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Die vorliegende Anmeldung betrifft die Verwendung monoklonaler
Antikörper, die an TNF gebunden werden, zur Herstellung von Medikamenten
für die Behandlung gram-negativer bakterieller Meningitis, wobei die
genannte Behandlung die Verwendung von Antibiotika einschließt.
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Bakterielle Meningitis bleibt eines der schwieriger zu handhabenden
Probleme in der klinischen Medizin. Es gibt Belege, daß bakterielle
Meningitis eine Infektion in bzw. an einer Stelle mit verringertem
Potential zur Widerstandskraft als Wirtszelle darstellt. Bei im
wesentlichen keinem Vorliegen von Antikörpern oder entsprechenden
Komplementen in der Rückenmarksflüssigkeit, sind Polymorphonukleozyten im
wesentlichen unfähig, einen Beitrag zur Klärung des Eindringens von
Bakterien in den frühen Stufen der Erkrankung zu leisten. Morbidität und
Mortalität durch bakterielle Meningitis bleiben hoch; eine Todesrate von
30% für pneumococcale Meningitis hat sich während der vergangen 40 Jahre
trotz neuer Antibiotika und einem verbesserten Verständnis von
Therapieanwendungen nicht verändert. Bakterielle Meningitis ist im Detail
bei Cecil, Textbook of Medicine, 19. Ausgabe, auf den Seiten 1655 bis 1661
beschrieben.
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Die Rolle von Tumorekrosefaktor (TNF) bei bakterieller Meningitis ist
in einem Arftikel von Arditi et al. im Journal of Infectious Diseases, 162:
S. 139 bis 145 (1990), beschrieben. Siehe auch entsprechende Artikel von
Arditi et al. im Journal of Infectious Diseases, Vol. 160, Nr. 6, S. 1005
bis 1011, Dezember 1989, sowie einen Artikel von Mustafa et al., the
Journal of Infectious Diseases, Vol. 160, Nr. 5, S. 818 bis 825, November
1989.
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Kürzlich wurde die Rolle von Zytokinen bei gram-positiver Meningitis
in einem Arikel von Saukkonen et al. beschrieben, the Journal of
Experimental Medicine, Vol. 171, S. 439 bis 448, Februar 1990. Gemäß diesem
Artikel wurde polyklonales Serum, das Antikörper aufweist, die sich an TNF
binden, direkt an das Gehirn gleichzeitig mit dem die Meningitis
initiierenden Mikroorganismus geliefert.
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Obwohl derzeitige Anwendungen rasche diagnostische Vorgehensweisen und
eine aggresive Behandlung mit den jüngsten Cephalosporinen der dritten
Generation (unter anderen) einschließen, werden viele Patienten ein Opfer
der Krankheit trotz der prompten Sterilisierung der
Zerebrospinalflüssigkeit. Dieses unerwartete Ergebnis kann sich aus
schädlichen Wechselwirkungen zwischen Wirtszellen und Gewebeteilen und
bakteriellen Komponenten einstellen, die durch Behandlung mit lytischen
Antibiotika freigesetzt werden (Scand. J. Infect., Dis. Supp. 74: 173 bis 179,
1991). Das Berten von Peptidoglycan, kapsularem Polysaccharid und
Lipopolysaccharid, welche aus den Bakterien freigesetzt werden, induziert
die Erzeugung einer Anzahl von Mediatoren, einschließlich TNF, im zentralen
Nervensystem, was zu meningealer und perivaskularer Entzündung im
Subarachnoidraum führt. Aufbrechen der Blut-Hirn-Barriere ergibt, unter
Auftreten von Hirnödemen, Ischämie und einen dramatischen Anstieg im
Innenschädeldruck. Diejenigen, die die akute Phase der Erkrankung
überleben, behalten oft mehrfache neurologische Folgeerscheinungen.
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Der fehlende Erfolg mit derzeitigen klinischen Anwendungen zur
Verringerung von Morbidität und Mortalität unter Opfern bakterieller
Meningitis hat einige Forscher veranlaßt, Versuche mit Vorgehensweisen
durchzuführen, um Entzündungserscheinungen herabzusetzen und zu verringern.
Frühere Ergebnisse aus entsprechenden Versuchen, und zwar unter Anwendung
Steroid-basierter entzündungshemmender Mittel entweder vor oder zusammen
mit antibiotischer Verabreichung, legen es nahe, daß ein derartiger
Versuchsansatz einen Wert haben kann, Mustafa et al., American Journal of
Diseases of Children, Vol. 144, S. 883 bis 887, August 1990.
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In anderen Formen lebensbedrohender bakterieller Infektionen, ganz
besonders von Sepsis, ist die Verhinderung einer Entzündung in Zusammenhang
mit einem günstigen Ergebnis gebracht worden. Insbesondere hat die
Intervention mit der Erzeugung und Aktivität des Proentzündungszytokin
Tumornekrosefaktor beachtliche Aufmerksamkeit erhalten.
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Die Behandlung experimentell-induzierter Sepsis mit Antibiotika und
Antikörpern mit der Befähigung zur Neutralisierung von Tumornekrosefaktor
hat eine höhere Überlebensrate im Vergleich zu Lebewesen ergeben, die nur
mit Antibiotika alleine behandelt wurden. Zum Nachweis der Wirksamkeit bei
Sepsis war es jedoch notwendig, eine Infusion mit Antikörpern gegen TNF
innerhalb von 30 min der bakteriellen oder Endotoxin-Herausforderung
durchzuführen. Siehe Mathison et al., Journal of Clinical Investigation,
Vol. 81, S. 1925 bis 1937, Juni 1988, sowie Hinshaw et al., Circulatory
Shock, Vol. 30, S. 279 bis 292, 1990.
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Bei gegebenem intravenösen Verabreichungsweg dieses Protein-basierten
Therapeutikum schien die Wahrscheinlichkeit von dessen Zweckmäßigkeit bei
Meningitis allerdings gering zu sein. Diese Folgerung beruhte auf der
Annahme eines nur geringen Ein- bzw. Durchdringens dieses Makromoleküls
durch die Blut-Hirn-Barriere und eines restriktiven Zeitverlaufs der
Verabreichung des Anti-Tumornekrosefaktors zur Verhinderung des Todesfalls
durch Sepsis unter experimentellen Bedingungen.
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Tatsächlich lehrt der Stand der Technik, daß die Verabreichung
genügender Mengen neutalisierender Antikörper zu TNF entweder vor (Butler,
Milsark und Cerami, Science 229: 869 bis 871, 1985; Tracey at al., Nature
330: 662 bis 664, 1987) oder zusammen mit (Linshaw et al., Circ. Shock
30: 279 bis 292, 1990; Saukkonen et al., J. Exp. Med. 171: 439 bis 448, 1990)
der Endotoxin- oder bakteriellen Herausforderung durchgeführt werden muß.
Nicht wie gemäß dem Stand der Technik, ist nun, in ziemlich überraschender
Weise, herausgefunden worden, daß die Verzögerung der Behandlung um bis zu
5 Stunden mit Anti-TNF-Monoklonalantikörpern zu statistisch signifikant
erhöhtem Überleben führte.
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Die vorliegende Anmeldung beschreibt das unerwartete Auffinden, daß
die intravenöse Verabreichung einer Zubereitung eines gegenüber
Tumornekrosefaktor fungierenden monoklonalen Antikörpers einige Stunden
nach der Initiation fulminanter bakterieller Meningitis die Wirksamkeit von
Antibiotika erhöht und verstärkt und zu erhöhtem Überleben und verbessertem
klinischen Status der Lebewesen im Vergleich zu Lebewesen führt, die mit
Antibiotika allein behandelt wurden.
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Es ist herausgefunden worden, daß die intravenöse Infusion
monoklonaler Antikörper zu TNF wirksam bei der Behandlung eines Säugetiers
mit einer bakteriellen Meningitis-Infektion ist. Das genannte Verfahren ist
bis zu mindestens 5 h nach der Infektion wirksam und schließt die
Behandlung gram-negativer Infektionen durch Verstärkung traditioneller
antibakterieller Chemotherapie unter Verwendung von Antibiotika wie von
Cephalosporinen oder Aminoglycosiden ein.
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Das genannte Verfahren beinhaltet die intravenöse Infusion
monoklonaler Antikörper, die an TNF gebunden werden (Anti-TNF), in einer
Menge, die ausreicht, um eine Meningitis-Infektion bei einem Säugetier zu
behandeln. In einer weiteren Ausführungsform ist ein monoklonaler Anti-TNF
ausreichend, um den TNF zu neutralisieren, der vom Säugetier in Reaktion
auf die Meningitis erzeugt wird. Es wird davon ausgegangen, daß die hier
beschriebene Behandlung sich besonders gegen Escherichia coli-Meningitis
eignet.
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Wie hier verwendet, bedeutet der Betriff therapeutisch wirksame Menge
(von monoklonalem Anti-TNF) eine Menge, ausgedrückt als mg/kg
Körpergewicht, die ausreicht, um eine klinische Verbesserung bei den
Anzeichen und Symptomen der Krankheit und/oder bei der Verhinderung der
Sterblichkeit beim kritischer kranken Säugetier zu ergeben. Diese wirksame
Menge (oder Dosis) beträgt ca 1 bis 20 mg/kg Säugetierkörpergewicht und
vorzugsweise ca. 15 mg/kg.
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Pharmazeutisch geeigneter Träger bedeutet ein Trägermittel, das
geeignet ist, sichere und wirksame Mengen von Anti-TNF auf intravenösem
Verabreichungsweg zu liefern.
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Intravenös bedeutet Injektion direkt in das Blutkreislaufsystem, wie
beispielsweise über venöse oder arterielle Wege durchgeführt (und zwar im
Unterschied zur Verabreichung in den Schädel oder das Rückenmark).
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Die Anti-TNF-Zubereitung: In den unten angegebenen Beispielen war die
monoklonale Antikörper-Zubereitung ein Maus-Anti-Human-TNF-Immunoglobulin
G, bekannt als A10G10, exprimiert aus einer Hybridoma-Zellinie, hinterlegt
mit ATCC mit der Zugangsnummer HB 9736.
Stämme und Bedingungen der Züchtung
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Escherichia coli-Stamm 050:K1 wurde in Untersuchungen zur
Veranschaulichung angewandt. Für das Bakterienwachstum wurde Hirn-Herz-
Infusionsnährlösung aus gefrorenen Lagerkulturen inokkuliert und 2 h lang
bei 37ºC wachsengelassen. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation
gesammelt, das Pellet wurde gewaschen und auf die gewünschte Konzentration
resuspendiert.
In vivo-Untersuchungen
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Ein Schwein-Säugetier-Modell von Meningitis wurde angewandt, um den
monoklonalen Anti-TNF in vivo zu bewerten. Gezüchtete Chester-Weißschweine
mit einem Gewicht von 8 bis 11 kg wurden betäubt und dann intrazisternal
mit entweder 6 · 10&sup5; cfu (zur physiologischen Bewertung) oder mit 2 · 10&sup7;
cfu (für die Überlebensuntersuchungen) infiziert. Für die physiologischen
Untersuchungen wurden insgesamt 8 Schweine infiziert und dann in zwei
Gruppen von jeweils 4 zum Test unterteilt. Für die Überlebensuntersuchungen
wurden insgesamt 26 Schweine infiziert und in 2 Gruppen von jeweils 13 zum
Test unterteilt.
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Für die physiologischen Untersuchungen wurden die Schweine 3 h nach
Infektion erneut betäubt. 1 Gruppe wurden 15 mg/kg monoklonaler Anti-TNF
über intravenöse Infusion in eine Ohrvene verabreicht, während die andere
Gruppe Placebo (bestehend aus dem pharmazeutischen Trägermittel) erhielt.
Ebenfalls wurden allen Tieren 5 mg/kg Gentamicinsulfat intramuskulär 3 h
nach Infektion gegeben. 6 h nach Infektion (und 3 h nach Behandlung) wurden
die Schweine erneut betäubt und Blut und Zerebralspinalflüssigkeit zur
Untersuchung entnommen.
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Für die Überlebensuntersuchungen wurden die Schweine 5 h nach
Infektion betäubt. 1 Gruppe wurden 15 mg/kg monoklonaler Anti-TNF über
intravenöse Infusion in eine Ohrvene verabreicht, während die andere Gruppe
Placebo (bestehend aus dem pharmazeutischen Trägermittel) erhielt. Allen
Tieren wurden 75 mg/kg Ceftriaxon intramuskulär gegeben. Den überlebenden
Tieren wurden anschließend 50 mg/kg Dosismengen Ceftriaxon 24 und 48 h nach
Infektion gegeben. Die Tiere wurden in diesem Versuch bezüglich der
Sterblichkeiten 7 Tage lang beobachtet.
Ergebnisse:
Physiologische Untersuchungen
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Zerebralspinalflüssigkeit aus den Tieren wurde bezüglich des
Vorliegens von Tumornekrosefaktor (TNF), Interleuken 6 (IL-6), Lactat,
Glucose, weißen Blutzellen und von Bakterien bewertet. Sowohl Blut als auch
Spinalflüssigkeit wurden bezüglich der Konzentration von Anti-TNF bewertet,
um den Eindringgrad des Immunoglobulins durch die Blut-Hirn-Barriere in das
Zentralnervensystem zu ermitteln und zu bestimmen. Die Ergebnisse aus der
Spinalflüssigkeit belegten, daß bei mit dem monoklonalen Anti-TNF
behandelten Schweinen kein nachweisbarer TNF vorhanden war. Im Gegensatz
dazu, wiesen die nur mit Antibiotika behandelten Schweine einen
Durchschnittswert von 82 Pikogramm pro ml TNF auf. Auch wies die
Spinalflüssigkeit aus mit Anti-TNF behandelten Schweinen verringerte
Gehaltsmengen (mindesntes 77% Verringerung) des Zytokin IL-6 auf, bei einem
Durchschnittswert von 2747 Einheiten pro ml, verglichen mit den
Vergleichstieren mit einem Durchschnittswert von 12087 Einheiten pro ml.
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Tiere, die mit den Anti-TNF-Monoklonalantikörpern behandelt waren,
wiesen keine erkennbaren Unterschiede bei Pleozytose, Lactat, Glucose oder
verringerter Bakterienzahl gegenüber den Vergleichsversuchsergebnissen auf.
Diese Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefasst.
Tabelle I ERGEBNISSE VON SPINALFLÜSSIGKEITSBESTIMMUNGEN
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Die Durchschnittseindringung des monoklonalen Anti-TNF in die
zerebrale Spinalflüssigkeit wurde mit 4,5% Serum-Werten ermittelt.
Überlebensuntersuchungen:
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Todesfälle in der Vergleichsgruppe, behandelt nur mit Ceftriaxon,
hatten einen rapiden Anstieg und erreichten 77% 24 h nach Infektion. Im
Gegensatz dazu, ergaben sich bei mit dem monoklonalen Anti-TNF und
Ceftriaxon behandelten Schweinen Todesfälle für nur 15% der Gesamtzahl 24 h
nach Infektion. Am Ende der Versuchsreihe, 7 Tage nach Infektion, waren 92%
Vergleichstiere gestorben, wogegen nur 38% der mit monoklonalem Anti-TNF
behandelten Gruppe gestorben waren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II
zusammengefasst.
Tabelle II ÜBERLEBENSERGEBNISSE
Diskussion
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Die Daten zeigen, daß monoklonaler Anti-TNF, bei Verwendung in
Konjunktion mit Antibiotika, als wirksames Mittel bei eingebrachten
bakteriellen Meningitisinfektioonen dienen kann. Als überraschende
Erkenntnis zeigte die physiologische Untersuchung, daß die intravenöse
Verabreichung von monoklonalem Anti-TNF bei Lebewesen, die im
Zentralnervensystem mit Escherichia coli infiziert sind, zur Neutralisation
von TNF in der Zerebralspinalflüssigkeit führen kann und die verringerte
Erzeugung des Zytokin IL-6 ergibt.
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Bei den Überlebensversuchen zeigten die Ergebnisse, daß Lebewesen
(Säugetiere), die im zentralen Nervensystem mit einer potentiell tödlichen
Herausforderungsmenge von Escherichia coli infiziert waren, durch
intravenös verabreichten monoklonalen Anti-TNF in Kombination mit einem
Antibiotikum geschützt werden können, und daß dieser Schutz über einen
Zeitraum von mindestens 7 Tagen nach Infektion belegt ist. Deshalb ist
davon auszugehen, daß dieses Mittel als ein therapeutisches Mittel zur
Verwendung beim Mensch für die beschriebene bakterielle Meningitis sowie
für weitere medizinisch wichtige gram-negative Bakterien, welche zur
Verursachung dieser Krankheit befähigt sind, erachtet werden sollte.
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Unter Zugrundelegen der tatsächlichen Offenbarung ist davon
auszugehen, daß Behandlungsvariationen den Durchschnittsfachleuten bei der
Behandlung infektiöser Krankheiten klar und verfügbar sein sollten.
Demgemäß sollten die obigen Beispiele lediglich als Veranschaulichungen
dienen, und es sollte die hier offenbarte Erfindung nur auf die folgenden
Ansprüche eingeschränkt sein.