DE69327386T2

DE69327386T2 - Rekombinanter Vektor, Verfahren zur Herstellung einer Kartoffelpflanze mit Immunität gegen PVY-T und immune Kartoffelpflanze

Info

Publication number: DE69327386T2
Application number: DE69327386T
Authority: DE
Inventors: Yumiko Hayashi; Naoto Kadotani; Keisuke Kasaoka; Shigeru Kuwata
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1992-10-21
Filing date: 1993-10-20
Publication date: 2000-08-24
Anticipated expiration: 2013-10-21
Also published as: DE69327386D1; US6228637B1; EP0598493B1; EP0598493A1; JPH06133783A; DK0598493T3; ES2141751T3; JP3452372B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

I. GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf einen rekombinanten Vektor, welcher Kartoffelpflanzen Immunität gegenüber Kartoffelvirus Y Nekroselinie (hier im nachfolgenden auch als "PVY-T") bezeichnet, geben kann.
Diese Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Geben von Immunität gegenüber PVY-T an Kartoffelpflanzen und auf eine Kartoffelpflanze mit Immunität gegenüber PVY-T.

II. BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK

PVY-T erzeugt Tabakgelbfleckennekrose, welche schwere Nekrose in Tabak darstellt. PVY-T wird durch Blattläuse übertragen. Wenn mit PVY-T infizierte Kartoffelpflanzen kultiviert werden, kann PVY-T durch Blattläuse übertragen werden, wodurch Tabak schwere Schaden zugefügt werden kann. Obwohl PVY-T Mosaikkrankheit in Kartoffelpflanzen erzeugen kann, sind die Symptome schwach und unklar in einer Anzahl von Auswahlen, so daß es schwierig ist, die erkrankten Pflanzen bei Kultivierung von Saatkartoffeln zu entfernen. Deshalb können die erkrankten Kartoffelpflanzen als eine Quelle von PVY-T dienen.
Bei einigen Kartoffelauswahlen erzeugt Inokulation von PVY-T Nekroseflecken in dem beimpften Blatt bei der gegenwärtigen Generation, während in der nächsten Generation Symptome nicht beobachtet werden, und Infektion durch PVY-T nicht nachgewiesen werden kann. Wenn diese Kartoffelauswahlen durch Kreuzzüchten gezüchtet werden, können PVY-T resistente Kartoffelpflanzen erhalten werden. Es wird jedoch erwartet, daß es so lange wie 10 Jahre oder länger dauert, eine Auswahl zu erhalten, die gegenüber PVY-T durch dieses Verfahren resistent ist. Wenn Resistenz gegenüber PVY-T Kartoffelpflanzen durch Gentechnikverfahren gegeben werden kann, können PVY-T-resistente Kartoffelpflanzen in einer kurzen Zeitdauer erhalten werden, welches sehr vorteilhaft ist.
Ein Verfahren zum Geben von Resistenz einer Pflanze gegenüber einem Virus ist bekannt, bei dem das Gen, daß das Hüllprotein (hier im nachfolgenden auch als "CP" bezeichnet) des Virus codiert, in die Pflanze eingeführt wird (Offengelegte Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 62-201527 und 62-285791; Plant Cell Technology Band 4, Nr. 2 (1992). Seiten 101-109, Bio/Technology 8, 127-134 (1990)). Gemäß diesem Verfahren erzeugt die Pflanze, obwohl der Pflanze Resistenz gegenüber dem Virus gegeben wird, das CP des Virus. Wenn eine Pflanze ein Virus CP herstellt, werden Aminosäuren und Energie für die Herstellung von Virus CP verbraucht, so daß das Wachstum der Pflanze nicht so gut wie andere Pflanzen ist, welche das Virus CP nicht herstellen. Ferner muß, wenn eine Pflanze wie beispielsweise eine Kartoffel als ein Nahrungsmittel verwendet wird, die Sicherheit des CP gegenüber Gesundheit untersucht werden. Somit ist es sehr vorteilhaft, wenn eine Pflanze erhalten wird, welche gegenüber einem Virus resistent ist, wobei sie nicht das Virus CP erzeugt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten Vektor zur Verfügung zu stellen, durch den Immunität gegenüber PVY-T Kartoffelpflanzen gegeben werden kann, ohne die Pflanzen zu veranlassen, das CP von PVY-T herzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, Kartoffelpflanzen Immunität gegenüber PVY-T zu geben. Noch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Kartoffelpflanze mit Immunität gegenüber PVY-T zur Verfügung zu stellen.
Die gegenwärtigen Erfinder forschten intensiv, um zu finden, daß Immunität gegenüber PVY-T Kartoffelpflanzen gegeben werden kann, ohne die Kartoffelpflanzen zu veranlassen, das CP von PVY-T herzustellen, indem die Kartoffelpflanzen mit einem rekombinanten Vektor transformiert werden, der ein Gen enthält, das das CP von PVY-T bei einer stromabwärts gelegenen Region der Leader-Sequenz von RNA4 des Gurkenmosaikvirus (hier im nachfolgenden auch als "CMV" bezeichnet) codiert, wodurch die vorliegende Erfindung fertiggestellt wird.
Das heißt, die vorliegende Erfindung liefert einen rekombinanten Vektor, umfassend einen Promotor, welcher in einer Kartoffelpflanzenzelle wirkt: eine operabel gekoppelte Leader-Sequenz von RNA4 von CMV, welche stromabwärts des Promotors angeordnet ist; und eine operabel gekoppelte Sequenz welche ein CP von PVY-T codiert, welche stromabwärts der Leader-Sequenz angeordnet ist; wobei der rekombinante Vektor fähig ist, Kartoffelpflanzen zu transformieren. Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Geben von Immunität gegenüber PVY-T einer Kartoffelpflanze, umfassend Transformieren der Kartoffelpflanze mit dem rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung.
Eine Kartoffelpflanze mit Immunität gegenüber PVY-T, welche nicht CP von PVY-T herstellt, wurde zuerst zur Verfügung gestellt. Deshalb ist die vorliegende Erfindung in Bezug auf die Verhütung von Tabakgelbfleckennekrose und andere Krankheiten von Kartoffelpflanzen, in denen PVY-T teilnimmt, wirksam.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Genkarte, die pBIPT(CML) zeigt, welches ein Beispiel des rekombinanten Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung ist:
Fig. 2 zeigt die Aminosäurensequenz des CP des PVY-T, welches in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendet wurde:
Fig. 3 zeigt die Nucleotidsequenz des CP Gens des PVY-T, welches in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.
Fig. 4 zeigt die bestimmte Nucleotidsequenz des in pBIPT(CML) eingefügten DNA Fragments, welches in den Beispielen der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Immunität gegenüber PVY-T", daß nach Beimpfung einer Kartoffelpflanze mit PVY-T die Kartoffelpflanze nicht erkrankt ist, und die Kartoffelpflanze wird nicht hergestellt, ein Träger von PVY-T zu sein. In anderen Worten, die Vermehrung von PVY-T in der Kartoffelpflanze wird nicht nachgewiesen.
Die Leader-Sequenz von RNA4 von CMV, welche in den rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung eingefügt ist, ist bekannt und in Nitta et al., Japan Plant Pathology Association Journal, Band 54, Seiten 516-522 beschrieben. Die Nucleotidsequenz der Leader-Sequenz von RNA4 von CMV, welche in den im nachfolgenden beschriebenen Beispielen verwendet wurde, ist wie folgt, welches auch in Sequenz ID Nr. 3 gezeigt ist (erstes bis 85tes Nucleotid):
TCTAGAGTTATTGTCTACTGACTATATAGAGAGTGTGTGTGTGCTGTGTTTTCTCT TTTGTGTCGTAGAATTGAGTCGAGTCATG
Die Leader-Sequenz von RNA4 von CMV kann leicht durch chemische Synthese hergestellt werden oder durch Herausschneiden aus CMV Genom oder durch Verstärken der Sequenz durch PCR Verfahren unter Verwenden des CMV Genoms als eine Matrize.
Stromabwärts der zuvor beschriebenen Leader-Sequenz von RNA4 von CMV ist ein Gen, das CP von PVY-T codiert, operabel eingefügt. Die Aminosäurensequenz von CP von pVY-T wie auch die Nucleotidsequenz, die diese codiert, ist bekannt. Die in den Beispielen im nachfolgenden verwendete Aminosäuresequenz und die Nucleotidsequenz sind in Fig. 2 und 3 gezeigt wie auch in Sequenz ID. Nr. 1 und 2. Das CP von PVY-T codierende Gen kann leicht mithilfe eines herkömmlichen Verfahrens wie beispielsweise PCR Verfahren unter Verwenden des PVY-T Genoms als eine Matrize hergestellt werden.
Die zuvor beschriebene Leader-Sequenz von RNA4 von CMV und das CP von PVY-T codierende Gen sind stromabwärts eines Promotors in einer operablen Weise eingefügt. Der Promotor kann irgendein bekannter Promotor sein, welcher die Transkription in Kartoffelpflanzenzellen durchführen kann. Beispiele eines derartigen Promotors umfassen 35S Promotor von Blumenkohlmosaikvirus, NOS Promotor von Agrobakterium, Klasse-I Patatinpromotoren von Kartoffel und rbcS Promotoren von Pflanzen, obwohl der Promotor, welcher verwendet werden kann, nicht darauf beschränkt ist. Unter diesen ist der 35S Promotor von Blumenkohlmosaikvirus bevorzugt.
Der rekombinante Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf irgendeinem Vektor basieren, welcher Kartoffelpflanzen transformieren kann, und welcher in Kartoffelpflanzenzellen replizieren kann. Der Vektor hat einen Replikationsursprung, welcher in Kartoffelpflanzenzellen wirkt und kann vorzugsweise einen Terminator und einen entsprechenden Selektionsmarker wie beispielsweise Arzneimittelresistenz haben. Ein derartiger Vektor ist gut bekannt und ist kommerziell erhältlich. In den Beispielen im nachfolgenden wird pBI121, welcher ein in Pflanzenzellen wirkender Plasmidvektor ist, welcher kommerziell von CLONETECH, USA, erhältlich ist, verwendet. Die Genkarte eines Beispiels des rekombinanten Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung, welche in den Beispielen im nachfolgenden hergestellt wurde, in das die zuvor beschriebene Leader- Sequenz von RNA4 und das CP Gen von PVY-T eingefügt sind, ist in Fig. 1 gezeigt.
Es ist in der Technik gut bekannt, daß, selbst, wenn eine geringe Anzahl von Nucleotiden in einer DNA substituiert, gelöscht oder eingefügt sind, die Funktion der DNA nicht wesentlich beeinflußt werden kann. Deshalb sind, selbst wenn die Nucleotidsequenz einer Leader-Sequenz von RNA4 von CMV und/oder die codierte Aminosäuresequenz oder die Nucleotidsequenz von CP Gen von PVY-T unterschiedlich von denjenigen in Fig. 2 bzw. 3 beschriebenen wegen leichter Substitution, Deletion oder Insertion sind, so lange wie der rekombinante Vektor Kartoffelpflanze transformieren kann, wodurch der Kartoffelpflanze Immunität gegenüber PVY-T gegeben wird, ohne die Kartofelpflanze zu veranlassen, CP von PVY-T herzustellen, die Leader-Sequenz von RNA4 und das Gen, das CP von PVY-T codiert, innerhalb des Umfangs der Terminologien von "Leader-Sequenz von RNA4 von Gurkenmosaikvirus" und "Sequenz, welche ein Hüllprotein von Kartoffelvirus Y Nekroselinie codiert" in den Ansprüchen konstruiert. Beispielsweise sind, was das CP von PVY-T anbelangt, während das in den Niederlanden (Van Der Vlugt et al., (1989) J. Gen. Virology 70. 229-233) isolierte CP des PVY-T oder das von der Gruppe der Hokkaido Universität (OSHIMA et al., (1991). Japan Plant Pathology Association Journal. 57, 615-622) veröffentlichte CP des PVY-T eine Aminosäurensequenz hat, die unterschiedlich von derjenigen in Fig. 2 oder Sequenz ID Nr. 1 gezeigten ist, welche in den Beispielen im nachfolgenden in 2 oder 3 Aminosäuren verwendet wurde, die Sequenzen, die diese Aminosäuresequenzen codieren, auch innerhalb des Umfangs der Terminologie "Sequenz, welche ein Hüllprotein von Kartoffel virus Y Nekroselinie codiert", in den Ansprüchen. Ferner ist es unnötig zu sagen, daß, weil Nucleotidsequenzen, die Aminosäuresequenzen codieren, Degenerierung haben, die Sequenzen, welche die in Fig. 2 oder Sequenz ID Nr. 1 gezeigte Aminosäurensequenzen codieren, aber unterschiedliche Nucleotidsequenzen von derjenigen in Fig. 3 oder Sequenz ID Nr. 2 gezeigten haben, in der Terminologie "Sequenz, welche ein Hüllprotein von Kartoffelvirus Y Nekroselinie codiert", in den Ansprüchen eingeschlossen sind.
Der rekombinante Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung kann leicht hergestellt werden, indem die zuvor genannte Leader-Sequenz von RNA4 von CMV und die Sequenz, die CP von PVY-T codiert, in den zuvor genannten Vektor mithilfe eines gut bekannten herkömmlichen Verfahrens unter Verwenden von Restriktionsenzymen eingefügt wird. Ein spezifisches Beispiel zum Konstruieren des rekombinanten Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung wird detailliert in den hier im nachfolgenden beschriebenen Beispielen beschrieben.
Kartoffelpflanzen können mit dem rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert werden, vorzugsweise mithilfe eines Verfahrens, bei dem Agrobakterium tumefaciens, welches eine starke Infektionskraft gegenüber Pflanzen hat, zuerst transformiert wird, und das transformierte Agrobakterium tumefaciens wird dann in eine Kartoffelpflanze geimpft, obwohl das Transformationsverfahren nicht auf dieses Verfahren beschränkt ist. Das zuvor erwähnte Transformationsverfahren unter Verwenden von Agrobakterium tumefaciens ist in der Technik bekannt und kann mithilfe des Gefrier-Tau- Verfahrens (G. An et al., (1988) Binary Vectors. In Plant Molecular Biology Manual A3, Kluwer Academic, Dordrecht Seiten 1-19) durchgeführt werden.
Wie konkret in den hier im nachfolgenden beschriebenen Beispielen gezeigt ist, kann durch Transformieren von Kartoffelpflanzen mit dem rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung Immunität gegenüber PVY-T Kartoffelpflanzen gegeben werden. Darüber hinaus wird in den Kartoffelpflanzen, denen Immunität gegenüber PVY-T mithilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung gegeben wurde, obwohl das CP Gen von PVY-T transkribiert wird, CP nicht hergestellt. Ferner haben mithilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellte Kartoffeln die gleichen Morphologien wie diejenigen von normalen Kartoffeln.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt mithilfe der Beispiele davon beschrieben. Es sollte bemerkt werden, daß die Beispiele nur für den Veranschaulichungszweck dargestellt sind, und nicht in irgendeiner Weise einschränkend sein sollten.

BEISPIEL

(1) ISOLIERUNG VON CP GEN VON PVY-T

Lyophylisierte Probe eines mit PVY-T infizierten Tabakblatts (UDAGAWA et al., 1972. Japan Plant Association Journal 38. 210) wurde auf Blätter von Tabakpflanzen unter Erhalten von systemisch infizierten Tabakpflanzen geimpft. Aus den gemahlenen Blättern wurde PVY-T durch fraktionierende Zentrifugation gereinigt. Zu dem erhaltenen gereinigten PVY-T wurde Natriumdodecylsulfat zu einer Endkonzentration von 1 Gew.-% hinzugegeben, wodurch RNA von CP dissoziiert wurde. Aus dem sich Ergebenden wurde RNA mittels Sucrose- Dichte-Gradienten-Zentrifugation (0-32,5 Gew.-% Sucrose, 39000 Upm, 4 Stunden) abgetrennt. Zu der abgetrennten RNA wurde Ethanol zu einer Endkonzentration von 70 Gew.-% unter Fällen der RNA hinzugegeben, und die gefällte RNA von PVY-T wurde mittels Zentrifugation gewonnen. Zu der auf diese Weise erhaltenen RNA wurde Primer 1 (siehe Tabelle 1) hinzugegeben, und cDNA wurde unter Verwenden von M-MLV Reverse Transkriptase (kommerziell von BRL, USA erhältlich) in Übereinstimmung mit den dem kommerziellen Produkt beigefügten Instruktionen hergestellt. Zu der erhaltenen cDNA wurden Primer 1 und Primer 2 (siehe Tabelle 1) hinzugegeben, und das sich Ergebende wurde Polymerasekettenreaktion (PCR) nach Hinzugeben von Taq DNA Polymerase (kommerziell erhältlich von TAKARA SHUZO CO., LTD, Kyoto. JAPAN) ausgesetzt. Die PCR wurde in dem Puffer, der in den Instruktionen beschrieben ist, bei 93ºC, 1 Minute, 42 W, 1 Minute und 72ºC, 1 Minute lang durchgeführt, und dieser Wärmezyklus wurde 30mal wiederholt, wodurch das CP Gen verstärkt wurde. Beide Enden der verstärkten DNA wurden mit Sst I und Xba I weggeschnitten, und das Verdaute wurde Elektrophorese auf 1,2 Gew.-% Agarose ausgesetzt. Die gewünschte DNA wurde dann unter Verwenden von DEAE Cellulosemembran NA4 (kommerziell von Schleicher & Schuell, USA erhältlich) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Plasmid pBluescript II SK(+) (kommerziell von STRATAGENE, USA erhältlich) eingefügt, welche mit Restriktionsenzymen Sst I und Xba I verdaut worden war. E. coli JM 109 wurde mit dem sich ergebenden Plasmid (pPTCP) transformiert. Aus den erhaltenen Kolonien wurde Plasmid pPTCP gewonnen und mit Restriktionsenzymen Sst I und Xba I verdaut. Als ein Ergebnis wurde Insertion von CP Gen von PVY-T mit einer Größe von etwa 0,8 kb bestätigt.

(2) BESTIMMUNG DER NUCLEOTIDSEQUENZ VON CP GEN VON PVY-T

Plasmid pPTCP wurde mit 0,4 M NaOH (37ºC, 5 Minuten) denaturiert und mit Ethanol gefällt, gefolgt von Verdampfung bis zur Trockne. Unter Verwenden der auf diese Weise erhaltenen Probe wurde die Nucleotidsequenz von CP Gen von PVY-T unter Verwenden von T7 DNA Polymerasesequenzkit (kommerziell von PHARMACIA erhältlich) und Primern (M4 und RV, kommerziell von TAKARA SHUZO CO., LTD) erhältlich, bestimmt.

(3) INSERTION VON RNA4 LEADER-SEQUENZ VON CMV

E. coli BW 313 (Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 488-492, kommerziell von TAKARA SHUZO CO., LTD erhältlich), transformiert mit Plasmid pPTCP, wurde in flüssigem Medium kultiviert. Als die Absorption bei 600 nm bis 0,4 reichte, wurde Helfer Phage M13K07 hinzugegeben, und das sich Ergebende wurde über Nacht in der Anwesenheit von Kanamycin (70 pg/ml) kultiviert. Das Kulturmedium wurde bei 15 000 Upm 15 Minuten lang zentrifugiert, und Polyethylenglykol 6000 und NaCl wurden zu dem Überstand zu Endkonzentrationen von 4 Gew.-% und 0,5 M gegeben. Nachdem man das sich Ergebende 1 Stunde lang in Eis hatte stehen lassen, wurde Phage mittels Zentrifugation bei 15000 Upm 15 Minuten lang gefällt. Der gewonnene Phage wurde in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA. pH 8,0) suspendiert, und gleiches Volumen von Wasser-gesättigtem Phenol/Chloroform (1 : 1) wurde hinzugegeben, gefolgt von 5 minütigem Rühren. Das sich Ergebende wurde 15 Minuten lang bei 15000 Upm zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wurde Ethanolfällung unter Erhalten einer Matrizen DNA ausgesetzt. Zu der auf diese Weise erhaltenen Matrizen DNA wurde Primer 3 (siehe Tabelle 1) hinzugegeben, und ein Teil der Leader-Sequenz von RNA4 von CMV wurde unter Verwenden eines sequenzspezifischen Rekombinationskits MUTAN-K (kommerziell von TAKARA SHUZO CO., LTD. erhältlich) eingefügt, wobei ein Plasmid pPTCP(cm) erhalten wurde. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid pPTCP (cm) wurde dann als eine Matrize verwendet, wobei die verbleibende Leader-Sequenz unter Verwenden von Primer 4 eingefügt wurde (siehe Tabelle 1). Die Nucleotidsequenz der Insertion in das Plasmid wurde in der gleichen Weise, wie zuvor beschrieben, bestimmt. Die bestimmte Nucleotidsequenz ist in Fig. 4 und Sequenz ID Nr. 3 gezeigt. Wie gezeigt, wurde bestätigt, daß ein Plasmid pPTCP(CML) mit einer Leader-Sequenz von RNA4 von CMV stromaufwärts des CP Gens von PVY-T erhalten wurde.

TABELLE 1 NUCLEOTIDSEQUENZ VON VERWENDETEN PRIMERN

Primer 1: 5'AAAATCTAGATGAAATGACACAATCGATGCAGGAGGA3'
Primer 2: 5'TTTTGAGCTCTCACATGTTCTTCACTCCAAGTAGAG3'
Primer 3: 5'GGGGATCCACTAGTTCTAGAGTTTTCTCTTTTGTGTCGTAGAATT GAGTCGAGTCATGGGAAATGACACAATCGATGCAGGAGGA3'
Primer 4 : 5'GGGATCCACTAGTTCTAGAGTTATTGTCTACTGACTATATAGAGA GTGTGTGTGTGCTGTGTTTTCTCTTTTGTGTGT3'

(4) KONSTRUKTION DES REKOMBINANTEN VEKTORS ZUM TRANSFORMIEREN VON PFLANZEN

Aus einem Expressionsvektor für Pflanzen pBI121 (kommerziell von CLONETECH, USA erhältlich) wurde β-Glucoronidase Gen mittels Restriktionsenzymen Xba I und Sst I entfernt, und das sich ergebende Vektorfragment wurde mittels Elektrophorese auf 0,8 Gew.-% Agarosegel gewonnen. Das auf diese Weise gewonnene von pBI121 stammende Fragment und mit Xba I und SstI ausreichend verdaute Plasmid pPTCP(CML) wurden ligasiert, und E. coli JM109 wurde mit dem Ligasierungsprodukt transformiert. Das sich Ergebende wurde auf LB Platten kultiviert, die 30 ug/ml Kanamycin enthielten, und ein rekombinanter in Fig. 1 gezeigter Vektor pBIPT(CML) zum Transformieren von Pflanzen wurde aus den gebildeten Kolonien erhalten.

(5) TRANSFORMATION VON AGROBAKTERIUM TUMEFACIENS

Mittels des Gefrier-Tau-Verfahrens wurde Agrobakterium tumefaciens LBA4404 (Hockman et al., Nature 303: 179-183, 1983) mit dem CP von PVY-T exprimierenden Vektor pBIPT (CML) unter Erhalten von Agrobakterium tumefaciens LBA4404 (pBIPT(CML))transformiert.

(6) TRANSFORMATION VON KARTOFFELPFLANZEN

Kartoffelpflanzen wurden transformiert, indem in (5) erhaltenes Agrobakterium tumefaciens LBA4404 (pBIPT(CML)) verwendet wurde. Kartoffelauswahlen May Queen, Toyoshiro, Danshaku (Auswahlen von Japan) und Saco (Auswahl von USA) wurden der Transformation ausgesetzt. Virusfreie Pflanzen dieser Auswahlen wurden aseptisch in einem Medium gezüchtet, das anorganische Salze von Linsmaier und Skoog (1965), 30 g/l Sucrose und Agar (0,8 Gew.-%) enthielt. Die Blätter der auf diese Weise gezüchteten virusfreien Pflanzen wurden in Stücke mit den Abmessungen 0,6-1,0 cm · 0,5-1,0 cm geschnitten, und die Stiele (welche Knoten enthalten oder nicht enthalten können) wurden in Stücke mit einer Länge von 0,5-2,0 cm geschnitten. Diese Stücke der Blätter und Stiele wurden zusammen mit etwa 10&sup8; Zellen von Agrobakterium tumefaciens LBA4404 (pBIPT(CML)) in einem flüssigen Medium, welches anorganische Salze von Linsmaier und Skoog und 30 g/l Glucose enthielt, bei 25ºC 48 Stunden lang kultiviert. Die Stücke von Blättern und Stielen wurden 2-3 mal mit sterilisiertem Wasser gewaschen, welches 250 mg/l Cefotaxim enthielt, wodurch Bakterien abgewaschen wurden, und die Stücke wurden dann auf die Regenerierungsmedien mit den in Tabellen 2 und 3 gezeigten Zusammensetzungen gesetzt. Im Falle des Verwendens des in Tabelle 3 gezeigten Regenerierungsmediums (LSZK100) brachen Kanamycin-resistente Kalli aus den implantierten Stücken von Blättern und Stielen etwa 20 Tage nach Beginnen der Kultur hervor. Diese Kalli wurden auf dem zuvor genannten Medium weitere 10-30 Tage lang kultiviert und Kanamycin-resistente Blätter und Stiele wiedergewonnen. Die wiedergewonnenen Blätter und Stiele wurden in Stücke geschnitten, und die Stücke wurden auf einem Agar- (0,8 Gew.-%) Medium, welches anorganische Salze von Linsmaier und Skoog, 30 g/l Sucrose, 250 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Kanamycin enthielt, kultiviert. In Fällen, wo das in Tabelle 2 gezeigte Regenerierungsmedium (KS1) verwendet wurde, war die Bildung von Kalli und Regenerierung von Pflanzen langsamer als in Fällen, wo LSZK100 verwendet wurde. Die Zahl der mithilfe des zuvor beschriebenen Verfahrens erhaltenen Transformanten ist in Tabelle 4 gezeigt.

TABELLE 2 ZUSAMMENSETZUNG DES REGENERIERUNGSMEDIUMS (KS1 MEDIUM)

Komponente Konzentration (mg/l)

MS Medium*, aus dem NH&sub4;NO&sub3; entfernt wird
NH&sub4;NO&sub3; 300,0
Indolessigsäure (IAA) 0,3
Zeatin 2,0
Kokusnußwasser** 2,0 (Gew.-%)
Sucrose 3000,0
Manitol 35000,0
Kanamycin 100,0
Cefotaxim 250,0
Gellangummi (Gelrite) 2000,0
(pH 5,8)
*: Murashige und Skoog Medium (1962)
**: kommerziell von GIBCO erhältlich

TABELLE 3 ZUSAMMENSETZUNG VON REGENERIERUNGSMEDIUM (LSZK100 MEDIUM)

Komponente Konzentration (mg/l)

LS Grundmedium
myo-Inositol 100,0
Thiamin HCl 1,0
Indolessigsäure (IAA) 0,1
Zeatinribosid 1,0
Sucrose 20000,0
Kanamycin 100,0
Cefotaxim 250,0
Agar (pH 5,8) 8000,0

TABELLE 4

Auswahl Zahl von regenerierten Pflanzen

May Queen (Auswahl aus Japan) 64
Toyoshiro (Auswahl aus Japan) 28
Danshaku (Auswahl aus Japan) 6
Saco (Auswahl aus USA) 53

(7) TEST IN BEZUG AUF RESISTENZ GEGENÜBER PVY-T VON TRANSFORMANTEN

Zu den auf diese Weise erhaltenen Transformanten von Auswahlen May Queen. Toyoshiro, Danshaku und Saco wurde PVY-T inokuliert. Nach der Inokulation wurden die von den Transformanten getragenen Virusmengen mittels ELISA und unter Verwenden von Tabak BY4 Stamm als ein Indikator untersucht. Insbesondere wurden gereinigte Virusteilchen von PVY-T auf Tabak BY4 inokuliert, welches ein Indikator von PVY-T ist. Zwei Wochen später nach Bestätigen der Nekrose der Pflanzen wurden infizierte Blätter als Probe genommen und in PBS-T Puffer (Phosphatpuffer, 0,02 M) mit einem Gewicht des 2-10 fachen desjenigen des Rohgewichts der Blätter homogenisiert. Die erhaltene homogenisierte Flüssigkeit wurde auf jede Transformante inokuliert. Die Transformanten wurden in einem Inkubator kultiviert, der 16 Stunden einen Tag bei 23ºC in Tageszeit beleuchtet war, und bei 17ºC bei Nacht, nachdem die Transformanten auf Kultivierungstöpfe übertragen worden waren. Die Inokulation wurde 2-3 Wochen nach dem Transfer zu den Kultivierungstöpfen durchgeführt. Das oberste Blatt bis zu dem fünften Blatt von dem oberen Ende jeder Pflanze wurde der Inokulation ausgesetzt. Die Inokulation wurde durchgeführt, indem eine Mischung der zuvor genannten homogenisierten Flüssigkeit und 600 Mesh Carborundum (10 Gew.-%) aufgebracht wurde. Nach der Inokulation wurden Blätter als Proben zu verschiedenen Zeitpunkten (1 Woche bis 2 Monate) genommen, und der Virus in der homogenisierten Flüssigkeit jeder Probe wurde mittels ELISA mengenmäßig bestimmt. Der ELISA wurde in einer herkömmlichen Weise durchgeführt. Das heißt, Anti-PVY-T polyklonaler Antikörper als ein primärer Antikörper wurde in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Nach Verstopfen der Vertiefungen wurde jede Probe in eine Vertiefung gebracht, und man ließ die Reaktion auftreten. Dann wurde mit alkalischer Phosphatase als ein sekundärer Antikörper markierter Anti-PVY-T monoklonaler Antikörper zu jeder Vertiefung gegeben, und man ließ Reaktion auftreten. Nach Waschen der Vertiefungen wurde Dinatrium-p-Nitrophenyl-phosphat als ein Substrat hinzugegeben, und das Absorptionsvermögen bei 405 nm wurde gemessen. In dem Test unter Verwenden von Tabak BY4 als ein Indikator wurde jede homogenisierte Flüssigkeit jeder Transformante von Kartoffelpflanzen 10fach oder 100fach verdünnt, und die verdünnte Flüssigkeit wurde auf Tabak BY4 inokuliert. Nach 2-3 Wochen der Inokulation wurden die Tabakpflanzen in Bezug auf Krankheitsausbruch untersucht. Die Ergebnisse des ELISA und die Ergebnisse des Tests unter Verwenden des Indikators waren im wesentlichen angemessen. Aus den Ergebnissen wurde bestätigt, daß gegenüber PVY-T resistente Transformanten und Transformanten mit Immunität gegenüber PVY-T erhalten wurden. In Tabelle 5 bedeutet der Ausdruck "gegenüber PVY-T resistente Transformante" die Transformante, in der Vermehrung von PVY-T beobachtet wurde, aber die Virusmenge war geringer als diejenigen in den erkrankten Pflanzen. Wie zuvor erwähnt, bedeutet der Ausdruck "Transformante mit Immunität gegenüber PVY-T", daß Vermehrung des Virus nach der Inokulation überhaupt nicht beobachtet wurde. Somit wurde durch diesen Test bestätigt, daß Kartoffelpflanzen mit Immunität gegenüber PVY-T, welche nicht erkrankt waren, und welche nicht den Virus trugen, erhalten wurden. TABELLE 5 ERGEBNISSE DES PVY-T INOKULATIONSTESTS VON AUSWAHLEN
Zu den Transformanten mit Immunität gegenüber PVY-T wurden soviel wie etwa 100 ug/ml PVY-T unter Verwenden der infizierten Tabakblätter (BY4) als eine Inokulationsquelle geimpft. Jedoch wurde PVY-T nicht durch den zuvor beschriebenen ELISA nachgewiesen (die Nachweisgrenze von PVY-T mittels ELISA beträgt etwa 10 ng). Die immunen Transformanten von May Queen, Toyoshiro und Saco wurden in Bezug auf die Herstellung von CP des PVY-T mittels ELISA getestet. Als ein Ergebnis wurde das CP von PVY-T nicht in irgendeiner der getesteten Transformanten nachgewiesen (die Nachweisgrenze von CP von PVY-T mittels ELISA beträgt etwa 10 ng). Die erkrankten Pflanzen von May Queen wurden in Bezug auf die Herstellung von CP von PVY-T mittels ELISA untersucht. Als ein Ergebnis wurden 5-10 ug Virusteilchen pro 1 g Rohgewicht der Pflanzen nachgewiesen.
Zu den Transformanten mit Immunität gegenüber PVY-T, PVY Normallinie wurden PVS bzw. PUX inokuliert. Als ein Ergebnis wurden Resistenzen gegenüber diesen Viren nicht beobachtet.

(8) BESTÄTIGUNG DER TRANSKRIPTION VON CP GEN MITTELS NORTHERN BLOT ANALYSE

Transformanten YA48 (May Queen). YA51 (May Queen) und YF1 (Toyoshiro), welche Immunität gegenüber PVY-T haben, wurden im Hinblick auf die Transkription des CP Gens mittels Northern Blot Analyse untersucht. Das heißt, die gesamten RNAs wurden aus den Blättern jeder dieser drei Transformanten extrahiert, und die RNAs wurden mittels Glyoxal und Dimethylsulfoxid gemäß dem Verfahren von Thomas (Thomas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201-5205 (1980)) denaturiert, gefolgt von Agarosegelelektrophorese unter Abtrennen von RNAs. Die RNAs wurden auf eine Nylonmembran (GENE SCREEN PLUS, kommerziell von Du Pont erhältlich) übertragen, und Nothern Analyse wurde unter Verwenden von Xba I - Sac I Fragment von Plasmid pBIPT(CML) durchgeführt, welches mit ³²P mithilfe des Primerverfahrens mit Zufallsequenz unter Verwenden eines kommerziell erhältlichen Kits (AMERSHAM) markiert worden war. Die Nothern Blot Analyse zeigte, daß eine mRNA mit einer Größe von 1,0-1,4 kb in jedes von YA48, YA51 und YF1 transkribiert war. Diese Größe stimmt mit der Größe der mRNA überein, welche aus dem CP Gen transkribiert wird. In den Elternlinien von May Queen und Toyoshiro, welche als Kontrollen untersucht wurden, wurde Transkription einer derartigen mRNA nicht nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, daß mRNA des CP Gens in diesen drei Pflanzen transkribiert wird.

(9) MORPHOLOGIEN VON TRANSFORMANTEN

Die in (7) erhaltenen immunen Transformanten wie auch ihre Elternlinien (Nicht- Transformanten) wurden in einem geschlossenen Inkubator bei 23ºC (Tag) und bei 17ºC (Nacht) kultiviert. Als ein Ergebnis waren die Morphologien und Wachstumseigenschaften aller immunen Transformanten die gleichen wie diejenigen der Elternlinien, und die Form von Knollen waren die gleichen wie diejenigen der Elternlinien.
SEQ ID NR. 1
SEQUENZLÄNGE: 267
SEQUENZTYP: AMINOSÄURE
URSPRUNGSQUELLE: Hüllprotein von pVY-T
SEQUENZBESCHREIBUNG
SEQ ID NR. 2
SEQUENZLÄNGE: 801
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
URSPRUNGSQUELLE: Hüllproteingen von PVY-T
SEQUENZBESCHREIBUNG
SEQ ID NR. 3
SEQUENZLÄNGE: 895
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZBESCHREIBUNG
SEQ ID NR. 4
SEQUENZLÄNGE: 37
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure (synthetische DNA)
SEQUENZBESCHREIBUNG
AAAATCTAGA TGAAATGACA CAATCGATGC AGGAGGA 37
SEQ ID NR. 5
SEQUENZLÄNGE: 36
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
MOLEKÜLTYP: Andere Nucleinsäure (synthetische DNA)
SEQUENZBESCHREIBUNG
TTTTGAGCTC TCACATGTTC TTCACTCCAA GTAGAG 36
SEQ ID NR. 6
SEQUENZLÄNGE: 85
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure (synthetische DNA)
SEQUENZBESCHREIBUNG
SEQ ID NR. 7
SEQUENZLÄNGE: 78
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure (synthetische DNA)
SEQUENZBESCHREIBUNG

Claims

1. Rekombinanter Vektor, umfassend:

einen Promotor, welcher in einer Kartoffelpflanzenzelle wirkt;

eine operabel gekoppelte Leader-Sequenz von RNA4 von Gurkenmosaikvirus, welche stromabwärts des Promotors angeordnet ist; und

eine operabel gekoppelte Sequenz, welche ein Hüllprotein von Kartoffelvirus Y Nekroselinie codiert, welche stromabwärts der Leadersequenz angeordnet ist;

wobei der rekombinante Vektor fähig ist, Kartoffelpflanzen zu transformieren.

2. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 1, wobei die Leadersequenz von RNA4 von Gurkenmosaikvirus eine Nucleotidsequenz von dem ersten bis zum fünfundachzigsten Nucleotid der Sequenz, gezeigt in Sequenz ID Nr. 3, hat.

3. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 1, wobei die Sequenz, die Hüllprotein von Kartoffel virus Y Nekroselinie codiert, die in Sequenz ID Nr. 1 gezeigte Amininosäurensequenz codiert.

4. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 3, wobei die Sequenz, die Hüllprotein von Kartoffelvirus Y Nekroselinie codiert, eine in Sequenz ID Nr. 2 gezeigte Nucleotidsequenz hat.

5. Verfahren zum Geben von Immunität gegenüber Kartoffelvirus Y Nekroselinie einer Kartoffelpflanze, umfassend Transformieren der Kartoffelpflanze mit dem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4.