DE69305947T2

DE69305947T2 - Vorrichtung und Methode zur Affinitätstrennung

Info

Publication number: DE69305947T2
Application number: DE69305947T
Authority: DE
Inventors: Michael Kenneth Kenrick; David Alun Parry; Margaret Patricia Raybuck
Original assignee: Amersham International PLC
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1992-09-18
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 1997-03-13
Anticipated expiration: 2013-09-11
Also published as: US5556598A; DE69305947D1; CA2105962A1; JPH06315603A; US5833927A

Description

Hintergrund

Trennverfahren werden in breitem Maße in den biologischen Wissenschaften zur Gewinnung einer Komponente aus komplexen Gemischen unter Ausnutzung einer einzelnen oder einer Kombination von spezifischen Eigenschaften des gewünschten Gebildes angewendet. Diese Eigenschaften können Größe, Form, Ladung, Hydrophobizität, Löslichkeit, Dichte, usw. sein, wobei alle zur Kategorisierung der Chromatographie herangezogen werden. Gewöhnlich sind diese Eigenschaften nicht völlig spezifisch und deshalb muß meist eine Reihe verschiedener aufeinanderfolgender Trennungen ausgeführt werden, um die Reinigung zu verbessern. Häufig wird die Wahl der anzuwendenden Schritte empirisch bestimmt und das Auffinden eines neuen Reinigungsweges ist sehr arbeitsaufwendig, da jede Auswahl selbst viele Varianten aufweist. Die labile Beschaffenheit vieler biologischer Stoffe gestaltet dieses Verfahren ebenfalls zu einem schwierigen Unterfangen, wenn der gewünschte Stoff zuweilen ebenso schnell verschwindet, wie er gereinigt werden kann.
Eine Variante dieser Verfahren ist die Affinitätschromatographie. Hierbei wird eine spezifischere Eigenschaft des gewünschten Gegenstandes in der Trennstrategie ausgenutzt. Gewöhnlich bezieht dies ein spezifisches Bindungsvermögen ein, das beim Ausführen der Trennung behilflich ist. Biologische Systeme nutzen sehr regelmäßig spezifische Bindung als Teil ihrer natürlichen Funktionsweise, wie Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen bei Krankheitsresistenz oder Rezeptor/Ligand-Wechselwirkungen für Zellsignalbildung. Dies kann man sich für eine Trenntechnik mit 100 %-iger Trennung in einem Schritt zunutze machen und stellt daher eine sehr leistungsfähige Vorgehensweise dar. Bei einem derartigen leistungsfähigen Trennverfahren ist es bei der Ausführung dieser Handlungen wichtig, daß alle kontaminierenden ungebundenen Materialien mit hohem Wirkungsgrad entfernt werden. Vorzugsweise sollte sowohl für die Entfernung von Kontaminationen, als auch zum Einfangen des gewünschten Stoffes im ersten Durchlauf ein 100 %-iger Wirkungsgrad vorliegen. Dies erfordert maximale Wechselwirkung zwischen dem gewünschten Stoff oder Gebilde mit seinem Bindungspartner sowie sehr wirkungsvolles Waschen.
Es besteht daher Bedarffür ein Verfahren, bei dem genügend Einfanumoleküle zum Einfangen aller Zielmoleküle an einer festen Phase befestigt sind. Dies erfolgt in einer Weise, daß das Zielmolekül oder Gebilde leichten Zugang zu der Bindungsstelle hat, jedoch auch derart, daß nichtbindende Reste gründlich ohne Einfangen oder Pseudowirkung fortgewaschen werden können.
Es gibt eine Vielzahl von Formaten zur Ausführung von Affinitätschromatographieverfahren. Alle teilen das allgemeine Merkmal, daß eine Seite des Bindungspaares an einer festen Phase immobilisiert ist. Diese besteht meistens aus einem kugelförmigen Material, das manchmal in Säulen gefüllt ist. Die das gewünschte Gebilde enthaltende Flüssigkeit kann dann über, herum und in einigen Fällen innerhalb der Kugeln strömen und so mit dem Fanggebilde in Kontakt kommen und Kontaminationen können anschließend durch Fließenlassen von Waschlösungen über die Kugelflächen gewaschen werden. Die Gründlichkeit des Waschverfahrens kann durch die Beschaffenheit der Waschlösung, wie durch Temperatur, Ionenstärke, pH- Wert, Lösungsmittelgemisch, usw., beeinflußt werden.
Kugeln sind in vielen Fällen eine bevorzugte Wahl, da dieses Format die Oberfläche, an der das Fanggebilde immobilisiert ist, am größten gestaltet.
Im allgemeinen ist das Haupterfordernis für ein unlösliches Material, an das das Fanggebilde gebunden werden kann, derart, daß eine das Ziel enthaltende Flüssigkeit über die feste Phase geleitet wird, damit größter Kontakt zwischen den Kammern hergestellt werden kann. Die feste Phase erfordert auch eine maximale Oberfläche, damit genügend Fanggebilde zur Verfügung stehen. In den meisten Fällen besteht der Zweck des Verfahrens in der Entfernung des Ziels aus einem komplexen Gemisch in reiner Form und anschließend Elution des Ziels von den Fanggebilden, ohne daß das Fanggebilde entfernt wird. Hierfür müssen Bedingungen gefunden werden, bei denen die Bindungskräfte überwunden werden können, ohne einen der Bindungspartner zu schädigen.
In jüngster Zeit entstanden insbesondere auf dem Gebiet der Molekularbiologie Verfahren, die sehr viel empfindlicher sind als vorher und als Ausgangsmaterial keine große Probenmenge erfordern. Noch an der festen Phase gebunden, können immer mehr Nachbehandlungen ausgeführt werden. Dies ist die Grundlage der aufkommenden Gebiete von Downstream- Processing und Biotransformationen, bei denen chemische Modifizierungen häufig enzymatisch an Festphasen-immobilisierten Stoffen ausgeführt werden.
In den letzten Jahren kamen neue Formate für Affinitätschromatographie auf, die auf Filtrationsmembranen basieren, insbesondere zur Antikörperreinigung. Meistens beziehen diese die Verwendung eines Filterpatronenformats ein, das dem Fachmann, der auf den biologischen Gebieten arbeitet, bekannt ist. Dieses besteht aus entweder einer Einweg- oder wiederverwendbaren Kassette, in der eine Scheibe aus Filtrationsmembran eingesetzt ist.
Die Membran wird an beiden Seiten durch Kunststoffnetze in der Kassette getragen und aus der oberen und unteren Fläche der Kassette führt eine Düse heraus, derart ausgelegt, daß sie an eine Spritze angefügt werden kann und ein Auslaß, derart ausgelegt, daß er in ein Sammelgefäß gerichtet ist. Diese Kassetten schließen manchmal in der Konstruktion Kanäle für Flüssigkeitsströme zum maximalen Gestalten der Wechselwirkung der Flüssigkeit über der Membran (US-A-4 690 757) ein.
Spätere Entwicklungen führten zu neuen Versionen mit Fangresten in entweder bereits dauerhaft gebundener oder einer chemisch aktivierten Form zur üblichen Derivatisierung. Die Scheiben weisen gewöhnlich einen Durchmesser von etwa 5 cm auf und sollen eine ebenso hohe Bindungskapazität wie eine Säule aufweisen. Dies steht im Einklang für ihre Verwendung mit einer Spritze unter Anwendung großer Proben, zwischen 1 bis 50 ml-Lösung auf einmal, überein.
Wie bereits erwähnt, geht der Trend nun zu geringeren Proben, empfindlicherem Nachweis und Verstärkungstechniken, insbesondere in der Molekularbiologie. In der Biologie sind große Probenmengen schwierig zu erhalten und beinhalten eine deutliche Störung für das biologische Gebilde, das die Quelle der Proben ist. Dies gilt insbesondere, wenn wiederholt Proben genommen werden müssen, um den Verlauf der Reaktion zu verfolgen. Große Proben sind auch langsamer zu verarbeiten und setzen empfindliche biologische Gebilde abweisender Umgebung während des Verfahrens aus.
Wie bereits erwähnt, beinhalten bestehende Affinitätsverfahren die Entfernung des Ziels vom Fanggebilde als letzten Schritt. Dies erfordert empirisches Erkennen jener Bedingungen, die die Bindung ohne Schädigung der gewünschten gereinigten Einheit stören und kann sich beispielsweise bei Antikörpern, bei denen eine starke Bindung besonders häufig erwünscht ist, äußerst schwierig gestalten. Es ist klar, daß eine stärkere Bindung eine höhere Denaturierung durch die Elutionslösung nach sich zieht. Manchmal müssen verschiedene Kombinationen von Elutionsmitteln ausgewählt werden, um eine zweckmäßige Einstellung der Bedingungen zu finden. Manchmal erreicht jedoch keine Kombination die gewünschte Wirkung.
Genau wie bei der Molekülreinigung werden auch Zellen in Affinitätsverfahren eingesetzt. Dies kann eine Vielzahl von Formen auf Grundlage der unterschiedlichen Eigenschaften der Zellen annehmen. Gewöhnlich, jedoch nicht immer, müssen die Zellen zur weiteren Analyse aus dem Verfahren unversehrt gewonnen werden. Häufig beruht die Trennung auf der Anwesenheit von Zelloberflächenmolekülen, für die Antikörper erhalten werden können. Dies kann ebenfalls mit Größen- und Dichtemessungen kombiniert werden. Verfahren zur Affinitätsreinigung von Zellen schließen "die fluoreszenzaktivierte Flow Cytometry" ein, die die Größe mit Vorliegen eines oder mehrerer Zelloberflächenmarker kombinieren kann. Die Probleme der Reinigung von Zellen sind aufgrund ihrer Empfindlichkeit schwerwiegend und wenn Antikörperselektion angewendet wurde, müssen die selektierten Zellen mit dem noch gebundenen Marker eingesetzt werden.
Viele Gebiete der Wissenschaft nutzen natürliche Bindungsaffinitäten. Die genetische Komplementbildung bei Nucleinsäuren wird häufig als Grundlage für Analysenverfahren verwendet. mRNA wird beispielsweise aufgrund der Tatsache isoliert, daß sie am Ende stets einen Adeninnucleotidschwanz aufweist, der an eine Folge von Thymidinnucleotiden gebunden werden kann.
Spezielle Gennucleotidseouenzen können durch die komplementären Nucleotidsequenzen abgefangen werden. Diese Hybnde können gewöhnlich sehr leicht durch Vermindern der Ionenstärke des Elutionsmittels, wodurch die natürliche ladungsangetriebene Repulsion zwischen DNA-Strängen stattfinden kann, entfernt werden.
Wie bereits erwähnt, können manchmal zur schädigungsfreien Entfernung keine Elutionsbedingungen gefunden werden. Dies kann jedoch zu einem Vorteil umgewandelt werden, wenn das Abfangen in einer Situation ausgeführt wird, bei der es stattdessen als Linkerimmobilisierung der gewünschten Aktivität wirken kann, so daß anschließende Schritte in situ ausgeführt werden können. Dies könnte beispielsweise eine Enzymreaktion in der neuen Wissenschaftsdisziplin Biotransformationen sein, die immobilisierte Enzyme zur chemischen Synthese nutzt.
Wenn es wesentlich ist, das Zielmaterial zu entfernen, besteht eine letzte Maßnahme in der Nutzung eines Membranmaterials, das selbst in einem Lösungsmittel, das für das Ziel nicht schädigend ist, löslich ist. Dieser Fall setzt jedoch das Einfangmaterial ebenfalls frei.
Häufig erfolgt Kupplung des Materials an dessen feste Phase durch kovalente Linker zur Vermeidung jeglicher Probleme durch Auslaugung des Fanggebildes, die zur Kontamination des Verfahrens führt.
Wenn die Entfernung des Zielmoleküls schwierig oder unnötig ist, kann analytisch in situ gearbeitet werden. Viele biologische Analysen können an Membranen ausgeführt werden. Beispielsweise wird ein Gegenstand an der Membran immobilisiert und zum Einfangen des anderen genutzt. Unter Verwendung weiterer markierender bindender Einheiten kann die Anwesenheit einer Einheit unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern oder colorimetrischen Enzymmarkern oder Radiomarkierungen aufgezeigt werden. Dies kann für das Auge durch Geräte oder mikroskopische Analyse oder durch Zählen mit geeigneter Gerätschaft sichtbar gemacht werden. Das Erfordernis, auf der Membran vorzuliegen, gestattet effizientes Waschen, wie Bereitstellen für Informationen der Lokalisierung.
Weitere Prozesse werden nun an Membranen, wie Enzymreaktionen, Genverstärkungsreaktionen, chemische Synthesen, usw., ausgeführt.
Wenn Zellen einbezogen sind, müssen die Ergebnisse der Trennung besonders häufig durch direkte Beobachtung verifiziert werden. Dies wird verwendet, um auszusagen, ob die Zellen noch in gutem Zustand vorliegen, ob die Trennung sauber aussieht, usw.. Manchmal müssen weitere spezielle Versuche an getrennten Zellen ausgeführt werden, um ihre Identität über einen anderen Weg zu verifizieren, beispielsweise spezielles Anfärben oder Enzymaktivität Wenn eine Zellsortiervorrichtung verwendet wurde, können die erzeugten Zellen geprüft werden. Wenn eine Säule verwendet wurde, müssen sie zum Beobachten eluiert werden. Wenn jedoch eine Membran verwendet wurde, müssen sie direkt sichtbar gemacht werden, da die meisten Membranen halbdurchsichtig sind oder durchscheinen.
Die meisten Verfahren auf der Grundlage der Einfangtechnik nutzen noch das Säulenformat. Dies gestattet, daß die Probe langsam über die Matrix rieselt und dann Waschen ausgeführt wird, indem über die Matrix eine Folge von Waschschritten rieselt. Zur Verbesserung von Waschen und Elution werden häufig Lösungsmittelgradienten mit geändertem pH, Ionenstärke und Hydrophobizität verwendet.
Verschiedene Änderungen kleiner Volumina von Waschlösungen sind wesentlich effizienter als eine einzige große, was bei einer Säule schwierig ausführbar ist, ohne die Zeit weiter auszudehnen.
Diese Verfahren können einen langen Zeitraum annehmen, insbesondere wenn die Bindungsaffinität schwach ist und manchmal erfordern sie Kreislaufführung der Probenlösung wiederholt über die Fangoberfläche, um den Kontakt maximal zu gestalten. Während dieses langen Zeitraums werden viele Bestandteile geschädigt und möglicherweise denaturiert und folglich werden viele dieser Verfahren in gekühlten Räumen ausgeführt. Dies sind aber sehr unangenehme Umgebungen, um darin zu arbeiten und sie lösen nur teilweise das Problem.
Eine Lösung dafür war die Entwicklung der HPLC-Verfahren, die neben anderen Eigenschaften schneller sind, da die Flüssigkeiten unter Druck überführt werden. Diese Systeme sind jedoch kostspielig und setzen die Stoffe hohen Drücken sowie Temperaturen aus.
Membraneinfangverfahren sind gewöhnlich schneller und daher besser für labile Materialien, jedoch sind sie hinsichtlich des Totvolumens problematisch, was bedeutet, daß kleinste Proben nicht einfach eingesetzt werden können und daß das eluierte Material in der Konzentration geringer ist.
Wenn die vorliegenden Patronen eingesetzt werden, ist es nicht einfach, zu erkennen, wann sie mit Flüssigkeit gefüllt sind und dies kann dazu führen, daß bei dem Versuch, das Volumen zu minimieren, Luft durchgezogen wird und die Membran teilweise austrocknet. Da auch die Membranen darin enthalten sind und getragen werden, ist es für eine Betrachtung durch ein Lichtelektronenmikroskop nicht einfach, die Membran zu entfernen. In ähnlicher Weise können sie nicht leicht für anschließende Umsetzungen verwendet werden. Einige der Patronen können auseinandergenommen werden und die Membran folglich entfernt werden. Der wahre Grund hierfür ist jedoch die Wiederverwendung der Patrone und führt gewöhnlich zu einiger Schädigung der Membran.
In einigen Proben liegt der gewünschte Bestandteil in kleinen Mengen oder in kleiner Zahl vor. Dies führt zu großen Volumina, die über die Fanggebilde gezogen werden. Zusätzlich zu der damit verbundenen Zeit hat dies den weiteren Nachteil, daß der Verlauf der Flüssigkeitsströmung in einigen Fällen ausreicht, um die Entfernung bisher gebundener Komponenten zu veranlassen. Das Ausmaß hierfür hängt von der Beschaffenheit und der Stärke der Bindung ab, da jedoch biologisch signifikante Affinitäten häufig subtil sind, gibt es viele Fälle, bei denen dieses Reinigungsverfahren aus diesen Gründen nicht ausgeführt werden kann.
Ein anderer Weg zur Lösung dieses Problems ist die Erhöhung der Menge an verfügbarem Einfangpartner durch Steigerung der Menge an fester Phase. Dies führt zu geringeren Fließgeschwindigkeiten, längerer Reaktionszeit und größerer Verdünnung des gewünschten Materials.
Proben für diese Reinigungsarten sind häufig klinisch und potentiell infektiös und die Wasch- und insbesondere die Elutionschemikalien sind ebenfalls häufig von gefährlicher Beschaffenheit. Sie können organische Lösungsmittel, Säuren, Ionenpaar bildende Moleküle, Chelatbildner, Detergentien, usw. sein. Übliche Verfahren unter Verwendung von Säulen können die Ausführenden potentiell schädigen, da diese dem gesamten System ausgesetzt sind, welches häufig die Verwendung signifikanter Mengen an gefährlichem Material einbezieht. Membranpatronenvorrichtungen sind besser, sind jedoch noch auf Ausspritzen von Flüssigkeiten angewiesen, mit der Möglichkeit von Verschütten und Aerosolbildung.
Zahlreiche Ziele werden, nachdem sie gereinigt wurden, in einer weiteren Analyse, wie Elektrophorese, eingesetzt oder beispielsweise reaktiviert. Für die meisten dieser anschließenden Reaktionen liegt das Ziel, das gewöhnlich in begrenzten Mengen anwesend ist, vorzugsweise in einer hohen Konzentration vor. Für Säulen und Membranaffinitätssysteme führt Elution zu einer Probe, die mit einer geringeren als der maximalen Konzentration aufgefangen wird. Dies bedeutet häufig, daß bevor die Arbeit fortgesetzt wird, eine Konzentrierung ausgeführt werden muß. Die Konzentrierung eines stark gereinigten Stoffes bei geringen Ausgangskonzentrationen ist sehr ineffizient und führt häufig zu Verlusten von über 50 %.
Diese kleinen Mengen an verdünntem Material haben auch den Nachteil, daß sie bei der Lagerung leicht denaturiert werden und gewöhnlich müssen sie zur Erhöhung ihrer Stabilität mit anderen Molekülen, wie Rinderserumalbumin, vermischt werden. Dies hält zuweilen davon ab, sie überhaupt zu reinigen. Sie neigen auch sehr dazu, an den Flächen ihrer Lagerungsgefäße zu adsorbieren, was manchmal Vorbehandlung mit toxischen Siliciumverbindungen (Silanen) als Vorbeugemaßnahme erfordert.
Wie bereits erwähnt, werden die meisten chromatographischen Verfahren empirisch erstellt und häufig beziehen sie eine Vielzahl von Stufen ein. Strategien werden durch Einzeltests von einzelnen Schritten unter einer Vielzahl von Bedingungen in kleinem Maßstab angelegt, um sowohl Art als auch Reihenfolge der Schritte, manchmal für anschließende Vorgänge in größerem Maßstab, zu optimieren.
Dies bedeutet gewöhnlich, daß eine Vielzahl verschiedener kleiner Säulen hergestellt, ins Gleichgewicht gebracht und sowohl einzeln als auch in Kombination laufen müssen und die Elution analysiert und verfolgt werden muß. Die Bestandteile erfordern häufig Radiomarkierung, um sie in derartigen Verfahren nachweisen zu können und das führt zu einer beträchtlichen Menge an radioaktivem Abfall. Es gibt automatische Systeme zur Ausführung dieser Reaktionen, jedoch sind sie sehr kostspielig, kompliziert zu betreiben und die hergestellten Materialien müssen noch analysiert werden.
Das Konzept der Trennung am Ende einer Spitze wurde bereits in der Patentanmeldung Nr. WO-A-88/09201 genutzt. In diesem Fall enthielt die Spitze jedoch Säulenmaterial zwischen 2 Fritten und ist daher eine Miniatursäule. Die Verwendung der Säule erfolgt durch Strömenlassen der Lösung unter Schwerkraft, wie gewöhnlich für Säulenverfahren angewendet.

Die Erfindung

Die Erfindung stellt eine Vorrichtung zum Einfangen einer in einer Flüssigkeit vorliegenden Komponente bereit, umfassend eine Pipettenspitze, die ein nach hinten offenes Ende aufweist, angepaßt zum Aufstecken auf eine Pipette zum Aufziehen von Flüssigkeit in die Pipettenspitze, ein offenes vorderes Ende und mindestens eine Membran, die sich über die Pipettenspitze an oder benachbart zu deren vorderen Ende erstreckt.
Die Membran ist porös, da es erforderlich ist, daß die Flüssigkeit hindurchfließen kann über oder um die Membran herum und in die Pipettenspitze. Vorzugsweise ist die Membran ein gewebtes Netz oder ein Vliesnetz aus Fasern, wobei der Begriff verwendet wird, um Fäden und Filamente einzuschließen, die einzeln oder endlos sein können. Die Membran kann ein Netzgewebe, ein spinngebundenes Netz, eine Kernbahn-geätzte Membran oder ein elektrolytisches Netz sein. Membranen verschiedener Porengröße sind möglich. Es ist selbstverständlich, daß die Membran nicht normalerweise einfach als Filter zur physikalischen Abtrennung von Teilchen, die zu groß sind, um durch die Poren zu passieren, verwendet wird. Die Membranporengröße wird stattdessen ausgewählt, um innigen Kontakt zwischen Flüssigkeit und Membran zu gewährleisten. Je größer die Porengröße, desto leichter passiert die Flüssigkeit die Membran, jedoch ist der Einfangwirkungsgrad der Membran für die gewünschte Komponente geringer.
Die Membran wird vorzugsweise so ausgelegt, daß eine in der Flüssigkeit vorliegende Komponente gebunden und dadurch abgefangen wird. Beispielsweise kann in die Membran ein spezifischer Bindungspartner der zu bindenden Komponente eingebaut sein. Die Membran kann Fanggebilde eingebaut aufweisen, die Ionenaustauschmoleküle, Affinitätsproteine, wie Antikörper oder Biotinbindungsmoleküle, Enzyme, Nudeinsäuren, Nudeotidoligomere, Zellhaftmoleküle, Rezeptoren, Chelatoren, usw., sind.
In einer Ausführungsform besteht die Membran aus einem Material, das in der Lage ist, DNA zu binden, beispielsweise durch chemische Wechselwirkung oder hydrophobe Bindung oder physikalische Absorption oder durch Ladungswechselwirkung. DNA-Bindung an Kunststoffmaterialien ist komplex und bezieht eine Vielzahl an Kombinationen dieser Phänomena ein. Beispielsweise kann eine stark geladene Polymeroberfläche Ladungswechselwirkungen begünstigen, während eine ungeladene Polymerfläche hydrophobe Bindung begünstigen kann.
Von vielen Materialien ist bekannt, daß sie Kernfangeigenschaften aufweisen, einschließlich Polyester, Polyamid, Polycarbonat, Cellulose, Nitrocellulose, Polyvinylidindifluorid und Glas. Alternativ kann die Membran aus einem beliebigen Material gefertigt werden, das chemisch oder physikalisch in einer solchen Weise aktiviert werden kann, daß sie die abzufangende Komponente bindet. Die Immobilisierung des Fanggebildes, beispielsweise Antikörper, oder anderer spezieller Bindungsformen an der Membran wird leicht durch eine Vielzahl von chemischen und physikalischen Maßnahmen bewirkt, die in der Literatur ausgiebig beschrieben werden.
Die Membran kann im Hinblick auf die speziellen Erfordernisse der einbezogenen Trennung ausgewählt werden. Beispielsweise kann die Membran so ausgewählt werden, daß sie für anschließende Enzymreaktionen oder Züchtungserfordernisse nicht inhibierend wirkt. Die Membranen können auch derart ausgewählt werden, daß sie nicht fluoreszierend, transparent, wärme- oder chemikalienbeständig sind.
Fangmembranen, die erfolgreich eingesetzt wurden, sind 1, 5, 6 und 11 µm gewebte Membranen aus Polyester und 1 µm gewebte Membran aus Nylon. Jede der 1 µm Membranen ist bevorzugt. Weniger bevorzugt, jedoch wirksam zu einem geringeren Ausmaß, sind Polycarbonatmembranen zufälliger Netzteilung von 50, 100 µm und bahngeätzte Polyestermembranen 5, 10 µm. 0,45 µm Nitrocellulose wurde ebenfalls erfolgreich eingesetzt, wie auch 0,45 µm Nylon, obwohl die Fließgeschwindigkeit und folglich der Waschwirkungsgrad kleiner war (siehe Beispiel 1).
Es ist ein Vorteil der Erfindung, daß die gewünschte Komponente auf oder an oder in der nach vorne weisenden Oberfläche der Membran eingefangen wird. Die Membran wird an oder neben dem vorderen Ende der Pipettenspitze angebracht, das heißt nahe genug zum vorderen Ende, um leicht für anschließende Behandlung, Umsetzung oder Analyse sichtbar oder zugänglich zu sein. Die Membran wird vorzugsweise an das vordere Ende der Pipettenspitze gebunden; entweder im rechten Winkel zu der Achse der Pipettenspitze oder schräg eingesetzt (das heißt nicht senkrecht zur Längsachse der Pipettenspitze). Schräge Anordnung erhöht die Oberfläche der Membran für einen vorgegebenen Spitzendurchmesser und kann die Vermeidung von Kontamination unterstützen, wenn die Vorrichtung in eine verschmutzte Lösung eingesetzt wird. Die Membran kann auch an dem vorderen Ende eines kurzen rohrförmigen Bereichs befestigt werden, dessen hinteres Ende unter Reibungspassung auf das vordere Ende der erfindungsgemäßen Pipettenspitze gesteckt ist. Verschiedene rohrförmige Abschnitte, die verschiedene Membranen umfassen, können in dieser Weise auf der Pipettenspitze angebracht werden.
Die erste (oder einzige) Membran wird vorzugsweise an der Pipettenspitze oder neben ihrem vorderen Ende angebracht. Die Membran kann von der Pipettenspitze für anschließende Verarbeitung abziehbar gestaltet werden. In dieser Ausführungsform würde es jedoch nicht ausführbar sein, dieselbe oder eine andere Membran an der Pipettenspitze zu ersetzen. Der erfindungsgemäße Vorrichtung ist so ausgelegt, daß sie eher ein Wegwerfgegenstand ist als wiederverwendbar.
Die Membran kann abweichend dazu am vorderen Ende der Pipettenspitze mit einem Kragen befestigt werden.
Die Pipettenspitze ist bevorzugt aus einem Stück geformt, vorzugsweise aus Kunststoffmaterial, das Autoklavieren (bei 120ºC für 20 Minuten) sowie wiederholtem Erwärmen und Abkühlen zwischen 95ºC und Umgebungstemperatur widerstehen sollte. Es sollte kein Formtrennmittel oder Weichmacher bei der Herstellung der Pipettenspitze verwendet werden und das Kunststoffmaterial sollte keine Enzymreaktionen, wie bei der PCR, entweder durch Entfernung wichtiger Komponenten durch Adsorption oder durch chemische Inhibierung, hemmen. Bevorzugte Kunststoffmembranen schließen Polycarbonat, Polypropylen, Nylon, Polyester, PTFE ein. Polycarbonat und Polyester besitzen den Vorteil, daß das Röhrchen durchsichtig ist. Die Pipettenspitze sollte vorzugsweise nach Gefrierauftauen nicht zerbrechen.
Die Pipette ist gewöhnlich eine spitze Mikropipette mit einstellbarem Volumen oder nichteinstellbarem Volumen, wie sie beispielsweise von den Firmen Gilson und Eppendorf hergestellt wird und in biologischen Laboratorien bekannt sind. Vorzugsweise ist das rückwärtige Ende der Pipettenspitze innen kegelförmig abgeschrägt, so daß eine Reibungspassung zur Mikropipette entsteht. Das rückwärtige Ende der Pipettenspitze kann axial verstärkende Rippen aufweisen.
Vorzugsweise ist die Pipettenspitze aus sprödem Kunststoffmaterial und weist zwischen ihren Enden eine umlaufende Linie einer Abschwächung auf, beispielsweise bereitgestellt durch eine äußere Nut, längs derer die Spitze mit der Hand gebrochen werden kann. Die Länge des vorderen Endes der Spitze kann ausgewählt werden, damit sie zusammen mit der Membran in ein Eppendorf-Röhrchen zur weiteren Verarbeitung in einer Weise eingesetzt werden kann, daß der Deckel geschlossen werden kann. Die Pipettenspitze ist vorzugsweise konisch, wobei das rückwärtige Ende zum Aufstecken auf eine Mikropipette ausgelegt ist und die Spitze sich sowohl im inneren, als auch im äußeren Durchmesser zum vorderen Ende hin verjüngt.
Der kleinere Durchmesser des Endes der Spitze gestattet, daß die Membran in sehr kleine Proben getaucht werden kann. Die Spitze ist derart ausgelegt, daß die durch die Pipette eingesogene Flüssigkeit darin gehalten wird, wodurch Kontamination der Pipette selbst vermieden wird. Dies gestattet auch, Flüssigkeit, die die Membran passiert hat, bei sehr gering aufzuwendender Kraft in die Spitze aufzunehmen und die ausgedrückte Flüssigkeit wiederum die Membran passieren zu lassen und somit die Wechselwirkung der Probe mit dem Fangpartner zu verdoppeln. Durch dieses kann eine Vielzahl von Pipettierungen auf und nieder wiederholt werden, so daß die Probe eine Vielzahl von Möglichkeiten hat, mit dem Fanggebilde in Wechselwirkung zu treten. Die Pipettiergeschwindigkeit kann leicht variiert werden oder für sehr langsame Kinetiken könnte man die Spitze in der Lösung inkubieren lassen. Nach dem Bindungsschritt wird die Spitze leicht in die erforderliche Anzahl an Waschlösungen überführt und wiederum jedesmal, falls erforderlich, auf- und niederpipettiert. Einige aufeinanderfolgende kleinvolumige Waschvorgänge sind wirksamer beim Waschen als dasselbe Volumen auf einmal. Dieses Verfahren hält daher die erforderlichen Mengen an Waschlösungen klein, während die Waschwirkung maximal gestaltet wird. Das Pipettieren zum Waschen kann, falls erwünscht, heftig und zahlreich ausgeführt werden.
Ein besonderer Vorteil besteht darin, daß die Anwesenheit der Membran an dem Spitzenende dazu führt, daß Gebilde, die durch irgendwelche Einflüsse an der Membran binden, dieses vorwiegend an der äußeren Oberfläche tun. Dies ist für eine Sichtbarmachung, für eine effektive Elution oder für anschließende Reaktionen oder beispielsweise für zelluläre Gebilde, die in situ an der Membran weiter gezüchtet werden können, wichtig.
Die Beschaffenheit der Flüssigkeit, die die abzufangende Komponente enthält, ist nicht Gegenstand der Erfindung. Die Flüssigkeit kann beispielsweise eine biologische Flüssigkeit, wie eine Körperflüssigkeit, sein.
In einigen Fällen kann die Flüssigkeit aufgrunddessen, daß sie viel unlösliches Material enthält, so "verschmutz" sein, daß der Schritt des Einsaugens durch die Membran langsam oder schwierig sein würde. In diesem Fall mag es ausreichen, die Flüssigkeit mit der äußeren Oberfläche der Membran ohne Anwenden von positivem oder negativem Druck durch die Pipettenspitze in Kontakt zu bringen. Wenn die Flüssigkeit in Kontakt mit der Pipettenspitze gerührt wird, fängt die Membran die gewünschte Komponente ab. Die Pipettenspitze kann dann aus der "verschmutzten" Flüssigkeit entfernt werden und in eine Waschflüssigkeit getaucht werden, die in die Pipettenspitze eingesogen wird und dann durch die Membran gewöhnlich mehrere Male ausgestoßen wird.
Für Anwendungen, bei denen eine Vielzahl von Bedingungen für eine optimale Reinigung ausprobiert werden muß, vielleicht für eine anschließende Übertragung auf einen größeren Maßstab, können Versuche unter vielen Bedingungen in rascher Folge ausgeführt werden. Für Mehrfachzubereitungen können die Spitzen mit Mehrkanalversionen der Mikropipette verwendet werden, wie sie dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Diese gestatten gewöhnlich, 8 oder 12 Reinigungen gleichzeitig auszuführen. Die am Ende mit einer Membran versehenen Spitzen können zum leichteren Befestigen an den Mehrfachpipetten zu einer Reihe geheftet hergestellt werden.
Für besonders schwierige Trennungen oder jene, bei denen unterschiedliche Komponenten aus derselben Probe entfemt werden sollen, können Mehrfachschichten, getrennt durch einen kleinen Abstand, weiterverwendet werden. Jede dieser Schichten kann verschieden derivatisiert werden, so daß die Probe jede von ihnen kontaktiert und sie können in Kopf-Schwanz-Weise angeordnet werden. Dies ist ebenfalls brauchbar, wenn Proben in unerwünschter Weise teilchenförmig oder anderweitig kontaminiert sind und die erste Schicht kann benutzt werden, um dieses unerwünschte Material zu entfernen.
Diese Schichten können entweder zum Entfernen einer Vielzahl spezieller Kontaminationen, zur Verbesserung der Trennung durch Abfangen des Ziels an zwei oder mehreren Schichten derselben Materialien, zum Abfangen unterschiedlicher Materialien gleichzeitig oder zur Entfernung eines Materials, während ein weiteres abgefangen wird, verwendet werden. Die Schichten können dann nach der Behandlung getrennt werden, indem sie "Unslotting" unterzogen werden.
Dies kann ausgedehnt werden, indem Membranen eingeschlossen sind, an denen Moleküle oder Gebilde gebunden sind, die Konservierungsstoffe oder Enzyminhibitoren darstellen, damit das gewünschte Material die Prozedur übersteht. Sie können auch Detergentien, Tenside oder antibakterielle Mittel an der festen Membranphase aufweisen, wodurch ihre Aktivität, ohne Kontaminieren der Probe genutzt werden kann.
Bei einer weiteren Variante hiervon wird Enzymaktivität an einen Querschnitt der Membran gebunden, so daß das Enzym seine Reaktion ausüben und aus der Probe zur Vermeidung von Probenkontamination entfernt werden kann. In einigen Fällen können diese Abschnitte zur Wiederverwendung gelagert werden.
Es ergeht Hinweis auf unsere Europäische Patentanmeldung Nr. 92 308 537.7, eingereicht am 18. September 1992, mit dem Titel "Capture Method and Device". Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Trennung von Komponenten und Zellen, wobei das Verfahren umfaßt
a) Behandlung einer ganze Zellen enthaltenden Flüssigkeit, so daß die zytoplasmatische Membran zusammen mit einem kleinen Teil der Kernmembranen selektiv lysiert wird, jedoch unter Hinterlassen eines größeren Teils des intakten Zellkerns,
b) Auftragen der behandelten Flüssigkeit auf eine Oberfläche durch ein Netz von DNA aus den lysierten Kernen, das auf der Oberfläche gebildet wird und Abfangen der intakten Zellkerne,
c) Waschen des DNA-Netzes an der Oberfläche zur Abtrennung der abgefangenen Zellkerne von anderen Komponenten der Zellen.
Die genannte Patentanmeldung beschreibt auch eine Vorrichtung zur Verwendung in dem Verfahren. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist für diesen Zweck sehr geeignet; die nach vorne weisende Oberfläche der hier beschriebenen Membran kann die Oberfläche ausmachen, auf die die behandelte Flüssigkeit in vorstehendem Schritt b) aufgetragen wird. In diesem Fall wäre die Membran jedoch nicht derivatisiert.
Es ergeht Hinweis auf die beigefügten Zeichnungen, wobei:
Figuren 1 und 2 Querschnitt und Endansichten einer bevorzugten Vorrichtungsform zeigen.
Figuren 3, 4 und 5 sind Perspektivansichten, die 3 unterschiedliche, erfindungsgemäße Vorrichtungen zeigen.
Figur 6 ist eine perspektivische Seitenansicht einer derartigen Vorrichtung, angeordnet in einem Eppendorf-Röhrchen.
Gemäß Figuren 1 und 2 umfaßt die Vorrichtung eine Pipettenspitze 10, deren Bohrung 11 sich im Durchmesser längswärts vom hinteren Ende zum vorderen Ende 12 verjüngt. Die Stirnfläche des vorderen Endes der Pipettenspitze weist einen ringförmigen Gegenstand 13 zur Befestigung einer permeablen Membran 17, die sich über die Bohrung erstreckt und gemäß der Beschaffenheit der eingefangenen Komponente ausgewählt ist, auf. Der Gegenstand weist in seinem Aufbau einen dreieckigen Querschnitt auf. Eine Linie zur Schwächung in Form einer umlaufenden Nut 14 wird in der Wand der Pipettenspitze beim ausgewählten Abstand vom vorderen Ende gebildet. An deren hinteren Ende 15 ist die äußere Oberfläche der Pipettenspitze zylindrisch und weist eine Reihe von axial versteifender Rippen 16 auf, die gestatten, daß das Ende der Pipettenspitze in Reibungspassung an dem Ende der Mikropipette befestigt werden kann. Die Pipettenspitze wird aus einem durchsichtigen und spröden, thermoplastischen Kunststoffmaterial gefertigt. Polycarbonat ist insbesondere für diesen Zweck geeignet.
Bei der Verwendung wird eine biologische Flüssigkeit in die Pipettenspitze durch eine Mikropipette durch die Membran eingezogen, welche eine in der Flüssigkeit befindliche Komponente fängt. Die eingefangene Komponente wird dann durch Ziehen einer Waschlösung durch die Membran gewaschen. Die Pipettenspitze wird dann an der Linie der Abschwächung abgebrochen und das gesamte vordere Ende der Pipettenspitze mit der Membran und der eingefangenen Komponente wird zur weiteren Behandlung in ein übliches Eppendorf-Röhrchen überführt. Damit der Deckel des Eppendorf-Röhrchens geschlossen werden kann, ist es besonders vorteilhaft, Nut 14 in einem Abstand von 18 mm vom vorderen Ende der Pipettenspitze auszubilden.
Figuren 3, 4 und 5 zeigen im allgemeinen ähnliche Ausführungsformen. In Figur 3 ist eine Einfangmembran 17 dargestellt, die sich über das vordere Ende 12 der Pipettenspitze erstreckt. Ein Aerosolfilter 18 ist in der Pipettenspitze zwischen Bruchpunkt 14 und rückwärtigen Ende 15 angebracht, wobei der Zweck des Filters darin besteht, die Spitze der Mikropipette vor Kontamination mit biologischer Flüssigkeit, die durch die Einfangmembran eingesogen wird, zu schützen.
In Figur 4 trägt die Pipettenspitze keine daran gebundene Membran. Ein rohrförmiger Teil 19 trägt eine Membran 20 am vorderen Ende; das hintere Ende ist über Reibungspassung über dem vorderen Ende der Pipettenspitze angebracht.
In Figur 5 ist eine Vorrichtung wie in Figur 3 dargestellt, mit zwei rohrförmigen Abschnitten 19 und 21, die über die Reibungspassung an dem vorderen Ende gezogen sind. Die Vorrichtung hat somit drei Membranen, 17, 20 und 22, und die biologische Flüssigkeit wird durch diese in Folge eingesogen.
Figur 6 zeigt eine Vorrichtung ähnlich zu jener, die in Figur 3 erläutert ist, eingesetzt in ein Eppendorf-Röhrchen 23. Die Vorrichtung schließt eine äußere periphere Scheibe 24 ein, die sich genau vorn am Bruchpunkt 14 befindet, welcher als Bruchpunkt dient. Die Membran 17 ist am vorderen Ende der Pipettenspitze durch einen Halskragen 25 befestigt, der auch als Antirückflußdichtung dient. Das Eppendorf-Röhrchen enthält 50 µl Reaktionsflüssigkeit 26 zur weiteren Behandlung der Abfangmembran.
Bei der Verwendung wird seitwärts Druck auf das rückwärtige Ende 15 der Pipettenspitze ausgeübt, beispielsweise in der durch Pfeil 27 gekennzeichneten Richtung, zum Brechen der Pipettenspitze am Bruchpunkt. Das rückwärtige Ende der Pipettenspitze wird dann entfernt, der Deckel 28 des Eppendorf-Röhrchens geschlossen und die Einfangmembran 17, falls erforderlich, weiterbehandelt.

Beispiel 1

Verwendung von Membranspitzen zur Affinitätsreinigung einer Cytochrom p450-Variante aus 2 Proteingemischen

a) Ein Gemisch von Proteinen, das Protein Cytochrom P450 enthält, wurde als eine Reihe von Molekulargewichtsmarkern erhalten. Diese wurden als wässerige Lösung bei einer Konzentration von etwa 1 mg/ml für jedes Protein erhalten und bestehen aus P450 (55 kD), Eialbumin (46 kD), Kohlensäureanhydrase (30 kD), Trypsininhibitor (21,5 kD), Lysozym (14,3 kD), Aprotinin (6,5 kD), Insulinkette A (3,4 kD) und Insulinkette B (2,3 kD) in Tris-Puffer pH 8,0.
b) Phenobarbiton-behandelte Ratten (Guengerich, F.P. und Martin MV., Arch. Biochem. Biophys., 205, 365-379, 1980) wurden geopfert und die Leber entfernt. Extrakte wurden zubereitet (Guengerich, F.P., J. Biol. Chem. 252, 3970-3979, 1977) von Chromosomen, von denen man weiß, daß sie überexprimiertes P450 Protein enthalten. Dieses Verfahren umfaßt aufeinanderfolgende Homogenisierungs- und Zentrifugierungsschritte in einer Salzlösung. Die Extrakte werden nach der Herstellung bei -70ºC bis zum Gebrauch gelagert.
Die Spitzen wurden wie nachstehend zubereitet: Spitzen wurden wie beschrieben mit nylonverstärkter Nitrocellulosemembran, angebracht über dem vorderen Ende, aufgebaut. Antikörper wurden an der Oberfläche der Membran durch Eintauchen in 100 µl einer Lösung eines teilweise gereinigten polyklonalen Antikörpers für P450 (Ryan, D.E. und Levin, W. Pharmac. Ther. 45, 15-239, 1990) 10 mg/ml in 100 mM Carbonatpuffer pH 9,0 mit 10 mg/ml Rinderserumalbumin gebunden. Diese wurde in der Lösung für 15 Minuten gehalten und der Überschuß mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,0, gewaschen und in Salzlösung bei 4ºC unter Vermeiden von Trocknen gelagert.
10 µl des Proteingemisches in a) und b) wurden auf 500 µl in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt.
Getrennte Spitzen mit Antikörper-beschichteter Membran daran geheftet wurden dann verwendet, um Extrakte auf- und abzusaugen.
Das Saugen wurde fünfmal wiederholt. Die Spitzen wurden dann in Waschlösung von 3 x 5 ml PBS überführt und einmal Auf- und Absaugen wurde jeweils ausgeführt. Die Membran wurde dann vom Ende der Spitze abgezogen und zu Probenbeladungspuffer für PAGE Elektrophorese gegeben.
Die Proben wurden in 20 µl Beladungspuffer, enthaltend SDS, DTT, Glycerin und Bromphenolblau, für 2 Minuten gekocht. Kontrollproben vom Extrakt, gesaugt durch eine unbehandelte Spitze sowie leerer Extrakt nach "Behandlung mit Spitze" wurden durch gemeinsames Kochen von Probe und Beladungspuffer für 2 Minuten hergestellt.
10 µl jeder Probe wurden an denaturierten 12 % PAGE Gel bei 100 V für 3 Stunden laufen lassen und anschließend mit Coomassie blue-Fixativ gefärbt, um die Proteinbanden aufzuzeigen.
Die ersten drei Bahnen zeigten Gemisch A: 1) Gemisch nach der "Behandlung mit der Spitze": 2) Gemisch nach "Behandlung mit einer Spitze" unter Verwendung einer "leeren" Spitze ohne Antikörper und 3) Material, extrahiert durch eine Antikörper-behandelte Spitze.
Die nachstehenden 3 Banden zeigten 5) Leberextrakt nach "Behandlung mit der Spitze", 6) Leberextrakt nach "Behandlung mit der Spitze" unter Verwendung einer "leeren" Spitze ohne Antikörper, 7) mit der Spitze extrahiertes Material (das zusätzliche Material in dieser Bahn kann Antikörperverunreinigungen wiedergeben, die aus der Spitzenmembran eluiert wurden. Normalerweise würde man diese Reaktionen unter Verwendung von radiomarkierten Extrakten ausführen. Kontamination aus dem gebundenen Antikörper würde nicht zu einem Problem werden, wenn es nicht radiomarkiert wäre.).
Die Ergebnisse zeigen, daß der auf der Spitze gehaltene Antikörper effizient einen spezifischen Stoff aus einem komplexen Gemisch während rascher Saugschritte eingefangen hat.
Die abgefangenen Stoffe können dann von der Spitzenmembran zur weiteren Untersuchung entfernt werden.
Die Spitzen selbst entfernen keine Stoffe, die durch Absorption zur Membran nichtspezifisch sind.

Beispiel 2

Verwendung von Spitzen, die mit einer Membran derivatisiert sind, zur Immunopräzipitation von p53 Protein aus HeLa Zellextrakt

a) Spitzen wurden wie beschrieben mit einer über dem vorderen Ende gebundenen Nylonmembran hergestellt. Antikörper wurden an der Oberfläche der Membran durch Eintauchen der Spitze in entweder 500 µl einer Lösung von gereinigtem monoklonalem Antikörper für p53, pAb248 (1) oder durch eine Lösung von gereinigtem Antikörper zu Adenovirus E1A, M73, (2) in 100 mM Carbonatpuffer pH 9,0, gebunden. Dieses wurde bei 4ºC über Nacht gehalten. Die überschüssige Lösung wurde entfernt und die Spitzen wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,0, gewaschen. Die Membranen wurden dann durch Eintauchen in 500 µl 3 % BSA/PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Nach Entfernen von überschüssigem Blockierungsreagenz und Waschen in PBS wurden die Spitzen in 1 ml HeLa Zelllysat getaucht.
b) Etwa 10&sup7; HeLa-Zellen wurden in 2 ml 150 mM NaCl, 1 % NP40, 50 mM Tris pH 8,0 für 30 Minuten auf Eis lysiert. Die Flüssigkeit wurde zur Inkubation mit den derivatisierten Spitzen entfernt.
c) Die Spitzen und das Lysat wurden auf Eis für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von Entfernen des überschüssigen Lysats. Die Spitzen wurden dann mit 1 ml PBS gewaschen, durch Saugen von PBS in die Pipettenspitze und Ausstoßen aus der Pipettenspitze durch die Membran, dreimal. Jede Spitze wurde dann zu einem Röhrchen gegeben, enthaltend 40 µl Laemmli Probepuffer (2 % SDS, 10 % Glycerin, 100 mM DTT, 60 mM Tris pH 6,8, 0,001 % Bromphenolblau). Die Proben wurden dann 2 Minuten gekocht und auf drei getrennte Bahnen von 10 bis 15 % Polyacrylamid/SDS-Gel gegeben.
Die ersten zwei Bahnen zeigen Immunopräzipitation von p53 Protein bei Spitzen, die mit anti-p53 Antikörper, pAb248, derivatisiert wurden. In Bahn 3 (Negativkontrolle) zeigt eine mit anti-E1A Antikörper derivatisierte Spitze kein nachweisbares immunopräzipitiertes Protein, wie erwartet, da HeLa- Zellen die Adenovirusproteine nicht exprimieren.

Literatur

1. Yewdell J.W., Gannon J.V. und Lane D.P., J. Virol., (1986), 59, 444-452.
2. Harlow E., Franza B.R. und Schley C., J. Virol., (1985), 55, 553.

Claims

1. Vorrichtung zum Abfangen einer in einer Flüssigkeit vorliegenden Komponente, umfassend eine Pipettenspitze, die ein nach hinten offenes Ende aufweist, angepaßt zum Aufstecken auf eine Pipette zum Aufziehen von Flüssigkeit in die Pipettenspitze, und ein offenes vorderes Ende, gekennzeichnet durch mindestens eine poröse Einfangmembran, die sich quer über die Pipettenspitze an oder benachbart zu deren vorderen Ende erstreckt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das hintere Ende der Pipettenspitze innen kegelförmig abgeschrägt ist, so daß eine Reibungspassung an der Mikropipette vorliegt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die oder jede Membran ein gewebtes Netz oder ein Vlies aus Fasern ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die oder jede Membran zum Binden einer in der Flüssigkeit vorliegenden Komponente ausgelegt ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die oder jede Membran einen spezifischen Bindungspartner der zu bindenden Komponente umfaßt.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Membran an das vordere Ende der Pipettenspitze gebunden ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Pipettenspitze aus sprödem Kunststoffmaterial besteht und zwischen ihren Enden eine umlaufende Linie einer Schwächung aufweist, wodurch die Pipettenspitze mit der Hand längs dieser Linie einer Schwächung gebrochen werden kann.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die umlaufende Linie einer Schwächung durch eine äußere Nut bereitgestellt wird.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Pipettenspitze aus Polycarbonatmaterial besteht.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Pipettenspitze sich im Durchmesser zum vorderen Ende konisch verjüngt.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Pipettenspitze eine Längsachse aufweist und die Membran schräg zu der Längsachse angebracht ist.