DE69400312T2

DE69400312T2 - Zusammensetzung bestehend aus einem rekombinanten lebenden untereinheitsimpfstoff und verfahren zur herstellung

Info

Publication number: DE69400312T2
Application number: DE69400312T
Authority: DE
Inventors: Vincent Ganne
Original assignee: Societe dExploitation de Produits pour les Industries Chimiques SEPPIC SA
Current assignee: Societe dExploitation de Produits pour les Industries Chimiques SEPPIC SA
Priority date: 1993-01-29
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 1996-11-21
Anticipated expiration: 2014-01-29
Also published as: FR2700957B1; ES2089923T3; DK0681470T3; EP0681470B1; DE69400312D1; JPH08505866A; FR2700957A1; EP0681470A1; CA2154902A1; JP2004137283A; WO1994016681A1

Description

Die Erfindung betrifft neue Impfstoffzusammensetzungen, die an injizierbare Emulsionen, vor allem solche auf der Basis von Wasser in Öl (E/H), Öl in Wasser (H/E) oder Wasser in Öl in Wasser (E/H/E), gebundene rekombinante Untereinheits-Lebendimpfstoffe assozueren und zur Verabreichung in der Veterinär- oder Humanmedizin bestimmt sind.
Die Erfindung betrifft insbesondere rekombinante Lebendimpfstoffe, in welchen das rekombinante Protein, welches ein in die Immun-Schutzreaktion gegen einen Mikroorganismus, insbesondere ein Hüllenvirus, einbezogenes rekombinantes Protein ist, in vivo durch einen aus einem hüllenlosen Virus wie beispielsweise dem Adenovirus, dem Kuhpockenvirus, dem Canarypox-Virus oder den Bakuloviren bestehenden viralen Vektor exprimiert wird.
Die Impfung durch lebende Mikroorganismen bietet im Vergleich zur Impfung durch nicht lebende, aus abgetöteten Mikroorganismen oder isolierten Proteinen oder Peptiden bestehende Impfstoffe zahlreiche, gut bekannte Vorteile.
Als Lebendimpfstoffe werden weithin abgeschwächte Lebendimpfstoffe verwendet, die jedoch den Nachteil haben, daß sie pathogene Risiken bergen; so besteht immer eine Möglichkeit der Integration der viralen Nukleinsäure in das Genom des Wirts einerseits und der Rückbildung in eine virulente Form andererseits.
Darüber hinaus führen die zur Abschwächung der Virulenz der abgeschwächten Lebendimpfstoffe führenden Mutationen und Schädigungen zuweilen zu einer Herabsetzung der Immunreaktion, die die Injektion großer Dosen einer Impfstoffzusammensetzung erfordern. Die Verwendung von Adjuvantia bzw. Nebenmitteln wurde untersucht, um die Herabsetzung der Immunreaktion wieder auszugleichen.
Daher werden gemäß dem Patent EP 129923 ölige H/E-Adjuvantia zur Verbesserung der Immunreaktion verwendet.
Selbst wenn auf diese Weise eine gewisse Verbesserung der Immunreaktion festgestellt wird, erfordern die abgeschwächten lebenden Mikroorganismen wie beispielsweise abgeschwächte lebende Viren, die üblicherweise in gefriergetrockneter Form vorliegen, ein Solubilisieren in einer im wesentlichen wäßrigen Umgebung. Die Ölmenge, die dann in die wäßrige Phase eingeleitet werden kann, ist sehr begrenzt.
Daraus folgt, daß nur H/E-Emulsionen aus einem abgeschwächten Lebendimpfstoff hergestellt werden können.
Darüber hinaus können bestimmte abgeschwächte lebende Mikroorganismen, wie beispielsweise abgeschwächte lebende Hüllenviren, in direktem Kontakt mit einem Öl oder einer öligen Phase inaktiviert werden, vor allem durch einen Verlust der Unversehrtheit ihrer biologischen Membran.
Die Fortschritte der Gentechnik ermöglichen, rekombinante Untereinheits-Impfstoffe darzustellen, die aus immer reineren oder vollständig synthetischen Antigenen bestehen.
Die Reinheit rekombinanter Untereinheits-Impfstoffe ist auf dem Gebiet der Impfstoffsicherheit ein unbestreitbarer Trumpf gegenüber den abgeschwächten Lebendimpfstoffen.
Üblicherweise bestehen die rekombinanten Untereinheits-Impfstoffe aus einem oder mehreren gereinigten Proteinen, die durch rekombinante Mikroorganismen produziert und dem Wirt injiziert werden.
Selbst unter Berücksichtigung ihrer Reinheit führen diese den aus durch rekombinante Mikroorganismen erzeugten gereinigten Proteinen bestehenden Impfstoffen entsprechenden, nicht lebenden rekombinanten Untereinheits-Impfstoffe im allgemeinen zu einer Verringerung der immunologischen Wirksamkeit; daher erfordert die Anwendung rekombinanter Untereinheits-Impfstoffe die Verwendung einer großen Menge von Antigenen.
Außerdem erfordern die nicht lebenden rekombinanten Unteremheits-Impfstoffe mehrere Injektionen und sind daher schwer mit wirtschaftlichen Geboten vereinbar.
Vor kurzem wurden rekombinante Untereinheits-Lebendimpfstoffe entwickelt, die aus einem lebenden Mikroorganismus, vorwiegend einem Virus, als rekombinantem Vektor bestehen, in welchen ein exogenes Gen eingefügt ist. Erfindungsgemäß werden die rekombinanten Untereinheits-Lebendimpfstoffe direkt in den Wirt eingeleitet, in welchem das Protein in vivo durch das in den Mikroorganismus eingefügte exogene Gen dargestellt wird, um die Immunreaktion auszulösen.
Solche Impfstoffe wurden in dem Artikel von M. Eloit in Journal of General Virology (1990), 71, 2425-2431, oder in der internationalen Anmeldung WO-A-91/00107 beschrieben. Die letztgenannte beschreibt genauer ein Verfahren zum Erzeugen einer Immunreaktion beim Menschen oder beim Tier mittels eines solchen rekombinanten Untereinheits-Lebendimpfstoffs, der immer mit einem anderen, aus einem die reverse HIV-Transkriptase (HIV reverse transcriptase, HIVRT) codierenden Vektor bestehenden Impfstoff assoziiert werden muß.
Diese beiden Impfstoffe werden in Abständen von einigen Tagen bis zu einigen Wochen unabhängig voneinander injiziert. Der HIVRT-Impfstoff kann mit einem Adjuvans wie beispielsweise einer E/H-Emulsion, Mineralsalzen, Polynukleotiden oder natürlichen Substanzen bakteriellen Ursprungs assoziiert sein. Der HIVRT-Impfstoff ist nützlich als Immunstimulans (Booster) des rekombinanten Untereinheits-Impfstoffs.
Die Verwendung rekombinanter Untereinheits-Lebendimpfstoffe ermöglicht, die Nachteile der nicht lebenden rekombinanten Untereinheits-Impfstoffe teilweise auszugleichen; jedoch erfordert dies die Injektion rekombinanter Mikroorganismen, beispielsweise rekombinanter Viren, in sehr großen Mengen und Konzentrationen.
Selbst dann jedoch bleiben die erhaltenen Immunreaktionen noch unzufriedenstellend. Um diese Nachteile zu vermeiden, wird - wie in der internationalen Anmeldung WO-A-91.00107 empfohlen - als notwendig erachtet, außer dem rekombinanten Untereinheits-Impfstoff einen weiteren, die Rolle eines Immunstimulans (Booster) spielenden Impfstoff zu injizieren.
Die Erfindung besteht daher in rekombinanten Untereinheits- Lebendimpfstoffen, die den vorstehend erwähnten Nachteilen vorbeugen.
In überraschender Weise erlaubt die Erfindung außerdem, Öle in großer Menge direkt mit lebenden Mikroorganismen, wie beispielsweise lebenden rekombinanten Viren, die zumindest ein Antigen eines Hüllenvirus exprimieren, zu assoziieren.
Die Erfindung betrifft eine neue rekombinante Lebendimpfstoff-Zusammensetzung, die gekennzeichnet ist durch zumindest einen rekombinanten Untereinheits-Lebendimpfstoff in einer injizierbaren Emulsion mit (i) zumindest einer wäßrigen Phase und (ii) einer zumindest ein Öl umfassenden öligen Phase.
Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Impfstoffe rekombinante Untereinheits-Lebendimpfstoffe, die als rekombinanten Vektor ein rekombinantes Virus umfassen. Vorteilhaft ist dieses Virus hüllenlos. Es kann insbesondere aus den Adenoviren, dem Kuhpockenvirus, dem Canarypox-Virus, den Herpesviren oder den Bakuloviren ausgewählt sein.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Impfstoffe sind auch dadurch gekennzeichnet, daß mit einer injizierbaren, auf Wasser und einer zumindest ein Öl umfassenden öligen Phase sowie gegebenenfalls einem Emulgatorsystem basierenden Emulsion ein aus einem rekombinanten viralen Vektor, dessen Genom eine eine Antigen-Untereinheit codierende - bevorzugt in einen für die Replikation des entsprechenden Hüllenvirus unwesentlichen Abschnitt eingefügte - Sequenz enthält, die eine Synthese von Antikörpern und/oder eine Schutzwirkung gegen das Hüllenvirus oder den pathogenen Mikroorganismus induziert, bestehender rekombinanter Untereinheits-Lebendimpfstoff assoziiert ist. Die antigenen Untereinheiten können beispielsweise ein Protein, ein Glykoprotein, ein Peptid oder eine gegen eine Infektion durch einen lebenden Mikroorganismus wie beispielsweise ein Hüllenvirus, eine Bakterie oder einen Parasiten immunogene und/oder schützende peptidische Fraktion sein.
Die Emulsion kann eine Emulsion der Form H/E, E/H oder E/H/E sein.
Der Nutzen der Erfindung besteht in der Möglichkeit, eine stabile, immunogene, flüssige Zusammensetzung in einer öligen Emulsion zu erhalten, die auf überraschende Weise erlaubt, die Menge von Immunogenen im Verhältnis zu einer wäßrigen Zusammensetzung desselben Immunogens zu verringern.
Die aus die ölige Phase bildenden und in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung verwendbaren Öle sind vorteilhaft aus den natürlichen oder synthetischen mineralischen Ölen oder den nicht mineralischen Ölen pflanzlichen, tierischen oder synthetischen Ursprungs, die für ihre fehlende oder schwache Toxizität bekannt sind, ausgewählte flüssige Öle.
Sie müssen bei Lagertemperatur (+4ºC) flüssig sein oder bei dieser Temperatur zumindest flüssige Emulsionen ausbilden.
Insbesondere werden mineralische Öle mit linearer Kette, die eine Anzahl von Kohlenstoffatomen, bevorzugt mehr als 16, hat und frei von aromatischen Bestandteilen ist, gewählt.
Bekannte Beispiele sind das MARCOL 52 (hergestellt durch ESSO Frankreich) und das DRAKEOL 6VR (hergestellt durch PENRECO USA).
Es können auch synthetische Öle wie beispielsweise die Polyisobutene oder die Polyisoproprene verwendet werden.
Aus den pflanzlichen Ölen werden ungesättigte, oleinsäurereiche und biologisch abbaubare Öle ausgewählt, beispielsweise Erdnuß-, Oliven-, Sesam-, Soja- oder Weizenkeimöl.
Für die tierischen Öle gelten die gleichen Kriterien der immunologischen Toleranz und Wirksamkeit. Als Beispiel für tierisches Öl können Squalen, Squalan und Spermazetöl genannt werden.
Im Rahmen der Erfindung wird vorteilhaft ein Gemisch der vorstehend genannten Öle verwendet.
Üblicherweise umfassen die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen außerdem ein Emulgatorsystem.
Dieses muß so abgestimmt sein, daß es flüssige und stabile injizierbare Präparate der Form E/H, H/E, E/H/E liefert.
Es setzt sich aus einem oder mehreren oberflächenaktiven Stoffen zusammen, die vermischt einen lipophilen oder hydrophilen, durch eine HLB-Zahl (Hydrophil-Lipophil-Balance, hydrophil-lipophil-Gleichgewicht) zwischen 1 und 19 gekennzeichneten Charakter haben.
Die Emulgatoren sind bevorzugt Ester, die durch Kondensation einer bei 20ºC flüssigen Fettsäure auf einen Zucker (Mannit, Glukose, Saccharose) oder aus Glyzerol oder Derivaten dessen Ester erhalten werden.
Die gesättigten Fettsäuren sind bevorzugt diejenigen, welche wenigstens 16 Kohlenstoffatome haben, und insbesondere die Olein-, Linolein-, Rizinolein- oder Cetostearinsäuren.
Bevorzugt werden die Mannitester oder Derivate der Mannitester verwendet. Als Beispiel für einen Mannitester können vor allem die durch Anhydrierung der 1-4- oder 2-6-Ringverbindungen bildenden polyhydroxylierten Kohlenstoffkette des Mannits erhaltenen Mannitoleate genannt werden.
Die Esterderivate können aus Estern bestehen, deren Hydrophihe durch Veredeln hydrophiler Funktionsgruppen wie beispielsweise Alkohol, Polyol, Ethylenoxid, Propylenoxid, Carboxylsäure, Amin oder Amid modifiziert ist.
Alle verwendeten Emulgatoren müssen zur spritzbaren Verwendung in pharmazeutischer Hinsicht annehmbar sein, insbesondere frei von Schwermetallen sein und sehr geringe Säure- oder Peroxid-Indizes aufweisen.
Ebenfalls wünschenswert ist, daß sie die Vorschriften von Unschädlichkeitsprüfungen, wie beispielsweise der durch S.S. BERLIN (Annals of Allergy, 1962, 20, 473) beschriebenen, erfüllen.
Die verwendeten Emulgatoren bilden mit dem gewählten Öl eine ölige, homogene, klare und stabile Phase, die mit der für jedes injizierbare Präparat geeigneten wäßrigen Umgebung emulsioniert wird.
Tabelle 1 faßt den mineralischen oder nicht mineralischen Charakter, d.h. die Öl-Stoffwechselfähigkeit (metabolisable des huiles), die Art der erhaltenen Impfemulsion und die wesentlichen Eigenschaften dieser Öle zusammen.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen können zur Herstellung eines zum Impfen von Menschen oder Tieren, insbesondere Schweinen, Schafen, Rindern, Hunden, Katzen, Geflügel und Fischen, bestimmten Impfstoffs verwendet werden.
Die Konzentrationen rekombinanter Untereinheits-Lebendimpfstoffe in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in Abhängigkeit von der Art des zu impfenden Tiers und der Art des Impfstoffs variieren. Diese Konzentrationen liegen vorwiegend zwischen 10² und 10¹&sup5; Mikroorganismen oder Viren/ml und bevorzugt zwischen 10&sup5; und 10¹² Mikroorganismen oder Viren/ml.
Die dem Menschen oder dem Tier zu injizierenden Volumina der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen hängen von dem Gewicht desselben sowie von der Art des Impfstoffs ab. Diese Volumina können zwischen 10 µl und 5 ml liegen. Für den Menschen oder ein Tier mit annähernd dessen Gewicht, beispielsweise bestimmten Primaten, können die injizierten Volumina zwischen 0,25 und 2 ml liegen.
Üblicherweise enthält eine erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung vor der Injektion der Zusammensetzung weniger als 1 µg/ml, bevorzugt weniger als 0,3 µg/ml von durch das exogene Gen des rekombinanten Untereinheits-Lebendimpfstoffe exprimierten Antigenen. Denn erfindungsgemäß wird das die Immunitätsreaktion auslösende Antigen durch den Impfstoff im wesentlichen in vivo synthetisiert; d.h. nachdem dieses in den zu impfenden Menschen oder in das zu impfende Tier injiziert wurde.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen können mittels verschiedener bekannter Verfahren hergestellt werden, beispielsweise gemäß den in der EP 480981 und der EP 480982 beschriebenen Verfahren. Ein solches, die Gewinnung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung ermöglichendes Verfahren kann darin bestehen, daß ein in wäßriger Lösung vorliegender rekombinanter Lebendimpfstoff mit einem mineralischen oder nicht mineralischen Öl oder einem Gemisch eines mineralischen und eines nicht mineralischen Öls in Form einer E/H-, H/Eoder E/H/E-Emulsion emulgiert werden. Das Öl oder die Öle können mit einem Adjuvans der zellularen Immunität, wie beispielsweise Avridin, assoziiert sein.
Die Gewichtsanteile der das mit dem Emulgatorsystem assoziierte oder nicht assoziierte Öl enthaltenden öligen Phase und der die Antigene oder die aktiven Wirkstoffe enthaltenen wäßrigen Phase variieren in der Emulsion jeweils zwischen 5 und 95% öliger Phase bei 95 bis 5% wäßriger Phase, insbesondere zwischen 25 und 75% öliger Phase bei 75 bis 25% wäßriger Phase.
Das Mischen der öligen Phase und der wäßrigen Phase erfolgt auf bekannte Art und Weise unter Rühren bei Temperaturen zwischen 20º und 40º C.
Alle erhaltenen Präparate müssen stabil sein, d.h., das emulgierte Präparat darf nicht zerfallen; dies bedeutet, daß für diese Art Erzeugnis unter normalen Lagerbedingungen keine Freisetzung der antigenen Phase oder der öligen Phase auftreten darf. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können bei 4ºC genau 12 Monate oder länger stabil sein.
Darüber hinaus sind diese Impfpräparate flüssig, d.h. die mittels einer beweglichen BROOKFIELD-Schwenkvorrichtung gemessene Viskosität kann kleiner sein als 200 m Pa s und ist bei 25ºC vorteilhaft kleiner als 300 m Pa s.
Der ölige oder wäßrige Charakter der kontinuierlichen Phase der Emulsion ist durch die in Mikrosiemens pro cm gemessene Leitfähigkeit gekennzeichnet.
Für Werte kleiner als etwa 20 Mikrosiemens pro cm wird eine ölige kontinuierliche Phase bei Raumtemperatur erhalten.
Gleichermaßen Teil der Erfindung sind rekombinante Lebendimpfstoffe, bei welchen die codierende Sequenz in dem Impfstoff beispielsweise eine antigene Untereinheit der HIV- Viren, beispielsweise die HIV1- oder HIV2-Viren oder das FIV- Virus codiert, wobei das Exprimieren dieser antigenen Untereinheit eine Antikörpersynthese und/oder eine Schutzwirkung gegen diese Viren selbst induziert.
In den nachfolgenden Beispielen ist die verwendete Impfstoffzusammensetzung ein unvollständiges Adenovirus, welches das Glykoprotein gp 50 des Pseudorage-Virus (PRV) exprimiert. Der Aufbau des rekombinanten Adenovirus Ad-gp 50, das Exprimieren des Antigens gp 50 in Zellkulturen, die Immunreaktion und der durch Impfung von Mäusen und Kaninchen mit Ad-gp 50 verliehene Schutz sind in der Veröffentlichung von M. Ebit et al., Journal of General Virology (1990), 71:2425-2431 beschrieben.
Kurz zusammengefaßt wurde der Zellstamm 293, ein durch ein Adenovirus des Typs 5 (Ad-5) transformierter embryonaler menschlicher Stamm (Graham et al., 1977, Journal of General Virology, 36:59-72), zur Transfektion, Multiplikation und Titration des Adenovirus verwendet.
Der Aufbau von Ad-gp 50 verwendet einen in dem für das Wachstum des Virus nicht wesentlichen Bereich E3 unvollständigen
Der Ad-gp 50 exprimiert hohe Niveaus von gp 50 in den E1A vervollständigenden oder nicht vervollständigenden Zellstämmen und insbesondere in den für das Gen ELA entleerten Hela- Zellen.
Die Autoren merken an, daß - in vivo - die durch einen ELISA- Test gemessene Antikörper-Reaktion für erhöhte Ad-gp 50-Konzentrationen signifikant ist, während der auf Mäuse oder Kaninchen übertragene Schutz nach versuchsweiser Infektion durch PRV schwach ist.
Der Nutzen der Erfindung besteht im Emulgieren dieser Art rekombinanten Lebendimpfstoffs in mit vorstehend beschriebenen Emulgatoren assoziierten Ölen, um einerseits ihr immunogenes und schützendes Vermögen unter Verringerung der injizierten Lebendvirendosen zu erhöhen und andererseits die Synthese von Zytokinen wie beispielsweise den Interleukinen, insbesondere IL2 und IL6, zu steigern.
In den nachfolgenden, verschiedenen Beispielen ist das Aujeszky-Virus dem PRV äquivalent.

Beispiel 1 (vergleichend): Induktion von Antikörpern und Wirksamkeit der Impfung bei Fehlen von Adjuvantia

Der Impfstoff besteht aus rekombinanten Ad-gp 50 Adenoviren wie vorstehend beschrieben.
Die in drei Ad-gp 50-Konzentrationen vorliegenden Impfstoffzusammensetzungen werden durch bzw. bei JO subkutan in auf drei Gruppen verteilte Mäuse OF1 (10 Mäuse pro Gruppe) eingeimpft, und zwar 100 µl pro Maus.
Die drei verwendeten Impfstoffkonzentrationen sind wie folgt festgelegt:
- 10&sup9; Viren/ml, d.h. 10&sup8; TC ID50/Maus (C1)
- 3 10&sup8; Viren/ml, d.h. 107,4 TC ID50/Maus (C2)
- 3 10&sup7; Viren/ml, d.h. 106,4 TC ID50/Maus (C3).
Das zur Bewertung der Wirksamkeit des Impfstoffpräparats verwendete Protokoll ist in Fig. 1 beschrieben.
Eine Serumentnahme erfolgt zwei Wochen später, um die durch die Impfstoffpräparate induzierte Menge von anti gp 50-Antikörpern zu ermitteln.
Um die Wirksamkeit der Impfstoffe zu ermitteln, wird ein Belastungstest (épreuve challenge) bei Vorhandensein eines virulenten Aujeszky-Viruspräparats mit der durch vorangehenden Versuch festgelegten Konzentration 20 DL50 durchgeführt.
Die genannte Konzentration entspricht einer Sterblichkeit von 100% bei nicht geimpften Mäusen.
Die Sterblichkeit wird für die Dauer von 240 Stunden beobachtet; jenseits dieser Zeitdauer überdauern alle Mäuse den Test.
Zwei Parameter werden gültig ermittelt:
- die am Ende des Versuchs beobachtete Überlebensrate, ausgedrückt in Prozent
- die Sterblichkeitskinetik

Ergebnisse

- Dosierung der Antikörper anti gp 50:

Die Serumentnahme erfolgt zwei Wochen nach den Immunisierungen.
Die Dosierung der Antikörper anti gp 50 erfolgt mittels ELISA mittels der durch Eloit et coll. in Veterinary Record, 1989, 124: 91-94 beschriebenen Technik.
Die ermittelten Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, in der:
- C1, C2, C3 jeweils die drei Ad-gp 50-Konzentrationen 10&sup9;, 3 10&sup8; und 3 10&sup7; Viren/ml darstellen;
- die Titer entlang der Ordinate aufgetragen sind und die zum Erhalt einer optischen Dichte DO (densite optique) größer als das Grundrauschen notwendige Verdünnung angeben;
- T einen absoluten Vergleichswert angibt: nicht geimpft; Ohne Adjuvans wird eine Antikörper-Induktion nur bei der Konzentration von 10&sup9; Ad-gp 50/ml erhalten; bei den Konzentrationen 3.10&sup8; und 3 10&sup7; Ad-gp 50/ml werden keine Antikörper anti gp 50 nachgewiesen.

- Prüfung mit dem virulenten Virus

Der Widerstand gegen den Versuch mit Aujeszky-Viren wird für die drei Impfstoffkonzentrationen C1, C2 und C3 ermittelt.
Die Überlebensraten nach dem Versuch sind in Fig. 3 dargestellt.
Der prozentuale Überlebensanteil ist entlang der Ordinate aufgetragen.
Ein teilweiser Schutz gegen die Belastung (50%) wird bei Vorliegen von Cl (10&sup9; Ad-gp 50/ml) beobachtet.
Für C2 (3 10&sup8; /ml) und C3 (3 10&sup7; /ml) wird ein signifikantes Fehlen eines Schutzes im Verhältnis zu einem absoluten Vergleichswert (nicht geimpft) beobachtet.
Der absolute Vergleichswert (nicht geimpft) repräsentiert eine Sterblichkeitsrate von 100%.
Fig. 4 zeigt die Kinetik des Überlebens des Versuchs einer Infektion mit dem Aujeszky-Virus nach der Immunisierung ohne Adjuvans.
Der Prozentsatz der Lebensfähigkeit ist entlang der Ordinate aufgetragen.
Es wird angemerkt, daß die Sterblichkeit für den Vergleichswert als auch für die Konzentrationen C2 und C3 vor Ablauf von 120 Stunden ermittelt wird.
Demzufolge läßt sich feststellen, daß ohne Adjuvans der rekombinante Adenovirus nicht in der Lage ist, bei einer Konzentration von weniger als 10&sup9; Ad-gp 50/ml Antikörper anti gp 50 oder irgendwelchen Schutz gegen die Belastung mit dem infektiösen Aujeszky-Virus zu induzieren. Mit einer Konzentration von 10&sup9; Ad-gp 50/ml wird nur ein teilweiser Schutz erzielt.

- Beispiel 2: Induktion einer Immunreaktion und eines Schutzes gegen den Aujeszky-Virus-Test bei Vorhandensein eines öligen Adjuvans der Form E/H, H/E oder E/H/E:

Die in der nachstehenden Tabelle 1 beschriebenen sechs Adjuvantia wurden hinsichtlich ihres Potentials zur Induktion von Antikörpern anti gp 50 sowie zur Induktion eines Widerstands nach einem Versuch mit - wie in Beispiel 1 definierten - infektiösen Aujeszky-Viren untersucht.
Die Impfstoffpräparate werden in der Spritze durch Mischen des Adjuvans und der rekombinanten Viren in den - wie in Beispiel 1 definierten - Konzentrationen C1, C2 und C3 in Form der nachstehenden Präparate hergestellt:

1) H/E-Impfstoffpräparate

Präparat Nr. 1

25% Adjuvans (Öl + Emulgatorsystem) (1)
75% immunogene Zusammensetzung
(1) = ISA 25 Montanid

Präparat Nr. 2

25% Adjuvans (Öl + Emulgatorsystem + Avridin) (2)
75% immunogene Zusammensetzung
(2) = ISA 25A Montanid

Präparat Nr. 3

20% Adjuvans (Öl und Emulgatorsystem) (3)
80% immunogene Zusammensetzung
(3) = ISA 28 Montanid

2) E/H/E-Impfstoffpräparate

Präparat Nr. 4

50% Adjuvans (Öl und Emulgatorsystem) (4)
50% immunogene Zusammensetzung
(4) = ISA 206 Montanid

3) EIH- Impfstoffpräparate

Präparat Nr. 5

55% Adjuvans (Öl und Emulgatorsystem) (5)
45% immunogene Zusammensetzung
(5) = ISA 50 Montanid

Präparat Nr. 6

70% Adjuvans (Öl und Emulgatorsystem) (6)
30% immunogene Zusammensetzung
(6) = ISA 708 Montanid TABELLE 1 Adjuvans Öl Impfstoffart % wäßrige/ Adjuvans (Gewichtsanteile) Viskosität Leitfähigkeit MONTANID mineralisch Avridin nicht mineralisch *Avridin = N,N-Dioctadecyl-N-bis(2-Hydroxyethyl)-Propanediamin
Sämtliche der vorstehend erwähnten ISA Montanide werden hergestellt und vertrieben durch die Fa. SEPPIC. Die Emulgatoren, die sie beinhalten, sind Mannitesterderivate.
Diese Präparate werden
- mit den in Beispiel 1 beschriebenen Impfstoffpräparaten ohne Adjuvans (T1)
- mit zwei Vergleichsgruppen, die zum einen aus nicht geimpften Mäusen (T2) und zum anderen aus Mäusen, in welche das Adjuvans ISA 50 Montanid in Abwesenheit von Ad-gp 50 injiziert wird (T3), bestehen, verglichen.
Die Dosierungen der Antikörper anti gp 50, die Messungen prozentualer Überlebensraten und die Messungen der Sterblichkeitskinetik werden gemäß den im vorstehenden Beispiel 1 beschriebenen Protokollen durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 sowie in den Fig. 5, 6, 7, 8, 9 und 10, in welchen C1, C2 und C3 dieselben Bedeutungen haben wie in Beispiel 1, zusammenge- TABELLE 2 ADJUVANS Ad-gp 50-KONZENTRATION ELISA-TITER Montanid entfällt

a) Ergebnisse mit H/E-Emulsionen

- Dosierung der Antikörper anti gp 50

Tabelle 2 zeigt, daß die Raten von Antikörpern anti gp 50 signifikant höher sind als die, die mit dem Vergleichsstoff ohne Adjuvans erhaltenen wurden, und dies jeweils für das ISA 25 Montanid, das ISA 25 A Montanid, welches das um das Zellimmunitäts-Stimulans Avridin ergänzte ISA 25 Montanid ist, und das ISA 28 Montanid.

- Versuch mit dem virulenten Virus

Die Fig. 5, 6 und 7 geben die prozentuale Lebensfähigkeit in Abhängigkeit von der Zeit für die drei Impfstoffkonzentrationen verglichen mit dem Vergleichswert T2 an, und dies jeweils für das ISA 25 Montanid (Fig. 5), das ISA 25 A Montanid (Fig. 6) und das ISA 28 Montanid (Fig. 7)
Die Wirkung des Adjuvans ist mit den ohne Adjuvans erhaltenen und in Fig. 4 dargestellten Ergebnissen zu vergleichen.

b) Ergebnisse mit E/H/E-Emulsionen

- Dosierung der Antikörper anti gp 50

Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigen klar, daß die bei Vorhandensein von ISA 206 Montanid erhaltene Rate von Antikörpern anti gp 50 signifikant höher ist als die mit dem Vergleichsstoff T2 für die drei untersuchten gp 50-Konzentrationen erhaltenen Raten.

- Versuch mit dem virulenten Virus

Fig. 8 zeigt die Ergebnisse nach Belastung, die mit mineralischern Öl ISA 206 Montanid in Verbindung mit dem Ad-gp 50 erhalten wurden. Überlebensraten von 70% und 50% werden für die beiden schwächsten Ad-gp 50-Konzentrationen erhalten.

c) Ergebnisse mit E/H-Emulsionen

- Dosierung der Antikörper anti gp 50

Tabelle 2 zeigt eine Rate von bei der Konzentration von 3 10&sup8; Ad-gp 50/ml signifikant nachweisbaren Antikörpern, während die Erfassung von Antikörpern anti gp 50 ohne Adjuvans für dieselbe Konzentration nicht möglich ist.

- Versuch mit dem virulenten Virus

Die mit dem ISA 50 Montanid (mineralisches Öl) und dem ISA 708 Montanid (mineralisches Öl) erhaltenen Ergebnisse sind in den Fig. 9 bzw. 10 dargestellt.
Eine Überlebensrate größer als 60% für das ISA 50 Montanid und größer als 50% für das ISA 708 Montanid wird für alle Adgp 50-Konzentrationen erhalten.
In Abwesenheit des erfindungsgemäßen Adjuvans beträgt die Überlebensrate mit den Konzentrationen C2 und C3 wie beschrieben (siehe Fig. 4) etwa 10%.
Tabelle 2 zeigt demzufolge klar, daß die Rate von Antikörpern anti gp 50 in Gegenwart der erfindungsgemäßen Adjuvantia signifikant höher ist als die ohne öliges Adjuvans erhaltene Rate.
Die Fig. 4 bis 10 zeigen, daß ohne erfindungsgemäßes öliges Adjuvans (Fig. 4) in Gegenwart von 10&sup9; Ad-gp 50/ml ein teilweiser Schutz (50%) gegen die Belastung beobachtet wird und in Gegenwart von 3 10&sup8; und 3 10&sup7; Ad-gp 50/ml kein Schutz vorhanden ist (10%).
Die Verwendung des ISA Montanids erlaubt, Schutzraten bis zu 100% für die höchste Konzentration (10&sup9; Ad-gp 50/ml), 90% (3 10&sup8; Ad-gp 50/ml) und 60% (3 10&sup7; Ad-gp 50/ml) zu erhalten.
Die dieser Studie zugrunde liegende Anordnung erlaubt, den Nutzen der Anwendung der erfindungsgemäßen öligen Adjuvantia auf rekombinante Untereinheits-Lebendimpfstoffe, die ermöglicht, die Raten der speziellen Antikörper des exprimierten Gens und den Schutz gegen die infektiöse Substanz aufsignifikante Weise zu erhöhen, aufzuzeigen.
Diese signifikanten Ergebnisse werden bei der anfänglichen Impfung (primovaccination) erhalten.
Unter den geprüften adjuvanshaltigen, wirksamen Impfstoffen werden demzufolge unterschieden:
- Die EIH-Impfstoffe (ISA 50 und ISA 708 Montanide)
* sie induzieren große Antikörperraten bei Konzentrationen von 10&sup9; und 3 10&sup8; Ad-gp 50/ml, während solche bei der Konzentration von 3 10&sup7; Ad-gp 50/ml nicht nachweisbar sind;
* sie schützen für die drei untersuchten Konzentrationen mit Raten größer als 50% gegen die Belastung mit dem infektiösen Aujeszky-Virus.
Es scheint hierbei jedoch, daß es hier keine feste Korrelation zwischen der Uberlebensrate und der Induktion von Antikörpern anti gp 50 gibt.
Dieses Phänomen könnte zurückzuführen sein auf
- eine sehr starke Induktion einer mit der verwendeten ELISA- Analyse (IGM, IGA, IGE) nicht erfaßbaren Immunglobulin- Klasse;
- und/oder der Induktion einer Immunität zellulärer Art.
- Die E/H/E-Impfstoffe (ISA 206 Montanid):
* sie induzieren sehr große Antikörperraten für die drei untersuchten Ad-gp 50-Konzentrationen (10&sup9; /ml, 3 10&sup8; /ml, 3 10&sup7; /ml)
* sie schützen für die drei untersuchten Konzentrationen mit Raten größer als 50% gegen das infektiöse Aujeszky-Virus.
- Die H/E-Impfstoffe mit den ISA 25 und ISA 28 Montaniden:
* sie induzieren spezifische Raten von Antikörpern anti gp 50, die bei Konzentrationen von 10&sup9; und 3 10&sup8; Ad-gp 50/ml groß sind, während in Gegenwart von ISA 28 Montanid bei der kleinsten Ad-gp 50-Konzentration (3 10&sup7; /ml) noch das Vorhandensein von Antikörpern anti gp 50 nachgewiesen wird;
* sie schützen gegen das infektiöse Aujeszky-Virus mit dem ISA 28 Montanid mit Raten zwischen 40 und 55%.
Diese Art von Impfstoffen (H/E) scheint jedoch insgesamt weniger wirksam zu sein als die E/H- oder E/H/E-Impfstoffe.

- Die HIE-Impfstoffe mit einem Adjuvans der zellulären Immunität:

Das Hinzufügen eines avridinartigen Adjuvans zu dem ISA 25 Montanid erlaubt, Schutzgrade gegen den Versuch von 100% für die höchste Ad-gp 50-Konzentration (10&sup9; /ml) zu erhalten, ohne eine zu große Menge von Antikörpern anti gp 50 zu induzieren.

- Beobachtung lokaler Reaktionen:

Eine makroskopische Beobachtung ergibt weder lokale Reaktionen noch Granulome an der Injektionsstelle.

BEISPIEL 3

Induktion der Synthese von Antikörpern und von Interleukinen

Die in Tabelle 1 beschriebenen sechs Adjuvantia wurden hinsichtlich ihres Potentials zur Induktion der Synthese von IL2 - Interleukinen untersucht.
Die die genannten Adjuvantia umfassenden Impfstoffzusammensetzungen wurden verschiedenen Gruppen von jeweils 10 Mäusen injiziert.
Jede Gruppe wurde mit einer einen der sechs Adjuvantia sowie Ad-gp 50 in den - wie in Beispiel 1 definierten - Konzentrationen C1, C2 oder C3 enthaltenden Impfstoffzusammensetzung geimpft.
Zum Vergleich wurde anderen Gruppen von 10 Mäusen eine entweder kein erfindungsgemäßes Adjuvans, kein Ad-gp 50 oder auch weder Adjuvans noch Ad-gp 50 enthaltende Impfstoffzusammensetzung injiziert.
In allen Fällen wurde jede Maus mit 100 µl Zusammensetzung behandelt.
Die 14 Tage nach der Impfung ermittelten IL2-Serumtiter sind in der nachstehenden Tabelle 3 dargestellt. Dieser Titer wurde mittels einer durch die Fa. Genzyme Corp. vermarkteten ELISA-Technik gemessen. TABELLE 3 ADJUVANS Ad-gp 50-KONZENTRATION IL2-TITER (pg/ml) Montanid entfällt
Wie den erhaltenen Ergebnissen entnehmbar ist, wird die IL2- Synthese durch ein gemäß der Erfindung mit dem Ad-gp 50 assoziiertes Adjuvans stark stimuliert.

BEISPIEL 4

Die Adjuvantia ISA 25 Montanid, ISA 206 Montanid und ISA 50 Montanid gemäß Tabelle 1 wurden hinsichtlich ihres Potentials zur Induktion der Synthese von IL6-Interleukinen untersucht.
Die die genannten Adjuvantia enthaltenden Impfstoffzusammensetzungen wurden verschiedenen Gruppen von jeweils 10 Mäusen injiziert.
Jede Gruppe wurde mit einer eines der genannten Adjuvantia und Ad-gp 50 in - wie in Beispiel 1 definierten - Konzentrationen C1, C2 oder C3 enthaltenden Impfstoffzusammensetzung geimpft.
Zum Vergleich wurden andere Gruppen von 10 Mäusen dadurch behandelt, daß ihnen eine Zusammensetzung injiziert wurde, die kein erfindungsgemäßes Adjuvans, kein Ad-gp 50 oder auch weder Adjuvans noch Ad-gp 50 enthielt. In allen Fällen wurden jeder Maus 100 µl Zusammensetzung injiziert. Der 14 Tage nach der Injektion bestimmte IL6-Serumtiter ist in der nachstehenden Tabelle 4 angegeben. Dieser IL6-Titer wurde durch eine herkömmliche, durch die Fa. Endogen vermarktete ELISA-Technik gemessen. TABELLE 4 ADJUVANS Montanid entfällt
Wie den erhaltenen Ergebnissen entnehmbar ist, wird die IL6- Synthese durch die Impfstoffzusammensetzung stimuliert, die das mit dem Ad-gp 50 assozuerte Adjuvans ISA 206 Montanid der Emulsionsform E/H/E enthält.

BEISPIEL 5

Die sechs in Tabelle 1 beschriebenen Adjuvantia wurden hinsichtlich ihres Potentials zur Induktion der Synthese von vier verschiedenen anti gp 50-Antikörper-Unterklassen, d.h. Ig G1, Ig G2a, Ig G2b und Ig G3, untersucht.
Die Impfstoffzusammensetzungen wurden Gruppen von jeweils 10 Mäusen injiziert.
Jede Gruppe von Mäusen wurde mit einer eines der sechs Adjuvantia und Ad-gp 50 in - wie in Beispiel 1 definierten - Konzentrationen C1, C2 oder C3 enthaltenden Impfstoffzusammensetzung geimpft.
Zum Vergleich wurden andere Gruppen von 10 Mäusen dadurch behandelt, daß ihnen eine Zusammensetzung injiziert wurde, die kein erfindungsgemäßes Adjuvans, kein Ad-gp 50 oder auch weder Adjuvans noch Ad-gp 50 enthielt.
In allen Fällen wurde jede Maus mit Injektionen von 100 µl erfindungsgemäßer oder vergleichsweiser Zusammensetzung behandelt.
Der 14 Tage nach der Injektion der genannten Zusammensetzung bestimmte Serumtiter (exprimiert durch die letzte Verdünnung, bei der die Adsorption größer ist als die des in einer ein Adjuvans und kein Ad-gp50 enthaltenden Zusammensetzung bestehenden Vergleichsstoffs) für jeden Antikörper IGG ist in der nachstehenden Tabelle 5 angegeben. Der Serumtiter wurde auf herkömmliche Weise mittels eines ELISA-Verfahrens gemessen. TABELLE 5 ADJUVANS Montanid entfällt
Wie diesen Ergebnissen entnehmbar ist, erlaubt eine Impfstoffzusammensetzung gemäß der Erfindung die Synthese der 4 anti-gp 50-Antikörper-Unterklassen.
Es versteht sich von selbst, daß die vorstehenden Beispiele nur zur Veranschaulichung gegeben sind. Die Erfindung betrifft auch jede Zusammensetzung, die ein oder mehrere mineralische, nicht mineralische oder vermischte (mineralisch + nicht mineralisch) Öle enthält, die mit einem Emulgatorsystem assoziiert sind, welches die physiochemischen Eigenschaften (Viskosität, Leitfähigkeit) von ISA Montaniden besitzt, und mit einer wäßrigen Lösung mischbar sind, welche einen rekombinanten Impfstoff enthält, in dem ein gegen gleich welche pathogene Substanz immunogenes Protein oder Peptid in einem Vektor exprimiert wird, dessen Replikation mit einer öligen Emulsion verträglich ist.

Claims

1. Rekombinante Lebendimpfstoff-Zusammensetzung, gekennzeichnet durch zumindest einen rekombinanten Untereinheits-Lebendimpfstoff in einer injizierbaren Emulsion mit (i) zumindest einer wäßrigen Phase und (ii) einer zumindest ein Öl umfassenden öligen Phase.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der rekombinante Untereinheits-Lebendimpfstoff einen in einem rekombinanten Virus und bevorzugt in einem hüllenlosen rekombinanten Virus bestehenden rekombinanten Vektor umfaßt.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Virus aus den Adenoviren, den Kuhpockenviren, den Canarypox-Viren, den Herpes-Viren oder den Bakuloviren ausgewählt wird.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Virus ein Adenovirus ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Virus der Canarypox- Virus ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Virus ein Bakulovirus ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die ölige Phase ein Emulgatorsystem umfaßt.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Emulsionsform E/H/E oder E/H ist.

9. Lebendimpfstoff-Zusammensetzung gegen ein Hüllenvirus oder einen pathogenen Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer injizierbaren, auf Wasser und einer zumindest ein Öl umfassenden öligen Phase sowie gegebenenfalls einem Emulgatorsystem basierenden Emulsion ein aus einem rekombinanten, viralen Vektor, dessen Genom eine eine Antigen-Untereinheit codierende Sequenz enthält, die eine Synthese von Antikörpern und/oder eine Schutzwirkung gegen das Hüllenvirus oder den pathogenen Mikroorganismus induziert, bestehender rekombinanter Untereinheits-Lebendimpfstoff assoziiert ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der virale Vektor ein hüllenloses Virus ist.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz eine Antigen-Unteremheit codiert, die eine Schutzwirkung gegen HIV-Viren, etwa HIV1 oder HIV2, induziert.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz eine Antigen-Untereinheit codiert, die eine Schutzwirkung gegen das FIV-Virus induziert.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz eine Antigen-Untereinheit codiert, die eine Schutzwirkung gegen das Aujeszky-Virus induziert.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem Genom des viralen Vektors enthaltene Sequenz eine Sequenz ist, die das Glykoprotein gp 50 des Aujeszky- Virus codiert, und daß sie vor einer Infektion durch das Aujeszky-Virus schützt.

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Öl mineralisch oder nicht mineralisch ist.

16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei 4ºC genau oder länger als 12 Monate stabil ist und bei 25º eine Viskosität von weniger als 300 m Pa s aufweist.

17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewichtsanteile der dem Emulgatorsystem zugeordnetes oder nicht zugeordnetes Öl enthaltenden öligen Phase und der die Antigene oder die aktiven Stoffe enthaltenden wäßrigen Phase jeweils zwischen 5 und 95% öliger Phase bei 95 bis 5% wäßriger Phase und bevorzugt zwischen 25 bis 75% öliger Phase bei 75 bis 25% wäßriger Phase schwanken.

18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die ölige Phase ein Emulgatorsystem enthält, welches (i) einen durch Kondensation einer bei 20 ºC flüssigen Fettsäure auf einen Zucker oder Glyzerol gewonnenen Ester und/oder (ii) ein Derivat eines solchen Esters umfaßt.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker Mannit ist.

20. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Lebendimpfstoff-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, gekennzeichnet durch Emulgieren eines rekombinanten Lebendimpfstoffs in wäßriger Lösung mit einem mineralischen oder nicht mineralischen Öl oder einem Gemisch aus mineralischem oder nicht mineralischem Öl in Form einer E/H-, H/E- oder E/H/E- Emulsion.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das mineralische oder nicht mineralische Öl einem Zellimmunitäts-Adjuvans, etwa Avridin, beigefügt werden kann.

22. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Herstellung eines für den Menschen oder für Tiere bestimmten Impfstoffs.

23. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Herstellung eines Impfstoffs, der die Synthese von Zytokinen und insbesondere von Interleukinen induziert.

24. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Interleukine aus IL2 oder IL6 bestehen.