DE69427749T2

DE69427749T2 - Festes substrat mit hydrophilen reaktiven gruppen an der oberfläche

Info

Publication number: DE69427749T2
Application number: DE69427749T
Authority: DE
Inventors: Ibrahim Gouda; Olle Larm
Original assignee: Medicarb AB
Current assignee: Medicarb AB
Priority date: 1993-01-19
Filing date: 1994-01-14
Publication date: 2001-10-31
Anticipated expiration: 2014-01-15
Also published as: DE69427749D1; SE500964C2; EP0682536B1; CA2154168A1; WO1994016750A1; SE9300140L; JP3549110B2; ATE203170T1; SE9300140D0; ES2157976T3; EP0682536A1; AU5894594A; US5668193A; JPH08508896A; CA2154168C

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf feste Substrate, deren Oberflächen modifiziert worden sind, um reaktive Gruppen mit hydrophiler Beschaffenheit darauf einzuführen. Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Herstellen solcher festen Substrate.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In der Medizintechnik wie beispielsweise der Technik, die medizinische Gerätschaften wie beispielsweise Vorrichtungen zur Implantation oder Geräte, die mit lebendem Gewebe in Berührung kommen, betrifft, ist es häufig wünschenswert, die exponierten Oberflächen mit der Umgebung verträglich zu machen. Dies erfolgt häufig durch Immobilisieren von biologisch aktiven Verbindungen auf den exponierten Oberflächen. Dies erfolgt gewöhnlich in zwei Schritten, nämlich einem ersten Schritt, bei dem die betreffende Oberfläche aktiviert wird, und einem zweiten Schritt, bei dem die biologisch aktive Verbindung an die aktivierte Oberfläche gekoppelt wird.
In dem ersten Schritt, welcher eine Aktivierung umfasst, welche häufig durch die Behandlung unter Verwendung einer Polymerverbindung erfolgt, sollten die eingeführten reaktiven und funktionellen Gruppen durch eine starke Bindung an das Substrat daran gebunden werden. In dem zweiten Schritt, welcher die Kopplung umfasst, soll die Bindung ebenfalls so stark wie möglich sein. Die biologische Aktivität der immobilisierten Substanz darf jedoch nicht beeinträchtigt werden.
Beispiele für Methoden für die Immobilisierung einer biologisch aktiven Verbindung auf der Oberfläche beispielsweise von Krankenhausgerätschaften sind die Immobilisierung von Glykosaminoglykanen (GAGs) auf intraokularen Augenlinsen, bestimmten Wundverbänden, orthopädischen Implantaten usw. Eine solche Immobilisierung von GAGs erfolgt gewöhnlich in zwei Schritten, nämlich einer Vorbehandlung der Oberfläche, um sie mehr reaktiv und/oder hydrophil zu machen, und einer Immobilisierung des Moleküls durch Ionenbindung oder kovalente Bindung. Bei einem solchen Vorbehandlungsverfahren wird ein Reagenz oder Grundiermittel, das reaktive Aminofunktionen enthält, an der Oberfläche anhaften gelassen. Dieses Reagenz kann durch die Zugabe eines Vernetzungsmittels, gewöhnlich durch eine funktionelle organische Substanz, weiter stabilisiert werden.

STAND DER TECHNIK

Die bisher verwendeten Grundiermittel und Vernetzer werden gewöhnlich aus Materialien nicht-biologischer Herkunft hergestellt und sind nicht biologisch abbaubar. Beispiele für Reagenzien sind Polyethylenimin und Tridodecylmethylammoniumchlorid. Weitere Einzelheiten über diese Immobilisierungsmethoden findet man bei Hoffman J., Larm O. und Sholander S., A new method for covalent coupling of heparin and other glycosaminoglycans to substances containing primary amino groups (ein neues Verfahren für die kovalente Kopplung von Heparin und anderen Glykosaminoglykanen an Substanzen, die primäre Aminogruppen enthalten), Carbohydrate Research (1983) 117, 328; Larm O., Larsson R. und Olsson P., A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue (eine neue nicht thromboseerzeugende Oberfläche, hergestellt durch selektive kovalente Bindung von Heparin über einen modifizierten reduzierenden terminalen Rest), Biomaterials, Medical Devices and Artificial Organs (1983) 11, 161.
Das Beschichten eines festen Substrats mit einem Grundiermittel, das ein Polysaccharid enthält, ist aus den Dokumenten EP, A2, 0051354 (A) und EP, A2, 0486294 bekannt. Das verwendete Polysaccharid ist Chitosan mit einem N-Acetylierungsgrad von weniger als 90% und vorzugsweise weniger als 25%. Ein weiteres Polysaccharid kann an das Chitosan gebunden sein.
Die vorliegende Erfindung hat als Hauptaufgabe das Bereitstellen neuer Methoden zum Modifizieren von Oberflächen, um die Einführung von reaktiven Gruppen mit hydrophiler Beschaffenheit auf solchen Oberflächen zu ermöglichen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, neue Methoden zum Durchführen einer solchen Modifizierung unter Verwendung von Substanzen bereitzustellen, welche biologischer Herkunft sind und auch biologisch abbaubar sind.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, reaktive Amino- und/oder Hydroxylgruppen einzuführen, die sich dazu eignen, biologisch aktive Substanzen an die betreffenden Oberflächen kovalent zu binden.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, neue Methoden bereitzustellen, welche die Modifizierung von Oberflächen ermöglichen, um diese Oberflächen durch die Einführung von funktionellen Gruppen hydrophiler zu machen, welche für eine kovalente Kopplung von biologisch aktiven Substanzen an solche Oberflächen verwendet werden können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein festes Substrat bereit, dessen Oberfläche modifiziert worden ist, um reaktive Gruppen mit hydrophiler Beschaffenheit darauf einzuführen. Die Modifizierung der Oberfläche erfolgt durch ein Grundiermittel, das ein erstes Polysaccharid umfasst, das als reaktive Gruppenamino- und Hydroxylgruppen umfasst, wobei das erste Polysaccharid durch Vernetzen unter Verwendung eines mit Periodat oxidierten zweiten Polysaccharids, das vizinale Hydroxylgruppen oder Amino- und Hydroxylgruppen in einer vizinalen Position aufweist, stabilisiert wurde, wobei das Polysaccharid einer Periodatoxidation unterzogen wurde, um mindestens ein Dialdehydfunktionenpaar zu bilden. So wurde überraschenderweise festgestellt, dass ein solches erstes Polysaccharid wirksam an die Oberfläche von festen Substraten gebunden werden kann, und eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass das erste Polysaccharid Chitosan ist.
Chitosan besteht aus 1,4-β-gebundenen D-Glucosamin-Einheiten. Das Polysaccharid ist linear und die Eigenschaften unterscheiden sich im Hinblick auf den N-Acylierungsgrad. In der Natur sind alle Aminogruppen acetyliert und das Polysaccharid wird dann als Chitin bezeichnet. Es wird hauptsächlich aus den Schalen bzw. Panzern von Krabben und Garnelen erhalten.
Es ist bevorzugt, dass Chitosan einen N-Acylierungsgrad von höchstens ungefähr 90% aufweist. Ein bevorzugter N-Acylierungsgrad ist höchstens ungefähr 50% und vorzugsweise weniger als ungefähr 25%.
Es ist bevorzugt, dass das zweite Polysaccharid, das für die Stabilisierung durch Vernetzen verwendet wird, ausgewählt ist aus Polysacchariden, deren beim biologischen Abbau entstehende Produkte ungiftig sind, wie beispielsweise D-Glucosamin und D-Glucose. Es ist besonders bevorzugt, dass das zweite Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Chitosan, Amylose und Glykosaminoglykane.
Die Substrate mit modifizierten Oberflächen gemäß der vorliegenden Erfindung weisen gewöhnlich eine hydrophobe oder inerte Beschaffenheit auf und können ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Polyolefine, Polyurethane, Polyvinylchlorid, Polystyrol, Silicon und Polytetrafluorethylen oder aus der Gruppe umfassend medizinisch annehmbare Metalle und Glas. Von den polymeren Materialien sind Polyolefine, wie beispielsweise Polyethylen oder Polypropylen bevorzugt.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines festen Substrats bereit, dessen Oberfläche modifiziert worden ist, um reaktive Gruppen mit hydrophiler Beschaffenheit darauf einzuführen. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Substrats, dessen Oberfläche modifiziert werden soll;
b) Herstellen einer Lösung des ersten Polysaccharids, die auch ein zweites Polysaccharid enthält, das vizinale Hydroxylgruppen oder Amino- und Hydroxylgruppen in einer vizinalen Position aufweist, wobei das zweite Polysaccharid einer Periodatoxidation unterzogen wurde, um mindestens ein Dialdehydfunktionenpaar zu bilden. Das zweite Polysaccharid dient dazu, das erste Polysaccharid durch Vernetzen zu stabilisieren.
c) Beschichten der Oberfläche mit der Lösung, die sich aus Schritt b) ergibt; und
d) Herbeiführen einer Ausfällung des ersten Polysaccharids auf der Oberfläche, was zu einer Modifizierung ihrer Eigenschaften führt.
In einem solchen Verfahren ist es bevorzugt, als das erste Polysaccharid ein Chitosan zu verwenden.
Es ist bevorzugt, dass das zweite Polysaccharid ausgewählt wird aus Polysacchariden, deren beim biologischen Abbau entstehende Produkte ungiftig sind, wie beispielsweise D-Glucosamin und D-Glucose. Zu besonders bevorzugten Polysacchariden, welche das zweite Polysaccharid darstellen, gehören Chitosan, Amylose und Glykoseaminoglykane.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch nichtbeschränkende Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen weiter veranschaulicht, worin:
die Fig. 1 und 2 durch chemische Formeln eine kovalente Kopplung von Carbonatdehydrase auf einer Oberfläche, die primäre Aminogruppen enthält, veranschaulichen; und
Fig. 3 eine schematische Darstellung von denkbaren Kopplungsreaktionen zum Erhalten einer kovalenten Kopplung einer biologisch aktiven Substanz an eine modifizierte Substratoberfläche ist.

Veranschaulichung von Reaktionen, die zu einer kovalenten Bindung führen

Fig. 3 veranschaulicht eine Reihe von Reaktionen, welche in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um biologisch aktive Substanzen kovalent an Substrate zu binden, die Amino- und/oder Hydroxylgruppen enthalten. Die veranschaulichten Reaktionen sollen nur als Beispiele aufgefasst werden und es ist nicht beabsichtigt, dass sie den Umfang der Erfindung beschränken. In Fig. 3, welche eine kovalente Kopplung an Amino- oder Hydroxylgruppen veranschaulicht, ist EDC ein wasserlösliches Carbodiimid und Z bedeutet O oder NR, R, R' und R" sind organische Gruppen, die gegebenenfalls immobilisiert sind.
Im Hinblick auf Substrate, die aus Polymeren mit hydrophober Beschaffenheit wie beispielsweise Polyethylen und Polypropylen gebildet sind, ist es bevorzugt, die Oberfläche vor dem Auftragen des ersten Polysaccharids zu ätzen. Ein solches Ätzen kann unter Verwendung eines Oxidationsmittels in saurer Lösung, wie beispielsweise Kaliumpermanganat in Schwefelsäure erfolgen. Ein solches Ätzen verbessert die Haftung des ersten Polysaccharids, ganz gleich ob es durch Vernetzen stabilisiert ist oder nicht.
In den nachstehenden nichtbeschränkenden Beispielen beziehen sich Prozentsätze und Teile auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Ätzen von Polyethylenoberflächen

Ein Polyethylenfilm oder Schlauch wird 2 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 2% Kaliumpermanganat (KMnO&sub4;) (Gew./Vol.) in konzentrierter Schwefelsäure H&sub2;SO&sub4; inkubiert und sorgfältig mit destillierten Wasser gespült.

Beispiel 2

Periodatoxidation von Chitosan

In einem typischen Beispiel, bei dem ungefähr 10% der Monosaccharidreste oxidiert werden, wird das Polysaccharid Chitosan, das 15% N-Acetylgruppen enthält, in Wasser (100 ml) gelöst und Natriumperiodat (0,5 g) wurde zugegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 24 Stunden lang im Dunkeln aufbewahrt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, wobei 4,1 g Chitosan, das Dialdehydfunktionen enthält, erhalten werden.

Beispiel 3

Beispiel 2 wird wiederholt, wobei Amylose anstelle von Chitosan verwendet wird. Es werden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Beispiel 4

Beispiel 2 wird wiederholt, wobei Hyaluronsäure anstelle von Chitosan verwendet wird. Es werden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Beispiel 5

Aminierung mit Chitosan und Vernetzen

Die sich aus Beispiel 1 ergebende Oberfläche wird bei Raumtemperatur mit einer Lösung von Chitosan, das 15% N-Acetylgruppen enthält, (0,25% Gew./Vol.) in Wasser zusammen mit einem Vernetzungsmittel (0,015% Gew./Vol), das wie in Beispiel 2 vorstehend beschrieben hergestellt wurde, behandelt. Die Oberfläche wird sorgfältig mit Ethanol (80%) gespült und anschließend durch 2 Stunden lange Reaktion bei 50ºC mit Natriumcyanoborhydrid (0,00025% Gew./Vol. in 0,15 M NaCl, pH 3,9) stabilisiert. Die Oberfläche wird mit Wasser gespült und mit einer Lösung von Dextransulfat (Pharmacia AB, Uppsala Schweden) 0,1 g/l in 0,15 M NaCl, pH 3,0 10 Minuten lang bei 55ºC behandelt. Nach dem Spülen mit großen Volumina von destilliertem Wasser wird die Oberfläche mit einer Lösung von 0,25% Chitosan in wässriger Lösung bei pH 9,0 10 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und wie oben gewaschen. Das Vorhandensein von Aminogruppen wird mit einem Indikator (ponceau S, Sigma) überprüft.

Beispiel 6

Beispiel 5 wird wiederholt, wobei aber das Vernetzungsmittel von Beispiel 3 verwendet wird.

Beispiel 7

Beispiel 5 wird wiederholt, wobei aber das Vernetzungsmittel von Beispiel 4 verwendet wird.

Beispiel 8

Aminierung mit Chitosan allein

Die sich aus Beispiel 1 ergebende Oberfläche wird bei Raumtemperatur mit einer Lösung von Chitosan, das 15% N-Acetylgruppen enthält (0,25% Gew./Vol.) in Wasser behandelt.

Beispiel 9

Kovalente Kopplung einer biologisch aktiven Substanz an die modifizierte Oberfläche

Polyethylenperlen werden wie im vorstehenden Beispiel 1 geätzt und wie im vorstehenden Beispiel 5 mit Vernetzung aminiert. Die aminierten Perlen werden außerdem durch eine Behandlung mit einer Lösung von Boratpuffer (50 ml, pH 9,0), Ethanol (10 ml) und Chloracetaldehyddimethylacetal (1 ml) aktiviert. Zu der klaren Lösung werden weitere 40 ml Boratpuffer zugegeben und die Suspension wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Granulat wird in wässriger HCl (100 ml, 0,05 M) 25 Minuten lang bei 70ºC hydrolysiert. Die soweit daran beteiligten Reaktionen sind in der beigefügten Fig. 1 veranschaulicht.
Nach dem Waschen mit großen Volumina von Wasser wird Carbonatdehydrase (CA), die aus Rindererythrocyten gewonnen wurde (Sigma), durch reduktive Aminierung gekoppelt. Das Granulat wird in einer wässrigen Lösung (200 ml, pH 6,1), die CA (128 mg) und NaBH&sub3;CN (40 mg) enthält, 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Diese Reaktion ist in der beigefügten Fig. 2 veranschaulicht.
Nach dem Waschen mit Wasser und Trocknen wird die Kopplungsausbeute im Hinblick auf die Fähigkeit des immobilisierten Enzyms, p-Nitrophenylacetat zu hydrolysieren, colorimetrisch gemessen. Die Kopplungsausbeute ist 5 ug/cm².

Beispiel 10

Carbodiimidkopplung von Hyaluronsäure

Ein Polyethylenfilm wird wie in Beispiel 1 geätzt und wie in Beispiel 5 aminiert und mit einer Lösung von Hyaluronsäure (Pharmacia, 0,195 mg in 100 ml Wasser) behandelt. Eine Lösung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDC, Merck, 0,5 g in 1,0 ml Wasser) wird nach und nach während 0,5 h zugegeben. Nach der Einstellung des pH-Werts auf 4,75 (0,1 M HCl) wird die Reaktion über Nacht ablaufen gelassen. Die Filme werden mit großen Volumina von ultrareinem Wasser sorgfältig gespült und getrocknet. Die Kopplungsausbeute beträgt 1,8 ug/cm², wie durch FTIR bestimmt wird.

Beispiel 11

Immobilisierung von Carbonatdehydrase (CA) durch Carbodiimidkopplung

Polyethylenperlen (3 mm i Durchmesser, 40 ml) werden wie in Beispiel 1 geätzt und wie in Beispiel 5 aminiert. Die Perlen werden in einer wässrigen Lösung von CA (100 ml, pH 5,5, eingestellt mit M HCl) suspendiert. EDC (2 g in 5 ml Wasser, siehe Beispiel 8) wird nach und nach zu der gerührten Suspension zugegeben. Der pH-Wert wird 24 h bei Raumtemperatur auf 5, 5 gehalten. Die Perlen werden mit großen Volumina von NaCl (5 l) gewaschen und wie in Beispiel 9 analysiert. Die Kopplungsausbeute beträgt 2 ug/cm².

Beispiel 12

Carbodiimidkopplung von Heparansulfat

Polyethylen wird wie im vorstehenden Beispiel 1 geätzt und mit Heparansulfat (35 mg in 50 ml Wasser) behandelt. Das Kopplungsverfahren wird wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt, mit der Abwandlung, dass 0,2 g EDC in 1,0 ml Wasser in dem Kopplungsverfahren verwendet wird. Die Kopplungsausbeute wird halbquantitativ mit Toluidinblau, welches eine lila Farbe ergibt, und quantitativ mit FTIR bestimmt (1,6 ug/cm²).

Claims

1. Festes Substrat, dessen Oberfläche modifiziert worden ist, um reaktive Gruppen mit hydrophiler Beschaffenheit darauf einzuführen, wobei die Modifizierung durch ein Grundiermittel erfolgt, das ein erstes Polysaccharid umfasst, das als reaktive Gruppen Amino- und Hydroxylgruppen enthält, wobei das erste Polysaccharid durch Vernetzen unter Verwendung eines mit Periodat oxidierten zweiten Polysaccharids, das vizinale Hydroxylgruppen oder Amino- und Hydroxylgruppen in einer vizinalen Position aufweist, stabilisiert wurde, wobei das Polysaccharid einer Periodatoxidation unterzogen wurde, um mindestens ein Dialdehydfunktionenpaar zu bilden.

2. Festes Substrat nach Anspruch 1, wobei das erste Polysaccharid Chitosan ist.

3. Festes Substrat nach Anspruch 2, wobei das Chitosan einen N-Acylierungsgrad von höchstens ungefähr 90% aufweist.

4. Festes Substrat nach Anspruch 3, wobei das Chitosan einen N-Acylierungsgrad von höchstens ungefähr 50% und vorzugsweise weniger als ungefähr 25% aufweist.

5. Festes Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das zweite Polysaccharid ausgewählt ist aus Polysacchariden, deren beim biologischen Abbau entstehende Produkte ungiftig sind, wie beispielsweise D-Glucosamin und D-Glucose.

6. Festes Substrat nach Anspruch 5, wobei das zweite Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Chitosan, Amylose und Glykosaminoglykane.

7. Festes Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches eine hydrophobe Beschaffenheit aufweist.

8. Festes Substrat nach Anspruch 7, welches ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Polyolefine, Polyurethane, Polyvinylchlorid, Polystyrol, Silicon und Polytetrafluorethylen.

9. Festes Substrat nach Anspruch 8, welches ein Polyolefin wie beispielsweise Polyethylen oder Polypropylen ist.

10. Festes Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 7; welches ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend medizinisch annehmbare Metalle und Glas.

11. Verfahren zur Herstellung eines festen Substrats, dessen Oberfläche modifiziert worden ist, um reaktive Gruppen mit hydrophiler Beschaffenheit darauf einzuführen, wobei die Modifizierung durch ein Grundiermittel erfolgt, das ein erstes Polysaccharid umfasst, das als reaktive Gruppen Amino- und Hydroxylgruppen enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen eines Substrats, dessen Oberfläche modifiziert werden soll;

b) Herstellen einer Lösung des ersten Polysaccharids, die auch ein zweites Polysaccharid enthält, das vizinale Hydroxylgruppen oder Amino- und Hydroxylgruppen in einer vizinalen Position aufweist, wobei das zweite Polysaccharid einer Periodatoxidation unterzogen wird, um mindestens ein Dialdehydfunktionenpaar zu bilden, um dadurch das erste Polysaccharid durch Vernetzen zu stabilisieren;

c) Beschichten der Oberfläche mit der Lösung, die sich aus Schritt b) ergibt; und

d) Herbeiführen einer Ausfällung des ersten Polysaccharids auf der Oberfläche, was zu einer Modifizierung ihrer Eigenschaften führt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das erste Polysaccharid Chitosan ist.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 11 oder 12, wobei dem Schritt c) ein Ätzschritt vorangeht, um das Anhaften des ersten Polysaccharids an der Oberfläche zu verbessern.