DE69330716T2

DE69330716T2 - Nicht faserige, mit alginat beschichtete transplantate sowie herstellungs- und anwendungssvefahren dafür

Info

Publication number: DE69330716T2
Application number: DE69330716T
Authority: DE
Inventors: C. Cochrum; E. Dorian; Valerie Vreeland
Original assignee: University of California; Metabolex Inc; University of California Berkeley
Current assignee: Iselt Technology inc White Bear Lake Minn Us; University of California
Priority date: 1992-05-29
Filing date: 1993-06-01
Publication date: 2002-07-04
Anticipated expiration: 2013-06-02
Also published as: ATE205223T1; CA2135770A1; DE69330716D1; US5429821A; EP0642326A1; JPH07507550A; WO1993024077A1; EP0642326A4; AU4409793A; EP0642326B1; US5693514A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet von medizinischen Transplantaten von Zellen und Geweben, der Herstellung derartiger Transplantate und ihrer Verwendung. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf das Überziehen von Transplantaten mit einem neuen, stark schützenden Überzug aus Alginat, das frei ist von die Transplantation verschlechternden Mengen an Verunreinigungen; die nach diesem Überzugs-Verfahren gebildeten überzogenen Gewebe und die unter Anwendung dieser Produkte hergestellten Transplantate.

Diskussion des Hintergrundes

Übliche medizinische Behandlungen von funktionellen Mängeln von sekretorischen oder anderen biologischen Organen haben sich auf den Ersatz von identifizierten normalen Produkten des mangelhaften Organs durch natürliche oder synthetische pharmazeutische Mittel konzentriert. Z.B. muß zur Behandlung von insulinabhängigem Diabetes mellitus, auch als Typ I oder jugendlicher Anfangsdiabetes bekannt, die normale Sekretion von Insulin durch die Langerhans Inseln in dem Pankreas ersetzt werden, da funktionelle Inseln in dem Pankreas nicht mehr vorhanden sind. Diese Pankreas-Funktion wird nachgeahmt durch Verabreichen von Insulin, Titrieren der Injektionen als Antwort auf die Messungen des Glucosegehalts im Blut (Blutzucker). Bestenfalls wird die Insulinproduktion und Sekretion der Inseln unvollkommen erreicht und normalerweise nur schlecht erreicht.
Ein Organersatz wurde ebenfalls angewandt. Dies hat allgemein die kontinuierliche Anwendung von immunsuppressiven Mitteln erfordert, um eine immunologische Abstoßung des Organs zu verhindern, wodurch der Patient die volle Schutzfunktion des Immunsystems gegenüber Krankheiten verliert. Dieser Weg hat nur bei einer begrenzten Gruppe von Organen zur Erleichterung geführt. Versuche, Organgewebe ohne lmmunsuppression in genetisch verschiedene Wirte zu transplantieren, sind allgemein an dem Immunsystem des Wirts gescheitert. Vor dieser Erfindung hat sich die Anwendung von wirksamen Schutzbarriere-Überzügen zum Isolieren des Transplantat-Gewebes vor dem Immunsystem des Wirtes aus einer Anzahl von Gründen als medizinisch nicht durchführbar erwiesen. Die Überzugsmaterialien waren mit dem System des Wirts unverträglich oder sonst ungeeignet. Die früher entwickelten Verkapselungs- oder Überzugs-Verfahren führten nicht zu reproduzierbaren Überzügen mit der gewünschten Porosität und Dicke, die erforderlich sind, damit das transplantierte Gewebe eine lang und wirksam funktionierende Lebensdauer in dem Wirt hat.
Um Transplantate vor einer Zerstörung durch die Immunantwort des Wirtstieres zu schützen, sind verschiedene Versuche unternommen worden, um eine Schutzbarriere zwischen dem Transplantatgewebe oder Zellen und den immunologischen Komponenten des System des Wirts zu erzeugen. T.M.S. Chang (Chang, T.M.S., Science 146 : 524-525 (1964)) haben ein Verfahren zur Mikroverkapselung von Erythrozyten-Hämolysat und Urease in semipermeablen Polyamid-Membranen beschrieben. Diese Mikrokapseln überlebten nicht lange, wenn sie in den Blutstrom injiziert wurden. Mosback et al. und Chang et al. beschreiben die Herstellung von sem ipermeablen mikroverkapselten mikrobiologischen Zellen und lebenden roten Blutkörperchen, wobei der zuletzt genannte Artikel die Möglichkeit der Anwendung von Injektion von verkapselten Zellen zur Organersatz-Theraapie erwähnt. (K. Mosbach et al., Acta Chem. Scand. 20 : 2807-2812 (1966), Chang, T.M.S. et al. Can. J. Physiol. and Pharmacol. 44 : 115-128 (1966)).
Lebende Gewebe und Zellen wurden von Lim et al. (F. Lim et al. J. Pharm. Sci., 70 : 351-354 (1981)) in Alginat-Tröpfchen immobilisiert, die mit Polylysin überzogen waren. Über einen Versuch, diese überzogenen Tröpfchen zu verwenden, um den diabetischen Zustand von diabetischen Tieren zu korrigieren, wird von Lim et al. (Lim et al., Science 210 : 908-909 (1981)) berichtet. Die US-PS 4 251 387, 4 324 683, 4 352 883, 4 407 957, 4 663 286 und 4 803 168 beziehen sich auf diese Forschungen. Diese Produkte waren jedoch nicht erfolgreich für die Langzeit-Korrektur des diabetischen Zustands von Tieren und sie haben sich nicht als geeignet erwiesen zur Transplantation von Geweben, wie Pankreas-Zellen in Menschen.
Erhebliche zusätzliche Bemühungen von Goosen et al., die unternommen wurden, um Transplantate zu entwickeln, die in Calciumalginat-Tröpfchen verkapselt sind, die mit Polylysin umgesetzt worden sind, waren ebenfalls nicht erfolgreich, um Transplantat zu entwickeln, die zur Transplantation geeignet sind. (Z.B. US-PS 4 673 566, 4 689 293, 4 789 550, 4 806 355, 4 789 550).
Lim et al. berichteten über die verlängerte Umkehr des diabetischen Zustands von NOD-Mäusen mit Fremd-Transplantaten von mikroverkapselten Ratten-Inseln, unter Verwendung von Alginat/Polylysin-Kapseln. (Lim et al., Diabetes 40 : 1511-1516 (19)).
Die US-PS 4 744 933 beschreibt Verkapselungs-Lösungen, enthaltend biologisch aktive Materialien in einer äußeren Membran aus miteinander umgesetztem Alginat und Polyaminosäure.
Die US-PS 4 696 286 beschreibt ein Verfahren zum Überziehen von Transplantaten, die zur Transplantation in genetisch verschiedenen Individuen geeignet sind, durch Überziehen des Transplantats mit einer der Oberfläche entsprechenden Bindungsbrücke aus einem multifunktionellen Material, das chemisch an eine Oberflächenkomponente des Transplantats bindet, gefolgt von einer semipermeablen, biologisch verträglichen Schicht aus einem Polymer, das chemisch an die Bindungsbrücken-Schicht bindet.
Hackel et al. und Kerstan et al. berichten über die Verwendung von Calciumalginaten zur Immobilisierung von mikrobiologischen Zellen und Enzymen. (Hackel et al., J. Appl. Microbiol. 1 : 291-296 (1975), Kerstan, M. et al., Biotech. and Bioeng., 19: 387-397 (1977)). Nigam et al. und darin zitierte Veröffentlichungen beschreiben Methoden zum Überziehen von Lebenden Zellen in einer äußeren Membran aus Calciumalginat durch Eintropfen einer zellhaltigen Calciumlösung in eine Alginat-Lösung und ferner Inkubieren der Kapseln in einer Calciumlösung. (Nigam et al., Biotech. Tech., 2 : 271-276 (1988)).
Plunkett et al. beschreiben ein Angiogenese-Modell unter Verwendung von Tumorzellen, die in Alginat-Perlen eingeschlossen sind. (Plunkett et al., Lab. Invest., 90 : 6204-6205 (1990)). Ein Spray aus Tröpfchen einer Natriumalginat/Zell-Lösung wurde mit einer wäßrigen Calciumchlorid-Lösung zusammengebracht, zur Bildung von Calciumalginat-Perlen. Pumpgeschwindigkeit und Luftdruck wurden angewandt, um die Größe der Tröpfchen bei dem Sprühverfahren zu kontrollieren.
Mit Calciumalginat überzogene Implantate wurden bisher jedoch nicht als geeignet angesehen zur Verwendung in Transplantationsgeweben, da die überzogenen Transplantate in den Wirtssystemen nicht überlebten. Alginate in der Form, wie sie aus Algen erhalten werden, sind gemischte Polymere von Guluronat und Mannuronat, die verschiedene Mengen an anderen Materialien enthalten.
Die Gelbildung von Calciumalginat wird in erster Linie verursacht durch eine Bindung von Calciumionen an die Guluronsäure-Einheiten von Polymeren mit hohem Guluronat-Gehalt, die eine höhere Porosität aufweisen und höhere Vernetzungsgrade ergeben, was zu einer starken Schutzbarriere für die Transplantate führt. Skjak- Braek gibt als Alternative die Verwendung von Mannuronan C-5 Epimerase, einem Enzym, das imstande ist, D-Mannuronsäure-Reste, die in dem Alginat-Polymer bereits vorhanden sind, in L-Guluronsäure umzuwandeln, an. (G. Skjyk-Braek, Biochem. Soc. Trans.: 20-26 (1992)).
Obwohl Alginate angewandt wurden, um Nahrungsmittel und pharmazeutische Produkte zu überziehen, wurde die Verwendung von Alginaten zum Überziehen von lebenden Zellen, um einen nicht-immunogenen Überzug zu bilden, bisher nicht erreicht. Diejenigen, die auf diesem Gebiet arbeiten, haben erkannt, daß es notwendig ist, Alginate für Anwendungen zum Überziehen von Zellen zu reinigen. Z.B. wurde Filtrieren als Mittel zum Entfernen von Proteinen und Polyphenolen vorgeschlagen. Die gereinigten Alginate sind jedoch selbst immunogen. Soon-Shiong et al. haben ein fibröses Überwuchern von implantierten Alginat-Mikrokapseln bei großen Tieren beobachtet. (Soon-Shiong et al., Trans. Proc., 23 : 758-759, (1991)). In dieser Studie hat es sich gezeigt, daß handelsübliche Alginate häufig mit Polyphenolen und anderen immunogenen Materialien verunreinigt sind. Selbst wenn sie gereinigt waren, blieben handelsübliche Alginate mit einem hohen Mannuronsäure-Gehaft jedoch immunogen und imstande, Makrophagen in vivo zu aktivieren und fibrotische Wucherungen zu erzeugen. Ähnlich geben Espevik et al. an, daß alle Alginate inhärent fibrogen sind. (Espevik et al., Cell Trans. 1 : 165 (1992), T. Zekorn, Cell Trans., 1 : 176 (1992)). Andere haben berichtet, daß Alginate mit hohem Mannuronat-Gehalt menschliche Monocyten stimulieren, um Cytokine zu bilden (M. Otterlei et al., J. Immunother. 10 : 286-291 (1991)), oder die Makrophagen-Migration verstärken (M. Fujihara und T. Nagumo, Carbohydrate Research 243 : 211-216 (1993)), was nahe legt, worum sie nicht biologisch verträglich sind. So scheint nach dem Stand der Technik Übereinstimmung darin zu bestehen, daß Alginat, zumindest Alginat mit einem nennenswerten Anteil an Mannuronat, die Cytokin-Bildung, Makrophagen-Migration stimuliert und inhärent fibrogen ist. Trotz der Erkenntnis auf diesem Gebiet, daß gereinigte Alginate zum Überziehen von Zeilen verwendet werden könnten, sind für lange Zeit bis heute keine langlebigen nicht-immunogenen Überzüge erreicht worden.
Zusammensetzungen von Alginaten und Verfahren zum Reinigen und Fraktionieren von Alginaten sind allgemein beschrieben worden (Haug, A., Composition and Properties of Alginates: Report Nr. 30, Norsk Institut for Tang-og Tareforskning (Norwegisches Institut für Algenforschung) (1964), Haug, A., Acta Chem. Scand. 13 : 601- 603 (1959), Haug et al., Acta Chem. Scand. 19 : 1221-1226 (1965), Haug et al., Acta Chem. Scand. 21 : 691-704 (1967), Smidred et al., Acta Chem. Scand. 22 : 1989- 1997 (1968) und Skjäak-Braek et al., Biotech. and Bioeng. 33 : 90-94 (1989)). Über Zusammenhänge zwischen den chemischen und physikalischen Eigenschaften von Alginatgel-Perlen wurde ebenfalls berichtet (Martinsen et al., Biotech. and Eng. 33: 70-89 (1989)).
Von Algianat-Überzügen mit einer Dicke von mehr als 200 um wurde berichtet, daß sie die Permeabilität nicht besitzen, die erforderlich ist, um den Durchgang von Nährstoffen und Zellprodukten durch den Überzug in ausreichenden Mengen für eine lange Lebensfähigkeit des überzogenen Transplantats während es in das Wirtssystem implantiert ist, zu ermöglichen (Chicheportiche et al., Horm. Met. Res. Suppl. 26 : 209-213 (1990)).
Es besteht daher weiterhin Bedarf an neuen überzogenen Transplantaten, die von dem Immunsystem des Wirts im wesentlichen nicht abgestoßen werden.
Handelsübliche Alginate mit verschiedenen homopolymeren Bereichen von β-D-Mannuronsäure und α-L-Glucuronsäure sind potente Stimulatoren für Makrophagen und Lymphocyten. Die mitogene Aktivität von handelsüblichen Alginaten war verbunden mit Fraktionen, die durch Elektrophorese getrennt werden konnten: Zimmermann et al., Electrophoresis, 13 : 269 (1992). Die WO-A-8904369 bezieht sich auf die Reinigung von Alginaten durch Behandlung mit Aktivkohle.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft eine gereinigte nicht-fibrogene Alginat-Zusammensetzung, die geeignet ist zum Überziehen von physiologisch aktivem Gewebe oder Zellen zur Transplantation, die für den Wirt physiologisch annehmbar ist und die wirksam einen lang anhaltenden Schutz der transplantierten Gewebezellen vor einer Schädigung durch das Immunsystem des Wirts ergibt, wobei die Zusammensetzung wie in Anspruch 1 definiert ist.
Gewebezellen, die mit dieser Zusammensetzung nach der Erfindung überzogen sind, sind in einer Überzugs-Kapsel eingeschlossen mit einer Dicke, die die Diffusion solcher Mengen an Nährstoffen und anderen Substanzen, die für ihre Gesundheit, lange Lebensdauer und effektive Wirksamkeit nach der Transplantation erforderlich sind, zu den transplantierten Zellen oder Gewebe ermöglicht, und einer Permeabilität, die die effektive Diffusion und Freisetzung von transplantierten Gewebe- oder Zeliprodukten in das System des Wirts erlaubt.
Die Erfindung betrifft ferner ein nicht-fibrogenes Gel aus einem Alginat von zweiwertigen Metallionen wie in Anspruch 9 definiert, das physiologisch annehmbar, nicht-fibrogen und für den Wirt nicht toxisch ist und das angewandt werden kann, um einen Überzug mit den oben angegebenen Eigenschaften zu liefern.
Ebenfalls Teil der Erfindung ist ein Herstellungsverfahren zum wirksamen Überziehen von Transplantationsgewebe und anderen biologischen Substanzen mit einem vollständigen Barriere-Überzug, der physiologisch annehmbar, nicht-fibrogen und für den Wirt nicht toxisch ist und der einen vollständigen Barriere-Überzug mit einer kontrollierten Dicke und Permeabilität für Proteine mittlerer Größe ergibt, wie in Anspruch 13 definiert.
Der Überzug ist im wesentlichen frei von fibrogenen Konzentrationen an Fucose, Polyphenol und Protein. Die Menge an Fucose-Gruppen in dem Überzug ist im allgemeinen kleiner als 0,2 ug pro mg Natriumalginat (kleiner als 0,02 Gew.-%) und die Menge an Polyphenol-Gruppen ist im allgemeine kleiner als 2,0 ug Tannin- Äuqivalente pro mg Natriumalginat (kleiner als 0,2 Gew.-%).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGS- FORMEN

Die Erfindung entstand aufgrund des Wunsches der Erfinder, bekannte Überzüge für Gewebe-Transplantate zu verbessern, und eine Zusammensetzung zu liefern, die, nachdem sie als Überzug auf ein Gewebe aufgebracht worden ist zur Bildung eines Gewebe-Transplantats, das nach der Implantation in einen Wirt im wesentlichen keine nachteiligen Reaktionen, wie Fibrogenese und/oder Abstoßung durch den Wirt, hervorruft.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich gezeigt, daß die Nachteile der bekannten Transplantate ein Ergebnis von verschiedenen Faktoren waren, wie bestimmten natürlichen Materialien, die in kommerziell erhältlichen Alginat-Zubereitungen vorhanden sind und die für das Gewebe des Wirts, das das Transplantat umgibt, fibrogen sind. Diese Fibrogenität führt wiederum zur Verkapselung des Transplantats in einer undurchlässigen, gering mit Gefäßen durchzogenen Schicht aus Narbengewebe, das zu Nekrose und Dysfunktion des Transplantats führt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich auch gezeigt, daß nach dem Stand der Technik von den Alginaten keine ausreichenden Mengen an Substanzen entfernt wurden, die Fucose, Polyphenole und Protein enthalten, die die Entwicklung von Fibrose unterstützen. Obwohl vor der vorliegenden Erfindung angegeben wurde, daß transplantierte Pankreaszellen Insulin produzieren, zeigte die Untersuchung der transplantierten überzogenen Zellen immer das Vorliegen von deutlicher Fibrose. Im Gegensatz dazu führen Transplantate von Zellen, die mit den gereinigten Alginaten nach der vorliegenden Erfindung überzogen sind, im wesentlichen nicht zur Bildung von Fibrose.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden wirksame Verfahren zur Massenproduktion von Transplantaten mit Alginat-Überzügen mit einer Dicke von weniger als etwa 200 um entwickelt und geliefert, und es hat sich gezeigt, daß diese nach der Transplantation verwendet werden können, um Z.B. die Pankreas-Inselfunktion unbegrenzt wiederherzustellen.
Vor dieser Erfindung wurde angegeben, daß es bei mit Alginat überzogenen Transplantaten erforderlich ist, die äußere Oberfläche von Alginat-Überzügen mit Polylysin zu überziehen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden vollständig funktionierende, nicht-fibrinogene Überzüge mit perfekten Permeabilitäten entwickelt, die keine zweite Reaktion des äußeren Überzugs mit Polylysin erfordern.
So betrifft ein Aspekt dieser Erfindung eine neue Alginat-Zubereitung, die im wesentlichen nicht-fibrogen ist. Diese Zusammensetzung ist im wesentlichen frei von Substanzen, die die Akzeptanz von Transplantaten, die mit Gelprodukten von Alginaten von zweiwertigen Metallionen, durch den Wirt verschlechtern können.
Nach der vorliegenden Erfindung wird eine fibrogene Ausgangs-Alginat- Zubereitung gereinigt, um ein nicht-fibrogenes Alginat zu erhalten, das geeignet ist zum Überziehen von Zellen mit einem nicht-fibrogenen Überzug. Geeignete Ausgangs-Alginat-Zubereitungen werden vorzugsweise erhalten durch Isolieren von braunen Algen und sind im Handel erhältlich. Nach dieser Erfindung wird die Ausgangs-Alginat-Zubereitung mit einem Chelatierungsmiftel für zweiwertige Metallionen zusammengebracht, um zweiwertige Metallionen zu entfernen, und anschließend mit gebleichter Aktivkohle mit großer Oberfläche zusammengebracht. Die Kohle absorbiert Polyphenole zusammen mit assoziiertem Protein und Fucose-Einheiten. Zusammensetzungen, die Proteine, Polyphenole und Fucose-Einheiten enthalten, werden nach dem Stand der Technik kollektiv als "Fucane" bezeichnet. Nach der Behandlung mit Kohle wird das Alginat aus der Lösung ausgefällt, gewaschen und dann filtriert, um weitere Verunreinigungen zu entfernen und das nicht-fibrogene Alginat nach der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Der Ausdruck "nicht-fibrogen", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Zusammensetzung die, wenn sie verwendet wird, um ein Implantat mit einem Durchmesser von 500 um oder darunter herzustellen, das wenigstens 60 Tage, vorzugsweise mindestens 6 Monate, insbesondere mindestens 12 Monate und vor allem 18 Monate, nach der intraperitonealen Injektion eines mit Alginat überzogenen Implantats in eine BALB/c-Maus oder einen Mischlings-Hund als Wirt nicht zu einer biologischen Isolierung und damit zum Gewebetod des Implantats durch das Immunsystem eines Wirts durch den Prozeß der Fibrose und Makrophagen-Überwucherung führt. Die biologische Isolierung und der Gewebetod können Z.B. bestimmt werden durch Überwachung der Insulinproduktion durch ein Pankreas-Inselgewebe-Implantat oder durch Überwachung des Aufrechterhaltens eines euglykämischen Zustands bei einem diabetischen Wirt. Das erfindungsgemäße nicht-fibrogene Alginat ist geeignet zum Überziehen von Geweben oder einzelnen Zellen unter Anwendung bekannter Überzugsverfahren.
Die überzogenen Transplantat-Gewebe und -Zellen, die nach der vorliegenden Erfindung erhalten worden sind, sind wirksam zur Implantation in ein Wirtstier durch einfache Injektion mit Hilfe einer subkutanen Nadel mit einem Nadeldurchmesser, der ausreichend groß ist, um den Durchgang einer Suspension von überzogenen Zellen zu erlauben, ohne daß der Gewebeüberzug beschädigt wird. Zur Implantation werden die überzogenen Transplantat-Gewebe als pharmazeutische Zubereitungen zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert. Derartige Zubereitungen sollten die höchste Anzahl an überzogenen Transplantat- Kapseln enthalten, die wirksam in ein Säugetier injiziert werden kann, um eine ausreichende Anzahl an Transplantat-Kapseln während der Transplantation zu liefern.
Der Ausdruck "Transplantat", wie er hier verwendet wird, ist so definiert, daß er alle lebenden Gewebe, Zellen und biologisch aktiven Substanzen umfaßt, die in den Körper eines Wirtstiers implantiert werden sollen, sowie den Prozeß des Implantierens dieser Gewebe und Zellen. Diese Gewebe und Zellen umfassen ohne Einschränkung Gewebe und Zellen, die von einem Spendertier entnommen worden sind, Gewebe und Zellen, die erhalten worden sind durch Inkubieren oder Kultivieren von Spendergeweben und Zellen,·Zellen, die von lebenden Zellinien erhalten worden sind, biologisch aktive Produkte von Zellen und Geweben. Jede Art von Geweben oder Zellen für die eine Transplantation erwünscht ist, können nach der Erfindung überzogen und transplantiert werden: Die wichtigste Gewebe für Transplantate sind Gewebe von sekretorischen Organen, wobei die Transplantation von einem Spenderorgan in ein Wirtstier erwünscht ist, um mindestens teilweise die Wirkung des Spenderorgans in dem Wirtssystem zu wiederholen. Bevorzugte Spendergewebe sind Pankreasinselzellen, Leberzellen, Nervenzellen, Nierenridenzellen, Gefäßendothelzellen, Schilddrüsenzellen, Nebennierenzellen, Thymuszellen und Ovarzellen, Andere Arten von Zellen können ebenfalls angewandt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden in Bezug auf die Herstellung und Transplantation von Pankreasinseln und Inselzellen als Beispiel beschrieben, zu einer klareren Erläuterung und nicht zur Einschränkung. Dieses Verfahren kann ebenso gut auf Gewebe von anderen Organen angewandt werden, wie es für den Fachmann offensichtlich ist, mit üblichen und offensichtlichen Modifikationen, wie sie erforderlich sind, um allen ungleichmäßigen verschiedenen Erfordernissen für alle verschiedenen Gewebe gerecht zu werden. Anwendungen des Verfahrens auf alle Gewebe und Zellen, die zur Transplantation geeignet sind, sollen in den Rahmen dieser Erfindung fallen.
Isolierte Pankreasinseln (oder andere Zellen oder Gewebe, die zur Transplantation geeignet sind) können nach üblichen Verfahren präpariert werden, um sie von fremden Gewebe und Donor-Substanzen zu befreien.
Um das nicht-fibrogene Alginat nach der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird eine Ausgangs-Alginat-Zubereitung in Wasser oder Puffer gelöst, das/der u. a. vorzugsweise eine ein zweiwertiges Metall chelatierende Verbindung, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), enthält, und dann mit Aktivkohle mit großer Oberfläche zusammengebracht, um alle Fucane und andere vorhandenen Verunreinigungen durch Absorption zu entfernen. Etwa 50 g Alginat werden üblicherweise in 1 bis 10, vorzugsweise 3 bis 8 Liter, Wasser gelöst. Geeignete Aktivkohle umfaßt irgendeine Aktivkohle mit großer Oberfläche mit einer Teilchengröße von etwa 100 mesh oder feiner. Vorzugsweise kann sehr feines Aktivkohlepulver mit einer Oberfläche von mindestens etwa 1 000, vorzugsweise mindestens etwa 1 500 m²/g, verwendet werden. Geeignete Aktivkohle ist im Handel erhältlich.
Die Aktivkohle wird vor der Anwendung vorzugsweise gebleicht, um organische Verunreinigungen zu oxidieren und zu entfernen. Die Aktivkohle kann mit Hilfe eines bekannten Bleichmittels, wie Natriumhypochlorit u. ä. gebleicht werden. Die Kohle kann gebleicht werden, indem sie mit einer verdünnten Lösung des Bleichmittels ausreichend lange gerührt wird, um alle Verunreinigungen von der Oberfläche der Kohle zu entfernen. Allgemein ist ein Rühren der Aktivkohle mit 0,005 bis 0,50 M, vorzugsweise 0,08 bis 0,10 M Natriumhypochlorit-Lösung während 5 bis 30 min. vorzugsweise 10 bis 20 min. ausreichend, um die Aktivkohle zu oxidieren. Nach der Oxidation kann die Aktivkohle durch Zentrifugieren oder Filtrieren von der verdünnten Bleichlösung entfernt, mit Wasser oder Ethanol gewaschen und getrocknet werden. Das Verhältnis (Gew.lGew.) von Ausgangs-Alginat zu Aktivkohle beträgt üblicherweise 1 : 1 bis 1 : 20, vorzugsweise 1 : 2 bis 1 : 8. Offensichtlich kann die Menge an Aktivkohle so eingestellti werden, wie es erforderlich ist, um die Entfernung von ausreichend Verunreinigungen sicherzustellen, um die minimalen Mengen zu erreichen, die erfindungsgemäß zulässig sind.
Die Alginat-Lösung und die gebleichte Kohle können durch einfaches Vermische, Schütteln oder Rollen in Kontakt gebracht werden und die gebleichte Kohle kann dann durch übliches Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt werden. Vorzugsweise wird die Filtration durchgeführt durch Verwendung von nach und nach feiner werdenden Filtern im Unter-Mikrometer-Bereich.
Eine verdünnte Lösung eines Salzes mit einem einwertigen Kation wird dann zu der filtrierten Alginat-Lösung in einer ausreichenden Menge zugegeben, um Bindungsstellen für Metallionen an dem Alginat auszutauschen, Irgendein lösliches Salz mit einem einwertigen Kation kann verwendet werden. Natrium- oder Kaliumchlorid- Lösungen mit 0,01 bis 1,0 M sind jedoch bevorzugt.
Das Alginat kann dann aus der erhaltenen Lösung durch Zusatz von Ethanol unter Rühren ausgefällt werden. Allgemein beträgt das Verhältnis (Vol.Nol.) von Ethanol zu Alginat-Lösung 0,25 bis 2,0, vorzugsweise 0,5 bis 1,5. Das ausgefallene Alginat kann dann durch Filtrieren, Waschen mit Ethanol und Trocknen, um Spuren von Ethanol zu entfernen, gewonnen werden.
Das wie oben beschrieben erhaltene Alginat ist direkt geeignet zum Überziehen eines Transplantat-Gewebes oder von Zellen, ohne daß weitere Überzugs- Verbindungen, wie Homopoly(aminosäuren), Z.B. Polylysin oder Polyasparaginsäure, verwendet werden. Es ist jedoch manchmal erwünscht, die Eigenschaften des Alginats chemisch zu modifizieren, um den Alginat-Überzug für spezielle Zwecke maßzuschneidern. Wichtige Eigenschäften der Alginat-Überzugsmaterialien umfassen Z.B. gut definierte und kontrollierte Porengröße, Überzugsdicke, Viskosität der Überzugslösungen, mechanische Festigkeit usw.
Das mittlere Molekulargewicht und die Gesamt-Molverhältnisse von Mannuronat zu Guluronat werden am Anfang im wesentlichen bestimmt durch den Ursprung des Materials, sie können aber auch weiter eingestellt werden durch physikalische und chemische Verfahren. Die Molekulargewicht können Z.B. verringert werden durch partielle Säure-Hydrolyse, thermischen Abbau oder Beschallung. Hohe Molekulargewichte können erhalten werden durch kontrollierte Ausfäll-Verfahren mit gleichzeitiger Veränderung der Alginat-Zusammensertzung oder durch Dialyse, Molekular-Filtration oder Gel-Ausschluß-Chromatographie. Das Verhältnis Mannuronat zu Guluronat und die Sequenzverteilung können erhöht oder verringert werden durch selektive Ausfällung oder Löslichmachen durch ein- und zweiwertige Metall-Kationen, organische Lösungsmittel oder Säuren. Die Einstellung dieser Charakteristika ergibt optimale Ergebnisse mit unterschiedlichen Gewebe-Transplantaten.
Die Konzentration eines Alginats in Lösung ist eine Funktion der physikalischen Eigenschaften des Alginats. Bei sehr niedrigen Konzentrationen ist die Morphologie des Überzugs schlecht, was zu unwirksamen Überzügen führt. Bei sehr hohen Konzentrationen ist die Viskosität zu hoch, um gute Überzüge zu bilden. Das Molekulargewicht (kDa) des Alginats liegt im Bereich von 6 bis 120. Wenn die Anfangs-Molekulargewichte hoch sind, können sie verringert werden durch milde Säure-Hydrolyse des Alginats. Das Ausgangs- oder das gereinigte Alginat können in einer verdünnten Säurelösung gelöst und leicht erwärmt werden, bis das gewünschte Molekulargewicht erreicht ist. Verdünnte Lösungen von Mineralsäuren, wie HCl usw., mit einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 M können verwendet werden. Der Grad der Hydrolyse kann kontrolliert werden durch Überwachen des Molekulargewichts des Alginats und Neutralisieren der Hydrolyse-Reaktion, wenn das erwünschte Molekulargewicht erreicht ist. Offensichtlich führen höhere Säurekonzentrationen zu einer schnelleren Hydrolyse. Alternativ sind im allgemeinen einige Testreaktionen zu Beginn ausreichend, um entsprechende Hydrolyse-Bedingungen zu bestimmen.
Die Porosität und mechanische Festigkeit des Überzugs sind auch eine Funktion der relativen Mengen an Mannuronat (M) und Guluronat (G) in den Alginat- Polymeren. Vorzugsweise liegt die Menge an M, berechnet als Ml(M+G), in dem AIginat im Bereich von 0,25 bis 0,75. Die relative Menge an M und G in dem Alginat kann eingestellt werden durch Lösen von ausgefälltem Alginat in einer verdünnten (Z.B. 0,05 bis 0,50 M) Kaliumchlorid-Lösung, um G-reiche Fraktionen wieder zu lösen, während M-reiche Fraktionen in dem Niederschlag verbleiben. Das unlösliche Material kann durch Zentrifugieren gesammelt werden. Das wieder gelöste G-reiche Material kann dann erneut durch Zugabe von Ethanol ausgefällt werden. Durch Wiederholen dieses Prozesses kann jeder erwünschte relative Anteil an M und G in dem Alginat erhalten werden.
Homopolymere Alginat-Sequenzen (Polymannuronat und Polyguluronat) sind im allgemeinen in Säure unlöslich, während alternierende Mannuronat/Guluronat- Sequenzen zum größten Teil in Säure löslich sind. Durch Extrahieren des Alginats mit einer sauren Lösung mit pH 1,5 bis 2,5 und vorzugsweise pH von etwa 2,0, ist es möglich, Homopolymer-reiche Alginate selektiv zu lösen. Weiterhin werden M-reiche Alginate gegenüber G-reichen Alginaten bevorzugt gelöst. Bei der Behandlung eines Alginats mit einer sauren Lösung fallen daher G-reiche Alginate aus und es bleiben bevorzugt M-reiche Alginate in Lösung. Die Abtrennung des Niederschlags von der Lösung ergibt so sowohl G-reiche als auch M-reiche Alginat-Fraktionen. Die in der Lösung vorhanden G-reichen Alginate können durch Zusatz von Calciumionen oder Ethanol ausgefällt werden. Wahlweise können die G-reichen Alginate erhalten werden durch Ausfällen der G-reichen Fraktionen mit Calciumionen, während die Mreichen Fraktionen in Lösung bleiben. Nach Abtrennen des Niederschlags von der Lösung kann die M-reiche Alginat-Fraktion durch Zusatz von Säure oder Ethanol aus der Lösung ausgefällt werden. Die Anteile an durch Säure und/oder Calcium ausgefällten Materialien können kontrolliert werden durch Einstellen des pH-Wertes bzw. der Calcium-Konzentration.
Es ist auch möglich, spezielle relative Mengen an M und G in dem Alginat- Überzug zu erhalten durch Vermischen von unterschiedlichen M-reichen und Greichen Fraktionen, die wie oben beschrieben erhalten worden sind. Durch aufeinanderfolgende Zugabe kleiner Mengen an G-reichem Material zu M-reichem Material kann die Menge an G in der Gesamt-Alginat-Zusammensetzung nach und nach erhöht werden, wodurch die Gesamtzahl an Bindungsstellen für zweiwertige Metallionen in dem Gesamt-Überzug erhöht wird, was zu einer Erhöhung der Steifigkeit der Struktur des Überzugs und zu größeren Porengrößen führt. Für jedes spezielle Gemisch von M-reichen und G-reichen Fraktionen können die relativen Mengen an M oder G in dem Alginat leicht durch NMR-Spektroskopie bestimmt werden. Die ¹³C-NMR-Spektroskopie ist eine schnelle und billige Methode zur Bestimmung des M/G-Verhältnisses und der Disaccharid-Sequenz-Häufigkeiten, aber 'H-NMR kann ebenfalls angewandt werden, um M/G-Verhältnisse zu bestimmen. Das mittlere Molekulargewicht und die Porosität.des Alginat-Überzugs können eingestellt werden durch Vermischen von M-reichen und G-reichen Fraktionen in unterschiedlichen Anteilen.
Die Alginate nach der vorliegenden Erfindung sind nicht-fibrogen, haben einen Gehalt an hydrolysierbarem Fucose-Zucker von 0,2 ug/mg Natriumalginat oder weniger (0,02 Gew.-% oder weniger), vorzugsweise 0,1 uglmg Natriumalginat oder weniger (0,01 Gew.-% oder weniger) und insbesondere weniger als 0,05 ug/mg Natriumalginat (0,005 Gew.-% oder weniger). Die Gehalte an Fucose-Zucker in den Alginaten können bestimmt werden übliche Analyse von neutralem Zucker, wie in Beispiel 4 unten beschrieben.
Die Alginate nach der vorliegenden Erfindung enthalten eine nicht-fibrogene Menge an Polyphenolen, wie Tanninen oder Phloroglucinol. Um den Gehalt an Polyphenolen in dem Alginat nach der vorliegenden Erfindung zu bestimmen, wurde im Rahmen der Erfindung ein neues Assay entwickelt, beruhend auf einem Standardverfahren zur Messung von Tannin-Gehalten in Wässer. (S. Hach's Water Analysis Handbook, 2. Aufl. (1992), Methode 8193 nach M. B. Kloster, Journal of the American Water Works Association 6B: 44 (1974)). Tannine sind Polyphenole und das neue Alginat-Assay nach der Erfindung zur Bestimmung von Polyphenolen ergibt den Gehalt an Polyphenol in Werten für Tannin oder "Tannin-Äquivglentente", bezogen auf Standard-Tanninlösungen mit bekannter Konzentration.
Bei dem erfindungsgemäßen Assay auf Polyphenole in Alginaten werden dis Alginat-Proben mit einer Konzentration von etwa 1 Gew.-% in Wasser zubereitet. Ein Anteil der Alginat-Lösung wird in ein Teströhrchen gegeben und ein gleiches Volumen Wasser wird in ein Vergleichs-Teströhrchen gegeben. Ähnliche Volumina einer Natriumcabonat-Lösung und von TANNIVERº 3-Reagens (Nafriumwolframat, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, wasserfreies Natriummolybdat, Lithiumsulfat und Wasser plus 1% andere Reagentien) werden sowohl zu der Probe als auch zu dem Vergleich zugegeben, die Lösungen werden dann gemischt und etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption der Probe und des Vergleichs werden dann bei etwa 700 nm gemessen.
Eine geeignete Standardkurve für Tannin kann erzeugt werden unter Verwendung von Tannin-Standardkonzentrationen, die über einen Bereich von etwa 0,1 bis 10 ug/ml variieren. Nach dem Korrigieren der Absorption jeder Probe durch Subtrahieren der Absorption des Vergleichs kann die Absorption der Alginatprobe gegen eine Standardkurve aufgetragen werden, die von den Standard-Tanninlösungen erhalten worden ist, um die Menge in ug Tannin zu bestimmen, die pro mg Alginatprobe vorhanden sind, oder die ug "Tanninäquivalente" pro mg Alginat. Wenn sie mit Hilfe des oben beschriebenen PolyphenollTannin-Assays untersucht werden, zeigt es sich, daß die erfindungsgemäßen Alginate etwa 2,0 ug oder weniger Tannin- Äquivalente pro mg Natriumalginat (0,2 Gew.-% oder weniger) enthalten. Vorzugsweise enthalten die Alginate etwa 1,0 ug Tannin-Äquivalente oder weniger (0,1 Gew.-% oder weniger) und insbesondere etwa 0,75 ug Tannin-Äquivalente oder weniger (0,075 Gew.-% oder weniger) pro mg Natriumalginat.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Herstellung von einem Alginatgel-Überzug, der geeignet ist als Schutzbarriere, die immunologisch wirksame Konzentrationen an Substanzen aus dem Immunsystem des Wirts daran hindert, das Gewebe zusammenzuziehen, und der eine Permeabilität besitzt, die erforderlich ist, um eine ausreichende Diffusion von Nährstoffen und anderen Substanzen zu ermöglichen, so daß sie mit den Transplantaten in Kontakt kommen, wie es für eine lange Lebensdauer und Lebensfähigkeit erforderlich ist.
Die Viskosität der Überzugs-Lösungen der Alginate mit einer Konzentration von 0,7 bis 2,5 Gew.-% Alginat sollte eine Viskosität von etwa 10 bis 250 cP und vorzugsweise etwa 20 bis 100 cP bei 25ºC betragen.
Bei der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens können isolierte Pankreaszellen (oder andere Zellen oder Gewebe) mit isotonischer Salzlösung gewaschen und in einer Lösung von gereinigtem Alginat suspendiert werden. Gegebenenfalls, aber nicht notwendiger Weise, können die gewaschenen Zellen vorher mit einer wäßrigen Lösung von Poly-L-Lysin behandelt werden, um die Bindung der Zellen an das Alginat zu erhöhen, und dann mit Salzlösung gespült werden.
Die Zellsuspension in dem Alginat wird zu Tröpfchen geformt und die Tröpfchen werden mit einer Salzlösung eines zweiwertigen Metalls, vorzugsweise eines Erdalkalimetalls, zusammengebracht, um das Alginat zu einem Gel zu formen. Die Tröpfchen können nach irgendeinem üblichen Verfahren erzeugt werden. Z.B. können Alginat-Tröpfchen gebildet werden durch Emulgieren einer Lösung von Natriumalginat, die zelluläres Material enthält, zur Bildung von Tröpfchen von Natriumalginat und Zellen, und Bilden eines Gels aus den Tröpfchen mit Calciumchlorid (US-PS 4 352 883). Alginat-Tröpfchen können auch gebildet werden mit einer Spritze und Pumpe, um die Tröpfchen aus der Nadel heraus zu pressen, unter Anwendung einer Luftbürste mit laminarer Strömung, um die Tröpfchen von der Spitze abzustreifen, wobei die Tröpfchen durch Sammeln in einer Calciumchlorid-Lösung zu einem Gel geformt werden (US-PS 4 40T 957). A1ginat-Tröpfchen können auch gebildet werden durch Ausstoßen aus einer subkutanen Nadel und anschließendes Fallenlassen der Tröpfchen in eine Calciumchlorid-Lösung (Nigam et al., Biotechnology Techniques 2: 271-276 (1988)). Außerdem können auch Tröpfchen in einen gleich fließenden Strom, der Calciumchlorid enthält, injiziert werden (US-PS 3 962 383). Das Versprühen von Natriumalginat-Lösungen durch eine Sprühdüse zur Bildung eines Nebels aus Tröpfchen, die in einer Calciumchlorid-Lösung gesammelt werden, kann ebenfalls angewandt werden (Plunkett et al., Laboratory Investigation 65 : 510-517 (1990)).
Alginat-Tröpfchen können auch hergestellt werden unter Anwendung einer Kombination aus einer Nadel und einer gepulsten elektrischen elektrostatischen Spannung zur Bildung von gleichförmigen Tröpfchen (US-PS 4 789 550 von Hommell et al.). Die Alginatlösung kann durch eine Nadelspitze zur Bildung eines Tropfens gepreßt werden und der Tropfen kann durch Verändern des elektrostatischen Feldes zwischen der Nadelspitze und einer Calciumchlorid-Lösung, die sich unter der Nadelspitze befindet, von der Nadel abgezogen werden. Der Tropfen erhält eine Ladung von einer Polarität von der Nadel, die der Ladung in der Calciumchlorid-Lösung entgegengesetzt ist. Wenn die Spannungdifferenz zwischen dem Tropfen und der entgegengesetzt geladenen Calciumchlorid-Lösung einen Schwellenwert erreicht, bei dem die Anziehung der Lösung auf den Tropfen die Kraft der Grenzflächen-Spannung, die den Tropfen an der Nadelspitze festhält, übersteigt, wird der Tropfen abgezogen und fällt in die Calciumchlorid-Lösung. Das elektrostatische Feld kann fluktuieren unter Anwendung einer Rechteckwellenform zur Erzeugung einer Folge von Spannungen, die den Schwellenwert kreuzen, wodurch eine kontinuierliche Reihe von Tropfen entsteht, jeweils einer pro Zyklus der Rechteckwellen. Dieses Verfahren scheint nicht zu den kleinen Tröpfchen und dünnen Überzügen zu führen, wie sie für die wirksame Transplantation erforderlich sind.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung von Tröpfchen und zur Gelbildung, wie es hier angewandt werden kann, ist in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/890 982, eingereicht am 29.5.1992, angegeben.
Das Gewebe, das lebende physiologisch aktive Zellen, wie Pankreas = Inselzellen, enthält, wird mit einem Überzug mit einer Dicke von 10 bis 200 um überzogen. Der Überzug umfaßt ein Gel aus einem Alginat eines zweiwertigen Metalls, vorzugsweise einem Calciumalginat, Magnesiumalginat oder Gemischen davon, wobei das Metallalginat aus einem Alginat gebildet worden ist, das frei ist von Verunreinigungen, die die Lebensfähigkeit und Lebensdauer von Gewebe-Transplantaten verschlechtern würden, die mit dem Alginat überzogen sind. Die Überzugs-Kapsel hat vorzugsweise eine ausreichend geringe Permeabilität und eine ausreichend große Dicke, um die Gewebezellen vor den immunologischen Substanzen des Wirts nach der Transplantation zu schützen, wobei der Überzug auch ausreichend durchlässig und dünn ist, um die Diffusion von ausreicht Nährstoffen und Zeliprodukten durch den Überzug zu ermöglichen, die für die Lebensfähigkeit der Zellen erforderlich sind. Der Überzug hat vorzugsweise eine Dicke von mindestens etwa 10 um und weniger als etwa 50 um. Insbesondere ist eine einzelne Zelle oder sind 1 bis 2 Zellen in einer einzelnen Kapsel vorhanden. Soweit erwünscht, kann eine Mehrzahl von Alginat- Überzügen über die Zellen aufgebracht werden, um eine mehrschichtige Kapsel zu erzeugen.
Wenn eine weitere Verringerung der molekularen Permeabilität er wünscht ist oder eine Verringerung der Quellung des Alginat-Überzugs erforderlich ist, kann der Alginatgel-Überzug gegebenenfalls, aber nicht notwendiger Weise, mit Poly-L-Lysin oder einem anderen physiologisch annehmbaren nicht toxischen Polykationen-Polymer vernetzt werden durch Eintauchen des überzogenen Gewebes in eine Lösung des Polykationen-Polymers. Die Verringerung der Permeabilität ist eine Funktion des Grades der Polymerisation des Polykations, der Reaktion des Polykations mit dem Alginat-Überzug und der Konzentration des Polykations in der Lösung sowie der Inkubationszeit. Die Auswahl des optimalen Polykations und der Reaktionsbedingungen ist wie üblich und liegt vollständig im fachmännischen Können. Die Reaktion kann beendet werden durch Entfernen des Polymers aus der Lösung oder durch Verdünnen oder Waschen.
Polylysin und Polykationen allgemein führen zur Fibrose und eine weitere Behandlung des Alginat/Polykationen-Komplexes ist erwünscht, um die biologische Verträglichkeit des überzogenen Produktes zu verbessern. Das Eintauchen der mit Polykationen umgesetzten Produkte in eine Lösung von Natriumalginat, um freie &epsi;-Aminogruppen auf der Obecfläche des Überzugs umzusetzen, führt zu einer Ionenaustausch-Reaktion, bei der der Metallalginat-Kem teilweise oder vollständig gelöst wird durch Entzug der zweiwertigen Metallionen davon. Wenn jedoch Spuren von löslichem Alginat nach einer solchen Behandlung verbleiben, kann eine langsame Diffusion der verflüssigten Materialien aus der Kapsel zu einer fibrotischen Reaktion führen, besonders wenn bekannt ist, daß das Alginat in seiner löslichen Form Fibrose induziert. Wenn die mit Alginat behandelten Produkte vor der vollständigen Solubilisierung der Alginate und ihrer Entfernung aus dem Kern mit einem zweiwertigen Metallion behandelt werden, kann das Metallion mit dem durch die Überzugsschicht nach außen wandernden Natriumalginat reagieren wodurch die Abgegrenztheit der Membran verschlechtert wird und die Wahrscheinlichkeit einer fibroplasfischen Anhaftung an die überzogenen Fläche erhöht wird.
Daher sollte, wenn Alginat in dem äußeren Überzug verwendet werden soll, die Reaktion so durchgeführt werden, daß das Kerngel entweder durch Ionenaustausch oder Chelatierung des Calciumions, Z.B. mit Natriumcitrat oder EDTA, vollständig gelöst wird. Das Produkt kann dann mit verschiedenen Veränderungen des Waschmediums oder durch Perkolation erschöpfend gewaschen werden, was dem löslichen Alginat ausreichend Zeit läßt, vollständig aus dem Überzug hinaus zu diffundieren. Wenn das Alginat durch den Überzug nach außen diffundiert, können freie restliche Aminogruppen des Polykations damit reagieren.
Vorzugsweise wird eine negative Ladung an die mit Polykationen komplexierten, mit Alginat überzogenen Gewebe-Transplantat angebracht indem sie mit Polyasparaginsäure umgesetzt werden. Aufgrund ihrer geringeren Bindungsaffinität führt Polyasparaginsäure weniger leicht zu einer Komplexbildung und entfernt Metallionen aus dem primären Alginatgel-Überzug. Sie reagiert mit dem Polykation ohne den primären Alginat-Überzug zu lösen. Die Verwendung von Polyasparaginsäure als letztes Reagens ergibt verschiedene Vorteile gegenüber der Verwendung eines Alginat-End-Komplexes. Sie ergibt eine höhere mechanische Festigkeit, kleinerer Durchmesser der überzogenen Produkte und eine geringe Permeabilität aufgrund der zusätzlichen Vernetzung und Volumenverminderung des kondensierten Überzugs.
Die Erfindung wird durch die folgenden speziellen aber nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert. Prozente sind als Gewichtsprozent und Temperaturen sind als Grad Celsius angegeben, soweit nicht anders erwähnt. In diesen Beispielen sind Verfahren, die im Labor zur Praxis gebracht worden sind, in der Vergangenheitsform beschrieben und Verfahren, die konstruktiv in der Anmeldung zur Praxis gebracht worden sind, sind in der Gegenwartsform beschrieben.

BEISPIELE

Beispiel 1: Herstellung von Alginat mit hohem Mannuronat-Gehalt

50 g nieder-viskoses Natriumalginat (LV Alginat, KELCO Di. von Merck & Co.), das von Macrocystis pyrifera isoliert worden war, wurden in 5 I Wasser gelöst und durch ein 50 um Sieb filtriert, um feine Teilchen zu entfernen. 18,6 g Dinatrium- EDTA wurden zu der Lösung zugegeben und gelöst. Die Lösung wurden auf einer Walzenmühle mit 200 g mit Hypochlorit gebleichter Aktivkohle (Mallinckrodt Aktivkohlepulver) 30 min vermischt, um organische Verunreinigungen, wie Polyphenole und Fucosezucker-Reste zu entfernen. Die Aktivkohle wurde dann durch 30 min langes Zentrifugieren entfernt. Die erhaltene Lösung wurde nacheinander durch Füterpapier, ein 0,45 um Filter, ein 0,22 um Filter und ein 0,1 um Filter, filtriert. Dann wurden 30 g Natriumchlorid zu der filtrierten Lösung zugegeben und durch Wälzen in einer Walzenmühle gelöst. Das Alginat wurde durch Zugabe von 5 I reinem Ethanol aus der Lösung ausgefällt. Die Probe wurde 30 min zentrifugiert, um eine Alginat- Perle zu erhalten und die Alginat-Perle wurde in Ethanol suspendiert und dann mit einer Pinzette auseinandergebrochen, um ein vollständiges Waschen der Probe sicherzustellen. Überschüssiges Ethanol wurde durch Drücken und Pressen des Niederschlags entfernt. Der erhaltene Niederschlag wurde in einem Ofen unter Vakuum bei 60ºC getrocknet.

Beispiel 2: Herstellung von Alginat mit hohem Guluronat-Gehalt

80 g Protan-Alginat wurden auf einer Walzenmühle in 89 I Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch ein 50 um Sieb filtriert, um feine Teilchen zu entfernen, und dann auf einer Walzenmühle mit 320 g gebleichter Aktivkohle unter 30 min langem kontinuierlichen Mischen vermischt. Die Aktivkohle wurde dann durch 30 min langes Zentrifugieren entfernt. Die erhaltene Lösung wurde nacheinander durch Filterpapier, ein 0,45 um Filter, ein 0,22 um Filter und ein 0,1 um Filter, filtriert. Es wurden 163 g Magnesiumchlorid zu der Lösung zugegeben und durch Wälzen in einer Walzenmühle gelöst. Dann wurden 210 ml einer 1,7%igen Calciumchlorid-Lösung zugegeben und durch 30 min langes Wälzen auf einer Walzenmühle vermischt. Die erhaltene Lösung wurde 30 min zentrifugiert, um eine Alginat-Perle zu erzeugen. Die Alginat-Perle wurde in 3,0 I 0,1 M EDTA, pH 7,0 durch Wälzen auf einer Walzenmühle gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde, soweit erforderlich, auf 7,0 eingestellt. Dann wurden 20 g Natriumchlorid zu dieser Lösung zugegeben und gelöst.
Das Alginat wurde durch Zugabe von 5 I reinem Ethanol aus der Lösung ausgefällt und anschließend 30 min zentrifugiert, um eine Alginat-Perle zu erhalten. Die Alginat-Perle wurde dann in Ethanol suspendiert und mit einer Pinzette auseinandergebrochen, um ein vollständiges Waschen der Probe sicherzustellen. Überschüssiges Ethanol wurde dann durch Drücken und Pressen des Niederschlags entfernt. Der Alginat-Niederschlag wurde in einem Ofen unter Vakuum bei 60ºC getrocknet.

Beispiel 3: Bestimmung des Gehalts an Fucose und Tannin-Äquivalenten

Standard-Tanninlösungen wurden hergestellt durch Verdünnen einer frisch hergestellten Tanninlesung (0,1 mg/ml), um Standardlösungen mit einer Konzentration von 10,0, 5,0, 1,0, 0,4 und 0,1 ug/ml zu erhalten. Dann wurde eine Tannin-Standardkurve erzeugt durch Auftragen der Konzentration an Tannin gegen die Absorption jeder Probe, die bei 700 nm in einem Spektrophotometer abgelesen wurde.
Es wurden Probelösungen der Alginate nach den Beispielen 1 und 2 mit 1 Gew.-% hergestellt. Ein 2 ml Anteil jeder Probe wurde in ein 5 ml Teströhrchen gegeben. Als Kontrolle wurden 2 ml Wasser in ein Teströhrchen gegeben. Dann wurde Natriumcarbonat-Lösung (0,4 ml Hach Cat. 675-49) zu jedem Röhrchen, einschließlich dem Vergleich, zugegeben. In jedes Röhrchen wurde TANNIVER® 3-Reagens (0,04 ml) gegeben und gründlich vermischt. Die Röhrchen wurden 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Probe wurde in eine Quarz-Küvette gegeben und die Absorption bei 700 nm in dem Spektrophotometer abgelesen. Nach dem Korrigieren der Absorption in der Küvette der Blindprobe wurde die Absorption aller Alginat- Lösungen gegen die Tannin-Standardkurve aufgetragen, um die Menge in ug Tannin-Äquivalente pro mg der Natriumalginat-Probe zu bestimmen. Es zeigte sich, daß das Alginat des Beispiels 1 l,0 ug Tannin-Äquivalente pro mg Natriumalginat (0,1 Gew.-%) enthielt. Es zeigte sich, daß das Alginat des Beispiels 2 0,7 ug Tannin- Äquivalente pro mg Natriumalginat (0,07 Gew.-%) enthielt.
Zum Vergleich wurden die zur Herstellung der Alginate des Beispiels 1 und Beispiels 2 verwendeten Ausgangs-Alginate auf ihren Polyphenol-Gehalt untersucht unter Anwendung des oben beschriebenen PolyphenollTannin-Assays. Es zeigte sich, daß jedes der zur Herstellung der gereinigten Alginate der Beispiele 1 und 2 verwendeten Ausgangs-Alginate etwa 2,0 ug Tannin-Äquivalente pro mg Alginat enthielt. Das Reinigungsverfahren des Beispiels 1 ergibt eine Verringerung der Tannin- Äquivalente um mehr als etwa 90% und das Verfahren des Beispiels 2 ergibt eine Verringerung der Tannin-Äquivalente um mehr als etwa 90%, bezogen auf die Ausgangs-Alginat-Zusammensetzungen. Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung ist wirksam, um den Gehalt an Polyphenolen in den Ausgangs-Alginaten wesentlich zu verringern.

Beispiel 4: Analyse von Fucose-Zucker

Der Gehalt an Fucose in Alginat-Proben kann durch Gaschromatographie/- Massenspektrometrie-Analyse (GC-MS) bestimmt werden. Um Proben für die GC- MS-Analyse herzustellen, wurden 1 bis 3 mg jeder Probe abgewogen und in ein Teströhrchen (100 mm · 13 mm) mit Schraubverschluß gegeben. H&sub2;SO&sub4; (0,5 ml, 1 N), enthaltend 50 ug Inositol als inneren Standard, wurden dann in jedes Röhrchen gegeben. Standard-Röhrchen, die 10,0, 1,0, 0,1 und 0,01 ug Fucose enthielten, wurden dann auf ähnliche Weise hergestellt.
Alle Röhrchen wurden 1 h (oder 3 h) auf 121ºC ERHITZT: Nach dem Erhitzen wurden die Röhrchen gekühlt und es wurde eine stöchiometrische Menge Bariumchlorid zugegeben. Die neutralisierten Röhrchen wurden zentrifugiert (10 min. 1500 · g), um das entstandene Bariumsulfat zu entfernen. In den Proben verbliebenes Wasser wurde unter einem Luftstrom abgedampft.
Die Proben wurden dann mit Natriumborhydrid (1 mg/ml NaBH&sub4; in 1 N NH4OH, 0,5 m(Lösung, 1 h bei Raumtemperatur) reduziert. Nach der Reduktion wurde überschüssiges Borhydrid durch Zugabe von 200 ul Eisessig zerstört und unter einem Luftstrom eingedampft.
Die reduzierten Proben wurden unter Verwendung von 200 uf Essigsäureanhydrid und 20 ul 1-Methylimidazol (10 min bei Raumtemperatur) acetyliert. Die Proben wurden dann zwischen 2 ml Wasser und 2 ml Methylenchlorid aufgeteilt: Die Wasserphase wurde entfernt und die verbliebene organische Phase wurde eingedampft. Dann wurden 50 ul Aceton zu jeder Probe zugegeben und ein Anteil der Aprobe in einen 5890 HP Gaschcomatographen eingespritzt, der an einen 5970 HP selektiven Massendetektor gekuppelt war. Die GC-Trennung wurde durchgeführt mit einer J & W DB-23 Säule (30 m, Innendurchmesser 0,25 mm) unter Anwendung eines Temperaturgradienten von 160 bis 210ºC bei 3ºClmin. Die MS-Analyse wurde durchgeführt durch Vergleich der Retentionszeiten und durch spektrale Vergleiche mit authentischen Standards.
Die Ergebnisse der Fucose-Analyse der Ausgangs-Alginate und der gereinigten Alginate der Beispiele 1 und 2 sind unten in der Tabelle angegeben.

Tabelle: Ergebnisse der Fucose-Analvse

PROBE FUCOSE (ug Fucose/mg Probe)

Beispiel 1 (Ausgang) 2,91 (0,291 Gew.-%)
Beispiel 1 (gereinigt) < 0,01 (< 0,001 Gew.-%)
Beispiel 2 (Ausgang) 0,70 (0,07 Gew.-%)
Beispiel 2 (gereinigt) 0,09 (0,009 Gew.-%)
Der Fucose-Gehalt in Beispiel 1 (gereinigt) ist um einen Faktor von mehr als 300, bezogen auf den Fucose-Gehalt in Beispiel 1 (Ausgang), verringert. Der Fucose-Gehalt in dem Alginat des Beispiels 2 (gereinigt) ist um einen Faktor 8, bezogen auf Beispiel 2 (Ausgang), verringert.

Beispiel 5: Herstellung einer Suspension von Pankreas-Inseln

Pankreas-Inseln, die von einer Ratte isoliert worden waren, wurden mit isotonische Salzlösung gewaschen; sie wurden in einer Alginat-Lösung suspendiert, die hergestellt worden war durch Lösen des nach den Verfahren des Beispiels 1 und Beispiels 2 hergestellten Alginats mit einer Konzentration von 10 000 Inseln pro ml in 1,9 Gew.-% gereinigtem Alginat in 10 mM HEPES, 0,01 M Natriumcitrat, enthaltend ausreichend Natriumchlorid, wie es für die Isoosmolarität erforderlich ist (etwa 0,81 Gew.-%), wobei die End-Lösung eine Viskosität von etwa 50 cP bei 32ºC hatte. Die Inseln hatten einen mittleren Durchmesser von etwa 150 um. Dieses Verfahren wurde für Hunde-Inseln wiederholt.

Beispiel 6: Überziehen von Pankreas-Inseln

Unter Anwendung einer elektrostatischen Gleichstrom-Spannung von 8 KV, die von einem von de Graaff-Generator zwischen einer Nadelspitze und der Erdung erzeugt worden war, wurde eine wäßrige 0,117 M Calciumchlorid-Lösung bei Raumtemperatur, eine Suspension von Pankreas-Inseln (25 Inseln pro ul), die nach dem Verfahren des Beispiels 5 hergestellt worden waren, durch eine 20 Gauge Nadel mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 200 ul/min geleitet. Die Suspension trat als dünner, verdünnter Strom aus der Nadel aus, der zu Tröpfchen geformt wurde, die Tröpfchen wurden in der Calciumchlorid-Lösung gesammelt. Die Tröpfchen wurden durch Reaktion mit den Calciumionen in der Lösung zu einem Gel geformt. Die Calciumalginat-Überzüge auf den Inseln waren glatt und gleichförmig und hatten eine Dicke von etwa 130 um. 'Die gesamten überzogenen Teilchen hatten einen mittleren Durchmesser von etwa 360 um.
Dieses Verfahren wurde mit Hunde-Inseln, die nach dem Verfahren des Beispiels gebildet worden waren, wiederholt.

Beispiel 7: Transplantation von Pankreas-Inselzellen in diabetische Mäuse (i.p.)

BalblC Mäuse wurden einige Tage vor der Transplantation durch i.p. Injektion von Streptozocin (250 mg/kg) mit 50 mg/ml in 0,1 M Citrat-Puffer, pH 4, 5, diabetisch gemacht.
Überzogene Langerhans Inseln vom Hund, die nach dem Verfahren des Beispiels 6 hergestellt worden waren, wurden in einer Menge von 2 000 bis 3 000 Inseln pro Maus einer Gruppe von Mäusen i.p. injiziert. Die Mäuse wurden und blieben während mehr als 72 Wochen (18 Monate) euglykämisch. Einige Mäuse kehrten einige Wochen nach der Implantation wieder in den diabetischen Zustand zurück. Diese Mäuse wurden getötet und die überzogenen Inseln untersucht. Es zeigte sich, daß die mit Alginat überzogenen Inseln lebensfähig, frei von Fibrose und frei von Makrophagen-Überwucherung waren (nur 2 bis 10 Makrophagen pro überzogenen Insel-Kapsel).
Kügelchen aus dem gleichen Alginat (ohne Zellen) wurden einer Kontrollgruppe von BalblC Mäusen i.p. injiziert. Die Mäuse wurden in Zeitabständen von wenigen Tagen bis zu einigen Wochen getötet Die Alginat-Kügelchen wurden histologisch untersucht und es zeigte sich, daß sie frei waren von Fibrose und im wesentlichen frei von Makrophagen-Ü'berwucherungen.
Offensichtlich sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Lichte der obigen Lehre möglich. Es ist daher verständlich, daß die Erfindung im Rahmen der beiliegenden Ansprüche auf andere Weise durchgeführt werden kann, als hier speziell beschrieben.

Claims

1. Gereinigte nicht fibrinognene Alginat-Zusammensetzung, die geeignet ist zum Überziehen von funktionellen Gewebe- oder Zelltransplantaten mit einer wesentlich geringeren Menge an Fucose, Polyphenolen und Proteinen, wobei das nicht-fibrinogene Alginat so gereinigt ist, daß es weniger als 0,02 Gew.-% Fucose und weniger als 0,2 Gew.-% Polyphenole, angegeben in Werten für Tanninsäure, enthält;

wobei das Molekulargewicht des Alginats im Bereich von 6 bis 120 Kllodalton liegt;

wobei das Alginat ein Gemisch aus Mannuronat und Guluronat umfaßt, wobei die Menge an Mannuronat, berechnet als Verhältnis von Mannuronat/Mannuronat + Guluronat, in dem Alginat im Gewichtsbereich von 0,25 bis 0,75 liegt;

wobei das Alginat nicht-fibrinogen ist, wenn es zum Überziehen von Zellen verendet wird, und

wobei die mit dem nicht fibrinogenen Alginat überzogenen Zellen, wenn sie einer Maus implantiert werden, während mindestens 60 Tagen nach der Implantation keine Fibrose hervorrufen.

2. Zusammensetzung nach Anspruch, hergestellt nach einem Reinigungsverfahren, umfassend die folgenden Stufen:

(a) Herstellen einer wäßrigen Alginatlösung, umfassend ein Gemisch aus Mannuronat/Mannuronat + Guluronat in einem Gewichtsverhältnis von 0,25 zu 0,75 und ein Chelatierungsmittel für zweiwertige Metallionen;

(b) Zusammenbringen der Alginatlösung mit gebleichter Aktivkohle in einer Menge und während einer Zeit, die ausreichen, um Fucose, Polyphenole, Proteine und andere Verunreinigungen, die in dem Alginat vorhanden sind, zu absorbieren, um ein nicht-fibrinogenes Alginat herzustellen, und anschließendes Entfernen der Aktivkohle von der Alginatlösung;

(c) Zugeben von Ethanol zu der Alginatlösung in einer Menge, die wirksam ist, um das Alginat aus der Alginatlösung auszufällen, und

(d) Isolieren der ausgefällten nicht-fibrinognen Alginat-Zusammensetzung.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die ausgefällte nicht-fibrinogne Alginat-Zusammensetzung der Stufe (d) verwendet wird, um ein lebensfähiges funk- tionelles Gewebe oder Zellen zu überziehen, und mit zweiwertigen Metallionen zu einem Gel geformt wird.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die in der Zusammensetzung verbliebene Menge an Fucose kleiner ist als 0,01 Gew.-%.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die in der Zusammensetzung verbliebene Menge an Fucose kleiner ist als 0,005 Gew.-%.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die in der Zusammensetzung verbliebene Mange an Polyphenol kleiner ist als 0,1 Gew.-%, in Werten für Tanninsäure.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die in der Zusammensetzung verbliebene Mange an Polyphenol kleiner ist als 0,075 Gew.-%, in Werten für Tanninsäure.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei in Stufe (b) das Verhältnis von Alginat zu Aktivkohle von 1 : 1 bis 1 : 20 beträgt.

9. Nicht-fbrinogenes Gel aus zweiwertigen Metallionen und Alginat, umfassend zweiwertige Metallionen und ein nicht-fibrinogenes Alginat, das gereinigt worden ist mit Aktivkohle mit großer Oberfläche und das ein. Molekulargewicht von 6 bis 120 kD, ein Gewichtsverhältnis von Mannuronatl(Mannuronat + Guluronat) von 0,25 bis 0,75 aufweist, wobei die Menge an Fucose kleiner als 0,02 Gew.-% ist und die Menge an Polyphenol, in Werten für Tanninsäure, kleiner als 0,2 Gew.-% ist und wobei eine mit dem Alginatgel überzogene Zelle, wenn sie einer BALB/C-Maus implantiert wird, während mindestens 60 Tagen nach der Implantation im wesentlichen keine Fibrose hervorruft.

10. Alginatgel nach Anspruch 9, wobei das Gel während mindestens 6 Monaten nach der Implantation im wesentlichen keine Fibrose hecvorruft.

11. Alginatgel nach Anspruch 9, wobei das Gel während mindestens 12 Monaten nach der Implantation im wesentlichen keine fibrose hervorruft.

12. Alginatgel nach Anspruch 9, wobei das Gel während mindestens 18 Monaten nach der Implantation im wesentlichen keine Fibrose hervorruft.

13. Verfahren zum Überziehen von Gewebe mit einem nicht fibrinogenen AIginat, umfassend:

(a) Herstellen einer wäßrigen Alginatlösung, umfassend ein Alginat mit einem Molekulargewicht von 6 bis 120 kD, umfassend ein Gemisch aus Mannuronatl- Mannuronat + Guluronat in einem Gewichtsverhältnis von 0,25 zu 0,75 und einem Chelatierungsmittel für rweiwertige Metallionen;

(b) Zusammenbringen der Alginatlösung mit gebleichter Aktivkohle in einer Menge und während einer Zeit, die ausreichen, um in dem Alginat vorhandene Fucane zu absorbieren, um ein nicht-fibrinogenes Alginat mit einer wesentlich geringeren Menge an Fucose, Polyphenolen und Proteinen herzustellen, wobei die Menge an Fucose auf weniger als 0,02 Gew.-% und die Menge an Polyphenolen, angegeben in Werten für Tanninsäure, auf weniger als 0,2 Gew.-% verringert ist;

(c) Entfernen der gebleichten Aktivkohle von der Alginatlösung:

(d) Zugeben von Ethanol zu der Alginatlösung in einer Menge, die wirksam ist, um das Alginat aus der Alginatlösung auszufällen,

(e) Isolieren des ausgefällten Alginats und

(f) Überziehen von lebensfähigem physiologisch aktivem Gewebe mit dem ausgefällten nicht fibrinogenen Alginat.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die gebleichte Aktivkohle erhalten worden ist durch Zusammenbringen von Aktivkohle mit einer Teilchengröße von 100 mesh oder kleiner mit einer 0,005 bis 0,50 M Natriumhypochlorit-Lösung während etwa 5 bis 30 Minuten.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Verhältnis von gebleichter Aktivkohle zu Alginat in der Alginatlösung 1 : 1 bis 1 : 20 (Gew./Gew.) beträgt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das nicht-fibrinogene Alginat zur Herstellung einer Alginatgel-Kapsel, umfassend lebensfähiges physiologisch aktives überzogenes Gewebe oder Zellen, verwendet wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Überzug eine Dicke von mindestens 10 um und weniger als 200 um hat.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Gewebe mindestens eine oder mehrere Zellarten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pankreasinselzellen, Nervenzellen, Nierenrindenzellen, Gefäßendothelzellen, Schilddrüsenzellen, Nebennierenzellen, Ihymuszellen, Ovarzellen und Leberzellen, umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Gewebezellen Pankreasinselzellen sind.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei eine wirksame Menge der überzogenen Inseln, wenn sie einer diabetischen Maus implantiert werden, ermöglicht, daß die Maus mindestens 6 Monate nach der Implantation euglykämisch bleibt.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die diabetische Maus mindestens 12 Monate nach der Implantation euglykämisch bleibt.

22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die diabetische Maus mindestens 18 Monate nach der Implantation euglykämisch bleibt.