylmorpholin (7 ml) getropft. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde auf 0ºC und über Nacht auf Raumtemperatur gehalten, dann wurde filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohmaterial, gelöst in Ethylacetat, wurde nacheinander mit gekühlter 5%iger wäßriger Zitronensäure (3 · 100 ml), gekühltem 5% wäßrigem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, dann eingeengt und auf Kieselgel durch Eluieren mit einer Mischung von Methylenchlorid und Methanol (99 : 1 pro Volumen) chromatographiert, zum Erhalt von N-Trityl-L-phenylalanyl-L-leucylglycinethylester (18 g, 30 mmol), das durch Behandeln in Ethylalkohol 95% (400 ml) mit 1 N Natriumhydroxid (30 ml) für zwei Stunden bei Raumtemperatur umgewandelt wurde.
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem Ethylether (80 : 20 pro Volumen), Rf = 0,53.
  • ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): 0,88 (d, J = 5,9 Hz, 6H, δ + δ'Leu); 1,2-1,6 (m, 3H, β + β'Leu); 2,00 (dd, J = 5,7 Hz, J = 13,4 Hz, 1H, ßPhe); 2,83 (dd, J = 5,2Hz, J = 13,4 Hz, 1H,β'Phe); 3,51 (t, J = 5,4, 1H, αPhe); 3,99 (d, J = 4,4 Hz, 2H, α + α'Gly); 4,55 (m, 1H, αLeu); 6,8-7,4 (m, 22H, NHGly, NHLeu, 4-C&sub6;H&sub5;).
  • Verbindung (8a) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (450 ml) gelöst und p-Nitrophenol (5,5 g, 40 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde auf 0ºC gekühlt, eine Lösung von 1,3-Dicyclohexylcarbodümid (8,24 g, 40 mmol) zugetropft und über Nacht auf 4ºC gehalten. Danach wurde die Reaktionsmischung filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und auf 0ºC gekühlt. Nach einer Stunde wurde die Mischung filtriert und das Lösungsmittel entfernt zum Erhalt der Titelverbindung (9a) (20 g, Ausbeute 97%).
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem Ethylether, Rf = 0,80.
  • FD-MS: m/z 699 [M + H]&spplus;.
  • ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): 0,86 (d, J = 6,2 Hz, 3H, δLeu); 0,88 (d, J = 6,4 Hz, 3H, δ'Leu); 1,2-1,8 (m, 3H, β + β'Leu); 1,90 (dd, J = 5,9 Hz, J = 13,5 Hz, 1H, δPhe); 2,89 (dd, J = 4,6 Hz, J = 13,5 Hz, 1H, β'Phe); 3,52 (dd, J = 4,6 Hz, J = 5,9 Hz, 1H, αPhe); 4,0-4,4 (m, 3H, αLeu, α + α'Gly); 6,78 (t, J = 5,7 Hz, 1H, NHGly); 7,04 (d, J = 7,7 HZ, 1H, NHLeu);
  • 6,8-7,4 (m, 22 Hz, 4-C&sub6;H&sub5; und 2,6
  • 8,25 (m, 2H, 5,5
    • Beispiel 8 N-Trityl-glycyl-L-phenylalanyl-L-leucylglycyl-p-nitrophenylester (C&sub6;H&sub5;)&sub3;C-Gly-L-Phe-L-Leu-Gly-OC&sub6;H&sub4;pNO&sub2; (9b)
  • Zwischenprodukt N-Trityl-L-phenylalanyl-L-leucylglycylethylester (6 g, 10 mmol), hergestellt wie beschrieben in Beispiel 7, wurde mit 75% wäßriger Essigsäure bei Raumtemperatur eine Stunde behandelt, zum Erhalt von L-Phenylalanyl-L-leucylglycylethylester, das mit N-Tritylglycin (3 g, 10 mmol) in der Gegenwart von N-Hydroxybenzotriazol und 1,3- Dicyclohexylcarbodiimid kondensiert wurde, zum Erhalt der Titelverbindung (9b) (3,8 g, Ausbeute 50%).
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem Ethylether, Rf = 0,63.
  • FD-MS: m/z 755 [M + H]&spplus;. Beispiel 9 3'-N-(Glycyl-L-leucyl-L-phenylalanyl)doxorubicin (5a)
  • Doxorubicinhydrochlorid (2,9 g, 5 mmol), gelöst in wasserfreiem Dimethylformamid (50 ml) und Triethylamin (0,5 ml) wurde mit N-Tritylphenylalanylleucylglycyl-p-nitrophenylester ((9a): 3,5 g, 5 mmol), hergestellt wie in Beispiel 7 beschrieben, umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht auf Raumtemperatur gehalten, dann mit einer 1 : 1-Mischung von Ethylether und n-Hexan ausgefällt. Der Feststoff wurde durch Kieselgel- Säulenelution mit einer Mischung von Methylenchlorid und Methanol (98 : 2 pro Volumen) gereinigt, zum Erhalt von N-geschützten Peptidyldoxorubicin (10a) (4,6 g).
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem Methylenchlorid/Methanol (95 : 5 pro Volumen), Rf = 0,35.
  • FD-MS: m/z 1103 [M + H]&spplus;.
  • Verbindung (10a) wurde mit 75% wäßriger Essigsäure (250 ml) eine Stunde bei Raumtemperatur gelöst, dann mit einer 1 : 1-Mischung von Wasser und Methylenchlorid (2500 ml) verdünnt und mit festen Natriumbicarbonat auf pH 7 gebracht. Die organische Phase wurde abgetrennt und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt zum Erhalt der Titelverbindung (5a) (3,45 g, Ausbeute 80%).
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem Methylenchlorid/Methanol/Essigsäure/Wasser (80 : 20 : 7 : 3 pro Volumen), Rf = 0,47.
  • FD-MS: m/z 861 [M + H]&spplus;.
  • ¹H-NMR (400 MHz, DMSO): 0,80 (d, J = 6,4 Hz, 3H, δLeu); 0,83 (d, J = 6,4 Hz, 3H, δ'Leu); 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H, 6'CH&sub3;); 1,3-1,6 (m, 4H, β + β'Leu und 2'ägH); 1,83 (ddd, J = 2,8 Hz, J = 13,2 Hz, J = 13,2 Hz, 1H, 2'axH); 2,09 (dd, J = 6,0 Hz, J = 14,5 Hz, 1H, 8axH); 2,18 (d, J = 14,5 Hz, 1H, 8-eq); 2,8- 3,2 (m, 4H, 10CH&sub2; und βPhe); 3,36 (m, 1H, 4'); 3,64 (m, 2H, αGly); 3,95 (s, 3H, -OCH&sub3;); 3,9-4,1 (m, 2H, 3' und αPhe); 4,15 (q, J = 6,4 Hz, 1H, 5'H); 4,29 (q, J = 7,78z, 1H, αLeu); 4,55 (s, 2H, 14CH&sub2;); 4,7-5,0 (m, 3H, 7H und 4'OH und 14OH); 5,20 (d, J = 3,4 Hz, 1H, 1'H); 5,46 (s, 1H, 9OH); 7,1-7,3 (m, 5H, Ar-Phe); 7,54 (d, J = 8,5Hz, 1H, 3'NH); 7,63 (m, 1H, 3H); 7,88 (m, 2H, 1H und 2H); 8,17 (m, 4H, NH&sub3;&spplus; und NHGly); 8,70 (d, J = 8,1 Hz, 1H, NHLeu); 13,23 (s, 1H, 11OH); 14,00 (s, 1H, 6OH). Beispiel 10 3'-N-(Glycyl-L-leuchyl-L-phenylalanylglycyl)doxorubicin (5b)
  • Doxorubicinhydrochlorid (2,9 g, 5 mmol) wurde mit N-Trityl-glycyl-L- phenylalanyl-L-leucylglycyl-p-nitrophenylester ((9b): 3,8 g, 5 mmol), hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben, umgesetzt und dann mit 75% wäßriger Essigsäure wie in Beispiel 9 beschrieben behandelt, zum Erhalt der Titelverbindung (5b) (4 g, Ausbeute 90%).
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem
  • Methylenchlorid/Methanol/Essigsäure/Wasser (80 : 20 : 7 : 3 pro Volumen), Rf = 0,44.
  • FD-MS: m/z 938 [M + H]&spplus;. Beispiel 11 4-Demethoxy-3'-N-(glycyl-L-leucyl-L-phenylalanyl)daunorubicin (5c)
  • Die Titelverbindung (5c) (3 g, Ausbeute 75%) wurde aus 4-Demethoxydaunorubicinhydrochlorid (2,9 g, 5 mmol) und N-Tritylphenylalanylleucylglycyl-p-nitrophenylester ((9a): 3,5 g, 5 mmol) hergestellt, gefolgt von dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 9 beschrieben.
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem Methylenchlorid/Methanol/Essigsäure/Wasser (80 : 20 : 7 : 3 pro Volumen), Rf = 0,51.
  • FD-MS: m/z 815 [M + H]&spplus;.
  • ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): 0,84 (d, J = 6,0 Hz, 3H, δLeu); 0,88 (d, J = 6,0 Hz, 3H, δ'Leu); 1,27 (d, J = 6,4 Hz, 3H, 6'CH&sub3;); 1,4-1,7 (m, 3H, β + β'Leu); 1,7-2,0 (m, 2H, 2'CH&sub2;); 2,06 (dd, J = 4,2H, J = 14,9 Hz, 1H, 8axH); 2,32 (d, J = 14,9 Hz, 1H, 8ägH); 2,40 (s, 3H, COCH&sub3;); 2,70 (dd, J = 8,6 Hz, J = 13 Hz, 1H, βPhe); 3,12 (dd, J = 4,2 Hz, J = 13,7 Hz, 1H, β'Phe); 2,94, 3,23 (zwei d, J = 19,2 Hz, 2H, 10CH&sub2;); 3,5-3,8 (m, 3H, 4'H, αPhe und αGly); 3,9- 4,3 (m, 4H, α'Gly, αLeu, 5H, 3'H); 5,19 (m, 1H, 7H); 5,45 (d, J = 2,7 Hz, 1H, 1'H); 6,9-8,4 (m, 12H, 1H, 2H, 3H, 4H, ArPhe, 3'NH, NHGly, NHLeu). Beispiel 12 4'-Epi-3'-N-(glycyl-L-leucyl-L-phenylalanyl)doxorubicin (5d)
  • Die Titelverbindung (5d) (3,25 g, Ausbeute 86%) wurde aus 4'-Epidoxorubicinhydrochlorid (2,9 g, 5 mmol) und N-Tritylphenylalanylleucylglycyl-p-nitrophenylester ((9a): 3,5 g, 5 mmol), hergestellt, gefolgt von dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 9 beschrieben.
  • DSC auf Kieselgelplatte F&sub2;&sub5;&sub4;(Merck), Elutionssystem Methylenchlorid/Methanol/Essigsäure/Wasser (80 : 20 : 7 : 3 pro Volumen), Rf = 0,46.
  • FD-MS: m/z 861 (M + H)&spplus;.
  • ¹H-NMR (400 MHz, DMSO): 0,79 (d, J = 6,3 Hz, 3H, δLeu); 0,81 (d, J = 6,3 Hz, 3H, δ'Leu); 1,19 (d, J = 5,9 Hz, 3H, 6'CH&sub3;); 1,3-1,6 (m, 4H, 2'Hax, β,β'Leu, Leu); 1,82 (dd, J = 4,7 Hz, J = 12,5 Hz, 1H, 2'Häg); 2,1-2,3 (m, 2H, 8-CH&sub2;); 2,59 (dd, J = 8,2 Hz, J = 13,7 Hz, 1H, βPhe); 2,9-3,1 (m, 4H, β'Phe, 10-CH&sub2;, hH); 3,41 (dd, 4,7 Hz, J = 8,2 Hz, αPhe); 3,54 (dd, J = 5,5 Hz, J = 16,4 Hz, 1H, αGly); 3,67 (dd, J = 6,2 Hz, J = 16,4 Hz, 1H, α'Gly); 3,80 (m, 1H, 3'H); 3,90 (m, 1H, 5'H); 3,95 (s, 3H, O0CH&sub3;); 4,18 (m, 1H, αLeu); 4,55 (m, 2H, 14-CH&sub2;); 4.3-5.0 (m, 3H, 14-OH, 78,4'-OH); 5,17 (d, J = 3,1 Hz, 1H, 1'H); 5,46 (s, 1H, 9-OH); 7,1-7,3 (m, 5H, Ar-Phe); 7,53 (d, J = 8,2 Hz, 1H, NH-Gly); 7,60 (m, 1H, 3H); 7,86 (m, 2H, 1H, 2H); 8,05 (d, J = 6,4 Hz, 1H, NH-Leu); 8,11 (t, J = 5,9 Hz, 1H, NH-Gly).
  • Beispiele 13 bis 18 veranschaulichen die Verfahren für die Herstellung von Polymer-gebundenen Anthracyclinen der Formel (A). Beispiel 13 Copolymer von 3-Methacryloylamino-2-hydroxypropan-3'-N- (methacryloylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucylglycyl)doxorubicin und N-Methacryloylglycin (A1)
  • Polymerische Vorstufe (B2) (7,15 g, 5 mmol von -COOH), hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben und 3'-N-(Glycyl-leucyl-L-phenylalanyl)doxorubicin ((5a): 2,36 g, 2,5 mmol) wurden in wasserfreiem Dimethylformamid (100 ml) gelöst, dann wurde N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (0,7 g, 2,5 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde 24 Stunden unter Rühren auf Raumtemperatur gehalten, dann in Ethylether (800 ml) gegossen. Das Präzipitat wurde in Ethanol (100 ml) gelöst, mit Aceton (800 ml) ausgefällt · und bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, zum Erhalt der Titelverbindung (A1) (7 g). Doxorubicin.HCl-Gehalt: 9% (G/G). Beispiel 14 Copolymer von 3-Methacryloylamino-2-hydroxyropan-3'-N- (methacryloylglycyl-L-phenylalanyl-leucylglycyl)doxorubicin und (N-Methacryloylglycyl)-2-hydroxypropanolamid (A2)
  • Polymerische Vorstufe (B1) (10 g, 2,7 · 10&supmin;³ äq von p-Nitrophenylester), hergestellt wie in Makromol. Chem. 178, 2159 (1977) beschrieben, wurde in trockenem Dimethylformamid (60 ml) gelöst und 3'-N-(Glycyl-leucyl-L-phenylalanyl)doxorubicin ((5a): 1,53 g, 1,72 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde 24 h unter Rühren auf Raumtemperatur gehalten, dann 1-Aminopropanol (0,13 ml) zugegeben. Nach einer Stunde wurde die Reaktionsmischung zu einer gerührten Mischung von Aceton/Ethylacetat (1,2 l, 3/1 pro Volumen) gegeben und filtriert. Das Präzipitat wurde in Ethanol (150 ml) gelöst und mit Aceton/Ethylether (1,2 l, 4/1 pro Volumen) präzipitiert, zum Erhalt der polymerischen Verbindung der Formel (A2) (10 g).
  • Doxorubicin.HCl-Gehalt: 9% (G/G). Beispiel 15 Copolymer von 3-Methacryloylamino-2-hydroxypropan-4-demethoxy-3'-N- (methacryloylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucylglycyl)daunorubicin und N-Methacryloylglycin (A3)
  • 4-Demethoxy-3'-N-(glycyl-L-Ieucyl-L-phenylalanyl)daunorubicin ((5d): 1,48 g, 1,72 mmol) wurde mit polymerischer Vorstufe (B2) (10 g) in der Gegenwart von N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (0,48 g) in wasserfreiem Dimethylformamid, wie beschrieben in Beispiel 13, zum Erhalt der Titelverbindung (A3) umgesetzt.
  • 4-Demethoxydaunorubicin.HCl-Gehalt: 9% (G/G). Beispiel 16 Copolymer von 3-Methacryloylamino-2-hydroxypropan-4'-epi-3'-N- (methacryloylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucylglycyl)doxorubicin und I-N-(Methacryloylglycyl)-2-hydroxypropan (A4)
  • 4'-Epi-3'-N-(glycyl-L-leucyl-L-phenylalanyl)doxorubicin ((5e): 1,48 g, 1,72 mmol) wurde mit polymerischer Vorstufe (B1) gefolgt von 1-Aminopropanol (0,13 ml), wie in Beispiel 14 beschrieben, umgesetzt, zum Erhalt von 4'-Epidoxorubicin-Polymerkonjugat der Formel (A4) (10 g).
  • 4'-Epidoxorubicin.HCl-Gehalt: 9% (G/G). Beispiel 17 Copolymer von 3-Methacryloylamino-2-hydroxypropan-4'-epi-3'-N- (methacryloylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucylglycyl)doxorubicin und N-Methacryloylglycin (A5)
  • Die Titelverbindung wurde wie in Beispiel 13 beschrieben aus polymerischem Zwischenprodukt (82), 4'-Epi-3'-N-(glycylleucyl-L- phenylalanyl)doxorubicin (5e) und N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2- dihydrochinolin in wasserfreiem Dimethylformamid hergestellt. Beispiel 18 Copolymer von [N-(Methacryloylglycyl)]hydroxyethylamid-3'-N- (methacryloylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucylglycyl)doxorubicin und N-Methacryloylglycin (A6)
  • Das Titel-Doxoribicin-polymerische Prodrug (A6) wurde durch Kondensierung von polymerischem Zwischenprodukt (B4) und 3'-N-(Glycylleucyl-L-phenylalanyl)doxorubicin (5e) und N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2- dihydrochinolin in wasserfreiem Dimethylformamid wie in Beispiel 13 beschrieben hergestellt.
    • Beispiel 19
  • Antitumoraktivität von Verbindung (A1) gegen M5076
  • Die Antitumoraktivität von (A1), beschrieben in Beispiel 13, wurde wie folgt untersucht:
    • Materialien und Verfahren 1. Arzneimittelverabreichung
  • Alle Arzneimittellösungen wurden direkt vor der Verwendung hergestellt. Die Zubereitung (treatment) wurde i.v. in einem Volumen von 10 ml/kg Körpergewicht an den Tagen 5, 9 und 15 verabreicht.
  • Anthracycline wurden in sterilem Wasser gelöst und die Konzentration wurde spektrophotometrisch kontrolliert.
  • Lyophilisierte Polymere wurden in Wasser gelöst zum Erhalt einer Ausgangslösung von 25 mg Anthracyclin-Äquivalent/ml gemäß der angegebenen Konzentration, weitere Verdünnungen wurden mit Wasser durchgeführt.
    • 2. Fester Tumor
  • M5076 murines Reticulosarcom wurde durch serielle i.m. Passage erhalten und s.c. in C75 B1/6 Mäuse transplantiert (5 · 10&sup5; Zellen/Maus) zum Bestimmen der Aktivität am primären Tumor.
    • 3. Bestimmung der Antitumoraktivität und Toxizität
  • Tumorwachstum wurde durch Taster (Kaliper)-Messung bestimmt und das Tumorgewicht gemäß Geran et al., siehe Cancer Chemother. Rep. 3, 1 (1972) abgeschätzt.
  • Die Antiturmoraktivität wurde in Zeit (Tagen) bis zum Erreichen von 1 g Tumorgewicht bestimmt und ist als Tumorwachstumsverzögerung (TGD) angegeben.
  • Der mittlere Anstieg in Überlebenszeit (T/C%) wurde unter Verwendung der folgenden Formel
  • Toxizität wurde auf der Basis der Körpergewichtsreduktion und Bruttoergebnis aus Milz- und Leberreduktion bestimmt. Neurotoxizität ist als Anzahl an Mäusen mit fehlender motorischer Funktion bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 ausgeführt: Tabelle 1
  • 5 · 10&sup5; Zellen/Maus wurden sc injiziert
  • nb = nicht bestimmt
  • * Neurotoxizität
  • ¹ Zubereitung wurde an Tagen 5, 9, 15 verabreicht
  • ² TDG = Tumorwachstumsverzögerung
  • ³ Mittlere Überlebensdauer von behandelten Mäusen/mittlere Überlebensdauer der Vergleichsgruppe · 100
  • &sup4; Zahl an toxischen Todesfällen/Gesamtzahl an Mäusen
  • &sup5; Langzeitüberlebende
  • &sup6; Mäuse ohne Tumor am Ende der Experimente
    • Beispiel 20 Atitumoraktivität von Verbindung A3 gegen M5076
  • Die Antitumoraktivität von A3, beschrieben in Beispiel 15, wurde unter Verwendung des Verfahrens und der Materialien von Beispiel 19 untersucht. Die Resultate sind in Tabelle 2 gezeigt: Tabelle 2
  • 5 · 10&sup5; Zellen/Maus wurden sc injiziert
  • * Neurotoxizität
  • ¹ Zubereitung wurde an Tagen 5, 9, 15 verabreicht
  • ² TDG = Tumorwachstumsverzögerung
  • ³ Mittlere Überlebensdauer von behandelten Mäusen/mittlere Überlebensdauer der Vergleichsgruppe · 100
  • &sup4; Zahl an toxischen Todesfällen/Gesamtzahl an Mäusen
  • &sup5; Langzeitüberlebende
  • &sup6; Mäuse ohne Tumor am Ende der Experimente
  • Antitumoraktivität von Verbindung A4 (Copolymer von 3-Methacryloyl- amino-2-hydroxypropan-4'-epi-3'-N(methacryloylglycyl-L-phenyl-alanyl-L- leucylglycyl)doxorubicin und 1-N-(Methacryloylglycyl)-2-hydroxypropan) im Vergleich mit 4'-Epidoxorubicin.HCl.
  • Die Antitumoraktivität wurde mit dem gleichen Behandlungsplan für 4'-Epidoxorubicin.HCl und Verbindung A4 untersucht. Gegen frühes MK5076 murines Reticulosarcom war Verbindung A4 aktiver als das freie Arzneimittel in allen untersuchten Dosen (Tabelle 3). Tabelle 3 Antitumoraktivität von Verbindung A4 im Vergleich mit 4'-Epidoxorubicin.HCl gegen M5076 murines Reticulosarcoma
  • 5 · 10&sup5; Zellen/Maus wurden sc injiziert
  • ¹ Zubereitung wurde an Tagen 5, 9, 15 verabreicht
  • ² TDG = Tumorwachstumsverzögerung
  • ³ Mittlere Überlebensdauer von behandelten Mäusen/mittlere Überlebensdauer der Vergleichsgruppe · 100
  • &sup4; Zahl an toxischen Todesfällen/Gesamtzahl an Mäusen Toxizität von Verbindung A4 (Copolymer von 3-Methacryloylamino-2- hydroxypropan, 4'-Epi-3'-N-(methacryloylglycyl-L-phenyl-alanyl-L- leucylglycyl)doxorubicin und 1-N-(Methacryloylglycyl)-2-hydroxypropan) im Vergleich mit 4'-Epidoxorubicin.HCl.
  • Toxizität wurde an gesunden C57BIF-Mäusen, i.v. Verabreichung, mit Einzeldosen von 4'-Episoxorubicin.HCl (13,2 - 16,15 - 19 - 20,6 - 25,2 und 33,2 mg/kg) und Verbindung A4 (50 - 63 - 79 - 100 - 120 - 140 mg/kg) bestimmt.
  • Für die Bestimmung von LD&sub1;&sub0; und LD&sub5;&sub0; in gesunden C57 BIF-Mäusen wurde die Probit-Analyse nach drei Wochen Erholung verwendet. Der therapeutische Index wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:
  • Therapeutischer Index: DE&sub5;&sub0; (effektive Dosis 50)/LD&sub5;&sub0; (lethale Dosis 50)
  • Effektive Dosis 50 ist die Dosis, die eine 50%ige Tumorwachstumsreduktion bewirkt. Tiersicherheit wurde 90 Tage beobachtet.
  • Die LD&sub1;&sub0;- und LD&sub5;&sub0;-Werte in C57 B1/F-Mäusen sind wie folgt:
  • Die niedrige Toxizität der Verbindung A4 erlaubt es, höhere Dosen an. Produkt zu verabreichen und gleiche oder bessere Resultate als mit 4'-Epidoxorubicin.HCl zu erreichen und einen besseren therapeutischen Index zu erhalten. Der therapeutische Index für 4'-Epidoxorubicin.HCl und Verbindung A4 ist 3 bzw. 40.

Claims (10)

1. Polymergebundenes Anthracyclin der Formel (A), welches im wesentlichen aus drei Einheiten besteht, dargestellt durch die Formeln (1), (2) und (3):
worin:
Gly Glycin darstellt;
n 0 oder 1 bedeutet;
x 70 bis 98 mol-% bedeutet;
y 1 bis 29 mol-% bedeutet;
z 1 bis 29 mol-% bedeutet;
R&sub1; eine durch eine oder mehrere Hydroxygruppen substituierte C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylgruppe bedeutet;
Y einen Aminosäurerest oder ein Peptid-Zwischenstück bedeutet;
[NH-D] der Rest eines Anthracyclinaminoglycosids [NH&sub2;-D] ist; und
Z eine Hydroxygruppe oder einen Rest der Formel -NHR&sub1; bedeutet, worin R&sub1; wie oben definiert ist.
2. Polymergebundenes Anthracyclin gemäss Anspruch 1, worin [NH-D] den Rest eines Anthracyclinaminoglycosids der folgenden Formel (Q) bedeutet:
worin: eines von RI und RII Wasserstoff und das andere eine Hydroxygruppe oder Iod bedeutet; RIII Wasserstoff oder OCH&sub3; und RIV Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe bedeutet.
3. Polymergebundenes Anthracyclin gemäss Anspruch 1 oder 2, worin x 90 bis 98 mol-%, y 1 bis 10 mol-% und z 1 bis 10 mol-% bedeuten.
4. Polymergebundenes Anthracyclin gemäss Anspruch 1, 2 oder 3, worin R&sub1; eine Hydroxyethyl-, 2-Hydroxypropyl- oder 3-Hydroxypropylgruppe bedeutet.
5. Polymergebundenes Anthracyclin gemäss mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, worin Y Gly-Phe-Gly, Gly-Leu-Gly, Phe-Leu-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly oder Leu-Leu-Gly bedeutet.
6. Polymergebundenes Anthracyclin gemäss mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, worin [NH-D] der Rest von Doxorubicin, 4'-Epidoxorubicin, 4-Dimethoxydaunorubicin, Idarubicin oder 4'-Iod-4'- desoxodoxorubicin bedeutet.
7. Verfahren zur Herstellung eines polymergebundenen Anthracyclins der Formel (A) gemäss Anspruch 1, umfassend:
(i) Umsetzen eines polymeren Zwischenprodukts (B), worin (B) im wesentlichen aus Einheiten der folgenden Formeln (1) und (4) besteht:
worin x, n und R&sub1; in Formel (1) wie in Anspruch 1 definiert sind, w 30 bis 2 mol-% bedeutet und R&sub2; eine Hydroxygruppe oder eine Abgangsgruppe bedeutet; mit einem Anthracyclinderivat der allgemeinen Formel (5):
HY-[NH-D] (5)
worin [NH-D] und Y wie in Anspruch 1 definiert sind; und
(ii) wenn gewünscht ist, ein polymergebundenes Anthracyclin,
worin z in der Einheit der Formel (3) NHR&sub1; bedeutet, herzustellen: Umsetzen des Produkts aus Schritt (i), worin R&sub2; eine Abgangsgruppe bedeutet, mit einer Verbindung der Formel NH&sub2;R&sub1;, worin R&sub1; wie oben definiert ist.
8. Anthracyclinderivat der Formel (5):
HY-[NH-D] (5)
worin [NH-D] und Y wie in Anspruch 1 oder 2 definiert sind.
9. Verfahren zur Herstellung eines Anthracyclinderivats der Formel (5) gemäss Anspruch 8, umfassend:
(i) Umsetzen eines N-geschützten Peptids der Formel (8) oder (9):
R&sub3;-Y-OH (8) R&sub3;-Y-P (9)
worin R&sub3; eine säureempfindliche Amino-Schutzgruppe bedeutet, P eine Abgangsgruppe bedeutet und Y wie in Anspruch 7 definiert ist, mit einem Anthracyclinaminoglycosid [NH&sub2;-D] zur Herstellung eines Zwischenprodukts der allgemeinen Formel (10):
R&sub3;-Y-[NH-D] (10)
worin [NH-D] wie in Anspruch 1 oder 2 definiert ist und Y und R&sub3; wie oben definiert sind; und
(ii) Entfernen der Schutzgruppe R&sub3; zum Erhalt des Peptidylanthracyclins (5) in Form einer freien Base.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein(en) pharmazeutisch annehmbares Diluens oder Träger und, als aktiven Bestandteil, ein polymergebundenes Anthracyclin gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6.
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