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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Antioxidations-
Nahrungsmittelprodukt, eine Antioxidationspräparation und
ein Antioxidationsverfahren, welches zum Ziel hat,
Erkrankungen, die durch aktiven Sauerstoff hervorgerufen
werden, durch Entfernen des Superoxids (O&sub2;-) und
Wasserstoffperoxids (H&sub2;O&sub2;) zu verhindern oder zu
verbessern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
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Verschiedene Studien zu Milchsäurebakterien oder zu
physiologischen Effekten von Nahrungsmittelprodukten unter
Verwendung von Milchsäurebakterien wurden seit
Metschnikow's Langlebigkeitstheorie durchgeführt.
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Als Funktionen von in fermentierter Milch, wie Joghurt,
enthaltenen Milchsäurebakterien sind z. B. ein positiver
Effekt auf die intestinale Mikroflora, eine
kontrollierende Wirkung auf den Darm usw. wohlbekannt. Vor
kurzem wurde berichtet, dass Milchsäurebakterien
verschiedene Funktionen aufweisen, wie eine
immunaktivierende Wirkung, eine antimikrobielle Wirkung,
eine Antitumotwirkung und dergleichen. Wie oben
beschrieben, wurden aufgrund der verschiedenen
gesundheitsfördernden Effekte, die von Milchsäurebakterien
erwartet werden, Sauermilch- und
Milchsäurebakteriengetränke auf den Markt gebracht, die
Stämme, wie Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei
und vom Stamm Bifidobacterium, die auch im menschlichen
Darm nachgewiesen werden können, verwenden.
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In der Datenbank WPI, Woche 7351, Derwent Publications
Ltd., London, GB; AN 73-78473u, ist ein Gärungsprodukt mit
einer verbesserten Qualität und einem reduzierten
Lagerungsverlust offenbart, sowie eine Fermentation,
umfassend Lactobacillus plantarum und Kohl als Mangan
enthaltendes natürliches Material.
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GB-A-1 197 257 offenbart ein Sauermilchprodukt, das ein
angenehmes Aroma aufzeigt und Milchbakterien und Tee
umfasst.
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Datenbank WPI, Woche 9213, Derwent Publications Ltd.,
London, GB; AN 92-099832, offenbart eine ein Mn
enthaltendes natürliches Material (Teeblätter) und
trockene fermentierte Hefe (Koji Fungi) umfassende
Antioxidationszusammensetzung.
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EP-A-0 207 039 offenbart ein Verfahren zur Verhinderung
der Oxidation von Nahrungsmittelprodukten. Das Verfahren
umfasst die Zugabe einer enzymatischen Zusammensetzung
einer Oxidase, seinem Substrat, Katalase und
Superoxiddismutase.
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Aktiver Sauerstoff ist als biologischer Schutzfaktor, wie
bei der bakteriziden Wirkung von Leukozyten, wichtig, es
stellte sich aber heraus, dass eine übermässige
Herstellung von aktivem Sauerstoff im lebenden Körper
verschiedene Gewebeerkrankungen bewirkt.
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Als ein gewöhnlicher Faktor zur Generierung von aktivem
Sauerstoff sind Stress, Alkohol, Peroxide, Arzneimittel,
Training und dergleichen bekannt. Es wird hervorgehoben,
dass aktiver Sauerstoff und Lipoperoxid, die durch diese
Faktoren generiert werden, eng mit cerebralen
Nervenerkrankungen, Kreislauferkrankungen, Krebs,
Verdauungserkrankungen, Lebererkrankungen, Arterio
Sklerose, Nierenerkrankungen, Diabetes, Altern und
dergleichen verbunden sind.
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Der lebende Körper hat sich eine Serie von
Oxidationsschutzsystemen bewahrt, um sich selbst gegen die
Toxizität von Sauerstoff zu schützen. Andererseits ist es
notwendig, ausreichend Oxidations-
Nahrungsmittelkomponenten aufzunehmen, damit diese Systeme
normal funktionieren können. Als natürliche Oxidations-
Nahrungskomponenten sind Vitamin E, Vitamin C, β-Karotin,
Polyphenol und Spurenelemente (z. B. Selen, Kupfer, Zink
usw.) bekannt. Damit eine Antioxidationswirkung erzielt
werden kann, wurden Nahrungsmittelprodukte, die diese
Nahrungskomponenten enthalten, entwickelt. Der in vivo-
Antioxidationsmechanismus wird grob in eine vorbeugende
Antioxidationswirkung (Kontrolle der Herstellung eines
Radikals) und ein Antioxidationswirkung vom Verknüpfungs-
Unterbrechungs-Typ (Abfangen und Eliminieren eines
Radikals, das schon hergestellt wurde) klassifiziert.
Beispiele, die die erstere Wirkung haben, schliessen
Enzyme, wie Superoxiddismutase (SOD), Catalase (CAT),
Glutathionperoxidase (GSH-Px) und dergleichen ein.
Beispiele für die letztere Wirkung schliessen die obigen
Antioxidations-Nahrungskomponenten ein.
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Bei herkömmlichen Nahrungsmittelprodukten sind aber
Produkte bekannt, die auf die Durchführung einer
Verknüpfungseliminierung des Superoxids (O&sub2;-)
und
Wasserstoffperoxids (H&sub2;O&sub2;), die mit der Lipidperoxidation
verknüpft sind, zielen.
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Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein
Antioxidations-Nahrungsmittelprodukt, eine
Antioxidationspräparation und ein Antioxidationsverfahren,
welches gleichzeitig eine Superoxiddismutase (im folgenden
als "SOD" bezeichnet)-artige Aktivität und eine Catalase
(im folgenden als "CAT" bezeichnet)-Aktivität aufweist und
die insbesondere bei der vorbeugenden antioxidativen
Wirkung überlegen sind, bereitzustellen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG:
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Das Antioxidations-Nahrungsmittelprodukt der vorliegenden
Erfindung hat eine antioxidative Wirkung im lebenden
Körper, einschliesslich dem Inneren des Verdauungstraktes,
umfassend Sauermilch, hergestellt durch Fermentieren von
Milch oder Magermilch mit Lactobacillus plantarum, das
eine Mn-Catalaseaktivität hat, in Anwesenheit eines Tee-
Extrakts oder eines aus dem Tee-Extrakt erhältlichen
pulverigen Tees.
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Das heisst, die Erfinder stellten fest, dass spezielle
Bakterien unter den verschiedenen Milchsäurebakterien
keine CAT-Aktivität unter Bedingungen, wo kein Mangan
anwesend ist, aufzeigen, wenn aber Mangan in ihrer
Wachstumsumgebung vorhanden ist, können sie Mangan in ihre
Zellen aufnehmen, um eine Mn-CAT-Aktivität und
gleichzeitig eine SOD-artige Aktivität aufzuzeigen, und
somit wurde die vorliegende Erfindung erreicht. Das
Antioxidations-Nahrungsprodukt der vorliegenden Erfindung
ist insbesondere als ein vorbeugendes Antioxidations-
Nahrungsmittelprodukt geeignet.
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Es ist bekannt, dass die Mn-CAT im Vergleich mit einer
Eisen enthaltenden Häm-CAT nicht durch verschiedene
Inhibitoren, Modifizierer, Chelatbildner usw. beeinflusst
wird und in einem breiten pH-Bereich und Temperaturbereich
stabil ist.
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Weiterhin kann das erfindungsgemässe Antioxidations-
Nahrungsmittelprodukt ein Trockenprodukt sein, bevorzugt
ein gefriergetrocknetes Produkt, das Bakterien enthält,
die eine CAT-Aktivität haben und zusätzlich zu dem oben
beschriebenen Fermentationsprodukt ein Mangan enthaltendes
natürliches Material.
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Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine
Antioxidationspräparation, umfassend Lactobacillus
plantarum, mit einer Mn-Catalaseaktivität und einen Tee-
Extrakt oder einen aus dem Tee-Extrakt erhältlichen
pulverigen Tee bereit. Diese Antioxidationspräparation
kann ein Trockenprodukt (in Form von Tabletten, Pulver,
Körnern, Kapseln usw.) oder in Form einer Flüssigkeit
sein.
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Weiterhin wird erfindungsgemäss die Verwendung eines
fermentierten Produkts, erhältlich durch ein
manganhaltiges Material und Fermentieren mit Lactobacillus
plantarum, das eine Mn-Catalaseaktivität hat, um eine
gleichzeitige Superoxiddismutase-artige Aktivität und eine
Catalaseaktivität aufzuzeigen, zur Herstellung eines
gesunden Nahrungsmittels mit einer Antioxidationswirkung
im lebenden Körper, einschliesslich dem Inneren des
Verdauungstraktes.
KURZE ERKLÄRUNG DER ERFINDUNG:
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Fig. 1 ist ein Graph, der einen Wechsel der SOD-artigen
Aktivität und der CAT-Aktivität aufgrund der
Zugabe von MnCl&sub2; oder Tee darstellt;
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Fig. 2 ist ein Graph, der die Veränderung der
SODartigen Aktivität mit der Zeit nach der
Verabreichung eines Produkts, hergestellt durch
Fermentieren mit Lactobacillus plantarum, in
einer Pylorus-verschlossenen Ratte;
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Fig. 3 ist ein Graph, der die Veränderung der CAT-
Aktivität über die Zeit nach Verabreichung eines
Produkts, hergestellt durch Fermentieren mit
Lactobacillus plantarum in einer am
Pylorusverschlossenen Ratte;
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Fig. 4 ist ein Graph, der die Veränderung der
Lebendzellzahl eines Pylorus-verschlossenen
Magens zeigt;
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Fig. 5 ist ein Graph, der die SOD-artige Aktivität vor
und nach der Fermentation des mit Tee versetzten
Produkts, hergestellt durch Fermentieren mit
Lactobacillus plantarum, zeigt;
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Fig. 6 ist ein Graph, der einen Effekt nach
Verabreichung des mit Tee versetzten Produkts,
hergestellt durch Fermentieren mit Lactobacillus
plantarum, in einem Indomethacin-induzierten
Magengeschwürmodell zeigt;
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Fig. 7 ist ein Graph, der die SOD (-artige) Aktivität
im Serum nach Verabreichung eines mit Tee
versetzten Produkts, hergestellt durch
Fermentieren mit Lactobacillus plantarum zeigt;
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Fig. 8 ist ein Graph, der einen Effekt nach der
Verabreichung eines mit Tee versetzten Produkts,
hergestellt durch Fermentieren mit Lactobacillus
plantarum in mit Wasserstoffperoxid induzierten
gastromucosalen Verletzungen zeigt;
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Fig. 9 ist ein Graph, der den Hemmungseffekt einer Tee-
Extraktlösung und MnCl&sub2; auf die MPO-Aktivität
zeigt;
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Fig. 10 ist ein Graph, der den Hemmungseffekt von
Catechin auf die MPO-Aktivität zeigt.
BESTES VERFAHREN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG:
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Beispiele von Bakterien mit einer Mn-CAT-Aktivität gemäss
der vorliegenden Erfindung schliessen Lactobacillus
plantarum (Stamm ATCC14431) als Lactobacillus ein.
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In der Systematik der Bakterien heisst es, dass
Milchsäurebakterien keine CAT-Aktivität haben. Wenn
allerdings Mangan in der Wachstumsumgebung vorhanden ist,
nimmt das oben beschriebene Lactobacillus plantarum Mangan
in seine Zellen auf, um eine CAT-Aktivität zu zeigen.
Andererseits ist bekannt, dass Mn als zentrales Metall bei
der SOD wirkt und Mn selbst eine SOD-artige Aktivität hat.
Entsprechend wurde es möglich, ein fermentiertes Produkt,
durch Fermentieren mit. Lactobacillus plantarum in
Anwesenheit eines manganhaltigen Materials mit einer
SODartigen Aktivität und einer gleichzeitigen CAT-Aktivität
herzustellen.
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Vor kurzem wurde die klinische Verabreichung von SOD gegen
Rheuma, Cardioischämie usw. durchgeführt. Allerdings tritt
das grosse Pröblem auf, dass lokale Mengen an
Wasserstoffperoxid erhöht vorhanden sind, wenn SOD alleine
verwendet wird, und weiterhin ein Hydroxyradikal LOH) mit
der höchsten radikalischen Reaktivität gebildet wird.
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Entsprechend ist es wichtig, O&sub2;- zu eliminieren und
Wasserstoffperoxid durch Verwendung von CAT und GSH-Px in
Kombination zu entfernen, wenn eine SOD angewendet wird.
Aufgrund des obigen wird daher angenommen, dass die
verbundene Wirkung zwischen SOD-artig und CAT, erhalten
durch Zugabe von Mn zu Lactobacillus plantarum, sehr
wichtig ist.
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Weiterhin wird erwogen, dass der gleiche Effekt wie bei
Lactobacillus plantarum durch Verwendung von Bakterien mit
einer CAT-Aktivität zusätzlich zu Lactobacillus plantarum
erhalten werden kann, da Mangan selbst eine SOD-artige
Aktivität hat, selbst wenn kein SOD hergestellt wurde.
Beispiele dieser Bakterien mit einer Mn-CAT-Aktivität
neben Lactobacillus plantarum schliessen Pediococcus
pentosaceus, P. acidilactici, Thermolephilum album und
dergleichen ein.
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Weiterhin kann das Antioxidations-Nahrungsmittelprodukt
oder die Antioxidationspräparation der vorliegenden
Erfindung ein Trockenprodukt sein, bevorzugt ein
gefriergetrocknetes Produkt, umfassend Bakterien mit einer
CAT-Aktivität und ein manganhaltiges Material, zusätzlich
zu dem obigen fermentierten Produkt. Das Trockenprodukt
kann in jeder Form verwendet werden, wie als Pulver,
Körnchen, Tabletten und dergleichen. Das Trockenprodukt
kann so wie es ist aufgenommen werden oder nachdem das
Trockenprodukt zu kommerziell erhältlicher Milch zugegeben
wurde und die Mischung fermentiert wurde, um Joghurt
herzustellen. Es kann zusätzlich zu dem Trockenprodukt
auch in Form eines gefrorenen Produkts vorliegen.
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Der Tee-Extrakt oder der aus einem Tee-Extrakt erhältliche
pulverige Tee in der vorliegenden Erfindung wird zur
Bereitstellung von Mangan gegenüber den Bakterienzellen
verwendet. Es ist nicht möglich, Mangan als anorganische
Verbindung zuzugeben, da Mangan selbst nicht als
Nahrungszusatzstoff akzeptiert wird, und daher wird dieses
natürliche Material verwendet. Entsprechend ist es
wichtig, den Tee-Extrakt oder einen aus dem Tee-Extrakt
erhältlichen pulverigen Tee zuzugeben, um Mangan
bereitzustellen, das zum Aufzeigen einer CAT-Aktivität und
einer SOD-artigen Aktivität in Bakterien mit einer CAT-
Aktivität erforderlich ist. Da Tee eine Vielzahl von
Antioxidationskomponenten, wie Catechin, Vitamin C,
verschiedene Spurenelemente usw., enthält, können
zusätzliche Effekte erhalten werden.
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Die Zugabe von Tee zu Lactobacillus plantarum führt zu dem
folgenden Effekt, dass nicht nur die SOD-artige Aktivität
und die CAT-Aktivität aufgezeigt werden, sondern auch,
dass die SOD-artige Aktivität im Vergleich mit dem Fall,
in dem eine anorganische Mn-Verbindung (z. B. Manganchlorid
MnCl&sub2; usw.) verwendet wird, extrem hoch ist, und weiterhin
kann die SOD-artige Aktivität und CAT-Aktivität bei einem
Aussetzen gegenüber Magensaft über einen langen Zeitraum
erhalten bleiben.
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Es wird bevorzugt, dass der Tee in Form eines Pulvers
zugegeben wird, da die Aufnahme des Mangans durch die
Bakterien einfach wird. Das Pulverisieren wird durch
Extrahieren eines natürlichen Materials mit Wasser
und/oder wassermischbarem organischen Lösungsmittel (z. B.
Alkoholen, wie Ethylalkohol usw.) und anschliessend mit
einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht
mischbar ist (z. B. Chloroform, Ethylacetat, Butanol usw.),
um eine Auftrennung in eine organische Phase und eine
wässrige Phase zu erhalten, Gewinnen eines gelösten
Feststoffgehalts aus der wässrigen Phase, gefolgt vom
Trocknen, durchgeführt. Weiterhin kann eine Feststoffmenge
ebenfalls aus der Lösung, die mit Wasser und/oder
wassermischbarem Lösungsmittel extrahiert wurde, gewonnen
und anschliessend pulverisiert werden. Des weiteren kann
eine wässrige Lösung, hergestellt durch Extrahieren des
natürlichen Materials mit Wasser, zugegeben werden, so wie
es ist ohne Pulverisierung, oder das durch Pulverisierung
erhaltene feine natürliche Material kann so wie es ist
zugegeben werden.
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Beispiele für den Tee schliessen grünen Tee
(nichtfermentierter Tee), wie raffinierten grünen Tee,
pulverisierten Tee, milden grünen Tee, groben Tee,
Staubtee, Keimtee, gerösteten Tee usw.; fermentierten Tee,
wie schwarzen Tee usw.; halbfermentierten Tee, wie Oolong-
Tee, Paochong-Tee (Jasmintee) usw. ein.
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Im Falle des fermentierten Produkts ist die Menge des
manganhaltigen natürlichen Materials (Menge an Mangan)
bevorzugt ca. 4 bis 20 mg, bevorzugter ca. 4 bis 8 mg,
bezogen auf 1 kg des Produkts. Im Falle des getrockneten
Produkts, das hauptsächlich Bakterienzellen, das
manganhaltige natürliche Material und einen Exzipienten
umfasst, ist die Menge an manganhaltigem natürlichen
Material (Menge an Mangan) bevorzugt ca. 4 bis 20 mg,
bevorzugter ca. 4 bis 8 mg, bezogen auf 10 g des Produkts.
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Typische Beispiele für die Form des Antioxidations-
Nahrungsmittelprodukts gemäss der vorliegenden Erfindung
schliessen fermentierte Produkte und (gefrier)getrocknete
Produkte, wie oben beschrieben, ein.
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Das erfindungsgemässe fermentierte Produkt schliesst
Sauermilch, wie Joghurt und Milchsäurebakteriengetränke,
ein. Die Sauermilch kann durch Zugabe einer vorbestimmten
Menge eines manganhaltigen natürlichen Materials in 1 λ
Milch oder Magermilch, Animpfen mit Milchsäurebakterien
mit einer CAT-Aktivität und Fermentieren bei 35 bis 37ºC
für ca. 12 bis 72 Stunden erhalten werden. Durch
Einstellen der Milchsäurebakterien-Startmenge und des
zuzugebenden manganhaltigen, natürlichen Materials,
Fermentationszeit usw. können Joghurt in fester Form
(stichfester Joghurt) (halb)fester (gerührter) Joghurt und
Trinkjoghurt hergestellt werden. Weiterhin können
entsprechend Süssmittel (z. B. Glucose, Sucrose usw.),
Fruchtfleisch (z. B. Grapefruit, Apfel, Orange, Lemone
usw.), anorganische Elektrolyte als Mineralquelle (z. B.
Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid,
Calciumchlorid usw.), Vitamine, Aromastoffe usw. zu der
fermentierten Milch zugegeben werden.
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Weiter kann das Getränk mit Milchsäurebakterien durch
Zugabe einer vorbestimmten Menge an einem manganhaltigen
natürlichen Material zu einer gemischten Lösung aus
Magermilch und Zucker (z. B. Glucose, Sucrose usw.),
Animpfen der gemischten Lösung mit Milchsäurebakterien mit
CAT-Aktivität und Fermentieren bei 35 bis 37ºC für ca. 12
bis 72 Stunden erhalten werden. Joghurt (z. B.
flüssigjoghurtartiger, saftartiger usw.) können durch
Zugabe von Magermilch zu einer Verdünnungslösung (z. B.
Wasser, Fruchtsaft usw.) hergestellt werden. Als zu
fermentierende Basis können z. B. Milchserum,
Niedrigfettmilch usw. zusätzlich zu der Magermilch
verwendet werden. Beispiele der Verdünnungslösung
schliessen Fruchtfleisch, Milchkaffe etc. zusätzlich zu
dem Wasser ein.
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Das erfindungsgemässe Trockenprodukt wird durch Mischen
von ca. 5 x10&sup8; bis 5 · 10¹&sup0; Bakterienzellen mit 2 bis 4 g
des manganhaltigen natürlichen Materials, der Zugabe eines
Exzipienten zu der Mischung, gefolgt von Trocknen,
erhalten. Beispiele des Exzipienten schliessen Lactose,
Glucose, Sucrose, Oligosaccharide und dergleichen ein.
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Das erfindungsgemässe Trockenprodukt kann so wie es ist
aufgenommen werden oder nachdem das Trockenprodukt zu
Milch zugegeben wurde und die Mischung bei Raumtemperatur
für 12 bis 24 Stunden fermentiert wurde, um Joghurt
zuhause herzustellen.
BEREICH DER INDUSTRIELLEN ANWENDBARKEIT:
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Wie oben beschrieben, können das erfindungsgemässe
Antioxidations-Nahrungsmittelprodukt und die
Antioxidationspräparation eine SOD-Aktivität und
gleichzeitig eine CAT-Aktivität aufzeigen und Superoxid
und Wasserstoffperoxid entfernen. Daher sind sie bei der
Verhinderung von Erkrankungen, die durch aktiven
Sauerstoff hervorgerufen werden, wirksam.
BEISPIELE
TESTBEISPIEL 1
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In vitro SOD-artige Aktivität und CAT-Aktivität des mit
Tee versetzten Produkts, hergestellt durch Fermentieren
mit Lactobacillus plantarum:
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Wenn Lactobacillus plantarum in einem APT-Medium
(enthaltend "Bacto trypton", kommerziell erhältlich von
DIFCO Ltd., Hefeextrakt, Glucose, Natriumcitrat,
Natriumchlorid, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat
und Natriumcarbonat) kultiviert wurde, wurde MnCl&sub2; oder
Tee (gepulverter grüner Tee) zu dem Medium gegeben, so
dass die Konzentration an Mn 12,5 uM, 50 uM, 100 uM bzw.
200 uM war und die SOD-Aktivität und CAT-Aktivität der
Bakterienzellen und des MnCl&sub2; oder Tee enthaltenden
Mediums nach Kultivieren für 16 Stunden zum Zeitpunkt, bei
dem die Vermehrung der Bakterien das Maximum erreichte,
wurden untersucht.
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Die SOD-artige Aktivität wurde durch ein NBT-
Reduktionsverfahren und die CAT-Aktivität wurde durch die
Abnahme an Wasserstoffperoxid gemessen. Die Ergebnisse
sind in Fig. 1 dargestellt.
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Wie in Fig. 1 gezeigt, nimmt die SOD-artige Aktivität im
Verhältnis zu der Menge an zugegebenem Mn in beiden Fällen
(Zugabe von MnCl&sub2;/Tee) zu, der Absolutwert der SOD-artigen
Aktivität im Falle einer Zugabe von Tee lag aber
wesentlich höher (ca. 35-fach gegenüber der Zugabe von
200 uM Mn).
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Die CAT-Aktivität war unter der Nachweisgrenze, wenn Mn
nicht zugegeben wurde. Andererseits wurde durch Zugabe von
2,5 uM oder mehr Mn eine Aktivität von ca. 1.800 U/200 ml
APT-Medium in beiden Fällen aufgezeigt (Zugabe von
MnCl&sub2;/Tee)
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Hierbei bedeutet die Funktion an SOD und CAT das Entfernen
von O&sub2;- und H&sub2;O&sub2;. SOD und CAT sind allerdings Enzyme, und
es wird gesagt, dass SOD und CAT inaktiviert werden,
selbst wenn sie oral aufgenommen werden, und daher wird
keine Wirkung erzielt. Da aber die SOD-Aktivität und CAT-
Aktivität in den Bakterienzellen im Falle eines mit Mn
versetzten Produkts, hergestellt durch Fermentieren mit
Lactobacillus pläntarum aufrecht erhalten wird, wird
angenommen, dass diese Aktivitäten solange erhalten
bleiben, bis die Bakterien getötet werden. Weiterhin wird,
wie oben beschrieben, davon ausgegangen, dass sie nicht
einfach inaktiviert werden, da Mn selbst und die
Komponente im Tee eine SOD-artige Aktivität haben, sie
aber keine Enzyme sind.
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Um die obige Beschreibung zu beweisen, wurde das mit Tee
versetzte Produkt, hergestellt durch Fermentieren mit
Lactobacillus plantarum, oral an Pylorus-verschlossene
Ratten verabreicht und eine Veränderung der SOD-artigen
Aktivität und CAT-Aktivität nach der Verabreichungszeit
wurde in den folgenden Testbeispielen untersucht.
TESTBEISPIEL 2
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Retention der SOD-artigen Aktivität und CAT-Aktivität
eines Produkts, hergestellt durch Fermentieren mit
Lactobacillus plantarum im Magen einer
Pylorusverschlossenen Ratte:
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Sofort nach Verschliessen des Pylorus einer männlichen
SD-Ratte (Gewicht 250 g) wurden 5 ml eines Produkts,
hergestellt durch Fermentieren mit Lactobacillus
plantarum, unter Verwendung einer oralen Probe verabreicht
und die Mageninhalte wurden zum Beobachtungszeitpunkt
gewonnen und die Veränderung der SOD-artigen Aktivität und
CAT-Aktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in den
Fig. 2 und 3 dargestellt. Weiterhin wurde ein Testprodukt
durch Zugabe von MnCl&sub2; oder von Tee (gepulverter grüner
Tee) in einer Konzentration von 50 uM (Mn-Konzentration)
zum APT-Medium und nach Animpfen mit Lactobacillus
plantarum Fermentieren für 16 Stunden, erhalten.
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Wie in Fig. 2 dargestellt, ist im Falle einer Zugabe von
MnCl&sub2; die SOD-artige Aktivität auf ca. 35% des
Ausgangswertes nach 30 Minuten erniedrigt und nach Ablauf
von 60 Minuten eliminiert. Im Gegensatz dazu blieb die
hohe Aktivität im Falle einer Zugabe des Tees über 3
Stunden erhalten.
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Wie in Fig. 3 gezeigt, ist im Falle einer Zugabe von MnCl&sub2;
die CAT-Aktivität nach 30 Minuten auf ca. 80% des
Ausgangswertes erniedrigt, ähnlich der SOD-artigen
Aktivität, andererseits nahm bei der Gruppe, der Tee
zugegeben wurde, die CAT-Aktivität um ca. 20% des
Ausgangswerts zu und die gleiche Aktivität, wie die des
Ausgangswerts wurde nach 60 Minuten aufgezeigt. Weiterhin
wurde nach 30 Minuten eine geringe (ca. 15%-ige
Aktivität) aufrecht erhalten.
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Wie in Fig. 4 gezeigt, ist die Lebendzellzahl nach oraler
Verabreichung auf ca. 1/1.000 des Ausgangswerts nach 60
Minuten im Falle der Zugabe von MnCl&sub2; erniedrigt. Nach 3
Stunden wurden keine Bakterienzellen nachgewiesen.
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Andererseits wurde in der Gruppe, zu der Tee gegeben
wurde, die Lebendzellzahl, die vor Verabreichung war, bis
zum Verstreichen von 60 Minuten aufrecht erhalten. Nach 3
Stunden wurden keine Bakterienzellen nachgewiesen. In
Fig. 4 bedeutet "N. D.", dass die Lebendzellzahl kleiner
als die Nachweisgrenze (104) ist.
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Wie oben beschrieben, wird deutlich, dass durch Zugabe
eines Tees zu Lactobacillus plantarum nicht nur eine SODartige
Aktivität und eine CAT-Aktivität aufgezeigt werden,
sondern auch eine hohe Aktivität über einen langen
Zeitraum, im Vergleich zu Mn, enthalten in einer
anorganischen Verbindung wie MnCl&sub2;, aufrecht erhalten
wird. Es wird angenommen, dass dies durch Retention der
Lebendzellzahl im Magen verursacht wird.
TESTBEISPIEL 3
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SOD-artige Aktivität einer wasserlöslichen Teefraktion vor
und nach Milchgärung:
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Wie oben beschrieben, kann eine hohe SOD-artige Aktivität
erhalten werden, wen Tee zugegeben wird. Tatsächlich wurde
Tee (gepulverter grüner Tee) zu einem APT-Medium in einer
Konzentration (Konzentration an Mn) von 50 uM zugegeben,
und das Medium wurde für 24 Stunden bei normaler
Temperatur stehen gelassen, um eine wasserlösliche
Fraktion (Überstand des Mediums vor Fermentation) zu
erhalten. Anschliessend wurde die SOD-artige Aktivität der
wasserlöslichen Fraktion gemessen. Wie in Fig. 5
dargestellt, ergab sich eine SOD-artige Aktivität vor
Fermentation von 54.040 U/200 ml APT-Medium.
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Andererseits wurde die SOD-artige Aktivität der
wasserlöslichen Fraktion, erhalten durch Animpfen des oben
beschriebenen, mit Tee versetzten APT-Mediums, worin Mn in
einer Konzentration (Konzentration an Mn) von 50 uM
zugegeben wurde, mit Lactobacillus plantarum und
Fermentieren für 16 Stunden, gemessen. Wie in Fig. 5
gezeigt, war als Ergebnis die SOD-artige Aktivität nach
Fermentation ca. 93.400 U/200 ml APT-Medium.
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Wie aus diesen Ergebnissen deutlich wird, konnte durch
Fermentation eine Erhöhung der Aktivität von ca. dem
1,7-fachen gegenüber der vor der Fermentation beobachtet
werden. Als Grund dafür wird folgender angesehen. Die
Antioxidationskomponente kann in wirksamerer Form durch
Verwenden des Tees und Lactobacillus plantarum vorliegen.
Damit kann der Effekt der Zugabe des Tees zu Lactobacillus
plantarum betätigt werden.
TESTBEISPIEL 4
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Unterdrückung von Gastromucosa-Verletzungen durch die
orale Verabreichung eines Produkts, hergestellt durch
Fermentieren mit Lactobacillus plantarum:
(1) Effekt im Indomethacin-Magen-Läsionsmodell:
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20 mg/kg Indomethacin wurden subkutan an männliche SD-
Ratten (Gewicht 250 g) verabreicht und die Wirkung des
Produkts, hergestellt durch Fermentieren mit Lactobacillus
plantarum auf die Bildung von Magengeschwüren wurde nach 6
Stunden untersucht. Als Produkt, hergestellt durch
Fermentieren mittels Lactobacillus plantarum, wurden
solche verwendet, wie sie durch Zugabe einer Lösung eines
Tee-Extrakts (erhalten durch Extrahieren von 100 g grünem
Tee mit 1 t heissem Wasser) zu einem APT-Medium in einer
Konzentration (Konzentration an Mn) von 50 uM erhalten
werden und anschliessendem Animpfen mit Lactobacillus
plantarum und Fermentieren für 16 Stunden, erhalten
werden.
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Das Testprodukt war wie folgt.
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(a) Mit Tee versetzte Produktgruppe, hergestellt
durch Fermentieren mit Lactobacillus plantarum:
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Sie wurde durch Herstellert einer Lösung eines Tee-Extrakts
erhalten, so dass deren SOD-artige Aktivität 24.000 U/ml
war, und durch Zugabe des Lösungsextrakts zu einem
Produkt, hergestellt durch Fermentieren mit Lactobacillus
plantarum. Die Lebendzellzahl von Lactobacillus plantarum
war 6,3 · 109 Zellen/ml.
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(c) Kontrollgruppe; Nur APT-Medium:
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Das Testprodukt wurde zweimal in einer Dosis von 2,5 ml
alle 3 Stunden nach subkutaner Gabe von Indomethacin oral
verabreicht.
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Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Fig. 6 ist ein
Graph, der den Geschwürindex von jeder Gruppe 6 Stunden
nach subkutaner Verabreichung von Indomethacin als
Durchschnittswert + Standardabweichung von 10 Ratten
darstellt. Wie in Fig. 6 gezeigt, war der Geschwürindex
der Kontrollgruppe 5,8 + 1,8 mm. Weiterhin wurde gezeigt,
dass ein Geschwür in allen 10 Ratten der Kontrollgruppe
gebildet wurde. Im Gegensatz dazu wurde in der Gruppe mit
dem Produkt, hergestellt durch Fermentieren mit
Lactobacillus plantarum, die Suppression im Vergleich mit
der Kontrollgruppe signifikant durchgeführt (p < 0,05).
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Die Bewertung des Geschwürindex und der Messung der
SODartigen Aktivität, die in einer Protein-freien
Serumkomponente nach Verabreichung des Produkts vorhanden
ist, wurde gleichzeitig durchgeführt. Als ein Ergebnis
wurde, wie in Fig. 7 gezeigt, die SOD-artige Aktivität in
der Protein-freien Komponente auf 0,23 ± 0,08 Einheiten/ml
in der Kontrollgruppe bestimmt. Im Gegensatz dazu wurde in
der Gruppe mit dem Tee versetzten Produkt, hergestellt
durch Fermentieren mit Lactobacillus plantarum, ein
signifikanter Anstieg, 2,34 ± 0,33 Einheiten/ml
(p < 0,01), aufgezeigt.
(2) Effekt bei dem Wasserstoffperoxid induzierten
Gastromucosa-Läsionsmodell:
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Um Gastromucosa-Läsionen aufgrund von Wasserstoffperoxid
zu generieren, wurden männliche SD-Ratten (Gewicht 250 g)
einer Operation zum Verschliessen des Pylorus unterworfen
und Diethylmaleinsäure (0,75 ml/kg) wurde subkutan als
Depletionsmittel für das Glutathion in das Gewebe
verabreicht. Anschliessend wurden 0,5 ml 7,5%-iges
Wasserstoffperoxid oral verabreicht und der Effekt des
Produkts, hergestellt durch Fermentieren mit Lactobacillus
plantarum auf die Gastromucosa-Läsionen nach 3 Stunden
untersucht.
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Als Produkte, hergestellt durch Fermentieren mit
Lactobacillus plantarum, wurden solche verwendet, wie sie
durch Zugabe von MnCl&sub2; oder einer Lösung eines Tee-
Extrakts (erhalten durch Extrahieren von 100 g grünem Tee
mit 1 l heissem Wasser) zu einem APT-Medium in einer
Konzentration (Konzentration an Mn von 50 uM und
anschliessendem Animpfen mit Lactobacillus Plantarum und
Fermentieren für 16 Stunden erhalten werden.
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Das Testprodukt war wie folgt.
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(a) Produktgruppe, hergestellt durch Fermentieren
mit Lactobacillus plantarum: Erhalten durch Fermentieren
mit MnCl&sub2;.
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(b) Mit Tee versetzte Produktgruppe, hergestellt
durch Fermentieren mit Lactobacillus plantarum:
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Sie wurde durch Herstellen einer Lösung eines Tee-Extrakts
erhalten, so dass deren SOD-artige Aktivität 24.000 U/ml
war, und durch Zugabe des Lösungsextrakts zu einem
Produkt, hergestellt durch Fermentieren mit Lactobacillus
plantarum. Die Lebendzellzahl von Lactobacillus plantarum
war 6,3 · 10&sup9; Zellen/ml.
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(c) Teegruppe: Erhalten durch Herstellen einer Tee-
Extraktlösung, so dass seine SOD-artige Aktivität 2.400
Einheiten/ml war, und Zugabe des Lösungsextrakts zu einem
APT-Medium.
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(d) Kontrollgruppe: nur APT-Medium
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Das Testprodukt wurde oral mit einer Dosis von 2,5 ml
verabreicht, unmittelbar vor der Verabreichung des
Wasserstoffperoxids.
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Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. Fig. 8 ist ein
Graph, der den durchschnittlichen Wert und die
Standardabweichung des Gastromucosa-Läsionsindexes (%
Fläche) von 10 Ratten darstellt. Wie in Fig. 8
dargestellt, sind die Erosionsflächen 30,6 ± 6,34% in der
Kontrollgruppe. Im Gegensatz dazu sind in der Tee-Gruppe
und in der Gruppe mit dem Produkt, hergestellt durch
Fermentieren mit Lactobacillus plantarum, die Gesamtfläche
an Erosionen 22,38 ± 5,59% bzw. 20,32 ± 8.05% und kein
signifikanter Unterschied zu der Kontrollgruppe wurde
beobachtet. In der Gruppe mit dem mit Tee versetzten
Produkt, hergestellt durch Fermentieren mit Lactobacillus
plantarum, war andererseits die Gesamtfläche an Erosion
4,46 ± 2,12% und zeigte damit einen bemerkenswerten
Suppressionseffekt im Vergleich zu der Kontrollgruppe
(P < 0, 05).
(3) Ergebnisse:
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In dem Indomethacin-induzierten Magengeschwür-Modell wurde
die unterdrückende Wirkung bei der Bildung von
Magengeschwüren aufgrund des mit Tee versetzten Produkts,
hergestellt durch Fermentieren mit Lactobacillus
plantarum, bestätigt. Weiter wurde in dem
Wasserstoffperoxid induzierten Gastromucosa-Läsionsmodell
eine Wirkung einer Verabreichung von Tee oder von
Lactobacillus plantarum-Zellen alleine nicht beobachtet.
Der unterdrückende Effekt wurde beobachtet, wenn sie in
Kombination verwendet wurden.
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Es wurde bisher erklärt, dass die Bildung von
Magengeschwüren aufgrund von Indomethacin durch eine
Beeinträchtigung der Mucosabeständigkeit und
Beeinträchtigung des Blutflusses aufgrund einer Hemmung
der Bildung von Prostaglandin verursacht wird. Gemäss den
letzten Berichten wurde bestätigt, dass es mit aktivem
Sauerstoff des Arachidonsäure-Metabolismus und
Infiltration von Neutrophilen in Verbindung steht. Es wird
überlegt, dass es mit aktivem Sauerstoff, hergestellt in
den Gastromucosa-ventriculi zusammenhängt, da die
subkutane Verabreichung von Indomethacin zu diesem
Zeitpunkt auf die Gastromucosa durch das Blut aus dem
Bereich, wo es verabreicht wurde, wirkt.
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Die Bildung von Magengeschwüren wurde durch mit Tee
versetztem Lactobacillus plantarum unterdrückt und
gleichzeitig wurde die SOD-artige Aktivität der
Proteinfreien Komponente des Serums erhöht. Daher wird überlegt,
dass die Antioxidationssubstanz im Tee absorbiert wurde,
um den aktiven Sauerstoff in der Gastromucosa zu
eliminieren. Es wird weiterhin angenommen, dass Beispiele
von Gastromucosa-Läsionen aufgrund der oralen
Verabreichung von Wasserstoffperoxid direkte
Mucosaerkrankungen aufgrund von Wasserstoffperoxid und
indirekte Erkrankungen durch Infiltration von Neutrophilen
einschliesst. In beiden Fällen wirkt das
Wasserstoffperoxid, welches im Magenlumen anwesend ist,
als eine induzierte Substanz. Die Tatsache, dass die
Gastromucosa-Läsionen, induziert durch Wasserstoffperoxid,
durch Verabreichung des Tees und Lactobacillus plantarum-
Zellen in Kombination unterdrückt werden kann, bedeutet,
dass die Mn-CAT-Aktivität der Lactobacillus plantarum-
Zellen wirksam im Magenlumen wirken. Andererseits bedeutet
die Tatsache, dass der wirksame Suppressionseffekt nicht
durch Verabreichung von Lactobacillus plantarum-Zellen
alleine aufgezeigt wurde, das die CAT-Aktivität der Zellen
nicht im Magenlumen wirken, was die Ergebnisse des
Testbeispiels 2 zeigen.
TESTBEISPIEL 5
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MPO (Myeloperoxidase)-Aktivität-inhibierende Wirkung des
Tee-Extrakts und Catechin:
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Es ist bekannt, dass Neutrophile aktiven Sauerstoff
herstellen, um Fremdmaterialien und Bakterien im lebenden
Körper zu entgiften, insbesondere haben die Neutrophilen
ein doppelt veränderndes System für Wasserstoffperoxid,
welches als MPO bezeichnet wird, wobei Perchlorsäure oder
Monochloramin mit einer hohen Cytotoxizität hergestellt
wird. Zum Zeitpunkt einer Überschussreaktion wurde die
Absonderung der MPO nach aussen bestätigt und es wird
angenommen, dass dies ein Faktor ist, der zu einem
Durcheinander der Biomembran führt. Es gibt weiterhin
einen Bericht, dass die Infiltration der Neutrophilen in
Verbindung mit deren Krisenmechanismus in dem
Indomethacin-induzierten Magengeschwür und den
Wasserstoffperoxid induzierten Gastromucosa-Läsionen.
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Die Bedeutung der Zugabe von Tee, verwendet als
natürliches Mangan enthaltendes Material, gemäss der
vorliegenden Erfindung, ist oben beschrieben. Weiterhin
wurde in vitro untersucht, ob die Tee-Komponente die MPO-
Aktivität inhibiert oder nicht.
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Zu 2,9 ml eines 50 mM Phosphatpuffers (pH 5,4), enthaltend
0,1% Wasserstoffperoxid und 1,03 mM o-Dianisidin, wurden
50 ul einer Testlösung und 50 ul MPO aufgereinigtes Enzym
(1,24 Einheiten/ml) zugegeben und nach Inkubation in. einer
Küvette bei 25ºC wurde die Veränderung der Extinktion (λ
450 nm) für 5 Minuten gemessen. Als Blank wurden 50 ul des
50 mM-Phosphatpuffers (pH 5,4) verwendet.
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Als Testlösung wurde eine Teeextraktlösung, erhalten durch
Extrahieren eines grünen Tees mit heissem Wasser und eine
Lösung, erhalten durch Messen der Mn-Konzentration in der
Tee-Extraktlösung und Zugabe von MnCl&sub2; zu APT-Medium, so
dass die Konzentration an Mn in dem Medium die gleiche war
wie in der verwendeten Tee-Extraktlösung, erhalten.
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Anschliessend wurde die MPO-Aktivität-Hemmungsrate für
jede Mn-Konzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Fig. 9 dargestellt.
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Aus Fig. 9 wird deutlich, dass die Teeextraktlösung die
MPO-Enzymaktivität inhibiert und die Inhibierungsaktivität
grösser wird je höher die Konzentration an Mn ist.
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Weiterhin zeigt sie eine hohe Inhibitionsrate im Vergleich
zu einer Mn-Lösung mit der gleichen Konzentration. Es wird
angenommen, dass dies im Zusammenhang mit einer Tee-
Komponente, die nicht Mn ist, in Verbindung steht.
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Daher wurde untersucht, ob die Nicht-Mn-Komponente, die im
Tee enthalten ist, in Verbindung steht mit der MPO-
Aktivitätshemmung oder nicht. Das heisst, in der gleichen
Weise wie oben beschrieben, wurde die MPO-
Inhibierungsaktivität unter Verwendung von aufgereinigtem
Catechin als eine andere Komponente als Mn untersucht. Die
Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt. Wie aus Fig. 10
deutlich wird, zeigt Catechin den inhibierenden Effekt in
einer Konzentration von 1,5 ug/ml oder mehr.
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Wie oben beschrieben, wurde die Inhibierung der MPO-
Aktivität mit der Teekomponente bestätigt und gleichzeitig
wurde deutlich, dass Mn und Catechin hinsichtlich ihrer
Aktivitätshemmung miteinander verbunden sind.
BEISPIEL 1 - Joghurtartig
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Zu 1 l sterilisierter Milch wurden 4 g Tee (gepulverter
grüner Tee) zugegeben. Die Milch, zu der der Tee zugegeben
wurde, wurde mit Lactobacillus plantarum angeimpft.
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Anschliessend wurde die Fermentation für 18 Stunden
durchgeführt, während die Temperatur auf 35 bis 37ºC
gehalten wurde.
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Die folgenden Joghurtformen konnten durch Einstellen der
Herstellungsbedingungen, wie der Menge an Tee,
Fermentationszeit usw., gemäss einem herkömmlichen
Verfahren hergestellt werden.
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a. fest (stichfester Joghurt)
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b. (halb)fest (gerührter Joghurt)
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c. flüssig (Trinkjoghurt)
BEISPIEL 2 - Milchsäurebakterien-artiges Getränk
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Ein Tee (gepulverter grüner Tee) wurde zu einer
vorherbestimmten Menge einer gemischten Lösung aus
Magermilch und Sucrose gegeben und anschliessend wurde die
gemischte Lösung mit Lactobacillus plantarum angeimpft und
dann für 18 Stunden bei einer Temperatur von 37ºC
fermentiert. Anschliessend wurde die fermentierte Lösung
mit Wasser verdünnt und ein Stabilisator und ein
Aromastoff wurden zu dem milchsäureartigen Trinkjoghurt
gegeben. Die Zusammensetzung ist in Tabelle 1 dargestellt.
BEISPIEL 3 - Milchsäureartiges Getränk
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Ein Single-Cell-Tee (hergestellt von Single Cell Foods
Co., Ltd.) als Tee (gepulverter grüner Tee) wurde zu einer
vorbestimmten Menge einer gemischten Lösung an Magermilch
und Sucrose gegeben und anschliessend wurde die gemischte
Lösung mit Lactobacillus plantarum angeimpft und dann für
18 Stunden bei einer Temperatur von 37ºC fermentiert.
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Anschliessend wurde die fermentierte Lösung mit Wasser und
Orangensaft verdünnt und ein Stabilisator und ein
Aromastoff wurden zu dem saftartigen
Milchsäurebakteriengetränk zugegeben. Die Zusammensetzung
ist in Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE 1
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1) : Stabilisator, Aromastoff usw.
BEISPIEL 4 - Gefriergetrockneter Typ
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Etwa 5 · 10¹&sup0; Bakterienzellen (Lactobacillus plantarum)
4 g Tee (gepulverter grüner Tee) und ein Exzipient, wie
Lactose und Glucose, wurden vermischt und die Mischung
wurde gefriergetrocknet, um ein tablettenartiges
gefriergetrocknetes Produkt zu ergeben. Dieses Produkt war
wie es ist zum Einnehmen geeignet.
BEISPIEL 5 - Gefriergetrockneter Typ
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Etwa 5 · 10&sup8; Bakterienzellen (Lactobacillus plantarum),
4 g Tee (gepulverter grüner Tee) und ein Exzipient, wie
Lactose und Glucose, wurden vermischt und die Mischung
wurde gefriergetrocknet, um ein gefriergetrocknetes
Produkt vom Tabletten-Typ zu ergeben. Dieses Produkt wurde
zu kommerziell erhältlicher Milch gegeben und die Mischung
wurde bei Raumtemperatur für 12 bis 24 Stunden
fermentiert. Als Ergebnis konnte ein Joghurt hergestellt
werden. Entsprechend ist dieses gefriergetrocknete Produkt
zur Herstellung von Joghurt im normalen Haushalt geeignet.