DE69330956T2 - Methode zur reinigung einer wässrigen enzymlösung - Google Patents
Methode zur reinigung einer wässrigen enzymlösungInfo
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Description
- Zur Reinigung oder Konzentrierung einer wäßrigen Enzymlösung, insbesondere einer enzymatischen Fermentationsbrühe, sind aus der Technik verschiedene Reinigungsverfahren bekannt. Beispiele sind Aussalzen und Behandlung mit Aktivkohle. Allerdings bedarf die Selektivität, mit der diese Reinigungsverfahren die Enzyme von Kohlenhydraten, nicht enzymatischen Proteinen, farbigen Verbindungen und anderen Verunreinigungen abtrennen, der Verbesserung.
- Somit besteht das Ziel der Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung einer wäßrigen Enzymlösung, wobei die Enzyme wirksam von Kohlenhydraten, nicht enzymatischen Proteinen, farbigen Verbindungen und anderen Verunreinigungen abgetrennt werden können. Übliche Quellen für wäßrige Enzymlösungen sind Fermentationsbrühen oder filtrierte Fermentationsbrühen.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung einer wäßrigen Enzymlösung ist dadurch gekennzeichnet, daß der wäßrigen Enzymlösung ein lösliches Aluminat zugesetzt wird und daß gleichzeitig eine Säure in solchen Mengen zugesetzt wird, daß der pH-Wert der Lösung zwischen 4 und 10 gehalten wird und daß der pH- Wert mindestens um eine pH-Einheit vom isoelektrischen Punkt des zu reinigenden Enzyms abweicht, wobei das lösliche Aluminat der Lösung in einer Menge zwischen einer maximalen Menge, die nicht mehr als eine vernachlässigbare Menge von Enzym ausfällt, und einer minimalen Menge, die nicht mehr als eine vernachlässigbare Menge von Verunreinigungen, hauptsächlich Kohlenhydrate in der Lösung zurückläßt, zugesetzt wird und daß der Überstand anschließend von dem Niederschlag, der verworfen wird, abgetrennt wird.
- Es wurde gefunden, daß das Fällungsverfahren am wirksamsten bei niedrigeren pH-Werten abläuft. Die meisten Enzyme allerdings zeigen bei niedrigen pH- Werten eine geringe Stabilität. Somit muß ein Kompromiß-pH-Wert mit einem einigermaßen effizienten Verfahren und einer einigermaßen guten Enzymstabilität gewählt werden.
- Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise gefunden, daß das "Fenster", d. h. der Bereich des zugegebenen Aluminats, in dem praktisch keine Enzyme und praktisch sämtliche Verunreinigungen ausgefällt werden, größer ist als für andere Fällungsmittel, wenn die Fällung durch das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird.
- Es ist selbstverständlich, daß die Zugabe des löslichen Aluminats zu der pH- eingestellten Enzymlösung unter anschließender Fällung von Aluminiumhydroxid den pH ändert, daß allerdings der pH-Wert erfindungsgemäß mit Ameisensäure wieder eingestellt wird, wenn der veränderte pH-Wert die oben angegebenen Bedingungen nicht erfüllen sollte, d. h. wenn der veränderte pH-Wert nicht im Bereich zwischen 4 und 10 liegen sollte und wenn er nicht mindestens um eine pH- Einheit von dem isoelektrischen Punkt des zu reinigenden Enzyms abweichen sollte.
- In dieser Beschreibung mit den Ansprüchen bedeutet "ein lösliches Aluminat" ein Aluminat, dessen Löslichkeit in einem wäßrigen Medium Lösung bei einer Temperatur von 25ºC über 100 g/l Lösung liegt. Ein Beispiel ist Natriumaluminat.
- Die maximale Menge von Aluminat, die nicht mehr als eine vernachlässigbare Menge an Enzym ausfällt, hängt von der Art und Konzentration des Enzyms ab, und liegt normalerweise bezogen auf die Lösung um 5% (Gew./Gew.) Aluminat.
- Die minimale Menge von Aluminat, die nicht mehr als eine vernachlässigbare Menge von Verunreinigungen, hauptsächlich Kohlenhydrate, ausfällt, ist von der Art und Konzentration der Verunreinigungen abhängig und liegt normalerweise bezogen auf die Lösung um 0,5% (Gew./Gew.).
- Einige Enzyme neigen bereits bei Zugabe des löslichen Aluminats in einer Menge von 0,8% Aluminat, bezogen auf die Lösung, zur Ausfällung bis zu einem gewissen Grad, und solche Enzyme sind erfindungsgemäß nicht sehr gut geeignet.
- Die U.S. -Patentschrift Nr. 3 795 586 beschreibt ein Reinigungsverfahren für Enzyme, wobei Aluminiumhydroxid und weitere unlösliche Verbindungen in situ ausgefällt werden. In sämtlichen Beispielen, in denen Aluminiumhydroxid gebildet wird, wurde allerdings Aluminiumsulfat verwendet, und es wurde festgestellt, daß erfindungsgemäß eine viel wirksamere Enzymabtrennung von den Verunreinigungen mittels Aluminat in Kombination mit einer Säure erhalten werden kann.
- In der WO 91/09943, Seite 8, Zeilen 11-13, ist angegeben, daß NaAlO&sub2; einer Fermentationsbrühe in einer Menge von 4 g NaAlO&sub2;/l Fermentationsbrühe während des Ausflockungsschrittes zugesetzt wird. Eine Zugabe von NaAlO&sub2; in einer Konzentration dieser Größenordnung fällt keinerlei gelöstes Material aus, sondern flockt nur bereits vorhandene Teilchen aus. Somit ist die Konzentration an NaAlO&sub2; kleiner als die in Anspruch 1 angegebene minimale Menge an Aluminat.
- Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt, daß das Gemisch, das lösliches Aluminat, wäßrige Enzymlösung und Säure enthält, auch ein Wasser-mischbares Lösungsmittel, vorzugsweise einen Alkohol, enthält. Es wurde festgestellt, daß die Verwendung von relativ hohen Aluminat- Konzentrationen (z. B. mehr als etwa 0,8%, berechnet als Al) in einigen Fällen während der anfänglichen Ausflockung aufgrund von Adsorption des Enzyms an die aluminiumhaltigen Flocken zu beträchtlichen Verlusten von Enzymen führen kann. Diese Ausführungsform der Erfindung kann allerdings diese beträchtlichen Verluste verhindern. Der Alkohol wird in der Regel vor dem Ausflocken zugegeben, und diese Zugabe ändert weder die positive Wirkung des Aluminats noch beeinträchtigt sie die Abtrennung des Überstands von dem Niederschlag.
- Eine bevorzugte Ausführungsform für das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt, daß der Alkohol Glycerin oder ein Glycol ist. Es wurde festgestellt, daß Glycerin oder Glycole zur Verhinderung der oben angegebenen beträchtlichen Enzymverluste gut geeignete Alkohole darstellen.
- Eine bevorzugte Ausführungsform für das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt, daß der Alkohol in dem Gemisch in einer Menge zwischen 20 und 80% Gew./Gew. vorhanden ist. Es wurde festgestellt, daß der Bereich von 20-80% Gew./Gew. Alkohol der optimale Bereich für die wirksamste Verhinderung der beträchtlichen Verluste von Enzymen ist.
- Eine bevorzugte Ausführungsform für das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt, daß die Säure Ameisensäure ist. Es wurde festgestellt, daß Ameisensäure eine selektivere Abtrennung als andere Säuren bereitstellt.
- Eine bevorzugte Ausführungsform für das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt, daß der pH-Wert der Lösung zwischen 5 und 8 gehalten wird. Dieser pH-Bereich ist für die meisten Enzyme optimal.
- Eine bevorzugte Ausführungsform für das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt, daß das lösliche Aluminat Natriumaluminat ist. Natriumaluminat ist das kostengünstigste Aluminat und ist im Handel erhältlich.
- Eine bevorzugte Ausführungsform für das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt, daß die maximale Menge von Aluminat zwischen 2 und 3% Gew./Gew. der Lösung, berechnet als Al, liegt und daß die minimale Menge zwischen 0,3 und 1% Gew./Gew. der Lösung, berechnet als Al, liegt. Diese Werte für die maximale und minimale Zugabe von Aluminat stellen für die meisten Enzyme eine wirksame Abtrennung bereit.
- Eine bevorzugte Ausführungsform für das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt, daß der Überstand von dem Niederschlag durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt wird. Dieses sind die wirksamsten und einfachsten Trennverfahren.
- Eine bevorzugte Ausführungsform für das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt, daß nach Zugabe der Säure und des Aluminates jedoch vor Trennung des Überstandes und des Niederschlages ein Flockungsmittel zugegeben wird und daß das Flockungsmittel ein kationisches und/oder anionisches Flockungsmittel ist. Unter Verwendung dieser Flockungsmittel wird eine noch bessere Trennung bereitgestellt.
- Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Beispiele erläutert.
- Savinase® wird gemäß der US 3 723 250 fermentiert. Zu 1 l Fermantentationsbrühe werden zugesetzt:
- Wasser 1,5 l
- Calciumchloriddihydrat 10 g
- Natriumaluminat 40 g
- Ameisensäure ca. 40 g
- Der pH wird durch Kontrolle der Ameisensäure-Dosis im Bereich von 5,5-6,0 gehalten.
- Rohafloc KF 785 ca. 300 mg
- Superfloc A 130 ca.- 150 g
- Der Überstand wird von dem Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt.
- Rohafloc KF ist ein kationisches Flockungsmittel von Röhm, und Superfloc A 130 ist ein anionisches Flockungsmittel von American Cyanamid.
- Esperase® wird gemäß der US 3 723 250 fermentiert.
- Nach der Fermentation wird die Brühe durch Zugabe von 1 l Leitungswasser/l Brühe, 35 g CaCl&sub2;·2H&sub2;O/l Brühe und 10 g Al&sub2;(SO&sub4;)&sub3;/l Brühe vorbehandelt. Der pH wird während der Al&sub2;(SO&sub4;)&sub3;-Zugabe mit wäßrigem Natriumhydroxid konstant auf 8,0 eingestellt. Die Suspension wird anschließend durch Zugabe eines kationischen und eines anionischen Flockungsmittels: Superfloc C 521 (5 g/l Brühe) und Superfloc A 130 (300 mg/l Brühe) ausgeflockt.
- Die Abtrennung der ausgeflockten Suspension wird durch eine Zentrifugation und anschließende Filtration unter Erhalt einer klaren Flüssigkeit durchgeführt. Das Filtrat wird auf einen Trockengehalt entsprechend ca. 12% RI (Brechungsindex) eingedampft und auf eine Temperatur von ca. 37ºC erhitzt. Bei dieser Temperatur werden der Lösung schrittweise unter schnellem Mischen 250 g Na&sub2;SO&sub4;/l Konzentrat zugesetzt. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid und 20% Essigsäure auf 7,0 eingestellt, und die Suspension wird 1/2 h gemischt.
- Das ausgefällte Enzym wird auf einer Filterpresse geerntet und bei 25ºC erneut in Monopropylenglycol (2,5 l/kg Filterkuchen) aufgelöst. Nicht gelöstes Material wird durch Filtration entfernt, und der Filterkuchen wird mit einem Gemisch von Monopropylenglycol und Wasser gespült.
- Das Esperase®-Filtrat wird mit Wasser auf eine Monopropylenglycol- Konzentration von ca. 30% verdünnt, wobei die Konzentration an Esperase® 20 g/l beträgt.
- Das Monopropylenglycol-Konzentrat wird anschließend bei pH 5,9 (eingestellt mit Ameisensäure) mit Natriumaluminat (5 g/l) behandelt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit einem Gemisch von Monopropylenglycol und Wasser gespült.
- Die Ausbeute an Esperase® bei dieser Aluminatreaktion liegt über 95%, und die Farbverminderung beträgt über 80%.
Claims (10)
1. Verfahren zur Reinigung einer wäßrigen Enzymlösung, dadurch
gekennzeichnet, daß der wäßrigen Enzymlösung ein lösliches Aluminat zugesetzt
wird und daß gleichzeitig eine Säure in solchen Mengen zugesetzt wird, daß
der pH-Wert der Lösung zwischen 4 und 10 gehalten wird und daß der pH-
Wert mindestens um eine pH-Einheit vom isoelektrischen Punkt des zu
reinigenden Enzyms abweicht, wobei das lösliche Aluminat der Lösung in
einer Menge zwischen einer maximalen Menge, die nicht mehr als eine
vernachlässigbare Menge von Enzyms ausfällt, und einer minimalen Menge,
die nicht mehr als eine vernachlässigbare Menge von Verunreinigungen,
hauptsächlich Kohlenhydrate, in Lösung zurückläßt, zugesetzt wird und daß
der Überstand anschließend von dem Niederschlag, der verworfen wird,
abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch, das
lösliches Aluminat, wäßrige Enzymlösung und Säure enthält, auch ein
Wasser-mischbares Lösungsmittel, vorzugsweise einen Alkohol, enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol
Glycerin oder ein Glykol ist.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 2-3, dadurch gekennzeichnet, daß der
Alkohol in dem Gemisch in einer Menge zwischen 20 und 80% Gew./Gew.
vorhanden ist.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure
Ameisensäure ist.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-
Wert der Lösung zwischen 5 und 8 gehalten wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß das
lösliche Aluminat Natriumaluminat ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß die
maximale Menge von Aluminat zwischen 2 und 3% Gew./Gew. der Lösung,
berechnet als Al, und daß die minimale Menge zwischen 0,3 und 1%
Gew./Gew. der Lösung, berechnet als Al, liegt.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß der
Überstand von dem Niederschlag durch Zentrifugation oder Filtration
abgetrennt wird.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß nach
Zugabe der Säure und des Aluminates, jedoch vor der Trennung des
Überstandes und des Niederschlages ein Flockungsmittel zugesetzt wird und daß
das Flockungsmittel ein kationisches und/oder anionisches Flockungsmittel
ist.
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