DE69333961T2

DE69333961T2 - Nukleinsäureliganden und ihre herstellungsmethoden

Info

Publication number: DE69333961T2
Application number: DE69333961T
Authority: DE
Inventors: Larry M. Boulder GOLD; Craig Boulder TUERK; Diane Boulder TASSET; Nebojsa Lafayette JANJIC
Original assignee: Gilead Sciences Inc
Current assignee: Gilead Sciences Inc
Priority date: 1992-09-29
Filing date: 1993-09-28
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2013-09-29
Also published as: JPH08501943A; DE69333961D1; EP1683871A2; EP1683871A3; AU689087B2; EP1683871B1; JP2004097232A; EP0668931B1; WO1994008050A1; DK0668931T3; ATE315101T1; EP0668931A4; PT668931E; EP0668931A1; CA2145761A1; AU5441194A; ES2257735T3; CA2145761C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Hierin beschrieben werden Verfahren zur Identifikation und Herstellung von Nucleinsäureliganden. Nucleinsäureliganden sind doppel- oder einzelsträngige DNA- oder RNA-Spezies, die sich spezifisch an ein erwünschtes Zielmolekül binden. Die Grundlage zur Identifikation von Nucleinsäureliganden bildet ein Verfahren, das SELEX genannt wird, was ein Akronym für Systematic Evolution of Ligands for EXponential enrichment (Systematische Entwicklung von Liganden für exponentielle Anreicherung) ist.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen Mittel zur Analyse und Anwendung der Informationen, die aus dem SELEX-Verfahren gewonnen wurden, um einen verbesserten Nucleinsäureliganden für das ausgewählte Ziel zu schaffen. Diese Verfahren umfassen Computer-Modellierung, Grenzbestimmungsverfahren und chemische Modifikationsverfahren. Gemäß den Verfahren dieser Erfindung ist es möglich, zu bestimmen: 1) welche Nucleinsäurereste eines Nucleinsäureliganden für Bindung an das ausgewählte Ziel maßgeblich sind; 2) welche Nucleinsäurereste die strukturelle Konformation des Nucleinsäureliganden beeinflussen; und 3) wie die dreidimensionale Struktur des Nucleinsäureliganden beschaffen ist. Diese Informationen ermöglichen die Identifikation und Produktion verbesserter Nucleinsäureliganden, die hervorragende Bindungskapazität an das Ziel sowie erhöhte strukturelle Stabilität aufweisen. Diese Informationen können auch verwendet werden, um Nicht-Nucleinsäure- oder Hybrid-Nucleinsäure-Spezies zu bilden, die ebenfalls als Liganden für das Ziel funktionieren. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen weiters eine Analyse der Zielspezies bereit, die bei der Herstellung therapeutischer und/oder diagnostischer Verfahren verwendet werden können.
Insbesondere werden hierin hochaffine Nucleinsäureliganden zu den HIV-RT-, HIV-1-Rev-, HIV-1-tat-, Thrombin- und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor- (bFGF) Proteinen beschrieben. Im Schutzumfang der Erfindung sind modifizierte Nucleinsäureliganden und mimetische Liganden eingebunden, die durch die hierin identifizierten Nucleinsäureliganden informiert werden. Weiters sind im Schutzumfang der Erfin dung Nucleinsäureliganden eingebunden, die in der Lage sind, die biologische Aktivität des Zielmoleküls zu modifizieren, beispielsweise Nucleinsäureliganden, die die Wirkung von bFGF inhibieren. Weiters umfasst die vorliegende Erfindung Nucleinsäureliganden, die modifizierte Nucleotide enthalten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die meisten Proteine oder kleinen Proteine sind nicht dafür bekannt, dass sie sich spezifisch an Nucleinsäuren binden. Die bekannten Ausnahmen unter Proteinen sind jene Regulationsproteine wie Repressoren, Polymerasen, Aktivatoren und dergleichen, die in einer Lebendzelle so funktionieren, dass sie den Transfer von genetischer Information, die in den Nucleinsäuren kodiert ist, in zelluläre Strukturen und die Replikation des genetischen Materials bewirken. Weiters binden sich kleine Moleküle wie GTP an manche Intron-RNAs.
Lebende Materie entwickelte sich dahingehend, dass die Funktion von Nucleinsäuren auf eine fast ausschließlich informative Rolle beschränkt wurde. Das Zentrale Dogma der Molekularbiologie, wie Crick es postulierte, sowohl ursprünglich als auch in seiner erweiterten Form, schlägt vor, dass Nucleinsäuren (entweder RNA oder DNA) als Matrices für die Synthese anderer Nucleinsäuren durch Replikationsverfahren dienen können, die die Information in einer Matrix-Nucleinsäure "lesen" und somit komplementäre Nucleinsäuren ergeben. Alle der experimentellen Paradigmen bezüglich Genetik und Genexpression hängen von diesen Eigenschaften der Nucleinsäuren ab: im Wesentlichen verfügen doppelsträngige Nucleinsäuren aufgrund des chemischen Konzepts der Basenpaare, und da Replikationsprozesse in der Lage sind, Basenpaarung auf eine relativ fehlerfreie Weise zu verwenden, über redundante Information.
Die einzelnen Komponenten von Proteinen, die zwanzig natürlichen Aminosäuren, verfügen über ausreichende chemische Unterschiede und Aktivitäten, um eine enorme Bandbreite an Aktivitäten sowohl für Bindung als auch für Katalyse bereitzustellen. Von Nucleinsäuren wird jedoch angenommen, dass sie nicht so breit gefasste chemische Eigenschaften haben wie Proteine, dass sie jedoch eine informative Rolle spielen, die es ermöglicht, dass genetische Information von Virus zu Virus, Zelle zu Zelle und Organismus zu Organismus übertragen wird. In diesem Zusammenhang müssen Nucleinsäurekomponenten, die Nucleotide, nur Paare von Oberflächen besitzen, die Informationsredundanz innerhalb eines Watson-Crick-Basenpaars ermöglicht. Nucleinsäurekomponenten müssen nicht über chemische Unterschiede und Aktivitäten verfügen, die für einen breiten Bereich von Bindung oder Katalyse ausreichend sind.
Manche Nucleinsäuren, die in der Natur zu finden sind, nehmen jedoch an Bindung an bestimmte Zielmoleküle teil, und in manchen Fällen wurde sogar von Katalyse berichtet. Der Aktivitätsbereich dieser Art ist im Vergleich zu Proteinen und insbesondere Antikörpern eng gefasst. Sind Nucleinsäuren beispielsweise dafür bekannt, sich an manche Proteinziele mit hoher Affinität und Spezifität zu binden, so hängt die Bindung von den exakten Sequenzen von Nucleotiden ab, die der DNA- oder RNA-Liganden aufbauen. So sind kurze, doppelsträngige DNA-Sequenzen bekannt dafür, dass sie sich an Zielproteine binden, die Transkription sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten unterdrücken oder aktivieren. Andere kurze, doppelsträngige DNA-Sequenzen sind dafür bekannt, sich an Restriktionsendonucleasen, Proteinziele, die mit hoher Affinität und Spezifität selektiert werden können, binden. Andere kurze DNA-Sequenzen dienen als Centromere und Telomere auf Chromosomen, wahrscheinlich durch die Schaffung von Liganden für die Bindung spezifischer Proteine, die in die Chromosomenmechanik eingebunden sind. Somit hat doppelsträngige DNA eine durchwegs bekannte Fähigkeit, sich innerhalb der Ecken und Ritzen von Zielproteinen zu binden, deren Funktionen auf DNA-Bindung gerichtet sind. Einzelsträngige DNA kann sich auch an manche Proteine mit hoher Affinität und Spezifität binden, obwohl die Zahl der Beispiele eher gering ist. Durch die bekannten Beispiele doppelsträngiger DNA-Bindungsproteinen wurde es möglich, die Bindungswechselwirkungen als solche zu beschreiben, die verschiedene Proteinmotive einbinden, deren Aminosäureseitenketten sich in die große Furche von B-förmiger, doppelsträngiger DNA hinein erstrecken und somit die Sequenzprüfung bereitstellen, die Spezifität ermöglicht.
Doppelsträngige DNA dient gegebenenfalls als ein Ligand für bestimmte Proteine, beispielsweise für die Endonuclease RNase III aus E. coli. Es gibt mehr bekannte Fälle von Zielproteinen, die sich an einzelsträngige RNA-Liganden binden, obwohl in diesen Fällen die einzelsträngige RNA häufig eine komplexe dreidimensionale Form annimmt, die lokale Regionen von intramolekularer doppelsträngiger Beschaffenheit umfasst. Die Amino-Acyl-tRNA-Synthetasen binden sich mit hoher Spezifität fest an tRNA-Moleküle. Eine kurze Region innerhalb der Genome von RNA-Viren bindet sich fest und mit hoher Spezifität an die viralen Hüllproteine. Eine kurze Sequenz von RNA bindet sich an die von Bakteriophagen T4 kodierte DNA-Polymerase, wiederum mit hoher Affinität und Spezifität. Somit ist es möglich, RNA- und DNA-Liganden, entweder doppel- oder einzelsträngig, zu finden, die als Bindungspartner für spezifische Proteinziele dienen. Die meisten bekannten DNA-Bindungsproteine binden sich spezifisch an doppelsträngige DNA, während die meisten RNA-Bindungsproteine einzelsträngige RNA erkennen. Diese statistische Beeinflussung in der Literatur spiegelt zweifellos die vorhandene statistische Neigung von Biosphäre wider, DNA als ein doppelsträngiges Genom und RNA als eine einzelsträngige Einheit in den Situationen zu verwenden, in denen RNA eine andere Rolle als jene des Genoms spielt. Chemisch gesehen gibt es keinen guten Grund, einzelsträngige DNA lediglich als einen vollständig fähigen Partner für spezifische Proteinwechselwirkungen abzutun.
Für RNA und DNA wurde auch erkannt, dass sie sich an kleinere Zielmoleküle binden. Doppelsträngige DNA bindet sich an verschiedene Antibiotika wie z.B. Actinomycin D. Eine spezifische einzelsträngige RNA bindet sich an das antibiotische Thiostrepton; spezifische RNA-Sequenzen und -Strukturen binden sich wahrscheinlich an bestimmte andere Antibiotika, insbesondere jene, deren Funktion es ist, Ribosomen in einem Zielorganismus zu deaktivieren. Eine Familie von bezüglich ihrer Entwicklung verwandten RNAs bindet sich mit Spezifität und dezenter Affinität an Nucleotide und Nucleoside (B. Bass & T. Cech, Nature 308, 820 (1984)) sowie an eine der zwanzig Aminosäuren (M. Yarus, Science 240, 1751 (1988)). Katalytische RNAs sind nun ebenfalls bekannt, obwohl diese Moleküle in einem geringen Bereich chemischer Möglichkeiten Leistung erbringen, die somit großteils mit Phosphodiester- Transferreaktionen und Hydrolyse von Nucleinsäuren entfernt in Zusammenhang stehen.
Trotz dieser bekannten Fälle wird von der großen Mehrheit von Proteinen und anderen zellulären Komponenten angenommen, dass sie sich unter physiologischen Bedingungen an Nucleinsäuren binden, und solche Bindung, wie sie beobachtet werden kann, ist nicht spezifisch. Entweder ist die Kapazität von Nucleinsäuren, sich an andere Verbindungen zu binden, auf die oben genannten, relativ wenigen Möglichkeiten eingeschränkt, oder das chemische Repertoire der Nucleinsäuren für spezifische Bindung wird in den Strukturen, die in der Natur vorkommen, vermieden (es wird gegen diese selektiert). Die vorliegende Erfindung basiert auf der fundamentalen Erkenntnis der Erfinder, dass Nucleinsäuren als chemische Verbindungen eine praktisch unbegrenzte Reihe an Formen, Größen und Konfigurationen bilden können und in der Lage zu einem weitaus größeren Repertoire an Bindungs- und Katalysefunktionen in der Lage sind als jene, die in biologischen Systemen zu finden sind.
Die chemischen Wechselwirkungen wurden in Fällen bestimmter bekannter Beispiele von Protein-Nucleinsäure-Bindung untersucht. Die Größe und Sequenz der RNA-Stelle von Bakteriophagen-R17-Hüllproteinbindung beispielsweise wurden von Uhlenbeck und Mitarbeitern identifiziert. Die minimale natürliche RNA-Bindungsstelle (21 Basen lang) für das R17-Hüllprotein wurde bestimmt, indem markierte Fragmente variabler Größe der mRNA einem Nitrocellulosefilter-Bindungstest, in dem Protein-RNA-Fragment-Komplexe am Filter gebunden bleiben, unterzogen wurden (Carey et al., Biochemistry 22, 2601 (1983)). Zahlreiche Sequenzvarianten der minimalen Bindungsstelle des R17-Hüllproteins wurden in vitro geschaffen, um die Beiträge einzelner Nucleinsäuren zur Proteinbindung zu bestimmen (Uhlenbeck et al., J. Biomol. Structure Dynamics 1, 539 (1983), und Romaniuk et al., Biochemistry 26, 1563 (1987)). Es wurde erkannt, dass die Aufrechterhaltung der Haarnadelschleifenstruktur der Bindungsstelle für Proteinbindung wesentlich war, dass jedoch darüber hinaus Nucleotidsubstitutionen an den meisten der einzelsträngigen Reste in der Bindungsstelle, einschließlich eines aufgeweiteten Nucleotids im Haarnadelstamm, Bindung signifikant beeinflussten. In ähnlichen Studien wurde die Bindung von Bakteri ophagen-Qβ-Hüllprotein an seinen Translationsoperator untersucht (Witherell & Uhlenbeck, Biochemistry 28, 71 (1989)). Die RNA-Bindungsstelle des Qβ-Hüllproteins wurde als eine erkannt, die jener von R17 bezüglich Größe und bezüglich der vorhergesagten Sekundärstruktur darin ähnlich war, dass sie etwa 20 Basen mit einer 8-Basenpaar-Haarnadelstruktur umfasste, die ein aufgeweitetes Nucleotid und eine 3-Basen-Schleife umfasste. Im Gegensatz zur Bindungsstelle von R17-Hüllprotein ist nur einer der einzelsträngigen Reste der Schleife für Bindung wesentlich, und die Gegenwart des aufgeweiteten Nucleotids ist nicht erforderlich. Die in Translationsregulation eingebundenen Protein-RNA-Bindungswechselwirkungen weisen signifikante Spezifität auf.
Nucleinsäuren sind dafür bekannt, in Lösung Sekundär- und Tertiärstrukturen zu bilden. Die doppelsträngigen Formen von DNA umfassen die so genannte B-Doppelhelixform, Z-DNA und Superhelix-Twists (A. Rich et al., Ann. Rev. Biochem. 53, 791 (1984)). Einzelsträngige RNA bildet lokalisierte Sekundärstrukturegionen, wie z.B. Haarnadelschleifen und Pseudoknoten-Strukturen (P. Schimmel, Cell 58, 9 (1989)). Es ist jedoch wenig über die Wirkungen von ungepaarten Schleifennucleotiden bezüglich Stabilität der Schleifenstruktur, Kinetik der Bildung und Denaturierung und Thermodynamik und beinahe nichts über Tertiärstrukturen und dreidimensionale Formen und auch über die Kinetik und Thermodynamik von Tertiärfaltung in Nucleinsäuren bekannt (Tuerk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1364 (1988)).
Eine Art von In-vitro-Entwicklung wurde in Bezug auf Replikation des RNA-Bakteriophagen Qβ berichtet. Mills et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58, 217 (1967); Levinsohn & Spiegleman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 866 (1968); Levinsohn & Spiegelman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 805 (1969); Saffhill et al., J. Mol. Biol. 51, 531 (1970); Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 3038 (1972); Mills et al., Science 180, 916 (1973). Die Phagen-RNA dient als eine poly-cistronische Messenger-RNA, die Translation von Phagen-spezifischen Proteinen steuert, und dient auch als eine Matrix für ihre eigene Replikation, die durch Qβ-RNA-Replikase katalysiert wird. Von dieser RNA-Replikase wurde gezeigt, dass sie für ihre eigenen RNA- Matrices höchst spezifisch ist. Während des Ablaufs von Replikationszyklen in vitro wurden kleine RNA-Varianten isoliert, die auch durch Qβ-Replikase repliziert wurden. Es wurde erkannt, dass geringfügige Veränderungen der Bedingungen, unter denen die Replikationszyklen durchgeführt wurden, zur Akkumulation verschiedener RNAs führten, wahrscheinlich, weil ihre Replikation unter den veränderten Bedingungen begünstigt wurde. In diesen Versuchen musste die ausgewählte RNA wirksam durch die Replikase gebunden werden, um Replikation zu initiieren, und musste während der Verlängerung von RNA als eine kinetisch begünstigte Matrix dienen. Kramer et al., J. Mol. Biol. 89, 719 (1974), berichteten von der Isolierung einer mutierten RNA-Matrix von Qβ-Replikase, deren Replikation gegenüber Inhibierung durch Ethidiumbromid resistenter war als die natürliche Matrix. Es wurde erwogen, dass diese Mutante in der anfänglichen RNA-Population nicht vorhanden war, sondern dass sie durch sequenzielle Mutation während In-vitro-Replikationszyklen mit Qβ-Replikase gebildet wurde. Die einzige Variationsquelle während der Selektion war die intrinsische Fehlerquote während der Verlängerung durch Qβ-Replikase. In diesen Studien trat durch präferenzielle Amplifikation von einer oder mehreren aus einer beschränkten Anzahl an spontanen Varianten einer anfänglich homogenen RNA-Sequenz etwas ein, was als "Selektion" bezeichnet wurde. Es gab keine Selektion eines erwünschten Resultats, nur jenes einen, das der Wirkungsart von Qβ-Replikase zueigen war.
Joyce & Robertson (Joyce, in: RNA: Catalysis, Splicing, Evolution, Belfort & Shub (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam, 83-87 (1989); und Robertson & Joyce, Nature 344, 467 (1990)) berichteten von einem Verfahren zur Identifikation von RNAs, die einzelsträngige DNA spezifisch spalten. Die Selektion auf katalytische Aktivität basierte auf der Fähigkeit des Ribozyms, die Spaltung einer Substrat-ssRNA oder -DNA an einer spezifischen Position zu katalysieren und das 3'-Ende des Substrats zum 3'-Ende des Ribozyms zu transferieren. Das Produkt der gewünschten Reaktion wurde unter Verwendung eines Oligodesoxynucleotid-Primers selektiert, der sich nur an das vollständige Produkt über die Bindung hinweg, die durch die katalytische Reaktion gebildet wurde, binden konnte, und ermöglichte selektive reverse Transkription der Ribozymsequenz. Die selektierten katalytischen Sequenzen wurden durch Anbindung des Promotors von T7-RNA-Polymerase an das 3'-Ende der cDNA, gefolgt von Transkription zu RNA, amplifiziert. Das Verfahren wurde verwendet, um aus einer kleinen Anzahl an Ribozymvarianten die Variante zu identifizieren, die gegenüber Spaltung eines selektierten Substrats am stärksten reaktiv war.
Nach dem Stand der Technik wurde nur eine sehr geringe Anzahl an chemischen Funktionen für Nucleinsäuren in ihren Wechselwirkungen mit anderen Substanzen erläutert oder vorgeschlagen: als Ziele für Proteine, die sich so entwickelten, dass sie bestimmte spezifische Oligonucleotidsequenzen binden; und erst jüngst als Katalysatoren mit einem eingeschränkten Bereich an Aktivitäten. Frühere "Selektions"-Versuche waren auf einen sehr engen Bereich an Varianten mit einer der zuvor beschriebenen Funktionen eingeschränkt. Nun wird zum ersten Mal erkannt, dass die Nucleinsäuren in der Lage sind, eine sehr viel größere Vielfalt an Funktionen auszuüben, und die Methodik, die zur Erkenntnis dieser Fähigkeit führt, ist hierin offenbart.
Die WO 91/19813 von Gold & Tuerk mit dem Titel "Nucleic Acid Ligands" beschreibt ein grundlegend neues Verfahren zur Bildung eines Nucleinsäureliganden für jedes beliebige erwünschte Ziel. Dieses Verfahren ist als das SELEX-Verfahren bekannt.
Das Verfahren des SELEX-Patents, auf das oben Bezug genommen wurde, basiert auf der einmaligen Erkenntnis, dass Nucleinsäuren über eine ausreichende Kapazität verfügen, zahlreiche verschiedene zwei- und dreidimensionale Strukturen zu bilden, und über ausreichende chemische Vielseitigkeit, die innerhalb ihrer Monomere erhältlich ist, verfügen, um als Liganden (aus spezifischen Bindungspaaren) mit praktisch jeder chemischen Verbindung, unabhängig davon, ob groß oder klein, zu wirken.
Das Verfahren umfasst die Selektion aus einem Gemisch von Kandidaten und schrittweise Wiederholungen struktureller Verbesserung unter Verwendung desselben allgemeinen Selektionsschemas, um praktisch jegliches erwünschtes Kriterium von Bindungsaffinität und -selektivität zu erreichen. Ausgehend von einem Gemisch von Nucleinsäuren, vorzugsweise einem, das ein Segment einer randomisierten Sequenz aufweist, umfasst das hierin als SELEX bezeichnete Verfahren die Schritte des Kontaktieren des Gemisches mit dem Ziel unter für Bindung günstigen Bedingungen, der Abtrennung ungebundener Nucleinsäuren von jenen Nucleinsäuren, die sich an Zielmoleküle binden, des Dissoziierens der Nucleinsäure-Zielpaare, der Amplifikation der Nucleinsäuren, die von den Nucleinsäure-Zielpaaren dissoziiert wurden, um ein ligandenangereichertes Gemisch von Nucleinsäuren zu erhalten, und anschließend das Wiederholen der Schritte von Binden, Abtrennung, Dissoziieren und Amplifizieren über mehrere Zyklen hinweg, wie erwünscht.
Wenn hier auch keine Einschränkung auf eine Herstellungstheorie beabsichtigt wird; so basiert SELEX auf der Erkenntnis der Erfinder, dass es innerhalb des Nucleinsäuregemischs, das eine große Anzahl an möglichen Sequenzen und Strukturen enthält, einen breiten Bereich an Bindungsaffinitäten für ein bestimmtes Ziel gibt. Ein Nucleinsäuregemisch, das beispielsweise ein randomisiertes Segment aus 20 Nucleotiden umfasst, kann 4²⁰ vermutliche Möglichkeiten aufweisen. Bei jenen, die höhere Affinitätskonstanten für das Ziel aufweisen, ist eine Bindung am wahrscheinlichsten. Nach Abtrennen, Dissoziieren und Amplifizieren wird ein zweites Nucleinsäuregemisch gebildet, das an Kandidaten mit höherer Bindungsaffinität angereichert ist. Zusätzliche Selektionsdurchgänge begünstigen schrittweise die besten Liganden, bis das resultierende Nucleinsäuregemisch vorwiegend aus nur einer oder ein paar wenigen Sequenzen zusammengesetzt ist. Diese können dann kloniert, sequenziert und einzeln auf Bindungsaffinität als reine Liganden getestet werden.
Selektions- und Amplifikationszyklen werden wiederholt, bis ein erwünschtes Ziel erreicht ist. Im allgemeinsten Fall wird Selektion/Amplifikation fortgesetzt, bis keine signifikante Verbesserung bezüglich Bindungsstärke bei einer Wiederholung des Zyklus mehr erreicht wird. Das Verfahren kann verwendet werden, um bis zu etwa 10¹⁸ verschiedene Nucleinsäure-Spezies zu überprüfen. Die Nucleinsäuren des Testgemischs umfassen vorzugsweise einen randomisierten Sequenzabschnitt sowie konservierte Sequenzen, die für wirksame Amplifikation erforderlich sind. Nucleinsäuresequenzvarianten können auf zahlreiche verschiedene Arten gebildet werden, ein schließlich Synthese randomisierter Nucleinsäuresequenzen und Größenselektion aus zufällig gespaltenen zellulären Nucleinsäuren. Der variable Sequenzabschnitt kann vollständig oder teilweise randomisierte Sequenz enthalten; auch kann er Unterabschnitte konservierter Sequenz enthalten, inkorporiert innerhalb der randomisierten Sequenz. Sequenzvariationen in Test-Nucleinsäuren können vor oder während der Wiederholungen von Selektion/Amplifikation durch Mutagenese eingeführt oder vermehrt werden.
In einer Ausführungsform des Verfahrens der SELEX-Patentanmeldungen ist das Selektionsverfahren so effizient bei der Isolierung jener Nucleinsäureliganden, die sich am stärksten an das ausgewählte Ziel binden, dass nur ein Selektions- und Amplifikationszyklus erforderlich ist. Solch eine effiziente Selektion kann beispielsweise in einem Verfahren vom Chromatographietyp auftreten, worin die Fähigkeit von Nucleinsäuren, mit Zielen zu assoziieren, die an eine Säule gebunden sind, auf solch eine Weise funktioniert, dass die Säule ausreichend fähig ist, Trennung und Isolierung von den Nucleinsäureliganden mit der höchsten Affinität zu ermöglichen.
In vielen Fällen ist es nicht notwendigerweise wünschenswert, die wiederholten Schritte von SELEX durchzuführen, bis ein einzelner Nucleinsäureligand identifiziert wird. Die zielspezifische Nucleinsäureliganden-Lösung kann eine Familie von Nucleinsäurestrukturen oder -motiven umfassen, die zahlreiche konservierte Sequenzen und zahlreiche Sequenzen, die, ohne die Affinität der Nucleinsäureliganden zum Ziel signifikant zu beeinflussen, substituiert oder hinzugefügt werden können, aufweisen. Durch Beenden des SELEX-Verfahrens vor dessen Abschluss ist es möglich, die Sequenz zahlreicher Mitglieder der Familie von Nucleinsäureliganden-Lösungen zu bestimmen.
Die Existenz zahlreicher Nucleinsäure-Primär-, -Sekundär- und -Tertiärstrukturen ist bekannt. Die Strukturen oder Motive, die am häufigsten in Wechselwirkungen, die nicht vom Watson-Crick-Typ sind, eingebunden sind, werden als Haarnadelschleifen, symmetrische und asymmetrische Aufweitungen, Pseudoknoten und unzählige Kombinationen dieser bezeichnet. Beinahe alle bekannten Fälle solcher Motive las sen darauf schließen, dass sie in einer Nucleinsäuresequenz von nicht mehr als 30 Nucleotiden gebildet werden können. Aus diesem Grund wird häufig bevorzugt, dass SELEX-Verfahren mit zusammenhängenden randomisierten Segmenten mit Nucleinsäuresequenzen initiiert werden, die ein randomisiertes Segment von zwischen etwa 20-50 Nucleotiden enthalten.
Die SELEX-Patentanmeldungen beschreiben auch Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsäureliganden, die sich an mehr als eine Stelle des Zielmoleküls binden, und Nucleinsäureliganden, die Nicht-Nucleinsäure-Spezies umfassen, die sich an spezifische Stellen am Ziel binden. Das SELEX-Verfahren stellt ein Mittel zur Isolierung und Identifikation von Nucleinsäureliganden bereit, die sich an jegliches erdenkliches Ziel binden. In bevorzugten Ausführungsformen jedoch wird das SELEX-Verfahren in Situationen angewandt, in denen das Ziel ein Protein ist, einschließlich Nucleinsäure-Bindungsproteine und Proteine, die nicht dafür bekannt sind, Nucleinsäure als Teil ihrer biologischen Funktion zu binden.
Nur wenig ist über RNA-Struktur bei hoher Auflösung bekannt. Die Basis-A-Form-Helixstruktur von doppelsträngiger RNA ist aus Faserbeugungsstudien bekannt. Röntgenkristallographie ergab die Struktur einiger weniger tRNAs und einer kurzen poly-AU-Helix. Die Röntgenstruktur eines tRNA/Synthetase-RNA/Protein-Komplexes wurde auch aufgeklärt. Die Strukturen von zwei Tetranucleotid-Haarnadelschleifen und eines Modell-Pseudoknotens sind aus NMR-Studien bekannt.
Es gibt mehrere Gründe für die geringe Menge an Strukturdaten. Bis zur Entwicklung von In-vitro-RNA-Synthese war es schwierig, solche Mengen an RNA zu isolieren, die für strukturelles Arbeiten ausreichend war. Bis zur Entdeckung katalytischer RNAs gab es nur wenige RNA-Moleküle, die für strukturelle Untersuchungen überhaupt als geeignet erachtet wurden. Gute tRNA-Kristalle waren schwierig zu gewinnen, was die Durchführung anderer Kristallstudien wenig attraktiv machte. Die Technologie für eine NMR-Studie an Molekülen dieser Größe wurde erst vor kurzer Zeit zugänglich.
Wie zuvor beschrieben sind mehrere Beispiele für katalytische RNA-Strukturen bekannt, und es wurde das SELEX-Verfahren entwickelt, das RNAs selektiert, die sich fest an zahlreiche verschiedene Zielmoleküle binden – und schließlich in der Lage sind, ebenfalls auf neue katalytische RNA-Strukturen zu selektieren. Es wurde nun wichtig, die Struktur dieser Moleküle zu kennen, um zu lernen, wie diese genau funktionieren, und dieses Wissen zu nützen, um sie zu verbessern.
Es wäre wünschenswert, ausreichend viel von RNA-Faltung zu verstehen, um in der Lage zu sein, die Struktur einer RNA mit weniger Aufwand vorherzusagen und nicht auf rigorose NMR- und Röntgen-Kristallstrukturbestimmung zurückgreifen zu müssen. Sowohl für Proteine als auch für RNAs gab es stets den Wunsch, in der Lage zu sein, Strukturen basierend auf Sequenzen und auf der Grundlage nur weniger (oder keiner) Versuchsdaten zu berechnen.
Proteinstrukturvorhersage ist bekannt schwierig. Bei einer ersten Annäherung bilden sich Sekundärstruktur und Tertiärstruktur von Proteinen zusammen; Proteinfaltung kann thermodynamisch durch ein Zwei-Phasen-Modell, mit vollständig gefalteten und vollständig ungefalteten Phasen, angenähert werden. Dies bedeutet, dass die Anzahl an Freiheitsgraden zum Modellieren einer Proteinstruktur sehr groß ist; ohne vorhersehbare Zwischenprodukte kann das Problem der Vorhersage nicht in kleinere, leichter lösbare Teilprobleme aufgeteilt werden. Dahingegen scheinen RNAs häufig gut definierte Sekundärstrukturen zu bilden, die mehr Stabilität als die Tertiär-Wechselwirkungen bereitstellen. Die Tertiärstruktur von tRNA kann beispielsweise ohne die Sekundärstruktur aufzubrechen durch Chelatbildung von Magnesium oder durch Anheben der Temperatur aufgebrochen werden. Sekundärstrukturvorhersage für RNAs ist durchwegs bekannt und ist im Allgemeinen für kleine RNA-Moleküle durchaus exakt. Für RNAs kann strukturelle Vorhersage in Teilprobleme unterteilt werden; zuerst wird die Sekundärstruktur vorhergesagt; dann wird vorhergesagt, wie die resultierenden Helices und die verbleibenden Einzelstränge in Bezug zueinander angeordnet sind.
Bezüglich RNA sind die ersten Versuche struktureller Vorhersage für tRNAs gemacht worden. Die Sekundärstruktur des kanonischen tRNA-Kleeblatts war aus vergleichender Sequenzanalyse bekannt, was das Problem auf eines des Anordnens von vier kurzen A-Form-Helices relativ zueinander im Raum reduzierte. Manuelles CPK-Modellieren, überschlagsmäßige Energieminimierung und einige wenige Abstandsbeschränkungen, die aus Vernetzungsstudien und phylogenetischen Kovariationen verfügbar waren, wurden verwendet, um ein tRNA-Modell zu erstellen, das sich leider als falsch erwies, als die erste Kristallstruktur von Phenylalanin-tRNA einige Jahre später aufgeklärt wurde.
Computermodellieren hat nun manuelles Modellieren ersetzt, wodurch den durch Schwerkraft und Masse bedingten Schwierigkeiten des Modellbauers Abhilfe geschaffen wurde. Computermodellieren kann ohne zusätzliche experimentelle Daten nur in Situationen verwendet werden, in denen eine homologe Struktur bekannt ist; beispielsweise wurde die Struktur des 3'-Ende des Wasserrübengelbmosaik-Virus-RNA-Genoms, basierend auf der bekannten 3D-Struktur von tRNA und dem Wissen, dass das 3'-Ende von TYMV von zahlreichen zellulären tRNA-Modifikationsenzymen als tRNA-ähnlich erkannt wird, modelliert. Dieses Modell war das erste 3D-Modell eines RNA-Pseudoknotens; die grundlegende Struktur eines isolierten Modell-Pseudoknotens wurde durch NMR-Daten bestätigt.
Arbeitsvorschriften zur Computermodellierung wurden, eingeschränkt durch die manuelle Untersuchung von Daten zu chemischem und enzymatischem Schutz, verwendet, um die Strukturen mehrerer RNA-Moleküle zu modellieren. In einer isolierten Unterstruktur wurde für ein Modell für die Konformation einer GNRA-Tetranucleotidschleife durch NMR-Studie einer isolierten GNRA-Haarnadelschleife gezeigt, dass sie im Wesentlichen korrekt war.
Francois Michel (Nature 342, 391 (1989)) konstruierte ein Modell für den katalytischen Kern von Gruppe-I-Introns. Wie im Fall der tRNAs ist die Sekundärstruktur von Gruppe-I-Intron-Kernen aus vergleichender Sequenzanalyse durchwegs bekannt, sodass das Problem auf eines der korrekten Anordnung von Helices und den verbleibenden einzelsträngigen Regionen reduziert wird. Michel (1989, s.o.) analysierte eine Abgleichreihe von 87 Gruppe-I-Intron-Sequenzen mittels Sichtprüfung und fand sieben starke paarweise und Triplett-Kovariationen außerhalb der Sekundärstruktur, die er als Tertiärkontakte interpretierte und manuell als Beschränkungen an seinem Modell inkorporierte. Bis jetzt gibt es keine unabhängige Bestätigung des Michel-Modells.
Andere versuchten, ein automatisiertes Verfahren zu entwickeln, um mit Abstandsbeschränkungen aus Vernetzung, Fluoreszenztransfer oder phylogenetischer Covariation umzugehen. Die RNA wird als eine Assemblierung von Zylindern (A-Form-Helices) und Perlen (einzelsträngige Reste) behandelt, und ein mathematisches Verfahren, das als Abstandsgeometrie bezeichnet wird, wird verwendet, um Anordnungen dieser Elemente zu bilden, die mit einer Reihe von Abstandsbeschränkungen übereinstimmen. Unter Verwendung einer kleinen Reihe von sieben Abstandsbeschränkungen an der Phenylalanin-tRNA-Tertiärstruktur ergab diese Arbeitsvorschrift die bekannte L-Form der tRNA-Struktur in etwa 2/3 der Fälle.
Das HIV-1-tat-Protein aktiviert Transkription in der langen terminalen Wiederholung (LTR) des viralen Genoms von HIV-1. Siehe Cullen et al., Cell 58, 423 (1989). Der Aktivierungsmechanismus ist nicht klar oder zumindest umstritten, erfordert jedoch, dass die transkribierte RNA eine spezifische Haarnadelstruktur mit einer Trinucleotidaufweitung (TAR genannt) enthält. Die natürliche TAR-RNA und die Stelle von tat-Wechselwirkung sind in 25 gezeigt. Für eine kleine Basis-Domäne des tat-Proteins wurde gezeigt, dass sie direkt mit der TAR-RNA-Sequenz wechselwirkte. Siehe Weeks et al., Science 249, 1281 (1990); Roy et al., Genes Dev. 4, 1365 (1990); Calnan et al., Genes Dev. 5, 201 (1991a). Arginine innerhalb dieser Basis-Domäne sind eindeutig für die Wechselwirkung maßgeblich. Siehe Calnan et al., s.o. (1991a); Subramanian et al., EMBO 10, 2311-2318 (1991); Calnan et al., Science 252, 1167-1171 (1991b). Arginin alleine ist durch die TAR-RNA-Sequenz spezifisch gebunden und kann um tat-Proteinbindung konkurrieren. Siehe Tao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2723-2726 (1992); Puglisi et al., Science 257, 76-80 (1992).
Tat-TAR-Wechselwirkungen alleine sind nicht ausreichend, um Transaktivierung zu unterstützen; vermutlich ist ein Zellfaktor – ein 68-kD-Schleifenbindungsprotein – für kooperative Bindung mit dem tat-Protein an TAR und darauf folgende In-vivo- oder In-vitro-Transaktivierung erforderlich. Siehe Marciniak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3624 (1990a); Marciniak et al., Cell 63, 791 (1990b). Überexpression der TAR-Sequenz in retroviral transformierten Zelllinien macht sie gegenüber HIV-1-Infektionen hoch resistent. Siehe Sullenger et al., Cell 63, 601 (1990).
Thrombin ist eine multifunktionelle Serinprotease, die wichtige prokoagulierende und antikoagulierende Aktivitäten aufweist. Als ein prokoagulierendes Enzym koaguliert Thrombin Fibrinogen, aktiviert Gerinnungsfaktoren V, VIII und XIII und aktiviert Blutplättchen. Die spezifische Spaltung von Fibrinogen durch Thrombin initiiert die Polymerisation von Fibrinmonomeren, ein primäres Ereignis bei der Bildung von Blutgerinnsel. Das zentrale Ereignis bei der Bildung von Blutplättchenthromben ist die Aktivierung von Blutplättchen aus dem "nichtbindenden" in den "bindenden" Modus, und Thrombin ist der stärkste physiologische Aktivator im Rahmen der Blutplättchenaggregation (Berndt & Phillips, in: Platelets in Biology and Pathology, J.L. Gordon (Hrsg.), Amsterdam: Elsevier/North Holland Biomedical Press, 43-74 (1981); Hansen & Harker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3184 (1988); Eidt et al., J. Clin. Invest 84, 18 (1989)). Somit spielt Thrombin als prokoagulierendes Mittel eine zentrale Rolle bei der Stoppung einer Blutung (physiologische Hämostase) und bei der Bildung von gefäßverschließenden Thromben (pathologische Thrombose).
Als Antikoagulans bindet sich Thrombin an Thrombomodulin (TM), ein Glykoprotein, das an der Oberfläche von Gefäßendothelzellen exprimiert wird. TM verändert die Substratspezifität von Fibrinogen und Blutplättchen zu Protein C durch eine Kombination einer allosterischen Änderung in der Aktivstellenkonformation und einer Überlappung der TM- und Fibrinogen-Bindungsstellen an Thrombin. Aktiviertes Protein C, in Gegenwart einer Phospholipid-Oberfläche, Ca²⁺ und ein zweiter, Vitamin-K-abhängiger Protein-Cofaktor, Protein S, inhibiert Koagulation durch proteolytisch abbauende Faktoren Va und VIIIa. Somit konvertiert die Bildung des Thrombin-TM-Komplexes Thrombin von einem prokoagulierenden zu einem antikoagulierenden Enzym, und das normale Gleichgewicht zwischen diesen sich entgegengesetzten Aktivitäten ist für die Regulierung von Hämostase wichtig.
Thrombin ist auch in biologische Reaktionen eingebunden, die in keinem nahen Zusammenhang mit dem Koagulationssystem mehr stehen (zusammengefasst in Shuman, Ann. N. Y. Acad. Sci. 485, 349 (1986); Marx, Science 256, 1278 (1992)). Thrombin ist chemotaktisch für Monozyten (Bar-Shavit et al., Science 220, 728 (1983)), mitogen für Lymphozyten (Chen et al., Exp. Cell Res. 101, 41 (1976)), Mesenchymzellen (Chen & Buchanan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 131 (1975)) und Fibroblasten (Marx, s.o. (1992)). Thrombin aktiviert Endothelzellen, um das neutrophile adhäsive Protein GMP-140 (PADGEM) zu exprimieren (Hattori et al., J. Biol. Chem. 264, 7768 (1989)) und aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor zu produzieren (Daniel et al., J. Biol. Chem. 261, 9579 (1986)). Erst jüngst wurde gezeigt, dass Thrombin kultivierte Nervenzellen dazu bewegt, ihre Axone zurückzuziehen (erörtert in Marx, s.o. (1992)).
Der Mechanismus, durch den Thrombin Blutplättchen und Endothelzellen aktiviert, erfolgt durch einen funktionellen Thrombinrezeptor, der an diesen Zellen zu finden ist. Eine mutmaßliche Thrombin-Spaltungsstelle (LDR/S) im Rezeptor lässt darauf schließen, dass der Thrombinrezeptor durch proteolytische Spaltung des Rezeptors aktiviert wird. Dieses Spaltungsereignis "demaskiert" eine N-terminale Domäne, die dann als Ligand wirkt und den Rezeptor aktiviert (Vu et al., Cell 64, 1054 (1991)).
Gefäßverletzung und Thrombenbildung sind die Schlüsselereignisse in der Pathogenese verschiedener Gefäßerkrankungen, einschließlich Atherosklerose. Die pathogenen Abläufe der Aktivierung von Blutplättchen und/oder des Koagulationssystems, die zu Thrombose in verschiedenen Erkrankungszuständen und an verschiedenen Stellen, wie z.B. den Koronararterien, Herzkammern und Herzklappenprothesen, führen, scheinen unterschiedlich zu sein. Daher kann die Verwendung eines Blutplättchen-Inhibitors, eines Antikoagulans oder einer Kombination von beiden in Verbindung mit thrombolytischen Mitteln erforderlich sein, um geschlossene Blutgefäße zu öffnen und neuerlichen Verschluss zu unterbinden.
Kontrollierte Proteolyse durch Verbindungen der Koagulationskaskade ist für Hämostase maßgeblich. Folglich existieren zahlreiche verschiedene, komplexe Regulationssysteme, die teilweise auf einer Reihe hoch spezifischer Protease-Inhibitoren basieren. In einer pathologischen Situation kann funktionelle Inhibierungsaktivität durch übermäßige Produktion aktiver Protease oder Inaktivierung von Inhibierungsaktivität unterbrochen werden. Die Fortdauer einer Entzündung als Reaktion auf Mehrfachtraumata (Gewebeschaden) oder Infektion (Sepsis) hängt von proteolytischen Enzymen, sowohl aus dem Plasma-Kaskadensystem, einschließlich Thrombin, als auch lysosomalen Ursprungs, ab. Multiorganversagen (MOF) in diesen Fällen wird durch gleichzeitig auftretendes Ungleichgewicht zwischen Proteasen und ihren Inhibierungsregulatoren gefördert. Ein Ungleichgewicht von Thrombinaktivität im Gehirn kann zu neurodegenerativen Erkrankungen führen.
Thrombin wird auf natürliche Weise bei der Hämostase durch Bindung an Antithrombin III (ATIII) in einer Heparin-abhängigen Reaktion inhibiert. Heparin übt seine Wirkung durch seine Fähigkeit aus, die Wirkung von ATIII zu beschleunigen. Im Gehirn kann Protease Nexin (PN-1) der natürliche Inhibitor von Thrombin sein, um Axonenauswuchs zu regulieren.
Heparin ist ein Glykosoaminoglycan, zusammengesetzt aus Ketten alternierender Reste von D-Glucosamin und Uronsäure. Heparin wird zur Zeit ausführlich als ein Antikoagulans bei der Behandlung instabiler Angina, Lungenembolie, Atherosklerose, Thrombose und nach einem Myokardinfarkt verwendet. Seine antikoagulierende Wirkung wird durch seine Wechselwirkung mit ATIII vermittelt. Bindet sich Heparin an ATIII, so wird die Konformation von ATIII verändert, und es wird zu einem signifikant gestärkten Inhibitor von Thrombin. Obwohl Heparin im Allgemeinen als wirksam für bestimmte Indikationen betrachtet wird, wird angenommen, dass die physikalische Größe des ATIII-Heparin-Komplexes Zugang auf einen großen Teil des biologisch aktiven Thrombins im Körper verhindert, wodurch seine Fähigkeit, Blutgerinnselbildung zu inhibieren, vermindert wird. Nebenwirkungen von Heparin umfassen Blutungen, Thrombozytopenie, Osteoporose, Hautnekrose, Alpe, Hypersensibilität und Hypoaldosteronismus.
Hirudin ist ein starker Peptid-Inhibitor von Thrombin, gewonnen aus dem europäischen medizinischen Blutegel Hirudis medicinalis. Hirudin hemmt alle bekannten Funktionen von α-Thrombin, und es wurde gezeigt, dass es Thrombin an zwei getrennten Stellen kinetisch bindet; einer Stelle hoher Affinität bei oder nahe der katalytischen Stelle für Serinprotease-Aktivität und einer zweiten anionischen Exostelle. Die anionische Exostelle bindet auch Fibrinogen, Heparin, TM und vielleicht auf den Rezeptor, der in die Vermittlung der Aktivierung von Blutplättchen und Endothelzellen eingebunden ist. Ein C-terminales Hirudinpeptid – für das durch Co-Kristallisierung mit Thrombin gezeigt wurde, dass es in der anionischen Exostelle bindet – zeigt Inhibierungswirkungen auf Fibrinbildung, Blutplättchen- und Endothelzellenaktivierung sowie Protein-C-Aktivierung über TM-Bindung, wahrscheinlich durch Konkurrieren um Bindung an dieser Stelle. Dieses Peptid inhibiert keine proteolytische Aktivität gegenüber chromogenen Tripeptid-Substraten, Faktor V oder X.
Die Struktur von Thrombin macht es aufgrund der anionischen Exostelle zu einem besonders wünschenswerten Ziel für Nucleinsäurebindung. Ortsgerichtete Mutagenese innerhalb dieser Stelle zeigte, dass Fibrinogen-Koagulations- und TM-Bindungs-Aktivitäten voneinander trennbar sind. Es ist denkbar, dass ein RNA-Ligand ausgewählt werden könnte, der je nachdem, wie er mit Thrombin wechselwirkt, d.h. welches Substrat er nachahmt, Prokoagulations- und/oder Antikoagulationswirkungen aufweist.
Ein einzelsträngiger DNA-Ligand zu Thrombin wurde gemäß einem Verfahren, das mit SELEX identisch ist, hergestellt. Siehe Bock et al., Nature 355, 564 (1992). Ein Consensus-Ligand wurde identifiziert, nachdem relativ wenige Durchgänge von SELEX durchgeführt worden waren, für den gezeigt wurde, dass er eine gewisse Fähigkeit besaß, Blutgerinnungsbildung in vitro zu unterbinden. Der Ligand ist die 15mere DNA 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3', die hierin als G15D (Seq.-ID Nr. 1) bezeichnet wird. Die symmetrische Beschaffenheit der Primärsequenz lässt darauf schließen, dass G15D eine reguläre fixierte Tertiärstruktur aufweist. Die kD von G15D zu Thrombin beträgt etwa 2 × 10^–7. Für wirksame Thrombin-Inhibierung als ein Antikoagulans heißt es, je stärker die Affinität des Liganden zu Thrombin, desto besser.
Basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) ist ein multifunktioneller Effektor für zahlreiche Zellen mesenchymalen und neuralektodermalen Ursprungs (Rifkin & Moscatelli, J. Cell Biol. 109, 1 (1989); Baird & Bohlen, in: Peptide Growth Factors and Their Rezeptors (M.B. Sporn & A.B. Roberts, Hrsg.), Springer, N.Y., 369-418 (1991); Basilico & Moscatelli, Adv. Cancer Res. 59, 115 (1992)). Er ist eines der am intensivsten untersuchten und am besten charakterisierten Mitglieder einer Familie verwandter Proteine, die auch sauren FGF (Jaye et al., Science 233, 541 (1986); Abraham et al., Science 233, 545 (1986)), int-2 (Moore et al., EMBO J. 5, 919 (1986)), kFGF/hst/KS3 (Delli-Bovi et al., Cell 50, 729 (1987); Taira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2980 (1987)), FGF-5 (Zhan et al., Mol. Cell. Biol. 8, 3487 (1988)), FGF-6 (Marics et al., Oncogene 4, 335 (1989)) und Keratinozyten-Wachstumsfaktor/FGF-7 (Finch et al., Science 245, 752 (1989)) umfasst.
In vitro stimuliert bFGF Zellproliferation, Migration und Induktion von Plasminogenaktivator und Collagenese-Aktivitäten (Presta et al., Mol. Cell. Biol. 6, 4060 (1986); Moscatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2091 (1986); Mignatti et al., J. Cell Biol. 108, 671 (1989)). In vivo ist er einer der stärksten Induktoren von Neovaskularisation. Seine angiogene Aktivität in vivo lässt auf eine Rolle bei Gewebemodellierung und Wundheilung, jedoch auch in bestimmten Erkrankungszuständen, die durch pathologische Neovaskularisation wie z.B. Tumorproliferation, Tumormetastase, diabetische Retinopathie und rheumatoide Arthritis charakterisiert sind, schließen (Folkman & Klagsbrun, Science 235, 442 (1987); Gospodarowitz, Cell Biology Reviews 25, 307 (1991)).
Obwohl bFGF keine Signalsequenz für Sekretion aufweist, wird er an beiden Seiten der Plasmamembran gefunden, wohin er wahrscheinlich über Exozytose exportiert wurde (Vlodavsky et al., Trends Biol. Sci 16, 268 (1991); Mignatti & Rifkin, J. Cell. Biochem. 47, 201 (1991)). In der extrazellulären Matrix ist er typischerweise mit einer Fraktion assoziiert, die Heparansulfat-Proteoglycane enthält. Tatsächlich war Hepa rin-Affinitätschromatographie bisher ein nützliches Verfahren zur Reinigung dieser und anderer Heparin-bindender Wachstumsfaktoren. In Zellkultur bindet sich bFGF an nieder- und hochaffine Stellen. Die niederaffinen Stellen bestehen aus zellassoziierten Heparansulfat-Proteoglycanen, an die sich bFGF mit etwa nanomolarer Affinität bindet (Moscatelli, J. Cell. Physiol. 131, 123 (1987)). Alle biologischen Wirkungen von bFGF werden durch Wechselwirkung mit den hochaffinen Bindungsstellen (10-100 pM) vermittelt, die für den dimeren Tyrosinkinase-FGF-Rezeptor stehen (Ueno et al., J. Biol. Chem. 267, 1470 (1992)). Fünf FGF-Rezeptorgene wurden bis heute identifiziert, von denen jedes mehrere Strukturvarianten infolge alternativen mRNA-Spleißens bilden kann (Armstrong et al., Cancer Res. 52, 2004 (1992); Ueno et al., s.o. (1992)). Es gibt bis heute wesentliche Beweise, dass die nieder- und hochaffinen Bindungsstellen bei der Bestimmung der gesamten Affinität von bFGF kooperativ wirken. Versuche mit mutierten Zelllinien, die mangelhafte Glycosoaminoglycan-Synthese aufweisen (Yayon et al., Cell 64, 841 (1991)), oder Heparitinasebehandelten Zellen (Rapraeger et al., Science 252, 1705 (1991)) zeigten, dass Bindung entweder von zellassoziiertem Heparansulfat oder, in dessen Abwesenheit, von exogen hinzugefügtem Heparin an bFGF für Signalgebung über den Tyrosinkinaserezeptor erforderlich ist. Die erst jüngst erfolgte Auflösung von beobachteter Kd in ihre kinetischen Komponenten zeigt, dass, während die Assoziationsraten von bFGF an die nieder- und hochaffinen Stellen vergleichbar sind, die Dissoziationsraten von bFGF von dem Zelloberflächenrezeptor 23fach geringer sind als jene für das zellassoziierte Heparansulfat (Nugent & Edelman, Biochemistry 31, 8876 (1992)). Die niedrigere Abgangsrate wird jedoch nur beobachtet, wenn der Rezeptor an die Zelloberfläche gebunden ist, was darauf schließen lässt, dass gleichzeitige Bindung an beide Stellen zur allgemeinen hochaffinen Bindung beiträgt. Dies ist in Anbetracht der Beobachtung, dass die Heparin-Bindungs- und Rezeptor-Bindungsstellen an benachbarten, jedoch voneinander getrennten Regionen des Moleküls angeordnet sind, wie ausgehend von der erst jüngst aufgelösten Röntgen-Kristallstruktur von bFGF bestimmt wurde, wahrscheinlich (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3446 (1991); Eriksson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3441 (1991); Ago et al., J. Biochem. 110, 360 (1991); Zhu et al., Science 251, 90 (1991)).
Die Idee, dass bFGF-Antagonisten über nützliche medizinische Anwendungsmöglichkeiten verfügen können, ist nicht neu (zusammengefasst in Gospodarowicz, s.o. (1991)). Für bFGF ist nun bekannt, dass er eine Schlüsselrolle bei der Entstehung von Läsionen an Glattmuskelzellen nach Gefäßverletzungen spielt (Reidy et al., Circulation, Beilage 111 86, III-43). Überexpression von bFGF (und anderer Mitglieder der FGF-Familie) korreliert mit zahlreichen malignen Störungen (Halaban et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 638, 232 (1991); Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5710 (1990); Fujimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 180, 386 (1991)), und erst jüngst wurde für neutralisierende Anti-bFGF-Antikörper erkannt, dass sie Wachstum fester Tumoren in vivo durch Inhibierung tumorverbundener Angiogenese unterdrücken (Hori et al., Cancer Res: 51, 6180 (1991)). In diesem Zusammenhang ist die kürzlich durchgeführte therapeutische Untersuchung von Suramin, einem polysulfatierten Naphthalinderivat mit bekannter, Protozoen bekämpfender Aktivität, als ein tumorbekämpfendes Mittel nennenswert. Von Suramin wird angenommen, dass es die Aktivität von bFGF durch Bindung in der Polyanionen-Bindungsstelle und Störung der Wechselwirkung des Wachstumsfaktors mit seinem Rezeptor inhibiert (Middaugh et al., Biochemistry 31, 9016 (1992); Eriksson et al., s.o. (1992)). Zusätzlich zu zahlreichen, nicht wünschenswerten Nebenwirkungen und wesentlicher Toxizität ist Suramin dafür bekannt, mit mehreren anderen, Heparin bindenden Wachstumsfaktoren wechselzuwirken, was eine Verbindung seiner vorteilhaften therapeutischen Wirkungen mit spezifischen Wirkstoff-Protein-Wechselwirkungen schwierig gestaltet (La Rocca et al., Cancer Cells 2, 106 (1990)). Anti-angiogene Eigenschaften bestimmter Heparinpräparate wurden ebenfalls beobachtet (Folkman et al., Science 221, 719 (1983); Crum et al., Science 250, 1375 (1985)), und diese Wirkungen basieren wahrscheinlich zumindest teilweise auf ihrer Fähigkeit, bFGF-Signalgebung zu stören. Wenn nun auch die spezifische Heparinfraktion, die zu bFGF-Bindung beiträgt, teilweise aufgeklärt ist (Ishai-Michaeli et al., Biochemistry 21, 2080 (1992); Turnbull et al., J. Biol. Chem. 267, 10337 (1992)), so ist ein typisches Heparinpräparat hinsichtlich Größe, Sulfationsgrad und Iduronsäuregehalt stets heterogen. Darüber hinaus beeinflusst Heparin auch zahlreiche Enzyme und Wachstumsfaktoren. Daher sind, unter Ausnahme von monoklonalen Antikörpern, spezifische Antagonisten von bFGF nicht bekannt.
Tuerk & Gold, Science 249, 505-510 (1990), beschreiben das grundlegende SELEX-Verfahren unter Verwendung eines RNA-Kandidatengemischs und von T4-DNA-Polymerase als ein Ziel.
Thiesen & Bach beschreiben in Nucleic Acids Res. 18, 3203-3209 (1990), ein neues Verfahren, das als Target Detection Assay (TDA) bezeichnet wird, um DNA-Bindungsstellen für mutmaßliche DNA-Bindungsproteine zu bestimmen. Der TDA-Zyklus besteht aus vier voneinander getrennten Schritten: einem randomisierten DNA/Protein-Inkubationsschritt, einem Protein:DNA-Komplex-Trennungssschritt, einem DNA-Elutionsschritt und einem Schritt der Polymerasekettenreaktion- (PCR-) DNA-Amplifikation. Um die Effizienz des TDA-Verfahrens zu testen, werden potenzielle DNA-Bindungsstellen durch das DNA-Bindungsprotein SP1 aus einem Pool von Oligonucleotiden mit randomisierten Nucleotiden an 12 Positionen selektiert. Zielstellen, die durch rekombinantes SP1 selektiert wurden, stimmten mit der SP1-Consensusstelle sehr stark überein.
Famulok & Szostak, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31, 979-988 (1992), ist ein zusammenfassender Artikel, in dem In-vitro-Selektion von spezifischen Ligandenbindungs-Nucleinsäuren beschrieben wird. Der Artikel beschreibt SELEX als eine Vorgehensweise zur Bildung von RNA-Molekülen, die sich an DNA binden. Ebenfalls werden die Selektion von DNA für Proteinerkennung, die Selektion auf veränderte katalytische Eigenschaften von Ribozymen sowie molekulare Erkennung kleiner Substrate durch Nucleinsäuren erörtert.
Bartel et al. beschreiben in Cell 67, 529-536 (1991), eine genetische Selektion in vitro, um die wichtigen strukturellen Eigenschaften des viralen RNA-Elements, das durch das Rev-Protein von HIV-1 gebunden ist, zu identifizieren. Funktionelle Rev-Bindungs-RNAs werden aus einem Pool von 10¹³ Varianten der Wildtyp-Rev-Bindungsdomäne selektiert. Basen, die unter den Bindungsspezies konserviert sind, definierten ein Bindungselement mit einem aus 20 Nucleotiden bestehenden Kern. Kovariationen mancher dieser konservierten Basen zeigten auf, dass das Rev- Bindungselement ein Stamm-Aufweitung-Stamm-Element mit einem G:G-Basenpaar in der Aufweitung war.
Die WO 92/14843 von Toole et al. beschreibt ein SELEX-Verfahren zur Identifikation von Oligomersequenzen, die Zielmoleküle wie Serumproteine, Kinine, Eicosanoide und extrazelluläre Proteine spezifisch binden. Das Verfahren wurde verwendet, um Aptamere zu bilden, die sich an Serum Faktor X, Thrombin, Bradykinin, PGF2 alpha und Zelloberflächenmoleküle banden.
Die WO 93/04204 von Ecker et al. beschreibt SELEX-ähnliche Verfahren, die zur Bestimmung von Oligomeren, die spezifische Aktivität für ein Zielmolekül aus einem Pool von primär randomisierten, assemblierten Untereinheiten aufweisen, nützlich sind. Die offenbarten Verfahren umfassen wiederholte Synthesen von immer stärker vereinfachten Reihen von Oligomeren in Verbindung mit Selektionsverfahren zur Bestimmung von Oligomeren, die die höchste Aktivität aufweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Identifikation und Herstellung von Nucleinsäureliganden sowie die so identifizierten und hergestellten Nucleinsäureliganden. Das oben beschriebene SELEX-Verfahren ermöglicht die Identifikation eines einzelnen Nucleinsäureliganden oder einer Familie von Nucleinsäureliganden für ein bestimmtes Ziel. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Analyse des Nucleinsäureliganden oder der Familie von Nucleinsäureliganden, durch SELEX erhalten, um verbesserte Nucleinsäureliganden zu identifizieren und herzustellen.
Diese Erfindung umfasst Verfahren zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von Nucleinsäureliganden. Solche Verfahren umfassen mathematisches Modellieren und Strukturmodifikationen der durch SELEX abgeleiteten Liganden. Weiters umfasst die Erfindung Verfahren zur Bestimmung, welche Nucleinsäurereste in einem Nucleinsäureliganden zur Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur des Ligan den erforderlich sind und welche Reste mit dem Ziel wechselwirken, um die Bildung von Liganden-Ziel-Bindungspaaren zu erleichtern.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Nucleinsäureliganden aufgrund ihre Fähigkeit erwünscht, eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten des Ziels zu inhibieren. In solchen Fällen werden Verfahren zur Bestimmung, ob der Nucleinsäureligand die erwünschte biologische Aktivität wirksam inhibiert, bereitgestellt.
Weiters umfasst diese Erfindung Verfahren zur Identifikation von fester bindenden RNA-Liganden und kleineren, stabileren Liganden zur Verwendung zu pharmazeutischen oder diagnostischen Zwecken.
Die vorliegende Erfindung umfasst verbesserte Nucleinsäureliganden zu den HIV-RT- und HIV-1-Rev-Proteinen. Auch eingebunden sind Nucleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen homolog zu den spezifisch hierin identifizierten Nucleinsäureliganden sind und die im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit wie diese Nucleinsäureliganden besitzen, HIV-RT oder das HIV-1-Rev-Protein zu binden.
Auch eingebunden in den Schutzumfang der Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung von SELEX-Reihenversuchen, um verlängerte Nucleinsäureliganden zu identifizieren. Insbesondere werden verlängerte Nucleinsäureliganden zum HIV-RT-Protein offenbart. Nucleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen homolog zu den verlängerten HIV-RT-Nucleinsäureliganden sind und die im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit wie diese Liganden besitzen, HIV-RT zu binden, sind auch in dieser Erfindung eingebunden.
Der Schutzumfang der Erfindung umfasst auch Nucleinsäureliganden zum HIV-1-tat-Protein. Insbesondere wurden RNA-Sequenzen identifiziert, die zu Bindung an das tat-Protein in der Lage sind. Im Schutzumfang der Erfindung liegen auch Nucleinsäureliganden-Lösungen, die in den 26 und 27 gezeigt sind.
Weiters umfasst diese Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Nucleinsäureliganden und Ligandenlösungen für das HIV-1-tat-Protein, umfassend die Schritte a) des Herstellens eines Kandidatengemischs aus Nucleinsäuren; b) des Selektierens zwischen Elementen des Kandidatengemischs auf Grundlage von Affinität zum tat-Protein; und c) der Amplifikation der selektierten Moleküle, um ein Nucleinsäuregemisch zu erhalten, das an Nucleinsäuresequenzen mit einer relativ hohen Affinität für Bindung an das tat-Protein angereichert ist.
Weiters umfasst diese Erfindung Nucleinsäureliganden zu Thrombin. Insbesondere wurden RNA-Sequenzen identifiziert, die in der Lage sind, sich an Thrombin zu binden. Die Erfindung umfasst die in den 29 und 30 gezeigten Nucleinsäureliganden-Lösungen.
Darüber hinaus umfasst diese Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Nucleinsäureliganden und Ligandenlösungen zu Thrombin, umfassend die Schritte a) des Herstellens eines Kandidatengemischs aus Nucleinsäuren; b) des Selektierens zwischen Elementen des Kandidatengemischs auf Grundlage von Affinität zu Thrombin; und c) der Amplifikation der selektierten Moleküle, um ein Nucleinsäuregemisch zu erhalten, das an Nucleinsäuresequenzen mit einer relativ hohen Affinität für Bindung an Thrombin angereichert ist.
Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung RNA-Liganden zu Thrombin, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, einschließlich jener Liganden, die in 29 (Seq.-ID Nr. 137-155) aufgelistet sind. Auch sind RNA-Liganden zu Thrombin eingebunden, die im Wesentlichen zu jedem beliebigen der gegebenen Liganden homolog sind und die im Wesentlichen über dieselbe Fähigkeit verfügen, sich an Thrombin zu binden. Weiters umfasst diese Erfindung RNA-Liganden zu Thrombin, die im Wesentlichen dieselbe strukturelle Form wie die hierin präsentierten Liganden aufweisen und die im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit aufweisen, sich an Thrombin zu binden.
Weiters umfasst diese Erfindung Nucleinsäureliganden zu bFGF. Insbesondere werden RNA-Sequenzen bereitgestellt, die in der Lage sind, sich spezifisch an bFGF zu binden. Die Erfindung umfasst die in den Tabellen II-IV gezeigten Nucleinsäureligandensequenzen (Seq.-ID Nr. 27-89).
Auch umfasst diese Erfindung Nucleinsäureliganden von bFGF, die Inhibitoren von bFGF sind. Insbesondere werden RNA-Liganden identifiziert und beschrieben, die die Bindung von bFGF an seine Rezeptoren inhibieren.
Weiters umfasst diese Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Nucleinsäureliganden und Ligandensequenzen zu bFGF, umfassend die Schritte a) des Herstellens eines Kandidatengemischs aus Nucleinsäuren; b) des Selektierens zwischen Elementen des Kandidatengemischs auf Grundlage von Affinität zu bFGF; und c) der Amplifikation der selektierten Moleküle, um ein Nucleinsäuregemisch zu erhalten, das an Nucleinsäuresequenzen mit einer relativ hohen Affinität für Bindung an bFGF angereichert ist.
Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung die RNA-Liganden zu bFGF, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, einschließlich jener Liganden, die in den Tabellen II-IV aufgelistet sind. Auch eingebunden sind RNA-Liganden zu bFGF, die im Wesentlichen zu jedem beliebigen der gegebenen Liganden homolog sind und die im Wesentlichen über dieselbe Fähigkeit verfügen, bFGF zu binden und zu inhibieren. Weiters umfasst diese Erfindung RNA-Liganden zu bFGF, die im Wesentlichen dieselbe strukturelle Form wie die hierin präsentierten Liganden aufweisen und die im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit besitzen, bFGF zu binden und zu inhibieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch modifizierte Nucleotidsequenzen, basierend auf den hierin identifizierten Nucleinsäureligandensequenzen, und Gemische eben dieser. Insbesondere umfasst diese Erfindung RNA-Liganden, die an den Ribose- und/oder Phosphat- und/oder Basenpositionen modifiziert wurden, um In-vivo-Stabilität des RNA-Liganden zu steigern. Andere Modifikationen an RNA-Liganden liegen im Schutzumfang dieser Erfindung, einschließlich spezifischer Änderungen an der Basensequenz und Additionen von Nucleinsäuren oder Nicht-Nucleinsäure-Gruppierungen zur ursprünglichen Verbindung.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt den Consensus-Pseudoknoten, der aus den primären und sekundären SELEX-Versuchen stammt, die hochaffine Inhibierungsliganden von HIV-1-Umkehrtranskriptase (HIV-RT) beschreiben. Die Consensus-Sekundärstruktur ist ein Pseudoknoten; die 5'-Helix dieses Pseudoknotens (Stamm 1) ist auf Primärsequenzebene konserviert, und die 3'-Helix oder Stamm 2 ist es nicht. X bezeichnet eine Nucleotidposition, die nicht konserviert ist; X-X' bezeichnet ein bevorzugtes Basenpaar. Die 26 Nucleotidpositionen sind wie gezeigt nummeriert.
2 zeigt eine Verfeinerung der 5'-Informationsgrenze. Eine Reihe von Modell-Liganden wurden mit T7-RNA-Polymerase aus Matrix-Oligos synthetisiert (Milligan et al., Nucl. Acid. Res. 15, 8783 (1987)). Oben links ist der vollständige Ligand B veranschaulicht. Am rechten Rand sind die Variationen in den einzelnen Liganden A bis E gezeigt, die in den umrahmten Bereichen auftreten. Im Diagramm sind die einzelnen Bindungskurven für diese Modell-Liganden gezeigt.
3 zeigt die Wirkung verschiedener Nucleotidsubstitutionen innerhalb der Liganden-B-Sequenz auf Bindung an HIV-RT. Es werden die verschiedenen Substitutionen und resultierenden Affinitäten zu HIV-RT, ausgedrückt in Bezug auf die Bindung von Ligand B, veranschaulicht. Ligand B war eine Kontrolle, die in jedem Versuch getestet wurde; die Affinität von Ligand B wird als 1,0 normalisiert, und die relative Affinität (Kd von Ligand B wird durch die Kd von jedem Liganden dividiert) wird gezeigt. Auch werden die Affinitäten verschiedener Trunkierungen von Ligand B gezeigt. Der mit *G-G assoziierte Wert, der U1-G16 ersetzt, stammt von Ligand C aus 2.
4 zeigt eine chemische Sonde der nativen gegenüber den denaturierten Konformationen von Ligand B. Die verschiedenen Nucleotide von Ligand B wurden mit Chemikalien unter nativen und denaturierenden Bedingungen umgesetzt, auf die modifizierten Positionen getestet, Elektrophorese unterzogen und zum Vergleich sichtbar gemacht. ∎ gibt höchst reaktive Basenpaarungs-Gruppen der Base an der bezeichneten Position an und ⎕ bezeichnet teilweise Reaktivität;
bezeichnet starke Reaktivität von Purin-N7-Positionen und Δ bezeichnet teilweise Reaktivität (zur Modifikation mit DEPC). Die Fragezeichnen weisen darauf hin, dass diese Positionen an G(–2) und G(–1) aufgrund von Bandenkollision am Gel nicht unterschieden werden konnten.
5 zeigt Reaktivitäten modifizierbarer Gruppen von Ligand B, wenn er an HIV-RT gebunden wurde. In Diagrammform sind jene Gruppen dargestellt, die im Vergleich zu jener der nativen Konformation veränderte Reaktivität zeigen, wenn sie an HIV-RT gebunden sind.
6 zeigt Resultate aus Modifikationsinterferenz für Liganden-B-Komplexbildung mit HIV-RT. Die Symbole für Modifikation sind entsprechend der Legende im Kästchen eingesetzt. Die angegebenen Modifikationen sind jene, gegen die durch Bindung an HIV-RT (die sich in reduzierter Modifikation an jenen Positionen in der selektierten Population zeigte) stark (schwarze Symbole) oder teilweise (weiße Symbole) selektiert wurde.
7 zeigt Substitution von Hydroxyl durch 2'-Methoxy an den Ribosen der oben rechts gezeigten Liganden-B-Sequenz. Leere Kreise stehen für Hydroxylgruppen an den angegebenen Positionen, und volle Kreise stehen für Methoxy-Substitution.
8 zeigt Selektion durch HIV-RT aus gemischten Populationen von 2'-Methoxyribose gegenüber 2'-Hydroxyl an den Positionen U1 bis A5 und A12 bis A20. Ein Oligonucleotid wurde mit der folgenden Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) synthetisiert:
5'-(AAAAA)_d(UCCGA)_x(AGUGCA)_m(ACGGGAAAA)_x(UGCACU)_m-3,
worin tiefgestelltes "d" für 2'-Desoxy steht, tiefgestelltes "x" bedeutet, dass jene Nucleotide 50:50 mit Phosphoramidit-Reagenzien vermischt sind, was in 2'-Methoxy oder 2'-Hydroxyl an der Ribose resultiert, und tiefgestelltes "m" darauf hinweist, dass jene Nucleotide alle 2'-Methoxy an der Ribose sind.
9 zeigt die Ausgangs-RNA und die Sammlung von Sequenzen (Seq.-ID Nr. 115-135), die aus SELEX mit HIV-RT als Teil eines Walking-Versuchs erhalten wurden.
10 veranschaulicht den verlängerten Consensus-HIV-RT-Liganden (Seq.-ID Nr. 136), erhalten aus der in 9 gezeigten Sequenzliste.
11 veranschaulicht die überarbeitete Beschreibung des Pseudoknoten-Liganden von HIV-RT. Zusätzlich zu den vereinbarten Markierungen aus 1 bezeichnet S-S' das bevorzugte C-G- oder G-C-Basenpaar an dieser Position.
12 zeigt die Sequenz eines hochaffinen RNA-Liganden für HIV-1-Rev-Protein, erhalten aus SELEX-Versuchen. Gezeigt ist ein Nummerierungsschema, das als Verweis auf bestimmte Basen in der RNA verwendet wird. Diese Sequenz wurde für chemische Modifikation mit ENU verwendet. 12 zeigt auch in a) die verlängerte RNA-Sequenz, die in chemischen Modifikationsversuchen mit DMS, Kethoxal, CMCT und DEPC verwendet wird. Die Sequenz des für Primerextension der verlängerten Ligandensequenz verwendeten Oligonucleotids ist in b) gezeigt.
13 zeigt die Resultate chemischer Modifikation der HIV-1-Rev-Liganden-RNA unter natürlichen Bedingungen. In a) werden chemische Modifikationsmittel, ihre Spezifität und die Symbole, die für teilweise und vollständige Modifikation stehen, aufgelistet. Die RNA-Sequenz ist mit Grad und Typ der Modifikation für jede modifizierte Base gezeigt. b) zeigt die Helix-, Aufweitungs- und Haarnadel-Strukturelemente des HIV-1-Rev-RNA-Liganden entsprechend der Modifikation und den Computer-Daten der strukturellen Vorhersage.
14 zeigt die Resultate chemischer Modifikation der Liganden-RNA, die Bindung an das HIV-1-Rev-Protein stört. Aufgelistet sind die Modifikationen, die Proteinbindung stören, eingeteilt in Kategorien starker Störung und geringfügiger Störung. Die Symbole bezeichnen entweder Basenpaarungs-Modifikationen, N7-Modifikationen oder Phosphatmodifikationen.
15 zeigt die Modifikationsstörungswerte für Phosphatalkylierung. Die Daten sind auf A17-3'-Phosphat normalisiert.
16 zeigt die Modifikationsstörungswerte für DMS-Modifikation von N3C und N1A. Die Daten sind auf C36; A34 normalisiert.
17 zeigt die Modifikationsstörungswerte für Kethoxal-Modifikation von N1G und N2G. Die Daten sind auf G5 normalisiert.
18 zeigt die Modifikationsstörungswerte für CMCT-Modifikation von N3U und N1G. Die Daten sind auf U38 normalisiert.
19 zeigt die Modifikation Modifikationsstörungswerte sinterferenzwerte für DEPC-Modifikation von N7A und N7G. Die Daten sind auf G19; A34 normalisiert.
20 zeigt die chemische Modifikation des RNA-Liganden in Gegenwart des HIV-1-Rev-Proteins. Angegeben sind jene Positionen, die im Vergleich zu Modifikation unter natürlichen Bedingungen, jedoch ohne vorhandenes Protein, entweder reduzierte Modifikation oder gesteigerte Modifikation in Gegenwart von Protein aufwiesen.
21 zeigt die 5'- und 3'-Sequenzen, die die in SELEX verwendete, "6a"-beeinflusste, zufällige Region flankieren. Die Matrix, die die anfängliche RNA-Population produzierte, wurde aus den folgenden Oligonucleotiden konstruiert:
5'-CCCGGATCCTCTTTACCTCTGTGTGagatacagagtccacaaacgtgttc tcaatgcacccGGTCGGAAGGCCATCAATAGTCCC-3' (Matrix-Oligo) (Seq.-ID Nr. 3)
5'-CCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGACTATTGATGGCCTTCCGACC-3' (5'-Primer) (Seq.-ID Nr. 4)
5'-CCCGGATCCTCTTTACCTCTGTGTG-3' (3'-Primer) (Seq.-ID Nr. 5)
worin die Kleinbuchstaben im Matrix-Oligo bedeuten, dass an jeder Position ein Gemisch von Reagenzien zur Synthese verwendet wurde, mit 62,5 % des Kleinbuchstaben und 12,5 % jeweils von den anderen drei Nucleotiden. Unter der Sequenz 6a sind die Sequenzen von 38 Isolaten aufgelistet, die nach sechs Durchgängen von SELEX, die mit Rev-Protein mit dieser Population von RNA durchgeführt wurden, kloniert wurden. Die in diesen Isolaten gefundenen Unterschiede zu den 6a-Sequenzen sind durch fettgedruckte Buchstaben gekennzeichnet. Unterstrichen sind die vorhergesagten Basenpaarungen, welche die die Aufweitung flankierenden Stämme der Motiv-I-Rev-Liganden umfassen. Basen, die in die 5'- und 3'-fixierten flankierenden Sequenzen eingebunden sind, sind in Kleinbuchstaben dargestellt.
22 zeigt drei Reihen tabellarischer Aufstellungen, die Folgendes enthalten:

A) Die Zählung jedes Nucleotids, die an entsprechenden Positionen der Rev-6a-Ligandensequenz im in 21 zu findenden Pool von Sequenzen gefunden wurden;
B) Die gebrochene Häufigkeit von jedem Nucleotid, das an diesen Positionen gefunden wurde (x ÷ 38, worin x die Zählung aus A ist);
C) Den Unterschied zwischen der gebrochenen Häufigkeit von B) und der erwarteten Häufigkeit, basierend auf dem Eintragsgemisch von Oligonucleotiden während der Matrixsynthese [für "Wildtyp"-Positionen (x ÷ 38) – 0,625 und für alternative Sequenzen (x ÷ 38) – 0,125].

23 zeigt drei Reihen tabellarischer Aufstellungen, die Folgendes enthalten:

A) Die Zählung jedes Basenpaars, das an entsprechenden Positionen der Rev-6a-Ligandensequenz im in 21 zu findenden Pool von Sequenzen gefunden wurde;
B) Die gebrochene Häufigkeit von jedem Nucleotid, das an diesen Positionen gefunden wurde (x ÷ 38, worin x die Zählung aus A ist);
C) Den Unterschied zwischen der gebrochenen Häufigkeit von B) und der erwarteten Häufigkeit, basierend auf dem Eintragsgemisch von Oligonucleotiden während der Matrixsynthese [für "Wildtyp"-Positionen (x ÷ 38) – 0,39; für Basenpaare, die ein alternierendes Nucleotid und ein Wildtyp-Nucleotid enthalten, (x ÷ 38) – 0,078; und für Basenpaarungen von zwei alternierenden Nucleotiden (x ÷ 38) – 0,016]. Werte sind nur für Purin-Pyrimidin-Paarungen gezeigt, die anderen acht Pyrimidin- und Purin-Paarungen sind kollektiv gezählt, als "andere" gezeigt und für Abschnitt C) als (x ÷ 38) – 0,252 berechnet.

24 zeigt die zuvor bestimmte Rev-Proteinliganden-Motiv-I-Consensussequenz (US-Patentanmeldung der Seriennummer 07/714.131, eingereicht am 10. Juni 1991; WO 91/19813), die 6a-Sequenz aus derselben Anmeldung und die bevorzugte Consensussequenz, abgeleitet aus dem beeinflussten Randomisierungs-SELEX, wie aufgrund der in den 22 und 23 dargestellten Daten interpretiert. Absolut konservierte Positionen in der bevorzugten Consensussequenz sind fettgedruckt dargestellt, und S-S' bezeichnet entweder ein C-G- oder G-C-Basenpaar.
25 zeigt die natürliche RNA-Sequenz (oder TAR-RNA) aus HIV-1, mit der das tat-Protein wechselwirkt. Die umrahmte Region der Sequenz identifiziert jene Nucleotide, die für die tat-TAR-Wechselwirkung als wichtig erkannt wurden.
26 listet die Sequenzen von Liganden auf, die mittels der vorliegenden Erfindung als Nucleinsäureliganden zum HIV-1-tat-Protein isoliert wurden. die Sequenzen sind gemäß gemeinsamen Sekundärstrukturen und der Primärsequenz drei Motiven (I, II und III) zugeordnet. Umgekehrte Wiederholungssequenzen, die RNA-Helices vorhersagen, sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die Regionen von Primärsequenzhomologie innerhalb jedes Motivs sind mit strichlierten Kästchen hervorgehoben. Die Begren zungen der Sequenzinformation, die für hochaffine Bindung wesentlich ist, sind durch ein Kästchen mit durchgehender Linie angegeben. Die Sequenzen 1 und 17 passen in keines dieser drei identifizierten Motive.
27 zeigt ein schematisches Diagram der Consensus-Sekundärstruktur und Primärsequenz von jedem der in 26 angegebenen Ligandenmotive. X bezeichnet nicht-konservierte Nucleotidpositionen. X' bezeichnet ein Basenpaarungskomplement zu X an dieser Position in einer Helix, R steht für Purin und Y für Pyrimidin. Die strichlierte Linie in Motiv III bezeichnet eine variable Anzahl an Nucleotiden in diesem Abschnitt der Schleife.
28 ist die von tat-Protein-Konzentration abhängige Bindung von selektierten Liganden-RNAs aus 26 und des 40n-RNA-Kandidatengemischs an Nitrocellulose-Filter.
29 zeigt Nucleotidsequenzen (Seq.-ID Nr. 137-155) von RNA-Liganden, isoliert durch SELEX für das menschliche Thrombinprotein (Sigma). Jede Sequenz ist in 3 Blöcke von links nach rechts folgend eingeteilt: 1) die 5'-fixierte Region, 2) die variable 30N-Region, und 3) die 3'-fixierte Region. Einzelne Sequenzen sind in Klasse I und Klasse II durch konservierte Sequenzmotive innerhalb der variablen 30N-Region gruppiert, wie durch fettgedruckte, unterstrichene Buchstaben angezeigt wird.
30 zeigt vorgeschlagene Sekundärstrukturen von RNA-Liganden (Seq.-ID Nr. 156-159). (A) zeigt die Sequenz der 76-Nucleotid-Klasse-I-RNA-Klone 6, 16 und 18 und den 72-Nucleotid-Klasse-II-Klon 27. Die Begrenzungsbestimmungen, worin [eine 5'-Begrenzung und] eine 3'-Begrenzung bezeichnet, sind ebenfalls gezeigt. Die möglichen Sekundärstrukturen von jeder RNA sind in (B) wie mittels Begrenzungsversuchen bestimmt gezeigt. Begrenzungen sind unterstrichen. In (A) und (B) sind die 5'- und 3'-fixierten Regionen durch Kleinbuchstaben dargestellt, die zufällige 30N-Region durch Großbuchstaben und die konservierte Region durch fettgedruckte Großbuchstaben. Die Haarnadelstrukturen, die synthetisiert wurden, sind mit einer Angabe der Gesamtzahl an Nucleotiden umrahmt.
31 zeigt Bindungskurven für Thrombinliganden. In (A) wurden RNAs mit einmaligen 30N-Sequenzmotiven (siehe 29) für Bindungsanalyse mit menschlichem Thrombin (Sigma) ausgewählt, einschließlich der drei aus Klasse I: RNA 6, RNA 16 und RNA 18 und der einen aus Klasse II: RNA 27. Bindung der Hauptmenge der RNA-Sequenzen des 30N3-Kandidatengemischs ist auch gezeigt. In (B) ist Bindung der Klasse-I-RNA-Klone 6, 16 und 18 und des Klasse-II-RNA-Klons 27 gezeigt, jedoch mit menschlichem Thrombin von den Enzyme Research Laboratories. In (C) sind Bindungen der 15mer-ssDNA 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3' (G15D) (Seq.-ID Nr. 1), der Klasse-I-Klon-16-Haarnadelstrukturen (24R, 39D) und der Klasse-II-Klon-27-Haarnadelstruktur (33R) (siehe 30B) unter identischen Bedingungen wie in (B) gezeigt. Im Fall der RNA-Haarnadelstrukturen bezeichnet R RNA-Synthese und D Transkription aus einer DNA-Matrix.
32 zeigt einen Bindungsvergleich von RNA-Liganden zwischen nicht modifizierter RNA und RNA mit solcherart modifizierten Pyrimidinen, dass sie das 2'-NH₂-Ribosenucleotid enthält. Bindungsvergleiche von (A) Haupt-RNA-30N-Kandidatengemisch und 2-NH₂-modifiziertem 30N-Kandidatengemisch, von (B) Klasse-I-RNA 16 und 2-NH₂-modifizierter RNA 16 und von (C) Klasse-II-RNA 27 und 2-NH₂-modifizierter RNA 27 sind gezeigt.
33 zeigt die Konkurrenzversuche zwischen der 15mer-ssDNA G15D und RNA-Haarnadelliganden dieser Erfindung um Bindung an menschliches Thrombin. In A) entspricht die Konzentration des Tracers G15D der Konzentration von Protein bei 1 μM. Die Konkurrenten für Bindung umfassen G15D selbst, die 24- und 39-Nucleotid-RNA-Haarnadelstrukturen aus Klasse-I-RNA 16 und die 33-Nucleotid-RNA-Haarnadelstruktur aus Klasse-II-RNA 27 (siehe 30). Bindung wird als die relative gebundene Fraktion G15D ausgedrückt, die das Verhältnis von G15D-Bindung mit Konkurrenten zu G15D-Bindung ohne Konkurrenten ist. In B) ist die RNA 33 der Tracer, und die Konzentration des Tracers entspricht der Konzentration von Protein bei 300 ⁿM. Die Konkurrenten für Bindung umfassen die ssDNA G15D und RNA 24.
34 zeigt die Resultate von funktionellen Tests an Thrombin in Gegenwart und Abwesenheit der beschriebenen RNA-Ligandeninhibitoren. In A) wurde die Hydrolyse durch Thrombin des chromogenen Substrats S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNitroanilin) am angegebenen Thrombin und die RNA-Konzentration durch die Änderung der OD 405 gemessen. In B) wurde die Umsetzung von Fibrinogen zu Fibrin und die resultierende Koagulation durch den Tilt-Test in Gegenwart und Abwesenheit der beschriebenen RNA-Ligandeninhibitoren gemessen.
35 zeigt Bindungsspezifität für Thrombinliganden. Klasse-I-RNA 16, Klasse-II-RNA 27 und Hauptmengen-30N3-RNA wurden für Bindungsanalyse mit A) menschlichem Antithrombin III (Sigma) und B) menschlichem Prothrombin (Sigma) ausgewählt.
36 zeigt Bindungskurven für Familie-1-Ligand 7A (Δ), Familie-2-Ligand 12A (⎕), zufällige RNA, SELEX-Versuch A(+) und zufällige RNA, SELEX-Versuch B (x). Der Anteil von an Nitrocellulose-Filter gebundener RNA wird als eine Funktion von freier Proteinkonzentration in einem Diagramm dargestellt, und Datenpunkte wurden an Gleichung 2 angepasst. Die folgenden RNA-Konzentrationen wurden verwendet: < 100 pM für 7A und 12A und 10 nM für zufällige RNAs. Bindungsreaktionen erfolgten bei 37°C in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,01 % menschliches Serumalbumin enthielt.
37 zeigt die Wirkung von RNA-Liganden 5A (o), 7A (Δ), 12A (⎕), 26A (♢), zufälliger RNA, SELEX-Versuch A (+) und zufälliger RNA, SELEX-Versuch B (x) auf Bindung von ¹²⁵I-bFGF an die niederaffinen (Schautafel A) und hochaffinen (Schautafel B) Zelloberflächenrezeptoren. Versuche erfolgten im Wesentlichen wie in Roghani & Moscatelli, J. Biol. Chem. 267, 22156 (1992), beschrieben.
38 zeigt die kompetitive Verdrängung von 32P-markierten RNA-Liganden 5A (o), 7A (Δ), 12A (⎕) und 26A (♢) durch Heparin (mittleres Molekulargewicht 5.000 Da). Die Prozentsätze der gesamten Eintrags-DNA, die sich an Nitrocellulose-Filter band, sind als eine Funktion von Heparinkonzentration in Diagrammform dargestellt. Versuche erfolgten bei 37°C in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,01 menschliches Serumalbumin, 0,3 μM RNA und 30 nM bFGF enthielt.
39 zeigt die vorgeschlagenen Sekundärstrukturen für Familie-1-Liganden, die sich an bFGF mit hoher Affinität binden. Die Pfeile bezeichnen doppelsträngige (Stamm-) Regionen, die die konservierten Schleifen flankieren. Kleinbuchstaben geben Nucleotide in der konstanten Region an.
40 zeigt die vorgeschlagenen Sekundärstrukturen für Familie-1-Liganden.
41 zeigt die Consensus-Strukturen für Familie-1- und Familie-2-Liganden. Y = C oder U; R = A oder G; W = A oder U; H = A, U oder C; D = A, G oder U; N = jede beliebige Base. Komplementäre Basen sind geprimt. Die Symbole in Klammern bezeichnen eine variable Anzahl an Basen oder Basenpaaren an der angegebenen Position, die innerhalb der im Index angegebenen Grenzen liegen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Diese Anmeldung ist eine Erweiterung und Verbesserung des Verfahrens zur Identifikation von Nucleinsäureliganden, das als SELEX bezeichnet wird. Das SELEX-Verfahren ist in der PCT-Patentveröffentlichung WO 91/19813, veröffentlicht am 26. Dezember 1991 mit dem Titel "Nucleinsäureliganden", detailliert beschrieben.
Diese Anmeldung umfasst Verfahren zur Identifikation und Herstellung verbesserter Nucleinsäureliganden auf der Grundlage des SELEX-Verfahrens. Die Anmeldung umfasst separate Abschnitte, die die folgenden Ausführungsformen der Erfindung abdecken: I. Das SELEX-Verfahren; II. Verfahren zur Identifikation verbesserter Nucleinsäureliganden nach der Durchführung von SELEX; III. SELEX-Reihenversuche – Walking; IV. Aufklärung der Struktur von Liganden über Kovarianzanalyse; V. Aufklärung eines verbesserten Nucleinsäureliganden für HIV-RT (Beispiel I); VI. Durchfüh rung eines Walking-Versuchs mit HIV-RT-Nucleinsäureliganden zur Identifikation verlängerter Nucleinsäureliganden; und VII. Aufklärung eines verbesserten Nucleinsäureliganden für HIV-1-Rev-Protein (Beispiel II); Nucleinsäureliganden zu HIV-1-tat-Protein (Beispiel III); Nucleinsäureliganden zu Thrombin (Beispiel IV); und Nucleinsäureliganden zu bFGF (Beispiel V).
Verbesserte Nucleinsäureliganden zu HIV-RT- und HIV-1-Rev-Proteinen sind hierin offenbart und beansprucht. Diese Erfindung umfasst die hierin identifizierten, spezifischen Nucleinsäureliganden. Der durch die Erfindung gewährleistete Schutzumfang der Liganden umfasst alle Liganden der HIV-RT- und -Rev-Proteine, die gemäß den hierin beschriebenen Verfahren identifiziert wurden. Insbesondere umfasst diese Erfindung Nucleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen homolog zu den hierin identifizierten Nucleinsäureliganden sind und die im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit besitzen, unter physiologischen Bedingungen die HIV-RT- oder -Rev-Proteine zu binden, wie die hierin identifizierten Nucleinsäureliganden. Unter im Wesentlichen homolog wird ein Homologiegrad von mehr als 70 %, noch bevorzugter von mehr als 80 %, verstanden. Im Wesentlichen homolog umfasst auch Basenpaarungs-Flips in jenen Bereichen der Nucleinsäureliganden, die Basenpaarungsregionen umfassen. Im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit, das HIV-RT- oder -Rev-Protein zu binden, bedeutet, dass die Affinität innerhalb von zwei Größenordnungen der Affinität der hierin beschriebenen Nucleinsäureliganden, und vorzugsweise innerhalb einer Größenordnung, liegt. Es fällt durchwegs innerhalb des Kompetenzbereichs von Fachleuten, zu bestimmen, ob eine bestimmte Sequenz im Wesentlichen homolog zu den hierin identifizierten Sequenzen ist und ob sie im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit wie die hierin identifizierten Sequenzen besitzt, das HIV-RT- oder HIV-1-Rev-Protein zu binden.
I. Das SELEX-Verfahren
In seiner grundlegendsten Form kann das SELEX-Verfahren durch die folgende Abfolge an Verfahrensschritten definiert werden:

1) Ein Kandidatengemisch von Nucleinsäuren mit unterschiedlichen Sequenzen wird hergestellt. Das Kandidatengemisch umfasst im Allgemeinen Regionen fixierter Sequenzen (d.h. jedes der Mitglieder des Kandidatengemischs enthält dieselben Sequenzen an derselben Stelle) und Regionen randomisierter Sequenzen. Die Regionen fixierter Sequenzen werden entweder ausgewählt, a) um die nachstehend beschriebenen Amplifikationsschritte zu unterstützen; b) um Nachahmung einer Sequenz, die für Bindung an das Ziel bekannt ist, zu erleichtern; oder c) um die Konzentration einer bestimmten strukturellen Anordnung der Nucleinsäuren im Kandidatengemisch zu steigern. Die randomisierten Sequenzen können vollständig randomisiert (d.h. die Wahrscheinlichkeit, eine Base an einer beliebigen Position zu finden, ist 1:4) oder teilweise randomisiert sein (z.B. kann die Wahrscheinlichkeit, eine Base an einer beliebigen Position zu finden, auf jedem beliebigen Niveau zwischen 0 und 100 % liegen).
2) Das Kandidatengemisch wird mit dem ausgewählten Ziel unter Bedingungen, die für Bindung zwischen dem Ziel und Mitgliedern eines Kandidatengemischs günstig sind, kontaktiert. Unter diesen Umständen kann die Wechselwirkung zwischen dem Ziel und den Nucleinsäuren des Kandidatengemischs als eine betrachtet werden, die Nucleinsäure-Ziel-Paarungen zwischen dem Ziel und den Nucleinsäuren, die die stärkste Affinität für das Ziel aufweisen, bildet.
3) Die Nucleinsäuren mit der höchsten Affinität für das Ziel werden von jenen Nucleinsäuren mit weniger Affinität zum Target getrennt. Da nur eine sehr geringe Anzahl an Sequenzen (und möglicherweise nur ein Nucleinsäuremolekül), die den Nucleinsäuren mit höchster Affinität entsprechen, im Kandidatengemisch vorhanden ist, ist es im Allgemeinen wünschenswert, die Aufteilungskriterien so festzulegen, dass eine signifikante Menge an Nucleinsäuren im Kandidatengemisch (etwa 5-50 %) während der Aufteilung zurückgehalten wird.
4) Jene Nucleinsäuren, die während der Aufteilung als solche selektiert werden, die relativ höhere Affinität für das Ziel aufweisen, werden dann amplifiziert, um ein neues Kandidatengemisch zu schaffen, das an Nucleinsäuren mit einer relativ höheren Affinität für das Ziel angereichert ist.
5) Durch Wiederholen der oben genannten Schritte von Aufteilung und Amplifikation enthält das neu gebildete Kandidatengemisch weniger und weniger einzelne Sequenzen, und der mittlere Affinitätsgrad der Nucleinsäuren zum Ziel wird im Allgemeinen ansteigen. Im Extremfall ergibt das SELEX-Verfahren ein Kandidatengemisch, das eine oder eine geringe Anzahl an einzelnen Nucleinsäuren enthält, die jene Nucleinsäuren aus dem ursprünglichen Kandidatengemisch mit der höchsten Affinität zum Zielmolekül darstellen.

Die SELEX-Patentanmeldungen beschreiben und erläutern dieses Verfahren sehr detailliert. Umfasst sind Ziele, die in diesem Verfahren verwendet werden können; Verfahren zur Herstellung des anfänglichen Kandidatengemischs; Verfahren zur Abtrennung von Nucleinsäuren innerhalb eines Kandidatengemischs; und Verfahren zur Amplifikation abgetrennter Nucleinsäuren, um angereicherte Kandidatengemische zu bilden. Die SELEX-Patentanmeldungen beschreiben auch Ligandenlösungen, die aus zahlreichen Zielspezies gewonnen werden, einschließlich Proteinzielen, in denen das Protein ein Nucleinsäure-Bindungsprotein ist oder nicht.
SELEX stellt hochaffine Liganden eines Zielmoleküls bereit. Dies stellt eine einzigartige Errungenschaft dar, die auf dem Gebiet der Nucleinsäureforschung beispiellos ist. Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung der aus SELEX gewonnenen Ligandenlösung, um neue Nucleinsäureliganden zu entwickeln, die die erwünschten Eigenschaften aufweisen. Die erwünschten Eigenschaften für einen bestimmten Nucleinsäureliganden können variieren. Alle Nucleinsäureliganden sind in der Lage, einen Komplex mit den Zielspezies zu bilden. In manchen Fällen wird erwünscht, dass der Nucleinsäureligand dazu dient, eine oder mehrere biologische Aktivitäten des Ziels zu inhibieren. In anderen Fällen wird erwünscht, dass der Nucleinsäureligand dazu dient, eine oder mehrere biologische Aktivitäten des Ziels zu modifizieren. In anderen Fällen dient der Nucleinsäureligand dazu, die Gegenwart des Ziels zu identifizieren, und seine Wirkung auf die biologische Aktivität für das Target ist nicht von Bedeutung.
II. Verfahren zur Identifikation verbesserter Nucleinsäureliganden nach Durchführung von SELEX
Um Nucleinsäuren zu bilden, die für die Verwendung als Pharmazeutikum wünschenswert sind, wird bevorzugt, dass der Nucleinsäureligand 1) sich an das Ziel so bindet, dass er in der Lage ist, die erwünschte Wirkung am Ziel zu erreichen; 2) so klein wie möglich ist, sodass er die erwünschte Wirkung erzielt; 3) so stabil wie möglich ist; und 4) ein spezifischer Ligand zum ausgewählten Ziel ist. In den meisten, wenn nicht in allen Situationen wird bevorzugt, dass der Nucleinsäureligand die höchstmögliche Affinität zum Ziel aufweist. Modifikationen oder Derivatisierungen des Liganden, die Resistenz gegenüber Abbau und Clearance in situ während der Therapie, die Fähigkeit, verschiedene Gewebe- oder Zellmembranbarrieren zu überwinden, oder andere zusätzliche Fähigkeiten, die die Affinität für das Zielmolekül nicht signifikant stören, verleihen, können auch als Verbesserungen bereitgestellt werden. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verfahren zur Gewinnung verbesserter Nucleinsäureliganden nach der Durchführung von SELEX.
Tests für Ligandenwirkungen auf Zielmolekülfunktion.
Eine der Verwendungen von Nucleinsäureliganden, die mittels SELEX hergeleitet wurden, ist das Finden von Liganden, die Zielmolekülfunktion verändern. Da Ligandenanalyse viel mehr Arbeit erfordert, als dies im Laufe von SELEX-Anreicherungen der Fall ist, ist es ein gutes Verfahren, um zuerst auf Inhibierung oder Verstärkung von Funktion des Zielproteins zu testen. Solche funktionellen Tests am kombinierten Ligandenpool könnten sogar vor dem Klonieren und Sequenzieren durchgeführt werden. Tests auf biologische Funktion des ausgewählten Ziels sind im Allgemeinen verfügbar und Fachleuten bekannt und können leicht in Gegenwart des Nucleinsäureliganden durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob Inhibierung eintritt.
Affinitätstests der Liganden.
SELEX-Anreicherung liefert zahlreiche klonierte Liganden mit wahrscheinlicher variabler Affinität für das Zielmolekül. Sequenzvergleiche können Consensus-Sekundärstrukturen und Primärsequenzen ergeben, die das Gruppieren der Ligandensequenzen zu Motiven ermöglichen. Obwohl eine einzelne Ligandensequenz (mit manchen Mutationen) häufig in der Gesamtpopulation klonierter Sequenzen gefunden werden kann, kann der Repräsentationsgrad einer einzelnen Ligandensequenz in der klonierten Population von Ligandensequenzen möglicherweise nicht exakt mit der Affinität für das Zielmolekül korrelieren. Daher ist Häufigkeit alleine nicht das einzige Kriterium für die Beurteilung von "Gewinnern" gemäß SELEX, und Bindungstests für verschiedene Ligandensequenzen (die jedes Motiv, das durch Sequenzanalyse. entdeckt wird, adäquat definieren) sind erforderlich, um die Bedeutung des durch Sequenzvergleich erzielten Consensus zu bemessen. Die Kombination von Sequenzvergleich und Affinitätstests sollte ein Maßstab für die Auswahl von Kandidaten für ausführlichere Liganden-Charakterisierung sein.
Bestimmung von Informationsbegrenzungen.
Ein wichtiger Weg, um einzugrenzen, welche Sequenzmenge für spezifische Affinität relevant ist, ist die Erstellung der Begrenzungen dieser Information innerhalb der Ligandensequenz. Dies erfolgt üblicherweise durch Selektieren von endmarkierten Fragmenten aus hydrolysierten Pools des Liganden von Interesse, sodass 5'- und 3'-Begrenzungen der Information entdeckt werden können. Um eine 3'-Begrenzung zu bestimmen, wird eine In-vitro-Transkription des PCR-Liganden im großen Maßstab durchgeführt, die RNA unter Verwendung von UV-Schattierung auf einer Verstärkungsfolie mittels Gel gereinigt, die gereinigte RNA phosphatisiert, ausführlich mit Phenol extrahiert, durch Kinasierung mit ³²P markiert, und das markierte Produkt wird (unter Verwendung eines Gelfilms als Anhaltspunkt) mittels Gel gereinigt. Das resultierende Produkt kann dann partiellen Versuchsverdauen mit RNase T1 (variierende Enzymkonzentration und Dauer, bei 50°C in einem Puffer von 7 M Harnstoff, 50 mM NaCitrat, pH 5,2) und alkalischer Hydrolyse (bei 50 mM NaCO₃, im Vorhinein eingestellt auf einen pH von 9,0 durch Vermischen von 1 M Bicarbonat und Carbonatlösungen; Tests in Bereichen von 20 bis 60 min bei 95°C) unterzogen werden. Nach dem optimale Bedingungen für alkalische Hydrolyse erstellt wurden (sodass eine gleichmäßige Verteilung von kleineren bis zu größeren Fragmenten besteht), kann das Verfahren in größerem Maßstab durchgeführt werden, um genug Material zur Selektion durch das Ziel bereitzustellen (üblicherweise an Nitrocellulosefiltern). Anschließend werden Bindungstests entwickelt, die je nach Zielproteinkonzentration von der geringsten Sättigungs-Proteinkonzentration zu jener Proteinkonzentration, bei der etwa 10 % der RNA gebunden ist, wie mittels der Bindungstests für den Liganden bestimmt wird, variieren. Die Zielkonzentration sollte (sofern die Zielzufuhr dies gestattet) durch Steigern des Volumens, und nicht durch Reduzieren der absoluten Menge des Targets, variiert werden; dies liefert ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis, da die Menge an RNA, die an das Filter gebunden ist, durch die absolute Menge des Ziels limitiert ist. Die RNA wird wie im SELEX eluiert und dann auf einem denaturierenden Gel mit partiellen T1-Verdauen laufen gelassen, sodass eine Beziehung zwischen den Positionen von Hydrolysebanden mit der Ligandensequenz hergestellt werden kann.
Die 5'-Begrenzung kann auf ähnliche Weise bestimmt werden. Großtechnische In-vitro-Transkriptionen werden wie zuvor beschrieben gereinigt. Es gibt zwei Verfahren zur Markierung des 3'-Endes der RNA. Ein Verfahren ist, Cp mit ³²P zu kinasieren (oder ³²P-Cp zu erwerben) und es an die gereinigte RNA mit RNA-Ligase zu ligieren. Die markierte RNA wird dann wie zuvor beschrieben gereinigt und sehr identischen Arbeitsvorschriften unterzogen. Eine Alternative ist, unmarkierte RNAs partiellen alkalischen Hydrolysen zu unterziehen und als Test für Bandenpositionen einen anellierten, markierten Primer mit Umkehrtranskriptase zu verlängern. Einer der Vorteile gegenüber pCp-Markierung ist die Einfachheit des Verfahrens, die komplettere Sequenzierungsleiter (durch Didesoxy-Kettenterminations-Sequenzierung), mit der die Begrenzung in gegenseitige Beziehung gestellt werden kann, und eine gesteigerte Ausbeute an testbarem Produkt. Ein Nachteil ist, dass die Verlängerung an eluierter RNA manchmal künstliche Stoppstellen enthält, sodass es wichtig sein kann, durch Spotting und Elution des Ausgangsmaterials auf Nitrocellulosefiltern ohne Waschschritte und Testen als Eintrags-RNA dieses Material zu kontrollieren.
Daraus geht hervor, dass es möglich ist, die Begrenzungen der Sequenzinformation, die für hochaffine Bindung an das Ziel erforderlich ist, zu finden.
Ein aufschlussreiches Beispiel ist die Bestimmung der Informationsbegrenzungen, die im Nucleinsäureliganden für HIV-RT zu finden sind. (Siehe die US-Patentanmeldung der Seriennummer 07/714.131, eingereicht am 10. Juni 1991, und die PCT-Patentanmeldungsveröffentlichung WO 91/19813, veröffentlicht am 26. Dezember 1991 mit dem Titel "Nucleinsäureliganden".) Diese Versuche werden nachstehend näher beschrieben. Der ursprüngliche Pool an angereicherten RNAs ergab ein paar spezifische Liganden für HIV-RT (ein Ligand, 1.1, stellte ¼ der Gesamtpopulation dar, Nitrocellulose-Affinitätssequenzen stellten ½ dar, und einige RNAs wiesen weder Affinität zum einen noch zum anderen auf). Zwei hochaffine RT-Liganden teilen die Sequenz ...UUCCGNNNNNNNNCGGGAAAA... (Seq.-ID Nr. 6). Grenz-Versuche von beiden Liganden zeigten eine eindeutige 3'-Begrenzung und eine weniger eindeutige 5'-Begrenzung auf. Aus den Grenz-Versuchen und den sekundären SELEX-Versuchen kann zusammengefasst werden, dass die Liganden mit höchster Affinität die wesentliche Information UCCGNNNNNNNNCGGGAAAAN'N'N'N' (Seq.-ID Nr. 7) enthielten (worin N's mit Ns in den 8-Basen-Schleifensequenzen der Haarnadel, die durch Paarung von UCCG mit CGGG gebildet werden, Basenpaare bilden) und dass das 5'-U verzichtbar sein würde mit einem geringen Verlust an Affinität. In dieser Anwendung bestätigte die Konstruktion von Modellverbindungen, dass es keinen Unterschied bezüglich der Affinität von Sequenzen mit nur einem 5'-U im Vergleich zu 2 5'-Us (wie sie die zwei verglichenen Liganden gemeinsam haben) gab, dass die Entfernung beider Us eine 5fache Abnahme der Affinität verursachte und jene des nächsten C einen noch drastischeren Verlust an Affinität bewirkte. Die 3'-Begrenzung, die in den Grenz-Versuchen eindeutig zu sein schien, war plötzlich weniger. Diese neue Information kann verwendet werden, um das maßgebliche Element am 3'-Ende abzuleiten, das zumindest drei basengepaarte Nucleotide (zu Sequenzen, die zwischen den zwei Strängen von Stamm 1 eine Schleife bilden) aufweist. Nur zwei basengepaarte Nucleotide resultieren in einer 12fachen Reduktion der Affinität. Sind keine 3'-basengepaarte Nucleotide vorhanden (Trunkierung am Ende von Schleife 2), so resultiert dies in einer etwa 70fachen Reduktion der Affinität.
Quantitative und qualitative Bewertung der Beteiligung einzelner Nucleotide zur Affinität.
SEKUNDÄRE SELEX. Nachdem die minimale, hochaffine Ligandensequenz identifiziert worden ist, kann es nützlich sein, die Nucleotide innerhalb der Begrenzungen zu identifizieren, die für die Wechselwirkung mit dem Zielmolekül maßgeblich sind. Ein Verfahren erfolgt über die Schaffung einer neuen zufälligen Matrix, in der alte Nucleotide einer hochaffinen Ligandensequenz partiell randomisiert sind oder in der Blöcke mit Zufallsverteilung zwischen Blöcke mit absoluter Zufallsverteilung gesetzt sind. Solche "sekundären" SELEX-Verfahren bilden einen Pool an Ligandensequenzen, in denen maßgebliche Nucleotide oder Strukturen absolut konserviert sind, wobei weniger maßgebliche Eigenschaften bevorzugt werden und nicht wichtige Abschnitte unbeeinflusst sind. Sekundäre SELEX-Verfahren können es somit erleichtern, einen Consensus weiter auszuarbeiten, der auf relativ wenigen Ligandensequenzen basiert. Darüber hinaus können Liganden mit noch höherer Affinität bereitgestellt werden, deren Sequenzen im ursprünglichen SELEX unerforscht blieben.
In dieser Anmeldung zeigen die Erfinder solch eine beeinflusste Randomisierung für Liganden des HIV-1-Rev-Proteins. In der PCT-Patentanmeldungsveröffentlichung WO 91/19813, veröffentlicht am 26. Dezember 1991 unter dem Titel "Nucleinsäureliganden", wurden Nucleinsäureliganden zum HIV-1-Rev-Protein beschrieben. Eine dieser Ligandensequenzen band sich mit höherer Affinität als alle anderen Ligandensequenzen (Rev-Ligandensequenz 6a, gezeigt in 12), war jedoch nur in zwei Kopien in den 53 Isolaten vorhanden, die kloniert und sequenziert wurden. In dieser Anmeldung wurde diese Sequenz in einen sekundären SELEX-Versuch eingebunden, in dem jedes der Nucleotide der 6a-Sequenz (beschränkt auf jenen Teil der Sequenz, der eine Rev-Proteinbindungsstelle umfasst, definiert durch Homologie zu anderen des Rev-Ligandenmotivs I) während Oligonucleotidsynthese mit den anderen drei Nucleotiden im Verhältnis 62,5:12,5:12,5:12,5 vermischt wurde. Wird bei spielsweise die Sequenz an Position G1 während Oligosynthese inkorporiert, so werden die Reagenzien für G, A, T und C in den Verhältnissen 62,5:12,5:12,5:12,5 vermischt. Nach sechs SELEX-Durchgängen unter Verwendung des Rev-Proteins wurden Liganden aus diesem Gemisch kloniert, sodass eine umfassendere Consensus-Beschreibung abgeleitet werden konnte.
NUCLEOTIDSUBSTITUTION. Ein anderes Verfahren ist, Oligo-transkribierte Varianten in Fällen zu testen, in denen der SELEX-Consensus irreführend sein kann. Wie zuvor gezeigt half dies den Erfindern, die Beschaffenheit der 5'- und 3'-Begrenzungen der für HIV-RT-Bindung erforderlichen Information zu verstehen. Wie im nachfolgenden Beispiel gezeigt wird, half dies, den Consensus von Nucleotiden innerhalb von Stamm 1 des HIV-RT-Pseudoknotens zu quantifizieren.
CHEMISCHE MODIFIKATION. Eine andere nützliche Reihe an Verfahren werden einschließlich als chemische Modifikationsversuche beschrieben. Solche Versuche können verwendet werden, um die native Struktur von RNAs durch Vergleichen von Modifikationsmustern denaturierter und nicht-denaturierter Zustände zu sondieren. Das chemische Modifikationsmuster eines RNA-Liganden, der in weiterer Folge durch das Zielmolekül gebunden wird, kann sich vom natürlichen Muster unterscheiden, was auf potenzielle Veränderungen der Struktur bei Bindung oder Schutz von Gruppen durch das Zielmolekül hinweist. Weiters werden RNA-Liganden durch das Zielmolekül nicht gebunden werden, wenn sie an Positionen modifiziert sind, die entweder für die gebundene Struktur des Liganden oder für die Wechselwirkung mit dem Zielmolekül maßgeblich sind. Solche Versuche, in denen diese Abschnitte definiert werden, werden als "Störungsversuche durch chemische Modifikation" bezeichnet.
Es gibt zahlreiche verschiedene erhältliche Reagenzien, um solche Versuche durchzuführen, die Fachleuten auch bekannt sind (siehe Ehresmann et al., Nuc. Acids. Res. 15, 9109 (1987)). Chemikalien, die Basen modifizieren, können verwendet werden, um Liganden-RNAs zu modifizieren. Ein Pool wird an das Ziel bei variierenden Konzentrationen gebunden, und die gebundenen RNAs werden wiedergewonnen (in sehr ähnlicher Weise wie in den Grenz-Versuchen), und die eluierten RNAs werden auf die Modifikation analysiert. Der Test kann mittels darauf folgender Modifikations-abhängiger Basenentfernung und Anilinabspaltung an den basenfreien Positionen oder durch Reverstranskriptionstest empfindlicher (modifizierter) Positionen erfolgen. In solchen Tests scheinen Banden (die modifizierte Basen angeben) in unselektierten RNAs auf, die in Bezug auf andere Banden in Zielprotein-selektierten RNAs verschwinden. Ähnliche chemische Modifikationen mit Ethylnitrosoharnstoff oder über gemischte chemische oder enzymatische Synthese mit beispielsweise 2'-Methoxys an Ribose oder Thiophosphaten können verwendet werden, um wesentliche Atomgruppen an der Hauptkette zu identifizieren. In Versuchen mit 2'-Methoxy- gegenüber 2'-OH-Gemischen resultiert die Gegenwart einer wesentlichen OH-Gruppe in gesteigerter Hydrolyse in Bezug auf andere Positionen in Molekülen, die durch das Ziel auf stringente Weise selektiert wurden.
Ein Beispiel dafür, wie chemische Modifikation verwendet werden kann, um nützliche Information über einen Liganden zu erhalten und Bemühungen zu unterstützen, seine funktionelle Stabilität zu verbessern, wird nachstehend für HIV-RT gegeben. Ethylnitrosoharnstoff-Modifikationsstörung identifizierte 5 Positionen, an denen Modifikation Bindung störte, und 2 dieser Positionen störten Bindung drastisch. Modifikation verschiedener Atomgruppen an den Basen des Liganden wurden auch als maßgeblich für die Wechselwirkung mit HIV-RT identifiziert. Diese Positionen lagen primär in der 5'-Helix und der überbrückenden Schleifensequenz, die in der SELEX-Phylogenese hochkonserviert war (Stamm 1 und Schleife 2, 1). Diese Versuche bestätigten nicht nur die Gültigkeit dieser Phylogenese, sondern lieferten auch Informationen für laufende Versuche, stabilere RNAs zu bilden. Ein RT-Ligand wurde synthetisiert, in dem alle Positionen 2'-Methoxy an den Riboseabschnitten der Hauptkette aufwiesen. Dieses Molekül band sich mit drastisch reduzierter Affinität zu HIV-RT. Basierend auf den frühen Versuchen zu Modifikationsstörungen und auf den SELEX-Phylogenesevergleichen konnte bestimmt werden, dass die 3'-Helix (Stamm II, 1) im Wesentlichen eine strukturelle Komponente des Moleküls war. Ein Ligand, in dem die 12 Ribosereste dieser Helix 2'-Methoxy waren, wurde dann synthetisiert und band sich mit hoher Affinität an HIV-RT. Um zu bestimmen, ob jegliche 2'- OHs der verbleibenden 14 Reste für Bindung spezifisch erforderlich waren, wurde ein Molekül, in dem alle der Ribosen des Pseudoknotens vorhanden waren, mit gemischten äquimolaren Reagenzien (optimale Mengen, empirisch bestimmt) zur Bildung von 2'-OH und 2'-Methoxy synthetisiert. Selektion durch HIV-RT aus diesem Gemisch, gefolgt von alkalischer Hydrolyse, zeigt Banden von verstärkter Hydrolyse, die ein Hinweis auf vorwiegendes Vorhandensein von 2'-Hydroxylen an diesen Positionen sind. Eine Analyse dieses Versuchs führte zur Schlussfolgerung, dass Reste (G4, A5, C13 und G14) für hochaffine Bindung an HIV-RT 2'-OH aufweisen müssen.
Vergleiche der Intensität der Banden für gebundene und ungebundene Liganden können nicht nur Modifikationen aufzeigen, die Bindung stören, sondern auch Modifikationen, die Bindung fördern. Ein Ligand kann mit exakt jener Modifikation gebildet und auf die verstärkte Affinität getestet werden. Somit können chemische Modifikationsversuche ein Verfahren zur Untersuchung zusätzlicher örtlicher Kontakte mit dem Zielmolekül darstellen, eben wie das "Walking" (siehe unten) zur Untersuchung auf zusätzliche Kontakte auf Nucleotidebene mit benachbarten Domänen eingesetzt wird.
Eines der Produkte des SELEX-Verfahrens ist ein Consensus von Primär- und Sekundärstrukturen, der die chemische oder enzymatische Synthese von Oligonucleotidliganden ermöglicht, deren Design auf jenem Consensus basiert. Da der Replikationsmechanismus von SELEX eher limitierte Variationen auf Untereinheitsebene (Ribonucleotide beispielsweise) erfordert, füllen solche Liganden den verfügbaren Atomabstand der Bindungsoberfläche eines Zielmoleküls nur unvollständig. Diese Liganden können jedoch als hochaffine Gerüste betrachtet werden, die derivatisiert werden können, um zusätzliche Kontakte mit dem Zielmolekül zu bilden. Darüber hinaus enthält der Consensus Atomgruppendeskriptoren, die zur Bindung gehörig sind, und Atomgruppendeskriptoren, die mit den dazu gehörigen Atomgruppenwechselwirkungen übereinstimmen. Beispielsweise enthält jedes Ribonucleotid des Pseudoknotenliganden von HIV-RT eine 2'-Hydroxylgruppe an der Ribose, wobei jedoch nur zwei der Ribosen des Pseudoknotenliganden an dieser Position nicht mit 2'-Hydroxy substituiert werden können. Ein ähnlicher Versuch mit Desoxyribonucleotid gemischen mit Ribonucleotidgemischen (wie die Erfinder mit 2'-Methoxy- und 2'-Hydroxy-Gemischen durchführten) würde zeigen, welche Ribosen oder wie viele Ribosen für Bindung von HIV-RT entbehrlich sind. Ein ähnlicher Versuch mit radikaleren Substitutionen an der 2'-Position würde wiederum die zulässigen Substitutionen an 2'-Positionen aufzeigen. Von diesem Verfahren kann erwartet werden, Derivate des Pseudoknotenliganden zu finden, die höhere affine Assoziation mit HIV-RT verleihen. Solche Derivatisierung schließt die Inkorporation von Vernetzern, die insbesondere direkt kovalente Bindungen zum Zielprotein ergeben, nicht aus. Solche Derivatisierungsanalysen sind nicht auf die 2'-Position der Ribose eingeschränkt, sondern können Derivatisierung an jeder Position in der Base oder Hauptkette des Nucleotidliganden einbinden.
Eine logische Erweiterung dieser Analyse ist eine Situation, in der ein oder ein paar Nucleotide des polymeren Liganden als eine Stelle für chemische Derivatuntersuchung verwendet wird. Der Rest des Liganden dient dazu, dieses Monomer (oder diese Monomere) an einer Stelle zu verankern, an dem eine Vielzahl an Derivaten auf Nicht-Störung von Bindung sowie auf verstärkte Affinität getestet wird. Solche Untersuchungen können zu kleineren Molekülen führen, die die Struktur des anfänglichen Ligandengerüsts nachahmen und, unabhängig von diesem Nucleinsäuregerüst, signifikante und spezifische Affinität zum Zielmolekül aufweisen. Solche derivatisierten Untereinheiten, die gegenüber dem anfänglichen SELEX-Liganden Vorteile bezüglich Massenproduktion, therapeutischen Wegen der Verabreichung, Zufuhr, Clearance oder Abbau aufweisen können, können zum Therapeutikum werden und können sehr wenig des ursprünglichen Liganden beibehalten. Dieser Ansatz stellt somit eine zusätzliche nützliche Eigenschaft von SELEX dar. SELEX-Liganden können direkte chemische Untersuchung einer definierten Stelle an einem Zielmolekül, die bekannterweise für die Zielfunktion wichtig ist, ermöglichen.
Strukturbestimmung. Diese Versuche halfen, die Sequenz- und Struktur-abhängige Assoziation von Liganden an HIV-RT zu bestätigen und zu bewerten. Zusätzliche Verfahren können durchgeführt werden, um Auflösung auf atomarer Ebene von Ligand/Zielmolekül-Komplexen bereitzustellen. Diese sind NMR-Spektroskopie und Röntgenkristallographie. Verfügt man über solche Strukturen, so kann dann rationales Design als Verbesserungen an entwickelten Liganden, die durch SELEX bereitgestellt werden, durchgeführt werden. Das Computermodellieren von Nucleinsäurestrukturen wird nachstehend beschrieben.
Chemische Modifikation. Diese Erfindung umfasst Nucleinsäureliganden, in denen bestimmte chemische Modifikationen vorgenommen wurden, um die In-vivo-Stabilität des Liganden zu steigern oder die Zufuhr des Liganden zu verstärken oder zu vermitteln. Beispiele für solche Modifikationen umfassen chemische Substitutionen an den Ribose- und/oder Phosphatpositionen einer bestimmten RNA-Sequenz. Siehe z.B. Cook et al., PCT-Anmeldung WO 9203568; US-Patent Nr. 5.118.672 von Schinazi et al.; Hobbs et al., Biochem. 12, 5138 (1973); Guschlbauer et al., Nucleic Acids Res. 4, 1933 (1977); Shibaharu et al., Nucl. Acids Res. 15, 4403 (1987); Pieken et al., Science 253, 314 (1991).
III. SELEX-Reihenversuche – Walking.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist es möglich, nachdem eine minimale Consensus-Ligandensequenz für ein gegebenes Ziel bestimmt wurde, eine zufällige Sequenz zur minimalen Consensus-Ligandensequenz zuzusetzen und zusätzliche Kontakte mit dem Ziel zu entwickeln, eventuell zu getrennten, jedoch benachbarten Domänen. Dieses Verfahren wird in den SELEX-Patentanmeldungen als "Walking" bezeichnet. Die erfolgreiche Anwendung der Walking-Arbeitsvorschrift zur Entwicklung eines verstärkten Bindungsliganden zu HIV-RT ist nachstehend dargelegt.
Der Walking-Versuch umfasst zwei SELEX-Versuche, die nacheinander durchgeführt werden. Ein neues Kandidatengemisch wird gebildet, in dem jedes der Elemente des Kandidatengemischs eine fixierte Nucleinsäureregion aufweist, die einem mittels SELEX hergeleiteten Nucleinsäureliganden entspricht. Jedes Element des Kandidatengemischs enthält auch eine randomisierte Region an Sequenzen. Gemäß diesem Verfahren ist es möglich, zu identifizieren, was als "verlängerte" Nucleinsäureligan den bezeichnet wird, die Regionen enthalten, die sich an mehr als eine Bindungsdomäne eines Ziels binden können.
IV. Aufklärung der Struktur von Liganden mittels Kovarianzanalyse
In Verbindung mit den empirischen Verfahren zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von Nucleinsäuren umfasst die vorliegende Erfindung Computermodellierungsverfahren zur Bestimmung der Struktur von Nucleinsäureliganden.
Sekundärstrukturvorhersage ist eine nützliche Grundlage für korrekten Sequenzabgleich. Auch ist sie eine äußerst dienliche Hilfe für korrekte 3D-Strukturvorhersage, dadurch, dass sie einige Basen in eine A-Form-Helixgeometrie zwingt.
Es gibt Tabellen von Energieparametern zur Berechnung der Stabilität von Sekundärstrukturen. Wenn frühe Vorhersageprogramme für Sekundärstruktur versuchten, die Anzahl an Basenpaaren, die durch eine Sequenz gebildet werden, einfach zu maximieren, versuchen die meisten aktuellen Programme nun, Strukturen mit minimaler freier Energie, wie durch diese thermodynamischen Parameter berechnet wird, zu finden. Dieser Ansatz birgt zwei Schwierigkeiten. Erstens sind die thermodynamischen Regeln von Natur aus unexakt, typischerweise bis etwa 10 %, und es gibt zahlreiche verschiedene mögliche Strukturen, die innerhalb dieser 10 % des allgemeinen Energieminimums liegen. Zweitens muss die tatsächliche Sekundärstruktur nicht an einem allgemeinen Energieminimum liegen, da dies von der Kinetik von Faltung und der Synthese der Sequenz abhängt. Nichtsdestoweniger sind diese Unzulänglichkeiten für kurze Sequenzen von geringfügiger Bedeutung, da es nur sehr wenige mögliche Strukturen gibt, die sich bilden können.
Das Brute-Force-Vorhersageverfahren ist ein Dot-Plot: es wird ein N-mal-N-Plot der Sequenz gegen sich selbst erstellt, und jede mögliche Stelle für ein Basenpaar wird mit einem X markiert. Diagonale Verbindungen zwischen Xs markieren die Stellen für mögliche Helices. Ausführliche strukturierte Suchverfahren können dann nach allen möglichen Anordnungen kompatibler (d.h. nicht-überlappender) Helices der Länge L oder mehr suchen; Energieberechnungen können für diese Strukturen durchgeführt werden, um sie als mehr oder weniger wahrscheinlich zu klassieren. Die Vorteile dieses Verfahrens sind, dass alle möglichen Topologien, einschließlich Pseudoknoten-Konformationen, untersucht werden können und dass auch einige suboptimale Strukturen automatisch gebildet werden. Die Nachteile des Verfahrens sind, dass es in den schlimmsten Fällen innerhalb einer Zeitspanne durchgeführt werden kann, die proportional zu einem exponentiellen Faktor der Sequenzgröße ist, und dass mit diesem Verfahren (je nach der Größe der Sequenz und dem tatsächlich verwendeten strukturierten Suchverfahren) keine ausreichend tiefgehende Untersuchung möglich ist, um ein globales Minimum zu finden.
Das elegantere Vorhersageverfahren, und zur Zeit das am häufigsten verwendete Verfahren, ist das Programm von Zuker (Zuker, Science 244, 48 (1989)). Das Zuker-Programm, das ursprünglich auf einem von Ruth Nussinov entwickelten Algorithmus basierte, geht von einer zentralen vereinfachenden Annahme aus, dass keine Pseudoknoten-Konformationen zulässig sind. Dies ermöglicht die Verwendung eines dynamischen Programmierungsansatzes, der innerhalb einer Zeitspanne abläuft, die nur zu N³ bis N⁴ proportional ist, worin N für die Länge der Sequenz steht. Das Zuker-Programm ist das einzige Programm, das in der Lage ist, mit Genauigkeit mit Sequenzen umzugehen, die aus ein paar hundert Nucleotiden bestehen, wodurch es zum am häufigsten verwendeten Verfahren für Biologen wurde. Die Unfähigkeit des Zuker-Programms jedoch, Pseudoknoten-Konformationen vorherzusagen, ist ein grundlegender Mangel, da mehrere verschiedene SELEX-Verfahren bis jetzt Pseudoknoten-RNA-Strukturen ergaben, die mit bloßem Auge erkannt wurden. Ein Brute-Force-Verfahren, das in der Lage ist, Pseudoknoten-Konformationen vorherzusagen, muss verwendet werden.
Das zentrale Element der vergleichenden Sequenzanalyse der vorliegenden Erfindung sind die Sequenz-Kovariationen. Man spricht von einer Kovariation, wenn die Identität einer Position von der Identität einer anderen Position abhängt; beispielsweise zeigt ein erforderliches Watson-Crick-Basenpaar darin starke Kovariation, dass durch Kenntnis einer der zwei Positionen bereits die Identität an der anderen Position bekannt ist. Kovariationsanalyse wurde früher verwendet, um die Sekundärstruktur von RNAs vorherzusagen, für die es mehrere verwandte Sequenzen, die eine gemeinsame Struktur aufweisen, gibt, wie beispielsweise tRNA, rRNAs und -Gruppe-I-Introns. Nun geht klar hervor, dass Kovariationsanalyse verwendet werden kann, um Tertiärkontakte ebenfalls nachzuweisen.
Stormo und Gutell entwarfen und verwendeten einen Algorithmus, der die Menge an Kovariationen zwischen zwei Positionen in einer abgeglichenen Sequenzreihe exakt bemisst. Das Programm wird "MIXY" genannt – Mutual Iniformation at position X and Y (Wechselseitige Information an Position X und Y).
Es soll nun eine abgeglichene Sequenzreihe betrachtet werden. In jeder Spalte oder Position wird die Häufigkeit des Auftretens von A, C, G, U und Lücken berechnet. Diese Häufigkeit wird f(b_x) genannt, die Häufigkeit von Base b in Spalte x. Nun sollen zwei Spalten gleichzeitig betrachtet werden. Die Häufigkeit, mit der eine bestimmte Base b in Spalte x auftritt, ist f(b_x), und die Häufigkeit, mit der eine bestimmte Base b in Spalte y auftritt, ist f(b_y). Kümmern sich Position x und Position y nicht um die Identität der jeweils anderen – d.h. diese Positionen sind unabhängig voneinander – gibt es keine Kovariation – die Häufigkeit der Beobachtung von Basen b_x und b_y an Position x und y in jeder beliebigen Sequenz sollte demnach f(b_xb_y) = f(b_x)f(b_y) sein. Gibt es wesentliche Abweichungen der beobachteten Häufigkeiten von Paaren von ihren erwarteten Häufigkeiten, so wird von den Positionen gesagt, dass sie kovariieren. Die Menge der Abweichung vom erwarteten Wert kann mit einer Informationsmessung M(x,y), der wechselseitigen Information von x und y, quantifiziert werden:
M(x,y) kann als die Zahl der Informationsteile beschrieben werden, die über die Identität von Position y lediglich mittels Kenntnis von Position y durch Kenntnis lediglich der Identität von Position x gewonnen werden. Gibt es keine Kovariation, so ist M(x,y) gleich null; größere Werte von M(x,y) weisen auf starke Kovariation hin.
Diese Zahlen korrelieren äußerst gut mit einer Wahrscheinlichkeit für engen physischen Kontakt in der Tertiärstruktur, wenn dieses Verfahren auf die tRNA-Sequenzdatenreihe angewandt wird. Die Sekundärstruktur ist an den Peaks der M(x,y)-Werte ziemlich eindeutig, und die meisten der Tertiärkontakte, die aus der Kristallstruktur bekannt sind, scheinen ebenfalls als Peaks auf.
Diese Kovariationswerte können verwendet werden, um dreidimensionale Strukturvorhersagen zu entwickeln.
In gewisser Weise ist das Problem jenem der Strukturbestimmung mittels NMR ähnlich. Anders als im Fall von Kristallographie, die schließlich ein tatsächliches Elektronendichtediagramm ergibt, ergibt NMR eine Reihe interatomarer Abstände. Je nach Anzahl der interatomaren Abstände, die erhalten werden können, kann es eine, einige wenige oder zahlreiche 3D-Strukturen geben, mit denen sie übereinstimmen. Mathematische Verfahren wurden entwickelt, um eine Matrix von interatomaren Abständen zu einer Struktur im dreidimensionalen Raum umzuwandeln. Die zwei hauptsächlich verwendeten Verfahren sind Abstandsgeometrie und eingeschränkte Molekulardynamik.
Abstandsgeometrie ist das formalere und rein mathematische Verfahren. Die interatomaren Abstände werden als Koordinaten in einem N-dimensionalen Raum betrachtet, worin N die Anzahl der Atome ist. In anderen Worten wird die "Position" eines Atoms durch N Abstände zu allen anderen Atomen spezifiziert, anstelle der drei (x,y,z), mit denen üblicherweise gearbeitet wird. Interatomare Abstände zwischen jedem einzelnen Atom werden in einer N-mal-N-Abständematrix aufgezeichnet. Eine vollständige und präzise Abständematrix kann unter Verwendung von Matrix-Algebra-Rechenschritten leicht in kartesische 3-mal-N-Koordinaten umgewandelt werden. Der besondere Leistung von Abstandsgeometrie, wie sie im Rahmen von NMR eingesetzt wird, ist der Umgang mit unvollständigen (nur manche der interatomaren Abstände sind bekannt) und unpräzisen Daten (Abstände sind bestenfalls nur mit einer Präzision von einigen wenigen Å bekannt). Viel Zeit von Abstandsgeometrie-basierten Strukturberechnungen wird somit für eine Vorbearbeitung der Abstän dematrix, die Berechnung von Grenzwerten für die unbekannten Abstandswerte, basierend auf den bekannten Werten, und die Einschränkung der Grenzwerte auf die bekannten aufgewandt. Üblicherweise werden Mehrfachstrukturen aus der Abständematrix abgeleitet, die mit einer Reihe von NMR-Daten übereinstimmen; überlappen sie gut, so waren die Daten ausreichend, um eine einzige Struktur zu bestimmen. Im Unterschied zur NMR-Strukturbestimmung ergibt Kovarianz nur unpräzise Abstandswerte, und auch nur eher probabilistisches als absolutes Wissen darüber, ob eine gegebene Abstandseinschränkung angewandt werden sollte.
Eingeschränkte Molekulardynamik ist eher ein ad-hoc-Verfahren. Angesichts eines empirischen Kraftfeldes, das versucht, die Kräfte zu beschreiben, die alle Atome spüren (Van-der-Waals-Kräfte, kovalente Bindungslängen und -winkel, Elektrostatik), kann eine Reihe von Femtosekunden-Zeitschritten einer Molekülbewegung durch Zuordnen einer zufällig gewählten Geschwindigkeit zu jedem Atom (aus der Boltzmann-Verteilung bei einer bestimmten Temperatur) und Berechnen der Bewegung jedes Atoms für eine Femtosekunde unter Verwendung von Newtons dynamischen Gleichungen simuliert werden; das bedeutet "Molekulardynamik". Bei eingeschränkter Molekulardynamik werden den Atomen zusätzliche ad-hoc-Kräfte zugeordnet, wenn sie spezifizierte Abstandsgrenzen überschreiten.
Im vorliegenden Fall ist es sehr leicht, mit der probabilistischen Eigenschaft der Daten im Rahmen von eingeschränkter Molekulardynamik umzugehen. Die Kovariationswerte können zu künstlichen einschränkenden Kräften zwischen bestimmten Atomen für bestimmte Abstandsgrenzen transformiert werden, durch Variieren der Größenordnung der Kraft gemäß der Größenordnung der Kovarianz.
NMR und Kovarianzanalyse bilden Abstandseinschränkungen zwischen Atomen oder Positionen, die durch Abstandsgeometrie oder eingeschränkte Molekulardynamik leicht zu Strukturen transformiert werden. Eine andere Quelle experimenteller Daten, die verwendet werden können, um die dreidimensionalen Strukturen von Nucleinsäuren zu bestimmen, sind Versuche zu chemischem und enzymatischem Schutz, die Einschränkungen der Zugänglichkeit zu Lösungsmitteln für einzelne Atome oder Positionen hervorbringen.
V. AUFKLÄRUNG EINES VERBESSERTEN NUCLEINSÄURELIGANDEN FÜR HIV-RT.
Ein Beispiel für die Verfahren der vorliegenden Erfindung ist hierin für den Nucleinsäureliganden für HIV-1-Umkehrtranskriptase (HIV-RT) dargestellt.
Die PCT-Patentanmeldung WO 91/19813, veröffentlicht am 26. Dezember 1991 mit dem Titel "Nucleinsäureliganden", beschreibt Resultate, die gewonnen wurden, wenn SELEX mit dem HIV-RT-Target durchgeführt wurde. Aus der Untersuchung der Nucleinsäuresequenzen, für die erkannt wurde, dass sie eine hohe Affinität zu HIV-RT aufwiesen, wurde geschlossen, dass die Nucleinsäureligandenlösung als ein Pseudoknoten konfiguriert war.
Hierin werden nun Versuche beschrieben, die die minimale Anzahl an Sequenzen definieren, die erforderlich ist, um die Nucleinsäureligandenlösung über Begrenzungsuntersuchungen darzustellen. Ebenfalls wird hierin die Konstruktion von Varianten der Ligandenlösung beschrieben, die verwendet werden, um die Beteiligungen einzelner Nucleotide in der Lösung an der Bindung der Ligandenlösung an HIV-RT zu bewerten. Auch wird hierin die chemische Modifikation der Ligandenlösung beschrieben; 1) um ihre vorhergesagte Pseudoknotenstruktur zu bestätigen; 2) um zu bestimmen, welche modifizierbaren Gruppen vor chemischen Angriffen geschützt werden, wenn sie an HIV-RT gebunden sind (oder während Bindung ihren Schutz verlieren); und 3) um zu bestimmen, welche Modifikationen Bindung an HIV-RT stören (wahrscheinlich durch Modifikation der dreidimensionalen Struktur der Ligandenlösung), und daher, welche wahrscheinlich in die proximalen Kontakte mit dem Ziel eingebunden sind.
Die Nucleinsäureligandenlösung, wie sie bereits zuvor bestimmt wurde, ist in 1 gezeigt. Darin ist ein RNA-Pseudoknoten dargestellt, in dem Stamm 1 (wie markiert) konserviert und Stamm 2 relativ nicht-konserviert ist; X bezeichnet keine Konservierung und X' steht für Basenpaare mit X. Im ursprünglichen SELEX wurde Consensus U1 bevorzugt (der an dieser relativen Position in 11 von 18 Sequenzen besteht, die zum Consensus beigetragen werden), doch A1 wurde ebenfalls häufig gefunden (in 6 der 18). Es gab zwei Sequenzen, in denen das Basenpaar G4-C13 und eine A-U-Substitution durch C-G substituiert war. Die bevorzugte Anzahl an Nucleotiden, die die zwei Stränge von Stamm 1 verbanden, betrug acht (in 8 von 18). Die Anzahl und das Muster von basengepaarten Nucleotiden, die Stamm 2 bilden, und die Präferenz für A5 und A12 wurden aus dem Consensus eines sekundären SELEX abgeleitet, in dem die zufällige Region wie folgt konstruiert war: NNUUCCGNNNNNNNNCGGGAAAANNNN (Seq.-ID Nr. 8) (N sind randomisiert). Für einen der Liganden wurde erkannt, dass er HIV-RT signifikant inhibierte und AMV- oder MMLV-Umkehrtranskriptasen nicht inhibierte.
Verfeinerung der Informationsbegrenzungen. Die ersten zwei SELEX-Versuche, in denen 32 Nucleotidpositionen randomisiert wurden, stellten hochaffine Liganden bereit, in denen Stamm 1 an seinem 5'-Ende eine variable Länge aufwies; das heißt, dass manche Liganden die Sequenz UUCCG aufwiesen, die mit CGGGA ein Basenpaar bilden konnte, UCCG mit CGGG oder CCG mit CGG. Bestimmung der Grenzen der Sequenzen, die der Wechselwirkung mit HIV-RT Hochaffinität verliehen, erfolgte durch Selektion aus partiellen alkalischen Hydrolysaten von endmarkierten klonalen RNAs, eine rasche, jedoch qualitative Analyse, die darauf schließen ließ, dass die Liganden höchster Affinität die wesentliche Information UCCGNNNNNNNNCGGGAAAANN'N'N' (Seq.-ID Nr. 7) enthielten (worin N's mit Ns in der 8-Basen-Schleifensequenz der Haarnadel, gebildet durch die Paarung von UCCG und CGGG, Basenpaare bildeten) und dass das 5'-U unter geringem Verlust von Affinität erlässlich wäre. Um die 5'-Sequenzen in einem homogenen Umfeld noch stringenter zu testen, wurden die in 2 gezeigten Bindungsversuche durchgeführt. Die aus Oligonucleotid-Matrices transkribierten RNAs waren alle die gleichen wie die vollständige Sequenz, die im oberen rechten Eck der Figur zu sehen ist, mit Ausnahme der variierenden 5'-Enden, wie in den Kästchen A-E gezeigt wird, die am linken Rand der Figur zu sehen sind. Das Resultat daraus ist, dass ein 5'-U für die höchstaffine Bindung an HIV-RT ausreichend ist (Kästchen A und B), dass es ohne U zu reduzierter Bindung kommt (Kästchen C) und dass jede weitere Entfernung von 5'-Sequenzen Bindung an diese nicht-spezifischen Sequenzen reduziert (Kästchen D). Das Design (das nachstehend als Ligand B bezeichnet wird) mit nur einem 5'-U (U1) wurde für die übrigen, hierin beschriebenen Versuche verwendet.
Abhängigkeit von der Länge von Stamm 2 wurde auch durch Bilden verschiedener 3'-Trunkierungen am 3'-Ende von Ligand B untersucht. Deletion von 3 Nucleotiden aus dem 3'-Ende (A24-U26) ergab in Bezug auf Affinität des Moleküls zu HIV-RT keinen Unterschied. Deletion der 4 3'-terminalen Nucleotide (C23-U26) resultierte in einer 7fach reduzierten Bindung, von 5 Nucleotiden (G22-U26) in etwa einer 12fachen Reduktion, und Deletion von 6 Nucleotiden (U21-U26, oder keine 3'-Helix) resultierte in etwa 70facher Reduktion der Affinität. Solche Reduktionen waren weniger drastisch als Reduktionen, die für Substitutionen einzelner Basen beobachtet wurden, über die nachstehend berichtet wird, was (mit anderen nachstehend berichteten Daten) darauf schließen lässt, dass diese Helix primär eine strukturelle Rolle spielt, die das Positionieren maßgeblicher Gruppen in Schleife 2 unterstützt.
Testen des SELEX-Consensus aus Stamm 1. Verschiedene Nucleotidsubstitutionen im konservierten Stamm 1 wurden vorgenommen und ihre Affinität zu HIV-RT bestimmt. Wie in 3 gezeigt ergab Substitution eines U1 durch ein A in Modell-RNAs nur einen geringen Unterschied in Bezug auf Affinität zu HIV-RT. C (das die Stabilität von Stamm 1 steigern würde) oder G (dargestellt durch den obigen U-Deletionsversuch) an dieser Position resultierte in etwa einer 20fachen Senkung der Affinität. Substitution von G16 durch A (das mit U1 ein Basenpaar bilden würde) unterband spezifische Bindung. Ein G-C-Paar wurde anstelle von C2-G15 eingesetzt, was auch Bindung unterband, und anstelle von C3-G14, was Bindung um etwa das 10fache reduzierte. Diese zwei Positionen waren in der Phylogenese von SELEX-Liganden hoch konserviert. Verschiedene Kombinationen wurden anstelle des G4-C13-Basenpaars eingesetzt. Der Wirkungsgrad dieser Substitutionen auf Affinität lautete G4-C13=C-G>U-A>A-U>>>>A-C, worin die Affinität im Fall von A-U im Ver gleich zu G4-C13 20fach reduziert ist und von A-C zumindest 100fach reduziert ist. Diese Resultate stimmen mit dem zuvor bestimmten SELEX-Consensus überein.
Chemisches Sondieren der Pseudoknoten-Struktur. Zahlreiche chemische Modifikationsversuche wurden durchgeführt, um die native Struktur von Ligand B zu sondieren, um chemische Modifikationen zu identifizieren, die Affinität von Ligand B zu HIV-RT signifikant reduzieren, und um Veränderungen an der Struktur zu entdecken, die mit Bindung durch HIV-RT einhergehen. Die verwendeten Chemikalien waren Ethylnitrosoharnstoff (ENU), der Phosphate modifiziert, Dimethylsulfat (DMS), das die Basenpaarungsflächen von C (an N3) und A (an N1) modifiziert, Carbodiimid (CMCT), das die Basenpaarungsfläche von U (an N3) und zu einem gewissen Grad von G (an N1) modifiziert, Diethylpyrocarbonat (DEPC), das N7 von A und zu einem geringeren Ausmaß N7 und N7 von G modifiziert, und Kethoxal, das die Basenpaarung N1 und N2 von G modifiziert. Die meisten der Tests zu chemischer Modifikation erfolgten an einer Liganden-B-Sequenz, die verlängert war, um Sequenzen einzubinden, an die ein markierter Primer anelliert und mit AMV-Umkehrtranskriptase verlängert werden konnte. Tests für ENU- und DEPC-modifizierte Positionen erfolgten an Ligand B durch jeweilige Modifikations-abhängige Hydrolyse oder modifizierte Basenentfernung, gefolgt von Anilinabspaltung der Hauptkette an diesen Stellen.
Die Resultate des Sondierens der nativen Struktur im Vergleich zur Modifikation von denaturiertem Liganden B sind in 4 zusammengefasst. Das Muster von ENU-Modifikation unterschied sich zwischen denaturierten nativen Zuständen des Liganden nicht, was darauf schließen ließ, dass es keine stabile Einbindung der Phosphate oder N7-Positionen von Purinen in die Lösungsstruktur des Pseudoknotens gibt. Die anderen Modifikationsdaten lassen darauf schließen, dass sich Stamm 2 eher stabil bildet und gegenüber jeglichen gezeigten chemischen Modifikationen, die die Basenpaare beeinflussen, resistent ist, obwohl der Terminus A6-U26 gegenüber Modifikation in gewisser Weise empfindlich ist, was auf ein Gleichgewicht zwischen basengepaarten und natürlichen Zuständen an dieser Position hinweist. Die einzelsträngigen As (A5, A17, A18, A19 und A20) sind mit DMS vollständig reaktiv, wenn auch A5, A19 und A20 eine verminderte Reaktivität gegenüber DEPC aufwei sen. Die Basenpaare von Stamm 1 scheinen eine abgestufte Resistenz gegenüber Modifikation in Form von G4-C13>C3-G14>C2-G15>U1-G16 aufzuweisen, worin G4-C13 vollständig resistent gegenüber chemischer Modifikation und U1-G16 hoch reaktiv ist. Dies lässt darauf schließen, dass diese kleine Helix des Pseudoknotens vorübergehende und gerichtete Denaturierung oder "Fraying" ("Zerfransen") erfährt.
Schutz von Ligand B vor chemischer Modifikation durch HIV-RT. Bindung von Protein verändert die Fraying-Eigenschaft von Helix I, wie in 5 gezeigt, durch Stabilisieren oder Schützen dieser Helix. Das nativ reaktive U1 wird auch bei Bindung geschützt. Bindung von Protein steigert die Empfindlichkeit des Basenpaars A6-U26, was darauf schließen lässt, dass dieses in gebundenem Zustand nicht gepaart ist. Dies kann ein Hinweis auf unzureichende Länge einer einzelnen Nucleotid-Schleife I während der Bindung sein, entweder, weil es zwischen dem gebundenen Stamm 1 und dem Ende von Stamm 2 im durch RT erkannten, nativen Pseudoknoten keine Brücke bilden kann, oder, weil Bindung die erforderliche Länge von Schleife I durch Verändern der Konformation von diesem nativen Zustand erhöht. A17 und A19 von Schleife II werden auch durch Bindung an HIV-RT geschützt. Darüber hinaus wird die einzelne Basenbrücke A12 bei Bindung geschützt.
Untersuchungen zu Modifikationsstörung des RT-Liganden B. Der RNA-Ligand B wurde partiell modifiziert (mit allen oben erwähnten Chemikalien, zur Strukturbestimmung). Diese modifizierte Population wurde mit variierenden Konzentrationen des Proteins gebunden, und die gebundenen Spezies wurden auf die modifizierten Positionen getestet. Hieraus kann bestimmt werden, ob Modifikation Bindung stört und wann es keine oder nur geringe Wirkung gibt. In 6 ist ein schematisches Diagramm gezeigt, das diese Resultate der Modifikationsstörungen zusammenfasst. Wie gezeigt, ist die meiste signifikante Störung von Bindung an der linken Seite des Pseudoknotens gehäuft, die Stamm 1 und Schleife 2 enthält. Dies ist auch der Teil des Moleküls, der in der Sammlung von Sequenzen, die durch SELEX isoliert wurden, hoch konserviert war (Primärsequenz) und wo Substitutionsversuche die drastischste Reduktion von Bindungsaffinität zu HIV-RT bewirkten.
Substitution von 2'-Hydroxyl durch 2'-Methoxy an Ribosen von Ligand B. "RNA"-Moleküle, in denen ein 2'-Methoxy an den 2'-Kohlenstoff der Ribose anstelle der normalen Hydroxylgruppe gebunden ist, sind gegenüber enzymatischem und chemischem Abbau resistent. Um zu testen, wie umfassend 2'-Methoxys anstelle von 2'-OHs in RT-Liganden eingesetzt werden können, wurden vier Oligos, wie in 7 gezeigt, hergestellt. Da sich vollständig substituierter 2'-Methoxy-Ligand nur schlecht bindet (Ligand D) und da die Erfinder erkannten, dass die meisten der Modifikationsstörungsstellen an einem Ende des Pseudoknotens gehäuft vorzufinden waren, wurden darauf folgende Substitutionsversuche auf die nicht-spezifische 3'-Helix, wie in den Kästchen B und C gezeigt, eingeschränkt. Beide dieser Liganden binden sich mit hoher Affinität an HIV-RT. Oligonucleotide wurden dann hergestellt, in denen die zulässigen Substitutionen an der Ribose von Stamm 2 alle 2'-Methoxy waren, wie in C aus 7, und an den verbleibenden 14 Positionen erfolgte gemischte Synthese mit 2'-Methoxy- und 2'-OH-Phosphoramidit-Reagenzien. Diese Oligos wurden Selektion durch HIV-RT unterzogen, gefolgt von alkalischer Hydrolyse von selektierten RNAs und Gel-Trennung (2'-Methoxys sind an alkalischer Hydrolyse nicht beteiligt, wie dies 2'-Hydroxyle sind). Wie durch Sichtprüfung von Filmen (siehe 8) und quantitative Bestimmung relativer Intensitäten unter Verwendung eines Ambis-Detektionssystems (siehe das nachstehende Beispiel für Vergleichsverfahren) beurteilt wurde, zeigten die durch HIV-RT aus den gemischten Inkorporationspopulationen selektierten Liganden signifikant gesteigerte Hydrolyse an den Positionen C13 und G14, was auf eine Störung durch 2'-Methoxys an diesen Positionen hinweist. In einem ähnlichen Versuch, in dem die Gemische an allen Positionen auf diese Weise analysiert wurden, zeigten G4, A5, C13 und G14 2'-O-Methyl-Störung.
Die Resultate aus Substitutionsversuchen, quantitativen Begrenzungsversuchen und chemischen Sondierungsversuchen liefern höchstinteressante Informationen zur Beschaffenheit des Pseudoknoten-Inhibitors von HIV-RT und heben maßgebliche Kontaktregionen an dieser RNA hervor. Diese Resultate werden nachstehend Nucleotid für Nucleotid bereitgestellt.
U1 kann durch A unter geringem Verlust von Affinität ersetzt werden, jedoch nicht durch C oder G. Obwohl U1 wahrscheinlich vorübergehende Basenpaarung mit G16 eingeht, stört Modifikation von U1-N3 mit CMCT die Bindung zu HIV-RT nicht. Bindung durch HIV-RT schützt jedoch die N3 von U1, vielleicht durch sterische oder elektrostatische Abschirmung von dieser Position. Substitution durch C, wodurch ein stabileres Basenpaar mit G16 gebildet wird, reduziert Affinität. Ersetzung von G16 durch A, was zur Bildung eines stabilen U1-A16-Paars führt, hebt spezifische Affinität zu HIV-RT auf, und Modifikation von G16-N1 stört die Bindung an HIV-RT sehr stark. Diese Modifikation von G16-N1 muss einen maßgeblichen Kontakt mit dem Protein unterbinden. Warum C-Substitutionen anstelle von U1 Affinität reduzieren und A-Substitutionen nicht, ist nicht geklärt. Zugegebenermaßen erfolgt die G-Substitution in einem Umfeld, in dem das 5'-Ende der RNA um ein Nucleotid kürzer ist, doch synthetische RNAs, in denen U1 das 5'-terminale Nucleotid ist, binden sich mit unveränderter Affinität im Vergleich zu jenen In-vitro-Transkripten mit zwei zusätzlichen G am 5'-Ende (7). Vielleicht ersetzt A an U1 eine mögliche U-Wechselwirkung durch eine ähnliche oder unterschiedliche Wechselwirkung mit HIV-RT, eine Ersetzung, die durch C oder G an dieser Position nicht erfolgen kann.
Das nächste Basenpaar von Stamm 1 (C2-G15) kann nicht ohne vollständigen Verlust von spezifischer Affinität zu HIV-RT durch ein G-C-Basenpaar ersetzt werden. Modifikation der Basenpaarungsflächen beider Nucleotide stört Bindung an HIV-RT stark, und Bindung mit HIV-RT schützt vor diesen Modifikationen. Substitution des nächsten Basenpaars, C3-G14, durch ein G-C-Paar zeigt eine weniger drastische Reduktion der Affinität, doch Modifikation stört an dieser Position stark. Substitution von G4-C13 durch ein C-G-Paar zeigt keine Wirkung auf Bindung, und Substitution der weniger stabilen A-U- und U-A-Paare lässt gewisse spezifische Affinität zu. Substitution dieser Positionen durch das nicht-paarende A-C unterbindet spezifische Bindung. Dies hängt mit dem Auftreten von C-G-Substitutionen und einer A-U-Substitution in der ursprünglichen SELEX-Phylogenese an dieser Position, der Nicht-Reaktivität dieses Basenpaars im nativen Zustand und dem hohen Grad an Modifikationsstörung, der für diese Basen erkannt wurde, zusammen.
Die Daten zu chemischen Modifikationen aus Schleife 2 bekräftigen die phylogenetische Konservierung, die in den ursprünglichen SELEX-Versuchen zu beobachten war, durchwegs. Starke Modifikationsstörung wird an den Positionen A17 und A19 gesehen. Schwache Modifikationsstörung tritt an A20 auf, was mit der Beobachtung von manchen der Schleifen 2 des ursprünglichen SELEX korreliert, die an dieser relativen Position deletiert sind (wenn auch die durchgeführten Versuche zu chemischer Störung nicht alle möglichen Kontakte, die eine Base mit HIV-RT bilden kann, erschöpfend testete). A18 ist im ursprünglichen SELEX nicht-konserviert, und weder stört Modifikation an dieser Position noch ist diese Position vor Modifikation durch Bindung an HIV-RT geschützt.
Zusammengefasst lassen die obigen Daten darauf schließen, dass die wesentlichen Komponenten von Stamm 1 ein einzelsträngiges 5'-Nucleotid (U oder A), das sequenzspezifischen Kontakt mit dem Protein bilden kann, und eine 3-Basenpaar-Helix (C2-G15, C3-G14, G4-C13), worin sequenzspezifische Wechselwirkungen mit dem HIV-RT an den ersten zwei Basenpaaren und eine Präferenz für ein starkes Basenpaar (d.h. entweder C-G oder G-C) an der dritten, Schleife schließenden Position von G4-C13 vorhanden sind, darstellen. Schleife 2 sollte aufgrund der einzelsträngigen Eigenschaft von G16, die möglicherweise mit HIV-RT auf eine sequenzspezifische Weise wechselwirkt, wie dies wahrscheinlich auch A17 und A19 machen, ausführlicher als GAXAA (16-20) beschrieben werden. Stamm 2 variiert bezüglich des Musters und der Anzahl von Basenpaaren bildenden Nucleotiden maßgeblich, aufgrund der 3'-Deletionsversuche jedoch, von denen hier berichtet wird, könnte angenommen werden, dass für maximale Affinität ein Minimum von 3 Basenpaaren in Stamm 2 erforderlich sind. Im Umfeld von acht Nucleotiden, die die zwei Stränge verbinden, die die Helix aus Stamm 1 umfassen, sind zumindest 2 Nucleotide in Schleife 1 des gebundenen Liganden erforderlich.
Die überarbeitete Ligandenbeschreibung für HIV-RT, die auf Grundlage der Verfahren dieser Erfindung gewonnen wurde, ist in 11 gezeigt. Die zentralen Unterschiede zu jener, die in 1 gezeigt ist (die auf den Consensus des ursprünglichen und sekundären SELEX basiert), ist die Länge von Stamm 2, die stärker degenerier te Spezifikation des Basenpaars G4-C13, die Größe von Schleife 1 (die direkt mit der Größe von Stamm 2 verbunden ist) und die einzelsträngige Beschaffenheit von U1 und G16.
Wie können diese Unterschiede miteinander in Einklang gebracht werden? Obwohl hier keine Einschränkung auf eine bestimmte Theorie beabsichtigt ist, erfordert das SELEX-Verfahren 5'- und 3'-fixierte Sequenzen zur Replikation. In jeder beliebigen RNA-Sequenz führen solche zusätzlichen Sequenzen zur Steigerung des Potenzials zu anderen Konformationen, die mit jener des hochaffinen Liganden konkurrieren. Als ein Resultat können zusätzliche strukturelle Elemente, die nicht direkt zur Affinität beitragen, wie ein verlängerter Stamm 2, selektiert werden. Angesichts der Tatsache, dass die ersten zwei Basenpaare von Stamm 1 aufgrund von sequenzspezifischen Kontakten C-G sein müssen, wäre das stabilste abschließende Basenpaar G4-C13 (Freier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9373 (1986)). Die sequenzspezifische Selektion von U1 und G16 kann mit ihrer Fähigkeit, Basenpaare zu bilden, übereinstimmen; in anderen Nucleinsäureliganden-Protein-Komplexen, wie beispielsweise Klenow-Fragment/Primer-Matrix-Verbindung und tRNA/tRNA-Synthetase, besteht signifikante lokale Denaturierung von basengepaarten Nucleotiden (Freemont et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8924 (1988); Ronald et al., Science 246, 1135 (1989)), die in diesem Fall ebenfalls auftreten kann.
VI. Durchführung des Walking-Versuchs mit HIV-RT-Nucleinsäureliganden zur Identifikation verlängerter Nucleinsäureliganden.
Es wurde bereits zuvor erkannt, dass fixierte Sequenzen (aus 28 Nucleotiden), 5' zum Pseudoknoten-Consensusliganden platziert, die Affinität zu HIV-RT reduzierten und dass Sequenzen (aus 31 Nucleotiden), 3' zum Liganden zugesetzt, diese Affinität steigerten. Ein SELEX-Versuch wurde daher durchgeführt, in dem eine 30 Nucleotide umfassende, variable Region 3' zur Liganden-B-Sequenz hinzugefügt wurde, um zu sehen, ob ein Consensus von höheren Affinitätsliganden gegen HIV-RT erhalten werden konnte. Einzelne Isolate wurden kloniert und nach dem 16. Durchgang sequenziert. Die Sequenzen sind in 9, gruppiert in zwei Motive, aufgelistet (Seq.- ID Nr. 115-135). Ein schematisches Diagramm der Konservierung von Sekundärstruktur und Primärsequenz von jedem Motiv ist in 10 gezeigt. Die Abstände zwischen den RNase-H- und katalytischen Polymerase-Domänen von HIV-RT wurden erst jüngst auf eine Größe von 18 Basenpaaren eines A-Form-RNA-DNA-Hybrids bestimmt, die (mittels Computer) in die Tasche einer Struktur bei einer Auflösung von 3,5 Å eingepasst wurde, welche aus Röntgenkristallographie abgeleitet wurde (Kohlstaedt et al., Science 256, 1783 (1992)). Der Abstand zwischen der Anhäufung an Basen, die für diese Wechselwirkung im Pseudoknoten als maßgeblich bestimmt wurden, und den konservierten Basen in der verlängerten Ligandensequenz beträgt ebenfalls etwa 18 Basenpaare. Demgemäß wird geschlossen, dass der Pseudoknoten mit der katalytischen Polymerasestelle wechselwirkt – darin, dass für den Liganden gezeigt wurde, dass er HIV-RT bindet, in dem die RNAse-H-Domäne deletiert ist – und dass die entwickelte Verlängerung des Pseudoknotens mit der RNAse-H-Domäne wechselwirken kann. Im Allgemeinen steigern die Liganden, die aus jedem dieser Motive getestet wurden, Affinität der Liganden-B-Sequenz zu HIV-RT um zumindest das 10fache.
VII. AUFKLÄRUNG EINES VERBESSERTEN NUCLEINSÄURELIGANDEN FÜR HIV-1-REV-PROTEIN.
Ein Beispiel für die Verfahren der vorliegenden Erfindung wird hierin für die Nucleinsäureliganden für HIV-1-Rev-Protein dargeboten.
Die PCT-Patentveröffentlichung WO 91/19813 beschreibt die Resultate, die gewonnen wurden, wenn SELEX mit dem Rev-Ziel durchgeführt wurde. Eine Untersuchung der Nucleinsäuresequenzen, für die erkannt wurde, dass sie eine hohe Affinität zu Rev zeigten, offenbarte eine Gruppierung dieser Sequenzen in drei Motive (I, II und III). Liganden von Motiv I schienen eine Zusammensetzung der einzelnen Motive, die durch Motive II und III beschrieben werden, zu sein und banden sich im Allgemeinen mit höherer Affinität an Rev. Eine der Motiv-I-Ligandensequenzen (Rev-Ligandensequenz 6a) band sich mit signifikant höherer Affinität als alle anderen Liganden, die kloniert und sequenziert wurden. Wie in 12 gezeigt, wird von der 6a- Sequenz angenommen, dass sie eine Aufweitung zwischen zwei Helices mit gewisser Basenpaarung über diese Aufweitung hinweg bildet.
Hierin werden chemische Modifikationsversuche beschrieben, die an Ligand 6a durchgeführt werden und darauf abzielen, die vorgeschlagene Sekundärstruktur zu bestätigen, herauszufinden, wo Bindung des Rev-Proteins den Liganden vor chemischem Angriff schützt, und die Nucleotide nachzuweisen, die für Rev-Wechselwirkung essenziell sind. Darüber hinaus wurde ein zweiter SELEX-Versuch mit beeinflusster Randomisierung der 6a-Ligandensequenz durchgeführt, um einen Consensus für die Bindung mit höchster Affinität an das HIV-1-Rev-Protein umfassender zu beschreiben.
Chemische Modifikation des Rev-Liganden. Untersuchung zu chemischer Modifikation des Rev-Liganden 6a wurden durchgeführt, um seine möglichen sekundären Strukturelemente zu bestimmen, um herauszufinden, welche Modifikationen die Bindung des Liganden durch Rev stören, um zu identifizieren, welche Positionen bei Proteinbindung vor Modifikation geschützt werden, und um mögliche Änderungen an der Ligandenstruktur nachzuweisen, die bei Bindung auftreten.
Die modifizierenden Chemikalien umfassen Ethylnitrosoharnstoff (ENU), der Phosphate modifiziert, Dimethylsulfat (DMS), das die Basenpaarungspositionen N3 von C und N1 von Adenin modifiziert, Kethoxal, das Basenpaarungspositionen N1 und N2 von Guanin modifiziert, Carbodiimid (CMCT), das Basenpaarungsposition N3 von Uracil und zu einem geringeren Ausmaß die N1-Position von Guanin modifiziert, und Diethylpyrocarbonat (DEPC), das die N7-Position von Adenin und zu einem gewissen Grad auch die N7 von Guanin modifiziert. ENU-Modifikation wurde durch Modifikations-abhängige Hydrolyse einer markierten RNA-Kette getestet, während alle anderen Modifikationsmittel an einem verlängerten RNA-Liganden verwendet wurden, wobei modifizierte Positionen durch Primet-Erweiterung eines anellierten Oligonucleotids aufgezeigt wurden.
Das chemische Sondieren der nativen Rev-Ligandenstruktur ist in 13 zusammengefasst. Die mittels Computer vorhergesagte Sekundärstruktur (Zuker (1989), s.o.; Jaeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7706 (1989)) und native Modifikationsdaten weisen allgemeine Übereinstimmung auf; der Ligand setzt sich aus drei Helixregionen, einer vier Basen umfassenden Haarnadelschleife und drei "Aufweitungs"-Regionen zusammen (siehe 13 für eine Definition dieser strukturellen "Elemente").
ENU-Modifikation von Phosphaten war für Liganden unter nativen und denaturierenden Bedingungen unverändert, was auf keine vorhandene Einbindung von Phosphatgruppen in der Sekundär- oder Tertiärstruktur der RNA hinweist. Im Allgemeinen sind alle mittels Computer vorhergesagten, Basenpaar bildenden Regionen vor Modifikation geschützt. Eine Ausnahme ist die leichte Modifikation von N7 (G¹⁰, A¹¹, G¹²) in der zentralen Helix (normalerweise eine geschützte Position in Helices). Diese Modifikationen sind möglicherweise ein Resultat von "Helix-Atmung"; die Abwesenheit von Basenpaarungsflächen-Modifikationen in der zentralen Helix lässt darauf schließen, dass die N7-Zugänglichkeit auf geringfügige Helix-Verdrehungen, und nicht auf ein vollständiges, lokales Auffalten der RNA, zurückzuführen ist. Die G19-U22-Haarnadelschleife ist vollständig modifiziert, unter Ausnahme von einer in gewisser Weise partiellen Modifikation von G19.
Die interessantesten Regionen in der nativen Struktur sind die drei "Aufweitungs"-Regionen, U8-U9, A13-A14-A15 und G26-A27. U8-U9 sind durch CMCT vollständig modifiziert, was möglicherweise auf Basenausrichtungen in das Lösungsmittel hinweist. A13, A14 und A15 werden alle durch DMS und DEPC modifiziert, wobei die stärksten Modifikationen am zentralen A14 auftreten. Das aufgeweitete Gegenüber der A13-A15-Region zeigt vollständigen Schutz von G26 und sehr geringe Modifikation von A27 durch DMS. Eine andere Untersuchung von Rev-Bindungs-RNAs (Bartel et al., Cell 67, 529 (1991)) trat für die Existenz von nicht kanonischer A:A- und A:G-Basenpaarung ein, die im vorliegenden Liganden A13:A27 und A15:G26 entsprechen würde. Diese Möglichkeiten werden durch diese Modifikationsdaten nicht ausgeschlossen, wobei jedoch die von Bartel et al. vorgeschlagene isosterische A:A- Basenpaarung die N1A-Positionen für Basenpaarung verwenden und somit gegenüber DMS-Behandlung resistent sein würde. So würde ein A:G-Paar wahrscheinlich entweder ein N1A oder N7A zur Paarung verwenden und A gegenüber DMS oder DEPC resistent lassen.
Modifikationsstörung von Rev-Bindung. Die Resultate der Untersuchungen zu Modifikationsstörungen sind in 14 zusammengefasst (quantitative Daten zu einzelnen modifizierenden Mitteln sind in den 15 bis 19 dargestellt). Im Allgemeinen häuft sich Phosphat- und Basenmodifikation-Bindungsstörung in zwei Regionen des RNA-Liganden an. Bei einer ersten Annäherung entsprechen diese Regionen zwei getrennten Motiven, die in den SELEX-Versuchen, die dieser vorliegenden Untersuchung vorangingen, vorhanden sind. Störung durch Phosphatmodifikation weist wahrscheinlich sehr stark auf tatsächliche Stellen für Liganden-Protein-Kontakte hin und stellt ein zusätzliches Kriterium für die Gruppierung der Modifikationsstörungsdaten in Regionen dar.
Die erste Region liegt rund um U24-G25-G26 und umfasst Störung aufgrund von Phosphat-, Basenpaarungsflächen- und N7-Modifikationen. Dieselben drei Nucleotide, konserviert in Wildtyp-RRE, wurden in einer Untersuchung zu Modifikationsstörung unter Verwendung kurzer RNAs, die die RRE-IIB-Stammschleife enthielten, auch als maßgeblich für Rev-Bindung erkannt (Kjems et al., EMBO J. 11, 1119 (1992)). Die zweite Region liegt rund um G10-A11-G12, wiederum mit Störung aus Phosphat-, Basenpaarungsflächen- und N7-Modifikationen. Darüber hinaus gibt es eine kleinere "Mini-Region", die den Abschnitt C6-A7-U8 umfasst, mit Störungen von Bindung durch Phosphat- und Basenpaarungsflächen-Modifikationen.
Über den gesamten Liganden zeigten zahlreiche Basenpaarungsflächen-Modifikationen Bindungsstörung, sehr wahrscheinlich aufgrund von Störungen in der Sekundärstruktur des Liganden. Zwei der "Aufweitungs"-Basen, U9 und A14, zeigten keine Modifikationsstörung, was darauf hinweist, dass beide weder eine Rolle bei spezifischer Basenpaarungswechselwirkungen/Stapelung noch beim Kontaktieren des Proteins spielten.
Chemischer Modifikationsschutz, wenn RNA an Rev gebunden ist. Die chemischen Modifikationsdaten zu "Footprinting" sind in 20 zusammengefasst. Vier Positionen, U8, A13, A15 und A27, zeigten zumindest eine zweifache Reduktion der Modifikation von Basenpaarungsflächen (und eine ähnliche Reduktion von N7-Modifikation für die A-Positionen), während sie sich an Rev-Protein banden. Die geringfügigen N7-Modifikationen von G10-A11-G12 unter nativen Bedingungen wurden nicht nachgewiesen, wenn der Ligand in Gegenwart von Rev modifiziert wurde. G32, unmodifiziert bei chemischem Sondieren der nativen RNA-Struktur, zeigte starke Modifikation seiner Basenpaarungsfläche und der N7-Position, wenn es mit Rev einen Komplex bildete. U31 und U33, 5' und 3' von G32, zeigten geringfügige CMCT-Modifikation, wenn der Ligand an Protein gebunden war.
Sekundäre SELEX unter Verwendung beeinflusster Randomisierung der Matrix. Eine Matrix wurde wie in 21 gezeigt synthetisiert, in der die Rev-Liganden-6a-Sequenz mit den anderen drei Nucleotiden an jeder Position im Verhältnis von 62,5 (für die 6a-Sequenz) zu 12,5 für jedes der anderen drei Nucleotide vermischt wurde. Diese beeinflusste Matrix ließ RNAs mit Hintergrund-Affinität für Rev-Protein entstehen (Kd = 10^–7). Sechs Durchgänge von SELEX ergaben die in 21 gezeigte Liste von Sequenzen. Die Häufigkeitsverteilung der an jeder Position gefundenen Nucleotide und Basenpaare ist, da sie sich von jener, die ausgehend von der Eingangs-Verteilung während der Matrixsynthese erwartet wurde, unterscheidet, in den 22 und 23 gezeigt. Ein neuer Consensus, basierend auf diesen Daten, ist in 24 gezeigt. Die signifikantesten Unterschiede aus der Sequenz von Rev-Ligand 6a sind Ersetzungen des relativ schwachen Basenpaars A7-U31 durch ein G-C-Paar und ermöglichte oder bevorzugte Substitution von U9 durch C, A14 durch U, U22 durch G. Absolut konservierte Positionen sind an den Stellen G10, A11, G12; A15, C16, A17; U24, G25; und C28, U29, C30 vorhanden. Keine Basen wurden als Substitution für G26 und A25 gefunden, obwohl eine bzw. drei Deletionen an diesen Positionen gefunden wurden. Zwei markierte Transkripte wurden synthetisiert, eines mit einer einfachen Liganden-6a-ähnlichen Sequenz und eines mit Substitutionen durch die in 24 gezeigten signifikanten Präferenzen. Diese RNAs banden sich auf identische Weise an Rev-Protein.
Die meisten der Substitutionen in der Stammregion steigern ihre Stabilität. Es scheint keine signifikante Selektion von Stämmen mit einer Länge von mehr als 5 Basenpaaren zu bestehen, obwohl dies eine Selektion auf Replizierbarkeit (zur Erleichterung von Replikation während des Schritts der reversen Transkription von SELEX beispielsweise) sein könnte. Es gibt keine gestreute Substitution von anderen Nucleotiden für U9 im ursprünglichen SELEX, von dem in der PCT-Patentanmeldungsveröffentlichung WO 91/19813, veröffentlicht am 26. Dezember 1991, berichtet wird, doch dieser Versuch zeigt bevorzugte Substitution durch C. Deletionen von A27 schienen auch im ursprünglichen SELEX auf. Ein überraschendes Resultat ist das häufigere Auftreten von C18-A-Paarungen anstelle von C18-G23.
Der Grund dafür, dass Präferenzen in diesem Versuch gefunden werden können, die die gemessene Bindungsaffinität nicht verbesserten, kann in den Unterschieden der Bindungsreaktionen von SELEX und diesen Bindungstests liegen. Bei SELEX wird ein relativ eingeengter Pool heterogener RNA-Sequenzen (flankiert durch die erforderlichen fixierten Sequenzen) an das Protein gebunden. In den Bindungstests werden geringe Konzentrationen von homogener RNA-Sequenz gebunden. Bei SELEX kann es aufgrund der erhöhten Wahrscheinlichkeit für intermolekulare und intramolekulare Kontakte mit anderen RNA-Sequenzen zur Selektion auf bessere Unterscheidbarkeit bezüglich der Konformationssicherheit kommen. Bei der therapeutischen Verabreichung konzentrierter Dosen von RNA-Liganden und ihrer modifizierten Homologe können diese in sekundären SELEX-Untersuchungen gefundenen Präferenzen von Bedeutung sein.
Nucleinsäureliganden zum HIV-1-tat-Protein.
Die vorliegende Erfindung setzt das SELEX-Verfahren für ein spezifisches Ziel, das HIV-1-tat-Protein, ein. In nachstehenden Beispiel III werden die Versuchsparameter, die verwendet werden, um die Lösung von Nucleinsäureliganden zu HIV-1-tat-Protein zu isolieren und zu identifizieren, beschrieben. 26 listet die Nucleinsäuren auf, die nach 10 Wiederholungen des SELEX-Verfahrens sequenziert wurden.
25 zeigt die natürlich vorkommende TAR-Sequenz, die als ein natürlicher Ligand zum tat-Protein erkannt wurde. Die spezifische Wechselwirkungsstelle zwischen dem tat-Protein und der TAR-Sequenz wurde bestimmt und ist ebenfalls in 25 identifiziert.
Die in 26 gezeigten Sequenzen sind drei "Motiven" zugeordnet. Jedes dieser Motive stellt eine Lösung von Nucleinsäureliganden zum HIV-1-tat-Protein dar. Regionen von konservierter Primärsequenz innerhalb eines jeden Motivs sind mit strichlierten Linien eingerahmt. Die Motive I und II enthalten eine gemeinsame Struktur, die konservierte Sequenzen (jene Sequenzen, die in allen oder in beinahe allen Nucleinsäuresequenzen zu finden sind, die das gegebene Motiv bilden) in eine durch helikale Elemente flankierte Aufweitung platziert. Die Konservierung der Primärsequenz – die hauptsächlich in den einzelsträngigen Domänen von jeder Aufweitung vorhanden ist – sind zwischen den Motiven I und II auch ähnlich. Das dritte Motiv (III) ist durch eine große Schleife gekennzeichnet. Die drei Motive sind in 27 schematisch dargestellt. Es gibt keine augenscheinliche Ähnlichkeit zwischen den hierin identifizierten Nucleinsäureliganden und der in 25 gezeigten TAR-Sequenz.
Eine Bestimmung mittels Begrenzungsanalyse wurde an einer der Ligandensequenzen in Motiv III durchgeführt. Die Erkennungsbegrenzungen sind in 26 durch ein Kästchen mit durchgezogener Linie angegeben. Die Begrenzungsbestimmung wurde gemäß den zuvor beschriebenen Verfahren durchgeführt. Siehe Tuerk et al., J. Mol. Biol. 213, 749 (1990); Tuerk & Gold, Science 249, 505 (1990)).
In 28 sind die Bindungsaffinitäten der Sequenzen 7 (Motiv I), 24 (Motiv II), 29 (Motiv II), 31 (Motiv III) und des ursprünglichen Kandidatengemischs abgebildet. Wie daraus ersichtlich ist, weisen die Mitglieder aus jedem der Nucleinsäureliganden-Lösungsmotive im Vergleich zum Kandidaten-Nucleinsäuregemisch erhöhte Affinität zum tat-Protein auf. Jeder der Liganden zeigt im Vergleich zur TAR-Sequenz eine signifikant höhere Affinität zum tat-Protein.
Um Nucleinsäuren zu bilden, die für die Verwendung als Pharmazeutika wünschenswert sind, wird bevorzugt, dass der Nucleinsäureligand 1) sich so an das Ziel bindet, dass die erwünschte Wirkung auf das Ziel erreicht wird; 2) so klein wie möglich ist, um die erwünschte Wirkung zu erzielen; 3) so stabil wie möglich ist; und 4) ein spezifischer Ligand zum ausgewählten Ziel ist. In den meisten, wenn nicht in allen, Situationen wird bevorzugt, dass der Nucleinsäureligand die höchstmögliche Affinität zum Ziel aufweist.
Die Erfindung umfasst die in 26 gezeigten, spezifischen Nucleinsäureliganden und die in 27 schematisch gezeigten Nucleinsäureligandenlösungen. Der von dieser Erfindung abgedeckte Schutzumfang der Liganden umspannt alle Liganden zum tat-Protein, die gemäß dem SELEX-Verfahren identifiziert wurden. Spezifischer umfasst diese Erfindung Nucleinsäuresequenzen, die 1) im Wesentlichen homolog zu den in 26 gezeigten, spezifischen Nucleinsäureliganden sind und im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit wie diese spezifischen Nucleinsäureliganden besitzen, sich an das tat-Protein zu binden, oder die 2) im Wesentlichen homolog zu den in 27 gezeigten Nucleinsäureligandenlösungen sind und im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit wie diese Nucleinsäureligandenlösungen besitzen, sich an das tat-Protein zu binden. Unter im Wesentlichen homolog wird ein Grad von Primärsequenzhomologie von über 70 %, am meisten bevorzugt von über 80 %, verstanden. Im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit besitzen, sich an das tat-Protein zu binden, bedeutet, dass die Affinität innerhalb von zwei Größenordnungen der Affinität der hierin beschriebenen, im Wesentlichen homologen Sequenz liegt. Es liegt durchwegs im Kompetenzbereich von Fachleuten, zu bestimmen, ob eine bestimmte Sequenz – im Wesentlichen homolog zu jenen, die hierin spezifisch beschrieben sind – im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit besitzt, sich an das tat-Protein zu binden.
Ein Überblick zu den Motiven I, II und III und die in 28 gezeigten Bindungskurven zeigen, dass Sequenzen, die nur geringe oder keine Primärsequenzhomologie aufweisen, stets im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit aufweisen können, das tat-Protein zu binden. Wird angenommen, dass sich jedes dieser Ligandenmotive an dieselbe Bindungsstelle des tat-Proteins bindet, so geht klar hervor, dass Bindung durch die Sekundär- oder Tertiärstruktur des Nucleinsäureliganden gesteuert wird. Bestimmte Primärstrukturen – die hierin durch die Motive I, II und III dargestellt sind –, sind offensichtlich in der Lage, Strukturen anzunehmen, die jenen der Bindungsstelle des tat-Proteins sehr ähnlich zu sein scheinen. Aus diesen Gründen umfasst die vorliegende Anmeldung auch Nucleinsäureliganden, die im Wesentlichen dieselbe strukturelle Form wie die hierin dargelegten Liganden aufweisen und die im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit wie die in 26 oder 27 gezeigten Nucleinsäureliganden besitzen, das tat-Protein zu binden, worin im Wesentlichen dieselbe Struktur alle Nucleinsäureliganden umfasst, die gemeinsame strukturelle Elemente der Motive I, II und III aufweisen, die Affinität zum tat-Protein ergeben.
Diese Erfindung umfasst die Liganden wie zuvor beschrieben, worin bestimmte chemische Modifikationen vollzogen wurden, um die In-vivo-Stabilität des Liganden zu steigern oder die Zufuhr des Liganden zu fördern oder zu vermitteln.
Die hierin beschriebenen Nucleinsäureliganden und Nucleinsäureligandenlösungen zum HIV-1-tat-Protein sind als Pharmazeutika und als Teil von Gentherapiebehandlungen nützlich. Gemäß den Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, können die Nucleinsäureliganden intrazellulär in Zellen eingeführt werden, die mit dem HIV-Virus infiziert sind, wo der Nucleinsäureligand mit der TAR-Sequenz um das tat-Protein konkurriert. So kann Transkription von HIV-Genen unterbunden werden.
Nucleinsäureliganden zu Thrombin. Diese Erfindung umfasst die spezifischen, in 29 gezeigten Nucleinsäureliganden (Seq.-ID Nr. 137-155). Der Schutzumfang der durch diese Erfindung abgedeckten Liganden umspannt alle Liganden zu Thrombin, die gemäß dem SELEX-Verfahren identifiziert wurden. Insbesondere umfasst diese Erfindung Nucleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen homolog zu den in 29 gezeigten, spezifischen Nucleinsäureliganden (Seq.-ID Nr. 137-155) sind und im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit wie diese Nucleinsäureliganden besitzen, sich an Thrombin zu binden.
Ein Bericht zu den in 30 gezeigten, vorgeschlagenen strukturellen Formationen für die Liganden der Gruppe I und der Gruppe II zeigt, dass Sequenzen, die nur geringe oder keine Primärsequenzhomologie aufweisen, stets im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit besitzen können, Thrombin zu binden. Aus diesen Gründen umfasst die vorliegende Erfindung auch RNA-Liganden, die im Wesentlichen dieselbe Struktur wie die hierin dargelegten Liganden aufweisen und die im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit wie die in 30 gezeigten RNA-Liganden besitzen, Thrombin zu binden (Seq.-ID Nr. 156-159). "Im Wesentlichen dieselbe Struktur" umfasst alle RNA-Liganden, die die gemeinsamen Strukturelemente der in 30 gezeigten Sequenzen (Seq.-ID Nr. 156-159) aufweisen.
Diese Erfindung umfasst auch die zuvor beschriebenen Liganden, worin bestimmte chemische Modifikationen vorgenommen wurden, um die In-vivo-Stabilität des Liganden zu steigern oder um die Zufuhr des Liganden zu fördern oder zu vermitteln. Insbesondere sind im Schutzumfang dieser Erfindung RNA-Liganden von Thrombin eingebunden, die 2'-NH₂-Modifikationen bestimmter Ribosen des RNA-Liganden enthalten.
Die hierin beschriebenen Nucleinsäureliganden und Nucleinsäureligandenlösungen zu Thrombin sind als Pharmazeutika und als Teil von Gentherapiebehandlungen nützlich.
Die Begriffe der Gefäßverletzung und Thrombose sind für das Verständnis der Pathogenese verschiedener Gefäßerkrankungen, einschließlich des Beginns und des Fortschreitens von Atherosklerose, der akuten Koronargefäßsyndrome, Venentransplantat-Erkrankungen und Restenose nach koronarer Angioplastie, wichtig.
Von den hochaffinen Thrombinbindungs-RNA-Liganden dieser Erfindung kann erwartet werden, dass sie verschiedene Eigenschaften besitzen. Diese Charakteristika können im Zusammenhang mit Hirudinpeptid-Inhibitoren und dem gängigen Verständnis von Thrombinstruktur und -bindung betrachtet werden. Im Rahmen dieses Verständnisses, und ohne hier an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, ist es sehr wahrscheinlich, dass die RNA-Liganden die stark basische, anionische Exostelle binden. Auch ist es wahrscheinlich, dass die RNA nicht die katalytische Stelle bindet, die hohe Spezifität für den kationischen Argininrest aufweist. Man könnte annehmen, dass sich die RNA-Liganden auf dieselbe Weise verhalten wie die C-terminalen Hirudinpeptide. Als solche würden sie kleine Peptidylsubstrate nicht stark inhibieren, würden jedoch Fibrinogen-Koagulation, Protein-C-Aktivierung, Blutplättchen-Aktivierung und Endothelzellen-Aktivierung inhibieren. Angenommen, Fibrinogen-Koagulation und TM-Bindungsaktivitäten sind innerhalb der anionischen Exostelle voneinander zu trennen, so ist es möglich, dass verschiedene hochaffine RNA-Liganden diese Aktivitäten differenziell inhibieren können. Darüber hinaus kann eine Aktivität gegenüber einer anderen ausgewählt werden, um ein potenteres Antikoagulans als Prokoagulans zu bilden.
Das SELEX-Verfahren zur Identifikation von Liganden zu einem Ziel wurde unter Verwendung von menschlichem Thrombin als Ziel und eines Kandidatengemischs, das 76 Nucleotide umfassende RNAs mit einer 30 Nucleotide umfassenden Region randomisierter Sequenzen enthielt, durchgeführt (Beispiel IV). Nach zwölf SELEX-Durchgängen wurden einige der selektierten Liganden sequenziert, um die Existenz von zwei Gruppen von Sequenzen aufzuzeigen, die gemeinsame Elemente in der Primärsequenz aufwiesen.
Eine drastische Verlagerung von Bindung der RNA-Population wurde nach 12 SELEX-Durchgängen beobachtet, wenn diese mit dem Hauptteil von 30N-RNA verglichen wurde. Sequenzieren des RNA-Hauptteils nach 12 Durchgängen zeigte auch ein nicht-zufälliges Sequenzprofil. Die RNA wurde rückwärts transkribiert, amplifiziert, kloniert, und die Sequenzen von 28 einzelnen Molekülen wurden bestimmt (29). Basierend auf Primärsequenzhomologie wurden 22 der RNAs als Klasse I gruppiert, und 6 RNAs wurden als Klasse II gruppiert. Von den 22 Sequenzen der Klasse I enthielten 16 (8 von diesen waren identisch) ein identisches Sequenzmotiv GGAUCGAAG(N)₂AGUAGGC (Seq.-ID Nr. 9), während die verbleibenden 6 Sequenzen 1 oder 2 Nucleotidänderungen in der definierten Region oder einige wenige Variationen in N=2 bis N=5 enthielten. Dieses konservierte Motiv variierte bezüglich seiner Position innerhalb der 30N-Region. In Klasse II waren 3 der 6 RNAs identisch, und alle von ihnen enthielten das konservierte Motiv GCGGCUUUGGGCGCCGUGCUU (Seq.-ID Nr. 10), das ausgehend vom Ende der 5'-fixierten Region am 3. Nucleotid beginnt.
Drei Sequenzvarianten-RNA-Liganden aus Klasse I (6, 16 und 18) und einer aus Klasse II (27), identifiziert durch die Reihenfolge, in der sie sequenziert wurden, wurden für individuelle Bindungsanalyse verwendet. Für Klasse-I-RNAs stand als Beispiel Klon 16 mit einer kD von etwa 30 ⁿM, und die kD für den Klasse-II-RNA-Klon 27 betrug etwa 60 ⁿM.
Um die minimalen Sequenzerfordernisse für spezifische, hochaffine Bindung der 76-Nucleotid-RNA zu identifizieren, die die variable 30N-Region, flankiert durch 5'- und 3'-fixierte Sequenz, umfasst, wurden 5'- und 3'-Begrenzungsversuche durchgeführt. Für 5'-Begrenzungsversuche wurden die RNAs 3'-endmarkiert und hydrolysiert, um einen Pool an RNAs mit variierenden 5'-Enden zu ergeben. Für die 3'-Begrenzungsversuche wurden die RNAs 5'-endmarkiert und hydrolysiert, um einen Pool an RNAs mit variierenden 3'-Enden zu ergeben. Minimale RNA-Sequenzerfordernisse wurden nach RNA-Proteinbindung an Nitrocellulosefilter und Identifikation von markierter RNA durch Gelelektrophorese bestimmt.
3'-Begrenzungsversuche ergaben die Begrenzungen für jede der in 30A gezeigten 4 Sequenzen (Seq.-ID Nr. 156-159). Diese Begrenzungen stimmten mit allen Proteinkonzentrationen überein. 5'-Begrenzungsversuche ergaben die in 31 gezeigten Begrenzungen plus/minus 1 Nucleotid, unter Ausnahme von RNA 16, die einen größeren Begrenzungsbereich mit geringerer Proteinkonzentration ergab. Basierend auf diesen Begrenzungsversuchen sind mögliche Sekundärstrukturen der Thrombinliganden in 30B gezeigt.
RNAs, die der kleinsten und größten Haarnadel von Klasse-I-Klon 16 (24 und 39 Nucleotide) und der Haarnadel von Klasse-II-Klon 27 (33 Nucleotide) entsprechen, wurden für Bindungsanalyse synthetisiert oder transkribiert (siehe 30B). Resulta te zeigen, dass sich die RNA-27-Haarnadel mit einer Affinität (kD von etwa 60 ⁿM) bindet, die jener des gesamten 72-Nucleotid-Transkripts mit fixierter und variabler Region entspricht (vergleiche RNA 27 in 31A mit RNA 33R in 31 C). Die kDs für Klasse-I-Klon-16-RNA-Haarnadeln andererseits stiegen um eine Größenordnung von 30 ⁿM auf 200 ⁿM.
Für Modifikationen in der 2NH₂-Ribose von Pyrimidinresten von RNA-Molekülen wurde gezeigt, dass sie Stabilität von RNA (resistent gegenüber Abbau durch RNase) in Serum um zumindest das 1.000fache erhöhen. Bindungsversuche mit den 2NH₂-CTP/UTP-modifizierten RNAs von Klasse I und Klasse II zeigten einen signifikanten Abfall von Bindung im Vergleich zu der nicht modifizierten RNA (32). Bindung durch den 30N-RNA-Hauptteil zeigte jedoch einen geringfügigen Anstieg von Affinität, wenn sie modifiziert war.
Für ein ssDNA-Molekül mit einem 15 Nucleotide umfassenden Consensus 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3' (G15D) (Seq.-ID Nr. 1) wurde gezeigt, dass es menschliches Thrombin bindet und Fibrin-Gerinnselbildung in vitro inhibiert (Bock et al. (1992), s.o.). Die Resultate von Konkurrenz-Versuchen für Bindung von Thrombin zwischen G15D und den RNA-Haarnadelliganden dieser Erfindung sind in 33 dargestellt. Im ersten dieser Versuche A) wurde ³²P-markierte G15D als Tracer bei steigenden Konzentrationen von unmarkierter RNA oder unmarkierter G15D verwendet. Wie erwartet wurde, wenn die G15D verwendet wurde, um um seine eigene Bindung zu konkurrieren, Bindung von markierter DNA bei äquimolaren Konzentrationen (1 μM) von markierter und unmarkierter Konkurrenz-DNA auf 50 % reduziert. Sowohl die synthetischen Klasse-I-Klon-16-RNAs 24 und 39 als auch die synthetische Klasse-II-Klon-27-RNA 33 waren in der Lage, bei dieser Konzentration um Bindung von G15D zu konkurrieren. In Versuch B) wurde die höher affine Klasse-II-Haarnadel-RNA 33 (kD ≈ 60 ⁿM) ³²P-markiert und als Tracer bei steigenden Konzentrationen von unmarkierter RNA oder unmarkierter G15D-DNA (kD ≈ 200 ⁿM) verwendet. In diesen Versuchen war die G15D in der Lage, wirksam mit RNA 33 bei höheren Konzentrationen als jenen zu konkurrieren, bei denen RNA 33 mit sich selbst konkurriert (Bindungsverschiebung nach rechts), ein Resultat, das erwartet wird, wenn mit einem Liganden mit 3- bis 4fach höherer Affinität konkurriert wird. Die Klasse-II-Haarnadel-RNA 33 (kD ≈ 60 ⁿM) war nur geringer Konkurrenz durch die Klasse-I-Haarnadel-RNA 24 (kD ≈ 200 ⁿM) ausgesetzt, was darauf schließen lässt, dass, wenn auch eine gewisse Überlappung vorhanden ist, sich die RNAs dieser zwei Klassen mit hoher Affinität an verschiedene, doch immer noch benachbarte oder überlappende Stellen binden. Da beide dieser RNAs um G15D-Bindung konkurrieren können, bindet sich dieses DNA-15mer wahrscheinlich in der Region der Überlappung zwischen den Klasse-I- und Klasse-II-Haarnadeln.
Spaltung des chromogenen Substrats S2238. Die Fähigkeit von Thrombin, das chromogene Peptidylsubstrat S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNitroanilin) (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA) (Kabi Pharmacia) zu spalten, wurde in Gegenwart und Abwesenheit der RNA-Liganden dieser Erfindung gemessen. Es gab keine Inhibierungswirkung von RNA auf diese Spaltungsreaktion bei 10^–8 M Thrombin und 10^–8 M RNA, 10^–9 M Thrombin und 10^–8 M RNA oder bei 10^–8 M Thrombin und 10^–7 M RNA (34A). Diese Resultate lassen darauf schließen, dass sich die RNA-Liganden nicht in der katalytischen Stelle des Enzyms binden.
Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin und Gerinnselbildung. Die Fähigkeit von Thrombin, Gerinnselbildung durch Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin zu katalysieren, wurde in Gegenwart und Abwesenheit von RNA gemessen. War RNA in einer Konzentration entsprechend der Kd (30 ⁿM für Klasse-I-RNAs und 60 ⁿM für Klasse-II-RNAs) vorhanden, was ein 5- bis 10facher Überschuss von Thrombin war, so wurde die Koagulationsdauer um das 1,5fache erhöht (34B).
Spezifität von Thrombinbindung. Repräsentative Liganden aus Klasse I und Klasse II zeigten, dass diese Liganden geringe Affinität für ATIII bei Konzentrationen von 1 μM aufwiesen (35A). Diese Liganden zeigten reduzierte Affinität im Vergleich zur Hauptteil-30N3-RNA, was darauf schließen lässt, dass eine Selektion gegen nichtspezifische Bindung erfolgt war. Dies ist von besonderer Bedeutung, da ATIII ein reichlich vorhandenes Plasmaprotein mit hoher Affinität für Heparin, ein polyanionisches Makromolekül, ist. Diese Resultate zeigen, dass die Entwicklung einer diskreten Struktur, die in den Klasse-I- und Klasse-II-RNAs vorhanden ist, für Thrombinbindung spezifisch ist und dass sie sich, trotz ihrer polyanionischen Zusammensetzung, nicht an ein hochaffines Heparin-Bindungsprotein bindet. Auch gilt es anzumerken, dass diese für Thrombin spezifischen RNA-Liganden keine Affinität für Prothrombin, den inaktiven biochemischen Vorläufer von aktivem Thrombin, der in hohen Konzentrationen im Plasma zirkuliert (= 1 μM), zeigen (35B).
Nucleinsäureliganden zu basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF). Die vorliegende Erfindung wendet das SELEX-Verfahren an einem spezifischen Ziel, bFGF, an. Im nachfolgenden Abschnitt zu den Beispielen werden die zur Isolierung und Identifikation der Nucleinsäureligandenlösungen zu bFGF verwendeten Versuchsparameter beschrieben.
Diese Erfindung umfasst die spezifischen, in den Tabellen II-IV gezeigten Nucleinsäureliganden. Der von dieser Erfindung abgedeckte Schutzumfang der Liganden umspannt alle Liganden zu bFGF, die gemäß dem SELEX-Verfahren identifiziert wurden. Insbesondere umfasst diese Erfindung Nucleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen homolog zu den spezifischen, in den Tabellen II-IV gezeigten Nucleinsäureliganden sind und die im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit wie diese spezifischen Nucleinsäureliganden besitzen, sich an bFGF zu binden.
Ein Überblick zu den in 41 gezeigten, vorgeschlagenen strukturellen Formationen für die Liganden der Familie 1 und 2 zeigt, dass Sequenzen, die nur geringe oder keine Primärsequenzhomologie aufweisen, immer noch im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit besitzen können, bFGF zu binden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch RNA-Liganden, die im Wesentlichen dieselbe Struktur wie die hierin präsentierten Liganden aufweisen und im Wesentlichen dieselbe Fähigkeit wie die in den Tabellen II und III gezeigten RNA-Liganden besitzen, bFGF zu binden. "Im Wesentlichen dieselbe Struktur" umfasst alle RNA-Liganden, die die gemeinsamen strukturel len Elemente der in den Tabellen II und III gezeigten Sequenzen (Seq.-ID Nr. 27-67) aufweisen.
Diese Erfindung umfasst auch die zuvor beschriebenen Liganden, worin bestimmte chemische Modifikationen vorgenommen wurden, um die In-vivo-Stabilität des Liganden zu steigern, die Zufuhr des Liganden zu fördern oder zu vermitteln oder die Clearance-Geschwindigkeit aus dem Körper zu reduzieren. Insbesondere im Schutzumfang dieser Erfindung eingebunden sind RNA-Liganden von bFGF, die 2'-NH₂-Modifikationen bestimmter Ribosen des RNA-Liganden enthalten.
Die hierin beschriebenen Nucleinsäureliganden und Nucleinsäureligandenlösungen zu bFGF sind als Pharmazeutika und als Teil von Gentherapiebehandlung nützlich. Weiters können die hierin beschriebenen Nucleinsäureliganden zu bFGF auf nützliche Weise für diagnostische Zwecke verwendet werden.
Die hochaffinen Nucleinsäureliganden der vorliegenden Erfindung können auch verschiedene Eigenschaften aufweisen, einschließlich der Fähigkeit, die biologische Aktivität von bFGF zu inhibieren. Für repräsentative Liganden aus der Sequenzfamilie 1 und 2 wurde erkannt, dass sie Bindung von bFGF sowohl an gering affine als auch an hochaffine Zelloberflächenrezeptoren inhibieren. Diese Nucleinsäureliganden können als spezifische und potente Neutralisatoren von bFGF-Aktivität in vivo nützlich sein.
BEISPIEL I: AUFKLÄRUNG VERBESSERTER NUCLEINSÄURELIGANDENLÖSUNG FÜR HIV-RT
RNA-Synthese. In-vitro-Transkription mit Oligonucleotid-Matrices wurde wie von Milligan et al. (1987), s.o., beschrieben durchgeführt. Alle synthetischen Nucleinsäuren wurden an einem DNA/RNA-Synthesegerät Modell 394-08 von Applied Biosystems unter Verwendung herkömmlicher Arbeitsvorschriften hergestellt. Desoxyribonucleotidphosphoramidite und DNA-Synthese-Lösungsmittel und -Reagenzien wurden bei Applied Biosystems erworben. Ribonucleotid- und 2'-Methoxyribonucleotidphospho ramidite wurden bei Glen Research Corporation erworben. Für gemischte Basenpositionen wurden 0,1 M Phosphoramiditlösungen in den angegebenen Volumsverhältnissen vermischt. Basenentschützung erfolgte 6 h lang bei 55°C in einem 3:1-Verhältnis Ammoniumhydroxid:Ethanol. t-Butyldimethylsilyl-Schutzgruppen wurden von den 2'-OH-Gruppen von synthetischen RNAs mittels Behandlung über Nacht in Tetrabutylammoniumfluorid entfernt. Die RNAs ohne Schutzgruppen wurden dann Phenol-extrahiert, Ethanol-gefällt und durch Gelelektrophorese gereinigt.
Affinitätstests mit markierter RNA und HIV-RT. Modell-RNAs zur Verfeinerung der 5'- und 3'-Begrenzungen und zur Bestimmung der Wirkung von Substitutionen wurden während der Transkription mit T7-RNA-Polymerase, wie in Tuerk & Gold (1990), s.o., beschrieben, außer dass α-³²P-ATP verwendet wurde, in Reaktionen von 0,5 mM C, G und UTP mit 0,05 mM ATP markiert. Synthetische Oligonucleotide und phosphatisierte Transkripte (wie in Tuerk & Gold (1990), s.o.) wurden wie in Gauss et al., Mol. Gen. Genet. 206, 24 (1987), beschrieben kinasiert. Alle RNA-Protein-Bindungsreaktionen erfolgten in einem "Bindungspuffer" aus 200 mM KOAc, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, 10 mM Dithiothreit, mit den Ausnahmen, die nachstehend für chemische Schützungsversuche genannt sind. RNA- und Proteinverdünnungen wurden vermischt und auf Eis 30 min lang gelagert und anschließend 5 min lang auf 37°C gebracht. in Bindungstests betrug das Reaktionsvolumen 60 μl, wovon 50 μl getestet wurden. Jede Reaktion wurde durch ein vorher benetztes Nitrocellulosefilter (mit Bindungspuffer) gesaugt und mit 3 ml Bindungspuffer gespült, wonach sie getrocknet und für Tests gezählt oder Elution unterzogen und auf chemische Modifikation getestet wurde. In Vergleichen zur Bindungsaffinität wurden Resultate in Diagrammform dargestellt, und die Proteinkonzentration, bei der halbmaximale Bindung auftrat (die ungefähre kD unter Bedingungen von Proteinüberschuss), wurde graphisch bestimmt.
Selektion von modifizierten RNAs durch HIV-RT. Bindungsreaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass nicht die Menge von zu einer Reaktion hinzugefügtem HIV-RT variiert wurde, sondern das Reaktionsvolumen erhöht wurde, um die Konzentration zu reduzieren. RNAs, die unter denaturierenden Bedingungen modifiziert wurden, wurden bei Konzentrationen von 20, 4 und 0,8 nM HIV-RT (in Volumina von 1, 5 und 25 ml Bindungspuffer) selektiert. Die Menge von RNA, die zu jeder Reaktion zugesetzt wurde, war in jedem Versuch äquivalent (etwa 1-5 pmol). RNA wurden aus Filtern wie in Tuerk & Gold (1990), s.o., beschrieben eluiert und auf modifizierte Positionen getestet. In jedem Versuch wurde eine Kontrolle eingebunden, in der unselektierte RNA auf ein Filter aufgetragen, eluiert und parallel zu den selektierten RNAs auf modifizierte Positionen getestet wurde. Bestimmungen von Variationen chemischer Modifikationen für selektierte gegenüber unselektierten RNAs erfolgten mittels Sichtprüfung entwickelter Filme von einer Elektrophorese unterzogenen Testprodukten mit den folgenden Ausnahmen. Das Ausmaß von Modifikationsstörung durch ENU wurde durch densitometrisches Scannen von Filmen unter Verwendung eines LKB-Laser-Densitometers bestimmt. Ein Index zur Modifikationsstörung (M.I.) an jeder Position wurde wie folgt berechnet:
M.I. = (O.D.unselektiert/O.D.unselektiert A20)/(O.D.selektiert/O.D.selektiert A20)
worin der Wert an jeder getesteten Position für selektierte modifizierte RNA (O.D.selektiert) durch den Wert für Position A20 (O.D.selektiert A20) dividiert wird und durch in ähnlicher Weise normalisierte Werte für die unselektierte Spur dividiert wird. Alle Werte von M.I. über 2,0 werden als Störung und alle Werte über 4,0 als starke Störung betrachtet. Bei der Bestimmung der Wirkungen von gemischter Substitution von 2'-Hydroxylen durch 2'-Methoxys (an der Ribose an jeder Nucleotidposition) wurden Gele von Elektrophorese unterzogenen Hydrolyseprodukten an einem Ambis-Detektionssystem direkt gezählt. Die mit jeder Bande innerhalb einer Spur assoziierten Zählungen wurden wie zuvor gezeigt, außer für Position A17, normalisiert. Darüber hinaus wurden Bestimmungen mittels Laser-Densitometrie wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
Chemische Modifikation von RNA. Ein zweckdienlicher Bericht über die Typen chemischer Modifikationen von RNA und ihrer Spezifitäten und Testverfahren wurde von Ehresmann et al. (1987), s.o., zusammengestellt. Modifikation von RNA unter nativen Bedingungen erfolgte bei 200 mM KOAc, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, bei 37°C mit E thylnitrosoharnstoff (ENU) (1/5-Verdünnung (Vol./Vol.) von bei Raumtemperatur mit ENU gesättigtem Ethanol) 1-3 Stunden lang, Dimethylsulfat (DMS) (1/750-Verdünnung, Vol./Vol.) acht Minuten lang, Kethoxal (0,5 mg/ml) acht Minuten lang, Carbodiimid (CMCT) (8 mg/ml) 20 min lang und Diethylpyrocarbonat (DEPC) (1/10-Verdünnung, Vol./Vol., für native Bedingungen oder 1/100-Verdünnung für denaturierende Bedingungen) 45 min lang, und unter denselben Bedingungen, gebunden an HIV-RT, mit dem Zusatz von 1 mM DTT. Die Konzentrationen chemischer Modifizierungsreagenzien waren für denaturierende Bedingungen identisch (mit Ausnahme wo für DEPC angemerkt); jene Bedingungen waren 7 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, 1 mM EDTA bei 90°C 1-5 min lang, außer während der Modifikation mit ENU, die in Abwesenheit von 7 M Harnstoff erfolgte.
Test auf chemische Modifikation. Positionen von chemischer Modifikation wurden durch reverse Transkription für DMS, Kethoxal und CMCT an der verlängerten Liganden-B-RNA, 5'-GGUCCGAAGUGCAACGGGAAAAUGCACUAUGAAAGAAU-UUUAUAUCUCUAU UGAAAC-3' (Seq.-ID Nr. 11) (die Liganden-B-Sequenz ist unterstrichen), an die der Oligonucleotid-Primer 5'-CCGGATCCGTTTCAATAGAG-ATATAAAATTC-3' (Seq.-ID Nr. 12) anelliert ist, getestet; Produkte aus reverser Transkription (gewonnen wie in Gauss et al. (1987), s.o., beschrieben) wurden durch Elektrophorese an 10 % Polyacrylamidgelen getrennt. Positionen von ENU- und DEPC-Modifikation wurden wie in Vlassov et al., FEBS Lett. 120, 12 (1980), bzw. Peattie & Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4679 (1980), beschrieben getestet (getrennt durch Elektrophorese an 20 % Polyacrylamidgelen). Tests von 2'-Methoxyribose gegenüber Ribose an verschiedenen Positionen wurden mittels 45-minütiger alkalischer Hydrolyse bei 90°C in 50 mM Natriumcarbonat, pH 9,0, durchgeführt.
Modifikation von RNA in Gegenwart von HIV-RT.
Die Bedingungen waren dieselben wie für die Modifikation nativer RNA. Konzentrationen von HIV-RT betrugen etwa das Zehnfache der RNA-Konzentration. Im Allgemeinen lagen Proteinkonzentrationen im Bereich von 50 nM bis 1 μM.
SELEX-Isolierung von zusätzlichen Kontakten mit HIV-RT.
Die Ausgangs-RNA wurde aus PCRd-Matrices transkribiert, die aus den folgenden Oligonucleotiden synthetisiert wurden:
5'-GGGCAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGTCCGAAGTGCAACGGGAAAATGCACT-3' (5'-Primer) (Seq.-ID Nr. 13),
5'-GTTTCAATAGAGATATAAAATTCTTTCATAG-3' (3'-Primer) (Seq.-ID Nr. 14),
5'-GTTTCAATAGAGATATAAAATTCTTTCATAG-[30N]AGTGCATTTTCCCGT TGC-ACTTCGGACC-3' (variable Matrix) (Seq.-ID Nr. 15).
SELEX wurde wie zuvor beschrieben mit HIV-RT mit den folgenden Ausnahmen durchgeführt. Die Konzentration von HIV-RT in der Bindungsreaktion des ersten SELEX-Durchgangs betrug 13 nM, RNA bei 10 μM, in 4 ml Bindungspuffer, in den Durchgängen 2 bis 9 erfolgte Selektion mit 2,6 nM HIV-RT, 1,8 μM RNA in 20 ml Puffer, in den Durchgängen 10 bis 14 wurden 1 nM HIV-RT, 0,7 μM RNA in 50 ml verwendet, und für die Durchgänge 15 und 16 wurden 0,5 nM HIV-RT, 0,7 μM RNA in 50 ml Bindungspuffer verwendet.
VERWEISE ZU BEISPIEL I:

Ehresman, C., Baudin, F., Mougel, M., Romby, P., Ebel, J-P. Ehresman, B. (1987) Probing the structure of RNAs in solution. Nuc. Acids. Res. 15:9109-9128.
Freemont, P.S., Friedman, J.M., Beese, M.R., Sanderson, M.R. and Steitz, T.A. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8924.
Freier, S.M., Kierzed, R., Jaeger, J.A., Suigimoto, N., Caruthers, M.H., Neilson, T., and Turner, D.H. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373-9377.
Gauss, P., Gayle, M., Winter, R.B., Gold, L. (1987) Mol. Gen. Genet. 206.24.
Kohlstaedt, L.A., Wang, J., Friedman, J.M., Rice, P.A. and Steitz, T.A. (1992) Crystal structure at 3.5 Å resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor. Science 256:1783-1790.
Milligan, J.F., Groebe, D.R., Witherell, G.W. and Uhlenbeck, O.C. (1987) Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Res. 15:8783-8798.
Moazed, D., Stern, S. and Noller, H. (1986) Rapid chemical probing of conformation in 16S ribosomal RNA and 30S ribosomal subunits using primer extension. J. Mol. Biol. 187:399-416.
Peattie, D. and Gilbert, W. (1980) Chemical probes for higher order structure in RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4679-4682.
Peattie, D. and Herr, W. (1981) Chemical probing of the tRNA-ribosome complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2273-2277.
Roald, M.A., Perona, J., Söll, D. and Steitz, T.A. (1989) Science 246:1135.
Tuerk, C., Eddy, S., Parma, D. and Gold, L. (1990) The translational operator of bacteriophage T4 DNA polymerase. J. Mol. Biol. 213:749.
Tuerk, C. and Gold, L. (1990) Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249:505-510.
Tuerk, C., MacDougal, S. and Gold, L. (1992a) RNA pseudoknots that inhibit HIV-1 reverse transcriptase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992.
Vlassov, V., Giege, R. and Ebel, J.-P. (1980) The tertiary structure of yeast tRNAPhe in solution studied by phosphodiester bond modification with ethylnitrosourea. FEBS 120:12-16.

BEISPIEL II: AUFKLÄRUNG VERBESSERTER NUCLEINSÄURELIGANDENLÖSUNGEN FÜR HIV-1-REV-PROTEIN
Die für chemische Modifikation verwendete Rev-Ligandensequenz ist in 12 gezeigt (das gezeigte Nummerierungsschema wird hierin nachstehend verwendet). RNA für Modifikation wurde aus T7-RNA-Polymerasetranskription von synthetischen Oligonucleotid-Matrices gewonnen. ENU-Modifikation erfolgte an der in 12 gezeigten Ligandensequenz. DMS-, Kethoxal-, CMCT- und DEPC-Modifikationen wurden an einer verlängerten Ligandensequenz durchgeführt und mittels reverser Transkription mit dem in 12 gezeigten, synthetischen Oligonucleotid-Primer analysiert.
Chemische Modifikation von RNA. Chemische Modifikationsverfahren für Nucleinsäuren sind im Allgemeinen in Ehresmann et al. (1987), s.o., beschrieben. Modifikation von RNA unter nativen Bedingungen erfolgte in 200 mM KOAc, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, 1 mM EDTA bei 37°C. Modifikation unter denaturierenden Bedingungen erfolgte in 7 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, bei 90°C. Die Konzentration modifizierender Mittel und Inkubationszeiten lauten wie folgt: Ethylnitrosoharnstoff (ENU) – 1/5-Verdünnung (Vol./Vol.) von mit ENU gesättigtem Ethanol, nativ 1-3 Stunden, denaturierend 5 min; Dimethylsulfat (DMS) – 1/750-Verdünnung (Vol./Vol.), nativ 8 min, denaturierend 1 min; Kethoxal – 0,5 mg/ml, nativ 5 min, denaturierende 2 min; Carbodiimid (CMCT) – 10 mg/ml, nativ 30 min, denaturierend 3 min; Diethylpyrocarbonat (DEPC) – 1/10-Verdünnung (Vol./Vol.), nativ 10 min, denaturierend 1 min.
Modifikationsstörung von Rev-Bindung. RNAs, die unter denaturierenden Bedingungen chemisch modifiziert wurden, wurden für Rev-Bindung durch Filtertrennung selektiert. Selektionen erfolgten bei Rev-Konzentrationen von 30, 6 und 1,2 nM (bei den jeweiligen Volumina von 1, 5 und 25 ml Bindungspuffer; 200 mM KOAc, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, und 10 mM Dithiothreit). Etwa 3 pmol modifizierte RNA wurden zu jeder Proteinlösung zugesetzt, vermischt und auf Eis 15 min lang gelagert und anschließend 10 min lang auf 37°C gebracht. Bindungslösungen wurden durch vorher benetztes Nitrocellulosefilter gesaugt und dann mit 5 ml Bindungspuffer gespült. RNA wurde aus den Filtern wie von Tuerk & Gold (1990), s.o., beschrieben eluiert und auf modifizierte Positionen, die zurückblieben, analysiert. Modifizierte RNA wurde auch auf Filter aufgetragen und eluiert, um gleichförmige Gewinnung modifizierter RNA zu überprüfen.
Das Ausmaß von Modifikationsstörung wurde durch densitometrisches Scannen von autoradiographischen Aufnahmen unter Verwendung von LKB (ENU) und Laser-Densitometern von Molecular Dynamics (DMS, Kethoxal, CMCT und DEPC) bestimmt. Werte für modifizierte Phosphate und Basen wurden auf eine ausgewählte modifizierte Position sowohl für selektierte als auch nicht selektierte Spuren normalisiert; die Werte für die modifizierten Positionen in der selektierten Spur wurden dann durch die entsprechenden Positionen in der nicht selektierten Spur dividiert (spezifische normalisierende Positionen sind in den 15-19 zu sehen). Werte über 4,0 für modifizierte Basen und Phosphate werden als stark störend bezeichnet, und Werte über 2,0 werden als leicht störend definiert.
Modifikation von RNA in Gegenwart von Rev. "Footprinting" des Rev-Liganden, Modifikation des RNA-Liganden in Gegenwart von Rev-Protein, erfolgte in 200 mM KOAc, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, 1 mM DTT und 5 mM MgCl. Die Konzentration von Protein betrug 500 nM und belief sich auf etwa dreifachen molaren Überschuss gegenüber der RNA-Konzentration. Modifikation mit vorhandenem Protein wurde mit allen modifizierenden Mitteln, die zuvor genannt wurden, außer mit Ethylnitrosoharnstoff (ENU), versucht.
Test von chemisch modifizierter RNA. Positionen von ENU-Modifikation wurden wie in Vlassov et al. (1980), s.o., beschrieben nachgewiesen und durch Elektrophorese an 20 % denaturierenden Acrylamidgelen voneinander getrennt. DMS, Kethoxal, CMCT und DEPC wurden durch reverse Transkription des verlängerten Rev-Liganden mit einem radioaktiv markierten Oligonucleotid-Primer (12) getestet und durch Elektrophorese an 8 % denaturierenden Acrylamidgelen voneinander getrennt.
SELEX mit beeinflusster Randomisierung. Die Matrices für In-vitro-Transkription wurden mittels PCR aus den folgenden Oligonucleotiden hergestellt:
5'-CCCGGATCCTCTTTACCTCTGTGTGagatascagagtccacaacgtg ttctcaatgacccGGTCGGAAGGCCATCAATAGTCCC-3' (Matrix-Oligo) (Seq.-ID Nr. 16),
5'-CCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGACTATTGATGGGCCTTCCGACC-3' (5'-Primer) (Seq.-ID Nr. 17),
5'-CCCGGATCCTCTTTACCTCTGTGTG-3' (3'-Primer) (Seq.-ID Nr: 18)
worin die Kleinbuchstaben in dem Matrix-Oligo darauf hinweisen, dass an jeder so gekennzeichneten Position ein Gemisch von Reagenzien zur Synthese verwendet wurde, bestehend aus 62,5 % der Kleinbuchstaben und 12,5 % jeweils von den anderen drei Nucleotiden.
SELEX erfolgte wie zuvor beschrieben unter Berücksichtigung der folgenden Ausnahmen. Die Konzentration von HIV-1-Rev-Protein in den Bindungsreaktionen des ersten und zweiten Durchgangs betrug 7,2 nM und jene der RNA 4 μM in einem Volumen von 10 ml (bestehend aus 200 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, 10 mM DTT). In den Durchgängen 3 bis 6 betrug die Konzentration von Rev-Protein 1 nM und die RNA-Konzentration 1 μM in einem 40-ml-Volumen. HIV-1-Rev-Protein wurde bei American Biotechnologies, Inc., erworben.
BEISPIEL III: NUCLEINSÄURELIGANDEN ZU HIV-1-tat-PROTEIN.
SELEX an HIV-1-tat-Protein. tat-Protein wurde bei American Bio-Technologies, Inc., erworben. Die Matrices für In-vitro-Transkription wurden mittels PCR unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide hergestellt:
5'-CCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3' (5'-Primer) (Seq.-ID Nr. 18),
5'-GCCGGATCCGGGCCTCATGTCGAA-[40n]-TTGAGCGTTTATTCTGAGC TCCC-3' (variable Matrix) (Seq.-ID Nr. 19),
5'-GCCGGATCCGGGCCTCATGTCGAA-3' (3'-Primer) (Seq.-ID Nr. 20).
SELEX-Durchgänge wurden, wie in Tuerk et al. (1992a), s.o., und in den SELEX-Anmeldungen beschrieben, unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Bindungsreaktionen erfolgten mit 13 nM tat-Protein und 1,3 μM RNA in einem Volumen von 2 ml in den Durchgängen 1 und 2, und 6,5 nM tat-Protein und 0,65 μM RNA in 4 ml in den Durchgängen 3 bis 10.
RNA-Synthese. In-vitro-Transkription mit Oligonucleotid-Matrices erfolgte wie von Milligan et al. (1987), s.o., beschrieben. Alle synthetischen Nucleinsäuren wurden am DNA/RNA-Synthesegerät Modell 394-08 von Applied Biosystems unter Verwendung der Standard-Arbeitsvorschriften hergestellt. Desoxyribonucleotidphosphoramidite und DNA-Synthese-Lösungsmittel und -Reagenzien wurden bei Applied Biosystems erworben.
Affinitätstests mit markierter RNA und HIV-1-tat-Protein. Modell-RNAs zur Verfeinerung von 5'- und 3'-Begrenzungen und zur Bestimmung der Wirkung von Substitutionen wurden während der Transkription mit T7-RNA-Polymerase wie in den SELEX-Anmeldungen beschrieben markiert, mit der Ausnahme, dass α-³²P-ATP verwendet wurde, in Reaktionen von 0,5 mM C, G und UTP mit 0,05 mM ATP. Alle RNA-Protein-Bindungsreaktionen erfolgten in einem "Bindungspuffer" aus 200 mM KOAc, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, 10 mM Dithiothreit. RNA- und Protein-Verdünnungen wurden vermischt und auf Eis 30 min gelagert und anschließend 5 min lang auf 37°C gebracht. In Bindungstests betrug das Reaktionsvolumen 60 μl, von denen 50 μl getestet wurden. Jede Reaktion wurde durch ein vorher (mit Bindungspuffer) benetztes Nitrocellulosefilter gesaugt und mit 3 ml Bindungspuffer gespült, wonach sie getrock net und für Tests gezählt oder Elution unterzogen und auf chemische Modifikation getestet wurde. In Vergleichen zur Bindungsaffinität wurden Resultate in Diagrammform dargestellt, und die Proteinkonzentration, bei der halbmaximale Bindung auftrat (die ungefähre kD unter Bedingungen von Proteinüberschuss), wurde graphisch bestimmt. Die Resultate der Bindungstests sind in 27 angegeben.
BEISPIEL IV: NUCLEINSÄURELIGANDEN ZU THROMBIN
Hochaffine RNA-Liganden für Thrombin wurden mittels SELEX isoliert. Zufällige RNA-Moleküle, die für das anfängliche Kandidatengemisch verwendet wurden, wurden durch In-vitro-Transkription aus einer 102 Nucleotide umfassenden, doppelsträngigen DNA-Matrix, die eine zufällige Kassette mit einer Länge von 30 Nucleotiden (30N) enthielt, gebildet. Eine Population von 10¹³ 30N-DNA-Matrices wurde mittels PCR unter Verwendung eines 5'-Primers, der den T7-Promotor für In-vitro-Transkription enthielt, und von Restriktionsstellen sowohl im 5'- als auch im 3'-Primer zum Klonieren gebildet.
Die RNA-Konzentration für jeden SELEX-Durchgang betrug etwa 2-4 × 10^–7 M, und Konzentrationen von Thrombin (Sigma, 1.000 Einheiten) betrugen von 1,0 × 10^–6 im 1. Durchgang bis 4,8 × 10^–7 in den Durchgängen 2 und 3 und 2,4 × 10^–7 in den Durchgängen 4 bis 12. Der Bindungspuffer für die RNA und das Protein war 100 mM NaCl, 50 mM Tris/Cl, pH 7,7, 1 mM DTT und 1 mM MgCl₂. Bindung erfolgte 5 min lang bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 100 μl in den Durchgängen 1 bis 7 und 200 μl in den Durchgängen 8 bis 12. Jede Bindungsreaktion wurde durch ein vorher (mit 50 mM Tris/Cl, pH 7,7) benetztes Nitrocellulosefilter (2,5 cm Millipore, 0,45 μM) in einer Millipore-Filter-Bindungsvorrichtung filtriert und unverzüglich mit 5 ml desselben Puffers gespült. Die RNA wurde aus den Filtern in 400 μl Phenol (äquilibriert mit 0,1 M NaOAc, pH 5,2), 200 μl frisch zubereitetem 7 M Harnstoff wie beschrieben (Tuerk et al. (1990), s.o.) eluiert. Die RNA wurde mit 20 μg tRNA ausgefällt und wurde als eine Matrix für cDNA-Synthese verwendet, gefolgt von PCR und In-vitro-Transkription, um RNA für den darauf folgenden Durchgang herzustellen. Die RNA wurde in den Durchgängen 1 bis 8 mit ³²P-ATP radioaktiv markiert, sodass Bindung überwacht werden konnte. Um die Dauer für jeden SELEX-Durchgang zu verkürzen, wurde die RNA in den Runden 9 bis 12 nicht markiert. RNA wurde durch Nitrocellulosefilter (1,3 cm Millipore, 0,45 μM) vor dem 3., 4., 5., 8., 11. und 12. Durchgang zuerst filtriert, um Selektion auf jegliche nichtspezifische Nitrocellulosebindung aus diesen Durchgängen auszuschließen.
Bindungskurven wurden nach dem 5., 8. und 12. Durchgang durchgeführt, um Änderungen der kD im RNA-Hauptteil zu berechnen. Diese Versuche erfolgten mit Proteinüberschuss bei Konzentrationen von 1,2 × 10^–5 bis 2,4 × 10^–9 M bei einer RNA-Endkonzentration von 2 × 10^–9 M. Die RNA für diese Bindungskurven wurde auf hochspezifische Aktivität mit ³²P-ATP oder ³²P-UTP markiert. Bindung an Nitrocellulosefilter erfolgte wie für die SELEX-Durchgänge beschrieben, mit der Ausnahme, dass die an das Filter gebundene RNA getrocknet und direkt an den Filtern gezählt wurde.
RNA-Sequenzieren. Nach dem 12. SELEX-Durchgang wurde die RNA mit reverser Transkriptase (AMV, Life Sciences, Inc.) unter Verwendung des ³²P-5'-endmarkierten 3'-komplementären PCR-Primers sequenziert.
Klonieren und Sequenzieren einzelner RNAs. RNA aus dem 12. Durchgang wurde zu DNA revers transkribiert und mittels PCR amplifiziert. Verdau an Restriktionsenzym-Schnittstellen in den 5'- und 3'-fixierten Regionen wurde verwendet, um die 30N-Region zu entfernen, die daraufhin in die komplementären Stellen im E.-coli-Klonierungsvektor pUC18 ligiert wurden. Ligierte Plasmid-DNA wurde in JM103-Zellen transformiert und mittels blau/weiß-Koloniebildung gescreent. Kolonien, die einzelne Sequenzen enthielten, wurden gezüchtet, und Miniprep-DNA wurde hergestellt. Doppelsträngige Plasmid-DNA wurde für Didesoxy-Sequenzieren mit dem Sequenase-Set, Version 2.0, und ³⁵S-dATP (Amersham) verwendet.
End-Markieren von DNA. Zum End-Markieren wurde mit T7-Polymerase transkribierte RNA mittels UV-Schattierung Gel-gereinigt. RNA wurde durch Dephosphorylierung des 5'-Endes mit alkalischer Phosphatase, 1 Einheit, 30 min lang bei 37°C 5'- endmarkiert. Aktivität alkalischer Phosphatase wurde durch Phenol:Chloroform-Extraktion zerstört. RNA wurde daraufhin mit γ³²P-ATP in einer Reaktion mit Polynucleotidkinase 30 min lang bei 37°C endmarkiert.
RNA wurde mit (5'-³²P)pCp und RNA-Ligase 30 min lang bei 37°C 3'-endmarkiert. 5'- und 3'-endmarkierte RNAs wurden an einem 8 %, 8 M Harnstoff, Polyacrylamidgel Gelbanden-gereinigt.
Bestimmung von 5'- und 3'-Begrenzungen. 2 pmol RNA, 3'- oder 5'-endmarkiert für die 5'- bzw. 3'-Begrenzungsversuche, wurden in 50 mM Na₂CO₃ (pH 9,0) und 1 mM EDTA in einer 10-μl-Reaktion 10 min lang bei 90°C hydrolysiert. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 1/5 Volumen 3 M NaOAc (pH 5,2) und Einfrieren bei –20°C gestoppt. Bindungsreaktionen erfolgten bei 3 Proteinkonzentrationen, 40 nM, 10 nM und 2,5 nM, in 3 Volumina (100 μl, 400 μl und 1.600 μl, sodass die Menge an Protein konstant gehalten wurde), die 1 × Bindungspuffer und 2 pmol RNA enthielten. Die Reaktionen wurden 10 min lang bei 37°C inkubiert, durch eine vorher benetzte Nitrocellulosemembran filtriert und mit 5 ml Waschpuffer gespült. Die RNA wurde aus den Filtern durch Zerteilen des Filters und Schütteln der Teile in 200 μl 7 M Harnstoff und 400 μl Phenol (pH 8,0) 15 min lang bei 20°C eluiert. Nach dem Zusatz von 200 μl H₂O wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase einmal mit Chloroform extrahiert. Die RNA wurde mit 1/5 Volumen 3 M NaOAc, 20 μg Träger-tRNA und 2,5 Volumina Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde einmal mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 5 μl H₂O und 5 μl Formamid-Ladefarbstoff resuspendiert. Der Rest der alkalischen Hydrolysereaktion wurde 1:10 verdünnt, und ein gleiches Volumen an Ladefarbstoff wurde zugesetzt. Um zu lokalisieren, wo an der Sequenzleiter die Begrenzung vorhanden war, wurde ein RNase-T1-Verdau des Liganden, parallel zu alkalischer Hydrolysereaktion und Bindungsreaktionen, Elektrophorese unterzogen. Der Verdau erfolgte in einer 10-μl-Reaktion, die 500 fmol endmarkierte RNA und 10 Einheiten RNase T1 in 7 M Harnstoff, 20 mM Na-Citrat (pH 5,0) und 1 mM EDTA enthielt. Die RNA wurde 10 min lang bei 50°C ohne Enzym und weitere 10 min nach dem Zusatz von Enzym inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 10 μl Ladefarbstoffe und Inkubieren bei 4°C verlangsamt. Unverzüglich nach dem Verdau wurden 5 μl von jedem der Verdauungs-, Hydrolyse- und 3 Bindungsreaktionen an einem 12%igen Sequenzierungsgel Elektrophorese unterzogen.
In-vitro-Transkription von RNA-2-NH₂-Ribosederivaten von UTP und CTP. RNA wurde direkt aus der pUC18-Plasmid-Miniprep-dsDNA-Matrix mit T7-RNA-Polymerase in einer Reaktion, die ATP, GTP, 2NH₂-UTP und 2NH₂-CTP enthielt, transkribiert. Für ³²P-markierte RNA wurde ³²P-ATP in die Reaktion eingebunden. Unmodifizierte RNAs wurden in einem Gemisch, das ATP, GTP, UTP und CTP enthielt, transkribiert.
Synthese von RNA. RNA-Moleküle, die niedrigeren Grenzen von Nucleotidsequenz, die für hochaffine Bindung zu Thrombin erforderlich sind, entsprachen und wie sie durch die Begrenzungsversuche bestimmt wurden (30B), wurden an einem 394-DNA/RNA-Synthesegerät von Applied Biosystems synthetisiert. Diese RNA-Moleküle umfassen die Klasse-I-Klon-16-Haarnadelstrukturen aus 24 Nucleotiden (24R) und 39 Nucleotiden (39R) und die Klasse-II-Klon-27-Haarnadel aus 33 Nucleotiden (33R).
Bindung einzelner RNA-Moleküle. Vier DNA-Plasmide mit einmaligen 30N-Sequenzen wurden für In-vitro-Transkription ausgewählt. ³²P-markierte RNA wurde mit herkömmlichen Nucleotiden sowie mit den 2-NH₂-Derivaten von CTP und UTP transkribiert. Bindungskurven mit diesen einzelnen RNAs könnten unter Verwendung des Bindungspuffers und Thrombin- (1.000 Einheiten, Sigma) Konzentrationen von 1,0 × 10^–5 bis 1,0 × 10^–10 M erstellt werden. Menschliches α-Thrombin (Enzyme Research Laboratories, ERL) wurde ebenfalls verwendet, um Bindungsaffinitäten von RNA bei Konzentrationen von 1,0 × 10^–6 bis 1,0 × 10^–10 M zu bestimmen.
Bindung der 5'-endmarkierten, einzelsträngigen 15mer-DNA 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3' (G15D) (Seq.-ID Nr. 1), beschrieben von Bock et al. (1990), s.o., wurde unter den hierin beschriebenen Bindungsbedingungen mit ERL-Thrombin bestimmt und mit Bindung durch die zuvor beschriebenen, radioaktiv markierten RNA-Haarnadelstrukturen verglichen.
Konkurrenzversuche. Um zu bestimmen, ob die beschriebenen RNA-Liganden um Bindung des DNA-15mers G15D an Thrombin konkurrieren können, wurden äquimolare Konzentrationen (1 μM) von Thrombin und des 5'-endmarkierten DNA-15mers G15D unter Filterbindungs-Bedingungen (kD von etwa 200 ⁿM) in Gegenwart und Abwesenheit von "kaltem" unmarkiertem RNA- oder DNA-Liganden bei variierenden Konzentrationen von 10 nM bis 1 μM inkubiert. Bei nicht vorhandener Konkurrenz belief sich RNA-Bindung auf 30 %. Das Protein wurde zuletzt zugesetzt, sodass Konkurrenz für Bindung eintreten konnte. Die auf Konkurrenz getesteten RNA-Liganden waren die 24meren (24R) und 39meren (39R) Haarnadeln von synthetischen Klasse-I-Klon-16-RNAs und die 33mere (33R) Haarnadel von synthetischer Klasse-II-27-RNA. Resultate sind als relativer Anteil von gebundener G15D (G15 mit Konkurrenten/G15 ohne Konkurrenten) gegenüber der Konzentration von kaltem Konkurrenten ausgedrückt.
Um zu bestimmen, ob Klasse-I-RNAs um Bindung mit Klasse-II-RNAs konkurrieren können, und um die Konkurrenz mit der G15D-DNA zu bestätigen, wurden äquimolare Konzentrationen (300 ⁿM) von Thrombin und der 5'-endmarkierten Klasse-II-RNA-33-Haarnadel unter Filterbindungs-Bedingungen in Gegenwart oder Abwesenheit von "kalter" unmarkierter RNA 24 oder DNA G15D bei variierenden Konzentrationen von 100 ⁿM bis 32 μM inkubiert. Resultate sind als relativer Anteil von gebundener RNA 33 (RNA 33 mit Konkurrenten/RNA 33 ohne Konkurrenten) gegenüber der Konzentration von kaltem Konkurrenten ausgedrückt (33).
Chromogener Test auf Thrombinaktivität und Inhibierung durch RNA-Liganden. Die Hydrolyse des chromogenen Substrats S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNitroanilin [H-D-Phe-Pip-Arg-pNA]) (Kabi Pharmacia) durch Thrombin wurde, basierend auf der Freisetzung von p-Nitroanilin (pNA) aus dem Substrat, photometrisch bei 405 nm gemessen.
Thrombin wurde zu einer Endkonzentration von 10^–8 oder 10^–9 zu einem Reaktionspuffer (50 mM Na-Citrat, pH 6,5, 150 mM NaCl, 0,1 % PEG), der 250 μM S2238-Substrat enthielt, bei 37°C zugesetzt. Für Inhibierungstests wurden Thrombin plus RNA (äquimolar oder in 10fachem Überschuss) 30 s lang bei 37°C präinkubiert und anschließend zum Reaktionsgemisch zugesetzt (34A).
Fibrinogen-Koagulation. Thrombin wurde zu einer Endkonzentration von 2,5 nM zu 400 μl Inkubationspuffer (20 mM Tris-Acetat, pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂), der 0,25 mg/ml Fibrinogen und 1 u/λ RNAse-Inhibitor (RNAsin, Promega) enthielt, mit oder ohne 30 nM RNA der Klasse I oder 60 ⁿM RNA der Klasse II bei 37°C zugesetzt. Dauer in s vom Zusatz von Thrombin bis zur Koagulation wurde durch den Tilt-Test gemessen (34B).
Spezifität von Thrombinbindung. Die Bindungsaffinität der Volllängen-RNA 16 der Klasse I, der RNA 27 der Klasse II und des 30N3-RNA-Hauptteils der Serumproteine Antithrombin III (ATIII) und Prothrombin wurde, wie zuvor für die Entwicklung von hochaffinen RNA-Liganden beschrieben, durch Filterbindung bestimmt. Diese Versuche erfolgten mit Proteinüberschuss bei Konzentrationen von 1 × 10^–5 bis 5 × 10^–10 M bei einer RNA-Endkonzentration von 2 × 10^–9 M (35).
BEISPIEL V. NUCLEINSÄURELIGANDEN ZU bFGF.
Materialien. bFGF wurde von Bachem California erhalten (Molekulargewicht 18.000 Da, 154 Aminosäuren). Heparin mit Gewebekultur-Gütegrad (mittleres Molekulargewicht 16.000 Da) wurde bei Sigma erworben. Niedermolekulares Heparin (5.000 Da) stammte von Calbiochem. Alle anderen Chemikalien wiesen zumindest Reagens-Gütegrad auf und wurden im Handel erworben.
SELEX. Wesentliche Eigenschaften der SELEX-Arbeitsvorschrift wurden detailliert in früheren Berichten beschrieben (Tuerk & Gold (1990), s.o.; Tuerk et al. (1992a), s.o.; Tuerk et al., in: Polymerase Chain Reaction (F. Ferre, K. Mullis, R. Gibbs & A. Ross, Hrsg.), Birkhauser, NY (1992b)). Kurz zusammengefasst wurden DNA-Matrices für In-vitro-Transkription (die eine Region von dreißig zufälligen Positionen, flankiert durch konstante Sequenzregionen, enthalten) und die entsprechenden PCR-Primer chemisch synthetisiert (Operon). Die zufällige Region wurde durch Verwendung eines äquimolaren Gemischs der vier Nucleotide während der Oligonucleotid-Synthese gebildet. Die zwei konstanten Regionen wurden so entworfen, dass sie PCR-Primer-Anellierungsstellen, eine Primer-Anellierungsstelle für cDNA-Synthese, T7-RNA-Polymerasepromotorregion und Restriktionsenzym-Schnittstellen enthielten, die das Klonieren in Vektoren ermöglichten (siehe Tabelle I).
Ein anfänglicher Pool von RNA-Molekülen wurde durch In-vitro-Transkription von etwa 200 pmol (10¹⁴ Moleküle) der doppelsträngigen DNA-Matrix unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase hergestellt (New England Biolabs). Transkriptionsgemische bestanden aus 100-300 nM Matrix, 5 Einheiten/μl T7-RNA-Polymerase, 40 mM Tris-Cl-Puffer (pH 8,0) mit 12 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM Spermidin, 0,002 % Triton x-100 und 4 % PEG. Transkriptionsgemische wurden bei 37°C 2-3 Stunden lang inkubiert. Diese Bedingungen führten typischerweise zu 10- bis 100facher Transkriptionsamplifikation.
Selektionen auf hochaffine RNA-Liganden erfolgten durch Inkubieren von bFGF (10-100 pmol) mit RNA (90-300 pmol) 10 min lang bei 37°C in 50 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (10,1 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4), gefolgt von Trennen der Protein-RNA-Komplexe von den ungebundenen Spezies durch Nitrocellulosefilter-Abtrennung (Tuerk & Gold (1990), s.o.). Die selektierte RNA (die typischerweise 0,3-8 % der gesamten Eintrags-DNA betrug) wurde dann von den Filtern extrahiert und durch Vogel-Myeloblastosevirus-Umkehrtranskriptase (AMV RT, Life Sciences) zu cDNA revers transkribiert. Reverse Transkriptionen erfolgten bei 48°C (30 min) in 50 mM Tris-Puffer (pH 8,3), 60 mM NaCl, 6 mM Mg(OAc)₂, 10 mM DTT und 1 Einheit/μl AMV RT. Amplifikation der cDNA durch PCR unter Standardbedingungen ergab ausreichende Mengen an doppelsträngiger DNA für den nächsten Durchgang von In-vitro-Transkription.
Nitrocellulosefilter-Bindungstest. Oligonucleotide, die an Proteine gebunden sind, können von den ungebundenen Spezies durch Filtration durch Nitrocellulose-Membranfilter effizient getrennt werden (Yarus & Berg, Anal. Biochem. 35, 450 (1970); Lowary & Uhlenbeck, Nucleic Acids Res. 15, 10483 (1987); Tuerk & Gold (1990), s.o.)). Nitrocellulosefilter (Millipore, 0,45 μm Porengröße, Typ HA) wurden an einer Filtervorrichtung befestigt und mit 4-10 ml Puffer gewaschen. Nach Inkubationen von ³²P-markierter RNA mit Reihenverdünnungen des Proteins (5-10 min) bei 37°C in Puffer (PBS), der 0,01 % Humanserumalbumin (HSA) enthält, wurden die Lösungen unter mildem Vakuum in 45-μl-Aliquoten auf die Filter aufgetragen und mit 5 ml PBS gewaschen. Die Filter wurden dann unter einer Infrarotlampe getrocknet und in einem Szintillationszähler gezählt.
Klonieren und Sequenzieren. Einzelne Elemente der angereicherten Pools wurden in pUC18-Vektor kloniert und wie beschrieben (Schneider et al. (1992), s.o.; Tuerk & Gold (1990), s.o.) sequenziert.
SELEX-Versuche mit bFGF als Ziel. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren wurden zwei SELEX-Versuche (Versuch A und B), die auf bFGF abzielten, mit getrennten Pools randomisierter RNA initiiert, worin jeder Pool aus etwa 10⁴ Molekülen bestand. Die konstanten Sequenzregionen, die die randomisierte Region flankieren, waren, wie auch die entsprechenden Primer, in jedem Versuch unterschiedlich. Die zwei verwendeten Matrix/Primer-Kombinationen sind in Tabelle I gezeigt.
Selektionen wurden in PBS bei 37°C durchgeführt. Die in Versuch B durchgeführte Selektion erfolgte in Gegenwart von Heparin (Sigma, Molekulargewicht 5.000-32.000 Da, mittleres Molekulargewicht 16.000 Da) im Selektionspuffer bei einem Molverhältnis von 1/100 (Heparin/bFGF). Heparin konkurriert um Bindung von randomisierter RNA an bFGF und die Menge von Heparin. Die verwendete Menge von Heparin reduzierte RNA-Bindung an bFGF signifikant, eliminierte sie jedoch nicht (Daten nicht dargestellt). Der Faktor für die Verwendung von Heparin war zwei. Heparin ist einerseits dafür bekannt, eine geringfügige Konformationsänderung im Protein zu induzieren und auch bFGF gegen thermal induzierte Denaturierung zu stabilisieren. Ande rerseits wurde von der augenscheinlichen kompetitiven Natur der Bindung von Heparin mit randomisierter RNA an bFGF erwartet, dass sie entweder die Stringenz der Selektion für die Heparin-Bindungsstelle erhöht oder die Bindung von RNA-Liganden an alternative Stelle(n) steuert.
Signifikante Verbesserung der Affinität von RNA-Liganden zu bFGF wurde in Versuch A nach zehn Durchgängen beobachtet und in Versuch B nach dreizehn Durchgängen. Das Sequenzieren dieser angereicherten Pools von RNA-Liganden ergab einen definitiven Ausschluss von Zufälligkeit, was darauf hinwies, dass die Anzahl von Molekülen, die im Pool verblieben, wesentlich reduziert war. Einzelne Elemente der angereicherten Pools wurden dann in pUC18-Vektor kloniert und wie zuvor beschrieben sequenziert.
49 Klone wurden aus Versuch A sequenziert und 37 Klone aus Versuch B. Aus den insgesamt 86 Sequenzen waren 71 einmalig. Zwei verschiedene Familien konnten basierend auf den überlappenden Regionen von Sequenzhomologie identifiziert werden (Tabellen II und III). Auch einige Sequenzen mit nicht eindeutiger Homologie zu Mitgliedern einer der beiden Familien waren, wie erwartet (Irvine et al., J. Mol. Biol. 222, 739 (1991)), vorhanden und sind in Tabelle IV gezeigt.
Die Consensus-Sequenz aus Familie-1-Liganden (Tabelle II) ist durch einen zusammenhängenden Abschnitt von 9 Basen, CUAACCAGG (Seq.-ID Nr. 27), definiert. Dies lässt auf eine minimale Struktur schließen, die aus einer 4-5-Nucleotid-Schleife besteht, die die stark konservierte AACC-Sequenz und einen ausgeweiteten Stamm umfasst (41 und Tabelle VI). Die Consensus-Sequenz für Familie-2-Liganden (Tabelle III) ist stärker verlängert und enthält weniger konservierte Regionen, RRGGHAACGYWNNGDCAAGNNCACYY (Seq.-ID Nr. 43). Hierin sind die meisten der stark konservierten Positionen in einer größeren (19-21 Nucleotide umfassenden) Schleife enthalten (41 und Tabelle VII). Eine zusätzliche Struktur innerhalb der Schleife ist möglich.
Die Existenz von zwei unterschiedlichen Sequenzfamilien in den angereicherten Pools von RNA lässt darauf schließen, dass es zwei konvergente Lösungen für hochaffine Bindung an bFGF gibt. SELEX-Versuch A brachte Mitglieder für beide Sequenzfamilien (Tabelle II). Alle der Sequenzen aus dem SELEX-Versuch B (selektiert in Gegenwart von Heparin) andererseits gehören entweder der Familie 2 (Tabelle III) oder der Familie "anderer Sequenzen" (Tabelle IV) an, es wurden jedoch keine in Familie 1 gefunden. Dies ist angesichts der Tatsache, dass bFGF in einem scheinbaren 100fachen molaren Überschuss gegenüber Heparin während der Selektionen vorhanden war, überraschend. Der effektive molare Überschuss von bFGF gegenüber Heparin war jedoch wahrscheinlich viel geringer. Das mittlere Molekulargewicht von Heparin, das in den Selektionen verwendet wurde, betrug 16.000 Da. Da jede Zuckereinheit 320 Da wiegt und zumindest acht Zuckereinheiten für hochaffine Bindung an bFGF erforderlich sind, können sich im Mittel sechs Moleküle von bFGF an ein Heparinmolekül binden. Dies reduziert das Molverhältnis von Heparin zu bFGF auf 1:16. In der Praxis ist diese Menge an Heparin ausreichend, um die beobachtete Affinität des unselektierten RNA-Pools für bFGF um einen Faktor von fünf zu reduzieren (Daten nicht dargestellt). Der beobachtete Ausschluss einer gesamten Ligandenfamilie durch die Gegenwart einer relativ geringen Menge an Heparin im Selektionspuffer kann eine Konsequenz einer durch Heparin induzierten Konformationsänderung im Protein sein. Aufgrund der relativen Mengen von Heparin und bFGF, die in Selektionen verwendet wurden, erfordert dieses Modell, dass die Heparin-induzierte Konformation nach der Dissoziation des Protein-Heparin-Komplexes weiter besteht und dass die Lebensdauer dieses Konformers ausreichend lang ist, um Äquilibrierung mit den RNA-Liganden zu ermöglichen.
Familie-2-Sequenzen bestehen aus Klonen, die aus beiden SELELX-Versuchen abgeleitet wurden. Dies lässt darauf schließen, dass die flankierenden konstanten Regionen typischerweise eine relativ geringe Rolle bei der Bestimmung der Affinität dieser Liganden spielen, und untermauert die Voraussetzung, dass die Consensus-Sequenz in dieser Familie die Hauptdeterminante von hochaffiner Bindung an bFGF ist.
Bestimmung von Bindungsaffinitäten für bFGF.
Gleichgewichtsdissoziationskonstante. Im einfachsten Fall kann Gleichgewichtsbindung von RNA an bFGF durch die Gleichung 1 beschrieben werden: RNA·bFGF – RNA + bFGF (1)
Der Anteil an gebundener RNA (q) steht mit der Konzentration von freiem Protein [P] in Verbindung (Gleichung 2): q = f[P]/([P] + Kd) (2)worin K_d die Gleichgewichtsdissoziationskonstante ist und f für die Wirksamkeit von Beibehaltung der Protein-RNA-Komplexe an Nitrocellulosefiltern steht. Der Mittelwert von f für bFGF betrug 0,82.
Um Strukturen höherer Ordnung zu eliminieren, wurden alle RNA-Lösungen in PBS 2-3 min lang auf 90°C erhitzt und vor Inkubation mit Protein auf Eis gekühlt. Nur Einzelbanden für alle RNA-Klone wurden an nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen nach dieser Behandlung detektiert.
Relative Bindungsaffinität einzelner Liganden zu bFGF können nicht von der Sequenzinformation vorhergesagt werden. Einmalige Sequenzklone wurden daher durch Messen des Anteils von radioaktiv markierter RNA, die nach Inkubation mit 4 und 40 nM Protein an Nitrocellulosefilter gebunden war, auf ihre Fähigkeit gescreent, sich an bFGF zu binden. Dieses Screeningverfahren war ausreichend exakt, um die Identifikation mehrerer Klone zu ermöglichen, die Dissoziationskonstanten im nanomolaren Bereich aufwiesen. Bindung dieser selektierten Klone wurde dann näher analysiert.
Hochaffine RNA-Liganden für bFGF wurden in beiden Sequenzfamilien (Tabellen VI und VII) gefunden. Die Affinität von Klonen, die zu keiner der beiden Familien gehörten, war im Allgemeinen geringer (Daten nicht dargestellt).
Die ursprünglichen, unselektierten RNA-Pools banden sich mit Affinitäten von 300 nM (Reihe A) und 560 nM (Reihe B) an bFGF (36). SELEX ermöglichte daher die Isolierung von Liganden mit zumindest um 2 Größenordnungen besserer Affinität für bFGF.
Um auch die Spezifität zu untersuchen, wurde eine repräsentative Reihe von hochaffinen Liganden für bFGF (5A und 7A aus Familie 1; 12A und 26A aus Familie 2) auf Bindung an vier andere Heparin-Bindungsproteine getestet. Es wurde erkannt, dass die Affinität dieser Liganden für sauren FGF, Thrombin, Antithrombin III und Gefäßendothelwachstumsfaktor relativ schwach war (K_d > 0,3 μM) (Daten nicht dargestellt).
RNA-Ligandeninhibierung von bFGF-Rezeptorbindung. Dieselben vier hochaffinen RNA-Liganden wurden auch auf ihre Fähigkeit getestet, Bindung von bFGF an die nieder- und hochaffinen Zelloberflächenrezeptoren zu inhibieren.
Untersuchungen zu Rezeptorbindung. bFGF wurde durch das Iodo-Gen- (Pierce) Verfahren, wie von Moscatelli (1987), s.o., beschrieben, mit ¹²⁵I markiert. Konfluente Babyhamsternieren- (BHK-) Zellen wurden ausführlich mit PBS gewaschen und dann 2 h lang bei 4°C mit αMEM-Medium, das 10 ng/ml ¹²⁵I-bFGF in PBS, 0,1 % HSA, 1 Einheit/ml RNasein enthielt, und Reihenverdünnungen von hochaffiner RNA inkubiert. In einem eigenen Versuch wurde erkannt, dass die RNA unter diesen Bedingungen nicht signifikant abgebaut wurde. Die Menge von ¹²⁵I-bFGF, der an die nieder- und hochaffinen Rezeptorstellen gebunden war, wurde wie von Moscatelli (1987), s.o., beschrieben bestimmt.
Alle vier Liganden konkurrierten um die niederaffinen Rezeptorstellen, während die unselektierten (zufälligen) RNAs dies nicht taten (37A). Die Konzentration von RNA, die erforderlich war, um halbe Verdrängung von bFGF vom niederaffinen Rezeptor zu bewirken, betrug 5-20 nM für die Liganden 5A, 7A und 26A und > 100 nM für Ligand 12A. Halbe Verdrängung von den hochaffinen Stellen wurde bei einer RNA-Konzentration von knapp 1 μM für die Liganden 5A, 7A und 26A und > 1 μM für Ligand 12A beobachtet. Zufällige RNAs konkurrierten wiederum nicht um den hochaffinen Rezeptor. Der beobachtete Unterschied bezüglich der Konzentration von RNA, der erforderlich war, um bFGF von den nieder- und hochaffinen Rezeptoren zu verdrängen, wird als eine Widerspiegelung des Affinitätsunterschieds in den zwei Rezeptorklassen für bFGF betrachtet (2-10 nM für die niederaffinen Stellen und 10-100 pM für die hochaffinen Stellen).
Heparin verdrängte durch Konkurrenz RNA-Liganden von beiden Sequenzfamilien (38), wobei höhere Konzentrationen von Heparin erforderlich waren, um Mitglieder der Familie 2 von bFGF zu verdrängen.
Der aus dem SELEX-Verfahren gewonnene Selektionsvorteil basiert auf Affinität zu bFGF. RNA-Liganden können sich im Prinzip an jede beliebige Stelle am Protein binden und sind daher von Bedeutung, um die Aktivität der Liganden in einem geeigneten funktionellen Test zu untersuchen. Der relevante funktionelle Versuch für die selektierten hochaffinen Liganden ist das Testen ihrer Fähigkeit, Bindung von bFGF an seine Zelloberflächenrezeptoren zu inhibieren, da dies die Weise ist, wie bFGF seine biologische Aktivität ausübt. Die Tatsache, dass mehrere repräsentative hochaffine RNA-Liganden Bindung von bFGF an Rezeptoren beider Klassen (gemäß ihren relativen Bindungsaffinitäten) inhibierten, lässt darauf schließen, dass sich diese Liganden an oder in der Nähe von ihrer/n Rezeptorbindungsstelle(n) binden. Ein weiterer Punkt, der diese Annahme untermauert, ist die Beobachtung, dass Heparin um Bindung dieser Liganden an bFGF konkurriert. Hochaffine Liganden aus Familie 1 und Familie 2 können sich an verschiedenen Stellen an bFGF binden. Diese Erfindung umfasst das kovalente Verbinden von Komponenten aus den zwei Ligandenfamilien zu einem einzigen, potenteren Inhibitor von bFGF. TABELLE I. IN DEN SELEX-VERSUCHEN A UND B EINGESETZTE OLIGONUCLEOTIDE
TABELLE II. SEQUENZEN DER FAMILIE 1 DER ZUFÄLLIGEN REGION AUS DEN SELEX-VERSUCHEN A UND B
TABELLE III. SEQUENZEN DER FAMILIE 2 DER ZUFÄLLIGEN REGION AUS DEN SELEX-VERSUCHEN A UND B.
TABELLE IV. ANDERE SEQUENZEN DER ZUFÄLLIGEN REGION AUS DEN SELEX-VERSUCHEN A UND B.
TABELLE V. WIEDERHOLUNGSSEQUENZEN DER ZUFÄLLIGEN REGION AUS DEN SELEX-VERSUCHEN A UND B
TABELLE VI. SEKUNDÄRSTRUKTUREN UND DISSOZIATIONSKONSTANTEN (K_d's) FÜR EINE REPRÄSENTATIVE REIHE HOCHAFFINER LIGANDEN AUS FAMILIE 1

^aStark konservierte Positionen sind durch Fettdruck gekennzeichnet. Nucleotide in der konstanten Region sind durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet.

_d

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines verbesserten Nucleinsäureliganden für ein vorgegebenes Ziel, worin der zu verbessernde Ligand durch ein Verfahren identifiziert wird, das Folgendes umfasst: (1) das Kontaktieren eines Kandidatengemischs aus Nucleinsäuren mit dem Zielmolekül, worin Nucleinsäuren, die im Vergleich zum Kandidatengemisch eine verstärkte Affinität zum Ziel aufweisen, vom Rest des Kandidatengemischs abgetrennt werden können; (2) das Abtrennen der Nucleinsäuren mit verstärkter Affinität vom Rest des Kandidatengemischs; (3) das Amplifizieren der Nucleinsäuren mit verstärkter Affinität, um ein ligandenangereichertes Gemisch aus Nucleinsäuren zu erhalten; (4) das Wiederholen der Schritte (1)-(3), falls erforderlich, um einen Nucleinsäureliganden zu identifizieren, worin das ligandenangereicherte Gemisch aus Nucleinsäuren, das in Schritt (3) hergestellt wird, als Kandidatengemisch in Schritt (1) verwendet wird, wobei die Verbesserung eine Modifikation des Liganden umfasst, sodass er zumindest einer der folgenden verbesserten Eigenschaften aufweist: verringerte Größe; verbesserte Stabilität; verbesserte Bindung an das Ziel; Modifikation der biologischen Aktivität des Ziels; Fähigkeit, Gewebe- oder Zellmembranbarrieren zu überwinden; Resistenz gegenüber Clearance; worin die Ligandenmodifikation die Form von spezifischen Veränderungen in der Basensequenz oder einer chemischen Modifikation oder Derivatisierung der Liganden annimmt, basierend auf: (a) der Bestimmung, welche Nucleotide für die Wechselwirkung mit dem Zielmolekül entscheidend sind; (b) chemischen Modifikationsexperimenten; oder (c) der Bestimmung der strukturellen Konformation des Nucleinsäureliganden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin (a), (b) oder (c) die Durchführung einer Kovarianzanalyse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin (a), (b) oder (c) das Bestimmen, welche Nucleotidreste zur Beibehaltung der dreidimensionalen Struktur des Liganden erforderlich sind, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin (a), (b) oder (c) das Bestimmen der Positionen des Liganden umfasst, die für die Bindungsstruktur des Liganden mit dem Ziel entscheidend sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin (a), (b) oder (c) das Bestimmen, welche Nucleotidreste mit dem Ziel wechselwirken, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, worin der Bestimmungsschritt das Bestimmen, welche Nucleotidreste mit dem Ziel wechselwirken, umfasst, um die Bildung von Ligand-Ziel-Bindungspaaren zu erleichtern.
Verfahren nach Anspruch 5, worin der Bestimmungsschritt das Bestimmen, welche Nucleotidreste an proximalen Kontakten mit dem Ziel beteiligt sind, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin (a), (b) oder (c) das Bestimmen der Bindungsaffinität eines modifizierten Liganden in Bezug auf den Liganden vor der Modifikation umfasst, worin die Modifikation durch Nucleotidsubstitution im Liganden bereitgestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin (a), (b) oder (c) das Bestimmen der Bindungsaffinität eines modifizierten Liganden in Bezug auf den Liganden vor der Modifikation umfasst, worin die Modifikation durch die Abwesenheit eines oder mehrerer Nucleotide des Liganden bereitgestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin (a), (b) oder (c) das Bestimmen der Bindungsaffinität einer chemisch modifizierten Form des Liganden in Bezug auf den Liganden vor der chemischen Modifikation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin (a), (b) oder (c) das chemische Modifizieren des Liganden in Gegenwart eines Ziels und das Bestimmen, welche Nucleotide des Liganden nicht chemisch modifiziert sind, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin (a), (b) oder (c) das Denaturieren des Liganden und das chemische Modifizieren sowohl der denaturierten als auch der nicht denaturierten Formen des Liganden sowie das Bestimmen, welche Nucleinsäurereste im denaturierten Liganden modifiziert sind, die im nicht denaturierten Liganden nicht modifiziert sind, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ligandenmodifikation die Addition, Substitution oder Deletion eines Nucleotids umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ligandenmodifikation die Trunkierung des Liganden umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ligandenmodifikation die Inkorporation eines Vernetzungsmittels umfasst, um den Liganden kovalent an das Ziel zu binden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ligandenmodifikation ein kleines Molekül ergibt, das die Struktur des anfänglichen Ligandengerüsts nachahmt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ligandenmodifikation eine Steigerung der In-vivo-Stabilität des Liganden bewirkt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ligandenmodifikation eine Steigerung oder Vermittlung der Ligandenanlieferung bewirkt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ligandenmodifikation Resistenz gegenüber enzymatischem oder chemischem Abbau bereitstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ligandenmodifikation die Clearance-Geschwindigkeit des modifizierten Liganden aus dem Körper während einer Therapie verringert.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ligandenmodifikation eine chemische Modifikation oder Derivatisierung des Liganden an Ribose- und/oder Phosphat- und/oder Basenpositionen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die chemischen Modifikationsexperimente (b) unter Verwendung einer Chemikalie durchgeführt werden, die ausgewählt ist aus: Ethylnitrosoharnstoff; Dimethylsulfat; Carbodiimid; Diethylpyrocarbonat; und Kethoxal.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Ziel ausgewählt ist aus: HIV-RT-Proteinen; HIV-1-Rev-Proteinen; HIV-1-tat-Proteinen; Thrombin; oder basischen Fibroblastenwachstumsfaktoren.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der modifizierte Ligand eine einsträngige Nucleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der modifizierte Ligand eine RNA oder DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der modifizierte Ligand eine RNA ist und die Ligandenmodifikation die Substitution auf Ribose von 2-Hydroxyl durch 2-Methoxy umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der modifizierte Ligand eine RNA ist und die Ligandenmodifikation die Modifikation bestimmter Ribosen umfasst, sodass sie 2-NH₂ umfassen.
Nucleinsäureligand für das HIV-RT-Protein, der (a) die Sequenz
aufweist, worin X-X' ein bevorzugtes Basenpaar bezeichnet, oder (b) eine Sequenz mit einem Homologiegrad von über 70 % mit der Sequenz aus (a) aufweist, die Basenpaar-Flips in jenen Bereichen der Nucleinsäureliganden enthalten kann, die Basenpaarungsregionen umfassen, und eine Affinität für ein HIV-RT-Protein innerhalb von zwei Größenordnungen der Affinität eines Liganden mit der Sequenz aufweist.
Nucleinsäureligand für das HIV-RT-Protein, der (a) die Sequenz
aufweist, worin X eine Nucleotidposition bezeichnet, die nicht konserviert ist, und worin Z aus der aus den in 9 dargelegten Sequenzen (Seq.-ID Nr. 115-135) bestehenden Gruppe ausgewählt ist, oder (b) eine Sequenz mit einem Homologiegrad von über 70 % mit der Sequenz aus (a) aufweist, die Basenpaar-Flips in jenen Bereichen der Nucleinsäureliganden enthalten kann, die Basenpaarungsregionen umfassen, und eine Affinität für ein HIV-RT-Protein innerhalb von zwei Größenordnungen der Affinität eines Liganden mit der Sequenz aufweist.
Nucleinsäureligand für ein HIV-1-Rev-Protein, der (a) die Sequenz
aufweist, (b) eine Sequenz mit einem Homologiegrad von über 70 % mit der Sequenz aus (a) aufweist, die Basenpaar-Flips in jenen Bereichen der Nucleinsäureliganden ent halten kann, die Basenpaarungsregionen umfassen, und eine Affinität für ein HIV-1-Rev-Protein innerhalb von zwei Größenordnungen der Affinität eines Liganden mit der Sequenz aufweist.
Nucleinsäureligand nach einem der Ansprüche 28 bis 30, der an den Ribose- und/oder Phosphat- und/oder Basenpositionen chemisch modifiziert oder derivatisiert ist.