DE69333842T2

DE69333842T2 - Neue 2'-O-Alkyl-Nukleoside und -Phosphoramidite, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendungen

Info

Publication number: DE69333842T2
Application number: DE69333842T
Authority: DE
Inventors: Daniel Peter Claude Vista McGee; Phillip Dan Cook; Charles John Guinosso
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1992-07-23
Filing date: 1993-07-20
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2013-07-21
Also published as: EP1223173A3; EP1223173B1; AU4684993A; EP0651759B1; JPH07508042A; DE69333344T2; EP0651759A1; JP2000095793A; ATE256143T1; JPH1087689A; EP1223173A2; CA2140428C; DE69333344D1; JP3015464B2; DE69333842D1; WO1994002501A1; ATE299509T1; EP0651759A4; CA2140428A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung ist auf Verfahren zur Herstellung von 2'-O-Alkylguanosin und 2'-O-Alkylguanosinanaloga, von Phosphoramiditen dieser Verbindungen und Verfahren zu ihrer Verwendung gerichtet.
Hintergrund der Erfindung
Eine Anzahl von Oligonucleotidanaloga sind hergestellt worden. Eine Klasse von Oligonucleotiden, die synthetisiert worden sind, sind die 2'-O-substituierten Oligonucleotide. Diese Oligonucleotide weisen bestimmte einmalige und nützliche Eigenschaften auf. In der US-Patentanmeldung Nr. 814,961, erteilt am 24. Dezember, 1991, mit dem Titel Gapped 2' Modified Phosphorothioate Oligonucleotides, übertragen an denselben Rechtsnachfolger wie diese Anmeldung, europäisches Äquivalent veröffentlicht als EP061895A , werden 2'-substituierte Nucleotide in ein Oligonucleotid eingeführt, um erhöhtes Binden des Oligonucleotids an einen komplementären Zielstrang zu induzieren, während die Expression der RNase-H-Aktivität ermöglicht wird, um den Zielstrang zu zerstören.
In einem jüngsten Artikel, Sproat, B. S., Beijer, B. und Iribarren, A., Nucleic Acids Research, 1990, 18: 41, beachteten die Autoren außerdem die Verwendung von 2'-O-Methyl-substituierten Oligonucleotiden als „wertvolle Antisenseproben zur Untersuchung des Vor-mRNA-Splicens und der Struktur von Spliceosomen".
2'-O-Methyl- und -ethylnucleotide und Verfahren zu ihrer Herstellung sind von einer Vielzahl von Autoren berichtet worden.
Robins, M. J., Naik, S. R. und Lee, A. S. K., J. Org. Chem., 39: 1891 (1974) berichteten von einer Synthese mit geringer Ausbeute von 2'-O- und 3'-O-Methylguanosin über eine Zinn(II)-chlorid-katalysierte Monomethylierung durch Diazomethan. Wie später von Robins, M. J., Hansske, F. und Bernier, S. E., Can. J. Chem., 59: 3360 (1981) berichtet wurde, „sind geeignete und Hochleistungsverfahren für die Synthese der 2'-O- und 3'-O-Methylether von Adenosin, Cytidin und Uridin erfunden worden... Jedoch stellte Guanosin signifikante Schwierigkeiten dar". In dem vorhergehenden Dokument berichteten die Autoren über eine verbesserte Synthese von 2'-O- und 3'-O-Methylguanosin. Die Synthese wurde durch Ausführen der Zinn(II)-chloridkatalysierten Diazomethanmethylierung von 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin(2-aminoadenosin) anstelle von Guanosin verbessert. Die Diaminopurineinheit wurde dann zu der entsprechenden Guanineinheit mit Adenosindeaminase reduziert. Es wurde berichtet, daß in einer weiteren Diazotierungsreaktion, beschrieben von Singer und Kusmierek, Biochemistry 15: 5052 (1976), ein Gemisch aus 2'- und 3'-O-Ethylguanosin aus der Behandlung von Guanosin mit Diazoethan resultiert. Die Alkylierung führte ebenso zur Alkylierung der heterocyclischen Base. Das alkylierte Produkt wurde mit einer Base behandelt, um die Ethylgruppe von der heterocyclischen Base zu entfernen. Das resultierende Produkt wurde aufgrund desselben UV-Spektrums wie das von Guanosin, bei dem sich aber Rf von dem Rf von Guanosin unterschied, identifiziert.
Eine weitere Verbesserung in der Synthese von 2'-O-Methylnucleosiden wurde von Inoue, H., Hayase, Y. Imura, A., Iwai, S., Miura, K. und Ohtsuka, E., Nucleic Acids Research, 15: 6131 (1987) berichtet. Dieses Syntheseverfahren wurde unter Verwendung von CH₃I in Gegenwart von Ag₂O ausgeführt. Dieses Verfahren erwies sich für alle der bekannten Nucleotide mit Ausnahme von Guanosin als nüztlich. Wie durch diese Autoren berichtet, erwies sich Guanosin für dieses Syntheseverfahren als widerstandsfähig. Daher müssen die Autoren erneut die 2'-O-Methylierung von Guanosin mit Diazomethan ausführen. Um die Methylierung der Aminofunktionalität der Guanin-Grundeinheit zu vermeiden, wurde die Guanin-Grundeinheit mit einer Isobutyrylgruppe blockiert. Um außerdem die Methylveresterung der 3'-O-Funktionalität der Zuckereinheit zu vermeiden wurde eine TIPDS- Blockiergruppe (Tetraisopropyldisiloxan-Blockiergruppe) verwendet, um sowohl 3'- als auch die 5'-Hydroxyle der Zuckereinheit zu blockieren.
Sproat et al., supra und Sproat, B. S., Iribarren, A. M., Garcia, R. G. and Beijer, B., Nucleic Acids Research, 19: 733 (1991) sprachen die Synthese von 2'-O-Methylguanosin (und 2'-O-Allylguanosin) an. In beiden von diesen Veröffentlichungen von Sproat et al. stellen die Forscher einen weiteren synthetischen Weg für 2'-O-Methylguanosin und 2'-O-Allylguanosin dar. Sie charakterisierten den weiteren Weg in bezug auf die vorher bekannten Syntheseverfahren als „Vermeidungen... der Verwendung des stark toxischen und möglicherweise explosiven Reagens Diazomethan" und sind „weit besser als die Verwendung von Silberoxid/Methyliodid". Dasselbe Syntheseverfahren von Sproat und anderen Forschern wurde ebenso in B. S. Sproat und A. I. Lamond, „2'-O-Methyloligoribonucleotides: synthesis and applications", Oligonucleotides and Analogues, Hrsg. F. Eckstein, (IRL Press, 1991), die die Synthesen von 2'-O-Methylribonucleosid-3'-O-phosphoramiditen beschreiben, veröffentlicht. Die hierin beschriebene Uridinphosphoramiditsynthese erfordert sowohl Basen- als auch Zuckerschutz des Ausgangsnucleosids vor der Alkylierung. Nachdem die Basen- und Zuckerschutzgruppen an dem Uridin an der entsprechenden Stelle sind, wird es alkyliert. Nach der Alkylierung wird die Basenschutzgruppe entfernt, gefolgt von 5'-O-Dimethoxytritylierung und Phosphitylierung. Die Cytidinphosphoramiditsynthese, beschrieben von Sproat and Lamond, nutzt (und erfordert daher) das Basen- und Zucker-blockierte 2'-O-Methyluridinanalogon. Dieses Analogon wird dann zu einem blockierten Cytidinanalogon umgewandelt, die Blockiergruppe wird von dem Zucker entfernt, das Analogon wird dimethoxytrityliert und schließlich phosphityliert. Die Guanosinphosphoramiditsynthese, gelehrt von Sproat and Lamond, geht von einem 2-Amino-6-chlornucleosid mit blockierten 3'- und 5'-Zuckerhydroxygruppen aus. Dieses Nucleosid wird zu einem 2,6-Dichlorderivat umgewandelt. Die Dichlorverbindung wird dann 2'-O-alkyliert. Nach der O-Alkylierung wird die Dichlorverbindung zu einem Diazidozwischenprodukt umgewandelt. Das Diazidozwischenprodukt wird wiederum zu einem Diaminozwischenprodukt umgewandelt. Das Diaminozwischenprodukt wird dann zu dem Guanosinanalogon deaminiert. Die 2-Aminogruppe des Guanosinanalogons wird nach der Dimethoxytritylie rung und schließlich Phosphitylierung blockiert. Diese Guanosinverfahrensweise wird ebenso in Sproat, et. al., Nucleic Acids Research, 1991 19: 733 veröffentlicht.
Die obigen Syntheseverfahren umfassen mehrere Schritte und zahlreiche Reagensbehandlungen – 9 unterschiedliche Reagensbehandlungen für Uridin, 10 für Cytidin und 12 für Guanosin. Für die Cytidin- und Guanosinverbindungen ist mindestens eines der Reagenzien, das erforderlich ist, nicht ohne weiteres verfügbar und ist daher ein sehr teures Reagens.
Andere Gruppen lehrten die Herstellung von anderen 2'-O-alkylierten Nucleosiden. 2'-O-Methylthiomethylguanosin wurde von Hansske, F., Madej, D. und Robins, M. J., Tetrahedron, 40: 125 (1984) berichtet. Es wurde als ein Nebenprodukt eines Oxidationsschrittes während der Umwandlung von Guanosin zu 9-β-D-arabinofuranosylguanin, d. h. das Arabinoanalogon von Guanosin, hergestellt. Die Zugabe der 2'-O-Methylthiomethyleinheit ist ein Artefakt aus dem DMSO-Lösungsmittel, das während des Oxidationsverfahrens verwendet wird. Das 2'-O-Methylthiomethylderivat von 2,6-Diaminopurinribosid wurde ebenso in der Veröffentlichung von Hansske et al. berichtet. Es wurde ebenso als ein Artefakt aus dem DSMO-Lösungsmittel erhalten.
Außerdem offenbaren Gladkaya, et al., Khim. Prir. Soedin., 1989, 4, 568 N₁-Methyl-2'-O-(tetrahydropyran-2-yl) und 2'-O-Methylguanosin. Sproat, et al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 733 lehren die Herstellung von 2'-O-Allylguanosin. Die Allylierung von Guanosin erfordert einen weiteren Syntheseweg. Iribarren, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1990, 87, 7747 untersuchten ebenso 2'-O-Allyloligoribonucleotide. Iribarren, et al. führten 2'-O-Methyl-, 2'-O-Allyl- und 2'-O-Dimethylallyl-substituierte Nucleotide in Oligoribonucleotide ein, um die Wirkung dieser RNA-Analoga auf die Antisenseanalyse zu untersuchen. Iribarren fand heraus, daß 2'-O-Allyl-enthaltende Oligoribonucleotide gegen die Digestion durch entweder RNA- oder DNA-spezifische Nukleasen resistent sind und etwas resistenter gegen Nukleasen mit doppelter RNA/DNA-Spezifizität als 2'-O-Methyloligoribonucleotide sind. Jedoch fand Iribarren heraus, daß 2'-O-Dimethylallyl-enthaltende Oligoribonucleotide verringerte Hybridisierung an komplementäre RNA-Sequenzen im Vergleich zu 2'-O-Methyloligoribo nucleotiden aufweisen. Daher schlug Iribarren vor, daß weitere Versuche, alkylierte RNA-Proben herzustellen, insbesondere die, die besser als 2'-Allylcytidinenthaltende Oligoribonucleotide sind, auf 2'-O-Alkylgruppen, die weniger als fünf Kohlenstoffatome enthalten, eingeschränkt werden sollten.
Bestimmte Oligonucleotide, die 2'-O-Alkyl-substituierte Nucleotide enthalten, sind vielversprechende Kandidaten zur Verwendung als humane Pharmazeutika. Die mit langkettigen Alkylgruppen (d. h. vier oder mehreren Kohlenstoffatomen) sind besonders nützlich. Beispielsweise können langkettige Alkylgruppen funktionelle Gruppen in entsprechende Orientierung mit dem gegenüberliegenden Strang bei der Stranghybridisierung bringen. Daher sind langkettige 2'-O-Alkylnucleotide, wie langkettige 2'-O-Alkylguanosinnucleotide, in einigen Fällen stark wünschenswert. Zur Verwendung bei therapeutischen Tests im großen Umfang und eventuell zur humanen pharmazeutischen Verwendung müssen große Mengen von diesen Oligonucleotiden synthetisiert werden. Die großen Mengen an Oligonucleotiden erfordern wiederum große Mengen an 2'-O-Alkylnucleosidphosphoramiditen, die beim Synthetisieren der Oligonucleotide verwendet werden. Daher müssen sowohl die Kosten als auch die Reinheit der Ausgangsphosphoramidite, die bei der Synthese von diesen Oligonucleotiden verwendet werden, berücksichtigt werden. Als allgemeiner Grundsatz gilt, wenn sich die Anzahl an Syntheseschritten erhöht, erhöhen sich die Herstellungskosten. Wenn sich außerdem die Anzahl an Schritten erhöht, steigen die Qualitätsprobleme. Im Hinblick darauf ist es offensichtlich, daß ein großer Bedarf an neuen und verbesserten Verfahren zur Herstellung von Nucleosiden und Nucleosidphosphoramiditen besteht.
Gegenstände der Erfindung
Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, Verfahren zur Synthese von 2'-O-alkyliertem Guanosin und Guanosinanaloga bereitzustellen.
Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, neue und verbesserte Synthesen von 2'-O-Alkylguanosinphosphoramiditen bereitzustellen.
Diese und andere Gegenstände werden dem Fachmann aus einer Prüfung der vorliegenden Beschreibung und der anhängenden Ansprüche offensichtlich.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 2'-O-alkyliertem Guanosin-3'-O-phosphoramidit, umfassend die Schritte:
das Alkylieren eines 2,6-Diamino-9-(ribofuranosyl)purins in Gegenwart eines Metallhydrids unter Bildung eines 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkylierten Ribofuranosyl)purins
das Deaminieren des 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkylierten Ribofuranosyl)purins unter Bildung eines 2'-O-alkylierten Guanosins;
das Blockieren der 5'-Hydroxyleinheit des 2'-O-alkylierten Guanosins; und
das Phosphitylieren der 3'-Position des 5'-blockierten 2'-O-alkylierten Guanosins.
Diese Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung von 2'-O-substituiertem Guanosin bereit, umfassend:
das Behandeln von 2,6-Diaminopurinribosid mit einer Base mit einem pK_b ≥ pK_b von NaH und mit einer Verbindung mit der Formel R-L, wobei R eine aliphatische oder alicyclische Gruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter Bildung von 2'-O-substituiertem 2,6-Diaminopurinribosid und 3'-O-substituiertem 2,6-Diaminopurinribosid, wobei der Substituent die aliphatische oder alicyclische Gruppe ist;
das Deaminieren des 2'-O-substituierten 2,6-Diaminopurinribosids, um das 2'-O-substituierte Guanosin zu ergeben; und
das Rückgewinnen des 2'-O-substituierten Guanosins.
Diese Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung von 2'-O-Alkylguanosin bereit, umfassend:
das Behandeln von 2,6-Diaminopurinribosid mit einer Base mit einem pK_b ≥ pK_b von NaH und einer Verbindung der Formel R-L, wobei R die Alkylgruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter Bildung von 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosid;
das Behandeln des 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosids mit Adenosindeaminase; und
das Rückgewinnen des 2'-O-Alkylguanosins.
Diese Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines 3'-O-Phosphoramidits von 2'-O-Alkylguanosin bereit, umfassend:
das Behandeln von 2,6-Diaminopurinribosid mit einer Base mit einem pK_b ≥ pK_b von NaH und einer Verbindung der Formel R-L, wobei R die Alkylgruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter Bildung von 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosid;
das Behandeln des 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosids mit Adenosindeaminase unter Bildung von 2'-O-Alkyl-guanosin;
das Schützen der 2-NH₂-Einheit des 2'-O-Alkyl-guanosins mit einer Schutzgruppe;
das Schützen der 5'-OH-Einheit des 2'-O-Alkyl-guanosins mit einer weiteren Schutzgruppe;
das Phosphitylieren der 3'-OH-Einheit des geschützten 2'-O-Alkyl-guanosins; und
das Rückgewinnen des 3'-O-Phosphoramidits von 2'-O-Alkylguanosin.
Abgesehen von der Herstellung mit Diazomethan hat sich die direkte Alkylierung von Guanosin bisher als schwierig erwiesen. Die vorliegende Erfindung stellt die direkte 2'- und 3'-O-Alkylierung von 2,6-Diamino-9-(-β-D-ribofuranosyl)purin, d. h. 2,6-Diaminopurinribosid oder 2-Aminoadenosin, bereit, die mit anschließender Deaminierung des 2'-O-alkylierten 2,6-Diaminopurinribosids zu dem entsprechenden 2'-O-alkylierten Guanosin ausgeführt werden kann. Diese Alkylierung kann, wenn gewünscht, ohne Verwendung von Blockiergruppen an weder dem Heterocyclus noch den Zuckereinheiten des Nucleosids praktiziert werden. Außerdem ist im Gegensatz zur Verwendung von Diazomethan, das nur das Methylalkylierungsprodukt ergeben wird, die Alkylierung, wie in dieser Erfindung praktiziert, nicht nur auf die direkte Methylalkylierung beschränkt, sondern wird verwendet, um eine Fülle von Alkylsubstituierten Guanosin- und 2,4-Diaminopurinribosidverbindungen zu erhalten. Diese in der Erfindung verwendeten notwendigen Verbindungen mit der Formel R-L, wobei R eine Alkylgruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist, sind entweder kommer ziell erhältlich, in der Literatur bekannt oder können durch Verfahrensweisen analog zu den bekannten Literaturverbindungen hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Zweischritt-Alkylierungsverfahren unterscheiden sich außerdem von dem Sechsschritt-Verfahren der Sproat et al. Forscher. Siehe die oben genannten Veröffentlichungen Nucleic Acids Research, 18: 41 (1990) und Nucleic Acids Research, 19: 733 (1991). Bei diesen Verfahrensweisen muß 2-Amino-6-chlorpurinribosid zunächst an sowohl den 3'- als auch 5'-Positionen blockiert, zu dem 2,6-Dichlorderivat umgewandelt, an der 6-Purinposition blockiert, zu dem 2'-O-Methyl- oder 2'-O-Allylderivat derivatisiert, zu dem 2,6-Diaminoderivat umgewandelt, an den 3'- und 5'-Positionen entblockiert und schließlich zu dem 2'-O-Methyl- oder 2'-O-Allylguanosinprodukt deaminiert werden.
Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Alkylierung direkt an 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin mit einer geeigneten Verbindung mit der Formel R-L, wobei R eine Alkylgruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist, in Gegenwart einer Base mit einem pK_b ≥ pK_b von NaH durchgeführt. Die Alkylierung kann auf die Monoalkylierung durch Einschränken der Menge von entweder der R-L-Gruppe oder der Base auf eine stöchiometrische (oder äquivalente) Menge begrenzt werden. Alternativ kann die Dialkylierung (an sowohl den 2'- als auch 3'-Positionen) durch die Verwendung einer überschüssigen R-L-Gruppe und Base praktiziert werden, um gleichzeitig sowohl die 2'- als auch die 3'-Positionen zu alkylieren.
Während man nicht an eine Theorie gebunden sein möchte, ist beobachtet worden, daß die Alkylierung an der 2'-Position im Vergleich zu der 3'-Position vorherrscht. Im allgemeinen wird ein Verhältnis von etwa 7:3 bis etwa 8:2 der 2'- bis 3'-Alkylierungsprodukte erhalten (wie durch DC bestimmt). Für sowohl DC als auch die präparative Chromatographie weißt das 2'-Produkt im allgemeinen eine schnellere Rf als das 3'-Produkt auf. Der Vorteil dieses Rf-Unterschiedes kann genutzt werden, um die 2'-O- und 3'-O-Produkte voneinander oder von 2'-O-, 3'-O-dialkylierten Produkten zu trennen. Daher können die 2'- und 3'-Alkylierungsprodukte durch Verfahren, wie Kieselgelchromatographie, wenn gewünscht, getrennt werden.
Für die Alkylgruppen, die im allgemeinen größer als Propyl sind, kann die Deaminierungsrate des 2'-Produktes gegen das 3'-Produkt zur Trennung der 2'-O- und 3'-O-Produkte genutzt werden. Daher werden die Gemische aus 2'-O- und 3'-O-alkylierten 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin der Deaminierung mit Adenosindeaminase unterzogen werden. Die enzymatische Deaminierung des 2'-O-Produktes ist leichter als die Deaminierung des 3'-O-Produktes. Dieser Unterschied in der Deaminierungsrate ermöglicht die Trennung des deaminierten 2'-Produktes, d. h. dem 2'-O-alkylierten Guanosins, von dem langsameren oder nicht-deaminierten 3'-Produktes, d. h. dem 2,6-Diamino-9-(3'-O-alkylierten-β-D-ribofuranosyl)purins. Außerdem sind Verfahren wie die Kristallisation genutzt worden, um weiterhin ein 2'-Produkt von dem entsprechenden 3'-Produkt durch Trennen des 2'-O-alkylierten Diaminopurinribosidproduktes von dem entsprechenden 3'-O-alkylierten Diaminopurinribosidproduktes zu trennen.
Eine bevorzugte Base, die zur Alkylierung genutzt wird, ist Natriumhydrid. Andere geeignete Basen können ebenso genutzt werden, jedoch müssen diese Basen ausreichend Basenstärke aufweisen, um das Proton von der 2'- (oder 3'-) Hydroxyleinheit des 2,6-Diaminopurinribosidausgangsmaterials zu entfernen. Während nicht gewünscht wird, an eine Theorie gebunden zu sein, kann irgendeine Base mit einem pK_a von etwa 10 pK_a-Einheiten größer als der pK_a des Protons der 2'-Hydroxyleinheit des 2,6-Diaminopurinribosidausgangsmaterials verwendet werden. Spezieller können Basen mit einem pK_b größer als pK_b von Natriumhydrid günstig ausgewählt werden. Diese Basen können aus der Zusammenstellung von Basen, wie der, die in Tabelle 1, Seite 220 von March, J. Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience, John Wiley & Sons, New York, 1985 angegeben werden, ausgewählt werden.
Die erfindungsgemäßen Alkylierungsreaktionen werden typischerweise in DMF als das Lösungsmittel durchgeführt. Andere geeignete Lösungsmittel umfassen DMSO, N-Methylpyrolidon und Sulfolon.
Vorzugsweise wird die Deaminierung durch die Verwendung von Deaminaseenzymen durchgeführt. Besonders bevorzugt ist Adenosindeaminase. Besonderes geeignet zur Verwendung ist Adenosin Deaminase Typ II erhältlich von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. Andere Deaminierungsreagenzien können ebenso eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Deaminierungsreaktionen werden typischerweise in einem Gemischlösungsmittel, das ein organisches Lösungsmittel und einen wässerigen Puffer enthält, durchgeführt. Geeignet zur Verwendung als das organische Lösungsmittel sind DMSO, N-Methylpyrolidon und Sulfolon. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Deaminierung unter Verwendung von DMSO als organisches Lösungsmittel erreicht. Geeignet zur Verwendung als wässeriger Puffer sind Puffer mit einem pH, der zu dem pH-Bereich der Verwendung des Deaminaseenzyms kompatibel ist. Bevorzugt sind Phosphatpuffer, wie Natriumphosphat und Trispuffer.
Um das 2'-Produkt gegen 3'-Produkt durch Beseitigung irgendeines 3'-Produktes anzureichern, wird eine TIPDS-Schutzgruppe (Tetraisopropylsiloxan-Schutzgruppe) verwendet, um die 3'- und 5'-Hydroxyleinheiten der Zuckeranteile des 2,6-Diaminopurinribosids zu schützen. In derselben Weise würde das ausschließliche 3'-Produkt durch die Verwendung einer basenstabilen, nicht-wandernden 2'-O-Schutzgruppe erhältlich sein. Diese basenstabilen, nicht-wandernden Schutzgruppen umfassen Tetrahydropyranyl (THP), 4-Methoxytetrahydropyran-4-yl (Mthp), 1-[(2-Chlor-4-methyl)phenyl-4-methoxypiperidin-4-yl (Ctmp), Triphenylmethyl (trityl), Mono-, Di- und Tri-methoxytrityl und andere ähnliche Schutzgruppen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Gemäß dieser Erfindung werden ebenso verbesserte Verfahren zur Herstellung von 2'-O-alkylierten Guanosinphosphoramiditen bereitgestellt.
Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren kann die Herstellung eines 2'-O-alkylierten Guanosin-3'-O-phosphoramidits die Schritte des Alkylierens eines 2,6-Diamino-9-(ribofuranosyl)purins unter Bildung eines 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkylierten Ribofuranosyl)purins; des Deaminierens des 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkylierten Ribofuranosyl)purins unter Bildung eines 2'-O-alkylierten Guanosins; des Blockierens der 5'-Hydroxyleinheit des 2'-O-alkylierten Guanosins; und des Phosphitylierens der 3'-Position des 5'-blockierten 2'-O-alkylierten Guanosins umfassen.
Das 3'-O-Phosphoramidit von 2'-O-Alkylguanosin und 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkyl-β-D-ribofuranosyl)purin kann in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung durch die Umsetzung von 2-NH₂, 5'-OH-geschütztem 2'-O-Alkylguanosin oder 2=NH₂, 6-NH₂ und 5'-OH-geschütztem 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkyl-β-D-ribofuranosyl)purin mit kommerziell erhältlichen Reagenzien, die dem Fachmann bekannt sind, wie 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminochlorphosphin bereitgestellt werden.
2'-O-Alkylguanosin und 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosid kann an dem 3'-OH phosphityliert werden, um Phosphoramidite durch in der Technik bekannte Verfahren, wie durch den Schutz der NH₂-Einheiten (2- oder 2- bzw. 6-NH₂) und 5'-OH-Einheit, gefolgt von der Reaktion mit Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminochlorphosphin bereitzustellen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, wie hierin bereitgestellt, können in Oligomere durch dem Fachmann bekannte Verfahren eingeführt werden.
Im Rahmen dieser Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Nucleosid" auf einen Zucker und eine Base, die normalerweise über einen „anomeren" Kohlenstoff an dem Zucker miteinander verbunden sind. Sowohl α- als auch β-Zucker sind in die vorliegende Erfindung einbezogen. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der Nucleosidzucker ein Pentofuranosylzucker, jedoch können andere Zucker ebenso verwendet werden, wie carbocyclische oder 4'-Deoxy-4'-thiozuckeranaloga.
Der Ausdruck „Oligonucleotid" oder „Oligomer", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polynucleotid, das aus natürlich vorkommenden Basen und Furanosylgruppen gebildet wird, die durch native Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Oligonucleotide werden natürlich mindestens ein 2'-O-Alkylguanosin oder Derivat davon umfassen. Daher bezieht sich dieser Ausdruck effektiv auf natürlich vorkommende Spezies oder synthetische Spezies, die aus natürlich vorkommenden Untereinheiten oder ihren engen Homologa gebildet werden. Der Ausdruck „Oligonucleotid" oder „Oligomer" kann sich ebenso auf Einheiten beziehen, die Anteile ähnlich zu natürlich vorkommenden Oligonucleotiden aufweisen, die aber nicht-natürlich vorkommende Anteile aufweisen. Daher können Oligonucleotide veränderte Zucker, veränderte Baseneinheiten oder veränderte Interzuckerverknüpfungen aufweisen. Beispiele von diesen sind das Phosphorthioat und andere Schwefel-enthaltende Spezies, die zur Verwendung in der Technik bekannt sind.
Außerdem bezieht sich, wie in dieser Erfindung verwendet, der Ausdruck „Alkylieren" auf die Addition einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyleinheit, vorzugsweise eine Alkyleinheit, zu den Präkursorn der Nucleosidphosphoramidite der Erfindung. Die Alkylierung der 2'-Position des Nucleosidzuckers verknüpft die Alkylierungseinheit der 2'-Position des Zuckers über eine Etherverknüpfung.
Bevorzugte Alkyleinheiten umfassen unsubstituiertes und substituiertes geradkettigetes C₁-C₂₀-Alkyl und unsubstituiertes und substituiertes verzweigtkettiges C₁-C₂₀-Alkyl. Bevorzugte Alkenylgruppen umfassen unsubstituiertes und substituiertes geradkettiges C₂-C₂₀-Alkenyl und unsubstituiertes und substituiertes geradkettiges C₂-C₂₀-Alkenyl. Bevorzugte Alkinylgruppen umfassen unsubstituiertes und substituiertes geradkettiges C₂-C₂₀-Alkinyl und unsubstituiertes und substituiertes geradkettiges C₂-C₂₀-Alkinyl. Daher umfassen bevorzugte Alkylierungsgruppen gerad- oder verzweigtkettiges C₁-C₂₀-Niederalkyl oder substituiertes Niederalkyl, gerad- oder verzweigtkettiges C₂-C₂₀-Niederalkenyl oder substituiertes Niederalkenyl, gerad- oder verzweigtkettiges C₂-C₂₀-Niederalkinyl oder substituiertes Niederalkinyl, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die erfindungsgemäßen Alkylgruppen umfassen gerad- und verzweigtkettige C₁-C₂₀-Alkyle, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Octadecyl, Nonadecyl und Eicosyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Isopentyl, 2-Methyl-pentyl, 3-Methylpentyl, 2-Ethylhexyl und 2-Propylpentyl, sind aber nicht darauf beschränkt. Alkenylgruppen umfassen ungesättigte Einheiten, die aus den obigen Alkylgruppen stammen, sind aber nicht darauf beschränkt, einschließlich Vinyl, Allyl und Crotyl, sind aber nicht darauf beschränkt. Alkinylgruppen umfassen ungesättigte Einheiten mit mindestens einer Dreifachbindung, die aus den obigen Alkylgruppen stammen, einschließlich Ethinyl und Propargyl, sind aber nicht darauf beschränkt.
Substituentengruppen für obige umfassen Halogen-(Cl, Br, F), Hydroxyl-(OH), Thiol-(SH), Keto-(C=O), Carboxyl-(COOH), Nitrat-(ONO₂), Nitro-(NO₂), Nitroso-(NO), Nitril-(CN), Trifluormethyl-(CF₃), Trifluormethoxy-(OCF₃), O-Alkyl-, S-Alkyl-, NH-Alkyl-, N-Dialkyl-, O-Aralkyl-, S-Aralkyl-, NH-Aralkyl-, Amino-(NH₂), Azido-(N₃), Hydrazino-(NHNH₂), Hydroxylamino-(ONH₂), Isocyanato-(OCN), Sulfoxid-(SO), Sulfon-(SO₂), Sulfid-(S-), Disulfid-(S-S), Silyl-, heterocyclische, alicyclische, carbocyclische, Interkalator-, Reportermolekül-, Konjugat-, Polyamin-, Polyamid-, Polyethylenglykol-, Polyether-Gruppen, die die pharmakodynamischen Eigenschaften von Oligonucleotide verbessern, und Gruppen, die die pharmakokinetischen Eigenschaften von Oligonucleotiden verbessern, sind aber nicht darauf beschränkt. Diese Verbindungen umfassen 3-Penten-2-on, 3-Methyl-2-butanol, 2-Cyanooctyl, 3-Methoxy-4-heptanal, 3-Nitrobutyl, 4-Isopropoxydodecyl, 4-Azido-2-nitrodecyl, 5-Mercaptononyl, 4-Amino-1-pentenyl sowie andere substituierte Gruppen. Diese substituierten Gruppen können in einer blockierten oder geschützten Form und später entblockiert in die substituierte Stammverbindung eingeführt werden. Beispielsweise wird die Verwendung der Phthalimidogruppe als blockierte Form einer Aminosubstitution nachstehend dargestellt.
Andere geeignete Substituentengruppen umfassen Interkalatoren, Reportergruppen, Reporterenzyme und Konjugate, einschließlich Cholesterole, Phospholipide, Biotin, Phenanthrolin, Phenazin, Phenanthridin, Anthrachinon, Acridone, Pyrene, Stilbene, Oxazolo-pyridocarbazole, Anthrachinone, Phenanthridine, Phenazine, Azidobenzole, Psoralene, Porphyrine, Cholsäuren, Folsäure, Fluoreszeine, Rhodamine, Coumarine und Farbstoffe; Steroide, lipophile Moleküle, Peptide, Protein, Vitamine, RNA-Spaltungskomplexe, Metallchelatbildner, Alkylatoren und Vernetzungsmittel.
Eine besonders bevorzugte Substituentengruppe ist CF₃. Weitere besonders bevorzugte Substituentengruppen sind Phthalimido und Imidazol. Wie angemerkt, ermöglicht die Verwendung der Phthalimidogruppe die Einführung einer blockierten Aminofunktionalität an der Alkylgruppe. Unter Verwendung der Guanosinanaloga, die gemäß dieser Erfindung als Zwischenprodukte in der Oligonucleotidsynthese hergestellt wurden, wird, nachdem die Oligonucleotidsynthese beendet ist, die Phthalimi dogruppe entfernt, was eine Aminofunktionalität ergibt, die an ein Guanosinnucleotid innerhalb der Oligonucleotidsequenz gebunden wird. Die Verwendung einer Imidazoleinheit als Substituentengruppe an der Alkylfunktionalität führt die vorgeschlagene Nucleinsäurespaltungs-Funktionalität, Imidazol, an dem Guanosinnucleotid innerhalb einer Oligonucleotidsequenz ein.
Arylgruppen umfassen Phenyl, Tolyl, Benzyl, Naphthyl, Anthracyl, Phenanthryl, Pyrenyl und Xylyl, sind aber nicht darauf beschränkt. Halogene umfassen Fluor, Chlor und Brom. Geeignete heterocyclische Gruppen umfassen Imidazol, Tetrazol, Triazol, Pyrrolidin, Piperidin, Piperazin und Morpholin, sind aber nicht darauf beschränkt. Amine umfassen Amine von allen der obigen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- und Arylgruppen, einschließlich primäre und sekundäre Amine und „maskierte Amine", wie Phthalimid. Amine sollen ebenso Polyalkylaminoverbindungen und Aminoalkylamine, wie Aminopropylamin und weitere Heterocyclo-alkylamine, wie Imidazol-1, 2- oder 4-yl-propylamin umfassen. RNA-Spaltungskomplexe können beispielsweise Interkalatoren oder Gruppen sein, die in der kleinen Furche von RNA binden. Interkalatoren sind Moleküle, die sich selbst zwischen benachbarte Basen eines Oligonucleotids schieben. Reportermoleküle sind Moleküle, die die Identifikation eines Moleküls entweder optisch oder anderweitig unterstützen. Vernetzungsmittel verbinden effektiv zwei Gruppen.
Geeignete Abgangsgruppen der vorliegenden Erfindung umfassen Halogenide, wie Chlorid, Bromid und Iodid, Sulfonate, wie Tosyl, Brosyl, Nosyl, Mesyl und Trifyl, und Oxoniumionen. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Abgangsgruppe ein Halogenid. Noch andere geeignete Abgangsgruppen sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Alkylierung vorzugsweise in Gegenwart einer Base, vorzugsweise eines Metallhydrids, wie Natriumhydrid, durchgeführt. Die Alkylierung des 2',3'-O-Dialkylstannylenderivats von Uridin wird vorzugsweise in Gegenwart eines Salzes, wie ein Metallhalogenid, durchgeführt. Cäsiumflourid und Natriumiodid sind in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Außerdem ist die 5'-Hydroxylblockiergruppe vorzugsweise eine Di methoxytrityleinheit. Das Phosphitylierungsreagens ist vorzugsweise Bis-N,N-diisopropylaminocyanoethylphosphit und die Phosphitylierungsreaktion wird vorzugsweise in Gegenwart von N,N-Diisopropylamino-hydrotetrazolid durchgeführt.
Bei der Ausführung der Alkylierung von Guanosin wird 2',6-Diaminopurin beispielsweise durch Verfahren, die in Attorney Docket No. ISIS-710, eingereicht am 27. Oktober 1992 beschrieben werden, alkyliert. Die verwandte europäische Anmeldung wird als EP0651759 veröffentlicht.
Die Aminoeinheit der erfindungsgemäßen Phosphoramidite kann aus verschiedenen Aminen, die derzeit für diese Phosphoramidite verwendet werden, ausgewählt werden. Diese Amine umfassen sowohl aliphatische als auch Heteroarylamine, wie in verschiedenen US-Patenten beschrieben, prinzipiell die von M. Caruthers und Kollegen. Diese umfassen US-Patente 4,668,777, erteilt am 26. Mai 1987; 4,458,066, erteilt am 3. Juli 1984; 4,415,732, erteilt am 15. November 1983; und 4,500,707, erteilt am 19. Februar 1985. Eine bevorzugte Aminogruppe ist Diisopropylamino.
Zusätzlich zu der Aminoeinheit des Phosphoramidits wird für Phosphodiester- und Phosphorthioatverknüpfungen eine zusätzliche Phosphorblockiergruppe verwendet. Eine bevorzugte Blockiergruppe ist die Cyanoethylgruppe. Andere Phosphorblockiergruppen umfassen Methoxy und 2-(Methylsulfonyl)ethyl. Außerdem wird ein Aktivierungsmittel normalerweise für die Phosphoramiditverknüpfungschemie verwendet. Ein bevorzugtes Aktivierungsmittel ist N,N-Diisopropylaminohydrotetrazolid. Andere geeignete Einheiten für diese Funktionen werden ebenso in den obengenannten Patenten sowie in dem US-Patent 4,725,677, erteilt am 16. Feb. 1988, und Berner, S., Muhlegger, K., und Seliger, N., Nucleic Acids Research 1989, 17: 853; Dahl, B. H., Nielsen, J. und Dahl, O., Nucleic Acids Research 1987, 15: 1729; und Nielson, J. Marugg, J. E., Van Boom, J. H., Honnens, J., Taagaard, M. und Dahl, O., J. Chem. Research 1986, 26 offenbart.
Zur Verwendung in Phosphorthioatverknüpfung wird das Beaucage-Reagens in Beaucage, S. L. und Caruthers, M. H., Tetrahedron Letters 1981, 22: 1859 sowie in Zon, G. and Stec, J., Phosphorothioate oligonucleotides: Oligonucleotides and Ana logs A Practical Approach; Eckstein, F. Ed.; IRL Press, Oxford, 1991, beschrieben, die ebenso die Schwefelbehandlung durch elementaren Schwefel beschreiben.
Beispiele
Die folgenden Beispiele stellen die Erfindung dar, sollen sie jedoch nicht einschränken. In verschiedenen Beispielen werden die Nomenklatur 4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl und Dimethoxytrityl gegenseitig austauschbar in bezug auf die DMT-Blockiergruppe, die an der 5'-Hydroxyleinheit der verschiedenen Nucleoside und Nucleotide der Erfindung positioniert ist, verwendet.
NMR-Spektren wurden mit den folgenden Vorrichtungen erhalten: ¹H-NMR: Varian Gemini-200 (199,975 MHz), ¹³C-NMR: Varian Gemini-200 (50,289 MHz). NMR-Spektren wurden unter Verwendung von entweder Deuteriochloroform (Tetramethylsilan als interner Standard) oder Dimethylsulfoxid-d₆ als Lösungsmittel aufgezeichnet. Die folgenden Abkürzungen wurden verwendet, um die Multiplizität der einzelnen Signale zu bezeichnen: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, ABq = ab-Quartett, m = Multiplett, dd = Dublett von Dubletts, br s = breites Singulett. Massenspektren wurden auf einer VG 70-SEQ Vorrichtung (VG Analytical (Fisons)) unter Verwendung von Fast-Atom-Bombardment-Ionisierung (7 kV Xe Atome) erreicht. Lösungsmittelverhältnisse für die Säulenchromatographie werden als Volumen/Volumen angegeben. Die Eindampfungen von Lösungsmitteln wurden im Vakuum (60 Torr) bei 30°C durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. Die Schmelzpunkte werden als unkorrigiert angegeben.
Beispiel 1
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin
Gemäß den Modifikationen der Verfahrenweisen, die in Robins, M. J., Hanske, F. und Beriner, S. E., Can. J. Chem., 59: 3360 (1981) beschrieben werden, wurden Guanosinhydrat (49 g, Aldrich Chemical Co.), Toluol (200 ml), Hexamethyldisilazan (160 ml, 4,3 val) und Trifluormethansulfonsäure (3,7 ml) in eine Edelstahl-Parr-Bombe geladen. Die Bombe wurde verschlossen und ungefähr 1/3 eingetaucht in ein Ölbad bei 170°C für 5 Tage erhitzt. Die Bombe wurde in einem Trockeneisacetonbad abgekühlt und geöffnet. Die Inhalte wurden zu einem 2-Liter-Rundhalskolben unter Verwendung von Methanol (MeOH) überführt und das Lösungsmittel auf einem Buchii-Verdampfer eingedampft. 1:1 H₂O/MeOH (600 ml) wurde zu dem Rest zugegeben und die resultierende braune Suspension wurde 4 bis 5 h unter Rückfluß erhitzt. Die resultierende Suspension wurde auf dem Buchii-Verdampfer eingedampft, um Methanol (≈ 1/2 Volumen) zu entfernen. Außerdem wurde H₂O (≈ 300 ml) zugegeben und das Gemisch wurde erhitzt, mit Holzkohle behandelt und durch ein Celite-Filterpad filtriert. Beim Abkühlen bildete sich ein kristalliner Feststoff. Der Feststoff wurde durch Filtration isoliert, mit H₂O gewaschen und unter hohem Vakuum bei 90°C getrocknet, wodurch das Produkt (43,7 g, 89% Ausbeute) als gelbbrauner Feststoff erhalten wurde. UV- und NMR-Spektren dieser Verbindung wurden mit Literaturwerten verglichen.
Die Variation der Verfahrensweisen von Robins et al supra beseitigten die Notwendigkeit, flüssiges Ammoniak in dem Reaktionsgemisch zu verwenden, da das Ammoniakmolekül in situ aus dem Silazanreagens und dem Hydratwasser des Guanosinhydratausgangsmaterials erzeugt wird. Außerdem war die Verwendung von Chlortrimethylsilan nicht notwendig, noch war es notwendig, die Reaktion unter wasserfreien Bedingungen durchzuführen, eine Vorverdampfung durchzuführen oder die Parr-Bombe unter einer trockenen Stickstoffatmosphäre zu öffnen und erneut zu verschließen.
Beispiel 2
2,6-Diamino-9-(2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin & 2,6-Diamino-9-(3'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
Natriumhydrid (NaH) (2,1 g) wurde zu 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (10,5 g) in trockenem Dimethylformamid (DMF) (150 ml) zugegeben. Nach dem Rühren für 10 min wurde Iodpropan (6 ml) zugegeben. Die Lösung wurde für 45 min bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt von der Zugabe eines weiteren aliquoten Teils von NaH (600 mg). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt und dann durch die Zugabe von Ethanol (EtOH) (5 ml) gequencht. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingedampft, der Rest in 10% MeOH/CH₂Cl₂ suspendiert und durch Kieselgelchromatographie (300 g) unter Verwendung von 5 → 10% MeOH/CH₂Cl₂ als Elutionsmittel gereinigt. Das 2',3'-Di-O-propyl-Produkt eluierte zunächst, gefolgt von dem 2'-O-Propyl-Produkt und dann dem 3'-O-Propyl-Produkt. Die 2'-O-Propyl-Produkt-enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und das Lösungsmittel abgestreift, wodurch ein roher Schaum erhalten wurde. Der Schaum wurde aus H₂O (40 ml) kristallisiert, mit kaltem H₂O gewaschen und getrocknet, wodurch 2,9 g der 2'-O-Propylverbindung erhalten wurden. Die Mutterlauge wurde eingedampft, wieder chromatographiert und kristallisiert, wodurch zusätzliche 2,4 g der 2'-O-Propylverbindung erhalten wurden. Die zweite Mutterlauge wurde eingedampft, wodurch 4 g eines Gemisches aus 2'- und 3'-O-Propylverbindungen als Öl erhalten wurden. Fraktionen, die das 3'-O-Propylprodukt als Hauptprodukt enthalten, wurden eingedampft und der Rest aus Wasser kristallisiert. (Siehe Beispiel 17 nachstehend für die Isolation und Charakterisierung der 2',3'-Di-O-propylverbindung).
2,6-Diamino-9-(2'-O-Propyl-β-D-ribofuranosyl)purin

¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,76 (t, 3, CH ₃), 1,4 (tq, 2, CH ₂), 3,3 (m, 1, H-5'' + HDO), 3,65–3,45 (m, 3, H-5', O-CH ₂), 3,9 (m, 1), 4,25 (br m, 1), 4,38 (dd, 1), 5,1 (br d, 1 3'-OH), 5,45 (br t, 1, 5'-OH), 5,75 (br s, 2, 6-NH ₂), 5,83 (d, 1, H-1'), 6,77 (br s, 2, 2-NH ₂) und 7,95 (s, 1, H-8), Anal. Berechnung für C₁₃H₂₀N₆O₄·½H₂O: C, 46,91; H, 6,2; N, 25,25. Gefunden: C, 47,09; H, 6,37; N, 25,33.

2,6-Diamino-9-(3'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl]purin

¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,75 (t, 3, CH ₃), 1,4 (tq, 2, CH ₂), 3,27–3,5 (ABX 2, O-CH ₂-), 3,5 und 3,6 (ABX, 2, H-5'), 3,9 (m, 1), 4,22 (m, 1), 4,35 (m, 1), 5,1 (br d, 1, 2'-OH), 5,45 (br t, 1, 5'-OH), 5,75 (br s, 2, 6-NH ₂), 5,8 (d, 1, H-1'), 6,8 (br s, 2CH ₂, 2-H ₂) und 7,95 (s, 1, H-8).

Beispiel 3
2'-O-Propylguanosin
Ein Gemisch aus 2,6-Diamino-9-(2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin und 2,6-Diamino-9-(3'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin (4,6 g) und Adenosindeaminase (200 mg, Sigma Chemicals Type II) wurden bei Raumtemperatur über Nacht in 0,1 M Trispuffer (150 ml, pH 7,4), DMSO (100 ml) und 0,1 M Natriumphosphatpuffer (10 ml) gerührt. Ein weiterer aliquoter Teil von Adenosindeaminase (140 mg) in 0,1 M Phosphatpuffer (30 ml) und DMSO (20 ml) wurde zugegeben und die Reaktion weitere 24 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingedampft und der Rest auf Kieselgel unter Verwendung von 5 → 20% MeOH/CH₂Cl₂ flashchromatographiert. Die Produkt-enthaltenden Fraktionen wurden im Vakuum eingedampft und der Rest aus H₂O kristallisiert, wodurch 2,6 g des Produktes erhalten wurden. Smp. zers. > 270°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,75 (t, 3, CH ₃), 1,42 (tq, 2, CH ₂), 3,3–3,6 (m, 4, H-5', O-CH ₂), 3,85 (m, 1), 4,2 (m, 1), 4,23 (m, 1), 5,10 (t, 1, 5'-OH), 5,13 (d, 1, 3'-OH), 5,75 (d, 1, H-1'), 6,45 (br s, 2, NH ₂), 7,95 (s, 1, H-8) und 10,67 (br s, 1, NH), Anal. Berechnung für C₁₃H₁₉N₅O₅: C, 47,99; H, 5,89; N, 21,53, Gefunden: C, 47,90, H, 5,85; N, 21,44.
Beispiel 4
N2-Isobutyryl-2'-O-propylguanosin
2'-O-Propylguanosin (3,6 g) in Pyridin (50 ml) wurde in einem Eisbad abgekühlt und Trimethylsilylchlorid (8,4 ml, 6 val) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 30 min gerührt und Isobutyrylchlorid (5,8 ml, 5 val) wurde zugegeben. Die Lösung wurde für 4 Stunden gerührt, während sie sich auf Raumtemperatur erwärmen konnte. Die Lösung wurde abgekühlt, H₂O zugegeben (10 ml) und die Lösung wurde für weitere 30 min gerührt. Konzentriertes NH₄OH (10 ml) wurde zugegeben und die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rest wurde durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von 10% MeOH/CH₂Cl₂ unter Elution des Produktes gereinigt. Die Produkt-enthaltenden Fraktionen wurden eingedampft, wodurch 2,5 g des Produktes als Schaum erhalten wurden. Eine analytische Probe wurde erneut auf Silici umdioxid chromatographiert und mit CH₂Cl₂ → 6% MeOH/CH₂Cl₂ eluiert. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,75 (t, 3, CH ₃), 1,13 [d, 6, CH(CH ₃)₂], 1,4 (m, 2, CH₂), 2,75 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,52 (m, 6, OCH ₂), 3,36 und 3,6 (ABX, 2, H-5'), 3,95 (m, 1), 4,26 (m, 1), 4,33 (m, 1), 5,07 (t, 1, 5'-OH), 5,18 (d, 1, 3'-OH), 5,9 (d, 1, H-1'), 8,25 (s, 1, H-8), 11,65 (br s, 1, NH) und 12,1 (br s, 1, NH), Anal. Berechnung für C₁₇H₂₅N₅O₆·1/2 H₂O: C, 50,49; H, 6,48; N, 17,32, Gefunden: C, 50,81; H, 6,62; N, 17,04.
Beispiel 5
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-propylguanosin
N2-Isobutyryl-2'-O-propylguanosin (2,64 g) wurde mit Pyridin co-eingedampft und dann in Pyridin (180 ml) löslich gemacht. Dimethoxytritylchlorid (2,4 g, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin (50 mg) wurden unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt und im Vakuum eingedampft. Der Rest wurde zwischen CH₂Cl₂/2 × verd. Na₂CO₃ partioniert. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und verdampft. Der Rest wurde durch Kieselgelchromatographie gereinigt (1:1 EtOAc/Hex → 5% MeOH/EtOAc, 1% TEA), wodurch 4,1 g des Produktes erhalten wurden. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,78 (t, 3, CH ₃), 1,12 [d, 6, CH(CH ₃)₂], 1,46 (m, 2, CH ₂), 2,75 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,35 und 3,55 (ABX, 2, H-5'), 3,73 (s, 6, OCH ₂), 4,0 (m, 1), 4,3 (m, 1), 4,4 (m, 1), 5,18 (d, 1, 3'-OH), 5,93 (d, 1, H-1'), 6,8, 7,2, 7,36 (m, 13, DMTr), 8,13 (s, 1, H-8), 11,63 (br s, 1, NH) und 12,1 (br s, 1, NH), Anal. Berechnung für C₃₈H₄₂N₅O₈·H₂O: C, 63,83; H, 6,20; N, 9,80, Gefunden: C, 64,22; H, 6,35; N, 9,55.
Beispiel 6
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-propylguanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
Eine CH₂Cl₂-Lösung aus N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-propylguanosin (4,1 g), Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit (3,7 ml, 2 val) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (0,5 g, 0,5 val) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde erneut zwischen verd. Na₂CO₃ und dann verd.
Na₂CO₃/NaCl partitioniert und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingedampft und der Rest wurde durch Kieselgelchromatographie gereinigt (120 g, 1% TEA in EtOAc), wodurch 5,2 g des Produktes als Schaum erhalten wurden. ³¹P NMR (CDCl₃) δ 150,5, 150,8.
Beispiel 7
2,6-Diamino-9-(2'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin & 2,6-Diamino-9-(3'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (10 g) wurde mit Natriumhydrid (1,7 g, 1,2 val) und Brompentan (5,3 ml, 1,2 val) in DMF (90 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 2 behandelt. Kieselgelchromatographie ergab drei Komponenten. Die erste eluierte Komponente (nicht charakterisiert, aber es wird angenommen, daß es die 2,3-Di-(O-pentyl)-Verbindung ist) wurde als ein Öl (700 mg) isoliert. Die nächste Komponente, isoliert als ein Schaum (3,3 g) wurde aus MeOH kristallisiert, wodurch 2,8 g 2,6-Diamino-9-(2'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin erhalten wurde. Die dritte Komponente, isoliert als ein Feststoff (200 mg), wurde aus MeOH kristallisiert, wodurch 80 mg 2,6-Diamino-9-(3'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin erhalten wurde. Die Fraktionen, die Gemische aus der ersten und zweiten Komponente enthalten, wurden eingedampft und der Rest aus MeOH kristallisiert, wodurch weitere 900 mg der 2-O-Pentylverbindung erhalten wurden. Eine weitere Fraktion ergab 1,2 g eines Gemisches aus 2'-O-Pentyl und 3'-O-Pentylverbindungen.
2,6-Diamino-9-(2'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin

¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,75 (t, 3, CH ₃), 1,16 (m, 4, CH ₂), 1,39 (m, 2, CH ₂), 3,53 (m, 2, CH ₂), 3,3 und 3,6 (ABX, 2, H-5'), 3,93 (br s, 1), 4,23 (m, 1), 4,38 (m, 1), 5,1 (d, 1 3'-OH), 5,5 (t, 1, 5'-OH), 5,75 (br s, 2, 6-NH ₂), 5,82 (d, 1, H-1'), 6,8 (br s, 2, 2-NH ₂) und 7,93 (s, 1, H-8).

2,6-Diamino-9-(3'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin

¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,87 (t, 3, CH ₃), 1,3 (m, 4, CH ₂), 1,55 (m, 2, CH ₂), 3,5 (m, 2, O-CH ₂-), 3,6 (m, 2, H-5'), 3,86 (m, 1), 3,95 (m, 1), 4,6 (m, 1), 5,32 (br d, 1 2'-OH), 5,46 (br t, 1, 5'-OH), 5,70 (d, 1, H-1'), 5,75 (br s, 2, 6-NH ₂), 6,76 (br s, 2, 2-NH ₂) und 7,93 (s, 1, H-8).

Beispiel 8
2'-O-Pentylguanosin
2,6-Diamino-9-(2'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin (1,9 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (50 ml, pH 6,0) und DMSO (25 ml) wurde mit Adenosindeaminase (zugegeben in zwei aliquoten Teilen – erster aliquoter Teil 50 mg, zweiter aliquoter Teil 80 mg) bei 35°C wie für die Verfahrensweise von Beispiel 3 behandelt, wodurch 1,4 g des Produktes erhalten wurden. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,8 (t, 3, CH ₃), 1,16 (m, 4, 2 × CH ₂), 1,4 (m, 2, CH ₂), 3,38, 3,6 (m, 4, OCH ₂, H-5'), 3,93 (s, 1, H-4'), 4,28 (m, 2, H-2', H-3'), 5,17 (br, 2,5', 3'-OH), 5,8 (d, 1, H-1'), 6,53 (br s, 2, NH ₂), 8,0 (s, 1, H-8) und 10,68 (br, 1, NH).
Beispiel 9
N2-Isobutyryl-2'-O-pentylguanosin
2'-O-Pentylguanosin (2,3 g) in Pyridin (35 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (4,15 ml, 5 val) und Isobutyrylchlorid (3,4 ml, 5 val) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum (2,3 g) erhalten wurde. Eine analytische Probe wurde aus EtOAc/Hex kristallisiert. Smp. 178–180°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,75 (t, 3, CH ₃), 1,1 [m, 10, 2 × CH ₂, CH(CH ₃)₂], 1,4 (m, 2, CH ₂), 2,74 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,56 (m, 4, OCH ₂, H-5'), 3,93 (m, 1, H-4'), 4,25 (m, 1), 4,34 (m, 1), 5,05 (t, 1, 5'-OH), 5,17 (d, 1, 3'-OH), 5,88 (d, 1, H-1'), 8,27 (s, 1, H-8), 11,65 (br s, 1, NH) und 12,05 (br s, 1, NH), Anal. Berechnung für C₁₉H₂₉N₅O₆: C, 53,89; H, 6,90; N, 16,54, Gefunden: 53,75; H, 6,92; N, 16,40
Beispiel 10
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-pentylguanosin
N2-Isobutyryl-2'-O-pentylguanosin (2,3 g) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (1,7 g, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin (100 mg als Katalysator) in Pyridin (50 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 5 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde (2,9 g). ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,83 (t, 3, CH ₃), 1,2 [m, 10, 2 × CH ₂, CH(CH ₃)₂], 1,48 (m, 2, CH ₂), 2,78 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,4, 3,6 (m, 4, OCH ₂, H-5'), 3,75 (s, 6, OCH ₃), 4,07 (m, 1), 4,27 (m, 1), 4,42 (m, 1), 5,2 (br d, 1, 3'-OH), 5,95 (d, 1, H-1'), 6,85, 7,25, 7,38 (m, 13, DMTr), 8,15 (s, 1, H-8), 11,67 (br s, 1, NH) und 12,1 (br s, 1, NH), Anal. Berechnung für C₄₀H₄₇N₅O₈·1/2H₂O: C, 65,38; H, 6,58; N, 9,53, Gefunden: C, 65,37; H, 6,59; N, 9,39.
Beispiel 11
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-pentylguanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-pentyl-guanosin (1,7 g) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethyl-phosphit (1,48 g) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (200 mg) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 6 behandelt, wodurch das Produkt erhalten wurde (1,4 g). ³¹P NMR (CDCl₃) δ 150,5, 150,85.
Beispiel 12
2,6-Diamino-9-(2'-O-nonyl-β-D-ribofuranosyl)purin
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (50 g, 180 mmol) wurde mit Natriumhydrid (8,8 g, 220 mmol) und Bromnonan (59 g, 54,4 ml, 285 mmol) in DMF (700 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 2 behandelt (die Diaminoverbindung in DMF wurde in einem Eisbad während der Zugabe von NaH abgekühlt), wodurch 83 g des Rohproduktes erhalten wurden. 50 g des Rohproduktes wurden durch Kieselgelchromatographie gereinigt. Die Fraktionen, die 2'-O-Nonyl- und 3'-O-Nonylprodukt enthalten, wurden vereinigt, wodurch ein 77:23-Gemisch (29 g) des 2'- und 3'-Produktes er halten wurde. Reines 2'-O-Nonylprodukt wurde durch Chromatographie erhalten.
¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,95 (t, 3, CH ₃); 1,17 [m, 12, O-CH₂-CH₂-(CH ₂)₆]; 1,42 [m, 2, O-CH₂CH ₂(CH₂)₆]; 3,27–3,70 (m, 2, H-5'); 3,50–3,70 [m, 2, O-CH ₂(CH₂)₇]; 3,95 (m, 1, H-4'), 4,24 (m, 1, H-3'); 4,40 (m, 1, H-2'); 5,10 (d, 1, 3'-OH, J = 5 Hz); 5,50 (t, 1, 5'-OH, J = 6 Hz); 5,76 (s, 2, 2-NH ₂); 5,83 (d, 1, H-1', J = 6,0 Hz); 6,81 (s, 2, 6-NH ₂); und 7,96 (s, 1, 8-H).
Beispiel 13
2'-O-Nonylguanosin
Ein Gemisch aus 2,6-Diamino-9-(2'-O-nonyl-β-D-ribofuranosyl)purin und 2,6-Diamino-9-(3'-O-nonyl-β-D-ribofuranosyl)purin (≈ 80:20-Gemisch, 29 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (50 ml, pH 7,4), 0,1 M Trispuffer (1800 ml, pH 7,4) und DMSO (1080 ml) wurde mit Adenosindeaminase (1,6 g) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 3 behandelt, wodurch 60 g des Produktes als Öl erhalten wurden. Ein analytisches Produkt wurde durch Kieselgelchromatographie gereinigt und aus EtOAc umkristallisiert. Smp. 258–259°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,96 (t, 3, CH ₃, J = 7 Hz); 1,17 [m, 12, O-CH₂-CH₂-(CH ₂)₆]; 1,42 [m, 2, O-CH₂CH ₂(CH₂)₆]; 3,27–3,61 (m, 4, H-5', O-CH ₂(CH₂)₇]; 3,95 (m, 1, H-4'), 4,10–4,13 (m, 2, H-2', H-3'); 5,13–6,06 (m, 2, 3'-OH5'-OH); 5,80 (d, 1, H-1', J = 6,4 Hz); 6,47 (s, 2, 2-NH ₂); 7,98 (s, 1, 8-H) und 10,64 (s, 1, N₁ Amid), Anal. Berechnung für C₁₉H₃₁N₅O₅: C, 55,73; H, 7,63; N, 17,10, Gefunden: C, 55,67; H, 7,66; N, 17,02.
Beispiel 14
N2-Isobutyryl-2'-O-nonylguanosin
2'-O-Nonylguanosin (14,7 g) in Pyridin (360 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (23,4 ml) und Isobutyrylchlorid (30,6 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Rohprodukt erhalten wurde (37 g). Das Rohmaterial wurde durch Kieselgelchromatographie gereinigt (unter Elution mit 90/10 CHCl₃/MeOH), wodurch 14,6 g des Produktes erhalten wurde, das aus EtOAc umkristallsiert wurde. Smp. 168–169°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,85 [t, 3, CH ₃(nonyl)], 1,14 [m, 18, O-CH₂CH₂(CH ₂)₆, CH(CH ₃)₂], 1,40 [m, 2, O-CH₂CH ₂(CH₂)₆], 2,79 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,31–3,63 (m, 4, H-5', O-CH ₂(CH₂)₇]; 3,96 (m, 1, H-4'), 4,27–4,37 (m, 2, H-2', H-3'); 5,10 (t, 1, 5'-OH, J = 5 Hz), 5,18 (d, 1, 3'-OH, J = 4 Hz), 5,91 (d, 1, H-1', J = 6,6 Hz), 8,31 (s, 1, 8-H), 11,73 (s, 1, C₂-Amid) und 12,11 (s, 1, N₁-Amid). Anal. Berechnung für C₂₃H₃₇N₅O₆: C, 57,60; H, 7,78; N, 14,60, Gefunden: C, 57,63; H, 7,92; N, 14,62.
Beispiel 15
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-nonylguanosin
N2-Isobutyryl-2'-O-nonylguanosin (14,6 g, 30,4 mmol) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (12,1 g, 34 mmol) in Pyridin (200 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 5 behandelt, wodurch 16 g des purpurnen Schaums vor der Chromatographie und 11,5 g nach der Chromatographiereinigung erhalten wurden. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,84 [t, 3, CH ₃ (nonyl), J = 7 Hz], 1,16 [m, 18, O-CH₂CH₂(CH ₂)₆, CH(CH₃)₂], 1,43 [m, 2, O-CH₂CH ₂(CH₂)₆], 2,77 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,18–3,63 (m, 4, H-5', O-CH ₂(CH₂)₇]; 3,74 (s, 6, DMTr O-CH ₃) 4,06 (m, 1, H-4'), 4,27 (m, 1, H-3'); 4,42 (m, 1, H-2'); 5,19 (d, 1, 3'-OH, J = 5 Hz), 5,94 (d, 1, H-1', J = 5,7 Hz), 6,83–7,38 (m, 13, DMTr aromatisch), 8,14 (s, 1, 8-H), 11,65 (s, 1, C₂-Amid) und 12,11 (s, 1, N₁-Amid). Anal. Berechnung für C₄₄H₅₅N₅O₈: C, 67,59; H, 7,27; N, 8,96, Gefunden: C, 67,59; H, 7,11; N, 8,80.
Beispiel 16
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-nonylguanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-nonylguanosin (2,1 g) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethyl-phosphit (1,5 g) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (0,2 g) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 6 behandelt, wodurch das Produkt (2,0 g) erhalten wurde. ³¹P NMR (CDCl₃) δ 150,7 und 150,4 (Diastereomere).
Beispiel 17
2,6-Diamino-9-(2',3'-di-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
Die Verfahrensweise von Beispiel 2 wurde unter Verwendung von 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (10 g), NaH (3 g) und 1-Brompropan (10 ml) in DMF wiederholt. Nach der Verdampfung des Reaktionslösungsmittels wurden die Reaktionsprodukte durch Kieselgelchromatographie gereinigt. Die sich langsamer bewegende Komponente ergab 4,3 g des 2'-O-Propylproduktes als Schaum. Dieser Schaum wurde aus Wasser kristallisiert, wodurch 3,6 g des Produktes erhalten wurden. Die sich schneller bewegende Komponente, die als Öl isoliert wurde, bildete Kristalle beim Stehenlassen. EtOH wurde zu den Kristallen zugegeben, sie wurden filtriert und 1 × EtOH gewaschen, wodurch 1,1 g 2',3'-Di-O-propylprodukt erhalten wurden. Smp. 165–167°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,80 und 0,92 (t, 6, CH ₃), 1,6 und 1,45 (m, 4, CH ₂), 3,7–3,45 (br m, 6), 4,07 (m, 2), 4,5 (dd, 1), 5,55 (br t, 1, 5'-OH), 5,8 (br s, 2, 6-NH ₂), 5,85 (d, 1, H-1'), 6,84 (br s, 2, 2-NH ₂) und 8,0 (s, 1, H-8). Anal. Berechnung für C₁₆H₂₆N₆O₄: C, 52,45; H, 7,15; N, 22,94. Gefunden: C, 52,18; H, 7,19; N, 22,75.
Beispiel 18
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
2,6-Diamino-9-(2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin (2,0 g) in Pyridin (35 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (3,9 ml, 5 val) und Isobutyrylchlorid (3,2 ml, 5 val) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 4 behandelt, wodurch ein Schaum nach der Kieselgelchromatographie erhalten wurde. Der Schaum wurde aus EtOAc/Hex kristallisiert, wodurch 2,2 g des Produktes erhalten wurden. Smp. 140–142°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,77 (t, 3, CH ₃), 1,07, 1,16 [d, 12, 2 × CH(CH ₃)₂], 1,5 (m, 2, CH ₂), 2,9, 3,03 [m, 2, 2 × CH(CH₃)₂], 3,4 (m, 1, H-5''), 3,58 (m, 3, OCH ₂, H-5'), 3,95 (m, 1, H-4'), 4,3 (m, 1), 4,5 (m, 1), 5,02 (t, 1, 5'-OH), 5,2 (d, 1, 3'-OH), 6,03 (d, 1, H-1'), 8,58 (s, 1, H-8), 10,39 (br s, 1, NH) und 10,57 (br s, 1, NH).
Beispiel 19
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(2'-O-propyl-β-D-ribo-furanosyl)purin (1,9 g) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (1,5 g, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin (20 mg als Katalysator) in Pyridin (50 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 5 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde (2,8 g). ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,79 (t, 3, CH ₃), 1,07, 1,16 [d, 12, 2 × CH(CH ₃)₂], 1,5 (m, 2, CH ₂), 2,9, 3,03 [m, 2, 2 × CH(CH₃)₂], 3,58 (m, 3, OCH ₂, H-5'), 4,15 (m, 1, H-4'), 4,4 (m, 1), 4,6 (m, 1), 5,15 (d, 1,3'-OH), 6,15 (d, 1, H-1'), 6,8–7,35 (m, 13, DMTr), 8,5 (s, 1, H-8), 10,3 (br s, 1, NH) und 10,57 (br s, 1, NH).
Beispiel 20
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl/purin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin (2,6 g) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit (1,7 g) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (300 mg) über Nacht bei Raumtemperatur behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde erneut verd. Na₂CO₃/CHCl₂ und dann Na₂CO₃/NaCl partitioniert und über MgSO₄ getrocknet. Die organische Schicht wurde zu einem Schaum eingedampft. Der Schaum wurde in CH₂Cl₂ (≈ 8 ml) gelöst und langsam zu Hexanen (500 ml) zugegeben. Der Feststoff wurde filtriert und getrocknet, wodurch das Produkt als Pulver erhalten wurde (3,1 g). ³¹P NMR (CDCl₃) δ 150,8 und 151,3.
Beispiel 21
2,6-Diamino-9-[2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin & 2,6-Diamino-9-[3'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]-β-D-ribo-furanosyl]purin
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (14,2 g) wurde mit Natriumhydrid (3 g, 1,5 val) und N-(3-Brompropyl)phthalimid (5,3 ml, 1,5 val) in DMF (20 g) bei 70°C über Nacht behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen H₂O und Hexanen (1×) aufgeteilt und die wässerige Schicht dann 4 × CH₂Cl₂ extrahiert. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und zu einem Rest eingedampft. Der Rest wurde durch Kieselgelchromatographie unter Elution mit MeOH/CH₂Cl₂ gereinigt. Das 2'-O-(N-Phthalimido)propylprodukt eluierte zuerst, gefolgt von gemischten Fraktionen und dann das 3'-O-(N-Phthalimido)produkt. Die Verdampfungen der Fraktionen ergab 3,4 g des 2'-O-(N-Phthalimido)propylproduktes, 3,0 g gemischte 2'- und 3'-Produkte und 1,4 g des 3'-O-(N-Phthalimido)propylproduktes alle als Schäume. Das 3'-O-(N-Phthalimido)propylprodukt wurde aus EtOAc/MeOH kristallisiert, wodurch 270 mg Feststoff erhalten wurden.
2,6-Diamino-9-[2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin

¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,8 (tq, 2, -CH ₂-), 3,4–3,58 (m, 6, 2 × CH ₂, H-5'), 3,9 (m, 1), 4,26 (m, 1), 4,37 (m, 1), 5,05 (br d, 1, 3'-OH), 5,4 (br t, 1, 5'-OH), 5,72 (br s, 2, NH ₂), 5,8 (br d, 1, H-1'), 6,75 (br s, 2, NH ₂), 7,8 (br s, 4, Ar) und 8,93 (s, 1, H-8).

2,6-Diamino-9-[3'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin

Smp. 220–222°C, ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,85 (tq, 2, -CH-N), 3,6–3,67 (m, 4, -O-CH ₂, H-5'), 3,85 (m, 1), 3,92 (m, 1), 4,6 (m, 1), 5,33 (d, 1, 2'-OH), 5,45 (br t, 1, 5'-OH), 5,65 (d, 1, H-1'), 5,73 (br s, 2, NH ₂), 6,75 (br d, 2, NH ₂), 7,8–7,85 (m, 4, Ar) und 7,85 (s, 1, H-8). Anal. Berechnung für C₂₁H₂₃N₇O₆: C, 53,73; H, 4,94; N, 20,88, Gefunden: C, 53,59; H, 4,89; N, 20,63.

Beispiel 22
2'-O-[(N-Phthalimido)prop-3-yl]guanosin
2,6-Diamino-9-[2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin (3,1 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (3 ml, pH 7,4), 0,05 M Trispuffer (65 ml, pH 7,4) und DMSO (45 ml) wurde mit Adenosindeaminase (200 mg) bei Raumtemperatur für 5 Tage wie für die Verfahrensweise von Beispiel 3 behandelt. Die Produktenthaltenden Fraktionen aus der Kieselgelchromatographie wurden eingedampft und bildeten bei der Konzentration weiße Kristalle. Die Kristalle wurden filtriert und mit MeOH gewaschen, wodurch 1,1 g des Produktes erhalten wurden. Eine analytische Probe wurde aus MeOH umkristallisiert. Smp. 192–194°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,82 (m, 2, CH ₂), 3,45–3,67 (m, 6, H-5', OCH ₂, NCH ₂), 3,9 (m, 1), 4,3 (m, 2, H-2', H-3'), 5,1 (m, 2,5' und 3'-OH), 5,8 (d, 1, H-1'), 6,5 (br s, 2, NH ₂), 7,83 (s, 4, Phthal), 7,98 (s, 1, H-8) und 10,5 (br s, 1, NH). Anal. Berechnung für C₂₁H₂₂N₆O₇·1/2H₂O: C, 52,61; H, 4,83; N, 17,53. Gefunden: C, 52,52; H, 4,78; N, 17,38.
Beispiel 23
N2-Isobutyryl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin
2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin (7,2 g, roh) in Pyridin (35 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (11,6 ml, 5 val) und Isobutyrylchlorid (8 ml, 5 val) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Produkt als roher Schaum erhalten wurde (6,5 g). Eine analytische Probe wurde durch Kristallisation aus EtOAc erhalten. Smp. 166–168°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,15 [d, 6, -CH(CH ₃)₂], 1,85 (m, 2, CH ₂), 2,8 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,45–3,7 (m, 6, H-5', OCH ₂, NCH ₂), 3,95 (m, 1), 4,34 (m, 1), 4,4 (m, 1), 5,12 (t, 1, 5'-OH), 5,18 (d, 1, 3'-OH), 5,9 (d, 1, H-1'), 7,83 (s, 4, Phthal), 8,3 (s, 1, H-8), 11,65 (br s, 1, NH) und 12,1 (br s, 1, NH). Anal. Berechnung für C₂₅H₂₈N₆O₈·1/2H₂O: C, 54,64; H, 5,32; N, 15,29. Gefunden: C, 54,46; H, 5,39; N, 14,98.
Beispiel 24
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin
N2-Isobutyryl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin (1,2 g) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (820 mg, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin (20 mg als Katalysator) in Pyridin (50 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 5 unter Verwendung von 1:1 Hex/EtOAc, dann EtOAc dann 5% MeOH/EtOAc mit 1% TEA als Elutionsmittel behandelt. Die Produkt-enthaltenden Fraktionen wurden eingedampft, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde (1,7 g). ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,1 [d, 6, -CH(CH ₃)₂], 1,85 (m, 2, CH ₂), 2,75 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,45–3,7 (m, 6, H-5', OCH ₂, NCH ₂), 3,75 (s, 6, OCH ₃), 4,0 (m, 1), 4,32 (m, 1), 4,4 (m, 1), 5,2 (d, 1, 3'-OH), 5,93 (d, 1, H-1'), 6,83, 7,2, 7,35 (m, 13, DMTr), 7,78 (s, 4, Phthal), 8,15 (s, 1, H-8), 11,6 (br s, 1, NH) und 12,05 (br s, 1, NH). Anal. Berechnung für C₄₆H₄₆N₆O₁₀·H₂O: C, 64,18; H, 5,62; N, 9,76. Gefunden: C, 64,42; H, 5,78; N, 9,53.
Beispiel 25
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin (1,6 g) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit (1,48 g) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (200 mg) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 6 behandelt, wodurch das Produkt erhalten wurde (2,0 g). ³¹P NMR (CDCl₃) δ 150,9.
Beispiel 26
N2-Dimethylaminomethyliden-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin
2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin (900 mg) in DMF (20 ml) wurde mit N,N-Dimethylformamiddimethylacetal (2 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde für 2 h gerührt und unter hohem Vakuum bei 52°C eingedampft. Der Rest wurde 1 × mit Pyridin co-eingedampft und in Lösung in Pyridin aufgenommen. Dimethoxytritylchlo rid (713 mg, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin (20 mg als Katalysator) wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über nacht gerührt, zwischen Na₂CO₃/CH₂Cl₂ partitioniert, über MgSO₄ getrocknet und durch Kieselgelchromatographie wie für die Verfahrensweise von Beispiel 5 gereinigt, wodurch 1,7 g des Produktes als gebrochen weißer Feststoff erhalten wurden. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,88 (m, 2, CH ₂), 3,1 [d, 6, N=CHN(CH ₃)₂], 3,3 (m, 2, H-5'), 3,67 (m, 4, OCH ₂, NC₂), 3,78 (s, 6, 2 × OCH ₃), 4,0 (m, 1, H-4'), 4,35 (m, 2, H-2', H-3'), 5,2 (d, 1,3'-OH), 5,95 (d, 1, H-1'), 6,85, 7,25, 7,39 (m, 13, DMTr), 7,85 (s, 4, Phthal), 7,95 [s, 1, H-8), 8,5 (s, 1, N=CHN(CH₃)₂] und 11,39 (s, 1, NH ₂). Anal. Berechnung für C₄₅H₄₅N₇O₉·1/2H₂O: C, 64,58; H, 5,54; N, 11,71. Gefunden: C, 64,10; H, 5,65; N, 11,47.
Beispiel 27
N2-Dimethylaminomethyliden-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
N2-Dimethylaminomethyliden-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin (1,7 g), Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit (1,4 ml) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (170 mg) wurden über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen CH₂Cl₂ und Na₂CO₃ (2 ×) partitioniert. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und zu einem Öl eingedampft. Das Öl wurde in einem Minimum von CH₂Cl₂ gelöst und tropfenweise zu 900 ml Hexanen zugegeben, um das Produkt auszufällen. Der Feststoff wurde isoliert und getrocknet, wodurch 2,1 g des Produktes erhalten wurden. ¹P NMR (CDCl₃) δ 150,4, 150,6.
Beispiel 28
2,6-Diamino-9-[2'-O-(N-phthalimido)pent-5-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin
2,6-Diamino-(9-β-D-ribofuranosyl)purin (6,7 g) wurde mit Natriumhydrid (1,3 g) und N-(5-Brompentyl)phthalimid (7,8 g, 1,1 val) in DMF (60 ml) bei Raumtemperatur für drei Tage behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen H₂O und CH₂Cl₂ partitioniert und 4 × CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Der Rest wurde durch Kieselgelchromatographie unter Elution mit 5 → 10% MeOH/CH₂Cl₂ gereinigt. Die 2'-O-(N-Phthalimido)pentyl-enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und zu einem gelben Schaum eingedampft, wodurch 2,2 g des Produktes erhalten wurden. Eine analytische Probe wurde aus EtOH kristallisiert. Smp. 173–175°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,2 (m, 2, -CH ₂-), 1,47 (m, 4, 2 × CH ₂), 3,55, 3,65 (m, 6, O-CH ₂, H-5', NCH ₂), 3,95 (m, 1), 4,28 (m, 1), 4,4 (m, 1), 5,13 (d, 1, 3'-OH), 5,5 (t, 1, 5'-OH), 5,77 (br s, 2, 6-NH ₂), 5,84 (br d, 1, H-1'), 6,8 (br s, 2, 2-NH ₂), 7,86 (M, 4, Phthal) und 7,95 (s, 1, H-8). Anal. Berechnung für C₂₃H₂₇N₇O₆: C, 55,50; H, 5,47; N, 19,71. Gefunden: C, 55,44; H, 5,51; N, 19,30.
Beispiel 29
2'-O-[(N-Phthalimido)pent-5-yl]guanosin
Ein Gemisch aus den 2,6-Diamino-9-[2'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin- und 2,6-Diamino-9-[3'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]-β-D-ribofuranosyl]purinisomeren (2,2 g) in 0,1 M Trispuffer (60 ml, pH 7,4), 0,1 M NaPO₄ Puffer (2 ml, pH 7,4) und DMSO (40 ml) wurde mit Adenosindeaminase (60 mg) bei Raumtemperatur für 5 Tage wie für die Verfahrensweise von Beispiel 3 behandelt. Die Produkt-enthaltenden Fraktionen aus der Kieselgelchromatographie wurden eingedampft, wodurch das Produkt (1,0 g) als roher weißer Feststoff erhalten wurde. Eine analytische Probe wurde durch die Addition von MeOH zur Bildung von Kristallen hergestellt. Smp. 178–180°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,24 (m, 2, CH ₂), 1,5 (m, 4, 2 × CH ₂), 3,5–3,6 (m, 6, H-5', OCH ₂, NCH ₂), 3,87 (m, 1, H-4'), 4,25 (m, 2, H-2', H-3'), 5,1 (m, 2, 5'- und 3'-OH), 5,78 (d, 1, H-1'), 6,5 (br s, 2, NH ₂), 7,84 (M, 4, Phthal), 7,98 (s, 1, H-8) und 10,67 (br s, 1, NH). Anal. Berechnung für C₂₃N₂₆N₆O₇·1/2H₂O: C, 54,43; H, 5,36; N, 16,56. Gefunden: C, 54,79; H, 5,24; N, 16,61.
Beispiel 30
N2-Isobutyryl-2'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]guanosin
2'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]guanosin (1,6 g, roh) in Pyridin (35 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (2,0 ml, 5 val) und Isobutyrylchlorid (1,68 ml, 5 val) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde. Dieser Schaum wurde 2 × mit EtOAc co-eingedampft, gefolgt von der Zugabe von EtOAc und Erhitzen, wodurch weiße Kristalle (950 mg) erhalten wurden. Smp. 202–204°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,1 [d, 6, -CH(CH ₃)₂], 1,17 (m, 2, CH ₂), 1,43 (m, 4, 2 × CH ₂), 2,74 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,45–3,55 (m, 6, H-5', OCH ₂, NCH ₂), 3,9 (m, 1), 4,25 (m, 1), 4,3 (m, 1), 5,07 (t, 1, 5'-OH), 5,15 (d, 1, 3'-OH), 5,87 (d, 1, H-1'), 7,8 (s, 4, Phthal), 8,27 (s, 1, H-8), 11,67 (br s, 1, NH) und 12,06 (br s, 1, NH). Anal. Berechnung für C₂₇H₃₂N₆O₈·1/2H₂O: C, 56,14; H, 5,76; N, 14,55. Gefunden: C, 56,45; H, 5,74; N, 14,41.
Beispiel 31
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]guanosin
N2-Isobutyryl-2'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]guanosin (0,95 g) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (620 mg, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin (20 mg als Katalysator) in Pyridin (50 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 5 unter Verwendung von EtOAc 1% TEA und dann 5% MeOH EtOAc/CH₂Cl₂ mit 1% TEA als Elutionsmittel behandelt. Die Produkt-enthaltenden Fraktionen wurden eingedampft, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde (1,4 g). ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,14 [d, 6, -CH(CH ₃)₂], 1,25 (m, 2, CH ₂), 1,53 (m, 4, 2 × CH ₂), 2,77 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,3–3,6 (m, 6, H-5', OCH ₂, NCH ₂), 3,75 (s, 6, OCH ₃), 4,07 (m, 1), 4,33 (m, 1), 4,4 (m, 1), 5,18 (d, 1, 3'-OH), 5,94 (d, 1, H-1'), 6,83, 7,2, 7,53 (m, 13, DMTr), 7,8 (s, 4, Phthal), 8,15 (s, 1, H-8), 11,6 (br s, 1, NH) und 12,1 (br s, 1, NH). Anal. Berechnung für C₄₈H₅₀N₆O₁₀·1/2H₂O: C, 65,52; H, 5,84; N, 9,55. Gefunden: C, 65,55; H, 5,94; N, 9,20.
Beispiel 32
2,6-Diamino-9-[3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl]purin
Zu einer Suspension aus 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (10,5 g) in Pyridin (100 ml) wurde 1,3-Dichlortetraisopropyldisiloxan (TIPDS, 12,6 g) zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden durchgeführt und weitere 1,3 g 1,3-Dichlortetraisopropyldisiloxan wurden zugegeben, gefolgt von Rühren über Nacht. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen und das nicht-lösliche Produkt (11,6 g) durch Filtration gesammelt. Eine analytische Probe wurde aus EtO-Ac/Hexanen umkristallisiert. Smp. 170–172°C. Anal. Berechnung für C₂₂H₄₀N₆O₅Si₂ 1/2H₂O: C, 49.5; H, 7.74; N, 15.7. Gefunden: 49.57; H, 7.82; N, 15.59.
Beispiel 33
2,6-Diamino-9-[3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-2-O-methyl-β-D-ribofuranosyl]purin
Ein Gemisch aus 2,6-Diamino-9-[3,5-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl]purin (8,8 g) in DMF (120 ml) und Methyliodid (3 ml, 3 val) wurde in einem Eisbad abgekühlt und NaH (60% in Öl, 1,0 g, 1,5 val) zugegeben. Nach 20 min wurde die Reaktion mit MeOH gequencht und zwischen ges. NH₄Cl und CH₂Cl₂ partitioniert. Die organische Phase wurde mit 1 × NH₄Cl gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Der Rest wurde aus heißem EtOH/H₂O kristallisiert, wodurch das Produkt (8,5 g) als Kristalle erhalten wurde. Smp. 87–89°C.
¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,05 (m, 28, TIPDS), 3,57 (s, 3, OCH ₃), 3,98 (m, 1, H-4'), 3,92 und 4,07 (ABX, 2, H-5'), 4,13 (d, 1), 4,6 (dd, 1, H-3'), 5,76 (br s, 2, NH ₂), 5,8 (s, 1, H-1'), 6,77 (br s, 2, NH ₂) und 7,77 (s, 1 H-8).
Beispiel 34
2,6-Diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
Zu einer Lösung aus 2,6-Diamino-9-[3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl]purin (8,5 g) in THF (50 ml) wurde 1 M Tetrabutylammoni umfluorid in THF (Aldrich, 20 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 2 h gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 2 × EtOAc gewaschen und getrocknet, wodurch 4,0 g des Rohproduktes erhalten wurden. Eine analytische Probe wurde aus heißem MeOH kristallisiert. Smp. 133–135°C.¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 3,3 (s, 3, OCH ₃), 3,58 (m, 2, H-5'), 3,98 (m, 1, H-4'), 4,28 (m, 2, H-2', H-3'), 5,23 (br s, 1, 3'-OH), 5,48 (br t, 1, 5'-OH), 5,77 (br s, 2, NH ₂), 5,82 (d, 1, H-1'), 6,83 (br s, 2, NH ₂) und 7,95 (s, 1, H-8). Anal. Berechnung für C₁₁H₁₆N₆O₄·1/2H₂O: C, 43,28; H, 5,61; N, 27,52. Gefunden: C, 43,51; H, 5,62; N, 27,26.
Beispiel 35
2'-O-Methylguanosin
2,6-Diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin (9,5 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (200 ml, pH 7,4) und DMSO (25 ml) wurde mit Adenosindeaminase (Typ II Sigma) bei RT für 4 Tage behandelt. Die resultierende Suspension wurde abgekühlt und filtriert, und der resultierende Filterkuchen mit H₂O gewaschen und zu einem weißen Feststoff getrocknet (4,0 g). Der Feststoff wurde aus heißem H₂O umkristallisiert, wodurch 2,9 g des Produktes erhalten wurden. Smp. 236–238°C. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 3,3 (s, 3, OCH ₃), 3,53 und 3,6 (ABX, 2, H-5'), 3,87 (m, 1, H-4'), 4,15 (m, 1, H-2'), 4,25 (m, 1, H-3'), 5,13 (t, 1, 5'-OH), 5,23 (d, 1, 3'-OH), 5,8 (d, 1, H-1'), 6,48 (br s, 2, NH ₂), 7,96 (s, 1, H-8) und 10,68 (br s, 1, NH). Anal. Berechnung für C₁₁H₁₅N₅O₅·1/2H₂O: C, 43,14; H, 5,26; N, 22,86. Gefunden: C, 43,59; H, 5,34; N, 23,04.
Beispiel 36
N2-Isobutyryl-2'-O-methylguanosin
2'-O-Methylguanosin (3,5 g) in Pyridin (100 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (9 ml, 6 val) und Isobutyrylchlorid (6,2 ml) bei RT für 4 h behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad abgekühlt, H₂O (20 ml) wurde zugegeben und das Rühren für weitere 20 min fortgesetzt. NH₄OH (20 ml) wurde zugegeben und nach dem Rühren für 30 min wurde das Reaktionsgemisch eingedampft. Der Rest wurde mit H₂O ver rieben, filtriert und das Filtrat eingedampft und durch Kieselgelchromatographie wie für die Verfahrensweise von Beispiel 4 gereinigt, wodurch das Produkt als gebrochen weißer Feststoff erhalten wurde (1,5 g). ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,1 [d, 6, CH(CH ₃)₂], 2,77 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,33–3,6 (m, 5, OCH ₃, H-5'), 3,93 (m, 1, H-4'), 4,22 (m, 1), 4,3 (m, 1), 5,1 (t, 1, 5'-OH), 5,28 (d, 1, 3'-OH), 5,9 (d, 1, H-1'), 8,28 (s, 1, H-8) und 11,9 (br s, 1, NH).
Beispiel 37
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-methylguanosin
N2-Isobutyryl-2'-O-methylguanosin (1,5 g) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (1,5 g, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin (100 mg als Katalysator) in Pyridin (50 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 5 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde (2,6 g). ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1,14 (d, 6, CH(CH ₃)₂], 2,75 [m, 1, CH(CH₃)₂], 3,5 (m, 2, H-5'), 3,74 (s, 6, OCH ₃), 4,05 (m, 1), 4,33 (m, 1), 5,26 (d, 1, 3'-OH), 5,95 (d, 1, H-1'), 6,83, 7,2, 7,35 (m, 13, DMTr), 8,15 (s, 1, H-8), 11,6 (br s, 1, NH) und 12,1 (br s, 1, NH).
Beispiel 38
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-methylguanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-methylguanosin (20 g) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit (10,8 g) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (1,6 g) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 6 behandelt, wodurch das Produkt erhalten wurde (15,7 g). ³¹P NMR (CDCl₃) δ 148,97 und 147,96.
Beispiel 39
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
2,6-Diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin (700 mg) in Pyridin (20 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (2,1 ml, 7 val) und Isobutyrylchlorid (1,25 ml, 5 val) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum (900 mg) nach der Kieselgelchromatographie erhalten wurde.
Beispiel 40
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin (900 mg) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (1,0 g) und Dimethylaminopyridin (20 mg als Katalysator) in Pyridin (30 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 5 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde (700 mg). ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,96 –1,16 [m, 12, 2 × CH(CH₃)₂], 2,9 und 3,05 [M, 2, 2 × CH(CH₃)₂], 3,18 und 3,37 (ABX, 2, H-5'), 3,38 (s, 3, OCH ₃), 3,7 (s, 6, OCH ₃), 4,05 (m, 1, H-4'), 4,44 (m, 2, H-2', H-3'), 5,24 (d, 1, 3'-OH), 6,06 (d, 1, H-1'), 6,78, 7,2, 7,33 (m, 13, Ar), 8,22 (s, 1, H-8), 10,3 (br s, 1, NH) und 10,57 (br s, 1, NH).
Beispiel 41
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin (600 mg) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit (500 μl) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (80 mg) über Nacht bei RT behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde erneut zwischen verd. Na₂CO₃/CHCl₂ und dann Na₂CO₃/NaCl partitioniert und über MgSO₄ getrocknet. Die organische Schicht wurde zu einem Schaum (500 mg) eingedampft. ³¹P NMR (CDCl₃) δ 151,1 (Dublett).
Beispiel 42
2,6-Diamino-9-(2'-O-octadecyl-b-D-ribofuranosyl)purin
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (50 g, 180 mmol) und Natriumhydrid (7 g) in DMF (1 l) wurden zum Sieden für 2 h erhitzt. Iodoctadecan (100 g) wurde bei 150°C zugegeben und das Reaktionsgemisch konnte sich auf RT abkühlen. Das Reaktionsgemisch wurde für 11 Tage bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und der Rest durch Kieselgelchromatographie gereinigt. Das Produkt wurde mit 5% MeOH/CH₂Cl₂ eluiert. Die Produkt-enthaltende Fraktion wurde eingedampft, wodurch das Produkt (11 g) erhalten wurde. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,84 (t, 3, CH ₂); 1,22 [m, 32, O-CH₂-CH₂-(CH ₂)₁₆-]; 1,86 (m, 2, O-CH₂CH ₂-); 3,25 (m, 2, O-CH₂-); 3,93 (d, 1, 4'H), 4,25 (m, 1, 3'H; 4,38 (t, 1, 2'H); 5,08 (d, 1,3'-OH); 5,48 (t, 1,5'-OH); 5,75 (s, 2,6-NH ₂); 5,84 (d, 1, 1'-H; 6,8 (s, 2, 2-NH ₂); und 7,95 (s, 1, 8-H).
Beispiel 43
2'-O-Octadecylguanosin
2,6-Diamino-9-(2'-O-octadecyl-β-D-ribofuranosyl)purin (10 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (50 ml, pH 7,4), 0,1 M Trispuffer (1000 ml, pH 7,4) und DMSO (1000 ml) wurde mit Adenosindeaminase (1,5 g) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 3 behandelt. An Tag 3, Tag 5 und Tag 7 wurde ein zusätzlicher aliquoter Teil (500 mg, 880 mg bzw. 200 mg) Adenosindeaminase zugegeben. Die Reaktion wurde für insgesamt 9 Tage gerührt und ergab nach der Reinigung durch Kieselgelchromatographie das Produkt (2 g). Eine analytische Probe wurde aus MeOH umkristallisiert.
¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,84 (t, 3, CH ₃), 1,22 [s, 32, O-CH₂-CH₂-(CH ₂)₁₆], 5,07 (m, 2, 3'-OH 5'-OH); 5,78 (d, 1,1'-H); 6,43 (s, 2, NH ₂), 7,97 (s, 1,8-H) und 10,64 (s, 1, NH ₂). Anal. Berechnung für C₂₈H₄₉N₅O₅: C, 62,80; H, 9,16; N, 12,95. Gefunden: C, 62,54; H, 9,18; N, 12,95.
Beispiel 44
N2-Isobutyryl-2'-O-octadecylguanosin
2'-O-Octadecylguanosin (1,9 g) in Pyridin (150 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (2 g, 5 val) und Isobutyrylchlorid (2 g, 5 val) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 4 behandelt. Das Produkt wurde durch Kieselgelchromatographie gereinigt (eluiert mit 3% MeOH/EtOAc), wodurch 1,2 g des Produktes erhalten wurden. ¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 0,85 [t, 3, CH ₃], 1,15 [m, 38, O-CH₂CH₂(CH ₂)₁₆, CH(CH ₃)₂], 2,77 [m, 1, CH(CH₃)₂], 4,25 (m, 2, 2'H, 3'H); 5,08 (t, 1, 5'-OH), 5,12 (d, 1, 3'-OH), 5,87 (d, 1, 1'-H), 8,27 (s, 1, 8-H), 11,68 (s, 1, NH ₂) und 12,08 (s, 1, NH ₂). Anal. Berechnung für C₃₂H₅₅N₅O₆: C, 63,47; H, 9,09; N, 11,57. Gefunden: C, 63,53; H, 9,20; N, 11,52.
Beispiel 45
2,6-Diamino-9-[2'-O-(imidazol-1-yl)butyl-β-D-ribofuranosyl]purin
2,6-Diamino-(9-β-D-ribofuranosyl)purin (5,0 g) in DMF (400 ml) wurde mit Natriumhydrid (0,78 g) behandelt. Nach dem Rühren von weiteren 30 min wurde eine weitere Portion von Natriumhydrid (2,6 g) unmittelbar zugegeben, gefolgt von Brombutylimidazol (9,9 g) in DMF (25 ml). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt und mit H₂O gequencht. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celite filtriert und eingedampft, wodurch ein öliges Produkt erhalten wurde. DC zeigte ein Gemisch aus Isomeren.
Beispiel 46
2'-O-(imidazol-1-yl)butylguanosin
Ein Gemisch aus den 2,6-Diamino-9-[2'-O-(imidazol-1-yl)butyl-β-D-ribofuranosyl]purin- und 2,6-Diamino-9-[3'-O-(imidazol-1-yl)butyl-β-D-ribofuranosyl]purinisomeren in 0,1 M Trispuffer (pH 7,4), 0,1 M Na₂SO₄-Puffer (pH 7,4) und DMSO wurde mit Adenosindeaminase bei RT für 5 Tage wie für die Verfahrensweise von Beispiel 3 gerührt. Die Produkt-enthaltenden Fraktionen wurden durch Kieselgelchromatographie gereinigt und die Produkt-enthaltende Fraktion eingedampft, wodurch das Produkt erhalten wurde.
Beispiel 47
N2-Isobutyryl-2'-O-(imidazol-1-yl)butylguanosin
2'-O-(imidazol-1-yl)butylguanosin in Pyridin wird mit Trimethylsilylchlorid (5 val) und Isobutyrylchlorid (5 val) wie für die Verfahrensweise von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Produkt erhalten wird.
Beispiel 48
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-(imidazol-1-yl)butylguanosin
N2-Isobutyryl-2'-O-(imidazol-1-yl)butylguanosin wird mit Dimethoxytritylchlorid (1,1 val) und Dimethylaminopyridin (als Katalysator) in Pyridin wie für die Verfahrensweise von Beispiel 5 behandelt. Nach der Chromatographiereinigung werden die Produkt-enthaltenden Fraktionen eingedampft, wodurch das Produkt erhalten wird.
Beispiel 86
N2,N6-Diisobutyrylamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
N2,N6-Diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin (1,6 g, 5,39 mmol, siehe Beispiel 34) wurde mit Pyridin (25 ml) co-eingedampft. Eine Suspension des Rests in Pyridin (40 ml) wurde in einem Eisbad abgekühlt und Trimethylsilylchlorid (4,8 ml) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 30 min gerührt, gefolgt von der Addition von Butyrylchlorid (2,8 ml, 5 val). Das resultierende Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. H₂O (10 ml) und konz. NH₄OH (10 ml) wurden unter Rühren zugegeben, um das Reaktionsgemisch zu quenchen. Nach 30 min wurde das Reaktionsgemisch eingedampft und der Rest auf einer Kieselgelsäule unter Verwendung von CH₂Cl₂ → 10% MeOH/CH₂Cl₂ unter Elution des Produktes gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden eingedampft, wodurch das Produkt als ein Öl erhalten wurde (2,4 g).
Beispiel 87
N2,N6-Diisobutyrylamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
N2,N6-Diisobutyrylamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin (2,4 g) wurde mit Pyridin co-eingedampft und in Pyridin wieder gelöst. Dimethoxytritylchlorid (1,8 g, 1 val) und Dimethylaminopyridin (5 mg) wurden zugegeben und die resultierende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde teilweise eingedampft und der Rest zwischen CH₂Cl₂ – verd. Na₂CO₃ partitioniert. Die organische Phase wurde mit verd. Na₂CO₃ gewaschen, mit MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Der Rest wurde auf einer Kieselgelsäule unter Elution mit Hexanen/EtOAc (1:1), enthaltend 1% Triethylamin, gereinigt. Die Fraktion, die das Produkt enthält, wurde eingedampft, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde (2,4 g).
Beispiel 88
N2,N6-Diisobutyrylamino-9-[5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-3'-O-(β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramid)-β-D-ribofuranosyl]purin
N2,N6-Diisobutyrylamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin (1,7 g, 0,0023 Mol) wurde mit Bis-N,N-diisopropylaminocyanoethylphosphit (1,48 ml, 2 val) und N,N-Diisopropylaminohydrotetrazolid (200 mg) bei Raumtemperatur über Nacht behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen verd. Na₂CO₃/CH₂Cl₂ aufgeteilt, die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Der Rest wurde auf eine Kieselgelsäule geladen und mit Hexanen/EtOAc (3:1 → 1:1 mit 1% Triethylamin) eluiert, wodurch das Produkt als fester Schaum erhalten wurde (1,73 g). ³¹P-NMR (CD₃CN, H₃PO₄ std.) zeigt die Diastereomere.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines 2'-O-alkylierten Guanosin-3'-O-phosphoramidits, umfassend die Schritte: das Alkylieren eines 2,6-Diamino-9-(ribofuranosyl)purins in der Gegenwart eines Metallhydrids unter Bildung eines 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkylierten Ribofuranosyl)purins, das Deaminieren des 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkylierten Ribofuranosyl)purins unter Bildung eines 2'-O-alkylierten Guanosins, das Blockieren der 5'-Hydroxyleinheit des 2'-O-alkylierten Guanosins und das Phosphitylieren der 3'-Position des 5'-blockierten 2'-O-alkylierten Guanosins.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das 2,6-Diamino-9-(ribofuranosyl)purin mit einem Alkylierungsmittel X-L, wobei X R₁-(R₂)_n ist, R₁ C₁-C₂₀ Alkyl, C₂-C₂₀ Alkenyl oder C₂-C₂₀ Alkinyl ist, R₂ ein Halogen, Hydroxyl, Thiol, Keto, Carboxyl, Nitro, Nitroso, Nitril, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, O-Alkyl, S-Alkyl, NH-Alkyl, N-Dialkyl, O-Aryl, S-Aryl, NH-Aryl, O-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralkyl, Amino, N-Phthalimido, Imidazol, Azido, Hydrazino, Hydroxylamino, Isocyanato, Sulfoxid, Sulfon, Sulfid, Disulfid, Silyl, Aryl, Heterocyclus, Carbocyclus, Interkalator, Reportermolekül, Konjugat, Polyamin, Polyamid, Polyalkylenglykol oder Polyether ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist und L eine Abgangsgruppe ist, in der Gegenwart eines Metallhydrids unter Bildung eines 2,6-Diamino-9-(2'-O- alkylierten Ribofuranosyl)purins alkyliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Blockierungsschritt eine Dimethoxytritylgruppe zugibt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Phosphitylierungsschritt mit Bis-N,N-diisopropylaminocyanoethylphosphit durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Phosphitylierungsschritt in der Gegenwart von N,N-Diisopropylaminohydrotetrazolid durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiter umfassend das Blockieren der N2-Aminoeinheit von dem 2'-O-alkylierten Guanosin vor dem Blockieren der 5'-Hydroxyleinheit.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Deaminierungsschritt unter Verwendung von Adenosindeaminase durchgeführt wird.
Verfahren zum Herstellen von 2'-O-substituiertem Guanosin, umfassend: das Behandeln von 2,6-Diaminopurinribosid mit einer Base mit einem pK_b ≥ pK_b von NaH und mit einer Verbindung mit der Formel R-L, wobei R eine aliphatische oder alicyclische Gruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter Bildung von 2'-O-substituiertem 2,6-Diaminopurinribosid und 3'-O-substituiertem 2,6-Diaminopurinribosid, wobei der Substituent die aliphatische oder alicyclische Gruppe ist, das Deaminieren des 2'-O-substituierten 2,6-Diaminopurinribosids, um das 2'-O-substituierte Guanosin zu ergeben, und das Rückgewinnen des 2'-O-substituierten Guanosins.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die aliphatische oder alicyclische Gruppe aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₂₀ geradkettiger oder verzweigtkettiger Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylkette bzw. C₁-C₂₀ alicyclischen, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Substituent der C₁-C₂₀ substituierten geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylkette oder C₁-C₂₀ substituierten alicyclischen Halogen, Hydroxyl, Thiol, Keto, Carboxyl, Nitrate, Nitro, Nitroso, Nitril, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, O-Alkyl, S-Alkyl, NH-Alkyl, N-Dialkyl, O-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralkyl, Amino, Azido, Hydrazino, Hydroxylamino, Isocyanato, Sulfoxid, Sulfon, Sulfid, Disulfid, Silyl, Heterocyclus, Alicyclus, Carbocyclus, Interkalatoren, Reportermoleküle, Konjugate, Polyamine, Polyamide, Polyethylenglykole und Polyether ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das 2,6-Diaminopurinribosid mit einem Alkylierungsmittel X-L, wobei X R₁-(R₂)_n ist, R₁ C₁-C₂₀ Alkyl, C₂-C₂₀ Alkenyl oder C₂-C₂₀ Alkinyl ist, R₂ Halogen, Hydroxyl, Thiol, Keto, Carboxyl, Nitro, Nitroso, Nitril, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, O-Alkyl, S-Alkyl, NH-Alkyl, N-Dialkyl, O-Aryl, S-Aryl, NH-Aryl, O-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralkyl, Amino, N-Phthalimido, Imidazol, Azido, Hydrazino, Hydroxylamino, Isocyanato, Sulfoxid, Sulfon, Sulfid, Disulfid, Silyl, Aryl, Heterocyclus, Carbocyclus, Interkalator, Reportermolekül, Konjugat, Polyamin, Polyamid, Polyalkylenglykol oder Polyether ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter Bildung von 2'-O-substituiertem-2,6-Diaminopurinribosid und 3'-O-substituiertem-2,6-Diaminopurinribosid, wobei der Substituent die Gruppe X ist, behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 11, weiter umfassend: das Abtrennen des 2'-O-substituierten-2,6-Diaminopurinribosids von dem 3'-O-substituierten-2,6-Diaminopurinribosid.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das 2'-O-substituierte-2,6- Diaminopurinribosid von dem 3'-O-substituierten-2,6-Diaminopurinribosid durch Durchführen der Deaminierung unter Bedingungen derart, daß die Deaminierungsrate des 2'-O-substituierten-2,6-Diaminopurinribosids im Vergleich zu der Deaminierungsrate des 3'-O-substituierten-2,6-Diaminopurinribosids beschleunigt ist, abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die beschleunigte Deaminierungsrate des 2'-O-substituierten-2,6-Diaminopurinribosids durch Verwendung des Enzyms Adenosindeaminase erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 11, wobei das 2'-O-substituierte-2,6-Diaminopurin mit Adenosindeaminase deaminiert wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 11, wobei die Base Natriumhydrid ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 11, wobei das 2'-O-substituierte-2,6-Diaminopurinribosid physikalisch von dem 3'-O-substituierten-2,6-Diaminopurinribosid durch Kristallisation oder Chromatographie abgetrennt wird.
Verfahren zur Herstellung von 2'-O-Alkyl-guanosin, umfassend: das Behandeln von 2,6-Diaminopurinribosid mit einer Base mit einem pK_b ≥ pK_b von NaH und einer Verbindung mit der Formel R-L, wobei R die Alkylgruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter Bildung von 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosid, das Behandeln des 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosids mit Adenosindeaminase und das Rückgewinnen des 2'-O-Alkyl-guanosins.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Alkylgruppe ein C₁-C₂₀ geradkettiges oder verzweigtkettiges, gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl oder ein C₁-C₂₀ geradkettiges oder verzweigtkettiges, gesättigtes oder ungesättigtes, substituiertes Alkyl ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Alkylgruppe C₁-C₂₀ gesättigtes, geradkettiges Alkyl oder C₁-C₂₀ gesättigtes, geradkettiges substituiertes Alkyl ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Substituent von dem C₁-C₂₀ geradkettigen oder verzweigtkettigen, gesättigten oder ungesättigten, substituierten Alkyl Halogen, Hydroxyl, Thiol, Keto, Carboxyl, Nitrate, Nitro, Nitroso, Nitril, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, O-Alkyl, S-Alkyl, NH-Alkyl, N-Dialkyl, O-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralkyl, Amino-Azido, Hydrazino, Hydroxylamino. Isocyanato, Sulfoxid, Sulfon, Sulfid, Disulfid, Silyl, Heterocyclus, Alicyclus, Carbocyclus, Interkalatoren, Reportermoleküle, Konjugate, Polyamine, Polyamide, Polyethyleneglykole und Polyether ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das 2,6-Diaminopurinribosid mit einem Alkylierungsmittel X-L, wobei X R₁-(R₂)_n ist, R₁ C₁-C₂₀ Alkyl, C₂-C₂₀ Alkenyl oder C₂-C₂₀ Alkinyl ist, R₂ Halogen, Hydroxyl, Thiol, Keto, Carboxyl, Nitro, Nitroso, Nitril, Trifluoromethyl, Trifluoromethoxy, O-Alkyl, S-Alkyl, NH-Alkyl, N-Dialkyl, O-Aryl, S-Aryl, NH-Aryl, O-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralakyl, Amino, N-Phthalimido, Imidazol, Azido, Hydrazino, Hydroxylamino, Isocyanato, Sulfoxid, Sulfon, Sulfid, Disulfid, Silyl, Aryl, Heterocyclus, Carbocyclus, Interkalator, Reportermolekül, Konjugat, Polyamin, Polyamid, Polyalkylenglykol oder Polyether ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter Bildung von 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosid behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 22, wobei die Base Natriumhydrid ist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 22, weiter umfassend: das Abtrennen des 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosids von weiter alkylierten Produkten, die aus der Behandlung des 2,6-Diaminopurinribosids mit der Base und der Verbindung R-L bzw. dem Alkylierungsmittel X-L resultieren.
Verfahren zur Herstellung eines 3'-O-Phosphoramidits von 2'-O-Alkylguanosin, umfassend: das Behandeln von 2,6-Diaminopurinribosid mit einer Base mit einem pK_b ≥ pK_b von NaH und einer Verbindung mit der Formel R-L, wobei R die Alkylgruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter Bildung von 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosid, das Behandeln des 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosids mit Adenosindeaminase unter Bildung von 2'-O-Alkyl-guanosin, das Schützen der 2-NH₂-Einheit des 2'-O-Alkyl-guanosins mit einer Schutzgruppe, das Schützen der 5'-OH-Einheit des 2'-O-Alkyl-guanosins mit einer Schutzgruppe, das Phosphitylieren der 3'-OH-Einheit des geschützten 2'-O-Alkyl-guanosins, und das Rückgewinnen des 3'-O-Phosphoramidits von 2'-O-Alkyl-guanosin.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das 2,6-Diaminopurinribosid mit einem Alkylierungsmittel X-L, wobei X R₁-(R₂)_n ist, R₁ C₁-C₂₀ Alkyl, C₂-C₂₀ Alkenyl oder C₂-C₂₀ Alkinyl ist, R₂ Halogen, Hydroxyl, Thiol, Keto, Carboxyl, Nitro, Nitroso, Nitril, Trifluoromethyl, Trifluoromethoxy, O-Alkyl, S-Alkyl, NH-Alkyl, N-Dialkyl, O-Aryl, S-Aryl, NH-Aryl, O-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralkyl, Amino, N-Phthalimido, Imidazol, Azido, Hydrazino, Hydroxylamino, Isocyanato, Sulfoxid, Sulfon, Sulfid, Disulfid, Silyl, Aryl, Heterocyclus, Carbocyclus, Interkalator, Reportermolekül, Konjugat, Polyamin, Polyamid, Polyalkylenglykol oder Polyether ist, n ein ganze Zahl von 0 bis 6 ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter Bildung von 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosid behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei das geschützte 2'-O-Alkylguanosin mit 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminochlorphosphin phosphityliert wird.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Base Natriumhydrid ist.