DE69334102T2

DE69334102T2 - Zusammenstellung zur Regulierung der Zytokinaktivität

Info

Publication number: DE69334102T2
Application number: DE69334102T
Authority: DE
Inventors: Irun R. Cohen; Ofer Lider; Liora Cahalon; Oded Shoseyov; Raanan Margalit
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1992-11-10
Filing date: 1993-11-09
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2013-11-10
Also published as: CA2149116A1; IL107563A; EP0669827B1; CN1093904A; JPH08506322A; HUT70945A; FI952267A0; YU71393A; NO951822L; PL309001A1; AU686581B2; EP1095657A3; DE69330252T2; EP1095657B1; NO951822D0; SI9300586A; DE69330252D1; NZ258367A; AU699624B2; AU6478398A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer Verbindung, bei der es sich um ein N-sulfatiertes oder N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-iduronglucosamin gemäß Anspruch 1 handelt und auf die Verwendung einer Verbindung, bei der es sich um ein nicht sulfatiertes, N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-iduronglucosamin gemäß Anspruch 2 handelt.
1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Substanzen für die Regulation der Zytokinaktivität, zum Beispiel die Hochregulation oder Herunterregulation der Aktivität des Tumornekrosefaktors Alpha (TNF-α). Offenbart sind insbesondere Substanzen und pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen, welche die Sekretion von aktivem TNF-α durch Wirtszellen entweder hemmen oder steigern, wenn sie einem Wirt in wirksamen Mengen verabreicht werden. Es wird angenommen, dass die Sekretion von aktiven Zytokinen, zum Beispiel TNF-α, durch die Immuneffektorzellen des Wirts (z.B. die aktivierten Makrophagen des Wirts) mit Hilfe der Verfahren der vorliegenden Erfindung reguliert werden kann.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Vorbeugung und/oder die Behandlung von pathologischen Prozessen oder umgekehrt die Initiierung einer vorteilhaften Antwort des Immunsystems, welche die Induktion der Zytokinproduktion, -sekretion und/oder -aktivität einschließen. Ausgewählte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine wirksame niedrige Dosis von niedermolekularem Heparin (Low molecular Weight Heparin, LMWH), das in Intervallen von bis zu zwischen 5 und 8 Tagen verabreicht wird. Wieder andere Zusammensetzungen schließen Substanzen, die carboxylierte und/oder Sulfat-Oligosaccharide in im Wesentlichen gereinigter Form, erhalten aus einer Vielzahl an primären Quellen einschließlich chromatographischer Trennung und Reinigung von LMWHs, enzymatisch abgebautes Heparin und enzymatisch abgebaute extrazelluläre Matrix (DECM) umfassen, ein.
Einzeln hemmen oder steigern die Substanzen, dieselbe enthaltende Zusammensetzungen und pharmazeutische Zusammensetzungen, die besonders für parenterale, orale oder topische Verabreichung geeignet sind, in vitro die TNF-α-Sekretion durch ruhende T-Zellen und/oder Makrophagen als Antwort auf die Aktivierung durch Immuneffektorzell-Aktivatoren, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt: für T-Zellen spezifische Antigene, T-Zellen-Mitogene, Aktivatoren von Makrophagen, restliche extrazelluläre Matrix (residual extracellular matrix, RECM), Fibronektin, Laminin oder dergleichen. In vivo Daten, welche die Hemmung von experimenteller Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ zeigen (delayed type hypersensitivity, DTH), werden zusätzlich zu den in vitro Ergebnissen angegeben.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
2.1. Tumornekrosefaktor Alpha
TNF-α, ein von Monozyten (Makrophagen) und T-Lymphozyten produziertes Zytokin, ist ein Schlüsselelement bei der Faktorenkaskade, die zu Entzündungsreaktionen führen und es weist als ein Hauptfaktor bei der Verursachung von Krankheitszuständen viele pleiotrope Effekte auf (Beutler, B. and Cerami, A., Ann. Rev. Immunol. (1989) 7:625-655).
Die biologischen Wirkungen von TNF-α sind abhängig von seiner Konzentration und dem Ort seiner Herstellung: bei niedrigen Konzentrationen ist es möglich, dass TNF-α erwünschte homöostatische und Abwehrreaktion auslöst; aber bei hohen Konzentrationen, und zwar systemisch oder in bestimmten Geweben, kann TNF-α mit anderen Zytokinen, vor allem Interkleukin-1 (IL-1) synergieren und viele Entzündungsreaktionen verschlimmern.
Es wurde gezeigt, dass die folgenden Reaktionen von TNF-α (gemeinsam mit IL-1) induziert werden: Fieber, Slow-Wave-Sleep, hämodynamischer Schock, erhöhte Produktion von Akute-Phase-Proteinen, verringerte Produktion von Albumin, Aktivierung von vaskulären Endothelzellen, erhöhte Expression von Haupthistokompatibilitätskomplex-Molekülen (MHC), reduzierte Lipoproteinlipase, reduziertes Cytochrom P450, reduziertes Zink und Eisen im Plasma, Fibroblastenproliferation, erhöhte Synovialzellen-Kollagenase, erhöhte Aktivität von Zyklooxygenase, Aktivierung von T-Zellen und B-Zellen und Induktion der Sekretion von Zytokinen, TNF-α selbst, IL-1, IL-6 und IL-8. Tatsächlich haben Studien gezeigt, dass die physiologischen Effekte dieser Zytokine in Wechselbeziehungen stehen (Philip, R. and Epstein, L. B., Nature (1986) 323(6083):86-89; Wallach, D. et al., J. Immunol. (1988) 140 (9):2994-2999).
Die Art und Weise, auf die TNF-α seine Wirkung ausübt, ist nicht im Detail bekannt, aber von vielen der Effekte wird angenommen, dass sie mit der Fähigkeit von TNF-α, Zellen zu stimulieren, um Prostaglandine und Leukotriene aus Arachidonsäure der Zellmembran zu produzieren, verbunden sind.
Als ein Ergebnis seiner pleiotropen Effekte spielt TNF-α bei einer Vielzahl von pathologischen Zuständen in vielen verschieden Körperorganen eine Rolle. In Blutgefäßen fördert TNF-α hämorrhagischen Schock, sorgt für die Herunterregulation von Thrombomodulin aus Endothelzellen und erhöht die Aktivität von Prokoagulans. Es verursacht die Adhäsion von weißen Blutzellen und vermutlich von Blutplättchen an die Wände von Blutgefäßen und kann so Vorgänge fördern, die zu Atherosklerose und Vaskulitis führen.
TNF-α aktiviert Blutzellen und verursacht die Adhäsion von Neutrophilen, Eosinophilen, Monozyten/Makrophagen und T- und B-Lymphozyten. Durch Induktion von IL-6 und IL-8 erhöht TNF-α die Chemotaxis von Entzündungszellen und fördert ihr Eindringen in Gewebe. Somit spielt TNF-α eine Rolle bei der Schädigung von Gewebe im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen, Allergien und Transplantatabstoßung.
TNF-α wurde auch Cachectin genannt, da es die Stoffwechselaktivitäten von Adipozyten moduliert und somit eine Rolle bei Erscheinungen wie starkem Abnehmen und Kachexie spielt, die Begleiterscheinungen bei Krebserkrankungen, chronischen Infektionen, chronischem Herzversagen und chronischen Entzündungen sind. TNF-α kann ebenso eine Rolle bei Anorexia Nervosa spielen, da es den Appetit hemmt, während der Abbau des Fettgewebes gesteigert wird.
TNF-α hat metabolische Effekte auf Skelett- und Herzmuskulatur. Ebenso hat es deutliche Auswirkungen auf die Leber: es setzt den Albumin- und Cytochrom P450-Stoffwechsel herab und erhöht die Produktion von Fibrinogen, I-Säure-Glycoprotein und anderen Akute-Phase-Proteinen. Darüber hinaus kann es auch Darmnekrose hervorrufen.
Im zentralen Nervensystem überwindet TNF-α die Blut-Hirn-Schranke und löst Fieber, verstärktes Schlafbedürfnis und Anorexie aus. Eine erhöhte Konzentration von TNF-α ist mit Multipler Sklerose assoziiert. Des Weiteren löst es Nebennierenhämorrhagie aus und beeinflusst die Produktion von Steroidhormonen, erhöht Kollagenase und PGE-2 in der Haut und verursacht eine Schädigung von Knochen und Knorpeln durch die Aktivierung von Osteoklasten.
Kurz gesagt spielt TNF-α in der Pathogenese von vielen unerwünschten entzündlichen Zuständen in Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung, Vaskulitis und Atherosklerose eine Rolle. Ebenso kann es bei Herzversagen und bei der Reaktion auf Krebserkrankungen eine Rolle spielen. Aus diesen Gründen wurde nach Wegen gesucht, die Produktion, Sekretion oder Verfügbarkeit von aktiven Formen von TNF-α zu regulieren, um so eine Vielzahl an Erkrankungen kontrollieren zu können.
Die grundlegende Funktion des Immunsystems besteht darin, vor Infektionen durch Fremdstoffe wie Mikroorganismen zu schützen. Es ist jedoch ebenso möglich, dass Eigengewebe angegriffen wird, was zu pathologischen Zuständen, die als Autoimmunerkrankungen bekannt sind, führt. Die aggressiven Reaktionen des Immunsystems einer Person gegen Gewebe von anderen Personen sind der Grund für unerwünschte Abstoßungsreaktionen auf transplantierte Organe. Hyperreaktivität des Systems gegen Fremdstoffe löst Allergien mit Symptomen wie Asthma, Rhinitis und Ekzembildung aus.
Diese Reaktionen werden von den Lymphozyten übernommen, und zwar primär von den aktivierten T-Lymphozyten; und die pathologische Entzündungsreaktion, die sie steuern, ist abhängig von ihrer Fähigkeit, sich durch die Gefäßwände von Blutgefäßen zu ihrem Zielgewebe hin und von diesem weg zu bewegen. Somit kann durch die Reduktion der Fähigkeit von Lymphozyten, an die Gefäßwände von Blutgefäßen zu adhärieren und diese zu durchdringen, ein Angriff auf das eigene Autoimmunsystem, die Abstoßung eines Transplantats und das Auftreten von Allergien vermieden werden. Dies würde eine neues therapeutisches Prinzip darstellen, das zu besserer Wirksamkeit und reduzierten entgegengesetzten Reaktionen führen würde, als dies bei den heute verwendeten Therapien der Fall ist.
Atherosklerose und Vaskulitis sind Beispiele für chronische und akute pathologische Gefäßentzündungen. Bei Atherosklerose kommt es zu einer Verdickung und Versteifung der Intima der Arterien, was zu Koronarerkrankungen, Myokardinfarkt, Hirninfarkt und peripheren Gefäßerkrankungen führen kann und stellt eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität in der westlichen Welt dar. Vom pathologischen Gesichtspunkt aus gesehen entwickelt sich Atherosklerose langsam und chronisch als eine von Fett- und Kalkablagerungen verursachte Läsion. Die Proliferation von faserigem Gewebe führt schließlich zu einem akuten Zustand, der die plötzliche Okklusion des Lumens des Blutgefäßes verursacht.
Es wurde gezeigt, dass TNF-α die Replikation des Humanen Immun-Defizienzvirus (HIV) in vitro erleichtert und erhöht (Matsuyama, T. et al., J. Virol. (1989) 63(6):2504-2509; Michihiko, S. et al., Lancet (1989) 1(8648):1206-1207) und die Expression des HIV-1 Gens stimuliert und somit vermutlich die Entwicklung des klinischen Zustands AIDS in latent mit HIV-1 infizierten Personen auslöst (Okamoto, T. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses (1989) 5(2):131-138).
Deshalb hat TNF-α, ebenso wie die Entzündungsreaktion, an der es Teil hat, nicht ausschließlich positive Aspekte. Vielleicht kann das bessere Verständnis seiner physiologischen Funktion auch zu einem besseren Verständnis des Sinn und Zwecks von Entzündungen insgesamt und zu Erkenntnissen bezüglich der Umstände, unter denen „TNF-α-Mangel" und „TNF-α Überschuss" auftreten, beitragen. Dies kann auch dazu führen, dass ein rationaler und spezifischer therapeutischer Ansatz für die Vorgehensweise bei Krankheiten, bei denen dieses Hormon produziert wird, gefunden wird.
2.2. Heparin
Heparin ist ein Glycosaminoglycan, ein polyanionisches, sulfatiertes Polysaccharid, das klinisch als Antithrombosemittel verwendet wird, um die Entstehung von Blutgerinnseln zu verhindern. In Tiermodellen wurde gezeigt, dass Heparin die Fähigkeit von autoimmunen T-Lymphozyten, ihr Zielorgan zu erreichen, reduziert (Lider, O. et al., Eur. J. Immunol. (1990) 20:493-499). Es wurde auch gezeigt, dass Heparin experimentelle Autoimmunerkrankungen in Ratten supprimiert und das Überleben des Allotransplantats bei einem Versuch mit Hauttransplantationen in Mäusen verlängert, wenn es in niedrigen Dosen angewandt (5 μg für Mäuse und 20 μg für Ratten) und einmal täglich injiziert wird (Lider, O. et al., J. Clin. Invest. (1989) 83:752-756).
Es wird angenommen, dass die Mechanismen, die der beobachteten Wirkung zugrunde liegen, die Hemmung der Freisetzung von für das Durchdringen der Gefäßwand benötigten Enzymen) durch T-Lymphozyten umfassen, und zwar primär die Freisetzung des Enzyms Heparanase, das spezifisch die Glycosaminoglycan-Gruppe der die Blutgefäße auskleidenden, subendothelialen extrazellulären Matrix (ECM) angreift (Naparstek, Y. et al., Nature (1984) 310:241-243). Die Expression des Enzyms Heparanase ist mit der Fähigkeit von autoimmunen T-Lymphozyten, die Gefäßwände von Blutgefäßen zu durchdringen und das Gehirn im Krankheitsmodell experimentelle, autoimmune Encephalomyelitis (EAE) anzugreifen, assoziiert.
Die Europäische Patentanmeldung EP 0114589 (Folkman et al.) beschreibt eine Zusammensetzung für die Hemmung von Angiogenese in Säugetieren, bei der die Wirkstoffe im Wesentlichen aus (1) Heparin oder einem Heparinfragment, bei dem es sich um ein Hexasaccharid oder ein noch größeres Saccharid handelt und (2) Kortison oder Hydrokortison oder dem 11-α Isomer von Hydrokortison bestehen. Gemäß der Offenbarung sind Heparin als solches oder Kortison als solches ohne Wirkung; nur die Kombination aus beiden führt zu der gewünschten Wirkung. Obwohl in der Literatur kein Beweis für eine Verbindung zwischen Angiogenese und Autoimmunerkrankungen zu finden ist, stellt die Beschreibung auf Seite 5 der Patentanmeldung eine Verbindung von Angiogenese mit Psoriasis und Arthritis her, wobei die Verwendung von hohen Dosen von 25 000 Einheiten bis 47 000 Einheiten Heparin pro Tag (d.h. ungefähr 160 bis ungefähr 310 mg pro Tag) angegeben ist.
Horvath, J. E. et al., in Aust. N.Z.J. Med. (1975) 5(6):537-539 beschreiben die Wirkung von sub-antikoagulatorischen Dosen von subkutanem Heparin auf die frühe Funktion von Nierenallotransplantaten. Die tägliche Dosis ist hoch (5000 E oder ungefähr 33 mg) und die Schlussfolgerung der Studie ist, dass Heparin in sub-antikoagulatorischen Dosen keine Wirkung auf die frühe Transplantatfunktion oder das Transplantatüberleben hat und dass es möglicherweise mit erhöhten hämorrhagischen Komplikationen assoziiert ist.
Toivanen, M. L. et al., Meth. and Find. Exp. Clin. Pharmacol. (1982) 4(6):359-363, untersuchten die Wirkung von Heparin in hoher Dosierung (1000 E/Ratte oder ungefähr 7 mg/Ratte) in der Hemmung von Adjuvans-Arthritis in Ratten und fanden heraus, dass Heparin die Schwere der Adjuvans-Arthritis bei den Ratten verstärkte.
Die PCT Patentanmeldung PCT/AU88/00017 veröffentlicht als WO88/05301 (Parish et al.) beschreibt sulfatierte Polysaccharide, die die Endoglycosylaseaktivität wie Heparanaseaktivität blockieren oder hemmen, zur Verwendung als Antimetastatikum oder antiinflammatorischer Wirkstoff. Es wurde gezeigt, dass Heparin und Heparinderivate, wie durch Periodat oxidierte, reduzierte Heparine, die eine vernachlässigbare antikoagulatorische Aktivität aufwiesen, antimetastatische und antiinflammatorische Aktivität entwickeln, wenn sie in Dosierungen im Bereich von 1,6-6,6 mg täglich pro Ratte und durch konstante Infusion verabreicht (entsprechend 75-308 mg täglich für einen erwachsenen, menschlichen Patienten) verwendet werden.
Heparin und Heparansulfat sind eng verwandte Glycosaminoglycan-Makromoleküle. Die Abbauprodukte dieser polymeren Makromoleküle, die als niedermolekulare Heparine (LMWH) bezeichnet werden, können dieselbe oder eine höhere pharmakologische Wirkung auf das Blutgerinnungssystem ausüben, als die verwandten Makromoleküle. Des Weiteren ist das LMWH auf Grund der ausführlichen aber unvollständigen post-synthetischen Verarbeitung der grundlegenden Dissaccharidunterheit des Polymers, nämlich Glucuronsäure und N- Acetyl-Glucosamin, eine heterogene Mischung, nicht nur was Größen, sondern auch was chemische Zusammensetzungen betrifft (siehe Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. Ausgabe, (Pergamon Press, New York, 1990) S. 1313-1315. Verfahren für das Erhalten von als Antikoagulantien nützlichen, niedermolekularen Produkten von Heparin sind im Stand der Technik beschrieben. Diese Verfahren haben das Ziel, die in vivo Persistenz oder das Ausmaß an hämorrhagischen Nebeneffekten ihrer Produkte zu optimieren (siehe zum Beispiel Ipino R. R., et al., U.S. Patent Nr. 5,010,063; Choay, J., et al., U.S. Patent Nr. 4,990,502; Lopez, L. L., et al., U.S. Patent Nr. 4,981,955). Andere lehren die Verwendung von Verfahren der Affinitätschromatographie für das Erhalten von niedermolekularen Produkten (Siehe zum Beispiel Rosenberg, R. D., et al., U.S. Patent Nr. 4,539,398 und Jordan, R. E., et al., U.S. Patent Nr. 4,446,314).
Psuja P., wie in Folio Haematol. (Leipz), (1987) 114:429-436 berichtet, untersuchte die Wirkung der Heterogenität von Heparinen auf ihre Wechselwirkungen mit Zelloberflächen. Psuja berichtete über Rezeptoren mit moderater Affinität für LMWH (D_d = 5,6 μM), die an kultivierten Endothelzellen gefunden wurden, aber er bestimmte, dass das obere Ende des Teils von LMWH, der an diese Rezeptoren gebunden war, weniger als 1 % des Gesamt-LMWH betrug.
Andere Forscher haben die Wirkung von LMWH auf den Stoffwechsel einer Vielzahl von kultivierten Zelltypen gezeigt. Asselot-Chapel, C., et al., in Biochem. Pharmacol. (1989) 38:895-899 und in Biochem. Biophys. Acta, (1989) 993:240-244 berichten, dass LMWH kultivierte, glatte Muskelzellen dazu veranlasst, das Verhältnis von Typ-III-Kollagen zu Typ-I-Kollagen und die Fibronektinsynthese zu reduzieren. Rappaport R. lehrt in US Patent Nr. 4,889,808, dass das LMWH humane diploide Lungenfibroplasten, die in Abwesenheit von Serum kultiviert wurden, dazu veranlassen kann, durch erhöhte Sekretion von Gewebeplasminogenaktivator und verwandten Proteinen auf LMWH zu reagieren.
Über Wirkungen von LMWH auf komplexe multizelluläre Systeme wurde berichtet. Die Arbeit von Folkman et al. und Lider et al. in der EPO-Anmeldung 0114589 und in J. Clin. Invest. (1989) 83:752:756 wurden oben erwähnt. Darüber hinaus lehrt Diferrante N. in der veröffentlichen, internationalen Anmeldung WO 90/03791 die Verwendung von LMWH zur Hemmung der Reproduktion von HIV in Kulturen von C8166 transformierten humanen Lymphozyten (ALL). Allerdings wurde in keinem der im Stand der Technik bekannten Versuche zur Wirkung von LMWH auf den Zellstoffwechsel berücksichtigt, dass die Heterogenität von LMWH antagonistische Effekte hervorrufen kann. Des Weiteren wurde in keinem der Versuche die regulatorische Wirkung auf die Zytokinaktivität basierend auf der Verwendung von im Wesentlichen reinen Oligosaccharidsubstanzen gezeigt oder vorgeschlagen.
WPI Datenbank, Abteilung CH, Woche 199135 Derwent Publications Ltd., London, GB; Klasse B04, AN 1991-257972 XP002265425 & JP 03 169821 A (Kissei Pharm KK) 23. Juli 1991 (1991-07-23) nimmt Bezug auf einen PGF2-produzierenden und – erhöhenden Wirkstoff, der unfraktioniertes Heparin (UFH) oder niedermolekulares Heparin (LMWH) als aktiven Bestandteil beinhaltet.
BE-A-1 004 029 betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung des Tumorwachstums.
WO 92/19249 beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Vorbeugung und/oder Behandlung von pathologischen Prozessen, welche die Induktion der TNF-α-Sekretion umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein niedermolekulares Heparin (LMWH) einschließen. In den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist das LMWH in einer niedrigen, wirksamen Dosis vorhanden und wird in Intervallen von ungefähr 5-8 Tagen verabreicht. Des Weiteren ist das LMWH in der Lage, die in vitro TNF-α-Sekretion durch ruhende T-Zellen und/oder Makrophagen als Antwort auf für T-Zellen spezifische Antigene, Mitogene, Makrophagenaktivatoren, gerissene extrazelluläre Matrix (disrupted extracellular matrix, dECM), Laminin, Fibronektin und dergleichen zu hemmen.
Rice K.G. et al. bezieht sich auf die „Study of structurally defined oligosaccharide substrates of heparin and heparin monosulfate lyases", carbohydrate research, Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, NL, Band 190, Nr. 2, 1. Juli 1989 (1989-07-01), Seiten 219-233, XP000026506 ISSN: 0008-6215.
Yamada S. et al. beschäftigt sich mit „One- and two-dimensional h-nmr characterization of two series of sulfated disaccharides prepared from chondroitin sulfate and heparin sulfate/heparin by bacterial eliminase digestion", Journal of biochemistry, Japanese Biochemical Society, Tokyo, JP, Band. 112, Nr. 4, 1992, Seiten 440-447, XP001160880 ISSN: 0021-924X.
Nader, Helena B. et al. beschreibt „Structural requirements of heparin disaccharides responsible for hemorrhage: reversion of the antihemostatic effect by ATP" Faseb Journal (1989), 3(12), 2420-4, XP001160861.
Y. Kariy et al. bezieht sich auf „Preparation of unsaturated disaccharides by eliminative cleavage of heparin and heparin sulfate with heparitinases." Comp. Biochem. Physiol., Band 103B, Nr. 2. 1992, pages 473-479, XP 000561260.
Linhardt, Robert J. et al. offenbart „Oligosaccharide mapping of low-molecular-weight heparins: structure and activity differences" Journal of Medicinal Chemistry, Band. 33, 1906-1990; Seiten 1639-1645, XP002265424.
Okayama, Minoru et al. behandelt „Purification and characterization of novel heparin sulfate proteoglycans produced by murine erythroleukemia cells in the growing phase", Journal of Biological Chemistry (1991), 266(6), 3808-19, XP001174105.
EP-A-0 084 999 beschreibt ein Verfahren für die Herstellung von organischen Oligosacchariden, die Fragmenten von natürlichen Mucopolysacchariden entsprechen, erhaltene Oligosaccharide und deren biologische Anwendungen.
Nawroth P.P. Stern D M offenbart „Tumor necrosis factor/cachectin-induced modulation of endothelial cell hemostatic properties", Oncologie (1987), 10(4), 254-258.
Die Verwendung einer Verbindung, bei der es sich um ein N-sulfatiertes oder N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-iduronglucosamin handelt, ist in Anspruch 1 definiert; die Verwendung einer Verbindung, bei der es sich um ein nicht sulfatiertes, N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-iduronglucosamin handelt, ist in Anspruch 2 definiert.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung einer Verbindung begrenzt, bei der es sich um ein N-sulfatiertes oder N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-iduronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon handelt, wobei diese Verbindung, wenn sie N-acetyliert ist, mindestens eine andere Sulfatgruppe aufweist und wenn sie N-acetyliert ist, mindestens zwei Sulfatgruppen aufweist, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung der in Anspruch 1 spezifizierten Krankheiten verwendet wird und die vorliegende Erfindung ebenfalls auf die Verwendung einer Verbindung begrenzt ist, bei der es sich um ein nicht sulfatiertes N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-iduronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon handelt, und zwar in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung der in Anspruch 2 spezifizierten Krankheiten. Weitere Gegenstände, die in der Beschreibung und den Zeichnungen enthalten sind und von den Ansprüchen 1 oder 2 der vorliegenden Erfindung nicht abgedeckt werden, sind nicht als Ausführungsformen der Erfindung dargestellt, sondern repräsentieren den Stand der Technik oder Beispiele, die für das Verständnis der Erfindung von Nutzen sind.
In der vorliegenden Erfindung sind Substanzen offenbart, die in der Lage sind, die Zytokinaktivität in einem Säugetier zu regulieren und die aus einem carboxylierten und/oder sulfatierten Oligosaccharid in einer im Wesentlichen gereinigten Form bestehen. Im Besonderen weist die Substanz einen konsistenten: (a) inhibitorischen „R"-Wert von ungefähr 200 000 % × (μg/g)^–1 oder mehr auf, wie durch einen in vivo Bioassay, der die relative Hemmung von experimentellen DTH-Reaktionen in Mäusen misst, die mit variierenden Dosen im Bereich von 0 bis ungefähr 2 μgg/g pro Maus dieser Substanz behandelt wurden, bestimmt; oder (b) steigernden „R"-Wert von ungefähr 0,03 % × (pg/ml)^–1 oder mehr auf, wie durch einen in vitro Bioassay bestimmt, der die relative Aktivität von TNF-α, sekretiert durch aktivierte, humane CD4⁺ T-Zellen in Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen dieser Substanz im Bereich von 0 bis ungefähr 1 × 10⁷ pg/ml misst. Bevorzugte Substanzen weisen in vivo inhibitorische „R"-Werte ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 300 000, 400 000, 500 000 und 600 000 % × (μg/g)^–1 oder mehr, auf.
Des Weiteren können die Substanzen der vorliegenden Erfindung, die einen inhibitorischen Effekt auf die Sekretion von aktivem TNF-α aufweisen, zusätzlich konstante inhibitorische „R"-Werte von mindestens 0,4 % × (pg/ml)^–1 haben, wie anhand eines in vitro Bioassays bestimmt wird, der die relative Aktivität von TNF-α, sekretiert durch aktivierte, humane CD4⁺ T-Zellen in Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen dieser Substanz von 0 bis ungefähr 1 × 10⁷ pg/ml misst.
Im Allgemeinen umfassen die die TNF-α-Aktivität hemmende Substanzen der vorliegenden Erfindung wie durch biologische Assays bestimmt (wie unten detaillierter beschrieben) Moleküle von verschiedenen Zuckereinheiten, deren grundlegende Aktivitätseinheit mit einem Disaccharid assoziiert wird.
Nach der Reinigung sind diese Substanzen oder die sie enthaltenden Zusammensetzungen im Wesentlichen frei von anderen Substanzen, die die entgegengesetzte oder antagonistische Wirkung ausüben. Somit wäre eine Substanz, die inhibitorische Aktivität („Herunter"-Regulation) aufweist, in einer im Wesentlichen gereinigten Form im Wesentlichen nicht nur frei von anderen Substanzen im Allgemeinen, sondern auch von anderen Substanzen, die zu Steigerung führen oder die inhibitorische Aktivität der „Herunter"-Regulation verzögern können. Die Situation wäre natürlich umgekehrt im Falle einer steigernden Substanz (d.h. im Falle eines „Hoch"-Regulators), wobei die Substanz im Wesentlichen frei von anderen Substanzen, vor allem jenen, die „herunter"-regulieren oder einer Steigerung entgegenwirken, wäre.
Der Ausdruck „regulatorische Wirkung" schließt sowohl die Hochregulation als auch die Herunterregulation von jedem beliebigen, die Verfügbarkeit beeinflussenden oder zu in vivo oder in vitro Aktivität von Zytokinen führenden Prozess ein, im Allgemeinen einschließlich IL-1, IL-6, IL-8 und im Besonderen einschließlich TNF-α. Somit können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine regulatorische Wirkung auf die Produktion von TNF-α im Wirt, auf die Wirtssekretion von TNF-α, auf die extrazelluläre Verfügbarkeit von TNF-α oder auf die aktiven Formen von TNF-α in einem Wirt ausüben. Zum Beispiel, aber nicht ausschließlich, kann die vorliegende Erfindung dergestalt wirken, dass die Sekretion einer Substanz, wie eines Proteins ausgelöst wird, das an TNF-α binden, dessen Konformation ändern und somit dessen biologische Aktivität beeinflussen kann. Ebenso ist es möglich, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch Eindringen in aktivierte T- Zellen oder Makrophagen an bestimmte Oligonukleotidsequenzen binden und somit die transkriptionalen oder translationalen Prozesse, die letztendlich die Proteinsynthese verändern, beeinflussen. Die Zusammensetzungen können auch durch Bindung an Rezeptoren auf der Zelloberfläche wirksam werden.
Um die folgende Diskussion zu vereinfachen, wird unter anderem auf die „Sekretion von aktivem TNF-α" oder die Regulation der „Aktivität von TNF-α" Bezug genommen, unter der Voraussetzung, dass diesen Ausdrücken eine deutlich breitere Bedeutung zugemessen werden soll, nämlich eine, die den tatsächlichen Mechanismus oder die tatsächliche Art und Weise einschließt, mit dem/der die beobachtete Steigerung oder Hemmung der TNF-α-Aktivität durch die Substanzen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stattfindet.
Die Substanzen der vorliegenden Erfindung umfassen eine carboxylierte und/oder sulfatierte Oligosaccharid-Gruppe, die aus natürlichen Quellen, einschließlich lebender Organismen, stammen kann. Zum Beispiel wurden Wirkstoffe aus niedermolekularen Heparinfraktionen (LMWH) ebenso wie aus extrazellulären Matrizen isoliert und gereinigt, die durch die Wirkung eines Enzyms, z.B. Heparanase aus Tieren (Säugetieren) oder Mikroorganismen (Bakterien), abgebaut wurden. Eine weitere Quelle für Wirkstoffe ist mit Enzym behandeltes Heparin (z.B. durch Endoglycosylase abgebautes Heparin).
Deshalb bedeutet der Ausdruck „im Wesentlichen gereinigte Form", dass spezifische Schritte unternommen wurden, um nicht-aktive Bestandteile oder Bestandteile mit gegenteiligem Effekt von den Oligosaccharidsubstanzen zu entfernen und die aktive Gruppe oder Gruppen aus Mischungen oder Überständen, wie den durch enzymatischen Abbau erhaltenen, zu isolieren. Im Speziellen werden die in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Substanzen durch einen streng festgelegten chromatographischen Prozess erhalten, in dem Gelpermeations-Chromatographie bei niedrigem Druck (d.h. Chromatographie auf Sephadex-Säulen) nur einen ersten Schritt im Reinigungsschema darstellt. Nach der Trennung bei niedrigem Druck, werden HPLC (high pressure liquid chromatography)-Techniken angewandt, um die einzelnen Oligosaccharidbestandteile zu isolieren. Vorzugsweise haben diese Schritte bei der Reinigung des individuellen Wirkstoffs im Wesentlichen zu Homogenität geführt.
Solch ein bevorzugter Reinigungsschritt kann zum Beispiel das Bearbeiten von Mischungen, die den Wirkstoff enthalten (z.B. durch Niederdruck-Gelchromatographie erhaltene Fraktionen) durch Gelpermeations-HPLC oder starke Anionaustauscher-(SAX)-HPLC-Säulen einschließen. Somit wurden Substanzen, die Oligosaccharide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Di-, Tri-, Tetra-, Penta- oder Hexasacchariden umfassen, vorzugsweise Disaccharide, beobachtet und isoliert. Die Oligosaccharide der vorliegenden Erfindung werden carboxyliert und/oder sulfatiert und sind deshalb negativ geladen. Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung schließen vorzugsweise Disaccharide, die drei negativ geladene Gruppen aufweisen, ein.
Die vorliegende Beschreibung sieht auch einen Bioassay zur Quantifizierung der Wirkung einer Testsequenz auf die Sekretion von aktivem TNF-α vor. Der Bioassay umfasst die folgenden Schritte: Vorinkubieren von humanen CD4⁺ T-Zellen in einem Medium mit variierenden Konzentrationen einer Testsubstanz; Hinzufügen einer konstanten Menge eines Aktivators, der dergestalt wirkt, dass die TNF-α-Sekretion durch die T-Zellen in Abwesenheit besagter Testsubstanz ausgelöst wird, wobei das Medium nach einer ausreichenden Zeitspanne gesammelt wird; und schließlich Testen der Aktivität des TNF-α im Medium. Vorzugsweise werden die humanen CD4⁺ T-Zellen aus mononuklearen Leukozyten aus dem peripheren Blut (PBL) erhalten. Geeignete Aktivatoren der Immuneffektorzellen schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt: für T-Zellen spezifische Antigene, Mitogene, Makrophagenaktivatoren, restliche extrazelluläre Matrix (RECM, weiter unten unter Abschnitt 4 definiert), Laminin, Fibronektin, und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der spezifischen, regulatorischen Aktivität von bestimmten Substanzen, wie durch in vitro und in vivo Bioassays, die weiter unten detaillierter beschrieben werden, bestimmt. Kurz gesagt weisen die in der vorliegenden Erfindungen nützlichen Substanzen eine regulatorische (entweder hemmende oder steigernde) Aktivität in Bezug auf die Induktion der Sekretion von aktivem TNF-α auf, wobei diese Aktivität dosisabhängig ist. Das heißt, eine Aufzeichnung des Prozentsatzes der Hemmung oder Steigerung im Bezug auf die Dosis (z.B. pg/ml der Substanz) erzeugt eine glockenförmige Kurve, in der ein maximaler Prozentsatz der Hemmung (Inh_max) oder der Steigerung (Aug_max) problemlos zu erkennen ist. Somit kann für jeden Punkt einer solchen Aufzeichnung ein „Verhältnis" zwischen dem Prozentsatz der Hemmung oder der Steigerung und der Konzentration oder Dosis berechnet werden. Im vorliegenden Fall kann eine „spezifische regulatorische Aktivität" oder „R"-Wert aus dem Verhältnis zwischen dem maximalen Prozentsatz der Hemmung oder der Steigerung (d.h. Inh_max oder Aug_max) und der Konzentration oder Dosis der Testsubstanz, die einen solchen maximalen Prozentsatz des regulierenden Werts erzeugt hat, erhalten werden. Des Weiteren kann ein „R"-Wert für jeden Bioassay erhalten werden. Somit kann ein „R"-Wert aus einem in vitro Mausmilz-Zellassay, einem ex vivo Mausmilz-Assay, einem in vitro humanen-PBL-Assay und einem in vivo Assay basierend auf der experimentellen DTH-Reaktion abgeleitet werden. Wird keine Wirkung beobachtet, so ist der „R"-Wert gleich Null.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung in einem Verfahren zur Regulation der Zytokinaktivität in einem Säugetier, einschließlich der Verabreichung einer Menge einer Substanz, die wirksam ist, um die Aktivität eines Zytokins in diesem Säugetier zu hemmen oder zu steigern, wobei diese Substanz ein carboxyliertes und/oder sulfatiertes Oligosaccharid in einer im Wesentlichen gereinigten Form umfasst und diese Substanz einen konsistenten: (a) inhibitorischen „R"-Wert, der nicht gleich 0 ist, aufweist, wie bestimmt durch (i) einen in vitro Bioassay, der die relative Aktivität von TNF-α, das durch aktivierte, humane CD4⁺ T-Zellen sekretiert wird, in Anwesenheit von variierenden Konzentrationen dieser Substanz von 0 bis ungefähr 1 × 10⁷ pg/ml misst, und/oder durch (ii) einen in vivo Bioassay, der die relative Hemmung der experimentellen DTH-Reaktion in Mäusen misst, die mit variierenden Dosen dieser Substanz von 0 bis ungefähr 2 μg/g Maus behandelt wurden; oder (b) steigernden „R"-Wert, der ungleich 0 ist, aufweisen, wie bestimmt durch einen in vitro Bioassay, der die relative Aktivität von TNF-α, das durch aktivierte, humane CD4⁺ T-Zellen sekretiert wird, in Anwesenheit von variierenden Konzentrationen dieser Substanz von 0 bis ungefähr 1 × 10⁷ pg/ml misst.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verwendung des Wirkstoffes für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparats, das für die Behandlung des Wirts geeignet ist, wobei das Verfahren eine Kombination der Substanz mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, um so eine Dosiseinheit bereitzustellen, vorzugsweise mit niedriger Dosis, die eine wirksame Menge der Substanz aufweist. Das pharmazeutische Präparat kann auch einen stabilisierenden Wirkstoff, wie zum Beispiel Protamin, umfassen, und zwar in einer Menge, die ausreichend ist, um einen beträchtlichen, wenn nicht substantiellen Anteil der Anfangsaktivität der Substanz über einen ausgedehnten Zeitraum aufrecht zu erhalten, z.B. ungefähr 100 Prozent über ungefähr 3 Tage. Bei Lagerungstemperaturen unterhalb der Raumtemperatur, z.B. ungefähr –10° bis ungefähr 10°C, vorzugsweise 4°C, wird ein größerer Anteil der Anfangsaktivität für einen Zeitraum von bis zu 4 Monaten beibehalten.
Da die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für die Verabreichung an den Menschen gedacht sind, sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen vorzugsweise steril. Die Sterilisation kann auf jede beliebige, dem Durchschnittsfachmann bekannte Art und Weise durchgeführt werden, was die Verwendung von sterilen Inhaltsstoffen, Hitzesterilisation oder Filtern der Zusammensetzung mit Hilfe eines sterilen Filters einschließt.
Es sollte auch offensichtlich sein, dass ein Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung darin besteht, die Behandlung eines Wirts, wie zum Beispiel eines Säugetiers, der an einer Krankheit leidet, deren Schweregrad durch die Zytokinaktivität in dem Wirt beeinflussbar ist, einzuschließen, wobei diese Behandlung die Verabreichung eines Wirkstoffs an einen solchen Wirt umfasst, wobei der wiederum die Oligosaccharide der vorliegenden Erfindung in im Wesentlichen gereinigter Form oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die aus dieser hergestellt werden können, umfasst. Abhängig von der Erkrankung des jeweiligen Wirts können Substanzen oder Zusammensetzungen verabreicht werden, welche die Verfügbarkeit oder Aktivität von TNF-α entweder reduzieren oder die TNF-α-Induktion erhöhen oder dessen Aktivität verstärken. Solche Zusammensetzungen oder pharmazeutische Präparate können in niedriger Dosis und in Intervallen von bis zu ungefähr 5-8 Tagen, vorzugsweise einmal wöchentlich, verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die Oligosaccharidsubstanzen (z.B. Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharide, vorzugsweise umfassend ein Disaccharid) zur parenteralen, oralen oder topischen Verabreichung enthalten, können je nach Zweckmäßigkeit und Wirksamkeit und in Dosierungen, die problemlos durch Routineuntersuchungen durch einen Durchschnittsfachmann bestimmt werden können, verabreicht werden.
Wirkstoffe und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, die die Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ (DTH-Reaktionen) eines angewandten Antigens zu hemmen, wie durch eine Reduktion der Induration, beobachtet nach der Anwendung des Antigens auf der Haut bis zu fünf bis sieben Tage nach der Verabreichung der Substanz oder der pharmazeutischen Zusammensetzung desselben in Bezug auf die Induration, die nach der Anwendung des Antigens auf der Haut in Abwesenheit oder nach Erholung von der Verabreichung der Substanz oder der pharmazeutischen Zusammensetzung derselben, belegt wird. Beispiele für das angewandte Antigen schließen Tetanus, Myelin-Basisprotein, gereinigtes Proteinderivat, Oxazolon und dergleichen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Des Weiteren ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen oder pharmazeutische Präparate vorzusehen, die in beliebiger Weise je nach der jeweiligen Anwendung verabreicht werden können, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt: enterale Verabreichung (einschließlich oraler oder rektaler Verabreichung) oder parenterale Verabreichung (einschließlich topischer Verabreichung oder Inhalation mit Hilfe von Aerosolen). In bevorzugten Ausführungsformen werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung oral, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal oder intravenös verabreicht.
Deshalb ist die vorliegende Erfindung zum Beispiel von Nutzen, wenn es darum geht, die Abstoßung von Allotransplantaten zu verzögern oder zu verhindern und eine Vielzahl von pathologischen Prozessen zu behandeln und diesen vorzubeugen, wie jene Prozesse, die mit Autoimmunerkrankungen, Allergien, entzündlichen Erkrankungen (insbesondere entzündlichen Darmerkrankungen) oder dem erworbenen Immundefektsyndrom (AIDS) in Beziehung stehen. Die vorliegende Erfindung findet auch Anwendung in der Behandlung von Typ-1-Diabetes, periodontalen Erkrankungen, Hautkrankheiten, Lebererkrankungen, Uveitis, rheumatischen Erkrankungen (insbesondere rheumatoide Arthritis), Atherosklerose, Vaskulitis oder Multipler Sklerose.
Außerdem ist die vorliegende Erfindung in der Behandlung von Tumoren, viralen Infektionen und bakteriellen Infektionen durch Verabreichung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Steigerung der Sekretion von aktivem TNF-α von Nutzen. Beispiele für die Tumorbehandlung schließen die Behandlung von Brust-, Darm- und Prostatakrebs ebenso wie die Behandlung von Lymphomen und anderen Basalzellkarzinomen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Behandlungen von bakteriellen Infektionen schließen die Behandlung von Diphtherie, Streptokokken, Pneumonie, Gonorrhö, Lepra und Tuberkulose ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele für virale Infektionen, die durch die Erfindung behandelt werden können, schließen die Behandlung von Grippe, Hepatitis, Gastroenteritis, Mononukleose, Bronchiolitis und Meningitis ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
In bestimmten pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind niedrige, wirksame Dosen des zuvor beschriebenen LMWH-Wirkstoffs vorhanden. Typischerweise enthält die pharmazeutische Zusammensetzung eine einzelne, niedrige Dosiseinheit von weniger als 5 mg LMWH-Wirkstoff, vorzugsweise von ungefähr 0,3 bis ungefähr 3 mg, und am bevorzugtesten enthält sie eine niedrige Dosiseinheit von 1 bis 1,5 mg.
Die vorliegende Erfindung behandelt auch allgemein ein Verfahren zur Verwendung eines niedermolekularen Heparins (LMWH), das in der Lage ist, die in vitro Sekretion von aktivem TNF-α durch ruhende T-Zellen und/oder Makrophagen als Antwort auf Aktivatoren von Immuneffektorzellen zu hemmen, wobei dieses Verfahren für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparats dient, das in Intervallen von bis zu ungefähr 5-8 Tagen verabreicht wird zur Vorbeugung und/oder Behandlung von pathologischen Prozessen, die die Induktion der TNF-α-Sekretion beinhalten, wobei dieses Verfahren die Kombination einer niedrigen, wirksamen Dosis des LMWH mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts oder Wirts, das/der an einem die Induktion von aktiver TNF-α-Sekretion einschließenden pathologischen Prozess leidet, vorzusehen, wobei dieses Verfahren umfasst, dass diesem Subjekt oder diesem Wirt eine pharmazeutische Zusammensetzung wie oben beschrieben in Intervallen von bis zu ungefähr 5-8 Tagen, vorzugsweise einmal wöchentlich, verabreicht wird. Wie weiter oben beschrieben, können pharmazeutische Zusammensetzungen, die aktive Oligosaccharide umfassen, auch täglich oder in bis zu wöchentlichen Intervallen verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls folgendes vor: die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Hemmung der Produktion von aktivem TNF-α umfassend ein Disaccharid der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben
worin X₁ für Wasserstoff oder Sulfat steht; X₂ für Wasserstoff oder Sulfat steht; und X₃ für Sulfat oder Acetyl steht, unter der Voraussetzung dass, wenn es sich bei X₃ um Sulfat handelt, wenigstens eines aus X₁ oder X₂ Sulfat ist und wenn es sich bei X₃ um Acetyl handelt, sowohl X₁ als auch X₂ Sulfate sind; und umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Insbesondere kann die pharmazeutische Zusammensetzung ein Disaccharid umfassen, bei dem es sich um 2-O-Sulfat-4-desoxy-4-en-iduronsäure-(α-1,4)-2-desoxy-2-N-sulfatglucosamin, 4-Desoxy-4-en-iduronsäure-(α-1,4)-2-desoxy-2-N-sulfat-6-O-sulfatglucosamin, 2-O-Sulfat-4-desoxy-4-en-iduronsäure-(α-1,4)-2-desoxy-2-N-sulfat-6-O-sulfatglucosamin oder 2-O-Sulfat-4-desoxy-4-en-iduronsäure-(α-1,4)-2-desoxy-2-N-acetyl-6-O-sulfatglucosamin handelt
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Steigerung der Produktion von aktivem TNF-α umfassend 4-Desoxy-4-en-iduronsäure-(α-1,4)-2-desoxy-2-N-acetylglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Solche pharmazeutische Zusammensetzungen können natürlich für eine Vielzahl an Applikationsformen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, parenterale Verabreichung, orale Verabreichung oder topische Verabreichung angepasst werden.
Des Weiteren ist eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Hemmung der Produktion von aktivem TNF-α vorgesehen, die eine Verbindung umfasst, bei der es sich um ein N-sulfatiertes oder N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-glucuronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben handelt. Ist solch eine Verbindung N-sulfatiert, so weist sie mindestens eine weitere Sulfatgruppe auf und ist sie N-acetyliert, so weist sie mindestens zwei Sulfatgruppen auf. Es ist zu beachten, dass auf Grund der Nichtsättigung (d.h. die Doppelbindung bei C-4 an C-5 am Teil der „Uron"-Säure von bestimmten der Disaccharide von Interesse keine Stereochemie assoziiert mit der C-6 Carboxylgruppe, die sich im Wesentlichen auf der Ebene des 6-gliedrigen Rings befindet, besteht. Deshalb entspricht im Fall der vorhandenen Doppelbindung zwischen C-4 und C-5 eine Iduronsäure einer Glucuronsäure. Folglich soll der Begriff „Uron"-Säure entweder eine Glucuronsäure oder eine Iduronsäure umfassen. Ebenso kann eine „Uron"-Gruppe entweder eine Iduron- oder Glucuron-Gruppe bedeuten.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Steigerung der Produktion von aktivem TNF-α, wobei die Zusammensetzung ein nicht sulfatiertes, N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-glucuronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Ebenso wird von der vorliegenden Erfindung die Hemmung der Produktion eines aktiven Zytokins in einem Subjekt behandelt, was die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Disaccharids der Formel (I) oder seines pharmazeutisch annehmbaren Salzes an ein Subjekt, zum Beispiel ein Säugetier, wie einen menschlichen Patienten, umfasst.
worin X₁ für Wasserstoff oder Sulfat steht; X₂ für Wasserstoff oder Sulfat steht; und X₃ für Sulfat oder Acetyl steht, unter der Voraussetzung dass, wenn es sich bei X₃ um Sulfat handelt, es sich bei wenigstens einem aus X₁ oder X₂ um Sulfat handelt und wenn es sich bei X₃ um Acetyl handelt, sowohl X als auch X₂ Sulfate sind. Ein weiteres Verfahren bezieht sich auf die Steigerung der Produktion eines aktiven Zytokins in einem Subjekt, was die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Disaccharids, bei dem es sich um 4-Desoxy-4-en-iduronsäure-(α-1,4)-2-desoxy-2-N-acetylglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben handelt, an ein Subjekt umfasst. In Übereinstimmung mit den Aufgaben der vorliegenden Erfindung schließen solche Verfahren die tägliche oder vorzugsweise wöchentliche Verabreichung der jeweiligen Verbindungen oder deren pharmazeutisch annehmbaren Salzen ein.
Die oben erwähnten Verbindungen können auch verwendet werden, um die Produktion eines aktiven Zytokins in einem Subjekt zu hemmen oder zu steigern, wobei dies die Verabreichung einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung behandelt auch ein Verfahren zur Verwendung einer Verbindung, bei der es sich um ein N-sulfatiertes oder N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-glucuronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben handelt, wobei die Verbindung, wenn sie N-sulfatiert ist, mindestens eine weitere Sulfatgruppe aufweist und wenn sie N-acetyliert ist, mindestens zwei Sulfatgruppen aufweist; für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Vorbeugung oder Behandlung einer Erkrankung, die durch unangemessene Produktion von TNF-α verursacht wird oder damit in Verbindung steht.
Des Weiteren ist ein Verfahren für die Verwendung einer Verbindung beinhaltet, bei der es sich um ein nicht-sulfatiertes, N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-glucuronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben handelt, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung eines medizinischen Zustands, der auf die erhöhte Produktion von TNF-α anspricht.
Andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen die Verwendung von Verbindungen zum Schutz eines Subjekts vor den schädlichen Auswirkungen eines Kontakts mit Strahlung, wobei dies die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung umfasst, bei der es sich um ein N-sulfatiertes oder N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-glucuronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben handelt, wobei die Verbindung, wenn sie N-sulfatiert ist, mindestens eine weitere Sulfatgruppe aufweist und, wenn sie N-acetyliert ist, mindestens zwei Sulfatgruppen aufweist. Charakteristischerweise werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung dem Subjekt vor dem Kontakt mit Strahlung verabreicht. Am vorteilhaftesten können die radioprotektiven Eigenschaften der offenbarten Verbindungen während einer Strahlungstherapie ausgenutzt werden.
Des Weiteren ist die Verwendung von Verbindungen zur Unterdrückung einer Abstoßungsreaktion bei Allotransplantaten in einem Subjekt einbezogen, wobei dies die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung, bei der es sich um ein N-sulfatiertes oder N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-glucuronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben handelt, umfasst, wobei die Verbindung, wenn sie N-sulfatiert ist, mindestens eine weitere Sulfatgruppe aufweist und, wenn sie N-acetyliert ist, mindestens zwei Sulfatgruppen aufweist. Das Allotransplantat kann natürlich ein Organtransplantat einschließlich Herz-, Leber-, Niere- oder Knochenmarktransplantate einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt. Die offenbarten Verfahren können auch auf Hauttransplantate angewandt werden.
Noch ein weiterer Gegenstand bezieht sich auf eine Unterdrückung der Expression eines Adhäsionsmoleküls in einem Subjekt, wobei dies die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung umfasst, bei der es sich um ein N-sulfatiertes oder N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-glucuronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben handelt, wobei die Verbindung, wenn sie N-sulfatiert ist, mindestens eine weitere Sulfatgruppe aufweist und, wenn sie N-acetyliert ist, mindestens zwei Sulfatgruppen aufweist. Beispiele für solche Adhäsionsmoleküle schließen ICAM-1 oder ELAM-1 ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ebenso offenbart ist ein in vitro Bioassay zur Quantifizierung der Wirkung einer Testsubstanz auf die Sekretion von aktivem TNF-α, der die folgenden Schritte umfasst Vorinkubieren von humanen CD4⁺ T-Zellen in einem Medium mit variierenden Konzentrationen einer Testsubstanz; Hinzufügen einer konstanten Menge eines Aktivators, der dergestalt wirkt, dass die TNF-α-Sekretion durch die T-Zellen in Abwesenheit der Testsubstanz ausgelöst wird, wobei das Medium nach einer ausreichenden Zeitspanne gesammelt wird; und schließlich Testen der Aktivität des TNF-α im Medium.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann nach weiterer Betrachtung der folgenden Offenbarung, einschließlich der detaillierten Beschreibungen spezifischer Ausführungsformen der Erfindung, klar ersichtlich sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Adjuvans-Arthritis (AA)-Werte, die von jenen Gruppen von Ratten erhalten wurden, die mit wöchentlichen Gaben von Fragmin in variierenden Dosen behandelt wurden, mit Bezug auf eine Kontrollgruppe, die nur phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) erhielt.
2 zeigt die AA-Werte von Gruppen an Ratten, die eine konstante 20 Mikrogramm-Dosis von Fragmin unter verschiedenen Dosierungsschemata, einschließlich einmaliger Behandlung, täglicher Behandlung, 5-tägiger Intervalle und wöchentlicher Gabe, erhielten.
3 vergleicht die Wirksamkeit von wöchentlicher Gabe von Fragmin mit Heparin und einer Kontrollsubstanz (PBS).
4 zeigt die Ergebnisse von täglicher Gabe von Fragmin, Heparin oder PBS.
5 zeigt die AA-Werte, die von Gruppen an Mäusen erhalten wurden, die entweder wöchentlich oder täglich mit verschiedenen niedermolekularen Heparinen, einschließlich Fraxiparin, Fraxiparine und Lovenox, behandelt wurden.
6 illustriert die prozentuale Überlebensrate von Ratten, an denen allogene Herztransplantationen durchgeführt wurden und die wöchentlich ebenfalls entweder Fragmin oder PBS erhalten hatten.
7 zeigt eine Balkengraphik, welche die Blutglucosewerte von zwei Gruppen NOD-Mäusen darstellt, wobei die eine Gruppe Fragmin und die andere lediglich PBS erhielt.
8 zeigt die Ergebnisse eines DTH-Versuchs an einem freiwilligen, menschlichen Probanden.
9 zeigt die „glockenförmige" Kurve von Fragmin, die das Verhältnis zwischen Dosis und Antwort beschreibt.
10 stellt den Verlust an inhibitorischer Aktivität an Hand von inaktiviertem Fragmin dar.
11 zeigt die Absorption bei 206 Nanometern von verschiedenen, aus der Gelfiltration von inaktiviertem Fragmin erhaltenen Fraktionen, einschließlich der Fraktionen F2, F8, F10 und F15.
12, 12A und 12B zeigen jeweils die Wirkung bei variierenden Dosen von aktivem Fragmin, Fraktion F15 und Fraktion F10 auf die Sensitivität von Mäusen gegenüber der DTH-Reaktion.
14 zeigt die Absorption bei 206 Nanometern im Vergleich zu der Anzahl an Fraktionen für einige Fraktionen, die aus der Sepharose 4B-Säulentrennung von Fragmin und durch Heparanase abgebauter ECM stammen.
13 und 15 vergleichen die Elutionsprofile von Fraktionen, die durch die Sepharose 4B-Säulentrennung von Fragmin und durch Heparanase abgebauter ECM erhalten wurden.
16 zeigt, dass ein Oligosaccharidprodukt (Fraktion 5 aus 13) im Hinblick auf seine Fähigkeit, die Sekretion von aktivem TNF-α zu hemmen, eine ähnlich glockenförmige Dosis-/Antwort-Kurve aufwies.
17 zeigt, dass die Bereiche mit dem größten Anti-TNF-α-Effekt in der Subfraktion zwischen ungefähr 5,65 und ungefähr 5,8 liegen.
18A und 18B zeigen jeweils das aus der HPLC-Trennung erhaltene Chromatogramm von Fragmin und von durch Heparanase abgebauter ECM.
19 zeigt die Absorption bei 206 Nanometern von zwei Fraktionen, F5 und F8, die aus der Sepharose 4B-Säulentrennung von durch Heparanase abgebauter ECM stammen.
20A und 20B zeigen demgegenüber jeweils die Absorption bei 206 und 232 Nanometern eines Peaks, der durch die HPLC-Trennung von Fraktion F5 erreicht wurde.
21A und 21B zeigen die UV-Absorption von zusätzlichen HPLC-Fraktionen, die von Fraktion F5 erhalten wurden.
22 zeigt die UV-Absorption der Fraktionen F7 und F8, die aus der Sepharose 4B-Säulentrennung von durch Heparanase abgebauter ECM stammen.
23 zeigt den im Wesentlichen reinen Peak, erhalten durch die SAX-HPLC-Chromatographie der kombinierten Fraktionen F7 und F8.
24 zeigt einen weiteren, als „A23/4" bezeichneten Peak, der mit entsalzten Präparaten der mit „1" bezeichneten Peaks aus 23 erhalten wurde.
25A, 25B und 25C zeigen die Chromatogramme, die aus der SAX-HPLC-Säulentrennung von Disaccharid-Standards von SIGMA stammen und jeweils als H-0895, H-1020 und H-9267 bezeichnet sind.
26 zeigt die Sepharose 4B-Säulentrennung einer Mischung, die aus der Behandlung von Heparin mit Heparanase (MM 5) erhalten wurde, was wiederum die Fraktionen F7 und F8 ergab.
27 zeigt die Absorption von verschiedenen, durch die Sepharose 4B-Chromatographie von PC3 Heparanase allein und von aus Heparin + PC3 erhaltenen Fraktionen bei 206 Nanometern.
28A und 28B zeigen zusätzliche Fraktionen, die aus der HPLC-Trennung von Fraktion F7 aus 26 stammen.
29 zeigt die Fraktion F90, die aus der HPLC-Trennung von Fragmin stammt.
30 zeigt demgegenüber das Chromatogramm, das aus einer SAX-HPLC-Trennung einer gealterten Probe von A23/4 erhalten wurde.
31 zeigt das NMR-Protonenspektrum einer 20 Mikrogramm Probe eines von ECM stammenden Disaccharids, das durch HPLC-Chromatographie, wie in 23 gezeigt, erhalten wurde.
32 zeigt ein zwei-dimensionales COSY-Spektrum der Probe aus 31.
33 zeigt einen erweiterten Teil des NMR-Spektrums aus 31, welches das Signal für das anomere Proton darstellt.
34 und 35 zeigen die FTIR-Spektra, die aus zwei getrennten Proben stammen, wobei eine die Anwesenheit einer sulfatierten Verbindung (34) und die andere die Anwesenheit eines teilweise desulfatierten Analoges (35) anzeigt.
36A zeigt das Massenspektrum eines methylierten Derivats der aus 23 erhaltenen Probe in einer Lösungsmittelmatrix bestehend aus DTT : Thioglycerol (1:1).
36B zeigt das Massenspektrum der Lösungsmittelmatrix alleine.
37A und 37B zeigen das Massenspektrum derselben Probe in einer anderen Lösungsmittelmatrix bestehend aus Methylnitrobenzylalkohol, wobei 37A das Massenspektrum der Probe plus der Lösungsmittelmatrix darstellt und 37B das Massenspektrum der Lösungsmittelmatrix alleine darstellt.
38 zeigt die Ergebnisse aus Versuchen, welche die Wirksamkeit von Disaccharid 9392 und 1020 vergleichen, um die AA-Werte von weiblichen Lewis-Ratten, die an experimentell induzierter Adjuvans-Arthritis leiden, zu verbessern
38A zeigt die Wirkung von Disaccharid 0895 auf die AA-Werte von Ratten, die an experimentell induzierter AA leiden, mit Bezug auf die Kontrolle (PBS).
38B zeigt die Wirkung der Glucosaminbehandlung bei der Verbesserung der AA-Werte von Lewis-Ratten unter verschiedenen Dosierungen von Glucosamin.
38C zeigt auf gleiche Weise die Wirkung von Galactosamin bei verschiedenen Dosierungen auf die AA-Werte von Lewis-Ratten.
38D und 38E zeigen die Ergebnisse weiterer Versuche mit dem Disaccharid 9392, in denen das Disaccharid entweder wöchentlich oder täglich, beginnend bei Tag 0 (d.h. Beginn der Induktion von AA) oder bei Tag 12 (d.h. die Ratte leidet bereits an AA) verabreicht wurde.
38F und 38G zeigen die Ergebnisse einer separaten, komparativen Versuchsreihe, die an Gruppen von Lewis-Ratten durchgeführt wurde, um die Wirksamkeit von wöchentlich verabreichtem Disaccharid 9392 im Vergleich zu der Wirksamkeit eines bekannten entzündungshemmenden Wirkstoffs, nämlich Dexamethason Phosphat, auf die Unterdrückung von experimentell induzierter Adjuvans-Arthritis zu bestimmen.
39 zeigt die Wirksamkeit von subkutan injiziertem Disaccharid 1020 gegenüber von Liposaccharid (LPS) induzierter Entzündung der Hornhaut der Ratten.
39A präsentiert die Ergebnisse von Versuchen, die sich auf die radioprotektive Wirkung von Glucosamin in verschiedenen Dosierungen in Bezug auf die Kontrolle (PBS) beziehen.
39B präsentiert die Ergebnisse von ähnlichen Bestrahlungsversuchen, welche die Verabreichung von Disaccharid 9392 in verschiedenen Dosierungen mit Bezug auf die Kontrolle (PBS) einschließen.
40 und 40A zeigen die Ergebnisse von Versuchen, welche die Fähigkeit von ausgewählten Substanzen der vorliegenden Erfindung zur Unterdrückung der Abstoßung von Allotransplantaten zeigen. Die in 40 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine Dosis in Höhe von 3 Nanogramm von Disaccharid 9392 durch subkutane Injektion einen Tag vor der Transplantation und danach wöchentlich die Abstoßung von Hauttransplantaten nach 5 Tagen um 50 % reduzierte. Eine Dosis von 300 Nanogramm desselben Disaccharids führte jedoch zu keinem signifikanten Unterschied bei 50 % Abstoßung im Vergleich zu der Kontrolle (PBS).
41 zeigt die Inzidenz von IDDM in Gruppen von weiblichen NOD-Mäusen, die separat entweder mit Disaccharid 9392, Glucosamin oder Salzlösung behandelt wurden.
41A zeigt die Mortalitätsrate von weiblichen NOD-Mäusen, die ebenfalls separat mit Disaccharid 9392, Glucosamin oder Salzlösung behandelt wurden. Es sei zu beachten, dass in den beiden 41 und 41A die weiblichen NOD-Mäuse ungefähr 3,5 Monate alt waren, was bedeutet, dass die Mäuse als Gruppe bereits eine 20% Inzidenz von IDDM erlitten hatten.
42 stellt den Wert von Atemnotsyndrom (Respiratory Distress, RD) von sechs immunisierten Ratten dar, die mit aerosolisiertem Antigen belastet wurden, und zwar mit Behandlung (B1, B2 und B3) und ohne Behandlung (A1, A2 und A3) mit Substanz H-9392.
43 zeigt die Struktur von 4-O-(2-Desoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl)-(2-O-sulfo-β-D-glucopyranosid)uronsäure, hergestellt gemäß dem synthetischen Schema aus Beispiel 6.23.
4. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Substanzen beschrieben, die carboxylierte und/oder sulfatierte Oligosaccharide in einer im Wesentlichen gereinigten Form umfassen und kollektiv ein Mittel zur Regulation der biologischen Aktivität von Zytokinen, wie TNF-α in einem Wirt, darstellen. Aus Gründen der Vereinfachung werden die Begriffe „Substanz(en)" oder „Wirkstoff(e)", sofern nicht anders angegeben, verwendet, um carboxylierte und/oder sulfatierte Oligosaccharide, die hier in im Wesentlichen gereinigter Form isoliert wurden, zu bezeichnen.
Ein funktionaler Ausdruck dieser Wirkung kann bei der Hemmung der Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DTH) in Mäusen und Menschen beobachtet werden. Dabei handelt es sich um eine T-Zellen abhängige, entzündliche Reaktion, die auch von Zellen wie Makrophagen und anderen Entzündungszellen ausgelöst werden kann. Die Behandlung mit den Wirkstoffen in Dosen, die die Produktion von aktivem TNF-α beeinflussen können, führte auch zur Hemmung eines Modells von autoimmuner Arthritis, das Adjuvans-Arthritis (AA) genannt wird. Die Behandlung mit dem Wirkstoff verlängerte auch den Überlebenszeitraum von allogenen Herztransplantaten in Ratten und führte zu einem Verschwinden von insulinbedingtem Diabetes Mellitus (Insulin dependant diabetes mellitus (IDDM)) in NOD-Mäusen. Außerdem beugte eine solche Behandlung der Induktion der Produktion von aktivem TNF-α durch T-Zellen und Makrophagen als Antwort auf den Reiz durch beschädigte oder restliche subendotheliale extrazelluläre Matrix vor. Diese restliche extrazelluläre Matrix (RECM), die dafür zuständig ist, den Beginn einer TNF-α-Induktion (und der resultierenden Entzündung) anzuzeigen, muss von der enzymatisch abgebauten extrazellulären Matrix (DECM), unterschieden werden. Komponenten der letzteren wurden hierin isoliert und es wurde gezeigt, dass diese die TNF-α Aktivität entweder beenden oder verstärken.
Da TNF-α an Stellen von vaskulären Verletzungen vermutlich eine Rolle im Artheroskleroseprozess spielt, verbessert die Hemmung der TNF-α-Aktivität an der Stelle mit beschädigter subendothelialer ECM den pathogenen Prozess von Atherosklerose. Ein überaus überraschender Aspekt der Behandlung mit den Oligosaccharid-Wirkstoffen besteht darin, dass eine solche Behandlung am wirksamsten ist, wenn niedrige Dosen in wöchentlichen Intervallen verabreicht werden. Hohe Dosen der Wirkstoffe oder täglich verabreichte Dosen der Wirkstoffe sind im Hinblick auf die Hemmung von TNF-α-Sekretion oder Immunreaktionen nicht wirksam.
Niedermolekulare Heparine, die durch Fraktionierung oder kontrollierte Depolymerisation von Heparinen entstanden sind, zeigen im Vergleich zu Heparin verbesserte antithrombotische Eigenschaften, aber auch unterschiedliche pharmakologische Eigenschaften: die Halbwertszeit ist verdoppelt und die Bioverfügbarkeit mit Bezug auf die antikoagulatorische Wirkung nach subkutaner Injektion ist höher (Bratt, G. et al., Thrombosis and Haemostasis (1985) 53:208; Bone, B. et al., Thrombosis Research (1987) 46:845).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, dass die Wirkstoffe, die in sub-antikoagulatorischen Dosen in Intervallen von mehreren Tagen verabreicht werden, für die Vorbeugung und/oder Behandlung von pathologischen Prozessen, bei denen die Induktion von aktivem TNF-α eine Rolle spielt, wirksam sind. Außerdem wurde nun gefunden, dass einzelne Substanzen, umfassend ein Oligosaccharid von 1-10 Zuckereinheiten, vorzugsweise 2-4 Zuckereinheiten, identifiziert werden können, welche die Aktivität von TNF-α entweder hemmen oder steigern können. Diese einzelnen Substanzen können zum Beispiel aus dem Gewebe eines lebenden Organismus erhalten werden, zum Beispiel von den löslichen Abbauprodukten von Substrat extrazellulärer Matrix.
4.1. Quellen für Wirkstoffe
Die LMWHs, die verwendet werden sollen, stammen von LMWHs mit einem durchschnittlichen molekularen Gewicht von 3000 bis 6000, wie zum Beispiel die im Europäischen Patent EP 0014184 offenbarten LMWHs. Manche LMWHs sind im Handel unter verschiedenen Markennamen erhältlich, so z.B. Fragmin^®, Fraxiparin^®, Fraxiparine^®, Lovenox^®/Clexanee^®.
LMWHs können auf mehrere verschiedene Arten hergestellt werden: Anreicherung durch Fraktionierung durch Ethanol und/oder molekulares Sieben, z.B. Gelfiltration oder Membranfiltration des in Standardheparin vorhandenem LMWH und kontrollierte Depolymerisation, entweder chemische Depolymerisation (durch salpetrige Säure, β-Eliminierung oder Periodat-Oxidation) oder enzymatische Depolymerisation (durch Heparinasen). Die Bedingungen für die Depolymerisation können sorgsam kontrolliert werden, um so Produkte des gewünschten molekularen Gewichts zu erzielen. Üblicherweise wird Depolymerisation durch salpetrige Säure verwendet. Ebenso wird Depolymerisation des Benzylesters von Heparin durch β-Eliminierung verwendet, was zu einer Ausbeute desselben Fragmenttyps führt, wie sie bei enzymatischer Depolymerisation unter Verwendung von Heparinasen erzielt wird. LMWH mit niedriger antikoagulatorischer Aktivität und bleibender chemischer Grundstruktur kann durch Depolymerisation unter Verwendung von Periodat-Oxidation oder durch Entfernen der Antithrombin-bindenden Fraktion von durch andere Verfahren hergestelltem LMWH unter Verwendung von immobilisiertem Antithrombin zur Adsorption hergestellt werden.
Bei Fragmin^® handelt es sich um ein niedermolekulares Heparin mit durchschnittlichem Molekulargewicht im Bereich von 4000-6000 Dalton, das durch kontrollierte Depolymerisation durch salpetrige Säure von Natriumheparin aus der Darmschleimhaut von Schweinen hergestellt wurde. Es wird von Kabi Pharmacia, Schweden, unter dem Namen Fragmin^® für die Verwendung als Antithrombosemittel als Salzlösungen zur Injektion mit Einmalspritzen von 2500 IE/0,2 ml und 5000 IE/0,2 ml hergestellt, was jeweils ungefähr 16 mg und 32 mg entspricht.
Bei Fraxiparin^® und Fraxiparine^® handelt es sich um LMWHs mit durchschnittlichem Molekulargewicht im Bereich von 4500 Dalton, die jeweils durch Fraktionierung oder kontrollierte Depolymerisation mit salpetriger Säure aus Kalziumheparin aus der Darmschleimhaut von Schweinen hergestellt werden. Es wird von Sanofi (Choay Laboratories) für die Verwendung als antithrombotisches Mittel in Einzeldosen umfassend ca. 36 mg hergestellt, was 3075 IE/0,3 ml Wasser entspricht.
Lovenox^® (Enoxaparin/e), ein durch Depolymerisation von Natriumheparin aus der Magenschleimhaut von Schweinen unter Verwendung von β-Eliminierung hergestelltes LMWH-Fragment wird von Pharmuka SF, Frankreich, hergestellt und von Rhône-Poulenc unter den Namen Clexanee^® und Lovenox^® zur Verwendung als antithrombotisches Mittel in Einmalspritzen umfassend 20 mg/ml und 40 mg/0,4 l Wasser vertrieben.
Wie in der vorliegenden Anmeldung, gezeigt, sind die Eigenschaften von LMWHs, die hierin entdeckt und beschrieben wurden, allen LMWHs gemein, unabhängig von ihrem Herstellungsprozess, den strukturellen Unterschieden (erzeugt durch Depolymerisation oder jene Unterschiede, die von Variationen in dem als Rohmaterial verwendeten Heparin abhängig sind) oder der antikoagulatorischen Aktivität, vorausgesetzt, dass das verwendete LMWH in der Lage ist, die in vitro Sekretion von aktivem TNF-α durch ruhende T-Zellen und/oder Makrophagen als Antwort auf die Aktivierung durch den Kontakt mit für T-Zellen spezifischen Antigenen, Mitogenen, Makrophagenaktivatoren, restlicher ECM oder deren Proteinkomponenten, wie Fibronektin, Laminin oder dergleichen, zu hemmen.
Ein weiterer Test, der für die Identifizierung der wirksamen LMWHs von Nutzen ist, besteht in der Hemmung von Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ (DTH) der Haut, eine von T-Lymphozyten abhängige Reaktion, auf einer Vielzahl an Antigenen (zum Beispiel, Tetanus-Antigen, Myelin-Basisprotein (MBP), gereinigte Proteinderivate (PPD) und Oxazolon). Die LMWHs hemmen auch die T-Zell-Adhäsion an ECM und dessen Proteinkomponenten.
4.2. Verlust der Aktivität von LMWH-Präparaten im Lauf der Zeit. Einfluss von hinzugefügtem Stabilisator
Von den Erfindern durchgeführte Zeitverlaufsstudien zeigen, dass LMWH-Proben wie Fragmin ihre Fähigkeit, die Aktivität von TNF-α zu hemmen, bei Raumtemperatur innerhalb von 72 h und bei niedriger Temperatur (z.B. 4°C) innerhalb von einigen Monaten verlieren.
Tabelle XI, Abschnitt 6.1., zeigt, dass ungefähr 53 % der Aktivität von Fragmin^® bei Raumtemperatur nach einem Tag verloren geht. Nach ungefähr zwei Tagen sind ungefähr 87 % der Aktivität verloren und nach ungefähr drei Tagen zeigt sich überhaupt keine Aktivität mehr. Wie weiter unten in Tabelle XII, Abschnitt 6.2., dargestellt, haben Versuche gezeigt, dass Fragmin^® seine Reaktivität gegenüber DTH selbst bei kühleren Temperaturen (4°C) verliert; allerdings dauert es länger, bis sich dieser Vorgang vollzieht. Herkömmliche, unfraktionierte Heparine verlieren dahingegen ihre klassische antikoagulatorische Wirkung bei 4°C nicht.
Bei dem Versuch, einen Wirkstoff zu finden, der in der Lage ist, die inhibitorische Zytokinaktivität der offenbarten LMWH-Präparate zu stabilisieren oder aufrecht zu erhalten, beschäftigten sich die Erfinder mit einem gut bekannten Heparinzusatzstoff. Protaminsulfat ist dafür bekannt, dass es die antikoagulatorische Wirkung von Heparinoid-Molekülen neutralisiert und wird klinisch für diesen Zweck verwendet (Siehe Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Achte Ausgabe, Pergamon Press, New York, 1990, S. 1317). Es wurde jedoch gemäß der Erfindung gefunden, dass hinzugefügtes Protaminsulfat die Hemmung von TNF-α abhängiger Aktivität durch LMWH nicht neutralisiert; tatsächlich ist es so, dass Protaminsulfat diese Aktivität eigentlich stabilisiert (Siehe Einträge in Tabelle XII weiter unten mit Bezug auf hinzugefügtes Protaminsulfat).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass (i) verdünnte LMWH-Lösungen bei 20°C und mehr ihre Wirkung schnell verlieren und bei 4°C langsamer (es sollte beachtet werden, dass der Aktivitätsverlust bei 4°C keine Eigenschaft von den standardmäßigen antikoagulatorischen und antithrombotischen Aktivitäten von Heparin oder LMWH ausmacht); (ii) hinzugefügtes Protaminsulfat, der klassische Neutralisator der Standard-Aktivitäten von Heparinen, die neue Aktivität von LMWHs gegen TNF-α wie in der vorliegenden Offenbarung beschrieben nicht stört. Die Erfinder haben tatsächlich gezeigt, dass Protaminsulfat wirklich diese neuartige Eigenschaft beibehält.
4.3. Fraktionierung von LMWH und Herstellung von abgebauter ECM oder abgebautem Heparin. Entdeckung von deutlich steigernden und inhibitorischen Aktivitäten in Bezug auf TNF-α Aktivität
Wie bereits weiter oben besprochen, hemmt niedermolekulares Heparin (Fragmin) die Sekretion von aktivem TNF-α. Die maximale Hemmung oder Inh_max (90 %) wurde bei einer Konzentration von 1 pg/ml beobachtet. (Siehe 9). Inaktiviertes Fragmin hingegen hatte keine Wirkung auf die TNF-α-Produktion (siehe 10). Die Fraktionierung des inaktivierten Materials durch Gelpermeations-Chromatographie bei niedrigem Druck unter Verwendung eines soliden Sepharose 4B-Trägers (siehe 11 zur Aufzeichnung der Absorbanz bei 206 nm im Vergleich zu der Anzahl an Fraktionen) zeigte jedoch aktive Fraktionen von sowohl inhibitorischer (F-15) als auch steigernder (F8, F2) Wirkung (siehe 11 und Tabelle XIII). Die inhibitorische Fraktion des inaktivierten Fragmin (F-15) hemmte ebenfalls die DTH-Reaktion (siehe 12 mit Bezug auf aktives Fragmin^®, 12A mit Bezug auf Fraktion F15 und 12B mit Bezug auf Fraktion F10). Fraktion F10 hatte keinerlei Wirkung auf die TNF-α-Produktion oder die DTH-Reaktivität.
Eine Trennung mit Hilfe von Sepharose-4B-Gelpermeations-Chromatographie wurde ebenfalls mit den Abbauprodukten von mit Heparanase behandelter ECM, die mit ³⁵S-enthaltenden markiert war, ausgeführt. Mehrere Typen des Enzyms Heparanase wurden in der vorliegenden Untersuchung verwendet. Diese Enzyme schließen MM5 (Säugetier-Heparanase aus menschlicher Plazenta, im Handel erhältlich von Rad-Chemicals, Weizmann Industrial Park, Ness Ziona, Israel), PC3 (bakterielle Endoglycosidase wie in Shoseiov, O. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1990) 169:667-672 beschrieben), und ein Enzym aus einer bakteriellen Quelle, erworben von IBEX Technologies, Quebec, Kanada, ein. Eine Grafik der Radioaktivität (CPM) im Vergleich zu der Anzahl an Fraktionen ist in 13 dargestellt. Eine weitere Graphik, welche die Elutionsprofile von fraktioniertem Fragmin und fraktionierter ECM-Heparanase vergleicht, ist in 14 dargestellt. Die Bedingungen für die Trennung mit Sepharose 4B bei niedrigem Druck sind in der folgenden Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1 Sepharose 4B-Chromatographie-Bedingungen
Die verschiedenen Fraktionen wurden per Assay bezüglich ihrer Wirkung auf die TNF-α-Produktion untersucht, und diese Ergebnisse sind weiter unten in Tabelle XV dargestellt. Interessanterweise wurde gefunden, dass Fraktionen mit ähnlichen Elutionseigenschaften von den beiden Quellen (d.h. F-39 und F-42 aus Fragmin und durch Heparanase abgebauter ECM) ähnliche qualitative, biologische Wirkung auf die TNF-α-Produktion und/oder -Aktivität ausüben.
15 und 13 zeigen eine Möglichkeit zur Darstellung des auf Sepharose 4B-Säulen erhaltenen Elutionsprofils von LMWH (Fragmin) und mit „S-Sulfat" markierten Oligosacchariden der ECM, die jeweils durch gereinigte Heparanase MM5 gewonnen wurden. Aus 13 wird ersichtlich, dass das Heparansulfat der ECM (das Substrat von Heparanase) durch das Enzym abgebaut wird, um so Heparansulfat-Fragmente mit Elutionseigenschaften herzustellen, die mit denen von fraktioniertem LMWH vergleichbar sind.
16 zeigt, dass ein Oligosaccharidprodukt (Sepharose 4B-Fraktion #5, 13), erhalten aus der „Brühe" aus ECM + Heparanase (d.h. die aus dem ECM-Abbau durch Heparanase erhaltene Mischung) im Hinblick auf die Dosis/Antwort im Wesentlichen ähnliche Charakteristika wie LMWH bei der Wirkung auf die Sekretion von aktivem TNF-α aufweist, das heißt, beide zeigen eine glockenförmige Dosis-/Antwort-Kurve und beide weisen maximale Hemmung von ungefähr 90 % bei einer Konzentration von ungefähr 1 pg/ml mit geringerer Aktivität bei höheren oder niedrigeren Konzentrationen auf. Es ist deshalb vorteilhaft, wenn die Verabreichung dieser Wirkstoffe Dosierungen beinhaltet, die innerhalb ein leicht zu bestimmendes „Fensters" der physiologischen Wirkung fallen.
17 zeigt, dass die Anti-TNF-α-Wirkung der ECM-Abbauprodukte im Bereich einer Subfraktion (zwischen ungefähr 5,65 und ungefähr 5,80) der Fragmente unter der Peak Nummer 5 in 13 am höchsten ist.
Somit kann Heparanase auf Heparansulfat wirken, um so Abbauprodukte herzustellen, die wie LMWH auf die T-Zellen und Makrophagen wirken, um die Produktion von aktivem TNF-α und damit durch TNF vermittelte Entzündungen zu beenden.
Es wurde ebenfalls entdeckt, dass niedermolekulare Oligosaccharid-Fragmente, die aus der Behandlung von intaktem Heparin mit Endoglycosylase stammen, die gewünschte regulatorische Wirkung bezüglich der TNF-α-Aktivität zeigen.
4.4. HPLC-Trennung von aus DECM und DH erhaltenenen LMWH-Fraktionen und Fragmenten
High performance liquid chromatography („HPLC") wurde verwendet, um eine bessere Auflösung der Fraktionen von LMWH (z.B. Fragmin), ECM-Abbau und Heparinabbau-Proben zu erzielen. Anfangs wurden zwei verschiedene HPLC-Bedingungen verwendet. Unter den ersten HPLC-Bedingungen Zytokin-Regulationsschema
wurde eine Anzahl an einzelnen Fraktionen getrennt und isoliert; ihre Fähigkeit, die Sekretion von aktivem TNF-α zu regulieren, wurde anschließend untersucht. Überraschenderweise fanden die Erfinder, dass die ausgewählten Fraktionen die Aktivität von TNF-α im Wirt steigern können, während andere die TNF-α-Aktivität hemmten. Anschließend wurden zweite HPLC-Bedingungen verwendet, um eine bessere Trennung der verschiedenen Komponenten nach ihrem Molekulargewicht zu ermöglichen.
Bei den ersten HPLC-Bedingungen wurde eine TSK-GEL^® G-Oligo-PW-Säule (30 cm × 7,8 mm I.D.), ausgestattet mit einer Oligo-Vorsäule (4 cm × 6 mm I.D.) verwendet. Die Bedingungen („HPLC I") sind weiter unten in Tabelle II angegeben. Ein repräsentatives Chromatogramm für die HPLC-I-Trennung von Fragmin und ECM + MM5 Heparanase ist jeweils in den 18A und 18B dargestellt.
Tabelle 11. HPLC-I-Chromatographie-Bedingungen
Die zweiten HPLC-Bedingungen („HPLC II") werden weiter unten in Tabelle III beschrieben und die verwendeten Bedingungen sind jenen, die von K. G. et al. in Analytical Biochem. (1985) 150:325-331 beschrieben wurden, ähnlich. Demzufolge wurden zwei verbundene Säulen in Reihe verwendet: eine Toyo Soda TSK-Gel G3000SW-Säule (jeweils 7,5 mm × 50 cm) verbunden mit einer G2000SW-Säule (7,5 mm × 50 cm). Diese Säulen wurden gemeinsam mit einer Vorsäule (7,5 mm × 10 cm), die mit dem Einlassende der G2000-Säule verbunden war, von Phenomenex erworben. Weitere Details zu den Versuchen sind in den Abschnitten 6.11, 6.14 und 6.15 weiter unten beschrieben.
Tabelle III HPLC-II-Chromatographie-Bedingungen
Unter diesen Bedingungen werden kleinere Substanzen länger zurückgehalten als größere Moleküle.
Unter weiteren HPLC-Bedingungen („HPLC III") wurde die Reinheit ausgewählter entsalzter HPLC-Fraktionen mit Hilfe einer starken Aniontauscher (SAX) HPLC-Säule untersucht. Es ist bekannt, dass solche SAX-HPLC-Säulen Moleküle von ähnlicher Größe gemäß der Anzahl an negativ geladenen Gruppen, die in dem Molekül vorhanden sind, trennen. Je größer die Anzahl an negativ geladenen Gruppen in einer Substanz ist, desto länger wird sie in der Säule zurückgehalten. Die HPLC-III-Bedingungen sind unten in Tabelle IV angegeben.
Tabelle IV HPLC III Chromatographiebedingungen
Es wird dem Durchschnittsfachmann nach Konsultation der hier präsentierten Offenbarung klar ersichtlich sein, dass andere HPLC-Bedingungen ebenfalls möglich sind und auf die Trennung und Reinigung der Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung angewandt werden können. Insbesondere können Reverse-Phase-Bedingungen vorteilhaft verwendet werden. Siehe zum Beispiel Rice, K.G. et al., supra.
Es wird angenommen, ohne dass dies eine Einschränkung darstellen würde, dass die Aktivität von TNF-α entweder durch Erhöhung der intrazellulären Produktion von aktivem TNF-α, Erhöhung der Menge von durch die Immuneffektorzellen des Wirts sekretiertem TNF-α oder durch Verbesserung der Zytokinaktivität durch die Wirkung eines Agonisten gesteigert wird.
Daraus lässt sich ebenfalls folgern, dass die biologische Aktivität von TNF-α durch konverse Vorgänge gehemmt werden kann, was nicht nur die Kompetition durch die aktiven inhibitorischen Stoffe für die Rezeptoren von TNF-α (z.B. wenn der inhibitorische Stoff als Antagonist von TNF-α wirkt oder die Produktion einer anderen Substanz, die als solcher wirkt, induziert), sondern auch die Bildung eines Komplexes von TNF-α und der inhibitorischen Substanz einschließt, der weniger aktiv ist als freier TNF-α. Alternativ folgt daraus, dass ein verbesserter Komplex von TNF-α und der steigernden Substanz für die beobachtete Erhöhung der Aktivität von TNF-α verantwortlich sein kann.
4.5. Bestimmung der Aktivität
Die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung, sowohl jene, die in der Lage sind, die TNF-α-Aktivität zu hemmen als auch jene, welche die TNF-α-Aktivität steigern können, wurden aus diese enthaltenden Mischungen isoliert und gereinigt. In manchen Fällen wurden diese Wirkstoffe durch die hierin beschriebenen, effektiven HPLC-Techniken im Wesentlichen bis zum Erreichen von Homogenität gereinigt.
Als eine weitere Indikation der Reinheit dieser Wirkstoffe wurden die spezifischen, regulatorischen Aktivitäten der verschiedenen Substanzen bestimmt.
Anfangs wurde jedoch ein Carbazol-Assay auf ähnliche Weise wie von Carney, S. L. in Proteoglycan Analysis, A Practical Approach, Chaplin, M. F. and Kennedy, J. F. (Eds.) IRL Press, Oxford, Washington, D.C. (1986) S.129 offenbart, durchgeführt, um die Menge an in einer bestimmten Probe vorhandenem Oligosaccharid-Material zu prüfen (z.B. Menge des vorhandenen Zuckers). Zuckermengen in Picogramm (pg) können auf diese Weise bestimmt werden. Der Assay wird wie weiter unten in Abschnitt 5 beschrieben durchgeführt.
Anschließend wird die offensichtliche, mit dieser Menge der Substanz assoziierte Aktivität durch einen der biologischen Assays bestimmt, die im folgenden Abschnitt 5 sehr detailliert beschrieben sind, um ein Dosis-/Antwort-Profil zu erstellen. Diese Bioassays können entweder bei in vitro oder in vivo Bedingungen durchgeführt werden.
Es wurde somit gefunden, dass die beobachtete Hemmung oder Steigerung der TNF-α-Aktivität, ausgedrückt als Prozentsatz der TNF-α-Aktivität, die in Abwesenheit der Substanzen der vorliegenden Erfindung beobachtet wurde, von der in einer Probe vorhanden Konzentration oder Dosis solch einer Substanz abhängt. Das daraus resultierende Aktivitätsprofil ist wie in 9 und 16 dargestellt ungefähr glockenförmig. Der maximale prozentuale Wert der Hemmung oder Steigerung, der für jede Substanz beobachtet wurde, wird mit Inh_max oder Aug_max bezeichnet, je nachdem, ob es sich um Hemmung oder Steigerung handelt.
Wie weiter unten beschrieben, kann der Bioassay, der verwendet wird, um die „ideale" Dosiseinheit festzustellen (d.h. die Dosiseinheit, die Inh_max oder Aug_max entspricht), auf der in vitro oder in vivo Hemmung oder Steigerung der Aktivität von TNF-α oder DTH-Assay in Mäusen basieren. Alternativ kann auch ein in vitro Assay, der auf humanen Zellen basiert (wie weiter unten beschrieben) verwendet werden. Wie hierin definiert, stehen die spezifische regulatorische Aktivität oder der „R"-Wert für das Verhältnis von Inh_max oder Aug_max zu der „idealen" Dosis, durch die diese maximale prozentuale Hemmung oder Steigerung ausgelöst wurde. Für die in vitro Assays werden die „R"-Werte üblicherweise in Einheiten von % × (pg/ml)^–1 ausgedrückt.
Wie oben erwähnt, kann die spezifische, regulatorische Aktivität auch unter in vivo Bedingungen festgestellt werden, und zwar durch Überwachung der Hemmung von experimenteller DTH-Reaktion in Mäusen oder Menschen. Es wurde gefunden, dass die Fähigkeit einer bestimmten Dosis einer inhibitorischen Zusammensetzung, die Sekretion von aktivem TNF-α zu hemmen, auf positive Weise mit ihrer Fähigkeit verbunden ist, die Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DTH) zu hemmen, obwohl dieselbe Zusammensetzung unter einem Assay im Vergleich zu einem anderen Assay stärker sein kann (d.h. im Vergleich von in vitro und in vivo Bioassays). Inhibitorische oder steigernde Aktivität ist in dieser in vivo zellmediierten Entzündungsreaktion von großer Bedeutung, da die DTH-Reaktion ein Ausdruck der Prozesse ist, die bei Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung, manchen Typen von Entzündungen der Blutgefäße und Allergien ablaufen. Somit ist die Aktivität in diesem Test indikativ für die Nützlichkeit bei diesen und möglicherweise auch bei anderen Krankheitstypen, wie weiter unter beschrieben.
Außerdem kann die neue Menge, die spezifische, regulatorische Aktivität, die als das Verhältnis von Inh_max oder Aug_max zu der Menge oder Konzentration der diese maximale prozentuale Hemmung oder Steigerung auslösenden Substanz (die „ideale" Dosis"), definiert ist, dazu dienen, die neuartigen Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung von jenen Substanzen zu unterscheiden, die zwar bekannt sind, aber im Stand der Technik bisher nicht als Substanzen, welche die hierin offenbarte regulatorische Wirkung auf die Zytokinaktivität aufweisen, erkannt wurden. Auf dieses spezifische Verhältnis wird hierin in Form der Abkürzung „R"-Wert Bezug genommen. Deshalb können die neuartigen Substanzen oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf einen minimalen „R"-Wert beschrieben werden, der aus dem entstehenden Profil aus dem Verhältnis von Aktivität zu Dosis berechnet werden kann und der jenen „R"-Wert, der unter Bezugnahme auf die Lehren der vorliegenden Offenbarung mit bekannten Zusammensetzungen assoziierbar ist, übertrifft.
4.6. Krankheiten, auf die die vorliegende Erfindung positive Auswirkungen haben kann
Zu den Erkankungen, deren Auftreten die Erfindung vorbeugt oder die durch die Erfindung behandelt werden können, zählen alle Krankheiten, die mit pathologischen Prozessen, welche die Induktion der Sekretion von aktivem TNF-α beinhalten, einhergehen, einschließlich Atherosklerose und Vaskulitis und damit verbundene pathologische Prozesse; Autoimmunerkrankungen, z.B. rheumatoide Arthritis, Typ-1-Diabetes (Insulinbedingter Diabetes Mellitus oder IDDM), Multiple Sklerose, Lupus Erythematodes, Graves Krankheit, Allergien; Abstoßung von Transplantaten; akute und chronische entzündliche Erkrankungen, z.B. Uveitis, Darmentzündung; Anorexia Nervosa; Hämorrhagischer Schock, verursacht durch Blutvergiftung, und HIV-Infektionen bei Aids. Bei Aids unterdrückt der Wirkstoff die HIV-Replikation, wodurch die Entwicklung des AIDS-related Complex (ARC) verhindert wird. Andere Erkrankungen, auf die sich eine Behandlung mit dem Ziel, die Zytokinaktivität zu regulieren, positiv auswirkt, schließen Psoriasis, Pemphigus, Asthma, Nierenerkrankungen, Lebererkrankungen, Knochenmarkversagen, Vitiligo, Alopecia und Myositis ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Des Weiteren ist die Steigerung von aktivem TNF-α in der Behandlung von Tumoren, bakteriellen Infektionen und viralen Infektionen von Nutzen. Parenterale, orale oder topische Verabreichung der Substanzen der vorliegenden Erfindung, die eine Steigerung der Produktion von TNF-α in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger bewirken, können auch bei zur Bekämpfung von Hautkrebs, wie Basalzellkarzinom, verhornendes Plattenepithelkarzinom oder Melanom beitragen.
Bei der klinischen Anwendung der Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung sollte bedacht werden, dass die erfolgreiche Behandlung mancher Erkrankungen zu einem großen Teil in der Wiederherstellung von Homöostase besteht. Für den Endokrinologen bedeutet dies die sinnvolle Verabreichung oder Antagonisierung von spezifischen Hormonen. Zum Beispiel kann eine Person, die an insulinbedingtem Diabetes leidet, wirksam mit einer Insulinersatztherapie behandelt werden; einem Patienten, der an der Graves Krankheit leidet, kann möglicherweise durch pharmakologische Maßnahmen geholfen werden, die zu einer Hemmung der Thyroxinfreisetzung führen. Nur sehr selten kann eine Krankheit durch die Gabe von Hormonen, an denen niemals ein Mangel bestanden hatte, gelindert werden.
Ein Beispiel dafür ist die Verwendung von Zytokinen, wie TNF-α, als antineoplastische Wirkstoffe. Die Begründung für die Gabe von immunomodulatorischen Wirkstoffen an Krebspatienten kann relativ wenig fundiert sein. Viele Zytokine wie TNF-α sind so toxisch, dass die Dosis lange vor Erreichen eines therapeutischen Ziels reduziert werden muss. In einem solchen Fall kann die Steigerung der Aktivität von endogen produziertem TNF-α einen Ansatz darstellen, der neuartig ist und sich schließlich als wirksamer als jede zuvor in Betracht gezogene Therapie erweist.
Es ist unumstritten, dass sich unser Verständnis der Rolle von TNF-α noch in einem Entwicklungsstadium befindet und zweifelsohne werden noch neue und nützliche Verwendungen der Hormone und der Substanzen, die seine Aktivität regulieren können, gefunden werden. Während klar ist, dass alle Verwendungen der beanspruchten Zusammensetzungen und pharmazeutischen Präparate im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen, sind auch jene Verwendungen, die die Krankheitssymptome lindern, den Ausbruch der Krankheit verhindern oder eine Heilung der Krankheit ermöglichen, besonders berücksichtigt.
4.7. Topische Anwendungen der Oligosaccharidsubstanzen der vorliegenden Erfindung
Die Substanzen der vorliegenden Erfindung finden auch in topisch verabreichten Zusammensetzungen, wie in den Präparaten für die Behandlung von Ödemen oder Entzündungen, Anwendung. Tatsächlich können die Substanzen der vorliegenden Erfindung, abgesehen von der rein therapeutischen Anwendung, auch unterstützend für die Schutzwirkung von kosmetischen Zusammensetzungen wie Sonnencremes oder Sonnenlotionen eingesetzt werden. Wenn überhaupt können nur wenige Sonnenschutzpräparate alle schädlichen Wellenlängen (z.B. 290-320 nm), die im ultravioletten Bereich des elektromagnetischen Spektrums vorhanden sind, abblocken. Deshalb löst zu starker Sonneneinfluss häufig einen akuten Zustand aus, der als Sonnen-Erythem bekannt ist und natürlich kann wiederholter, langer Sonneneinfluss zu einem lederartigen Aussehen der Haut oder im schlimmsten Fall zu Hautkrebs führen.
Deshalb wird die Integration der Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung in kosmetische Präparate vor allem dann in Betracht gezogen, wenn es darum geht, die Haut zu erhalten und zu schützen und für die Linderung eines medizinischen Zustands wie Sonnen-Erythem zu sorgen. In Sonnencremes oder in Sonnenlotionen wäre es von Vorteil, eine wirksame Menge des Oligosaccharids der vorliegenden Erfindung zusammen mit herkömmlichen Sonnenschutzmitteln zu integrieren. Im Allgemeinen kann ein Wirkstoff in einer Menge vorhanden sein, die zu einer Dosis von ungefähr 1 μg bis ungefähr 100 mg pro Kilogramm Subjekt führt, vorzugsweise von ungefähr 0,01 mg bis ungefähr 10 mg pro Kilogramm Subjekt und am bevorzugtesten ungefähr 0,1 mg bis ungefähr 1 mg pro Kilogramm Subjekt.
Die kosmetischen Zusammensetzungen können herkömmliche, dem Durchschnittsfachmann bekannte Inhaltsstoffe enthalten, wie jene, die in Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Dritte Ausgabe (1979), Band 7, S. 143-176, beschrieben sind. In Sonnenschutzpräparaten wird durch das Hinzufügen des Wirkstoffes der vorliegenden Erfindung die minimale erythemale Dosis (MED) und damit auch der Sonnenschutzfaktor (SSF) erhöht. Spezifische Inhaltsstoffe, einschließlich typischer Sonnenschutzmittel, sind in Kirk-Othmer, wie oben zitiert, auf den Seiten 153-154 aufgelistet. Zusätzlich können topische Präparate und kosmetische Formulierungen wie in den US Patenten 4,199,576, 4,136,165 und 4,248,861 beschrieben, hergestellt werden, deren vollständige Offenbarungen hierin durch Bezugnahme inkorporiert sind. Es ist für einen Durchschnittsfachmann aus dem Bereich der Kosmetik klar ersichtlich, dass die daraus entstehenden Zusammensetzungen in vielen Formen einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Lösungen, Lotionen, Cremes, Pasten, Emulsionen, Sprays oder Aerosole, hergestellt werden können.
4.8. Beispiele für Dosierungsschemata
Es wurde gemäß der Erfindung gefunden, dass die niedrigste Dosis von LMWH pro kg, die zu einer Hemmung von TNF-α, Hervorrufen oder Hemmung von DTH- Reaktivität um mindestens 50% führt, in der Maus bei 12 inhibitorischen Einheiten pro kg (12 E/kg) liegt. Aufgrund der Unterschiede bezüglich der Oberflächen und Stoffwechsel zwischen Mäusen und Menschen, sollten Menschen mit einer niedrigen LMWH-Dosis behandelt werden; deshalb wurde festgelegt, dass 12 E/kg in Mäusen 1 E/kg in Menschen entspricht. Die Dosis der Fragmin^® Charge 38609, die sowohl bei der Hemmung der Sekretion von TNF-α als auch bei der DTH-Reaktivität wirksam ist, liegt bei 5 μg pro Maus bei wöchentlicher Gabe. Da jede Maus ungefähr 25 g schwer ist, beträgt die Fragmin^® 38609-Dosis, die 12 E/kg entspricht, 200 μg/kg Maus. Die Dosis von 1 E/kg, die für Menschen geeignet ist, beträgt deshalb 200 μg/kg ÷ 12 = 16,67 μg/kg. Ein etwa 70 kg schwerer Mensch würde demzufolge mit einer Dosis von ungefähr 1,2 mg, die einmal wöchentlich in einer einmaligen Dosis subkutan verabreicht würde, behandelt. Da sich einzelne Menschen biologisch voneinander unterscheiden, ist es auch möglich, dass die individuelle Dosis nicht bei 1,2 mg liegt; allerdings liegt sie im Allgemeinen unterhalb von 5 mg, insbesondere im Bereich von 0,3 bis 3 mg.
Somit lautet eine ungefähre Formel für die Anpassung des Dosierungsschemas in Mäusen auf das Dosierungsschema im Menschen wie folgt: Dosis Mensch/kg = Dosis Maus/kg ÷ 10 oder 12
Die LMWH-Dosis, die in Ratten wirksam sein sollte, kann davon abgeleitet werden, dass die LMWH-Dosis pro Kilo der Ratte der halben Dosis pro kg Mäuse entspricht, d.h. 6 E/kg. Sind also zum Beispiel 12E von Fragmin^® Charge 38609 gleich 200 μg/kg, dann läge die für Ratten geeignete Dosis von 6 E bei 100 μg/kg oder 20 μg pro 200 g Ratte, einmal wöchentlich verabreicht.
Für die meisten Oligosaccharidsubstanzen der vorliegenden Erfindung, die aus LMWH, abgebautem Heparin und abgebauter ECM isoliert wurden, ist Folgendes eine Möglichkeit, die wirksame Dosis dieser Oligosaccharidsubstanzen für die Behandlung von Menschen aus dem in vivo DTH-Bioassay vorherzusagen.
12A zeigt, dass eine isolierte Fraktion (F15) in vivo die DTH in Mäusen in einem Bereich von 0,1-5,0 μg/Maus/Woche hemmt. Da unsere Mäuse 25 g wiegen, liegt die in vivo Dosis bei ungefähr (0,1 ÷ 0,025 kg) 4-200 μg/kg/Maus/Woche (das Äquivalent von 0,01-10 pg/ml in vitro).
Um den Unterschied bezüglich der Oberfläche zwischen Mäusen und Menschen zu kompensieren, muss die für die Maus bestimmte Dosis/kg durch 12 geteilt werden.
4-200 μg/kg Maus – 0,33-16,67 μg/kg Mensch. Somit sollte ein 70 kg schwerer Mensch bis zu ungefähr 1,2 mg (ungefähr 1,200 μg) erhalten. Um sicherzustellen, dass die Unterschiede zwischen einzelnen Menschen abgedeckt sind, kann diese Dosis auf ungefähr 5 mg erhöht werden; eine Menge, die deutlich unter jeder Dosis von Heparinoiden, die aufgrund ihrer Wirkung auf die Koagulation oder auf Thrombose eingesetzt werden, liegt. Aus diesem Grund beträgt die Dosis für einen 70 kg schweren Menschen ungefähr 5 mg oder weniger, vorzugsweise ungefähr 3 mg oder weniger, bevorzugter ungefähr 1,5 mg oder weniger und am bevorzugtesten ungefähr 1 mg oder weniger.
Aufgrund des hohen Reinheitsgrads der Materialien der vorliegenden Erfindung, einschließlich jener Materialien, die durch HPLC-Chromatographie erhalten wurden, können die bevorzugten Dosen sogar noch niedriger sein. So wurde zum Beispiel gefunden, dass die weiter unter detaillierter beschriebenen Disaccharide bereits bei ungefähr 0,1 μg bis ungefähr 0,5 μg pro Kilogramm Maus inhibitorische Aktivität aufweisen, wenn sie durch Injektion verabreicht werden. Somit wird geschätzt, dass die Dosierung der gereinigten Disaccharide für Menschen bei ungefähr 0,01 μg bis ungefähr 0,05 μg pro Kilogramm Mensch oder ungefähr 0,7 μg bis ungefähr 3,5 μg bei einem 70 Kilogramm schweren Menschen liegt. Ein allgemeiner Dosierungsbereich für einen 70 kg schweren Mann kann damit bei ungefähr 0,1 μg bis ungefähr 10 μg für die Disaccharide liegen. Die Dosierung kann bei den bekannten Disaccharid-„Markern", die weiter unter beschrieben werden, etwas höher sein.
Die oben zitierten Dosierungen können je nach Ansprechen des einzelnen Patienten mehrmals am Tag oder in täglichen, wöchentlichen oder noch längeren Intervallen verabreicht werden. Für die LMWHs ist das bevorzugte Dosierungsintervall jedoch wöchentlich, wie zuvor angegeben.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher beschrieben.
5. Referenzversuche unter alleiniger Verwendung von LMWH (Fragmin)
5.1. Bioassay der Hemmung der Sekretion von aktivem TNF-α unter Verwendung von Mäusemilzzellen
Überstände von Milzzellen, die bei Vorhandensein oder Fehlen von LMWH kultiviert wurden, oder von mit oder ohne LMWH behandelten Mäusen stammende Milzzellen werden auf ihre Fähigkeit zur Sekretion von aktivem TNF-α in vivo analysiert. Der TNF-α Bioassay basiert auf der zytotoxischen Wirkung von TNF-α auf Cycloheximid (CHI) sensitivierte Zellen und ihrer quantitativen Bestimmung durch den wie bei Wallach D., J. Immunol. (1984) 132:2464-2469 beschriebenen Neutralrot-Aufnahme-Assay. Kurz gesagt wird das Töten von CHI-sensitivierten HeLa-Zellen durch in den Überständen der Zellen vorhandenem TNF-α gemessen, wobei die TNF-α-Konzentration in den Überständen durch den Vergleich der Titrierungskurven von exogen hinzugefügtem TNF-α bestimmt wird. Zellviabilität wird durch zweistündiges Inkubieren mit Neutralrot, Abwaschen der überschüssigen Farbe, Extrahieren des Neutralrots, das von den Zellen mit einer Sorensons Zitratpuffer-Ethanol-Mischung aufgenommen wurde, und kalorimetrisches Quantifizieren bei 570 nm mittels eines Microelisa Autoreader bestimmt.
Die Zellen von mit LMWH behandelten Mäusen wurden wie folgt erhalten: Mäuseweibchen mit dem BALB/c-Strang (25 Gramm, 2 Monate alt), wobei zumindest 5 Mäuse pro Gruppe vorhanden sind, werden subkutan mehrere Dosen LMWH injiziert, die normalerweise im Bereich von 0,5 bis 20 μg pro Maus liegen. Fünf Tage später werden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet, die Milz wird entfernt und Suspensionen von an roten Blutkörperchen armen Milzzellen werden auf die TNF-α-Produktion als Reaktion auf Induktion mittels der restlichen extrazellulären Matrix (RECM), Concanavalin A (Con A) oder Lipopolysacchariden (LPS) hin untersucht.
5.2. In Vivo Bioassay der Hemmung experimenteller DTH-Reaktivität
Gruppen von BALB/c-Inzuchtmäusen (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) oder von CD1 Auszuchtmäusen (Tierzuchtzentrum des Weizmanninstituts, Rehovot, Israel) werden auf der rasierten abdominalen Haut mit 100 μl von 2%igem Oxazolon (OX) in topisch angewandtem Aceton/Olivenöl (4/1, v/v) sensitiviert. DTH-Sensitivität wird fünf Tage später wie folgt ausgelöst: Mäuse werden mit 20 μl 0,5%igem OX (10 μl werden beiderseits des Ohres topisch verabreicht) in Aceton/Olivenöl belastet. Ein konstanter Bereich des Ohres wird unmittelbar vor der Belastung und 24 und 48 h später mittels eines Mikrometers von Mitutoyo gemessen. Die einzelnen Messungen der Ohrschwellung werden mit der Identität der Mäusegruppen in Verbindung gebracht. Das Ansteigen (Δ) der Ohrschwellung wird abhängig von dem verwendeten Mikrometer als Durchschnitt in Einheiten von 10^–2 mm oder 10^–4 Zoll (+SE) ausgedrückt. Die Hemmung in Prozent wird wie folgt berechnet:
Wie in Beispiel 5.1 wurde den mit LMWH behandelten Mäusen an dem Tag vor der ersten Sensitivierung auf OX LMWH injiziert. Am fünften Tag nach der Sensitivierung auf OX werden die Mäuse wie oben beschrieben zwecks Induktion einer DTH-Reaktion belastet.
Die Positivkontrolle ist die in immunisierten Mäusen bei Fehlen der Behandlung mit LMWH ausgelöste DTH-Reaktion. Die Negativkontrolle ist die durch das Antigen in den naiven (nicht immunisierten) Mäusen hervorgerufene begleitende Schwellung.
5.3. In vitro Induktion von TNF-α-Sekretion mittels T-Zellen und Makrophagen
Mikrotiterplatten wurden wie folgt hergestellt: Fibronektin (FN) oder Laminin (LM) (Sigma) wurde bei einer Konzentration von 1 μg/50 μl PBS pro Well zu 96-Well-Flachboden-Platten (Costar) hinzugefügt und nach 16 h entfernt. Die verbleibenden Bindestellen wurden mittels BSA/PBS (10 mg/ml) blockiert, das den Wells für 2 h hinzugefügte und ausgewaschen wurde.
Die ECM-beschichteten Wells wurden wie folgt hergestellt: Endothelzellen von Rinder-Hornhaut wurden in 96-Well-Flachboden-Platten kultiviert. Die konfluenten Schichten von Endothelzellen wurden aufgelöst und die ECM verblieb frei von Zelltrümmern und intakt (Gospodarowicz, D. et al., J. Biol. Chem. (1978) 253:3736). Gerissene oder restliche ECM (RECM) wurde durch leichtes, dreimaliges Ritzen der ECM mit einer 27G-Injektionsnadel hergestellt und die behandelten Stellen wurden anschließend mit BSA/PBS beschichtet. Restliche klonierte, als K1 bezeichnete CD4+ T-Zellen von Ratten, die das Myelin-Basisprotein (MBP) erkennen, vermehrten sich und blieben in den Kulturen erhalten und wurden den Wells hinzugefügt: 10⁵ Zellen pro Well mit oder ohne 3 × 10⁵ syngenetischen Milzmakrophagen in 100 μl mit 1 %igem BSA und Antibiotika angereichertem RPMI 1640 (Gibco) pro Well.
Die Milzmakrophagen wurden durch Entfernen der T- und B-Zellen unter Verwendung spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb) gereinigt. Anti-Maus-TNF-α-mAb wurde von Genzyme (Cambridge, MA) erhalten und wurde 300fach verdünnt. Jedem Well wurde eine 10 μl Aliquote dieser verdünnten Lösung hinzugefügt. Falls angegeben, wurde den Wells MBP (100 μg/ml), Con A (2,5 μg/ml), LPS (1 μg/ml), FN (5 μg/ml) und LN (5 μg/ml) hinzugefügt.
Die Platten wurden 3 h lang bei 37°C in einem Feuchtinkubator inkubiert. Anschließend wurden die Inhalte der Wells (4 Wells pro experimentelle Gruppe) gesammelt, zentrifugiert und die Medien wurden wie in dem in Abschnitt 5.1 beschriebenen Beispiel auf die Sekretion von aktivem TNF-α hin untersucht: Das heißt, Überständen kultivierter Makrophagen und Lymphozyten wurden durch TNF-α abtötbare HeLa-Zellkulturen hinzugefügt und bei Vorhandensein der Testmedien wurde der Tod dieser Zellen im Vergleich zu den Titrierungskurven von exogen hinzugefügtem TNF-α kalibriert. Der Zelltod wird anhand der Freisetzung der Neutralrot-Farbe von den vorinkubierten HeLa-Zellen untersucht. Die hier gezeigten Ergebnisse stellen die aus insgesamt sechs, im Wesentlichen ähnliche Ergebnisse liefernden Versuchen erhaltenen Daten dar.
Tabelle V zeigt, dass bei gemeinsam kultivierten T-Zellen und Makrophagen die TNF-α-Sekretion durch den Kontakt mit spezifischem Antigen MBP (Gruppe 4), dem Mitogen Con A (Gruppe 6) oder LPS (Gruppe 8) induziert werden kann. Bei Fehlen von antigenetischem oder mitogenetischem Stimulus allerdings wurde die TNF-α-Sekretion auch durch die restliche extrazelluläre Matrix (RECM; Gruppe 10) oder durch ECM-Bestandteile, Fibronektin (FN; Gruppe 12) oder Laminin (LN; Gruppe 14) induziert. Intakte ECM war ein schwacher TNF-α-Induktor (Gruppe 16).
Tabelle V. Die TNF-α-Sekretion durch T-Zellen und Makrophagen wird von spezifischem Antigen MBP, Con A, LPS, RECM oder ECM-Bestandteilen induziert.
5.4. Regulation der TNF-α-Sekretion durch LMWHs (Referenzbeispiel)
T-Zellen und zusätzliche Zellkulturen wurden wie in Abschnitt 5.3 beschrieben hergestellt. LMWH wurde den Wells zu Beginn der Zellkultur hinzugefügt. Die TNF-α-Niveaus wurden nach 3 h Inkubation untersucht.
Tabelle VI zeigt, dass das Vorhandensein von LMWH (Fragmin^® Charge 38609) durch von spezifischem Antigen (MBP; Gruppe 4), Mitogenen (Con A und LPS, Gruppen 6 und 8), RECM oder ECM-Bestandteilen induzierte Sekretion von aktivem TNF-α in vitro hemmte. Da RECM induzierte TNF-α-Sekretion vermutlich bei Arteriosklerose eine Rolle spielt, ist die Hemmung von TNF-α durch LMWH bei Atherosklerose günstig.
Tabelle VI. Die Induktion von in vitro induzierter TNF-α-Sekretion wird durch LMWH gehemmt (Fragmin^® Charge 38609).
5.5. Ex vivo Versuche mit mit LMWH behandelten BALB/c-Mäusen (Referenzbeispiel).
Der folgende Versuch wurde zwecks Untersuchung der Wirkung von LMWH, das Mäusen in vivo verabreicht wurde auf die in vitro TNF-α-Sekretion durch Milzzellen durchgeführt. Jeweils 5 BALB/c-Mäuse pro Gruppe wurden mit mehreren subkutan injizierten Dosen von in Salzlösung verdünntem LMWH (Fragmin^® Charge 38609) behandelt. Nach einer Woche wurden die Tiere getötet und ihre von roten Blutkörperchen freien Milzzellen wurden auf ihre Fähigkeit zur TNF-α-Sekretion als Reaktion auf Kontrollwells ohne RECM (A) oder RECM-beschichtete Wells (B) untersucht. Die Messung der Niveaus der TNF-α-Sekretion wurde wie in Abschnitt 5.1 beschrieben durchgeführt. Tabelle VII zeigt die Ergebnisse, die angeben, dass eine einmalige, 7 Tage früher gelegene Injektion von 5 μg LMWH durch RECM induzierte TNF-α-Sekretion hemmte. Höhere oder geringere Dosen von LMWH waren weniger wirksam. Somit war eine Woche früher erfolgte in vivo Verabreichung einer optimalen Dosis von LMWH wirksam.
Tabelle VII. Ex vivo Hemmung der von T-Zellen mediierten TNF-α-Sekretion als Reaktion auf restliche ECM.
Tabelle VIII zeigt, dass eine in vivo Dosis von 5 μg LMWH Fragmin^® Charge 38609 auch bei der Hemmung von LPS-induzierter TNF-α-Sekretion wirksam war. BALB/c-Mäuse (4 Mäuse pro experimentelle Gruppe) wurden mit den subkutan injizierten angegebenen Mengen von in Salzlösung verdünntem LMWH behandelt. Nach einer Woche wurde den Mäusen intraperitoneal 10 mg LPS injiziert, 4 Stunden später wurden sie getötet und ihre von roten Blutkörperchen freien Milzzellen wurden anschließend 3 Stunden lang in RECM-beschichteten Wells in einem Feuchtinkubator kultiviert. Die Niveaus des in Reaktion auf die RECM sekretierten TNF-α wurde in den Überständen der Kulturen gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle VIII angeführt.
Tabelle VIII. Die Behandlung der Mäuse mit LMWH hemmt mittels Makrophagen LPS mediierte Sekretion von aktivem TNF-α
5.6. Versuche unter Verwendung einer Vielzahl von LMWH-Quellen (Referenzbeispiel)
Zwecks Untersuchung der Wirkung unterschiedlicher LMWHs auf die Hemmung der Sekretion von aktivem TNF-α und auf DTH-Reaktionen wurden Mäuse mit dem in unterschiedlichen Konzentrationen subkutan verabreichten, angegebenen LMWH behandelt. Nach einer Woche wurden einige der Mäuse getötet und die Induktion der Sekretion von aktivem TNF-α als Reaktion auf in vitro Con A-Aktivierung wurde gemessen (Tabelle IX). Die verbleibenden Mäuse wurden auf ihre Fähigkeit, auf das Antigen Oxazolon zu reagieren, untersucht (Tabelle X). Die Ergebnisse werden in den Tabellen als Hemmung (%) im Vergleich zu den Reaktionen der nicht mit LMWH behandelten Mäuse ausgedrückt.
Zwei Schlussfolgerungen können beim Studium der in Tabelle IX und Tabelle X gezeigten Ergebnisse gezogen werden.

1. Unterschiedliche, jeweils durch ähnliche antithrombotische Wirkung (Faktor-X-Assay) kalibrierte Chargen an LMWH weisen unterschiedliche Dosen zur Hemmung der Sekretion von aktivem TNF-α auf. Darüber hinaus weisen einige LMWH-Präparate wie Clexane^® Charge 4096 bei keiner der verwendeten Dosen inhibitorische Wirkung auf die Sekretion von aktivem TNF-α auf. Daraus folgt der Schluss, dass die antithrombotische Wirkung eines LMWH-Präparats nicht mit dem Potential des LMWH-Präparats zur Hemmung der Sekretion von aktivem TNF-α in Verbindung steht. Die zwei unterschiedlichen Bioassays werden durch unterschiedliche, in den Präparaten vorhandene Faktoren, mediiert.
2. Die Fähigkeit einer speziellen Dosis LMWH zur Hemmung der Sekretion von aktivem TNF-α steht in positiver Korrelation zu ihrer Fähigkeit zur Hemmung der DTH-Reaktion und die optimal wirksame Dosis eines LMWH-Präparats bei der Hemmung der Sekretion von aktivem TNF-α ist auch bei der Hemmung der DTH-Reaktion optimal wirksam.

Tabelle IX. Die wöchentliche Behandlung von Mäusen mit unterschiedlichen LMWHs hemmt die DTH-Sensitivität von Mäusen.
Tabelle X. Die wöchentliche Behandlung von Mäusen mit unterschiedlichen LMWHs hemmt unter Verwendung von Mäusemilzzellen-Bioassay die ex vivo Sekretion von aktivem TNF-α. Con A-induzierte
5.7. Behandlung von Adjuvans-Arthritis (AA) bei Ratten mit geringen Dosen an LMWHs (Referenzbeispiel)
Adjuvans-Arthritis ist eine experimentelle Erkrankung, die in einigen Strängen von Ratten durch deren Immunisierung gegen Mycobacterium tuberculosis-Antigene induziert werden kann (Pearson, C. M., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1956) 91:91). Diese experimentelle Erkrankung wird als ein Modell für rheumatoide Arthritis beim Menschen angesehen (Pearson, C. M., Arthritis Rheum. (1964) 7:80). Es scheint, als werde die Arthritis durch T-Lymphozyten hervorgerufen, die ein M. tuberculosis-Antigen erkennen, das mit Strukturen in den Geweben der Gelenke kreuzreagiert (Cohen I. R., et al., Arthritis Rheum. (1985) 28:841).
Lewis-Ratten wurden zur Induktion von Adjuvans-Arthritis mit M. tuberculosis (1 mg) in Öl immunisiert (Pearson, C. M., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1956) 91:91). Fünf Tage später wurden den Ratten wie angegeben die Dosen von LMWH und/oder Heparin subkutan eingeimpft und wie beschrieben bezüglich der Entwicklung von Arthritis auf einer Skala von 0-16 gewertet (Holoshitz, J., et al., Science (1983) 219:56). Alle Versuche wurden mit Fragmin^® Charge 38609 durchgeführt.
Zwecks Studium der Dosis-Antwort auf Fragmin^® (1) wurde zur Induktion von AA immunisierten Ratten wöchentlich ab dem fünften Tag nach der Injektion subkutan 0,5 μg (o), 1 μg (♦), 2 μg (•), 10 μg (♢), 15 μg (Δ) 20 μg (∎); 30 μg
40 μg (x) und PBS-Kontrolle (☐) injiziert. Die Dosis von 20 μg war bei der Hemmung von Arthritis am wirksamsten.
2 zeigt die Wirkung der 20 μg-Dosis Fragmin^® auf den Verlauf von AA: PBS-Kontrolle (0); einmalige Behandlung am fünften Tag
täglich (•); jeden fünften Tag (o); wöchentlich (∎). Es wird gezeigt, dass Arthritis sowohl durch die Verabreichung von Fragmin^® in 5-Tages-Intervallen als auch durch die Verabreichung in 7-Tagen-Intervallen gehemmt wird.
3 zeigt die Wirkung der wöchentlichen Verabreichung von Fragmin^® (Charge 38609) auf AA im Vergleich zu Heparin-Standard. Lewis-Ratten wurden zwecks Induktion von AA immunisiert. Beginnend an Tag 5 wurde den Ratten in wöchentlichen Intervallen eine 20 μg-Dosis Fragmin^® (•), Heparin (o) oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)-Kontrolle (☐) subkutan eingeimpft. Die Ergebnisse zeigen eine drastische Differenz der Wirksamkeit zwischen Fragmin® und Heparin: Fragmin^® hemmte Arthritis vollständig, während Heparin keine inhibitorische Wirkung aufwies.
Bei täglicher Verabreichung einer 20 μg-Dosis LMWH wurde keine inhibitorische Wirkung auf AA festgestellt, obwohl die inhibitorische Wirkung von Heparin erstaunlicherweise über der von täglich verabreichtem Fragmin^® lag (wie in 4 beschrieben: Fragmin^® (Charge 38609)(•), Heparin (o), PBS-Kontrolle (☐)).
Eine ähnliche inhibitorische Wirkung wurde bei mehreren anderen LMWHs, die zwecks Induktion von AA immunisierten Lewis-Ratten verabreicht wurden, beobachtet. 5 zeigt die Ergebnisse der Injektion einer 20 μg-Dosis Fraxiparin^® täglich (☐); wöchentlich (∎)); Fraxiparine^® (täglich (A); wöchentlich
Lovenox^®/Clexane^® (täglich (•); wöchentlich (o)) und PBS-Kontrolle (x). Alle drei LMWHs unterschiedlicher Art und Quelle zeigten bei wöchentlicher Verabreichung eine deutliche Hemmung von Arthritis, nicht so bei täglicher Verabreichung.
5.8. Behandlung mit LMWH verhindert die Abstoßung von allogenen Transplantaten
Wistar-Ratten wurde ein allogenetisches BN-Herz transplantiert (Ono, K. und Linsay, E. S., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1969) 45:225-229). Ab dem Tag vor der Transplantation wurde den Ratten in 7-Tagen-Intervallen 20 μg Fragmin^® oder PBS-Kontrolle (6, jeweils • oder o) injiziert und die Überlebensrate wurde gewertet. Der Tag der Abstoßung wurde als der Tag festgelegt, an dem das transplantierte Herz zu schlagen aufhörte, was durch Abtasten des Abdomens untersucht wurde. 6 zeigt, dass bei wöchentlich mit einer Dosis LMWH behandelten Ratten die Überlebensrate von allogenen Herztransplantaten größer war.
5.9. Biologische Wirkung von LMWH auf insulinbedingten Diabetes Mellitus (IDDM) bei NOD-Mäusen
Mäuse des NOD-Stranges entwickeln spontan eine Form von Typ-1 insulinbedingtem Diabetes Mellitus (IDDM), das das anerkannte Modell für humanen IDDM ist (Castano, L. und Eisenbarth, G. S., Annu. Rev. Immunol. (1990) 8:647-679). Die Erkrankung beginnt im Alter von 4-5 Wochen durch das Entstehen von Insulitis, der Entzündung der Langerhansschen Inseln. Insulitis schädigt schrittweise die insulinproduzierenden Beta-Zellen, die gegenüber Schädigung durch TNF-α empfindlich sind. Im Alter von ungefähr 4-5 Monaten sind ausreichend viele Beta-Zellen zerstört, sodass Diabetes ausbricht.
Zwecks Untersuchung, ob die Behandlung mit LMWH den IDDM-Vorgang beeinflussen könnte, wurde jeder Maus einer Gruppe von 10 NOD-Mäuseweibchen wöchentlich 5 μg Fragmin^® (Charge 38609) subkutan injiziert, die Dosis wurde so bestimmt, dass sie 12 Einheiten pro kg in Mäusen darstellte. Eine Gruppe von 10 Kontrollmäusen wurde mit Salzlösungs-Injektionen behandelt. Im Alter von 5 Monaten wurden alle Mäuse zur Bestimmung der IDDM-Entwicklung unter Verwendung eines standardmäßigen Verfahrens ausgeblutet (Elias, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1990) 87:1576-1580). 7 zeigt, dass die Kontrollmäuse („keine") anormale Blutglukose aufwiesen (400 mg/dl). Im Gegensatz dazu wiesen mit LMWH behandelte Mäuse eine normale Blutglukose auf (100 mg/dl). Somit konnte die Behandlung mit LMWH bei IDDM tatsächlich Besserung verschaffen.
5.10. LMWH-Behandlung von Allergien
Bei vielen Allergiepatienten induziert intradermale Belastung durch spezifisches Antigen oder Anti-IgE eine unmittelbare Bläschenbildung und Rötung, die 4-8 h später von einer Phase anhaltender Schwellung und Leukozyteninfiltration gefolgt wird, die als Spätphasen-Hautreaktion bezeichnet wird. Ursprünglich wurden Spätphasenreaktionen (LPR)² in der Haut beschrieben (Solley, G. O. et al., J. Clin. Invest. (1976) 58:408-420). Heute steht jedoch fest, dass Spätfolgen von IgE-bedingten Reaktionen, in besonderem Maße einschließlich der Infiltration von Reaktionsstellen mit hämatogenen Leukozyten, auch im Atemtrakt und bei weiteren anatomischen Stellen vorkommen (Lemanski, R. F. und Kaliner, M., in Allergy: Principles and Practice, Vol. 1 (1988), Middeton, Jr., E. et al. (Eds.), S. 224-246). Tatsächlich gibt es stichhaltige Argumente dafür, dass viele der klinisch signifikanten Folgen von IgE-bedingten Reaktionen, sowohl der Haut als auch der Atemwege, eher die Wirkung während der LPR von den an diesen Stellen rekrutierten Leukozyten als die direkte Wirkung von den in kurzen Abständen nach der Antigen-Provokation freigesetzten Mediatoren widerspiegeln (Kay, A. B. J. Allergy Clin. Immunol. (1991) 87:893-910).
Seit kurzem ist weitgehend anerkannt, dass chronische allergische Erkrankungen wie Asthma oder atopische Dermatitis ein Ergebnis eines zugrunde liegenden Entzündungsvorganges sind, die die Infiltration und Aktivierung hauptsächlich von eosinophilen Zellen und T-Zellen einschließen (Kay, A. B. J. Allergy Clin. Immunol. (1991) 87:893-910).
Ein weiterer Ansatz in der Beweisführung besagt, dass die mit LPRs assoziierte Leukozyteninfiltration als ein Ergebnis der Mastzellendegranulation auftritt. Sowohl beim Menschen als auch bei Versuchstieren können Wirkstoffe, die entweder durch IgE oder gewisse andere Mechanismen bedingte kutane Mastzellendegranulation induzieren, auch Infiltration der Reaktionsstellen mit Leukozyten fördern (Solley, G. O. et al., J. Clin. Invest. (1976) 58:408-420; Lemanski, R. F. und Kaliner, M., in Allergy: Principles and Practice, Vol. 1 (1988), Middeton, Jr., E. et al. (Eds.), S. 224-246; Kay, A. B. J. Allergy Clin. Immunol. (1991) 87:893-910). Eine Übersicht an Mediatoren, die mittels aktivierter Mastzellen erhalten werden kann, deckt viele Mediatoren auf, die zur Leukozyteninfiltration in LPRs beitragen, einschließlich sowohl Lipidmediatoren wie LTB₄, LTC₄, LTD₄, PGD₂ und PAF (Blutplättchen-Aktivierungsfaktor) als auch mehrerer Peptide oder proteinartiger chemotaktischer Faktoren (Holgate, S. T. et al., in Allergy: Principles and Practice, Vol. 1 (1988), Middleton, Jr. E. et al. (Eds.), S. 135-178). Letztere Wirkstoffe reichen in ihrer Größe vom Tetrapeptid, „eosinophile chemotaktische Faktoren von Anaphylaxie", bis hin zu sehr hohem Molekulargewicht, „neutrophile chemotaktische Faktoren".
Kürzlich wurden noch mehr mögliche, mit Mastzellen assoziierte Mediatoren von Leukozyteninfiltration identifiziert, einschließlich zu bzw. mit INF-α, IL-α ähnliche oder identische Zytokine und vier Mitglieder der MIP-1 Genfamilie kleiner, sekretierter Peptide (Gordon, J. R. et al, Immunol. Today (1990) 11:458-464). Bei vier dieser Zytokine (TNF-α, IL-1α, MIP-1α und MIP-1β) wurde die Fähigkeit zur Förderung von Leukozyteninfiltration nachgewiesen.
Zu einem weniger weit zurückgelegenen Zeitpunkt (Wershil, B. K. et al., in J. Clin. Invest. (1991) 87:446-453) wurde durch Verwendung von Mäusen mit Mangel an Mastzellen nachgewiesen, dass das Rekrutieren von Leukozyten während der IgE-bedingten LPR mastzellenbedingt ist und dass diese Hemmung durch lokale Verabreichung von anti-TNF-α-Antiserum teilweise blockiert wurde. Heutzutage ist weitgehend anerkannt, dass die Hemmung von mit IgE-bedingten LPR assoziierter zellulärer Infiltration/Aktivierung eine ausschlaggebende therapeutische Methode zur Linderung zahlreicher allergischer Erkrankungen ist (Barnes, P. J. N. Eng. J. Med. (1989) 321:1517-1527).
Überraschenderweise fanden die Anmelder heraus, dass LMWH die Leukozyten-Infiltration während der IgE-bedingten kutanen LPR bei Mäusen, die passive kutane Anaphylaxie (PCA) erfahren, wesentlich hemmt.
Mäusen wurden monoklonale IgE anti DNP Antikörper (~20 ng) intradermal injiziert (in die Ohren). Einen Tag später wurde DNP_30-40-HSA in Salzlösung intravenös injiziert. Die Ohrschwellung wurde durch Messen der Ohrdicke mittels eines Mikrometers vor und in mehreren Intervallen nach der Belastung mit dem DNP-HSA bestimmt. Bei allen Versuchen wurden von den Stellen der PCA-Reaktionen nach der Opferung durch zervikale Dislokation Gewebe erhalten, die auf Bereiche mit Giemsa-Färbung hin untersucht wurden. LMWH wurde einmalig an Tag 2 subkutan injiziert (5 μg/Maus).
Ergebnisse
An Stellen der PCA-Reaktionen stellte sich die Schwellung rasch ein (Δ von 35 × 10^–4 Zoll bei 15 Minuten), nicht jedoch an Kontrollstellen (Ohren, denen nur Verdünnungsmittel injiziert wurde). Die Schwellung der PCA-Stellen ging 2 bis 4 Stunden nach der intravenösen Antigen-Belastung deutlich zurück.
6-8 Stunden nach der intravenösen Antigen-Belastung wurden die PCA- und Kontrollstellen histologisch untersucht. Die Mehrzahl der Mastzellen an PCA-Stellen wies umfassende oder moderate Degranulation auf. Im Gegenzug dazu wiesen weniger als 5 % der Mastzellen an Kontrollstellen deutliche Degranulation auf. Lediglich an PCA-Stellen kam es 6 Stunden nach der Antigen-Belastung zu einer signifikanten neutrophilen Infiltration. Diese Infiltration war bei Mäusen, die zwei Tage zuvor mit LMWH vorbehandelt worden waren, deutlich gemindert (um 60 %). Dieses Medikament hatte keine Wirkung auf das Ausmaß der Mastzellendegranulation. Das Medikament hatte keine Wirkung auf die Gesamtanzahl und die Differenz der Leukozyten im peripheren Blut dieser Tiere. Daraus konnte geschlossen werden, dass LMW-Heparin die mit der IgE-bedingten späten kutanen Reaktion assoziierte zelluläre Infiltration hemmt. Zusätzlich setzten die Erfinder voraus, dass die Verabreichung von LMWH eine günstige Wirkung auf kutane LPR bei Tieren mit aktiver kutaner Anaphylaxie aufweist (spezifische IgE-Produktion wird durch DNP-HSA-Alaun induziert). Vorausgesetzt werden ebenso ähnliche therapeutische Wirkungen auf allergische pulmonale Entzündungen (Tarayre, J. P. et al. Int. J. Immunopharmacol. (1992) 14(5):847-855).
5.11. LMWH-Behandlung von humaner DTH
8 zeigt einen Versuch, bei dem eine 40jährige, 85 kg schwere, männliche, freiwillige Versuchsperson auf DTH-Reaktivität des Tetanus-Antigens untersucht wurde (Merieux Hauttestapplikator). Nach 24 und 48 Stunden wurde eine Induration von 18 mm gemessen. Dem Freiwilligen wurden dann subkutan 3 mg Fragmin^® (Charge 38609) injiziert. Fünf Tage später wurde der Freiwillige auf seine DTH-Reaktion auf Tetanus untersucht und die Induration wurde bei ungefähr 5 mm gehemmt. Drei Wochen später wurde der Freiwillige erneut auf DTH untersucht („Erholung") und der Test zeigte positive Reaktivität (23 mm Induration nach 24 und 48 Stunden). Dann wurde der Freiwillige wie zuvor mit Fragmin^® behandelt und 7 Tage später („7 Tage später") wurde erneut die DTH-Aktivität gemessen. Die Induration wurde wiederum bei ungefähr 5 mm gehemmt. DTH-Erholung wurde 3 Wochen später festgestellt. Somit kann LMWH bei einer Dosis von weniger als 5 mg in Behandlungsintervallen von 5 und 7 Tagen DTH beim Menschen hemmen.
6. Versuche unter Verwendung von LMWH (Fragmin) und anderen Wirkstoffen
6.1. Stabilitätsstudien der inhibitorischen Aktivität von LMWH (Fragmin) auf TNF-α
Fragmin Charge 38609 wurde in normaler Salzlösung auf eine Konzentration von 5 μg/0,1 ml verdünnt. Einige der Phiolen wurden mit einer gleichen Menge an Protaminsulfat (5 μg) gemischt und die Phiolen wurden bei Raumtemperatur (21°C) zwischen 0 und 72 Stunden (Tabelle XI) oder bei 4°C zwischen 1 und 4 Monate (Tabelle XII) gelagert. Das Protaminsulfat enthaltende oder freie Fragmin wurde dann zur in vivo Hemmung der DTH-T-Zellen-Antwort bei BALB/c-wie oben beschrieben verwendet. Bei dem vorliegenden Versuch lag die DTH-Positivkontrolle bei 17,5 ± 1,2 × 10^–2 mm (0 % Hemmung) und die vollständig gehemmte DTH lag bei 2,6 ± 0,5 × 10^–2 mm (100 % Hemmung).
Die Ergebnisse der Inkubation von LMWH bei 20°C werden in Tabelle XI aufgelistet. Aus Tabelle XI geht hervor, dass LMWH nach 72-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur seine inhibitorische Aktivität gegenüber TNF-α-bedingter, T-Zellen mediierter DTH-Reaktion verliert. Im Gegensatz dazu verlieren Heparin und LMWH ihre antikoagulatorische Aktivität bei Raumtemperatur nur langsam.
Tabelle XI. Stabilität von inhibitorischer Aktivität von Fragmin (Charge 38609, 5 μg/0,1 ml) gegenüber DTH-Reaktion, ohne Protaminsulfat, bei 20°C.
6.2. Verlust der Anti-DTH-Reaktivität bei niedriger Temperatur und stabilisierende Wirkung von hinzugefügtem Protamin
Tabelle XII zeigt, dass Fragmin bei 4°C seine Fähigkeit zur Hemmung der DTH-Reaktivität von T-Zellen von Mäusen in verdünnter Lösung innerhalb von 4 Monaten verliert. Das Hinzufügen einer gleichen Konzentration Protaminsulfat führt zu keiner Wechselwirkung mit der Hemmung der DTH-Reaktion, allerdings kann dadurch diese Aktivität nach 4 Monaten bei 4°C aufrecht erhalten werden. Dieses Ergebnis widerspricht erneut der normalen Rolle von zu Heparin oder Fragmin hinzugefügtem Protaminsulfat, dernach das Protaminsulfat die antikoagulatorische Wirkung der Heparinoidsubstanzen neutralisiert.
Tabelle XII. Verlust der Anti-DTH-Reaktivität im Lauf der Zeit bei niedriger Temperatur. Stabilisierende Wirkung von hinzugefügtem Protamin.
6.3. Herstellung von ECM-beschichteten Platten
ECM-beschichtete Wells wurden wie folgt hergestellt. Frisch sezierte Rinderaugen wurden wenige Stunden nach dem Schlachten von einem Schlachthof erhalten. Zwecks Entfernung der Hornhaut wurden die Augen in einem Abzug seziert. Die Hornhaut wurde dann für das Erhalten der Endothelzellen der Hornhaut mit einem Skalpell geritzt oder gekratzt. Diese Zellen wurden auf Gewebskulturplatten mit ungefähr 5 ml von DMEM enthaltendem, mit 10% fötalem Kälberserum, 5 % Kälberserum und Antibiotika wie etwa 1 %igem Streptomycin oder 1 %igem Neostatin ergänztem Medium gemeinsam mit 1 % Glutamin als ein Stabilisator kultiviert. Die Zellen setzten sich ungefähr 2 Tage nach dem Aussäen auf dem Boden der Platten ab, wurden alle vier Tage mit frischen Medien versorgt und bei 37°C in Feuchtinkubatoren mit 5% CO₂ inkubiert. Falls erwünscht können auch einige Fibroblasten-Wachstumsfaktoren dem Medium hinzugefügt werden, obwohl das Hinzufügen von FGF nicht ausschlaggebend ist. Bei Konfluenz der Zellen (ungefähr 2 Wochen später) wurde der Überstand abgesaugt und die Zellen dann mit 1-2 ml Trypsin trypsiniert.
80 % dieser Primärzellen (das weitere Vorgehen bezüglich der verbleibenden 20 % der Primärzellen wird unmittelbar nachfolgend beschrieben) wurden entnommen und auf fünf 96-Well-Flachboden-Platten aufgeteilt. Die Zellen wurden in mit 4 % Dextran T-40, 10 % fötalem Kälberserum und 5 % Kälberserum ergänztem DMEM kultiviert. Nach ungefähr 7 Tagen Inkubation bei 37°C in einem Feuchtinkubator mit 10 % CO₂ wurden die daraus hervorgehenden konfluenten Schichten von Endothelzellen lysiert. Der 0,025 M NH₄OH, der 0,25 % Triton X in PBS enthielt, umfassende Lysierungspuffer blieb 10 Minuten lang auf den Zellen und wurde dann dekantiert. Die Inhalte der Platten wurden dann drei Mal mit auf 4°C abgekühlter PBS gewaschen. Bei dem vorhergehenden Verfahren blieb die fest an dem gesamten Bereich des Wells angebrachte ECM intakt. Die resultierende ECM war frei von Nuklei oder zellulärem Debris. Die ECM-beschichteten Platten können zumindest drei Monate lang bei 4°C gelagert werden.
Die verbleibenden 20 % der Primärzellen blieben auf einer einzigen Platte und wurden wie vorhin beschrieben in ungefähr 5 ml Medium kultiviert, das mit 10 % fötalem Kälberserum, 5 % Kälberserum und Antibiotika ergänztes DMEM umfasst. Diese zweite Menge an Zellen wurde konfluent und wurde wie vorhin beschrieben mit Trypsin behandelt. Die trypsinierten Zellen wurden ein weiteres Mal aufgeteilt, wobei 80 % an fünf Platten in dem 4 % Dextran T-40 enthaltenden Wachstumsmedium und 20 % wie vorhin an einer einzigen Platte kultiviert wurden. Es ist möglich, auf dieser einzelnen Platte ein weiteres Mal eine 80/20-Aufteilung vorzunehmen.
6.4. Abbau von sulfatierten Proteoglykanen
³⁵(S)O₄-markierte ECM wurde mit 5 μl MM5 Heparanase (4 E/ml) in 1 ml PBS und 100 μl 8,2 M Phosphat-Zitrat-Puffer (ph-Wert 6,2) 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde dann gesammelt, bei 10 000 g für 5 min zentrifugiert (optional) und durch Gelfiltration auf Sepharose 4B-Säulen analysiert. 2 ml Fraktionen wurden mit PBS bei einer Flussgeschwindigkeit von 5 ml/h eluiert und unter Verwendung von Bio-Fluor. Szintillationsflüssigket zwecks Radioaktivität gezählt.
Dieser ³⁵(S)O₄-Markierungs-Versuch zeigte, dass die ECM tatsächlich abgebaut wurde, dass die resultierenden Abbauprodukte erfolgreich freigesetzt und des weiteren sachgemäß durch die Sepharose 4B-Säulen gefiltert wurden. Es wurden anschließende, mit dem Abbau von sulfatierten Proteoglykanen in Verbindung stehende Versuche auf nicht markierter ECM durchgeführt, wobei die Abbauprodukte durch ihre Absorption bei 206 oder 232 nm überprüft wurden.
Enzymabbau-Versuche wurden wie oben durchgeführt und die Abbauprodukte (DECM) wurden darüber hinaus durch Laden der abgebauten Proteoglykane, die von den Sepharose-Säulen auf die HLPC-Säulen eluiert wurden, gereinigt. Die HPLC-Analyse der Sepharose-Säulen-Fraktionen wurde in der in Abschnitt 6.11 f. beschriebenen Art und Weise durchgeführt. Die Detektion der Abbauprodukte wurde durch Überprüfen ihrer Absorption bei 206 nm erreicht.
Zusätzliche Enzymabbau-Versuche erzielten unter Verwendung von PC3 Enzym und von IBEX erhältlicher Heparanase ähnliche Ergebnisse.
6.5. Reinigung von humanen CD4⁺ T-Zellen
CD4⁺ T-Zellen wurden aus mononuklearen Leukozyten aus dem peripheren Blut von gesunden humanen Donatoren wie folgt gewonnen. Die mononuklearen Zellen wurden auf einem Ficoll-Gefälle isoliert, in mit 10 % FCS und Antibiotika ergänztem RPMI in Petrischalen gewaschen und bei 37°C in einem Feuchtinkubator mit 10 % CO₂ inkubiert. Nach einer Stunde wurden die nicht adhärierten Zellen entfernt und auf Nylonwolle-Säulen (Fenwall, IL) für 45-60 Minuten bei 37°C in einem Feuchtinkubator mit 10 % CO₂ inkubiert. Nicht adhärierte Zellen wurden eluiert und gewaschen. CD4+ T-Zellen wurden mittels Aussetzen der eluierten Zellen einer Mischung aus den folgenden monoklonalen Antikörpern (mAb) ausselektiert: anti-CD8, CD19 und CD14, gebunden an magnetische Kügelchen (Advanced Magnetics, Cambridge, MA). Ungebundene Zellen wurden wiederhergestellt und ihre Phänotypen untersucht. Die resultierenden gereinigten Zellen waren wie durch FACScan-Analyse bestimmt vorwiegend (> 90 %) CD3⁺CD4⁺.
6.6. Bioassay von TNF-α-Aktivität unter Verwendung von humanen, aus PBLs gewonnenen CD4⁺ T-Zellen
250 000 humane CD4⁺ T-Zellen wurden eineinhalb Stunden lang mit 150 μl ECM-Abbauprodukten bei zahlreichen Konzentrationen bei 37°C unter einer Atmosphäre mit 7 % CO₂ vorinkubiert. Dann wurden zwecks Inkubation in 96-Well-Flachboden-Platten (Costar) 100 μl PHA (Wellcome Co, England, 1 μg/ml) für 3 h hinzugefügt. Anschließend wurden die Inhalte der Wells (3-6 Wells pro experimentelle Gruppe) gesammelt, zentrifugiert und diese Medien wurden wie vorhin in Abschnitt 5.1 beschrieben auf die TNF-α-Sekretion hin untersucht. Kurz gesagt wurden Überstände kultivierter Lymphozyten Kulturen von Mäusefibrosarkomzellklonen (BALB/c.CL7) hinzugefügt. BALB/c.CL7-Zellen sind für das Töten durch TNF-α bei Vorhandensein von Actinomycin D (0,75 μg/ml) empfindlich. Nophar, Y. et al. J. Immunol. (1988) 140(10):3456-3460. Der Tod dieser Zellen bei Vorhandensein der Versuchsmedien wurde im Vergleich zu Titrierungskurven von exogen hinzugefügtem TNF kalibriert. Zellviabilität wird durch zweistündige Inkubation mit MTT Tetrazolium (Sigma, Kat. Nr. M2128), Extrahieren der von den Zellen mit Isoproponal-HCl-Mischung aufgenommenen Farbe und kalometrisches Quantifizieren (bei 570 nm) mittels eines Microelisa Autoreaders bestimmt. TNF-α wurde durch Untersuchen der neutralisierenden Wirkung von Anti-Maus-TNF-α-mAb (1/400 verdünnt, Genzyme, MA) typisiert.
6.7. Abbau von Heparin
1 mg Heparin (Sigma) in 1 ml PBS und 100 μl 25 M Phosphat-Zitrat-Puffer (ph-Wert 6,2) wurde mit 20 μl MM5 (5 E/ml) 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Produkte der Antwort wurden dann mittels Gelfiltration auf Sepharose 4B-Säulen analysiert. 2 ml Fraktionen wurden mit PBS bei einer Flussgeschwindigkeit von 5 ml/h eluiert. Zur weiteren Charakterisierung der Abbauprodukte wurde bei den von der Sepharose-Säule eluierten Peaks HPLC-Trennung unter Verwendung von Toyo Soda-Gel G3000S- und G2000SW-HPLC-Säulen wie in Abschnitt 6.11 f. beschrieben vorgenommen.
Zusätzliche Versuche wurden unter Verwendung von 20 μl PC3 durchgeführt. Die PC3 enzymatische Antwort wurde mit 1 mg Heparin unter denselben Bedingungen wie vorhin für MM5 beschrieben durchgeführt, abgesehen davon, dass die Antwort 24 h anstatt 48 h inkubiert wurde. Die Produkte wurden dann mittels Gelfiltration auf Sepharose 4B-Säulen analysiert (29). Die Ergebnisse des in vitro Bioassays werden in der nachfolgenden Tabelle XIX gezeigt.
6.8. Auslösung der DTH-Reaktion bei Mäusen und Untersuchung der inhibitorischen Wirkungen
BALB/c-Mäuse (zumindest 5 Mäuse pro Gruppe) wurden auf dem rasierten Abdomen mit 3 %igem 4-Ethoymethylen-2-Phenyloxazolon (OX; BDH Chemicals, GB) in topisch angewandtem Aceton/Olivenöl sensitiviert. Fünf Tage später wurde DTH-Sensitivität wie folgt ausgelöst: Mäuse wurden mit 0,5 %igem OX in Aceton/Olivenöl belastet. Das Ohr wurde unmittelbar vor der Belastung und 24 h später mittels eines Mikrometers von Mitutoyo (Japan) gemessen. Die einzelnen Messungen der Ohrschwellung wurden mit der Identität der Gruppen an Mäusen in Verbindung gebracht. Zwecks Wechselwirkung mit DTH-Reaktion wurden die immunregulatorischen, in PBS verdünnten Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht subkutan in den angegebenen Zeitabständen und Konzentrationen in den Rücken der behandelten Mäuse verabreicht. Behandelte Mäuse wurden während und nach (> 2 Monate) der Behandlung untersucht und keine wesentlichen Nebenwirkungen konnten klinisch beobachtet werden.
6.9. Trennung von LMWH (Fragmin) auf Gelpermeationschromatographie-Säule (Sepharose 4B)
Fragmin (Charge 38609) und inaktives Fragmin wurden mittels Gelfiltration auf Sepharose 4B-Säulen (Pharmacia) fraktioniert. 0,5 ml Fraktionen wurden mit PBS bei einer Flussgeschwindigkeit von 5 ml/h eluiert und bei 206 nm auf Absorbanz überprüft. (Bei 280 nm wurde keine Absorbanz erfasst). Auf 11 erscheint in der Graphik ein Vergleich der Fraktionsanzahl mit der Absorption bei 206 nm. Die Ergebnisse der Bioassays für ausgewählte Fraktionen werden in den nachfolgenden Tabellen XIII und XIV angezeigt.
Tabelle XIII. Gesamtwirkung von Fragmin, Sepharose 4B-Fraktionen von Fragmin und einer HPLC-Fraktion einer Sepharose 4B-Fraktion auf die Sekretion von aktivem TNF unter Verwendung von Human-PBL-Bioassay
Tabelle XIV. Gesamtwirkung von Fragmin und Sepharose 4B-Fraktionen von Fragmin auf DTH-Sensitivität von Mäusen.
6.10. Zusätzliche Versuche einschließlich der Fraktionierung von Fragmin und durch Heparanase abgebaute ECM
Fragmin und durch Heparanase abgebaute ECM wurden mittels Gelfiltration auf Sepharose 4B-Säulen fraktioniert. 0,2 ml Fraktionen wurden mit PBS bei einer Flussgeschwindigkeit von 5 ml/h eluiert und bei 206 nm auf Absorbanz überprüft. (Bei 280 nm wurde keine Absorbanz 280 nm erfasst). Auf 14 erscheint in der Graphik ein Vergleich der Fraktionsanzahl mit der Absorption bei 206 nm. Die Ergebnisse der Bioassays für die ausgewählten Fraktionen werden in der nachfolgenden Tabelle XV dargestellt.
Tabelle XV. Wirkung von Sepharose 4B-Fraktionen von Fragmin und DECM auf die Sekretion von aktivem TNF unter Verwendung von Human-PBL-Bioassay
6.11. Trennung von Wirkstoffen von Fragmin unter Verwendung von High Performance Liquid Chromatography
Zwei Versuche wurden unter Verwendung von zwei Reihen an High Performance Liquid Chromatographie-Bedingungen durchgeführt. Die ursprünglich verwendete Säulenart war eine TSK-GEI^® G-Oligo-PW-Säule (30 cm × 7,8 mm I.D.) mit einer Vorsäule (4 cm × 6 mm I.D.). Die Säule wurde mit 0,2 M Phosphatpuffer mit pH-Wert 7,0 bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert. Die Fraktionen wurden jeweils bei 0,5 ml Volumen gesammelt.
Die zweite verwendete HPLC-Art waren Toyo Soda TSK-Gel G3000SW- und G2000SW-Säulen (7,5 mm × 50 cm, in Reihe) mit einer Vorsäule von Phenomenex (7,5 mm × 10 cm). Die Säule wurde bei 1 ml/min mit vorsichtig entgasten 0,5 M NaCl eluiert. Fraktionen wurden jeweils bei 0,5 ml pro Fraktion gesammelt. Der Detektor wurde auf 232 nm mit 0,02 AUFS eingestellt und bei ± 0,1 sec wurden Retentionszeiten gemessen. Die Volumen der flüssigen Phase und das Gesamtvolumen wurden mittels blauem Dextran und Natriumazid gemessen. Die Detektion bei 206 nm wurde bei den Sammlungen auch bei denselben Bedingungen wie bei der 232 nm-Einstellung vorgenommen.
Auf 18 erscheint in der Graphik der Vergleich der Fragmin-HPLC-Fraktionsanzahl mit der Absorption bei 206 nm. Die Ergebnisse der Bioassays für die ausgewählten Fraktionen werden in der nachfolgenden Tabelle XVI angezeigt. Aus den dargestellten Ergebnissen ist ersichtlich, dass gewisse Substanzen die TNF-α-Aktivität hemmen, während andere seine Aktivität steigern können.
Tabelle XVI. Gesamtwirkung und HPLC-Fraktionen von Fragmin auf die Sekretion von aktivem TNF unter Verwendung von Human-PBL-Bioassay
6.12. Trennung von Wirkstoffen von ECM unter Verwendung von High Performance Liquid Chromatographie
Die Trennung von Wirkstoffen von ECM durch High Performance Liquid Chromatographie wurde wie in Abschnitt 6.11 erläutert durchgeführt.
Auf 18B erscheint in der Graphik der Vergleich der ECM-HPLC-Fraktionsanzahl mit der Absorption bei 206 nm. Die Ergebnisse der Bioassays für die ausgewählten Fraktionen werden in der nachfolgenden Tabelle XVII angezeigt. Aus den dargestellten Ergebnissen ist ersichtlich, dass gewisse Substanzen, die bei Heparanase mediiertem Abbau von ECM isoliert werden, die TNF-α-Aktivität hemmen können, während andere seine Aktivität steigern können. Die Ergebnisse zeigen auch, dass gewisse, bei der HPLC-Trennung erhaltene Fraktionen keine Wirkung auf die TNF-Aktivität aufweisen.
Tabelle XVII. Wirkung der DECM HPLC-Fraktionen auf die Sekretion von aktivem TNF unter Verwendung von Human-PBL-Bioassay.
6.13. Quantitativer Carbazol-Zucker-Assay
Kurz gesagt werden 1500 μl Borat-Schwefelsäure-Reagens auf einem Eisbad gekühlt. Die Versuchslösung (250 μl enthaltend 20 μl Uronsäure/ml) wird vorsichtig auf der Oberfläche des Borsäure-Reagens als Schicht aufgebracht und diffundiert 10 Minuten lang. Die Lösungen werden dann gründlich gemischt, 10 Minuten in ein siedendes Bad gegeben und dann auf einem Eisbad gekühlt. Abgekühltes Carbazol (50 μl) wird dann zu der Mischung hinzugefügt, verwirbelt und für 15 Minuten in ein siedendes Bad gegeben. Die Lösung wird dann gekühlt und bei 525 nm die Absorbanz abgelesen. Die Ergebnisse werden mit kalibrierten Lösungen verglichen.
6.14. Isolierung eines Disaccharids aus ECM-Abbauprodukten
Eine Disaccharid-Substanz wurde mittels HPLC aus Endothelial-ECM von Rinder-Hornhaut isoliert, die Heparanase von Säugetieren (MM5) unterzogen worden war.
Genauer gesagt:
Eine ECM-beschichtete Platte wurde mit 20 μl Heparanase von Säugetieren (0,5 mg/ml) in 1 ml PBS Puffer (vorab durch Zitronensäure auf einen pH-Wert von 6,2 eingestellt) 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde dann gesammelt und auf einer Sepharose 4B-Säule angebracht (35 cm × 0,7 cm I.D.). Die mobile Phase war PBS-Puffer bei einer Flussgeschwindigkeit von 5 ml/h. Fraktionen von 2,2 ml wurden gesammelt und bei 206 nm überprüft (19). Eine Probe (100 μl) von Sepharose 4B-Fraktion Nr. 5 (8,8-11 ml Elutionsvolumen) wurde in einer HPLC-Säule injiziert (Toyo Soda TSK-Gel G3000SW-und G2000SW-Säulen (jeweils 7,5 mm × 50 cm) in Reihe mit Vorsäule (7,5 mm × 10 cm) von Phenomenex). Die mobile Phase war 0,5 M NaCl bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/min. 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und bei 206 und 232 nm überprüft (20A und 20B). Peak Nr. 1 (P1) wurde in einem 25 ml Kolben gefriergetrocknet. Die Probe enthält ca. 20 μl Oligosaccharid in 60 mg NaCl (bestimmt mittels des Carbazol-Assays).
Die Probe hat ein Elutionsprofil ähnlich dem eines Standards eines Disaccharids oder Molekulargewicht-„Markers", der im Handel durch Depolymerisation von Heparin (Sigma) erhältlich ist.
Der Inh_max Wert der Substanz, basierend auf ähnlich erhaltenen Proben (siehe beispielsweise Peak F73 in 21A (Elutionszeit ungefähr 44 Minuten) und Eintrag F5/HPLC-F73 in der untenstehenden Tabelle XVIII), wurde in einem in vitro TNF-α-Hemmungs-Assay unter Verwendung humaner PBLs bei einer Konzentration von ungefähr 10 pg/ml als 87 % berechnet. Der Bioassay wurde wie vorhin beschrieben durchgeführt. Diese Probe kann wie nachfolgend beschrieben unter Verwendung einer SAX-HPLC-Säule weiter gereinigt werden.
6.15. Isolierung eines Disaccharids von ECM-Abbauprodukten einschließlich SAX-HPLC-Chromatographie
Eine ECM-beschichtete Platte wurde mit 20 μl Heparanase von Säugetieren (0,5 mg/ml) in 1 ml PBS Puffer (durch Zitronensäure vorab auf einen pH-Wert von 6,2 eingestellt) 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde dann gesammelt und auf einer Sepharose 4B-Säule angebracht (0,7 × 35 cm). Die mobile Phase war PBS-Puffer bei einer Flussgeschwindigkeit bei 5 ml/h. Fraktionen von 1,6 ml wurden gesammelt und bei 206 nm überprüft (22). Fraktionen Nr. 7-8 wurden kombiniert und gefriergetrocknet; das Pulver wurde wieder auf 1/10 des ursprünglichen Volumens suspendiert. Proben (100 μl) wurden wie vorhin in eine HPLC-Säule injiziert (Toyo Soda TSWK Gel G3000SW- und G2000SW-Säulen (jeweils 7,5 mm × 50 cm), in Reihe mit Vorsäule (7,5 mm × 10 cm) von Phenomenex verbunden). Die mobile Phase war 0,5 M NaCl bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/min. 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und bei 206 und 232 nm überprüft (23). Der mit „1" markierte Peak wurde bei zehn identischen Durchläufen gesammelt. Die im Wesentlichen homogenen Fraktionen wurden kombiniert und gefriergetrocknet.
Das Material wurde in 2 ml zweifach deionisiertem Wasser resuspendiert und auf einer bei 1,6 ml/min mit zweifach deionisiertem (DD) Wasser eluierten Sephadex G-10-Säule (26 × 150 mm) entsalzt. 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und bei 232 nm und auf Leitfähigkeit überprüft (zur Bestimmung des NaCl-Inhalts). Entsalzte Fraktionen wurden kombiniert, gefriergetrocknet und in 1 ml DD H₂O resuspendiert. 1 ml einer durch das Kombinieren von 100 μl der resuspendierten Lösung und 900 μl 0,2 M NaCl bei einem ph-Wert von 3,5 hergestellten Probe wurde in eine analytische SAX-HPLC-Säule injiziert (4,6 × 250 mm, gepackt mit Spherisorb, Teilchengröße 5 μm). Die Flussgeschwindigkeit lag bei 1,5 ml/min und ein Programm für lineares Gefälle von NaCl wurde wie folgt verwendet:
Der Eluent der Säule wurde bei 232 nm überprüft (24) und Peak A23/4 wurde gesammelt und auf TNF-Hemmung untersucht. Es wurde festgestellt, dass der Inh_max für diese SAX-HPLC-Fraktion bei einer Konzentration von 0,1 pg/ml bei 60 % lag, was einen „R"-Wert von 600 % × (pg/ml)^–1 ergibt.
Bei identischen Bedingungen wurden Heparindisaccharid-Standards mit unterschiedlichen Sulfatierungsgraden in SAX-HPLC-Säulen injiziert. Die Elutionsprofile dieser Standards werden in 25A–C dargestellt. Wie aus diesen Figuren ersichtlich, ergaben die Disaccharid-Standards unterschiedliche Retentionszeiten, wobei ein nicht-sulfatiertes Disaccharid (Sigma Produktnr. H-0895) am schnellsten eluierte (25A), ein disulfatiertes Disaccharid (Sigma Produktnr. H-1020) in weniger als 20 Minuten eluierte (25B) und ein trisulfatiertes Disaccharid (Sigma Produktnr. 9267) am langsamsten eluierte (25C). Der trisulfatierte Disaccharid-Standard H-9267 ergab eine Retentionszeit, die der für Peak A23/4 erhaltenen Zeit sehr ähnlich war (d.h. 23,07 min bzw. 23,10 min).
6.16. Ergebnisse von In Vitro Human-PBL-Bioassays für zahlreiche Substanzen
Tabelle XVIII stellt die Ergebnisse der in vitro Bioassays unter Verwendung humaner PBLs für zahlreiche Wirkstoffe und Ausgangs-„Mischungen" für die aus dem ECM-Abbau erhaltenen Produkte, einschließlich einem Peak „P1" aus 20, dar. Allerdings wies P1 einen „R"-Wert von 10 % × (pg/ml)^–1 auf, die Ausgangs-DECM-„Brühe" ergab einen „R"-Wert von 0,000053 % × (pg/ml)^–1.
Tabelle XVIII. Wirkung von ECM + MM5 Heparanase (DECM-„Brühe"), Sepharose 4B-Fraktionen der „Brühe" und HPLC-Fraktionen von Sepharose 4B-Fraktionen auf die Sekretion von aktivem TNF unter Verwendung von Human-PBL- Bioassay
6.17. Isolierung eines Oligosaccharids aus Heparin-Abbauprodukten
In einer in zu der oben beschriebenen Art ähnlichen Art wurde zwecks Abbau von ECM intaktes Heparin mit aus zahlreichen Quellen gewonnenen, hierin als MM5 und PC3 bezeichneten Heparanase-Enzymen, behandelt (siehe Shoseyov, O. et al., Biochem., Biophys. RES. COMM. (1990) 169:667-672, zur Herstellung von PC3-Enzymen). Einige der Ausgangs-Abbaumischungen wurden auf Sepharose 4B getrennt (Siehe 26 für Heparin + MM5 Sepharose 4B-Fraktionen F7 und F8 und 27 für Sepharose 4B Chromatographie von Heparin + PC3 und PC3 allein). Noch weitere Fraktionen wurden ferner durch die oben beschriebenen HPLC-II-Verfahren getrennt (Siehe 28A und 28B für die Fraktionen F7/HPLC-F86, -F84 und -F90). „Intaktes" Heparin und Fragmin wurden auch direkten HPLC-II-Bedingungen unterworfen und Fraktionen wurden gleichermaßen isoliert (HPLC-F90 von Fragmin wird in 29 dargestellt). Die Ergebnisse der in vitro Bioassays unter Verwendung von Human-PBLs für zahlreiche Wirkstoffe und Ausgangs-„Mischungen" werden in Tabelle XIX dargestellt, einschließlich der aus dem Abbau von Heparin erhaltenen Produkte.
Tabelle XIX. Wirkung von intaktem Heparin, Heparin + MM5 oder PC3-„Brühen" und ausgewählten Sepharose 4B und HPLC-Fraktionen derselben auf die Sekretion von aktivem TNF unter Verwendung von Human-PBL-Bioassay.
6.18. Ergebnisse der in vivo DTH-Reaktivität bei mit zahlreichen Substanzen behandelten Mäusen
Eine Vielzahl von Substanzen wurde bei in vivo Bioassay-Bedingungen untersucht und es wurde herausgefunden, dass die Hemmung der experimentellen DTH-Sensitivität von Mäusen abhängig vom Reinigungsgrad unterschiedliche Ausmaße annehmen kann. Die Mäuse wurden wie vorhin in Abschnitt 5.1 und 5.2 beschrieben mit einem Wirkstoff behandelt. Im Allgemeinen weisen die Substanzen, die durch High Pressure Liquid Chromatographie bis auf wesentliche Homogenität gereinigt wurden, „R"-Werte im 10 000er-Bereich auf. Die Ergebnisse einer Gruppe von Versuchen werden in Tabelle XX dargestellt.
Tabelle XX. Wöchentliche Behandlung von Mäusen mit unterschiedlichen Substanzen und deren Wirkung auf die DTH-Sensitivität der Mäuse
Wie ebenfalls in Tabelle XX vermerkt, wiesen intaktes Heparin und die Ausgangs-„Brühe" aus ECM + MM5 keine in vivo Wirkung auf. Im letzteren Fall wurde vermutlich aufgrund der sich aufhebenden Wirkungen von inhibitorischen und steigernden Bestandteilen keine Wirkung erzielt. Eine frische Probe Fragmin (Charge 38609) wies einen moderaten „R"-Wert auf, der mit bei früheren Versuchen erhaltenen Werten vergleichbar war. Eine Sepharose 4B-Fraktion wies einen leicht geringeren „R"-Wert als die entsprechenden, bei HPLC-II-Bedingungen erhaltenen Fraktionen auf.
Die Ergebnisse einer weiteren, in Tabelle XXI aufgelisteten Versuchsreihe bestätigte das Fehlen jeglicher Wirkung der Ausgangs-„Brühe" aus ECM + MM5. Insbesondere eine HPLC-II-Fraktion, Nr. F5/HPLC-L22, mit sehr hoher spezifischer regulatorischer Aktivität bei subkutaner Injektion bei Mäusen („R"-Wert = 454,545 % × (μg/g)^–1) zeigte orale Aktivität bei einer höheren Dosis („R") + 5,000 % × (μg/g)^–1. Aus Tabelle XXI geht auch hervor, dass aus der ECM isolierte Wirkstoffe in vivo höhere, spezifische, regulatorische Aktivität aufweisen als jene, die aus Fragmin erhalten wurden. Folglich mindert die evidente Desulfatierung die spezifische inhibitorische Aktivität der Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung. Bei in vitro Bioassay-Bedingungen werden tatsächlich steigernde „R"-Werte für solche „desulfatierten" Disaccharide erhalten. Weitere Versuche haben außerdem gezeigt, dass Galactosamin, ein Monosaccharid oder einfacher Zucker ohne Sulfatgruppen, als Antagonist der inhibitorischen Aktivität der sulfatierten Oligosaccharide der vorliegenden Erfindung wirken kann. Somit ist es auch möglich, dass die sulfatierten Oligosaccharide als direkt steigernde Bestandteile oder als Antagonisten der spezifischen inhibitorischen Aktivität der carboxylierten und/oder sulfatierten Oligosaccharide wirken. Die Beobachtungen der Forscher stimmen auch mit einem Mechanismus überein, aufgrund dessen gewisse Substanzen (zum Beispiel ein trisulfatiertes Disaccharid) als Agonist eines noch nicht identifizierten natürlichen Inhibitors der Sekretion von aktivem TNF-α wirken.
Tabelle XXI. In vivo DTH-Reaktivitätsdaten von subkutan mit zahlreichen Substanzen behandelten Mäusen
6.19. Vergleich der in vivo Aktivität von SAX-HPLC-Fraktionen zu jener von bekannten Disaccharid-Markern
Zwei Disaccharid-Marker wurden bei in vivo Bedingungen zwecks Bestimmung ihrer Fähigkeit zur Hemmung der relativen DTH-Reaktivität von Mäusen untersucht. Wie in Tabelle XXII gezeigt, wiesen die zwei Marker (H-1020 und H-9267) bei subkutaner Injektion bei Mäusen moderate Aktivität bei „R"-Werten zwischen 140 000-160 000 % × (μg/g)^–1 auf. Der Marker H-1020 wurde oral untersucht und seine moderate Aktivität („R"-Wert = 532 % × (μg/g)^–1 wurde entdeckt. Der H1020-Marker ist ein O,N-Disulfat, während der H-9267-Marker ein O,O,N-Trisulfat ist. Ihre Strukturen sind nachfolgend abgebildet.
Wie in Tabelle XXII dargestellt, wies die SAX-HPLC-Fraktion L22/SAX-A23/4 (24) weitere Verbesserungen über die bereits hohe spezifische regulatorische Wirkung von F5/HPLC-L22 hinaus auf, was zu einem „R"-Wert von 630 303 % × (μg/g)^–1 im Vergleich zu einem „R"-Wert von 454 545 % × (μg/g)^–1 für F5/HPLC-L22 (Tabelle XXI) führte. Es wurde jedoch entdeckt, dass diese Disaccharid-Substanz, dessen Retentionszeit durch die SAX-HPLC-Säule mit der Retentionszeit von H-9267 nahezu identisch ist, bei einem pH-Wert von 3,5 bei Raumtemperatur innerhalb weniger Tage seine Sulfatgruppen verliert. Somit zeigte eine neuerliche Analyse einer gealterten Probe mittels einer SAX-HPLC-Säule, dass der ursprüngliche Peak bei 23,10 min drei größeren Peaks Platz gemacht hatte, die in 30 als 2039/1, 2039/2 und 2039/3 bezeichnet werden und deren aller Retentionszeit kürzer als die bei A23/4 ist. Peak 2039/3 mit einer Retentionszeit ähnlich der des H-1020 Markers hat vermutlich eine N-Sulfatgruppe verloren. Die Peaks 2039/1 und 2039/2 entsprechen vermutlich monosulfatierten oder vollständig desulfatierten Disacchariden. (Ihre Retentionszeiten sind mit denen eines Disaccharid-Markers, H-0895, einem N-Acetylglucosaminglycan ohne Sulfatgruppen vergleichbar.)
Diese „sulfatierten" Substanzen wurden jeweils gesammelt und bei in vivo DTH-Bioassay-Bedingungen untersucht und überraschenderweise wurde eine nur moderate oder gar keine inhibitorische Aktivität festgestellt. (Siehe Tabelle XXII). Bei dem in vitro Human-PBL-Assay wiesen tatsächlich alle drei Peaks eine Steigerung der Sekretion von aktivem TNF-α auf. Diese in vitro Ergebnisse werden unmittelbar nachfolgend angeführt:
Tabelle XXII. Zusätzliche in vivo Ergebnisse unter Verwendung einer Vielzahl von subkutan verabreichten Disacchariden
6.19.1. Weitere Ergebnisse der Fähigkeit ausgewählter Disaccharide zur Regulation von in vivo Produktion von aktivem TNF-α
Es wurden zusätzliche Versuche durchgeführt, bei denen ausgewählte, im Handel von Sigma Chemical Co. erhältliche und hierin durch ihre entsprechenden Sigma-Katalognummern bezeichnete Disaccharidmoleküle auf ihre Fähigkeit zur Hemmung oder Steigerung der experimentellen DTH-Reaktion bei Mäusen und somit auf eine Indikation für ihre Fähigkeit zur Regulation der Produktion von aktivem TNF-α dieser Säugetiere untersucht.
Insbesondere CD1-Mäuse (erhältlich von dem Tierzuchtzentrum des Weizmann-Instituts, Rehovat, Israel), 4-12 Mäuse pro Gruppe, wurden wie in Abschnitt 5.2 oder 6.8 beschrieben behandelt.
Die Ergebnisse der zahlreichen Versuche werden in der nachfolgenden Tabelle XXIIIA zusammengefasst. Es ist ersichtlich, dass vier der elf untersuchten Disaccharide eine inhibitorische Wirkung auf die Schwellung der Mäuseohren als Antwort auf das verabreichte Oxazolon aufwiesen. Die Hemmung der von T-Zellen mediierten Entzündungsreaktion wird somit als ein Hinweis darauf angesehen, dass die Disaccharide mit einem „R"-Wert ungleich 0 die Produktion von aktivem TNF-α herunterregulieren können. Aus den in der Tabelle aufgelisteten Ergebnissen ergibt sich, dass die „R"-Werte von relativ moderaten 65 000 % × (μg/g)^–1 bis über ungefähr 1 500 000 % × (μg/g)^–1 reichen. Besonderes Augenmerk sei darauf gelegt, dass ein hoher „R"-Wert nicht zwingend das am meisten erwünschte Kennzeichen der aktiven Bestandteile von Interesse ist. Insbesondere das Dosis-„Fenster", in dem ein besonderer Bestandteil physiologische Wirkung aufweist, sollte so breit als möglich sein, sodass die Wahrscheinlichkeit, mit der eine verabreichte Dosis außerhalb des wirksamen Dosisbereichs fällt, so gering als möglich gehalten wird. Wie in den Fußnoten der Tabelle XXIIIA angegeben, scheint das Molekül H-9392 mit 0,000132-0,004 μg/g das breiteste Dosisfenster der untersuchten Bestandteile aufzuweisen.
Aus den Ergebnissen ist ebenso die überraschende Fähigkeit eines der elf untersuchten Disaccharide zur Steigerung der durch die experimentelle DTH-T-Zellen-Antwort verursachten Schwellung ersichtlich. Die Verbindung H-0895, die keine Sulfatgruppen aufweist, zeigt eine enorme Wirkung auf den Grad der Schwellung bei der sehr geringen Dosis von ungefähr 1,2 Pikogramm Disaccharid pro Gramm Maus. Der resultierende „R"-Wert von ungefähr 76 700 000 % × (μg/g)^–1 bleibt bisher unerreicht.
TABELLE XXIIIA. Zusätzliche in vivo Ergebnisse unter Verwendung einer Vielzahl von subkutan verabreichten Disaccharid-Markern
Nachfolgend wird die Struktur von vier inhibitorischen Disaccharidverbindungen, H-9392, H-9517, H-1020 und H-9267, dargestellt.
Inhibitoren
Sechs der elf untersuchten Disaccharide konnten wiesen keine beständige Wirkung auf und konnten somit als „neutral" klassifiziert werden. Nachfolgend wird die Struktur dieser neutralen Verbindungen dargestellt.
Eines der elf Disaccharide steigerte die Wirkungen auf die experimentelle DTH-Reaktion. Diese Verbindung H-0895 weist nachfolgend dargestellte Struktur auf.
Es ist somit möglich, eine allgemeine Formel vorzuschlagen, die die strukturellen Kennzeichen der inhibitorischen Verbindung eingliedert. Nachfolgend wird diese allgemeine Formel (H-GENUS) gezeigt:
worin X₁ für Hoder SO^3– steht; X₂ für H oder SO^3– steht; und X₃ für SO^3– oder CONCH₃ steht, vorausgesetzt, dass, wenn X₃ für SO^3– steht, zumindest eines von X₁ oder X₂ für SO^3– steht und dass, wenn X₃ für CONCH₃ steht, sowohl X₁ als auch X₂ für SO^3– stehen. Bezüglich einer Verbindung mit einem ziemlich breiten Fenster wirksamer Dosierungen ist X₁ bevorzugt SO^3–, X₂ bevorzugt H und X₃ bevorzugt SO^3– (d.h. H-9392 weist das breiteste Fenster wirksamer inhibitorischer Dosierungen auf).
Aus den oben dargestellten Ergebnissen ist auch ersichtlich, dass im Hinblick auf die Hemmung der bevorzugte Substituent am Glucosamin-Stickstoffsulfat ist. Bei einem Sulfat an der 2-N-Position von Glucosamin (X₃) wird inhibitorische Aktivität bei Vorhandensein von nur einem weiteren Sulfat entweder an der 2-Position des Iduronsäurerestes oder der 6-Position des Glucosamins beobachtet. Das Vorhandensein zwei weiterer Sulfate an beiden Hydroxylpositionen könnte ebenfalls funktionieren, doch das Fehlen jeglichen zusätzlichen Sulfats (wie bei H-1145) produziert eine „neutrale" Verbindung.
Im Gegensatz dazu erfordert die Einführung einer Acetylgruppe an der 2-N-Position von Glucosamin das Vorhandensein von zwei zusätzlichen Sulfaten, jeweils für die 2-Position der Iduronsäure (X₁) und die 6-Position des Glucosamins (X₂). Das Fehlen eines Substituenten an der 2-N-Position des Glucosamins, das eine positiv geladene Ammoniumgruppe bedingt, hebt tatsächlich jegliche inhibitorische Wirkung auf, wie dies durch die Tatsache, dass alle Versuchsverbindungen H-9017, H-8892 und H-9142 „neutral" waren, verdeutlicht wird. Das Vorhandensein von einer oder zwei Sulfatgruppe/n an der 2-Position der Iduronsäure oder an der 6-Position des Glucosamins wies keine evidente Wirkung auf.
Schließlich bedingt das Vorhandensein einer Acetylgruppe bei X₃ in Kombination mit dem Fehlen der Sulfatgruppen bei X₁ und X₂ eine gesteigerte regulatorische Aktivität (H-0895).
Die starke Korrelation zwischen den negativen Ladungen in dem Disaccharid und seiner Fähigkeit zur Hemmung der TNF-α-Produktion sollte beachtet werden. Das Vorhandensein des positiv geladenen Ammonium-Substituenten erzeugt „Neutralität", wobei die ladungsneutrale Verbindung H-0895 die Produktion von aktivem TNF-α steigert.
TABELLE XXIIIB. Empirische, aus den Ergebnissen von in vivo DTH-Studien einschließlich im Handel erhältlicher Disaccharide stammende Regeln
6.19.2. Ergebnisse der Fähigkeit ausgewählter Monosaccharide zur Regulation der in vivo Produktion von aktivem TNF-α.
Zusätzliche Versuche wurden durchgeführt, in denen ausgewählte, im Handel von Sigma erhältliche Monosaccharide auf ihre Fähigkeit zur Regulation der in vivo Produktion von aktivem TNF-α untersucht wurden. Unter Verwendung des im Wesentlichen selben Vorgangs wie in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben, wurden CD1-Mäuse, jeweils 6 in einer Gruppe, inokuliert und mit einer Vielzahl von Kontroll- und Versuchssubstanzen behandelt, um die Wirkung, falls vorhanden, der subkutan injizierten Substanzen auf die experimentelle DTH-Reaktion der Versuchstiere zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Versuche werden in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.
TABELLE XXIIIC. Zusätzliche in vivo Ergebnisse unter Verwendung einer Vielzahl von subkutan verabreichten Monosacchariden
Die Stereochemie der Hydroxylgruppe an der 4-Position des Monosaccharids bestimmt, ob der Zucker Glucosamin (α-Orientierung) oder Galactosamin (β-Orientierung) wie nachfolgend angegeben ist.
Somit stellt sich heraus, dass N-Acetylierung oder das Vorhandensein von einem Sulfat in dem Monosaccharid die Fähigkeit von Glucosamin zur Hemmung der DTH-Reaktion in Mäusen beeinflusst.
6.19.3. Behandlung von Adjuvans-Arthritis (AA) bei Ratten mit ausgewählten Monosacchariden und Disacchariden
AA wurde wie vorhin in Abschnitt 5.7 beschrieben bei 6-8 Wochen alten Lewis-Rattenweibchen induziert. Gruppen von Ratten mit jeweils 5-10 Ratten pro Gruppe wurden einen Tag vor der Induktion der experimentellen Arthritis mittels subkutaner Injektion einer Versuchssubstanz behandelt und danach in wöchentlichen Abständen wiederholten Behandlungen unterzogen. Die Wirkung, falls vorhanden, wurde wie in Abschnitt 5.7 beschrieben gewertet.
Von den drei untersuchten Disacchariden zeigte H-9392 die stärkste Wirkung bei der Senkung des AA-Wertes im Vergleich zu den Kontrollgruppen von Ratten, die nur Salzlösung (0,1 ml) erhielten. Wie in 38 dargestellt, unterdrückte die Verabreichung von 120 ng/Ratte oder 0,6 ng/g Ratte von H-9392 24 Tage nach der Induktion die zerstörerische Entzündung von AA nahezu vollständig (um bis zu ungefähr 90 %) und H-1020 hemmte die Entstehung von AA um ungefähr 30 % im Vergleich zur Kontrolle an Tag 24. Im Gegensatz dazu zeigte der Augmentor H-8095 bei zwei Dosierungsniveaus, 0,1 und 0,4 ng/Ratte, ein erhöhtes Niveau von AA-Entwicklung innerhalb von ungefähr 2 Wochen nach der Induktion. Diese Wirkung nahm jedoch kurz darauf schnell ab, bis sich an Tag 24 der AA-Wert im Wesentlichen nicht mehr von dem der Kontrollniveaus unterschied. (Siehe 38A.)
Allerdings wurde herausgefunden, dass gewisse Monosaccharide bei diesem Rattenmodell in vivo inhibitorische Wirkungen aufwiesen. Wie in 38B gezeigt, hemmt die Behandlung mit Glucosamin bei drei Dosierungsniveaus die Entwicklung von AA um ungefähr 60-80 % der Kontrollniveaus. Galactosamin weist ebenfalls inhibitorische Wirkungen auf, allerdings in einem deutlich geringeren Ausmaße als die von Glucosamin aufgewiesenen Wirkungen. (Siehe 38C.)
Interessanterweise haben weitere, mit H-9392 durchgeführte Versuche, in denen das Disaccharid entweder wöchentlich oder täglich beginnend bei Tag 0 (Start der Induktion von AA) oder bei Tag 12 (die Ratte leidet bereits an AA) verabreicht wurde, in allen Fällen positive Unterdrückung der Schwere von AA gezeigt. Die Ergebnisse dieser Versuche werden in den 38D (wöchentlich) und 38E (täglich) dargestellt. Wie in 38D angegeben, ist die wöchentliche Verabreichung von H-9392 beginnend an Tag 12, das heißt sogar wenn die Ratte bereits an AA leidet, zumindest genau so wirksam wie die wöchentliche Behandlung mit Beginn der Induktion (Tag 0) im Vergleich zur Kontrolle. 38E zeigt, dass die tägliche Behandlung von Ratten mit manifestierter Arthritis sogar bei Senkung des AA-Werts im Vergleich zur Kontrollgruppe immer noch hochwirksam war, während die tägliche Behandlung erkrankter Ratten nicht so wirksam wie die tägliche Behandlung beginnend beim Beginn der Induktion war.
Diese Ergebnisse zeigen auf drastische Art und Weise, dass die Substanzen der vorliegenden Erfindung nicht nur bei der Vorbeugung der Entstehung schwerer Arthritis, sondern auch bei der Behandlung manifestierter Arthritis wirksam sind. Darüber hinaus zeigt die vorliegende Arbeit auch, dass die Disaccharide der vorliegenden Erfindung bei wöchentlicher oder täglicher Verabreichung zweckmäßige inhibitorische Aktivität aufweisen können, während die vorhin beschriebenen LMWHs nur bei wöchentlicher Verabreichung inhibitorische Kennzeichen aufweisen.
Als eine weitere Veranschaulichung der Überlegenheit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von experimentell induzierter AA wurde eine gesonderte, vergleichende Versuchsreihe durchgeführt, in denen Lewis-Ratten (5 Ratten pro Gruppe) entweder Dexamethason Phosphat (ein bekannter entzündungshemmender, von Sigma erhältlicher Wirkstoff) oder das Disaccharid 9392 subkutan injiziert wurde. Die Behandlungen begannen 12 Tage nach der Induktion der Adjuvans-Arthritis (AA)-Erkrankung und bestanden aus zwei Behandlungsschemata: Die erste bezog das tägliche Injizieren des bekannten entzündungshemmenden Wirkstoffs ein, die zweite das wöchentliche Injizieren des bekannten entzündungshemmenden Wirkstoffes oder des Disaccharids. In allen Fällen wurden jeder Ratte 100 μg des bekannten entzündungshemmenden Wirkstoffs in 0,1 ml Phosphatpufferlösung verabreicht, während 120 ng des Disaccharids, ebenfalls in 0,1 ml Phosphatpufferlösung, jeder Ratte verabreicht wurden. Als Kontrolle wurde einer Gruppe von Ratten lediglich 0,1 ml Phosphatpufterlösung injiziert. Bei dem Schema mit täglicher Dosis des bekannten entzündungshemmenden Wirkstoffs endete die Behandlung 17 Tage nach der Induktion und bei dem Schema mit wöchentlicher Dosis des bekannten entzündungshemmenden Wirkstoffs oder Disaccharids endete die Behandlung 26 Tage nach der Induktion.
Die Ergebnisse der obigen Versuche werden in den 38F und 38G veranschaulicht. Aus 38F geht hervor, dass während ungefähr der ersten Woche der Behandlung die wöchentliche Verabreichung des Disaccharids 9392 beim Vergleich mit der täglichen Verabreichung von Dexamethason Phosphat gut abschneidet. Es sei jedoch angemerkt, dass nach dem Ende der Behandlung (nach Tag 26) die Gruppe von Ratten, die täglich Dexamethason Phosphat erhielten, einen Rückfall erlitt, während sich der Zustand der Disaccharidgruppe weiterhin verbesserte. 30 Tage nach der Induktion von AA ging es der Disaccharidgruppe besser als der Dexamethason-Phosphat-Gruppe.
Darüber hinaus zeigt wie in 38G dargestellt der Vergleich der Wirksamkeit des täglich verabreichten Dexamethason Phosphats mit der des wöchentlich verabreichten Disaccharids 9392, dass an Tag 30 nach der Induktion von AA die wöchentliche Verabreichung von Dexamethason Phosphat zu einer moderaten Abnahme der Schwere des AA-Werts führte. Im Gegensatz dazu bedingte die wöchentliche Verabreichung von Disaccharid 9392 30 Tage nach der Induktion von AA eine nahezu vollständige Unterdrückung der experimentell induzierten Adjuvans-Arthritis. Wiederum sei angemerkt, dass nach dem Ende der wöchentlichen Behandlung mit Dexamethason Phosphat die Ratte einen Rückfall der Adjuvans-Arthritis erlitt. Wie vorhin angemerkt verbesserte sich jedoch sogar nach dem Ende der Verabreichung von dem Disaccharid der Zustand der mit dem Disaccharid 9392 behandelten Ratten.
Somit ist die wöchentliche Verabreichung des Disaccharids 9392 nachweisbar der täglichen oder wöchentlichen langfristigen Verabreichung von Dexamethason Phosphat überlegen. Die mit dem Disaccharid behandelten Ratten zeigten weiterhin verbesserte AA-Werte als Zeichen einer Hemmung der Erkrankung über die Behandlung hinaus, während die in täglichen oder wöchentlichen Abständen mit Dexamethason Phosphat behandelten Ratten nach dem Ende der Behandlung einen Rückfall der Erkrankung erlitten.
6.19.4. Ergebnisse der Versuche zu der Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten Entzündung der Hornhaut bei Ratten

LPS-induzierte Entzündungen der Hornhaut hängen von TNF ab, wie dies Vanderhagen C. und Mitarbeiter in den Niederlanden in den zur Veröffentlichung vorgelegten Arbeiten „Kinetics of Intraocular TNF and IL-6 in Endotoxin-Induced Uveitis in the Rat" zeigen. Unter Verwendung einer 30-Gauge-Nadel wurde LPS (5 ng) in die Hornhaut von Lewis-Ratten injiziert. Nach einem Tag wurden separaten Gruppen von jeweils zwei Ratten pro Gruppe (oder von 4 Augen pro Gruppe) subkutan phosphatgepufferte Salzlösung (0,05 ml) oder H-1020 (bei einer Dosis von entweder 50 ng/Ratte oder 200 ng/Ratte) injiziert. Die Wirkungen wurden, falls vorhanden, wie folgt gewertet:

Ödem	0-3 Punkte
Gefäßneubildung	0-3 Punkte
Rötung	1/0 Punkte
Schwellung	1/0 Punkte
Hämorraghie	1/0 Punkte
Miose	1/0 Punkte
Synechia	1/0 Punkte (Adhäsion der Iris an Linse oder Hornhaut)
Hypopyon	1/0 Punkte (Eiter oder Blut in der vorderen Augenkammer)
Hornhauttrübung	1/0 Punkte

wobei die Summe der Punkte als Gesamtwert verwendet wird.

Wie anhand der graphischen Darstellung der Ergebnisse (39) ersichtlich ist, war die Dosis von 50 ng/Ratte bei der Unterdrückung der Wirkungen der lokal LPS-induzierten Entzündung im Vergleich zur Kontrolle wirksam. Interessanterweise konnte eine Dosis von 200 ng/Ratte keine signifikante Wirkung liefern.
6.19.5. Ergebnisse der Versuche zu der Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten Uveitis bei Ratten
Uveitis ist die Entzündung der vorderen Augenkammer als Reaktion auf systemisch verabreichtes LPS. Wie die im vorherigen Abschnitt durch lokale Verabreichung von LPS hervorgerufene Entzündung ist Uveitis TNF-bedingt. Bei dem vorliegenden Versuch werden Gruppen von 8 bis 10 Wochen alten Lewis-Ratten (8 Augen pro Gruppe) an Tag 1 entweder mit H-9392 (in einer Dosis von 32 ng/Ratte oder 500 ng/Ratte) oder Salzlösung (0,1 ml) behandelt. An Tag 2 wurden in jede Fußsohle 2 mg/ml Lösung von LPS (50 μl) injiziert; jede Ratte erhielt insgesamt 200 μg LPS. An Tag 3 wurde jedes Auge punktiert und die Gesamtkonzentration des Proteins wurde als quantitativer Assay des Entzündungsgrades gemessen. Die Ergebnisse dieser Versuche werden unmittelbar nachfolgend bereitgestellt.
Folglich unterdrückte eine einmalige Verabreichung von H-9392 in beiden Dosierungen die durch die systemische Verabreichung von LPS in der Ratte hervorgerufene Entzündung im Vergleich zur Kontrolle um mehr als ungefähr 70 %.
6.19.6. Ergebnisse von Versuchen zu der radioprotektiven Wirkung ausgewählter Substanzen
Gruppen von 8 Wochen alten BALB/c-Mäuseweibchen, 5-10 Mäuse pro Gruppe, wurde einen Tag vor der Bestrahlung subkutan entweder Salzlösung (0,1 ml, Kontrolle), H-9392 (30 ng/Maus) oder Glucosamin (10 000 ng/Maus) und nachfolgend in wöchentlichen Abständen bis zum Ende des Versuchs an Tag 30 injiziert. Alle Mäuse wurden mit einer Dosis von 700 rd unter Verwendung einer ⁶⁰Co-Gamma-Strahlungsquelle bestrahlt.
Die Mortalität innerhalb der unterschiedlichen Gruppen von Mäusen wurde dann über einen Zeitraum von 30 Tagen gewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass an Tag 30 die Mäuse, die nur Salzlösung erhalten hatten, eine Mortalitätsrate von 100 aufwiesen, während die mit H-9392 vorbehandelten Mäuse in demselben Zeitraum eine Mortalitätsrate von lediglich 40 % aufwiesen. Die Gruppe der Mäuse, der Glucosamin injiziert worden war, ging es besser als der Kontrollgruppe und sie wies zudem in demselben Zeitraum eine Mortalitätsrate von 20 % auf.
Somit konnten aufgrund der Vorbehandlung mit den Versuchssubstanzen der vorliegenden Erfindung Mäuse eine Strahlungsschema überleben, die normalerweise innerhalb von 30 Tagen bei der Gruppe zu einer Mortalitätsrate von 100 % geführt hätte.
In einem separaten Versuch wurden Gruppen von BALB/c-Mäusen (5 Mäuse in einer Gruppe) gleichermaßen 750 rd Gamma-Strahlen ausgesetzt, mit der Ausnahme, dass diese Gruppen an Mäusen jeweils am Tag vor der Bestrahlung, am sechsten Tag nach der Bestrahlung und erneut am dreizehnten Tag nach der Bestrahlung mit den Versuchssubstanzen (0,1 ml Salzlösung pro Maus; 0,3, 3, 30 und 300 ng/Maus von H-9392; und 1, 10 und 100 μg/Maus von Glucosamin) behandelt wurden. Alle Behandlungen wurden nach der dritten und letzten Verabreichung abgesetzt. Die Ergebnisse dieses Versuchs werden in den 39X (Salzlösung und Glucosamin) und 39Y (Salzlösung und H-9392) veranschaulicht und geben an, dass lediglich eine Maus in der Gruppe mit 30 ng H-9392 am dreizehnten Tag nach der Bestrahlung gestorben war, während in der Kontrollgruppe alle Tiere am 26. Tag nach der Bestrahlung gestorben waren. Die Behandlungsarten mit 300 ng H-9392 und 1 μg Glucosamin zeigten moderate Aktivität bei der Unterdrückung von Mortalität nach der Bestrahlung.
Diese Ergebnisse geben somit eine mögliche Zweckmäßigkeit der Substanzen von Interesse bei Krebstherapie an, wo die mit Strahlentherapie assoziierte Toxizität durch vorherige Verabreichung der vorliegenden Verbindungen maßgeblich gemindert werden kann. Diese Methode erlaubt möglicherweise ein Anheben der Strahlungsdosierung auf höhere, wirksamere Niveaus, ohne dass toxische Nebenwirkungen beobachtet werden. Wie anhand der zuvor beschriebenen Versuche veranschaulicht, sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in gewissen, sehr geringen Dosierungen hochwirksam, selbst wenn die Behandlung auf dreimalige Verabreichung von Disaccharid beschränkt ist.
6.19.7. Die Fähigkeit ausgewählter Substanzen zur Unterdrückung der Abstoßung von allogenen Transplantaten
Die Wirkung von H-9392 wurde auch bei Hauttransplantat-Abstoßungs-Versuchen bei Mäusen untersucht. Insbesondere wurden gemäß dem Verfahren von Baharav, E. et al. J. Immunol. Methods (1986) 90:143-144 Hauttransplantate von C57BL/6 Spender-Mäusen (H-2^b) auf BALB/c-Empfängermäusen (H-2^d) übertragen. Die Anzahl der Tage bis zur Abstoßung wurde anhand des Ablösens des Transplantats gemessen. Die Anzahl der Tage bis zur Abstoßung wurde für eine Kontrollgruppe (nur 0,1 ml Salzlösung injiziert) und Versuchsgruppen bestimmt, denen einen Tag vor der Transplantation und danach in wöchentlichen Abständen 3 ng oder 300 ng H-9392 subkutan injiziert wurden. Die in den 40 und 40A graphisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Dosis von 3 ng/Maus den Grad der Abstoßung des Hauttransplantats zu 50 % um 5 Tage verzögerte! Dieselbe, in einer Dosis von 300 ng/Maus verabreichte Verbindung konnte jedoch keine signifikante Differenz bei 50 % Abstoßung im Vergleich zur Kontrolle erzeugen. Diese Ergebnisse sind angesichts dessen, dass die Abstoßung eines vollständig allogenen Hauttransplantats als eine der stärksten bekannten Immunreaktionen angesehen wird, von großer Bedeutung.
6.19.8. Die Fähigkeit ausgewählter Substanzen zur Unterdrückung der Entwicklung von IDDM bei NOD-Mäusen
Es ist wohl bekannt, dass NOD-Mäuse als ein zuverlässiges Modell für humanen Typ-1-Diabetes dienen. Tatsächlich entwickeln alle NOD-Mäuseweibchen in der Kolonie bis zu einem Alter von ungefähr 4-5 Monaten spontan Diabetes. Da Typ-1-Diabetes oder insulinbedingter Diabetes mellitus (IDDM) als eine Autoimmunerkrankung angesehen werden, die durch autoreaktive T-Zellen hervorgerufen werden kann, wurden ausgewählte Verbindungen der vorliegenden Erfindungen auf ihre Fähigkeit zur Regulation dieser von T-Zellen mediierten Autoimmunreaktion untersucht.
Somit wurde Gruppen von NOD Mäuseweibchen, 6-12 in einer Gruppe, subkutan Salzlösung (0,1 ml), H-9392 (30 ng/Maus) oder Glucosamin (10,000 ng/Maus) injiziert. Wie in 41 gezeigt, waren alle Mäuse ungefähr dreieinhalb Monate alt, was bedeutet, dass bei den Mäusen als Gruppe gesehen bereits 20 %ige Inzidenz von IDDM aufgetreten war. Die Inzidenz von IDDM kann durch den Glucosespiegel im Blut der Mäuse überprüft werden. Bei nicht-diabetischen Mäusen liegt der durchschnittliche Glucosespiegel im Blut bei ungefähr 140 ± 10 mg/ml. Eine Maus wird dann als diabetisch eingestuft, wenn der Glucosespiegel im Blut gleich oder größer 200 mg/ml ist (d.h. größer als ungefähr die dreifache Standardabweichung vom „normalen" Wert). Der Einfachheit halber wurde der Glucosespiegel im Urin unter Verwendung des Clinstix^TM Dipsticks (Ames) gemessen. Dieser Versuch ergibt Werte von 0 bis +3, wobei ein Wert gleich oder größer +2 bei zwei separaten Messungen als positive Indikation für Diabetes gewertet wird.
Sehr überraschend war somit die Entdeckung, dass sowohl H-9293 als auch Glucosamin den Ausbruch von Diabetes bei NOD-Mäusen hemmte, sodass nach viereinhalb Monaten, als alle Kontrollmäuse als diabetisch eingestuft wurden, nur ungefähr 65 % der mit Glucosamin behandelten Mäuse Diabetes hatten, während bei den mit H-9392 behandelten Mäusen weniger als 50 % an der Erkrankung litten.
Anders ausgedrückt zeigt 41A, dass im Alter von 5 Monaten der diabetische Zustand bei allen Kontrollmäusen zum Tod geführt hatte. Im Gegensatz dazu war im selben Zeitrahmen nur ungefähr die Hälfte der mit 10 000 ng Glucosamin behandelten Mäuse gestorben. Auffallend ist, dass keine der mit 30 ng H-9392 behandelten Mäuse innerhalb desselben Zeitrahmens gestorben war; das heißt, die Graphik der H-9392-Ergebnisse fällt mit der x-Achse zusammen.
6.19.9. Wirkung ausgewählter Disaccharide auf TNF-α-induzierte Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und ELAM-1 durch Endothelzellen (EC).
Adhäsionsmoleküle wie etwa ICAM-1 und ELAM-1 sind bei der Erkennung und dem anschließenden „Rolling" (d.h. Adhäsion an und Migration durch das Endothel hindurch) der Leukozyten, die in die Entzündungsreaktion einbezogen sind, ausschlaggebend. Als Reaktion auf aktiven TNF-α exprimieren Endothelzellen (EC) ICAM-1 und ELAM-1. Somit kann TNF-α die Entzündung durch Hochregulation der Signale für Leukozytenadhäsion und -migration steigern. Zwecks Bestimmung der Wirkung der Disaccharide der vorliegenden Erfindung auf die TNF-α-induzierte Expression von ICAM-1 und ELAM-1 durch EC wurde der folgende Versuch durchgeführt.
Frisch aus humaner Nabelschnur-Vene isolierte EC wurden in M-199 (Gibco Laboratories) kultiviert, das mit 10 % FCS, 8 % Humanserum, Antibiotika und 50 μg pro ml Endothelzellen-Wachstumsfaktor ergänzt war (EC-GM; Sigma. St. Louis, MO). Mittels Hinzufügen von 0,1 ml EC-GM-Medium (3,5 × 10⁵ Zellen pro ml) zu 96-Well-Flachboden-Platten (Nunk Roskilde, Dänemark) wurden die EC ausgesät.
Konfluente Monolayer-Kulturen wurden gewaschen und bei 37°C 1 h lang mit ausgewählten Disaccharidverbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen in 50 μl M-199 inkubiert. Die Verbindungen wurden dann durch Waschen entfernt und die Kulturen über Nacht mit 200 IE pro ml vorgeformten TNF-α in EC-GM inkubiert. Die Zellen wurden dann drei Mal bei 37°C mit 1 % FCS enthaltender Hank's Lösung (1 %ige Hank's) gewaschen und mit 2 %igem Glutaraldehyd in PBS fixiert. Die Zellen wurden dann drei Mal mit 1 %iger Hank's gewaschen, mit 2,5 % BSA in PBS blockiert und erneut mit 1 %iger Hank's gewaschen. Anti-ICAM-1 und ELAM-1 mAb (Genzyme, Cambridge MA; in PBS 1/1000 verdünnt) wurden mit den Zellen 1 h lang bei 22°C inkubiert, dann durch dreimaliges Waschen mit 1 %iger Hank's entfernt. Peroxidase-konjugierter Ziege-anti-Maus-Antikörper (Sigma, verdünnt 1/1000) wurde mit Zellen 1 h lang inkubiert und anschließend durch Waschen entfernt. Nach Hinzufügen von o-Phenylendiamin (OPD), das durch Auflösen einer OPD-Hydrochlorid-Tablette in Wasser (OPD ist ein Substrat für Peroxidase und bei Sigma, Kat. Nr. p9187, erhältlich) hergestellt wurde, wurde in einem ELISA-Reader bei 492 nm die Absorbanz erfasst. Die Proben wurden dreifach untersucht und der Durchschnitt wurde aus zumindest drei unterschiedlichen Assays berechnet.
Tabelle XIIID. Wirkung von Disacchariden auf die Expression von Adhäsionsmokelülen durch Endothelzellen als Reaktion auf zuvor gebildeten TNF-α
Die vorhin beschriebenen Versuche verdeutlichen, dass Vorbehandlung der EC mit Disaccharidverbindungen 9392 und 1020 den EC signifikante Widerstandsfähigkeit gegen zuvor gebildeten TNF-α verlieh. Somit wurde die Hochregulation der TNF-α-induzierten EC-Expression von Adhäsionsmolekülen um bis zu 50 % gehemmt. Diese Ergebnisse bedeuten, dass die Verbindungen der Erfindung sowohl die Zielzellen von TNF-α (z. B. EC) als auch die Zellen, die TNF-α nicht nur zur Hemmung der Produktion von aktivem TNF-α, sondern auch zur Hemmung der Neigung der Zielzellen, auf TNF-α zu reagieren, produzieren (d.h. Regulation der peripheren Aufnahme des Zytokins), beeinflussen können. Dann kann sich die Verabreichung der Substanzen der vorliegenden Erfindung positiv auf gewisse Erkrankungszustände auswirken, indem den Zielzellen von TNF-α eine Art Widerstandsfähigkeit gegen die zell-induzierte Entzündungsreaktion, die durch die aktivierten T-Zellen und Makrophagen initiiert wird, verliehen wird.
6.19.10. Die Fähigkeit der Substanz H-9392 zur Unterdrückung der Anzeichen von experimentellem, allergischem Asthma bei Ratten
Experimentelles, allergisches Bronchialasthma ist eine direkte Art von Überempfindlichkeitsreaktion bei Ratten, die immunisiert und dann mittels Inhalation des Priming-Antigens in einer aerosolisierten Lösung erneut belastet wurden. (Edelman, et al., Am. Rev. Resp. Dis. (1988) 137:1033-37). Die Ätiologie und Pathophysiologie dieser experimentellen Erkrankung entsprechen dem natürlich auftretenden Pendant beim Menschen.
Zwecks Untersuchung der Fähigkeit der Substanz H-9392 zur Vorbeugung von Bronchialasthmaanfällen wurden 6 Brown-Norway-Rattenmännchen gegen Ovalbumin (OVA) geprimt, indem an Tag 0 1 mg OVA in Suspension mit 200 mg AlOH/ml 0,9 %ige Salzlösung subkutan und 1 ml, 6 × 10⁶ durch Hitze abgetötete Bortadella pertussis-Bakterien enthaltende Lösung (Pasteur Merieux, S.V.) intraperitoneal injiziert wurden. Anschließende Belastungen bestanden in einer 5minütigen Inhalationsphase von OVA (1 mg/ml Lösung), das in einem mit einem Luftstrom von 6 L/min betriebenen Devilbiss Vernebler aerosolisiert wurde. Atemnot-(RD)-Reaktionen wurden wie folgt eingeteilt: Schweregrad 0, keine Anzeichen für Atemnot; Schweregrad 1, Tachypnoe; Schweregrad 2, leicht erschwertes Atmen; Schweregrad 3, stark erschwertes Atmen mit geöffnetem Mund; Schweregrad 4, Verlust des Bewusstseins und des Muskeltonus. Sechzehn Tage nach der Erstimmunisierung wurden alle Tiere einer anfänglichen, aerosolisierten Belastung ausgesetzt, um die Positivkontrolle zu ergeben. Die Tiere waren kodiert, sodass der Beobachter die Geschichte des einzelnen Tieres nicht kannte. Alle Ratten waren gegenüber OVA empfindlich und bei allen Tieren wurde einheitlich Asthma induziert.
An Tag 30 wurden die Tiere in zwei Gruppen unterteilt und ihnen wurde entweder Salzlösung (Kontrollgruppe A) oder 30 ng der Substanz H-9392 (Gruppe B) subkutan verabreicht und sie wurden wie zuvor an Tag 35 belastet. Die Ergebnisse werden in 42 dargestellt. Wie in 42 gezeigt, wiesen die Tiere, die an Tag 30 einmalig Salzlösung erhielten, Atemnot von Schweregrad 3 oder 4 auf. Die mit der Substanz H-9392 behandelten Tiere zeigten lediglich Tachypnoe an. Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Gabe der Substanz H-9392 (5 Tage vor der zweiten Belastung) an ein Tier mit bestehender Überempfindlichkeit einen asthmatischen Anfall blockiert.
6.20. Ergebnisse des in vitro Human-PBL-Bioassay bei im Handel erhältlichen, aus Heparin gewonnenen Oligosacchariden
Im Handel erhältliche Proben von aus Heparin gewonnenen Disacchariden und Polysacchariden im Molekulargewichtsbereich von 1 800 bis 18 000 wurden auf biologische Aktivität untersucht. Die Ergebnisse werden in Tabelle XXIII dargestellt. Wie anhand der erhaltenen Daten ersichtlich ist, ergeben alle untersuchten Proben bis auf eine Ausnahme entweder keine Wirkung oder unbeständige Wirkungen. Wie in den Fußnoten der Tabelle erklärt, wurde ein Untersuchungsergebnis für einen bestimmten Eintrag dann als unbeständig bezeichnet, wenn die drei Bioassay-Durchgänge nicht alle dasselbe qualitative Ergebnis lieferten. (Alle Einträge in allen in dieser Offenbarung eingeschlossenen Tabellen, die Ergebnisse von Bioassays darstellen, waren das Resultat von zumindest drei Untersuchungen. In dem Human-PBL-Bioassay wurde bei jedem Durchgang Blut verwendet, das von verschiedenen Individuen stammt.)
Tabelle XXIII. Wirkung von im Handel erhältlichen Heparin-Disacchariden auf die Sekretion von aktivem TNF unter Verwendung von Human-PBL-Bioassay.
6.21. Ergebnisse von in vitro Human-PBL-Bioassay im Vergleich zu auf mAb basierendem Assay-Kit
Ein Vergleich der durch den hierin beschriebenen, auf humanen PBLs basierenden in vitro Bioassay gewonnenen Aktivitätsdaten und den Ergebnissen eines herkömmlichen, auf monoklonalen Antikörpern basierenden Assay-Kits zeigt, dass in den untersuchten Medien deutlich mehr Protein als jenes, das mittels Human-PBL-Bioassay als „aktiver" TNF erfasst wurde, vorhanden ist. Die Ergebnisse werden in Tabelle XXIV dargestellt. Beispielsweise ist die Differenz zwischen den Mengen an Protein, das von T-Zellen bei „Kontroll"-Niveaus (ca. 274 pg/ml) und Vorhandensein von Fragmin HPLC-F16 (ca. 200 pg/ml) produziert wird, nicht annähernd so groß wie die in denselben Proben mittels Human-PBL-Assay erfasste Aktivitätsdifferenz (100 %ige Änderung der Aktivität). Folglich lassen diese Ergebnisse den Schluss zu, dass sogar bei Vorhandensein der Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung die Aktivität von lediglich einem kleinem Anteil des sekretierten Proteins für das Töten TNF-empfindlicher Zellen ausreicht, obgleich die aktivierten Immuneffektorzellen signifikante Mengen an TNF-Protein sekretieren können. Diese Schlussfolgerung untermauert die Annahme, dass TNF sowohl in aktiver als auch inaktiver Form produziert wird.
Tabelle XXIV. Vergleich von durch Human-PBL-Bioassay erfasste TNF-Aktivität und durch mAb-Immunoassay-Kit erfasste Menge an Protein Bioassay von TNF-Aktivität
6.22. Ergebnisse vorausgehender Forschungen über die strukturellen Kennzeichen von aus ECM gewonnenem Disaccharid
Wie zuvor beschrieben wurde nach HPLC-II-Chromatographie (23) und Entsalzen eine 20 μg Probe eines aus ECM gewonnenen Disaccharids erhalten. Die anschließende Reinigung bei SAX-HPLC-Bedingungen zeigte bei dieser Probe einen gereinigten Anteil größer 90 % an (24, Peak A23/4 bei 23,10 min). Das NMR-Protonenspektrum dieser Probe (31) zeigt das Vorhandensein eines Kontaminanten mit einer repetitiven aliphatischen -CH₂-Gruppe. Nichtsdestotrotz sei angemerkt, dass die SAX-HPLC-Reinigung sowohl bei in vitro als auch bei in vivo Bioassay-Bedingungen positiv auf Hemmung untersucht wurde.
Ein NMR-Protonenspektrum wurde bei 23°C bei 500 MHz in D₂O aufgezeichnet. Auch ein zweidimensionales COSY-Spektrum wurde erstellt. Die schlussendliche Matrixgröße lag bei 512 × 512, N-Cosy mit Vorsättigung, 1536 Scans (32). Übliche Zuckersignale sind zwischen 3-5,5 ppm evident, sowohl in dem eindimensionalen als auch dem 2-D-Spektrum. Bei 5,39 ppm wurde ein Dublettsignal für das anomere Proton erfasst, das einen Kopplungsfaktor von 3 Hertz (33) aufweist, was dem Vorhandensein einer Glucosamin-Zuckereinheit in einer α-Konfiguration entspricht.
Die chemische Verschiebung des anomeren Protons gemeinsam mit der vermeintlichen Beta-Glucuronid-Spezifität parentaler Heparanase führt zu der vorläufigen Schlussfolgerung, dass das Disaccharid in einer α-Konfiguration ein Glucosamin an dem nicht-reduzierenden Ende aufweist, das an dem reduzierenden Ende an einen Glucuronsäurerest 1-4-gebunden ist. Darüber hinaus zeigt das Fehlen eines Signals bei 6 ppm an, dass das Disaccharid gesättigt ist (d.h. keine Doppelbindung bei C₄-C₅ des Glucosaminrests). Somit ist die Heparanase keine Eliminase, sondern offensichtlich eine Hydrolase.
Auf einem mit einem Transmissions-Film-Detektor ausgestatteten Mattson Galaxy 6020 wurden FTIR-Spektren aufgezeichnet; DTGS bei einer Auslösung von 2 cm^–1; 128 Scans unter Verwendung eines ZnSe-Fensters. Die 34-35 zeigen jeweils das Vorhandensein einer sulfatierten Verbindung und eines teilweise desulfatierten Analogikums an. Insbesondere 34 weist Absorptionen bei 3500-3000 (kennzeichnend für Carboxyl- und Hydroxylgruppen), 1594 (Carbonyl), 1394, 1121, 1107, 1074, 1005, 993, 936 und 852 cm^–1 auf, von denen zumindest einige, insbesondere die letzte, mit Sulfat assoziiert sind.
Mittels eines Jeol JMS HX/110A FAB wurde das Massenspektrum eines Methylderivats, von dem angenommen wird, dass es einige Sulfate verloren hat, erhalten. Ein Xenon-Strahl wurde bei E = 6 kV, Emissionsstrom = 10 mA, verwendet, die Beschleunigungsspannung lag bei 10 kV. Zuerst wurde das Methylderivat durch Verarbeiten einer Probe des Oligosaccharids mit Diazomethan in saurem Medium hergestellt. Das methylierte Produkt wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert. Ein kennzeichnendes Ion wurde auf dem M/Z (M + H⁺) = 531 aufweisenden Background beobachtet. Somit wird angenommen, dass die Daten mit einem Molekulargewicht eines methylierten Derivats von ungefähr 530 übereinstimmen. Zwecks Überprüfung der Ergebnisse wurden zwei unterschiedliche Matrizen verwendet; DTT : Thioglycerol (1:1) und Methylnitrobenzylalkohol (jeweils die 36A–B und 37A–B). Die „A"-Spektren entsprechen Probe + Matrix, obgleich die „B"-Spektren lediglich auf die spezifische Matrix Bezug nehmen.
Ausgehend von derartigen Massenspektraldaten kann eine vorläufige chemische Formel für das methylierte (teilweise desulfatierte) Derivat vorgeschlagen werden: C₁₃H₂₃NO₁₇S₂, MW = 529,47.

4-O-(2-desoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl)-(2-O-sulfo-β-D-glucopyranosid)uronsäure wird gemäß dem folgenden Protokoll synthetisiert.

6.23. Synthese von 4-O-(2-desoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl)-(2-O-sulfo-β-D-glucopyranosid)uronsäure
6.23.1. Herstellung von 6-O-Acetyl-2-azido-3,5-di-O-benzyl-2-desoxy-β-D-glucopyranosylchlorid

2-O-Tosyl-1,6:3,4-dianhydro-β-D-galactopyranose [2] wird gemäß Cerny et al. (1961) Coll. Chech. Chem. Cos. 26:2547 aus 1,6-Anhydro-μ-D-glucopyranose [1] hergestellt.
2-O-Tosyl-1,6-anhydro-β-D-glucopyranose [3] wird gemäß Cerny et al. (1965), Coll. Chech. Chem. Soc. 30:1151 aus 2-O-Tosyl-1,6:3,4-dianhydro-β-D-galactopyranose [2] hergestellt.
1,6:2,3-Dianhydro-β-D-mannopyranose [4] wird gemäß Stanek und Cerny (1972) SYNTHESIS S. 698 aus 2-O-Tosyl-1,6-anhydro-β-D-glucopyranose [3] hergestellt. 6-O-Acetyl-2-azido-3,4-di-O-benzyl-2-desoxy-β-D-glucopyranosylchlorid [A] wird gemäß Paulsen und Slenzel (1978) Chem. Ber. 111:2334 aus 1,6:2,3-Dianhydro-β-D-mannopyranose [4] hergestellt.

6.23.2. Herstellung von Methyl-(benzyl-2-O-acetyl-3-O-benzyl-β und α-L-glucopyranosid)-uronat

1,2:5,6-Di-O-isopropyliden-α-D-glucofuranose [6] wird gemäß Stevens (1978), Methods Carbohydr. Chem. 6:124 aus D-Glucose [5] hergestellt. 3-O-Benzyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-glucofuranose [7] wird gemäß Whistler und Lake (1972), Methods Carbohydr. Chem. 6:286 aus 1,2:5,6-Di-O-isopropyliden-α-D-glucofuranose [6] hergestellt.
Methyl-(benzyl-2-O-acetyl-3-O-benzyl-β und α-L-glucopyranosid)-uronat wird gemäß Jacquinet et al. (1984), Carbohydr. Res. 130:221 aus 3-O-Benzyl-1,2-O-isopropyliden-D-glucofuranose [7] hergestellt.

6.23.3. Kondensation der Produkte aus 6.23.1 und 6.23.2
Das Koppeln der Produkte aus den vorhergehenden Abschnitten 6.23.1 und 6.23.2 wurde gemäß Jacquinet et al. (1988), Carbohydr. Res. 174:253 vorgenommen. Gemäß Jacquinet et al. (1984) (oben) vorgenommene O-Deacetylierung, Hydrolyse, O-Sulfatierung, Reduktion und Debenzylierung ergeben 4-O-(2-desoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl)-(2-O-sulfo-β-D-glucopyranosid)uronsäure, die gemäß Rice et al. (1985), Anal. Biochem. 150:325 mittels SAX-HPLC weiter gereinigt wird. 43 führt die Struktur dieses Produkts an und es wird angenommen, dass es dieselbe biologische Aktivität aufweist wie die anderen hierin beschriebenen Verbindungen.

Claims

Verwendung einer Verbindung, bei der es sich um ein N-sulfatiertes oder N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-iduronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon handelt, wobei diese Verbindung, wenn sie N-sulfatiert ist, mindestens eine andere Sulfatgruppe aufweist, und diese Verbindung, wenn sie N-acetyliert ist, mindestens zwei Sulfatgruppen aufweist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder zur Behandlung eines medizinischen Zustandes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunerkrankungen, insulinabhängigem Diabetes Mellitus, Periodontalerkrankungen, entzündlichen Darmerkrankungen, Hauterkrankungen, Uveitis, rheumatischen Erkrankungen, chronischer Entzündung, Multipler Sklerose, Lupus erythematodes, Arteriosklerose, Arthritis, Vaskulitis, Allergien, Neoplasie, viralen Infektionen, bakteriellen Infektionen, Pilzinfektionen und Allotransplantat-Abstoßung.
Verwendung einer Verbindung, bei der es sich um ein nicht-sulfatiertes N-acetyliertes 4-Desoxy-4-en-iduronglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon handelt, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder zur Behandlung eines medizinischen Zustandes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunerkrankungen, insulinabhängigem Diabetes Mellitus, Periodontalerkrankungen, entzündlichen Darmerkrankungen Hauterkrankungen, Uveitis, rheumatischen Erkrankungen, chronischer Entzündung, Multipler Sklerose, Lupus erythematodes, Arteriosklerose, Arthritis, Vaskulitis, Allergien, Neoplasie, viralen Infektionen, bakteriellen Infektionen, Pilzinfektionen und Allotransplantat-Abstoßung.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei dieser Zustand von der inadäquaten Produktion eines aktiven Zytokins ausgelöst wird, wobei das Zytokin ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-6, IL-8 und TNF-α.
Die Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei dem Zytokin um TNF-α handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder die Vorbeugung eines medizinischen Zustandes dient, der von der Überproduktion von aktivem TNF-α ausgelöst wird oder damit in Verbindung stehen.
Die Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder die Vorbeugung eines medizinischen Zustands dient, bei dem es sich um eine Autoimmunerkrankung handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder Vorbeugung eines medizinischen Zustands ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus insulinabhängigem Diabetes Mellitus, Periodontalerkrankungen, entzündlichen Darmerkrankungen, Hauterkrankungen, Uveitis, rheumatischen Erkrankungen, chronischer Entzündung, Multipler Sklerose, Lupus erythematodes, Arteriosklerose, Arthritis, Vaskulitis und Allergien dient.
Die Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder Vorbeugung eines medizinischen Zustands dient, der von der Unterproduktion von aktivem TNF-α ausgelöst wird oder damit in Verbindung steht.
Die Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder Vorbeugung eines medizinischen Zustands dient, bei dem es sich um Neoplasie, virale Infektionen, bakterielle Infektionen oder Pilzinfektionen handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder Vorbeugung eines medizinischen Zustands dient, bei dem es sich um ein Basaliom, Plattenepithelkarzinom oder Melanom handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder Vorbeugung eines medizinischen Zustands dient, bei dem es sich um Allotransplantat-Abstoßung handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei es sich bei diesem Allotransplantat um ein Organtransplantat handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei diesem Organ um Herz, Leber, Niere oder Knochenmark handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei es sich bei diesem Allotransplantat um ein Hauttransplantat handelt.
Die Verwendung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1-14, wobei die Verbindung ein Disaccharid gemäß der Formel (I) oder dessen pharmazeutisch annehmbares Salz ist,
worin X1 für Wasserstoff oder Sulfat steht; X2 für Wasserstoff oder Sulfat steht; und X3 für Sulfat oder Acetyl steht; unter der Vorraussetzung, dass wenn X3 für Sulfat steht, wenigstens eines aus X1 oder X2 für ein Sulfat steht, und wenn X3 für Acetyl steht, sowohl X1 als auch X2 für Sulfate stehen, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Die Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei diesem Disaccharid um 2-O-Sulfat-4-desoxy-4-en-iduronsäure-(alpha-1,4)-2-desoxy-2-N-sulfatglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei diesem Disaccharid um 4-Desoxy-4-en-iduronsäure-(alpha-1,4)-2-desoxy-2-N-sulfat-6-O-sulfatglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei diesem Disaccharid um 2-O-Sulfat-4-desoxy-4-en-iduronsäure-(alpha-1,4)-2-desoxy-2-N-sulfat-6-O-sulfatglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei diesem Disaccharid um 2-O-Sulfat-4-desoxy-4-en-iduronsäure-(alpha-1,4)-2-desoxy-2-N-acetyl-6-O-sulfatglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon handelt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei der Verbindung um 4-Desoxy-4-en-iduronsäure-(alpha-1,4)-2-desoxy-2-N-acetylglucosamin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon handelt.
Die Verwendung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1-20, wobei diese pharmazeutische Zusammensetzung täglich verabreicht wird.
Die Verwendung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1-21, wobei diese pharmazeutische Zusammensetzung wöchentlich verabreicht wird.
Die Verwendung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1-22, wobei diese pharmazeutische Zusammensetzung parenteral, oral oder topisch verabreicht wird.